Objetivo: Estudiar la estabilidad de proteínas

4) Para conocer G, imprescindible conocer mecanismo

Para reacción D N KP = [N]/[D]

2D N2 KP = [N2]/[D]2

D ↔ I1 ↔ I2… ↔ In ↔ N KP = Ki

Caracterización de estabilidad de proteínas

Calorimetría de barrido diferencial (DSC)

1)Permite determinar mecanismo de desplegamiento/plegamiento

2) Medición de H, S y Cp para cada etapa

Objetivo: Estudiar la estabilidad de proteínas

Calorimetría de barrido diferencial (DSC)

Calorimetría de barrido diferencial (DSC)

Objetivo: Estudiar la estabilidad de proteínas

0 20 40 60 80 100-0.0002

-0.0001

0.0000

0.0001

0.0002

0.0003

0.0004

0.0005

amortiguador vs amortiguador

Cp

(ca

l/o C)

Temperature (oC)

280 300 320 340 360 380

0

1000

2000

3000

4000

2H = 60 kcal/mol

H = 30 kcal/mol

H = 60 kcal/mol

C exc

(kc

al/m

ol)

Temperatura (K)

Extrayendo mecanismo y energética mediante DSC

Objetivo: Estudiar la estabilidad de proteínas

lnKeq / (1/T) = - HvH / R

280 300 320 340 360 380

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

H = 30 kcal/molfrac

ció

n d

esn

atu

raliz

ado

Temperatura (K)

H = 60 kcal/mol

280 300 320 340 360 380

0

1000

2000

3000

4000

H = 30 kcal/mol

H = 60 kcal/mol

C exc

(kc

al/m

ol)

Temperatura (K)

Extrayendo mecanismo y energética mediante DSC

Objetivo: Estudiar la estabilidad de proteínas

lnKeq / (1/T) = - HvH / R

cal

excvH H

CRTH

2/1,2

2/12/1, 4

Extrayendo mecanismo y energética mediante DSC

Objetivo: Estudiar la estabilidad de proteínas

cal

excvH H

CRTH

2/1,2

2/12/1, 4

# unidades cooperativas

HvH Hcal / HvH

1 1

2 1.5

3 2

cal

exc

H

CRT

2/1,2

2/14

cal

exc

H

CRT

2/1,2

2/16

cal

exc

H

CRT

2/1,2

2/18

Extrayendo mecanismo y energética mediante DSC

Objetivo: Estudiar la estabilidad de proteínas

Herramienta de “desconvolución”

Caso ejemplar:

Plasminógeno ~700 a.a.

dpHdTm

RTmTmH

23.2)(

Extrayendo mecanismo y energética mediante DSC:

Número de protones () intercambiados en la reacción

65 70 75 80 85260

280

300

320

340

360

Hca

l (k

J m

ol -1)

Temperature (o C)

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

65

70

75

80

85 a b

pH

Tm

(o C

)

Extrayendo mecanismo y energética mediante DSC:

Número de protones () intercambiados en la reacción

= 1.05