REPORTE DE PROYECTO FINAL

OBTENCIÓN DE BIOPLÁSTICOS A PARTIR DE

DEGRADACIÓN BACTERIOLÓGICA DE MATERIA

ORGÁNICA

PRESENTAN:

GÓMEZ CHÁVEZ ABIGAIL

GUADARRAMA JUÁREZ JESSICA ITZEL

LLANES RODRIGUEZ VICTOR MANUEL

TORRES BEDOY LAURA VICTORIA

SAN JUAN DEL RÍO, QRO. ABRIL DE 2009

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INTRODUCCIÓN

Los bioplásticos hoy en día representan una alternativa mas amable y

vanguardista para el cuidado del medio ambiente, y trae una solución eficaz ante

el desabasto de polímeros derivados de hidrocarburos. El procedimiento que

conlleva para la obtención de los polihidroxialcanoatos, es vía genética o

bacteriológica, en este caso nos enfocamos a la segunda opción.

La producción bacteriana de bioplásticos no requiere en especifico de una

bacteria pero entre las que pueden realizar esta labor se encuentran la, Ralstonia

eutropha y pseudomona pp que son capaces de degradar la materia prima en lo

que se conoce como biomasa, y que para efectos de este experimento se utilizo

la pseudomona pp, obtenida de una sepa pura, para la degradación de nuestra

materia orgánica que fue la caña de azúcar.

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Objetivo:

Comprobar que se pueden obtener polímetros a partir de nuevas fuentes que no

sean hidrocarburos fósiles.

Hipótesis:

Se pueden obtener polímeros a través de materia orgánica, rica en carbohidratos

y almidones como la caña de azúcar, mediante su degradación bacteriológica.

Las bacterias de ciertas clases pueden degradar la materia orgánica y como

producto alterno producir PHA. En al actualidad la Ralstonia eutropha es el

principal agente bacteriano en producción de PHA a nivel industrial, sin embargo

basados en la hecho de que ésta es un genero derivado de las Pseudomona, se

utilizara una cepa pura de Pseudomona pp para comprobar que las bacterias de

este genero también son generadoras de PHA. Se pretende que mediante la

utilización de un bioreactor, acondicionado con Kitazatos, filtros de aire, una

bomba de aire de acuario y materia orgánica previamente procesada siendo la

elegida la remolacha de caña de azúcar, sean las bases que necesite la bacteria

para una producción y obtención de bioplolímero.

Marco teórico

Se definen como bioplásticos a aquellos materiales fabricados a partir de recursos

renovables (por ejemplo, almidón, celulosa, melazas, etc.) y también a los

sintéticos fabricados a partir de petróleo que son biodegradables (por ejemplo, la

policaprolactona).

Esta clasificación incluye las mezclas de ambos tipos, tal como las de almidón y

policaprolactona, ya comercializadas en el primer mundo.

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La biodegradabilidad es la degradación de sustratos complejos por parte de

microorganismos siguiendo vías metabólicas catalizadas por enzimas segregadas

por estos últimos, para obtener sustancias sencillas, básicamente agua, dióxido

de carbono y biomasa, fácilmente asimilables por el medio ambiente.

La velocidad de la biodegradación depende de la flora microbiana, la temperatura,

la humedad y la presencia de oxígeno. Los microorganismos no segregan

enzimas capaces de romper las uniones químicas de las macromoléculas

poliméricas que constituyen los plásticos sintéticos commodities más usados

comúnmente, en su mayoría derivados del petróleo.

Por otro lado, se define como “plástico compostable” a aquel que es

biodegradable, generando básicamente dióxido de carbono, agua, y humus, a una

velocidad similar a la de los materiales orgánicos sencillos (por ejemplo la

celulosa) y que no deja residuos tóxicos ni visibles.

Existe normativa en la Unión Europea, como la Norma EN 13432 en vigencia

desde enero de 2005, entre otras, que permite certificar los plásticos

compostables y los envases fabricados a partir de éstos, de forma tal que el

consumidor pueda distinguirlos fácilmente.

La certificación y el etiquetado de los bioplásticos como biodegradables /

compostables, permitiría tratar estos materiales post-consumo junto con la

fracción orgánica de los residuos sólidos

Para que un envase plástico obtenga la etiqueta de “compostable”, debe cumplir

los siguientes requisitos:

a) Biodegradabilidad: 90% antes de seis meses

b) Desintegrabilidad: la fragmentación y la pérdida de visibilidad del residuo

en el compost final.

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Esto se mide con el ensayo de compostaje (EN 14045), en el que el

material tiene que estar desintegrado antes de 3 meses, con un tamaño

inferior a 2 milímetros y que alcance al 90% de la masa inicial.

c) Ausencia de efectos negativos en el propio proceso de compostaje.

d) Bajos niveles de metales pesados, y la ausencia de efectos negativos

sobre la calidad del compost obtenido en la biodegradación y un compost

normal, no teniendo que existir diferencias de resultados bajo las mismas

condiciones.

Producción industrial de PHA:

La producción a nivel industrial de bioplásticos representa una desventaja ante los

creados a base de hidrocarburos ya que estos son hasta veces más costosos en

su producción que los plásticos comunes. Sin embargo se ha tratado de diseñar

día con día procesos efectivos y de bajo costos para su generación entre uno de

los mas efectivos podemos mencionar el siguiente:

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Imagen 01 (esquema de producción industrial)

Selección de la bacteria:

La selección de la bacteria se basa en distintos factores como peligrosidad al

manejarse, alimentación, manejo de la misma y rendimiento ante los resultados

esperados para esto nos basamos en la siguiente tabla:

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Tabla 1 (acumulación de PHA)

Esta tabla es proporcionada por una industria europea de bioplásticos donde

muestran que bacterias son las que pueden generar el PHA, sin embargo se opto

por el uso de pseudomonas pp, debido a que fue la bacteria que se logro adquirir

de una cepa 100% y por la facilidad de manejo ante las otras bacterias, como en

el caso de la Ralstonia eutropha, que requería ser mutada antes de ser utilizada

para el mismo proceso.

Pseudomonas:

Es un género de bacilos rectos o ligeramente curvados, Gram negativos, oxidasa

positiva, aeróbicos estrictos aunque en algunos casos pueden utilizar el nitrato

como aceptor de electrones. El catabolismo de los glúcidos se realiza por la ruta

de Etner-Doudoroff y el ciclo de los ácidos tri-carboxílicos. Algunos miembros del

género son psicrófilos, mientras que otros sintetizan sideróforos fluorescentes de

color amarillo-verdoso con gran valor taxonómico. Es común la presencia de

plásmidos y no forman esporas.

Con el reciente análisis de secuencias del RNAr 16S se han definido la taxonomía

de muchas especies bacterianas y como resultado, el género Pseudomonas

incluyen algunas cepas clasificadas anteriormente dentro de las Chryseomonas y

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Flavimonas Otras cepas clasificadas previamente en el género Pseudomonas,

ahora son agrupadas en los géneros Burkholderia y Ralstonia.

Reactivos:

Microorganismo: Se utilizó una cepa pura de Pseudomona pp.

Caldo Nutritivo

Caldo Lactosado

Caña de Azúcar

Sacarosa

Sulfato de Amonio

Fosfato Dibásico de Potasio

Sulfato de Magnesio Heptahidratado

Fosfato Monobásico de Sodio

Ácido Cítrico

Violeta de Genciana

Yodo Lugol

Solución Alcohol – Cetona

Safranina

Solución Amortiguadora Buffer

Solución de Yodo

Solución de Cloro

Solución del Número de Mc Fandell

Solución patrón 0.313 N

Solución HCl 0.1 N

Solución de NaOH 3 N

Solución de Microelementos

Para la solución de Microelementos contiene en solución en 0.1 N HCl:

Sulfato de Fierro 2 g/l

Cloruro de Manganeso Tetrahidratado 0.03 g/l

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Cloruro de Calcio Dihidratado 2 g/l

Cloruro de Cobre Dihidratado 0.01 g/l

Sulfato de Zinc Heptahidratado 0.1 g/l

Ácido Bórico 0.3 g/l

Cloruro de Cobalto Sextahidratado 0.2 g/l

Cloruro de Níquel Sextahidratado 0.02 g/l

Molibdato de Sodio Dihidratado 0.03 g/l

Para la solución para solución de McFandell:

Ácido sulfúrico puro

Cloruro de Bario

Material y Equipo:

Gradilla

Soporte universal

Pinzas para bureta

Bureta

3 Matraces Erlenmeyer

Agitador magnético

Tubos de ensaye con tapa

Crioviales

Balanza digital

Espátula plana

Espátula acanalada

8 vidrios de reloj

Cinta testigo

Pipetas

Perilla

Autoclave

Incubadora

Propipetas

3 matraces volumétricos de 1 lt.

3 matraces kitazato con tapón bihoradado

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3 Termómetros

3 Pipetas volumétricas rotas rellenas con algodón

Manguera

1 Bomba para pecera

Centrífuga

Microscopio

Portaobjetos

Cubreobjetos

Baño María

Refrigerador

Asas Bacteriológicas

Pinzas Morh

4 Mecheros Bunsen

pHmetro

Papel destraza

Procedimiento:

Se preparan las soluciones de HCl y NaOH y se valoran para determinar

realmente su concentración.

Se prepara la solución de microelementos.

Se preparan 1 lt de caldo nutritivo y ½ lt de caldo lactosado de acuerdo a lo

que indica su correspondiente etiquetado y se revisa el pH que presenta,

en caso de requerirlo utilizar solución de HCl o NaOH para modificarlo.

Se vierten los caldos en tubos de ensaye con 10 ml cada uno, y se prepara

el material el cual se va a esterilizar, para ello se le coloca algodón cuando

se requiera como lo es en el caso de las pipetas y se envuelve el material

en papel destraza colocando cinta testigo.

Se pone a esterilizar el material en la autoclave

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Imagen 1 (interior autoclave)

Se inocula la bacteria, para ello se utilizan los tubos con caldo ya

previamente estériles. Primero para ello se desinfecta el área con solución

de cloro y se encienden los mecheros de bunsen, del tubo que contiene el

agar con la cepa de Pseudomona pp, se toma una asada desde la orilla y

con cuidado para evitar que se contamine todo el cultivo.

Con una sola asada se inocula en 15 tubos de ensaye con caldo nutritivo y

se mantiene en la incubadora durante 24 hrs. a 35ºC.

Para el bioreactor:

Se colocan los matraces kitazato dentro del baño maría que deberá

contener agua suficiente para cubrir el interior de los mismos.

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Imagen 2 (Bioreactor)

Para el medio de cultivo:

El medio de cultivo de cada matraz kitazato deberá contener:

Fosfato dibásico de potasio 2.0 g/l

Fosfato monobásico de sodio 1.6 g/l

Sulfato de magnesio Heptahidratado 0.5 g/l

Solución de Microelementos 2 ml/l

Para el medio del cultivo del fermentador se examinaron 3 concentraciones de

caña de azúcar iniciales diferentes (10, 20 y 30 g/500 ml), todas ellas con su

correspondiente cantidad de sulfato de amonio.

Las concentraciones de caña de azúcar y sulfato de amonio examinadas se

presentan en la siguiente tabla:

Caña de azúcar (g/500ml) Sulfato de Amonio (g/500ml)

10 1.375

20 2.750

30 4.125

Tabla 2 (Concentraciones de caña de azúcar y sulfato de amonio examinadas)

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Imagen 3 (Bioreactor)

Estrategia de la Fermentación:

Para iniciar la fermentación se debe contener un 10% en volumen del

inoculo en el bioreactor, esto es equivalente al caldo nutritivo contenido en

5 tubos de ensaye. Se agrega en conjunto el medio de cultivo y el

contenido de 5 tubos de ensaye dentro

del matraz kitazato (bioreactor).

Imagen 4 (matraz Kitazato con 10% de caña)

A las pipetas volumétricas rotas se les agrega algodón para que de esta

manera funcionen como un filtro para la entrada de aire, (si el tamaño de la

pipeta no es suficiente para que la pipeta cubra el nivel del medio de cultivo

en el bioreactor, se coloca un trozo de manguera el cual debió haber sido

esterilizado previamente en solución de yodo).

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Imagen 5 (Comienzo de estrés a los Mios)

Se coloca el termómetro y la pipeta en cada uno de los tapones, la

manguera se conecta de la bomba, (la cual además de suministrar

oxígeno al medio también le proporcionará una agitación por las burbujas

generadas), a la punta de una de las pipetas, la salida del matraz kitazato

se conecta a la punta de la siguiente pipeta y nuevamente de la salida que

tiene el matraz se conecta la otra punta de la pipeta, dejando libre la ultima

salida para que de esta manera se pueda escapar el gas de desecho

producido por la bacteria en el bioreactor.

Imagen 6 (Estructura del bioreactor)

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El pH del medio de cultivo se ajustó entre 6.7 y 7.0 y la temperatura del

baño maría se mantuvo constante a 30ºC durante 24 horas, posteriormente

pasó un lapso de 72 hrs, que se utilizó para estresar la bacteria y crecer la

biomasa, después de este tiempo se le agregó un pulso de sacarosa para

restablecer su concentración inicial

Caña de azúcar (g/500 ml) Sacarosa (g/500 ml)

10 75

20 75

30 75

Tabla 3 (Concentraciones de sacarosa y caña de azúcar examinadas)

Imagen 7 (Matraz con 20% caña con 75g/500ml de sacarosa)

Se realizó una microscopía usando tinción de Gram al cultivo para observar

y garantizar la pureza del cultivo

Método para la tinción Gram

Preparar un frotis delgado del cultivo, secar a temperatura ambiente y fijar

a calor.

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Imagen 8 (Secado de bacterias para tinción Gram)

Cubrir el frotis con violeta de genciana durante un minuto, con reloj en

mano

Imagen 9 (Adición de violeta en tinción de Gram)

Lavar abundantemente.

Cubrir con Yodo-Lugol durante un minuto.

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Imagen 10 (Adición de Yodo-Lugol en tinción de Gram)

Lavar abundantemente.

Agregar alcohol-cetona hasta que no arrastre el colorante.

Imagen 11 (Adición de alcohol-cetona en tinción de Gram)

Lavar abundantemente.

Cubrir con safranina durante un minuto.

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Imagen 12 (Adición de safranina en tinción de Gram)

Lavar abundantemente.

Observar a inmersión en el microscopio.

Determinación de la biomasa

La biomasa se determinó de forma indirecta mediante el Número de

McFandell, de esta manera se puede conocer la cantidad existente en

millones de colonias dentro del cultivo.

Preparación del Número de McFandell

Para el número 1 que corresponde a 3x10-8/ml, se pesó 0.1 gr de cloruro de bario

y se disolvió en 9.9 ml de H2SO4, a partir de este se sacaron las cantidades

correspondientes para la preparación del número 1.5, 2, 2.5 y 3, siendo las

siguientes:

Número de

McFandell

Peso

de

BaCl2

Cantidad en

ml de H2SO4

Equivalente en

Núm. De

Colonias

1 0.1 gr 9.9 ml 3x10-8/ml,

1.5 0.15 gr 9.85 ml

2 0.2 gr 9.8 ml

2.5 0.25 gr 9.75 ml

3 0.30 gr 9.7 ml

Tabla 4 (Concentración de número de McFandell y Colonias bacteriológicas)

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Una vez preparado el número de McFandell se agitan las soluciones y se comparan

con el medio de cultivo contenido los bioreactores.

Recuperación del polímero

Se centrifugó el caldo de fermentación durante 45 minutos a 5000 r.p.m., y

congeló a -15ºC.

Imagen 13 (Centrifuga)

Técnica que faltó por realizar

Después de centrifugar se desecha el sobrenadante y se resuspende el

pellet en solución de TRIS-HCl 0.5 M de pH 7.0 y se liofiliza durante 72

horas.

Para la recuperación del polímero se realiza mediante dispersiones de

hipoclorito-cloroformo siguiendo la metodología empleada por Cortázar y

Malagón (2001): por cada gramo de biomasa liofilizada se usaron 100 ml

de dispersión de hipoclorito de sodio al 5% p/v y cloroformo al 50% v/v.

Se deja a temperatura ambiente en agitación constante durante una hora,

después se deja decantar para recuperar la fase orgánica.

Esta fase se concentra en rotavapor a 70ºC, sin usar vacío, hasta alcanzar

un volumen cercano a 20-40 ml.

El polímero se precipitó en metanol frío manteniendo una relación 1/10 en

volumen de cloroformo a metanol, se deja precipitar durante 8 horas a 4ºC.

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Se filtra al vacío y se desechó el sobrenadante, el polímero que se obtiene

se deja secar hasta alcanzar peso constante.

Observaciones:

En el bioreactor correspondiente a la concentración de 10 gramos de caña de

azúcar se observó después de efectuarse la fermentación que la formación de

“espuma” a diferencia de los otros dos casos fue mucho mayor.

Imagen 14 (Formación de espuma en el matraz)

El bioreactor que contenía la concentración de 20 gramos de la caña de azúcar

presentó formación de “espuma”, pero además se apreciaban “puntitos negros” en

la pared del bioreactor que no eran más que pequeñas acumulaciones de azúcar

que se adhirieron al matraz y que durante la fermentación tomaron esa

coloración, mientras que esto no ocurrió en las otras dos concentraciones

estudiadas.

Imagen 15 (Formación de puntos negros en el matraz)

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La última concentración que se estudió fue la de 25 gramos de caña de azúcar,

en este caso el crecimiento de la bacteria se apreció de mejor manera, a simple

vista se veía en forma de pequeños “platanitos”, ya que su forma era un poco

alargada.

Imagen 16 (Matraz con 25 gramos de caña observación de la bacteria)

Resultados Obtenidos:

Tinción de Gram: Se ve que la cepa es en realidad Pseudomona pp, Gram

negativa.

Número de McFandell: Se observó y cotejo los números de McFandell para la

turbidez en las distintas etapas del proceso dentro del bioreactor:

Número de

McFandell Etapa del proceso

1 Mediante el estrés de la bacteria por 24 horas

1.5 Finalizado el estrés de la bacteria por 24 horas

2 Matraz con 10g/500mk de caña con la sacarosa

2.5 Matraz con 20g/500mk de caña con la sacarosa

3 Matraz con 30g/500mk de caña con la sacarosa

Tabla 5 (Número de McFandell en etapas del proceso)

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Centrifugado: Se observó que al finalizar este proceso se obtuvo mayor cantidad

de sedimento en el matraz de XX g/500ml de caña.

Análisis de los Resultados:

Tinción de Gram: Esta indica que efectivamente el cultivo utilizado posee las

características de las pseudomonas que se requerían tales como ser Gram

negativas y esto nos dio la seguridad de que se trataba de una cepa 100% de

pseudomonas pp garantizando el % de obtención del polímero.

Número de McFandell: Esta parte nos fue indicando el crecimiento de las

bacterias a través de la comparación de la turbidez de cada Número de McFandell

con cada etapa del proceso indicando el aproximado del número de colonias

formadas en cada etapa.

Centrifugado: Se ve que se han obtenido diferentes cantidades de sedimento en

cada uno de los crioviales, producto de las diferentes cantidades de caña de

azúcar que se han agregado a cada una de estas, y en cada caso el 67% del

sedimento observado corresponde al polímero.

Conclusión:

En base a los resultados obtenidos durante el proceso, se determinó que la mejor

concentración delas tres estudiadas es la de 30 gramos de caña de azúcar, para

el desarrollo de la Pseudomona pp por que existe una mayor cantidad de

nutrientes, pero no nos resulta adecuado para la generación del polímero, ya que

para ello nos resultó más eficiente la concentración de 20 gramos, esto se aprecia

en el precipitado obtenido en los crioviales.

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Bibliografía:

Cortázar, J. y Malagón, D. 2001. Evaluación experimental de tres métodos

de recuperación de tres polímeros biodegradables del tipo PHAs

sintetizados por Pseudomonas. Trabajo de Grado. Universidad Nacional de

Colombia. Bogotá, Colombia.

Barbosa, M, Espinosa A, Malagón D y Moreno N. 2005 Producción de

Poli-β-hidroxibutarato PHB Por Ralstonia eutropha ATCC 17697.

Universitas Scientiarum,Pontificia Universidad Javeriana, Revista de la

Facultad de Ciencias.

Duarte, A. 1995Introducción a la Ingeniería Bioquímica. Facultad de

Ingenieria, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.

http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/MicrobeWiki

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Anexos:

CALCULOS:

* Solución de Acido Clorhídrico (HCl) al 0.1 N:

Solución de Hidróxido de Sodio (NaOH) al 3 N:

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* Valoración de la solución de HCl con una solución patrón de NaOH al 0.313 N

Valoración ml. gastados de HCl

1 14.8

2 14.7

3 14.9

Promedio= 14.8

* Valoración de la solución de NaOH con la solución de HCl al 0.313 N.

Valoración ml. gastados de HCl

1 7.5

2 7.5

3 7.5

Promedio= 7.5

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Apéndices:

La tinción de Gram o coloración Gram:

Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización

de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo

danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto para

poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una

primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria

Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram

negativa a las que se visualizan de color rosa.

Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes

celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de

peptidoglucano, además de dos clases de ácidos teicoicos: Anclado en la cara

interna de la pared celular y unida a la membrana plasmática, se encuentra el

ácido lipoteicoico, y más en la superficie, el ácido teicoico que está anclado

solamente en el peptidoglucano

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y

se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior por medio de

lipoproteínas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana

exterior por lipoproteínas. La membrana exterior está hecha de proteína,

fosfolípido y lipopolisacárido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen diferencialmente debido a estas

diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el

material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas

lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.26

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la

membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos,

como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.

La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder

retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo

tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea. Pero por

el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con

mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente

orgánico, sino que este actúa deshidratando los poros cerrándolos, lo que impide

que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración

azul-violácea.

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