ACIDO CITRICO

PRACTICA # 4 OBTENCIN DE ACIDO CITRICO A PARTIR DE Aspergillus niger EN CULTIVO SUMERGIDO

Laboratorio de Biosntesis Microbiana 1938

2010-2Objetivo General

Bsqueda de patrones de comportamiento y variaciones durante un bioproceso.

Investigar

1. Usos del cido ctrico

2. Qu es un carbohidrato reductor?

3. Tcnicas para cuantificar carbohidratos

4. Fundamento de la tcnica de DNS

5. Microorganismos utilizados en la industria para producir cido ctrico

6. Proceso industrial para la obtencin de cido ctrico por microorganismos

7. Por qu Aspergillus niger prefiere metabolizar la glucosa ms que la lactosa para producir c. Ctrico?

Medios de Cultivo

2Tubo de ensayo de 16x150 mm. Con 10 ml de agar Sabouroud inclinado estril

1Tubo de ensayo de 16x150 mm. Con 7 ml de solucin salina isotnica y Tween 80 al 0.2% estril

8Matraz erlenmeyer 250 ml con 100 ml de medio de produccin de ctrico con sacarosa.

Diluyentes, soluciones y reactivos

Agua destiladacido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)

Hidrxido de sodio 0.1NFenoftalena solucin alcohlica al 1%

Solucin salina isotnica + Tween 80 al 0.2%METODOLOGA

1. Preparacin del inculo

Aspergillus niger sobre productora de cido ctrico (cepa 2000) conservada por mtodo de subcultivo en agar Sabouroud a 5C.

2. Fermentacin

De acuerdo a la tabla rotular los matraces. A los tubos con crecimiento de A. niger adicionar 7 ml de solucin salina isotnica + Tween 80. Agitar vigorosamente hasta desprender las esporas (ayudarse con el asa bacteriolgica) Tomar con pipeta estril 1 ml de la suspensin de esporas obtenida e inocular cuatro matraces Erlenmeyer con 100 ml de medio de produccin de cido ctrico.

La mitad de los matraces se incuban en reposo en la gaveta y la mitad a 28C y 150 rpm, utilizando una incubadora con agitacin orbital durante 1 semanas aproximadamente.

Tabla 1. Tiempos de muestreo durante la obtencin de cido ctrico por A. niger.

0168 hrs

Das/agitacin07

Das /reposo07

3. Determinaciona) Determinacin de pH

Filtrar cada uno de los matraces. Medir el pH del sobrenadante, utilizando un potencimetro calibrado.

b) Acidez Total

Esta determinacin se realiza por duplicado.

Tomar 4 ml del sobrenadante y colocarlos en un matraz Erlenmeyer de 250 ml conteniendo 20 ml de agua destilada.

Agregar 2 gotas de Fenoftalena al 1%

Titular con NaOH 0.1N

c) Concentracin de Carbohidratos

Realizar diluciones de cada muestra colectada y repartida de acuerdo a la tabla 2 que a continuacin se presenta. SE DERBERA TENER PRECAUCIN DE HOMEGENIZAR PERFECTAMENTE LA SOLUCION ANTES DE TOMAR LA MUESTRA PARA DILUIR AL IGUAL QUE DESPUES DE DILUIRLA.

De cada dilucin realizar por duplicado la tcnica de cuantificacin de azcares reductores por el mtodo del cido 3,5-dinitrosalicilico (DNS)

Tabla 2. Diluciones a realizar para determinar la concentracin de carbohidratos de cada muestra colectada durante la fermentacin.

Fecha(das)07

Tiempo (horas)0168

Dilucin1/401/100

CUANTIFICACION DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES POR LA TECNICA DEL ACIDO 2,3-DINITROSALICILICO (DNS)

Tomar 0.5 ml de cada dilucin y transferirlos a un segundo tubo.

Agregar 0.5 ml de reactivo de DNS a cada tubo

Agitar los tubos y tapar con papel aluminio

Incubar 5 min. en bao Mara en ebullicin (introducir todos los tubos al mismo tiempo)

Sacar todos los tubos al mismo tiempo. Agregar 5 ml de agua destilada y Mezclar

Leer la absorbancia espectrofotomtricamente a 540 nm

Obtener la concentracin de cada dilucin de la muestra interpolando las absorbancias obtenidas en la curva estndar Realizar un blanco reactivo con aguaCALCULO DE RESULTADOS

Consumo de CHO

Tiempo (hrs)[CHO]

(mg/mL)Factor de dilucin[CHO]real

(mg/mL)

0

168

DISCUSIN DE RESULTADOS

Con base en los resultados, parmetros calculados e investigacin bibliogrfica analizar para cada tipo de incubacin cules fueron las mejores condiciones para la obtencin de cido ctrico de A. niger.BIBLIOGRAFIA

Barford J. & Fu F. Ch. (1999) Data analysis In: Demain A.L. & Davies J.E. (Eds.) Manual os Industrial Microbiology and Biotechnology. ASM. USA 20:240-241.

Madigan M., Martinko J. & Parker J. (1999) Brock, biologa de los microorganismos 8a edicin. Prentice Hall. Espaa 455-458.

Ward O. (1989) Biotecnologa de la fermentacin. Principios, procesos y productos Acribia. Espaa. 165-169.

Crueger W. & Crueger (1993) Biotecnologa, Manual de Microbiologa Industrial Acribia. Espaa. 153-164.

Grewal H.S. & Kaira K.L. (1995) Fungal production of citric acid Biotech adv 13 (2): 209-234.

ANEXO

Medio de produccin de cido ctrico para Aspegillus niger

ReactivoConcentracin (g/L)

Carbohidrato100.0

Sulfato de amonio2.0

Fosfato monobsico de potasio2.0

Sulfato de magnesio0.5

Sulfato ferroso amoniacal7 x 10-4

Sulfato de zinc4 x 10-4

Sulfato de cobre2 x 10-4

Agua destilada1000 mL