SHP-1 es un objetivo de regorafenib en el cncer colorrectal

Regorafenib es un inhibidor de mltiples protenas quinasas que ejerce actividades antitumorales y antimetastticas en el cncer colorrectal metastsico (CRC). SH2 que contiene el dominio fosfatasa 1 (SHP-1) se informa que tiene potencial de supresin de tumores, ya que acta como un regulador negativo de la sealizacin de p-STAT3Tyr705. Sin embargo, poco se sabe sobre el mecanismo respecto regorafenib afecta SHP-1 actividad tirosina fosfatasa y conduce a la apoptosis y la supresin tumoral en el CCR. Aqu, encontramos que regorafenib desencadena la muerte celular apopttica y mejorado significativamente SHP-1 actividad, que se redujo drsticamente la forma fosforilada de STAT3 en Tyr705 (p-STAT3Tyr705). Es importante destacar que, regorafenib aumentada SHP-1 actividad por la ruptura directa de la asociacin entre la N-SH2 y el dominio cataltico de PTP SHP-1. La delecin del dominio N-SH2 (dN1) o mutacin puntual (D61A) de SHP-1 bloqueaba el efecto de SHP-1 inducida por la actividad regorafenib-, inhibicin del crecimiento y una disminucin de la expresin de p-STAT3Tyr705, lo que sugiere que regorafenib desencadena un cambio conformacional en SHP-1 mediante el alivio de su autoinhibition. En ensayo in vivo mostr que el crecimiento de xenoinjerto de regorafenib inhibi significativamente la disminucin de la expresin y p-STAT3Tyr705 pero indujo mayor SHP-1 actividad. Colectivamente, regorafenib es una novela SHP-1 agonista ejerce efectos antitumorales superiores mediante la mejora de SHP-1 actividad que se dirige directamente a p-STAT3Tyr705. Pequea molcula de mejora de la SHP-1 actividad puede ser un enfoque teraputico prometedor para el tratamiento CRC.

INTRODUCCIN El cncer colorrectal (CCR) es un tumor maligno que lleva todo el mundo. En general, la incidencia de CCR es mayor en los pases econmicamente desarrollados que en los pases en desarrollo [1]. Etapa temprana CRC generalmente se trata con ciruga, con frecuencia en combinacin con la quimioterapia adyuvante. Regorafenib es un nuevo inhibidor oral de multicinasa ambas quinasas de receptores de tirosina-intracelulares y unidas a la membrana (RTK), que participan en las vas de sealizacin relacionadas con la angiognesis tumoral, la oncognesis, microambiente tumoral y el crecimiento tumoral / proliferacin [2, 3]. En estudios preclnicos, regorafenib exhibi actividad antitumoral en varios xenoinjertos de tumor [2]. Recientemente, regorafenib demostr beneficios generales de supervivencia en pacientes con CCR metastsico y, posteriormente, se convirti en el primer frmaco teraputico aprobado para la enfermedad [3]. Regorafenib se ha informado que no slo ejercer efectos antitumorales mediante la inhibicin de la proliferacin celular y la supresin marcadamente el crecimiento de xenoinjerto, sino tambin mostrar actividades antiangiognicas y antimetastsicas en el CCR [4].Regorafenib (fluoro-sorafenib) es estructuralmente muy similar a sorafenib, pero regorafenib contiene un tomo de flor en lugar de un tomo de hidrgeno en el anillo aromtico central. Sorafenib es tambin un inhibidor del crecimiento multi-quinasa y es la primera terapia oral aprobado por la FDA para el carcinoma hepatocelular (HCC) [5]. Recientemente, se ha demostrado que sorafenib y sus derivados mejorar directamente la actividad de Src regin de homologa 2 (SH2) que contiene el dominio fosfatasa-1 (SHP-1) y que disminuye especficamente la forma fosforilada de STAT3 en Tyr705 (p-STAT3Tyr705) Y, finalmente, conduce a la apoptosis y el cncer tumorogenicidad suprimida [6, 7]. SHP-1 se identific por primera vez en las clulas hematopoyticas y se expresa predominantemente en clulas hematopoyticas y epiteliales [8-10]. SHP-1 pertenece a una familia de no receptores protena tirosina fosfatasas (PTP), que participa en los procesos de sealizacin hematopoyticas y tambin ha sido reportado para funcionar como un supresor de tumor durante la progresin tumoral [11-14]. SHP-1 contiene dos dominios SH2, un dominio cataltico de PTP y un C-terminal de la cola [11]. En particular, su actividad fosfatasa es altamente dependiente de su variabilidad estructural. Por ejemplo, la estructura qumica de forma cerrada de SHP-1 es montado por el dominio N-SH2 y sobresale en el dominio cataltico para bloquear directamente la entrada en el sitio activo, y se cree que el dominio C-SH2 altamente mvil para actuar como una antena para buscar el activador de fosfopptidos [15-19]. Otros informes tambin indican que el dominio cataltico de PTP se activa debido a la flexibilidad del bucle WPD, que contiene el residuo del sitio activo, Asp421 [11, 15, 16, 20]. Nuestro trabajo reciente ha demostrado de manera mecnica que SHP-1 actividad sorafenib-mejorado es debido a la posibilidad de acoplamiento de sorafenib, que interrumpe directamente la asociacin entre la N-SH2 y el dominio PTP cataltica de SHP-1 y alivia ms de SHP-1 autoinhibition [6, 7]. Es importante destacar que, nuestros estudios anteriores han demostrado claramente que SHP-1 es un regulador negativo de p-STAT3Tyr705 [6, 21-24] que est altamente expresado en las clulas cancerosas y es crucial para el crecimiento, la supervivencia y metstasis de las clulas cancerosas durante la progresin del cncer. Por lo tanto, aclaremos si el regorafenib analgico sorafenib (fluoro-sorafenib) acta como un potenciador directo de SHP-1 por lo que mejor SHP-1 actividad downregulates directamente p-STAT3Tyr705 y, finalmente, contribuye a la apoptosis en el CCR. La comprensin del mecanismo de la va de supresin tumoral activada por regorafenib puede proporcionar una nueva estrategia teraputica a travs del cual abolir la sealizacin oncognica STAT3. Este estudio es objetivo de obtener una mayor comprensin de los mecanismos moleculares mediante los cuales regorafenib induce apoptosis in vitro, as suprime la tumorigenicidad in vivo. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que informa de que regorafenib es una novela SHP- 1 agonista que perjudica directamente la interaccin entre el dominio N-SH2 y el dominio cataltico de PTP SHP-1, y adems alivia la autoinhibition de SHP-1 . Nuestro estudio revela el nuevo mecanismo molecular mediante el cual regorafenib desencadena una va supresora SHP-1 tumor para ejercer efectos anti-tumorales superiores mediante la promocin de SHP- actividad de la fosfatasa de la tirosina 1 que se dirige a la expresin oncognica de p-STAT3 Tyr 705 directamente. RESULTADOS Regorafenib mostr una inhibicin de crecimiento superior y la apoptosis inducida significativamente en lneas celulares de cncer de colon En primer lugar, se investig el efecto biolgico de regorafenib en la inhibicin del crecimiento en un panel de lneas celulares de CRC 4 humano (HCT-15, DLD1, HT-29 y HCT-116). Dos das despus del tratamiento con regorafenib a dosis de ms de 5 M, la viabilidad celular se redujo drsticamente (Figura 1A) y la apoptosis se indujo significativamente (Figura 1B) en estas lneas celulares de CRC. Adems, 24 horas despus las clulas fueron tratadas con regorafenib, marcada muerte celular apopttica y aument la actividad especfica de la caspasa-3 se produjo de una manera dependiente de la dosis (Figura 1C). Estos hallazgos sugieren que regorafenib ejerce un efecto anti-cncer mediante la induccin de la muerte celular apopttica en clulas de CRC. Expresin downregulated de p-STAT3Tyr705 se asoci con la apoptosis efecto de regorafenib La forma fosforilada de STAT3 en Tyr705 (P-STAT3Tyr705) Ha sido informado de que se expresa constitutivamente en CRC y estar involucrado en la regulacin de proliferacin [25]. Por lo tanto, el prximo examin si p-STAT3Tyr705 la expresin est implicado en la apoptosis inducida por regorafenib. El tratamiento de clulas con CRC regorafenib durante 24 horas disminuy gradualmente la expresin de p-STAT3Tyr705 y su supervivencia relacionada se dirige aguas abajo de ciclina D1 y Mcl-1 de una manera dependiente de la dosis (Figura 2A). Tambin se encontr que las clulas HCT-15 y DLD1 tratados con regorafenib en 5M suprimidas gradualmente la expresin activa de p-STAT3Tyr705 pero aument notablemente los indicadores de apoptosis de las expresiones de PARP escindida y exfoliados caspasa-9 de una manera dependiente del tiempo (Figura 2B). En particular, la sobreexpresin de STAT3 obviamente restaurado p-STAT3Tyr705 expresin y inhibe la apoptosis inducida por el tratamiento con regorafenib durante 24 horas (Figura 2C), lo que sugiere que la apoptosis activada por regorafenib est mediada por la inactivacin STAT3.Figura 1: Regorafenib disminuy drsticamente la viabilidad celular y la apoptosis inducida significativamente en lneas celulares de cncer de colon. (A) ensayo de MTT se realiz para medir la viabilidad celular en las lneas celulares de cncer de colon 2 das despus del tratamiento con regorafenib de una manera dependiente de la dosis. Se utiliz el anlisis (B) Sub-G1 para detectar la apoptosis en las clulas 2 das despus del tratamiento con regorafenib de una manera dependiente de la dosis. (C) 24 horas despus de las clulas fueron tratadas con regorafenib, la muerte celular apopttica y la caspasa-3 actividad fueron inducidos de manera significativa en una forma dependiente de la dosis. Columnas, significan; bares, SD. * P