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Centro de lnvestluaclón en Allnnentaclón v Desarrollo, A. C.
IDENTIFICACIÓN DE VARIANTES GENÉTICAS DE β-LACTOGLOBULINA
EN LECHE POR ELECTROFORESIS CAPILAR Y CROMATOGRAFÍA
ACOPLADAS A ESPECTROMETRÍA DE MASAS/MASAS
PRESENTADA POR:
HECTOR ARMANDO OLGUIN ARREDONDO
TESIS APROBADA POR LA
DIRECCIÓN DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE
DOCTOR EN CIENCIAS
HERMOSILLO, SONORA. FEBRERO DE 2005.
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RESUMEN
La presente investigación muestra los resultados del estudio en aspectos metodológicos para
el desarrollo de un nuevo protocolo analítico, consistente en la obtención, separación,
aislamiento y mapeo de péptidos trípticos, aplicable a la identificación de variantes genéticas
(VG) de la β-lactoglobulina (β-LG) en leche de bovino. Para lograr el objetivo, primero se
estudiaron las condiciones de separación y purificación de proteínas por electroforesis capilar
en zona (CZE), utilizando una mezcla de las variantes A y B de la β-LG. El peso molecular de
cada variante aislada se determinó por CZE y espectrometría de masas con ionización por
electroespreado (ESI-MS) en línea (CZE-ESI-MS). Posteriormente, la proteína aislada fue
sujeta a digestión tríptica para llevar a cabo el mapeo de péptidos. Así, las condiciones de
digestión y de mapeo se determinaron comparando los perfiles electroforéticos generados, Los
péptidos aislados se identificaron por cromatografía capilar acoplada a espectrometría de
masas-masas con ionización por electroespreado (CC-ESI-MS/MS). Los patrones de
fragmentación generados por espectrometría de masas se compararon con bases de datos de
proteínas, determinando el grado de homología y elucidando la secuencia de aminoácidos que
identificaron a la proteína. Las variantes de β·LG se separaron utilizando capilares no
recubiertos, en una solución de boratos 0.05 M (0.1% de Tween 20) a pH 8.0, aplicando 20 kV
(+ -). La proteína separada se colectó aplicando presión al capilar por un rango de tiempo
definido. Posteriormente, la proteína se hidrolizó con tripsina en una proporción enzima-
sustrato (E/S) de 1/20, incubando por 20 hrs a 37°C.
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capilr1r por un rEHl[JO de tiernpo definido. Posteriormt,nle, la protelna se hidrolizó
con tripsina en una proporción enzi111a .. sustrato (E/S) de ·1120, incubando por 20
hrs a :lT'C. L.os péptidos trípticos fuernn se¡Jl3rados utlliz.ando capilares no
recubiertos, en una solución de ácido fórmico 0."15 M, pH 2 .. 3, aplicando 2!l kV
(+ ..... , "). La metodologla de CZF:. establecida parr:i la obtención de mapas
peptldicos presentó coeficientes d,i variación menores a 0.!39'½, (tiernpos dt)
migración) y 5.42%, (áreas). L.os péptidos separados se colectaron �lll una
solución de bicarbonato de amonio 0,05 M a pH 3,0. Los péptidos aislados
fueron analiz.ados por cc .. 1:Sl·MS/MS en modo de escaneo con ionización
positiva, para un ranuo de masa/carga (rnlz) de 300 a 2200. Asl, el protocolo
analltico clesarrollado permitió identificar lm; péptidos que con1prencien los
r�.!Siudos e 1-70 y ·¡ 02-124 de 1:, molécula de f.l-LG, permitiendo identificar las
vari:,ntes genética:, A y 8. El rnapeo y la deterrninaci6n de la secuencia
especifica de aminoécldos en péptidos trlplicos por espectrometria de
masas/mm,as, permitió la identificación de variantes ¡Jenéticas especificas en
las muestras de leche analiz.adas.
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