Nuevas Tecnologías de Mejoramiento (NBT) y Edición Génica · Caracterización complete de los...

Insert sensitivity risk

Agriculture Division of DowDuPont

Nuevas Tecnologías de Mejoramiento (NBT) y Edición Génica

Situación Regulatoria y aplicaciones en mejoramiento de maíz.

Lic Gustavo Abratti, MSc. MBA

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17 de Octubre 2018

Agriculture Division of DowDuPont Insert sensitivity risk

Temario

• Contexto: el proceso desde el explanto a los millones de hectáreas; Marco regulatorio de OGM en Argentina.

• Las Nuevas Técnicas de Mejoramiento (NBT-New Breeding Techniques)

• Edición génica mediada por Crispr Cas9: Ejemplos concretos de productos NBT vía edición génica en Corteva

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Del plásmido al lote……pasando por la bolsa

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Agriculture Division of DowDuPont™ Internal & ExternalAgriculture Division of DowDuPont 4

Etapas Fase Discovery Prueba

conceptoDesarr. Temprano

Des. avanzado

Pre lanzamiento Ventas

Años 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Descubrimiento.temprano

Optimización

Descubrimiento.avanzado

Eventos comerciales.

Producir y seleccionar.

Registration & Gov Affairs

Introgresión, breeding y testing en múltiples ambientes

Ensayos regulatorios

PVP, registrovaridedades, etc



Marcos RegulatoriosSituación en Argentina y el mundo

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De que hablamos cuando hablamos de regulación?

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Reglas:

Resoluciones, leyes, articulos.

Normas voluntarias. Tratados

internacionales.

Riesgo –Incertidumbre

Rol de los estados:

Protección de bienes

comunes

“Principio Precautorio”

Complejidad-

Novedad

Incertidumbre-Miedo

Reducir el riesgo

controlando la exposición.

Impacto en ecosistemas

• Organismos no blanco

• Eficacia

• Desarrollo de resistencia

• Nuevos usos.

• Invasividad

Uso alimento

Humano y animal

• Toxicidad

• Alergenicidad

• Efectos largo plazo

• Impacto composición

• Efectos no deseados

Comercio

• Situación en otros países

• Coexistencia


Organismos y responsabilidades

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Secretario de

agricultura

Aprobación final

Mercados: Riesgo comercial

Senasa: Uso alimentario

Conabia: Riesgo

ambiental

Inase : Poder policía, verifica cumplimiento de normas


Análisis de riesgo en OVGM

• Descripción del evento:• Fuentes de las secuencias.• Historia de uso seguro• Método de obtención• Estructura del inserto (Southerns, secuenciación)• Método de detección

• Estudios de laboratorio• Toxicidad o alergenicidad de las proteínas (crónica y aguda)• Equivalencia nutricional, composición.• Bioinformática

• Datos de campo• Eficacia del evento• Características agronómicas• Impacto en agroecosistema• Expresión del carácter de interés (fenotipo, ELISA, otros)

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Las Nuevas Técnicas de MejoramientoNew Breeding Techniques (NBT) o Plant breeding innovations (PBI)

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Agriculture Division of DowDuPont™ Internal & ExternalAgriculture Division of DowDuPont


Mejora tradicionalMutagénesisSelección asistida por marcadoresGermoplasmaPVP, Breeding

Cultivos OGMCreación de

“traits”

PatentesBiotech

New

breeding

techniques: procesos largos,

múltiples

generaciones,

desarrollos y

descubrimientos,

casos no previstos

por las regulaciones

del siglo XX

??

Advanced Plant Breeding


Mutagénesis dirigida por Oligonucleótidos (ODM)

Nucleasas Dedos de Zinc (ZFNs)

Mejoramiento reverso

RNA-dependent DNA Methylation

Cisgénesis e intragénesis

Genómica Sintética

Infiltración con Agrobacterium

Injerto (no GM sobre un patrón GM)

ODM

ZFNs

Meganucleasas

TALENs

CRISPR-Cas

Técnicas para edición de

genes

2007 2018


OVGM: Organismo vegetal que posea una combinación de material genético que se haya obtenido mediante la aplicación de la biotecnología moderna. (idem protocol de Cartagena)

Evento: la inserción en el genoma vegetal en forma estable y conjunta, de UNO (1) o más genes o secuencias de ADN que forman parte de una construcción genética definida”

Para que un cambio genético sea considerado una nueva combinación de material genético, se analizará si se ha producido una inserción en el genoma en forma estable y conjunta de UNO o más genes o secuencias de ADN que forman parte de una construcción genética definida.

Definiciónes de OGM según Res. 173/15

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Cualquier producto que se obtenga mediante NBTS que usan

biotecnología moderna deben pasar por el proceso de Consulta

Previa o se los considerará OGM.

Si el producto contiene “eventos” (inserciones estables…) es OGM.

La progenie de cualquier OVGM es considerada una planta OGM

hasta que se aporte evidencia científica de lo contrario.

Criterios de CONABIA

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Requerimientos de Información

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Los solicitantes que consultan mediante ICP deben describir:

Técnica de mejoramiento usada para obtener y seleccionar el producto.

Breve descripción y explicación del fenotipo buscado.

Evidencia de los cambios presentes en el producto final.

Evidencia de la eliminación de cualquier trasngén usado temporariamente o transientemente para obtener el producto

La Dirección de Biotecnología y la Conabia se reservan el derecho

de pedir información adicional sobre cualquier punto.


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1. Procedimiento de consulta previa

CONABIA

(comité de bioseguridad)

2. ¿Existe una nueva

combinación de

material genético?

Regulado

bajo la

normativa

vigente

NO

3. ¿Se utilizan

transgenes en

el proceso?

NO

4. ¿Posee

transgenes el

producto final?

NO

SI

SI

SI

OGM

No OGM

No

necesita

regulación

especial


Proceso Simple para definir si un producto es o no alcanzado por las normativas de OGM.

El análisis es caso a caso y basado en criterios científicos.

No hay una lista restringida a las NBT existentes . Flexible a nuevas técnicas todavía desconocidas.

Permite tener certezas en la fase de diseño (producto hipotético) .

La evaluación debe completarse en 60 días.

Según el tipo de fenotipo buscado, la CONABIA puede recomendar medidas de seguimiento adicionales tomando en cuenta aspectos científicos y técnicos.

Puntos destacados

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Experiencias y expectativas 2015-2018

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Argentina:Numerosas ICP para NBTS

Productos reales (ya desarrollados): Todos tipo SDN1, todos considerados NO GMOProductos Hipotéticos(Casos en etapa de diseño, SDN1 o SDN2): se concluyó que no serian considerandos OGM, si el solicitante puede aportar evidencia de que no se insertaron construcciones .

Otros países:Latinoamérica: Procesos símil Argentina: Chile, Brasil, Colombia.Firma de acuerdo de consejo agropecuario del sur Norteamérica: Lista de exclusión de USDA.Europa: Opinión del Fiscal general: “las técnicas de mutagénesis están excluidas de las

normativas de OGM, siempre que el producto no contenga inserciones”Corte suprema: todos los productos obtenidos por métodos de PBI son OGM.Suecia: Alamo



Edicion génica mediada por Crispr Cas 9

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INSERT

(Inserción construcción)

Con Molde

de reparación

SDN2

Gene EDIT

(Edición- cambio)Gene OFF

(Eliminación)

SDN1 SDN3

Sin Molde

de reparación

Maiz Waxy Maiz NLB-R Maiz Nuevo BT?

CRISPR-CAS9

corte de la doble hebra de ADN

en los sitios objetivo (blanco)

Formas de Edición con CRISPR-Cas


Tecnología CRISPR-Cas • Enzima que aporta actividad endonucleasa de alta

efectividad y selectividad programable

Capacidad para transformar material elite• Transformar y regenerar cualquier material de la especie, incluyendo las mejores líneas agronómicas (solo se logrado recientemente).

Genómica• Disponibilidad de métodos de secuenciación de

nueva generación (NGS) y secuencia completa de genomas de líneas elite.

• Infraestructura y herramientas informáticas para análisis, seguimiento y trazabilidad.

Requisitos para aplicar Edición Génica vía CRISPR-cas

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Obtención y Caracterización de Producto Editado

Caracterización complete de los productos, incluyendo información a nivel de secuencia de ADN para confirmar, :

(1) Éxito en la Edición

(2) Ausencia de cualquier inserción de ADN de los plásmidos usados en la transformación

El desarrollo y el análisis se realiza para cada nueva línea CRISPR-Cas que se edita.

Solo avanzan a status comercial aquellas líneas que pasan todos los controles moleculares

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Uso de CRISPR-Cas como herramienta

de mejoramiento

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CRISPR-Cas Enabled Breeding

Move STRESS TOLERANCE gene

Mejora convencional por retrocruza

Resistente a Stress

Pocopotencialrinde

Genes de tolerancia a stress incorporados en germoplasma elite de alto potencial de rinde

5…5…

Linea A

Sensiblea Stress

Buenpotencial rinde

Linea B100% B

100% A

Requiere multiples generaciones

25%

7…

12%

88%

7

%93%

3

%97%


Productos desarrollados por Pioneer® de lanzamiento cercano:

Maíz Waxy- CrisprCas9


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Dos vías de síntesis de almidón en el grano de maíz normal :

Polisacárido cadena lineal: Amilosa

Polisacárido Cadena ramificada: Amilopectina

Tipos de Almidón de maíz:

“Normal” : 75% amilopectina + ~25% amilosa

“Waxy” (Alta amilopectina): > 97% amilopectina

Producto comercial de alto valor :

“Speciality”: Mercado nicho de alto valor

Aplicaciones alimentarias e industriales derivadas de propiedades fisicoquímicas:

Alta viscosidad a alta temperatura

Geles mas claros y estables a baja temperatura

Buena estabilidad en ciclo congelado/descongelado.

Maíz Waxy

Agriculture Division of DowDuPont Insert sensitivity risk 28

Current Pioneer® Waxy Corn Product

El gen de maíz Wx1codifica almidón sintasa unida a gránulos. El alelo actual wx1 proviene de una variedad de maíz de

descubierta en 1908, cultivada comercialmente desde 1940 y vendida por Pioneer desde los años 80.

• DuPont Pioneer es el proveedor líder en el mercado de semillas de maíz Waxy en USA

• Problemas de maíz waxy actual:

• Retraso para la introgresión del alelo wx1 en las líneas élite actuales

• Algunas pérdidas de rinde, en parte debido a ligamiento (linkage drag)

Solución: Interrumpir el gen Wx1 usando tecnología CRISPR-Cas editando las lineas élite

Eliminación de 30bp

Disrupción del gen ~100% amilopectina FenotipoWAXY


Maíz Waxy Crispr Cas: Diseño de la Edición (Deleción)

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Interrupción del gen

~100%amilopectina

Fenotipo Waxy

3'UTR

TSSExón7CR4 CR8

5'UTR

ATG TG

A

Región promotora

CR4 Y CR8 –RNAs de guía que dirigen dos cortes dobles en la hebra de ADN

Posición de la deleción

30bp en el maíz Waxy

convencional

Eliminación de gen , via CRISPR-Cas

Deleción de 3000 bp en

el maíz Waxy Crispr

cas9


Maíz NLB- CrisprCas9


Tizón del Norte (NorthernLeaf Blight) en Maíz

Enfermedad causada por Exserohilum turcicum (Helminthosporium turcicum)

Impacto económico global: Pérdida 18% - 98%*

Diversidad: múltiples líneas de Maíz con alelos resistente, otras alelo sensible

a NLB . La resistencia a NLB puede mejorarse con la incorporación de loci de

resistencia.

Gen NLB18 : clonado a partir de líneas elite de DuPont Pioneer y validado de

diversas formas

Propuesta para aumentar la tolerancia de híbridos de maíz sensibles a NLB:

Reemplazar directamente por edición génica el alelo sensible del locus NLB18 con el alelo resistente

** Li B, Wilson WA, inventors. 29 Dec 2011. World Intellectual Property Organization, Application No. PCT/US2011/041822

***Díaz C et al (2012) . In 29 Congresso Nacional de Milho e Sorgo, Águas de Lindóia, Brazil, pp 0805-0812

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Zonas típicas de prevalencia en Argentina(Díaz C et al (2012)*** y datos propios)

Baja

Intermedia

Alta


Reemplazo Alélico NLB18 mediado por CRISPR-Cas9

NLB18-RLinea

donante

NLB18-SLinea elinte

susceptible

NLB18-R Línea elite resistente

Edición tipo SDN2 (EDIT)• Dos cortes en el ADN, Molde de reparación: alelo NLB18-R del gen de

interés• Resultado:

• Alelo alternativo para el mismo gen, reemplaza alelo susceptible• En su misma ubicación genómica sin agregado de secuencias de otra

especie ni construcciones. • Teóricamente posible por breeding tradicional (pero mucho mas difícil)


Los productos, sus beneficios y los conceptos descriptos no estarán disponibles ni se ofrecerán para la venta o distribución hasta no completar ensayos a campo y se obtengan todas las autorizaciones regulatorias aplicables

CRISPR-Cas Advanced Breeding:

Múltiples aplicaciones en agricultura.

El uso de CRISPR-Cas

facilita la Innovación en

productos Corteva

Cultivo

Res

iste

nc

iaa

en

ferm

ed

ad

es

Ren

dim

ien

toy

es

tab

ilid

ad

Res

iste

nc

ia a

se

qu

ia

“O

utp

ut”

tra

it

(Cali

da

d)

Ma

du

rez

Maíz

Soja

Canola

Arroz

Trigo

Girasol


El mejoramiento vegetal se nutrió y se nutre de todas conocimiento

disponible en cada época histórica para desarrollar nuevos

productos.

La aceleración de los cambios del ambiente y la sociedad exige no

dejar ninguna opción de lado para acelerar el ritmo de la

innovación. La edición génica es una de muchas herramientas

necesarias para innovar y sintetiza avances en múltiples áreas del

conocimiento.

Licencia social y aceptaciónMas allá de conformar al regulador: Conversaciones con los consumidores y la sociedad en la era de las fake news y las anti vacunas

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La seguridad los productos y el tutelaje (stewardship) son cimientos en los desarrollos de Corteva.

La seguridad del consumidor es condición sine qua non.

Es imprescindible asegurar comunicaciones abiertas, transparentes y oportunas acerca del uso de las tecnologías con otros sectores de la sociedad (stakeholders)

Apoyamos el desarrollo de marcos regulatorios apropiados y basados en ciencia para la regulación de plantas, proporcionales a las exigencias aplicables a otras clases de plantas.

Nos interesa facilitar el acceso a terceros de tecnologías, IP, infraestructura y experiencias

Algunos conceptos

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http://crisprcas.pioneer.com/https://openinnovation.pioneer.com/

http://crisprcas.pioneer.com/

https://openinnovation.pioneer.com/


www.corteva.com

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