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DIRECCION GENERAL DE TRAFICO OBSERVATORIO NACIONAL DE SEGURIDAD VIAL
NUEVAS PERSPECTIVAS PARA LA REDUCCIÓN DE LAS
LESIONES Y SECUELAS NEUROLÓGICAS ESTABLECIDAS
TRAS UN ACCIDENTE DE TRÁFICO CON TRAUMA
CRANEOENCEFÁLICO GRAVE
J. Vaquero, M. Zurita, C. Bonilla
ASOCIACION CIENCIAS NEUROLOGICAS
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INTRODUCCION Y PLANTEAMIENTO DEL ESTUDIO
En la actualidad las lesiones traumáticas constituyen la principal causa de muerte en personas
menores de 45 años de edad, siendo el TCE (traumatismo craneoencefálico) la variedad que
mayor relación tiene con las cifras de mortalidad. El TCE se define como cualquier lesión física
o deterioro funcional del contenido craneal secundario a un intercambio brusco de energía
mecánica.
De acuerdo con estudios epidemiológicos existentes, la incidencia anual es de
aproximadamente 200 casos por 100.000 habitantes. El grupo de edad de mayor riesgo es
aquel comprendido entre los 15 y 24 años de edad, siendo los accidentes de tráfico la
principal causa de las lesiones (Bruns et al, 2003).
Por todo ello son muchos los estudios que se están llevando a cabo para intentar paliar las
secuelas del daño cerebral traumático, con especial atención al producido tras un accidente de
tráfico grave, causante de secuelas neurológicas supuestamente irreversibles.
La mortalidad por TCE ha disminuido considerablemente desde que se reconoció la existencia
de dos tipos de fenómenos secuenciales e interdependientes en el desarrollo de un TCE: la
lesión primaria y la lesión secundaria.
La lesión primaria es responsable de todas las lesiones nerviosas y vasculares que
aparecen inmediatamente después de la agresión mecánica. Las lesiones anatómicas
resultantes son la degeneración axonal difusa (principal causa del coma
postraumático), muerte de neuronas y células gliales, contusiones, laceraciones y
hematomas intracerebrales. Todo esto es debido a que la lesión primaria altera un
sistema elevadamente integrado que carece casi totalmente de capacidad funcional de
reparación siendo la plasticidad neuronal también muy limitada.
La lesión secundaria es aquella que induce lesiones cerebrales producidas por
fenómenos sistémicos e intracraneales, que aparecen en los minutos, horas o incluso
en los primeros días que siguen a un TCE. Dado que la lesión primaria carece hoy de
tratamiento específico, la reducción de la mortalidad y secuelas que se ha producido en
el tratamiento de los TCE en los últimos años, viene dado al mejor control,
conocimiento y prevención de los procesos que imperan en la lesión secundaria. Esta
lesión secundaria también incluye muerte neuronal, formación de la cicatriz glial y
generación de un microambiente que inhibe la reparación del tejido dañado.
El daño cerebral post-traumático representa un gran problema médico y social ya que no
existen terapias efectivas capaces de restablecer las secuelas que se producen tras el mismo.
Por todo ello son numerosas las vías de investigación que están tratando de desarrollar
protocolos de actuación para tratar las secuelas del TCE.
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Nuevas perspectivas en el tratamiento de las lesiones traumáticas del
Sistema Nervioso Central: Terapias protectoras y reparadoras
La habilidad limitada del sistema nervioso para repararse ha centrado la atención de
numerosos grupos, donde en un principio se trata de encontrar tratamientos farmacológicos
que impidan o disminuyan el proceso de lesión primaria que se inicia tras un TCE (Lu et al,
2004a, 2004b, 2005; Qu et al, 2005). En principio todos estos estudios tratan de activar
mecanismos protectores que inhiban mecanismos de muerte celular o apoptosis.
En relación con las terapias protectoras, se está intentando estudiar sobre modelos
experimentales de daño cerebral el posible efecto terapéutico de diversos factores
neurotróficos, capaces de crear en el SNC un entorno propicio a los fenómenos de reparación,
y entre ellos, se han utilizado el factor de crecimiento nervioso (Zhou et al, 2003), el factor de
crecimieno fifroblástico tipo 2 (Yoshimura et al, 2003), o el factor de crecimiento análogo a la
Insulina de tipo 1 (Saatman et al, 1997). De forma simultánea, se han ensayado protocolos de
terapia génica, capaces de hacer llegar estos factores a las zonas lesionadas y lograr su
permanencia en ellas por medio de células transfectadas (Longhi et al, 2004) y aunque estas
estrategias ofrecen interesantes perspectivas, lo cierto es que su aplicacion requiere aún
muchos estudios en lo que respecta a las vías y pautas de administración, y al empleo de los
vectores víricos utilizados.
Una segunda línea de investigación que está cobrando importancia creciente en los últimos
años para intentar reparar el tejido nervioso lesionado es el empleo de protocolos de terapia
celular con células madre. La posibilidad de regeneración del tejido nervioso usando estas
células ha generado múltiples expectativas en relación al tratamiento de enfermadades del
SNC. Los resultados obtenidos en estudios experimentales, permiten pensar en una no muy
lejana posible aplicación de estas técnicas para paliar determinadas enfermedades humanas.
Estas células serían capaces por una parte de liberar factores neurotróficos, y por otra, de
reparar el tejido nervioso lesionado por medio de su diferenciación hacia células nerviosas
adultas.
Las células madre
En los últimos años existe un gran interés por el tema de las llamadas «células madre» y su
posible potencial terapéutico para paliar determinadas enfermedades en el ser humano.
Existen diferentes tipos de células madre. Dentro de los tipos de células madre, las células
madre embrionarias son las más pluripotenciales, tienen una gran capacidad para proliferar in
vitro y mantienen la posibilidad de diferenciarse hacia una gran variedad de líneas celulares.
Los primeros estudios experimentales se hicieron utilizando dichas células madre embrionarias
(Yoshizaki et al, 2004) y células madre fetales (Gao et al, 2006). Es difícil que estos estudios
lleguen a una aplicación clínica en pacientes, por las dificultades, técnicas y ético-legales, a la
hora de poder aislar este tipo de células, y por ello, más frecuentemente se emplean las células
madre adultas.
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Células madre adultas
Las células madre adultas pueden obtenerse de diferentes tejidos, siendo la fuente más
utilizada para obtener estas células madre adultas o células madre mesenquimales (CMM) el
estroma de la médula ósea. Las CMM de la médula ósea constituyen una población muy
heterogénea totalmente diferente de las células madre hematopoyéticas, y su papel principal es
contribuir a la regeneración de los tejidos de origen mesenquimal tales como hueso, cartílago,
músculo, ligamento, tendón, tejido adiposo y estroma (Prockop, 1997). La esperanza
terapéutica principal que se tiene con el uso de las células madre y en concreto con las CMM
es la posibilidad de realizar trasplantes antólogos para tratar determinadas enfermedades
humanas, sin la necesidad de administrar drogas inmunosupresoras con sus nocivos efectos
secundarios.
Las CMM se obtienen clásicamente por su tendencia de adhesión al plástico de los frascos de
cultivo (Friedenstein et al, 1976), dichas células pueden dividirse rápidamente y por ello son
habitualmente utilizadas en trabajos experimentales de laboratorio. Las CMM pueden ser
inducidas in vitro para diferenciarse en multitud de linajes celulares diferentes bajo
determinados medios de cultivo (Sánchez-Ramos el al, 2000; Woodbury el al, 2000).
Estas células son multipotenciales y hoy día sabemos que, bajo determinados estímulos,
pueden transdiferenciarse a células nerviosas, tanto in vitro como in vivo, y son capaces, a
largo plazo, de regenerar el tejido nervioso sometido a lesiones traumáticas. Hay evidencias
de transdiferenciación neuronal in vitro de células madre del estroma de la médula ósea por
medio de sustancias químicas o factores de crecimiento (Zurita et al, 2007a, 2008a) y por
métodos biológicos, donde se observa que las CMM se diferencian a un fenotipo neuronal
cuando son co-cultivadas en presencia de células de Schwann (Zurita et al, 2007b).
Terapia celular con CMM en modelos de lesión traumática del SNC
En esta línea de investigación, hay grupos que aportan una amplia experiencia con el empleo
de las células madre adultas de la médula ósea en modelos experimentales de lesión
traumática crónica de la médula espinal, obteniendo buenos resultados funcionales tras el
trasplante intralesional de dichas células en las lesiones medulares (Vaquero et al, 2006; Zurita
et al, 2006, 2008b).
Como consecuencia de estos estudios se han obtenido evidencias a favor de que las CMM del
estroma de la médula ósea no requieren ser diferenciadas in vitro antes de su implantación en
zonas lesionadas de Sistema Nervioso para lograr un efecto funcional beneficioso, lográndose
este efecto tanto a través de una transdiferenciación local por factores ambientales, como
posiblemente, al menos en las fases inmediatas tras el trasplante, por medio de la liberación de
factores tróficos capaces de inducir a su vez la proliferación de células madre neurales
endógenas (Chen et al 2002; Lu et al, 2003; Mahmood et al, 2004) y por último, realizando un
efecto protector sobre las células que permanecen en las zonas lesionadas.
Tratamiento del TCE con CMM
En los últimos años se han iniciado diversos estudios experimentales que tratan de estudiar el
efecto terapéutico de la CMM en las secuelas del daño post-traumático cerebral, con el
propósito de encontrar datos que permitan aplicar esta forma de terapia celular en ensayos
clínicos con pacientes. Hay estudios que intentan comprobar el potencial terapeutico de las
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CMM administradas intravenosamente (Lu et al, 2001a; Mahmood et al, 2003, 2004) donde se
ha visto que un porcentaje muy bajo de células llega al cerebro y por tanto muy pocas de ellas
se diferencian hacia elementos neurales. También se ha estudiado su capacidad reparadora en
trasplantes intraarteriales (Lu et al, 2001b), concluyendo que no es la forma de terapia mas
efectiva ya que se puede producir isquemia cerebral aumentando el daño traumático en los
animales tratados. La evidencia científica ha mostrado que las CMM, una vez trasplantadas
intralesionalmente en el cerebro de ratas adultas, reducen los déficits funcionales aparecidos
inmediatamente tras sufrir un accidente vascular (Chen et al, 2001a) o un traumatismo (Chopp
et al, 2002; Mahmood et al, 2002), debido a su administración en fase aguda, es decir a las
horas o pocos días tras producirse la lesión. Como ya se ha mencionado, una de las utilidades
de las células madre mesenquimales, debido a su capacidad de diferenciación hacia elementos
neurales y su capacidad de migración, es la posibilidad de tratar dichas lesiones a través de
dos posibles mecanismos: por un lado por la activación de las propias células progenitoras
neurales, ya que se sabe que las CMM son bombas liberadoras de factores tróficos y por otro
lado contribuir a la reparación del tejido dañado, ya que estas células son implantadas en la
propia lesión (Chopp et al, 2000; Hofstetter et al, 2002).
La diferenciación de las CMM ha sido observada en aquellos estudios de terapia celular sobre
lesiones cerebrales donde se han administrado en fase aguda, mostrando que un pequeño
número de células trasplantadas presentan marcadores típicos neurales tales como
marcadores neuronales, Neu N (Lu et al, 2001a), marcador típico de astrocitos, PGFA,
marcador CNPasa de oligodendrocitos y marcador microglial OX-42 (Lu et al, 2006). Al mismo
tiempo se han observado mejoras tanto motoras como sensoriales. Sin embargo, el número de
células donantes encontradas expresando marcadores neurales fue bajo, tanto en los
trasplantes en los que se administraron intravenosa o intraarterialmente, como en aquellos en
los que se realizó un trasplante intralesional. La hipótesis que se maneja al respecto señala
que esta recuperación funcional puede deberse a una interacción entre las células
trasplantadas y el tejido cerebral, lo cual se refleja en una producción de factores de
crecimiento y citoquinas. Pudiendo ser el efecto el aumento de la proliferacion celular después
del trasplante de las CMM ( Mahmood et al, 2004).
En la actualidad se están desarrollando vías de administración conjunta de CMM y factores de
crecimiento (Bhang et al, 2007), donde parece que la actividad apoptótica en los animales
trasplantados con CMM humanas y factor de crecimiento fibrobástico es la mitad que en el
grupo de animales trasplantados únicamente con células.
Uno de los problemas que se plantea en prácticamente todos los estudios mencionados, es
que aunque se encuentran células trasplantadas en la zona de lesión, y aunque éstas
muestran fenotipos de elementos neurales aparecen en muy bajo número, por lo que no se
detecta una reducción del volumen de lesión, posiblemente porque las cavidades post-
traumáticas son muy amplias, y las células encuentran un ambiente poco favorable para poder
sobrevivir y proliferar, y en mucha menor medida diferenciarse.
Aunque los resultados obtenidos con los trasplantes de las células madre adultas parecen estar
dando sus frutos, y aunque cada vez parece más claro que tal vez el futuro esté en desarrollar
terapias combinadas (Mahmood et al, 2007), aún queda una cuestión importante por resolver,
en la que parece que aún no se han centrado los investigadores. Tanto con la administración
intravenosa como con la administración intracraneal se encuentran células marcadas en los
bordes de la lesión (Chopp et al, 2002; Lu et al, 2001a; Mahmood et al, 2002, 2003) quedando
un gran vacío en el que ni los factores de crecimiento ni las propias células pueden actuar.
Posiblemente esto se deba a que estos protocolos de administración de las células siempre se
han desarrollado en fases tempranas tras producirse el daño, dónde el efecto protector de las
CMM puede tener un mayor papel que el reparador.
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Cuando se produce un TCE, en el que ya se han desarrollado los procesos de lesión primaria y
lesión secundaria, el tejido se reabsorbe quedando como resultado un gran agujero allí donde
se produjo el daño. El desarrollo de protocolos de administración de células madre en fases
tardías tras producirse una lesión, puede tener un gran potencial dentro del tratamiento de las
secuelas cerebrales crónicas establecidas. Estas células por un lado pueden establecer una
serie de interacciones con las propias células del cerebro que active, a través de la producción
de factores neurotróficos y citoquinas, a las propias células madre neurales induciéndolas a
proliferar y reparar el tejido lesionado, y por otro lado las propias células trasplantadas pueden
ser capaces de integrarse en el circuito neuronal dañado, proliferando y diferenciandose hacia
elementos neurales, traduciéndose en una recuperación sensorial y motora.
Experiencia de nuestro grupo de investigación
Nuestro grupo de investigación ha realizado estudios acerca de las posibilidades terapéuticas
del empleo de CMM en las secuelas de las lesiones cerebrales crónicamente establecidas, con
el objetivo fundamental de encontrar tratamientos paliativos útiles para abordar el grave
problema médico y social que representan los accidentes de tráfico que se acompañan de
trauma craneoencefálico grave.
Recientemente, nuestro grupo de investigación ha desarrollado un modelo experimental de
lesión traumática cerebral y hemos demostrado que la administración intralesional de CMM es
útil para paliar las secuelas crónicamente establecidas tras un TCE grave, abriendo así la
puerta a nuevos estudios en este campo con posible aplicación en pacientes discapacitados
tras un accidente de tráfico causante de grave daño cerebral (Bonilla et al, 2009).
Sin embargo, antes de plantearnos el inicio de ensayos clínicos en humanos, se hace preciso
conocer nuevos datos acerca de la potencial utilidad de estas nuevas técnicas, y entre ellos
conocer algunos indicios que nos permitan una aproximación a problemas como cuáles serían
las características de déficit funcional más susceptibles de mejora y si todos los pacientes con
graves secuelas serían candidatos a este tipo de terapia.
El Objetivo principal de nuestro estudio sería hacer un estudio experimental que
permita responder a la cuestión acerca de si existe un determinado grado de severidad de
lesión neurológica, a partir de la cual no es esperable ninguna recuperación de las secuelas de
los traumatismos craneoencefálicos mediante técnicas de terapia celular.
MATERIAL Y MÉTODOS
Modelo experimental de TCE
Para el presente estudio se realizará un modelo de traumatismo cerebral adaptado de un
protocolo previamente descrito en la literatura para inducir lesiones traumáticas en ratas Wistar
adultas (Zurita et al, 2006). Los animales (hembras adultas) serán anestesiados con isoflurano
y sometidos posteriormente a una craneotomía de 10 mm de diámetro sobre el hueso parietal
derecho del cráneo, entre las suturas lambda y bregma. Tras la exposición de la dura madre
cortical, se abrirá una ventana sobre la misma con el fin de exponer la corteza cerebral y se
realizarás una lesión cerebral traumática por contusión, reproduciendo el mismo tipo de daño
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cerebral que suele producirse en pacientes, en el caso de un traumatismo craneoencefálico en
el curso de un accidente de tráfico.
Se produce una lesión cerebral traumática dejando caer, desde una altura de 15 cm, sobre la
superficie del cerebro, una barra de 12 mm de diámetro y 25 g de peso. Esta barra es guiada
en su caída a través de un cilindro hueco, adaptado al área de la craneotomía y que permite
realizar una lesión estandarizada que se define como el producto del peso de la barra por la
Modelo de TCE en ratas dónde se muestra en la figura A el modelo de
lesión traumática y en la B la zona de la craneotomía.
Zona de la
craneotomía.
A B
Rata Wistar a la que se le acaba de realizar un
traumatismo en el hemisferio derecho del
cerebro.
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altura desde la cual se deja ésta caer. Con este modelo experimental, logramos producir una
lesión cerebral grave. Tras la cirugía, las ratas serán colocadas en una cámara con
temperatura y humedad controladas, realizándose cuidados postoperatorios acordes con la
situación clínica de las mismas y procedimientos diarios de vigilancia.
Evaluación de la función neurológica
Para llevar a cabo el seguimiento de la función motora y sensorial se realizan un total de 2 test
diferentes con el fin de detectar los posibles cambios en la función neurológica:
Escala de valoración sensitivo-motora.
Valoración en el test Video-tracking-Box (VTB)
Los test se realizarán 10 veces antes del TCE, con el fin de establecer los valores basales de
los animales, posteriormente se realizará un seguimiento dos veces por semana durante los
dos meses que siguen al desarrollo de la lesión cerebral.
La experiencia con este modelo experimental, que hemos obtenido tras más de 3 años de
estudios previos en esta línea de investigación, es que aunque se realiza una lesión traumática
estandarizada, las secuelas funcionales son variables, debido a la concurrencia de daño
traumático en sí mismo, y un daño vascular, preferentemente causado por la contusión
hemorrágica que se produce, y que es diferente de unos animales a otros. Esto condiciona que
con el mismo tipo de severidad de trauma, podamos encontrar, a largo plazo, diferente grado
de secuelas neurológicas, en cuanto a severidad de las mismas.
Lesiones cerebrales producidas tras el traumatismo craneoencefálico en fase aguda (izda) y en un estadío crónico (dcha).
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Escala de valoración sensitivo-motora
La evaluación neurológica se realizará a través de la modificación de un test descrito
previamente en la literatura, el test MNSs (Chen et al, 2001b).
Dicho test modificado cuenta con una serie de valoraciones que abarca la función motora,
sensorial, test de equilibrio de la viga y medida de ausencia de reflejos. Consta de una
puntuación máxima de 19 puntos, donde se establece una serie de categorías de gravedad de
la lesión según la puntuación obtenida:
1 a 6 puntos, lesión leve.
7 a 12 puntos, lesión moderada.
13 a 19 puntos, lesión severa.
Test sensorial y motor Puntos
Test motor
Levantando la rata por el rabo
- Flexión de los miembros traseros - Flexión de los miembros delanteros - El animal está rotado
1
1
1
Escala de valoración sensitivo-motora donde se muestra el test de la viga donde en A
se ve un animal antes de realizarle la lesión y en B un animal lesionado que no es
capaz de mantener el equilibrio.
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Para una evaluación más objetiva, hemos utilizado un segundo test, que utiliza un programa de
ordenador, vinculado a un vídeo-seguimiento (test VTB) para estudiar la función neurológica en
los animales. Este nuevo método cuantifica adecuadamente los parámetros relacionados con la
actividad locomotora y la orientación en ratas con lesiones cerebrales. Este método ha sido
utilizado en nuestro laboratorio con el fin de medir el resultado del comportamiento después de
Situando la rata en el suelo
- Camina normal - Inhabilidad para caminar recto - Circular hacia el lado parético )
0
1
2
Test
sensorial
Test de orientación (Visual y Táctil ) 1
Test propioceptivo ( sensibilidad profunda) 1
Test del
equilibrio
en la viga
Mantener el equilibrio con postura firme 0
Agarrarse al costado de la viga 1
Abrazado a la viga y 1 de los miembros cae de la viga 2
Abrazado a la viga y 2 de los miembros caen de la viga, o gira en la
viga (>60 Seg) 3
Conseguir el equilibrio en la viga pero cae fuera (>40 Seg) 4
Conseguir el equilibrio en la viga pero cae fuera (>20 Seg) 5
Caer fuera; no consigue el equilibrio o queda colgado de la viga (< 20
Seg) 6
Ausencia
de reflejos
Reflejo pinna (Sacudida de cabeza cuando tocamos oreja) 1
Reflejo corneal (Parpadeo del ojo cuando lo rozamos con un algodón ) 1
Reflejo Susto ( Respuesta motora cuando hacemos ruido con las
palmas de las manos ) 1
Inmovilidad y mirada fija 1
Temblor (Sacudida de “perro mojado”) 1
Irritabilidad, crísis epilépticas, clonus y miodistonía (espasticidad) 1
Puntuación máxima 19
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una lesión cerebral causada por una hemorragia intracerebral en ratas Wistar adultas (Otero y
cols, 2010). El test VTB permite analizar las imágenes de la actividad de los animales en una
plataforma. Definimos las diferentes áreas dentro de la plataforma, para determinar las
diferencias en el movimiento y la orientación de los animales en la zona interna y zona externa
de la plataforma. Las ratas sin lesión cerebral prefieren zona externa, mientras que los
animales con la lesión cerebral penetran y permanecen más tiempo en la zona interna. Se
estudia el tiempo que los animales pasan en la zona interna (tiempo de permanencia, izPT) y
este valor se considera un índice de actividad y orientación.
Establecimiento de los diferentes niveles de daño cerebral crónico
Cuando los resultados de los test fueron analizados (MNSs e izPT) se establecieron tres
niveles de gravedad de lesión cerebral crónica: leve, moderado y grave.
En el diagrama de resultados en el test MNSs observamos tres picos: el primero corresponde a
los animales que obtienen menos de 4 puntos en la prueba MNSs (6 ratas) el segundo pico
tiene un rango entre 4-10 puntos (33 animales) y el tercer pico correspondió a los animales
con más de 10 puntos en la prueba MNSs (11 ratas). Los animales con menos puntuación
(primer pico) fueron considerados como un grupo de lesiones leves. Los animales en el
segundo pico fueron considerados en el grupo de lesiones moderadas. Por último, los animales
del tercer pico fueron considerados como pertenecientes al grupo de lesión grave.
El estudio del diagrama de frecuencias izPT obtenido con el VTB también mostró una
tendencia a mostrar tres picos. El primer pico corresponde a los animales que permanecen
menos de 4 segundos en la zona interna de la caja del VTB-test (6 ratas). El segundo pico (4 a
15 segundos) se consideró integrado por 35 ratas. El último pico corresponde a los animales
con más tiempo en la zona interna, del VTB, con más de 15 segundos (9 ratas). Al igual que
con el test MNSs, asociamos un grado de lesión cerebral con los picos obtenidos en el
diagrama. El primer pico, correspondiente a los animales que permanecen menos tiempo en la
zona interna, se consideró el grupo de lesiones leves. Los animales en el segundo pico fueron
asignados al grupo de lesiones moderadas. Por último, el tercer pico. con los animales que
más tiempo pasan en la zona interna, fue asignado al grupo de lesiones graves.
Debido a que había animales que habían obtenido un grado de lesión cerebral diferente en
ambas pruebas funcionales (MNSs y izPT), hemos establecido criterios para determinar el
grado definitivo de déficit neurológico (lesión leve, moderada lesión y lesión grave). Los
animales con lesiones leves en ambas pruebas en general, fueron eliminados del estidio (6
ratas). Para definir los criterios de lesión moderada se determinó que los animales deben estar
en el grupo “moderado” de al menos una de las pruebas neurológicas (29 ratas). Los animales
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con la clasificación de lesión severa en una de las dos pruebas fueron asignados al grupo de
lesión grave (15 animales).
Obtención y aislamiento de las CMM
Las CMM se obtuvieron de ratas Wistar adultas de 200-250 g de peso y se expandieron in vitro
durante 4 semanas. Con una jeringa de 1 ml y una aguja de calibre 21, médula ósea completa
fue extraida asépticamente de la tibia y el fémur. Ambos extremos de los huesos se cortan y la
médula se empuja con 5 ml de medio de alfa-MEM (Lonza Group Ltd, Suiza). La médula ósea
fue disociada mecánicamente para obtener una mezcla homogénea. La suspensión celular fue
filtrada a través de una malla de 70 de nylon y se colocó en un frasco de 75 cm2 para el cultivo
con 12 ml de medio alfa-MEM que contiene 20% de suero fetal bovino (FBS, Lonza Group Ltd,
Suiza), 2 mM L- glutamina, 100 unidades / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina y 25
ng / ml de anfotericina B). Las células se incubaron a 37 º C en 5% de CO2 durante 3 días. En
este momento, las células no adherentes son removidas mediante la sustitución del medio. El
medio de cultivo fue reemplazado tres veces a la semana.
Después de que los cultivos primarios alcanzaron la confluencia, se lavaron tres veces con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se disociaron con solución de tripsina 0,25% y 1
mM EDTA durante 5 min a 37 º C. Las células se lavaron dos veces con medio de alfa-MEM /
2,5% de SFB a 1000 rpm durante 5 minutos y fueron cultivadas a 37 º C en 5% de CO2.
Preparación y caracterización de los trasplantes
Para obtener las CMM para los trasplantes, las células correspondientes a un P1 se lavaron
tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se disociaron con solución de
tripsina 0,25% y 1 mM EDTA durante 5 min a 37 º C. El cultivo, que mostró una viabilidad de
más del 96%, se inyecta en la cavidad cerebral traumática.
A B C
Obtención de las CMM del estroma de la médula ósea de ratas macho dónde se muestra en la figura A el lavado de las
diáfisis con medio alfa-MEM completo/20%FBS, en la figura B se muestra la disgregación mecánica de la médula ósea
obtenida y en la C el flitrado de la suspensión celular a través de una malla de nylon de 70 µm.
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Los estudios de citometría se realizaron en un citómetro de flujo para la caracterización de
CMM. Para el análisis de citometría de flujo, las células se despegaron con tripsina y se
marcaron con isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) o Alexa 647 como
anticuerpos primarios conjugados (Ab). Se estudiaron como marcadores CD11b, CD29, CD31,
CD45 y CD90 con un control de isotipo adecuado (todos de AbD Serotec, Oxford, Reino
Unido). Un control de isotipo apropiado (ABD Serotec) se incluyó en cada experimento.
Más del 95% de la población CMM debe expresar CD29 y CD90. Además, estas células no
deben tener expresión (≤ 5% positivo) de CD11b, CD45 o CD31. Los datos recogidos fueron
analizados con el software CXP (versión 2.1, Beckman Coulter Inc.).
Trasplante intracerebral de CMM y grupos experimentales
Para el trasplante intracerebral, 2 meses después del TCE, se hizo una incisión de 1 cm sobre
el lugar de la craneotomía para exponer la cavidad post-traumática y el tratamiento intralesional
se realizó administrando CMM de acuerdo con lo referido en el apartado anterior. Para definir
los grupos experimentales, las ratas correspondientes a lesiones consideradas moderadas y
severas fueron divididas aleatoriamente en dos grupos, respectivamente: aproximadamente el
50% de las ratas de cada nivel se separaron para el grupo de terapia CMM mientras que el otro
50% de cada nivel para el grupo control (administración de solución salina). Las ratas en el
grupo de lesiones leves fueron eliminadas del estudio.
Evaluación de la función neurológica después de los tratamientos
Para realizar la evaluación de la función neurológica después de los tratamientos, todas las
ratas fueron estudiadas con las mismas pruebas para el establecimiento de grados de déficit
neurológico (MNSs y izPT). Se estudiaron cada semana durante los dos meses siguientes a la
administración de CMM intracerebral o de solución salina, en los grupos de lesiones
moderadas y graves.
Estudios morfológicos
Cuatro meses después de la lesión cerebral y dos meses después de la administración de
CMM o de solución salina en los grupos moderados y graves, todas las ratas se sacrificaron
para estudiar los aspectos macroscópicos e histológicos de los cerebros. Para el sacrificio, los
animales fueron anestesiados con sevoflurano 8% en un flujo continuo de oxígeno de 3 l / min,
y perfundidos transcardialmente con 20 ml de solución salina con heparina seguida de 120 ml
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de paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M (pH 7,4). Los cerebros fueron fijados en formol al 4%
durante 1-2 días a temperatura ambiente, y bloques de tejido conteniendo la zona de lesión
fueron procesados para estudios histológicos.
El volumen de la lesión se calculó sobre cortes histológicos de acuerdo con la ecuación V
(mm3) = d2 (mm2) xD (mm) / 2, donde d y D son los diámetros menores y mayores de la
lesión, respectivamente (Houchens, 1978; Morales y cols, 2002).
Análisis estadístico de la eficacia de la terapia celular
El análisis estadístico de los datos referentes al comportamiento de los animales en grupos
controles y tratados fue realizado con el sistema SPSS, utilizando el análisis de ANOVA para
datos paramétricos. En estos estudios, un valor de p ≤ 0,05 fue considerado significativo.
RESULTADOS
Mortalidad y evaluación neurológica precoz
Para producir la lesión traumática cerebral, se utilizaron 62 ratas. Murieron 9 ratas durante la
cirugía o pocas horas después del procedimiento (mortalidad de 14,52%). Después de la lesión
se detectó un déficit neurológico evidente en todos los animales. Tres ratas se sacrificaron por
su incapacidad para ser independientes, una semana después de la lesión (mortalidad del
Cronologia del estudio. Tiempo de evolucion de los animales, momento de
evaluacion funcional y de la eficacia del tratamiento.
15
4,84%). Con nuestro modelo experimental, el porcentaje de mortalidad final obtenido fue del
19.36 %.
Caracterización de las CMM utilizadas
Para el tratamiento se utilizaron células con fenotipo mostrando CD29 y CD90 (≥ 95% positivo)
y sin expresión de CD11b, CD45 o CD31 (≤ 5% positivo). En nuestros estudios el perfil
fenotípico de las células administradas mostró expresión de marcadores: CD29 (99,5%), CD90
(99,3 %), CD11b (1,0%), CD45 (4.2 %) y CD31 (0,3%).
Establecimiento de los grupos experimentales de tratamiento
El número de animales y el tratamiento específico para cada grupo fue el siguiente: El grupo de
animales con lesiones moderadas (n = 29), se dividió en dos grupos: Grupo 1 (n:14) en el que
cada animal recibió CMM (5x106 CMM en solución salina, con un volumen total de 50 L, que se
inyectan directamente en el núcleo de la lesión dos meses después de lesión cerebral
traumática) y Grupo 2 (n: 15), como grupo control, cuyos animales recibieron el mismo volumen
que en el grupo 1, pero sólo solución salina. El grupo de lesiones graves estaba constituido por
15 animales y se dividió en; Grupo 3 (n:6) cuyos animales recibieron CMM con las mismas
pautad ya descritas, y Grupo 4 (n:9) controles, que recibieron solo solución salina.
Establecimiento de los grados de lesion de acuerdo a los tests utilizados A: MNSs. B: Tiempo de permanencia en zona interna del VTB test.
16
Neurological
deficit mNSS (points)
izPT (seconds)
Number of
animals
Experimental
groups
Classification
criteria
Mild lesion < 4 < 4 N=6 Animals that left
the study
Animals with mild classification
in both tests.
Moderate lesión 4-10 4-15 N=29 Group 1 CMM n=14
Group 2 Saline n=15
Animals with moderate classification at
less in one of the neurological tests, and
never obtained severe classification.
Severe lesión > 10 > 15 N=15
Group 3 CMM n=6
Group 4 Saline n=9
Animals with severe classification
at less in one of the neurological tests
Evolución de la función neurológica
Dos meses después de los tratamientos (cuatro meses después de la lesión) se obtuvieron los
resultados funcionales de los cuatro grupos experimentales de ambas pruebas neurológicas.
Cuando las pruebas MNSs fueron valoradas, se observó que en el grupo de lesión grave, o
severa, la evolución de los animales tratados con CMM fue similar a la evolución de los
controles (p ≥ 0.05) en todos los momentos del estudio. Sin embargo, en el grupo de animales
con lesión moderada la administración de CMM sí obtuvo diferencia significativa (* p <0.05)
Criterios para determinar el grado de lesion neurológica de acuerdo con los tests utilizados.
Caracterizacion de las CMM utilizadas, de acuerdo a la citometría de flujo.
17
entre animales tratados con CMM o controles. Esta observación se detectó ya a las 6 semanas
tras la administración de CMM.
Recuperacion funcional en los diferentes grupos y subgrupos experimentales.
18
Estudio morfológico de la zona de lesión
Al final del estudio, todos los animales fueron sacrificados para realizar el estudio macroscópico
de la zona de lesión. Los animales del grupo de lesión moderada tenían una cavidad
postraumática de menor tamaño que los animales con lesión severa (p<0.05). La cavidad
postraumática correspondía a la evolución de una zona de necrosis, donde histológicamente se
iodentificaban macrófagos y células astrocitarias reactivas. Comparando los subgrupos de
animales tratados con CMM o que recibieron solo solución salina, se apreció en los primeros
un mayor número de vasos sanguíneos, relacionable con la capacidad de inducir angiogénesis
atribuida a las células madre estromales.
Imagenes del cerebro en los diferentes grupos y subgrupos experimentales. No se observaron diferencias en el volumen de la lesión entre animales tratados con CMM o con solución salina.
19
DISCUSION
Es bien sabido que la lesión cerebral traumática es la principal causa de muerte y discapacidad
en personas menores de 25 años de edad (Langlois y colsl, 2006; Tagliaferri y cols, 2006;
Thurman y Guerrero, 1999) y cuando las secuelas se han establecido, no hay tratamiento
eficaz para promover la recuperación funcional, excepto la rehabilitación (Beauchamp y colsl,
2008; Narayan y colsl, 2002; Royo y cols, 2003). Por lo tanto, el TCE es un problema de salud
importante y una enorme carga socioeconómica. El desarrollo de nuevas modalidades de
tratamiento para pacientes con TCE abren un futuro terapéutico prometedor con un gran
beneficio clínico y económico.
El primer objetivo de este estudio fue establecer una escala para clasificar los diferentes
niveles de déficit neurológico en un modelo experimental de lesión cerebral traumática. Las
Imagenes microscópicas representativas. Solo se observaron diferencias significativas sobre la angiogénesis en los animales tratados con CMM
20
características más comunes y debilitantes en los sobrevivientes de un trauma cerebral son los
déficits cognitivos y trastornos motores. Los modelos animales han sido ampliamente
empleados (Morganti-Kossmann y cols, 2010; Schwarzbach y cols, 2006), pero pocos estudios
han investigado los efectos de diferentes terapias en relación con la gravedad de la lesión
cerebral y esta posible influencia no ha sido previamente estudiada en los protocolos de terapia
celular.
Tsenter y cols (2008) definen la severidad del trauma a través de pruebas realizadas con el test
MNSs en ratones 1 hora después del TCE. Un trauma leve corresponde a una puntuación
inferior a 5; un trauma moderado, a las puntuaciones de 5-6, un trauma severo, a las
puntuaciones de 7-8, y un trauma fatal o casi fatal, puntuaciones de 9-10. Más recientemente
Schwarzbold y cols (2010) utilizan esta clasificación para estudiar diferentes secuelas
asociadas con lesión cerebral en ratones. La evaluación neurológica realizada 1 hora después
del trauma mostró que la gravedad del TCE se relacionaba con elpeso con el cual se
provocana la lesión contusiva, de acuerdo al modelo de Allen. En nuestra experiencia, sin
embrgo, se pueden obtener diferentes niveles de gravedad de TCE, en cuanto a secuelas
neurológicas, con el mismo modelo de impacto traumático, lo que está de acuerdo con algunos
autores que señalan secuelas diferentes utilizando similares modelos de lesión traumártica
(Jones y cols, 2008; Pandey y cols 2009,).
En nuestro estudio analizamos la evolución de los déficits neurológicos en los primeros dos
meses después del traumatismo cerebral. El TCE es un proceso complejo que incluye la lesión
primaria y secundaria, y la activación del mecanismo intrínseco de la regeneración (Cernak,
2005; Reilly, 2001). Los días siguientes a la lesión traumática cerebral, todos nuestros animales
tenían evidentes déficits neurológicos. Durante la semana después del trauma cerebral se
detectaron diferencias en la evolución de las secuelas, las cuales fueron representadas en la
diferente clasificación del grado de lesión. Es posible que estos hallazgos estén relacionados
con la evolución de la lesión secundaria, y se ha establecido que los daños secundarios,
pueden contribuir significativamente a la discapacidad neurológica post-traumática (DeKosky y
cols, 1998). En modelos animales, el control de la evolución de la lesión secundaria es difícil de
realizar.
En nuestro estudio hemos determinado tres niveles de daño cerebral: lesiones leves, lesiones
moderadas y graves lesiones. Nuestra clasificación es ligeramente diferente a la de otos
autores porque utiliza una escala de déficit sensorial modificada (nuestro test MNSs) y un
nuevo test (prueba de VTB), más objetiva, para evaluar la lesión cerebral. En la fase de lesión
leve, los animales tenían pocas deficiencias neurológicas y estos animales se sacaron del
estudio, ya que estos animales tienen una recuperación espontánea de la función neurológica
durante el tiempo de evolución, similar a lo que ocurre en un TCE leve en humanos, y ha sido
documentado en estudios de TCE en ratones (Flierl y cols, 2009).
21
El segundo y principal objetivo de nuestro estudio fue conocer si el grado de déficit neurológico
influye en la eficacia de la terapia con CMM después de daño cerebral establecido. En las
fases aguda y subagudas el beneficio terapéutico de la terapia celular en la lesión cerebral
traumática es ya conocido y aceptado sobre modelos experimentales, aunque estas nuevas
tácnicas no se utilizan aún en humanos y están limitadas a escasos Ensayos Clínicos,
considerados por tanto como estudios de investigación clínica.
El tratamiento con CMM después de un TCE ha demostrado una mejora en el resultado
funcional en ratas (Bonilla y coll, 2009, Lu y col, 2001b; Mahmood y coll, 2001; Mahmood y col,
2002) y su uso tiene un gran potencial para aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, ningún
estudio ha investigado el efecto de la terapia celular en la lesión traum´stica cerebral
establecida en función del grado de severidad de las secuelas neurológicas. En el presente
estudio, hemos llevado a cabo la administración tardía de CMM en una etapa de secuelas
establecidas, sobre animales con daño cerebral moderado y grave. Nuestro modelo
experimental de lesión cerebral causa la pérdida de tejido cerebral y anomalías de
comportamiento que son evidentes en todos los animales inmediatamente después de un
trauma, pero difieren en la gravedad entre los grupos experimentales.
Una vez que el tratamiento se realizó, hemos obtenido resultados diferentes después de la
administración intracerebral de CMM según que analizáramos el grupo de animales con
secuelas moderadas o con secuelas severas. En el grupo de lesión severa, la administración
de CMM o de solución salina mostró una evolución neurológica similar, sin modificar el déficit
funcional establecido. En el grupo de lesión moderada, el trasplante intracerebral de CMM
mostró una recuperación evidente y progresiva de funciones neurológicas, a partir de unas
pocas semanas después del procedimiento. Este hallazgo sugiere por primera vez en la
literatura, una relación entre el grado de daño cerebral y la eficacia de la terapia celular con
CMM sobre las secuelas neurológicas crónicamente establecidas. En nuestro estudio, las CMM
logran recuperación neurológica en el caso de lesiones neurológicas moderadas, pero no en el
caso de lesiones severas, y probablemente estos datos están condicionados por la evolución
de la lesión secundaria. La lesión secundaria se produce después de un trauma cerebral y
evoluciona durante las horas, días y semanas después del trauma. Se inicia con el daño
oxidativo que induce procesos inflamatorios y la activación del mecanismo de muerte celular
apoptótica (Chong y col, 2005; Darwish y col, 2007; Werner y Engelhard, 2007). Muchas
cascadas fisiopatológicos pueden contribuir a la lesión secundaria después (Xiong y col,
2009a). Los resultados de este estudio contribuyen a conocer los beneficios potenciales de las
CMM en el tratamiento de la lesión cerebral traumática crónica.
Por otra parte, la evaluación del comportamiento es un punto clave en la evaluación del daño
cerebral (Fujimoto y col, 2004). Las diferencias de resultados entre lesiones moderadas y
22
severas, es posible que se relacionen con la severidad de la lesión secundaria en el grupo de
daño traumático severo, lo que puede limitar la eficacia de la terapia celular.
En el estudio histológico no hubo diferencias entre los grupos de lesión grave y moderada
aunque en el caso de animales tratados con CMM se observó un mayor grado de angiogénesis
que en los subgrupos de animales controles correspondientes. En estudios previos de nuestro
grupo, la co-localización de CMM trasplantados y Neu-N o GFAP apoyó la supervivencia a
largo plazo y la transdiferenciación de las CMM trasplantadas en el cerebro lesionado, junto
con un aumento de la neurogénesis endógena (Bonilla et al, 2009), pero el escaso número de
células trasplantadas que se encuentra en estos estudios no puede ser responsable de la
mejora de los resultados funcionales observados después del trasplante. Parece ser que las
CMM secretan varios factores de crecimiento (Chen et al, 2002; Chopp et al, 2002; Mahmood
et al, 2004; Yoshimura et al, 2003) que se relacionan con la mejoría de las secuelas
neurológicas. Las CMM también inducen a las células intrínsecas del cerebro para producir
estos factores de crecimiento (Mahmood et al, 2004) que a su vez promueven la
sinaptogénesis, la angiogénesis y la neurogénesis (Chen et al, 2006; Bonilla et al, 2009). Por lo
tanto, es evidente que diversos mecanismos de recuperación pueden desempeñar un papel
después del trasplante, incluyendo la expresión de factores neurotróficos, o la activación de
mecanismos endógenos capaces de restaurar las funciones neurológicas que habían sido
suprimidas (Vaquero y Zurita, 2009).
Aunque estos resultados iniciales parecen prometedores, se necesitan más estudios. Uno de
los problemas a considerar en este estudio es la reducción del volumen de las cavidades
postraumáticas. La administración de CMM por sí mismas no parece reducir significativamente
el volumen de la lesión después de un TCE. En una revisión reciente sobre las perspectivas
actuales del tratamiento de lesiones en el SNC hemos señalado (Vaquero y Zurita, 2009, 2010)
que el tamaño de las lesiones cerebrales y su variabilidad parecen ser determinantes en la
eficacia de las terapias celulares, y es necesario por tanto encontrar matrices biológicas que
permitan la supervivencia celular y la diferenciación de las células madre trasplantadas. Del
mismo modo, el número crítico de CMM que sean necesarias para restablecer el déficit
funcional después de un traumatismo cerebral experimental representa una de las principales
cuestiones por resolver (Vaquero y Zurita, 2010). Independientemente del número de células
administradas varios factores están presentes en el tejido del huésped, la mayoría de los
cuales relacionados con la fisiopatología de la lesión traumática, que disminuyen la
supervivencia de las células trasplantadas. Si podemos mejorar la supervivencia y la
integración de las células en el tejido lesionado se podría disminuir la cavidad postraumática y
mejorar los resultados funcionales. El reciente hallazgo en nuestro laboratorio de que las
matrices de soporte celular derivados del plasma son muy útiles en el logro de este objetivo
(Zurita et al, 2010) ofrece nuevas perspectivas en este apasionante campo de investigación.
23
Recientemente se han iniciado protocolos de terapia celular para el TCE en humanos (Zhang et
al, 2008, Cox et al, 2011). No se observó toxicidad inmediata o diferida relacionada con la
administración de CMM y parece haber indicios de eficacia terapéutica. Aunque la aplicación
de estas técnicas a pacientes está empezando, es obvio que todavía no se tienen los
conocimientos necesarios acerca de la fisiopatología de la lesión cerebral traumática y cómo
estas células madre adultas funcionan y cómo podemos optimizar los resultados
experimentales, aparentemente buenos. Nuestro estudio aporta una visión preclínica
importante, por cuanto nos lleva a tener en cuenta que la intensidad del trauma cerebral y
consecuentemente sus secuelas puede tener una cxlara influencia en la eficacia terapéutica de
estas nuevas técnicas que indudablemente serán aplicadas en un futuro inmediato a pacientes
con secuelas neurológicas causadas por un traumatismo craneoencefálico causado por un
accidente de tráfico.
CONCLUSIONES
Nuestros resultados confirman la posibilidad de recuperar parcialmente las secuelas
neurológicas tras un TCE por medio de las modernas técnicas de terapia celular con células
madre adultas, obtenidas del estroma de la médula ósea. Sin embargo, este efecto terapéutico
parece estar limitado por el grado de lesión neurológica, ya que en el caso de lesiones graves,
con importantes secuelas postraumáticas, la terapia celular no parece ser eficaz. Estas
observaciones deben ser tenidas en cuenta, ya que se están iniciando Ensayos Clínicos que
tratan de confirmar en humanos la eficacia que la terapia celular parece mostrar en estudios
experimentales preclínicos y que serán aplicados en un futuro próximo como tratamiento de las
secuelas neurológicas derivadas de los accidentes de tráfico.
BIBLIOGRAFIA Allen AR. Surgery of experimental lesión of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. JAMA 1911; 57:878-80. Andres RH, Guzman R, Ducray AD, Mordasini P, Gera A, Barth A, Widmer HR, Steinberg GK. Cell replacement therapy for intracerebral hemorrhage. Neurosurgical Focus 2008; 24(3&4), E15. Bajetto A, Bonavia R, Barbero S, Florio T, Schettini G. Chemokines and their receptors in the Central Nervous System. Frontiers in Neuroendocrinology 2001;22:147-184. Beauchamp K, Mutlak H, Smith WR, Shohami E, Stahel PF. Pharmacology of traumatic brain injury: where is the “golden bullet”? Mol Med 2008; 14:731–40. Bhang SH, Lee YE, Cho SW, Shim JW, Lee SH, Choi CY, Chang JW, Kim BS. Basic fibroblast growth factor promotes bone marrow stromal cell transplantation-mediated neural regeneration in traumatic brain injury. Biochemical Biophysiology Research Commun 2007; 359:40-45.
24
Bonilla C, Zurita M, Otero L, Aguayo C, Vaquero J. Delayed intralesional transplantation of bone marrow stromal cells increases endogenous neurogenesis and promotes functional recovery after severe traumatic brain injury. Brain Inj. 2009; 23: 760-769. Brazelton TR, Rossi Fabio MV, Keshet GI, Blau HM. From marrow to brain: expression of neuronal phenotypes in adult mice. Science. 2000;290:1775-1779. Bruns J, Hauser WA. The Epidemiology of Traumatic Brain Injury: A Review. Epilepsia 2003;44(10):2-10. Cernak I. Animal Models of Head Injury. NeuroRx: The Journal of the American Society for Experimental Neuro- Therapeutics 2005; 2: 410-22. Chen J, Chopp M. Neurorestorative treatment of stroke: cell and pharmacological approaches. NeuroRx 2006; 3:466–73.
Chen J, Li Y, Wang L, Lu M, Zhang X, Chopp M. Therapeutic benefit of intracerebral transplantation of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Journal of Neurological Sciences 2001a;189:49-57. Chen J, Li Y, Wang L, Zhang X, Lu D, Lu M, Chopp M. Therapeutic benefit of intravenous administration of bone marrow stromal cells after cerebral ischemia in rats. Stroke 2001b;32:1005-1011. Chen J, Sanberg PR, Li Y, Wang L, Lu M, Willing AE, Sanchez-Ramos J, Chopp M. Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats. Stroke 2001; 32(11):2682-8. Chen X, Iwata A, Nonaka M, Browne KD, Smith DH. Neurogenesis and glial proliferation persist for at least one year in the subventricular zone following brain trauma in rats. Journal of Neurotrauma 2003;20:623-631. Chen X, Katakosky M, Li Y. Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts: growth factor production. Journal of Neuroscience Research 2002;69:687-691. Chong ZZ, Li F, Maiese K. Oxidative stress in the brain: novel cellular targets that govern survival during neurodegenerative disease. Prog Neurobiol 2005; 75: 207–46. Chopp M, Li Y. Treatment of neural injury with marrow stromal cells. Lancet Neurol 2002; 1: 92–100. Chopp M, Zhang X, Li Y, Wang L, Chen J, Lu D, Lu M, Rosemblum M. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cells transplantation. Neuroreport 2000; 11:3001-3005. Cox CS Jr, Baumgartner JE, Harting MT, Worth LL, Walker PA, Shah SK, Ewing-Cobbs L, Hasan KM, Day MC, Lee D, Jimenez F, Gee A. Autologous bone marrow mononuclear cell therapy for severe traumatic brain injury in children. Neurosurgery 2011; 68: 588-600. Darwish RS, Amiridze N, Aarabi B. Nitrotyrosine as an oxidative stress marker: evidence for involvement in neurologic outcome in human traumatic brain injury. J Trauma 2007; 63: 439–42. DeKosky ST, Kochanek PM, Clark RS, Ciallella JR, Dixon CE. Secondary injury after head trauma: subacute and long-term mechanisms. Semin Clin Neuropsychiatry 1998; 3:176 –85. Flierl MA, Stahel PF, Beauchamp KM, Morgan SJ, Smith WR, Shohami E. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc 2009; 4: 1328–37.
Friedenstein AJ, Gorskaja JF, Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. Experimental Hematology 1976;4:267-274. Fujimoto ST, Longhi L, Saatman KE, Conte V, Stocchetti N, McIntosh TK. Motor and cognitive function evaluation following experimental traumatic brain injury. Neurosci Biobehav Rev. 2004; 28: 365-78.
Gao J, Prough DS, McAdoo DJ, Grady JJ, Parsley MO, Ma L, Tarenko YI, Wu P. Transplantation of primed human fetal neural stem cells improves cognitive function in rats after traumatic brain injury. Experimental Neurology 2006; 201:281-292.
Hawthorne, G., Gruen, R.L., and Kaye, A.H. Traumatic brain injury and long-term quality of life: findings
from an Australian study. J. Neurotrauma 2009; 26:1623–33.
25
Hofstetter C P, Schwartz E J, Hess D, Widnfalk J, El Manira A, Prockop Dj, Olson L. Marrow stromal cells from guiding strans in the injured spinal cord and promote recovery Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 2002, 99:2199-2204. Hong Shen L,
Li Y, Chen J, Zacharek, Gao A, Kapke A, Lu M, Raginski
K, Vanguri P, Smith
A, Chopp M.
Therapeutic benefit of bone marrow stromal cells administered 1 month after stroke. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism, 2007;27:6-13. Houchens DP. Therapy of human tumors in athymic (nude) mice. Procceding of the Symposium on the use of athymic nude mice in cancer research. PP 266-280 Ed. Gustav Fischer. New York, 1978. Jeong SW, Chu K, Jung KH, Kim SU, Kim M, Roh JK. Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage. Stroke 2003; 34:2258-2263. Jones NC, Cardamone L, Williams JP, Salzberg MR, Myers D, and O’Brien TJ. Experimental traumatic brain injury induces a pervasive hyperanxious phenotype in rats. J. Neurotrauma 2008; 25: 1367–1374. Langlois JA, Rutland-Brown W, Wald MM. The epidemiology and impact of traumatic brain injury: a brief overview. J Head Trauma Rehabil 2006; 21:375–8. Lois C, Alvarez-Buylla A. Proliferating subventricular zone cells in the adult mammalian forebrain can differentiate into neurons and glia. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 1993;90:2074-207. Longhi L, Watson DJ, Saatman KE, Thompson HJ, Zhang C, Fujimoto S, Royo N, Castelbuono D, Raghupathi R, Trojanowski JQ, Lee VM, Wolfe JH, Stocchetti N, Mcintosh TK. Ex vivo gene therapy using targeted engrafment of NGF-expressing human NT2N neurons attenuates cognitive deficits following traumatic brain injury in mice. Journal of Neurotrauma 2004;21:1723-1736. Lu D, Goussev A, Chen J, Pannu P, Li Y, Mahmood A, Chopp M. Atorvastatin reduces neurological deficit and increases synaptogenesis, angiogenesis, and neuronal survival in rats subjected to traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma 2004a;21:21-32.
Lu D, Li Y, Wang L, Chen J, Mahmood A, Chopp M. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a
rat model of traumatic brain injury. J Neurotrauma 2001a;18:813-819.
Lu D, Mahmood A, Chopp M. Biological transplantation and neurotrophic induced neuroplasticity after traumatic brain injury. Journal of Head Trauma Rehabilitation 2003;18:357-376. Lu D, Mahmood A, Qu C, Goussev A, Lu M, Chopp M. Atorvastatin reduction of intracranial hematoma volume in rats subjected to controlled cortical impact. Journal of Neurosurgery 2004b;101:822-825. Lu D, Mahmood A, Qu C, Goussev A, Schallert T, Chopp M. Erythropoietin enhances neurogenesis and restores spatial memory in rats after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma 2005;22:1011-1017.
Lu D, Mahmood A, Wang L, Li Y, Lu M, Chopp M. Adult bone marrow stromal cells administered
intravenously to rats after traumatic brain injury migrate into brain and improve neurological outcome.
NeuroReport 2001b;12:559-563.
Lu J, Moochhala S, Moore XL, Ng KC, Tan MH, Lee LK, He B, Wong MC, Ling EA. Adult bone marrow
cells differentiate into neural phenotypes and improve functional recovery in rats following traumatic brain
injury. Neuroscience Letters 2006;398:12-17.
Mahmood A, Lu D, Chopp M. Intravenous administration of marrow stromal cells (MSCs) increases the expression of growth factors in rat brain after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma 2004; 21:33-39.
Mahmood A, Lu D, Lu M, Chopp M. Treatment of traumatic brain injury in adult rats with intravenous administration of human bone marrow stromal cells. Neurosurgery 2003;53:697-702.
Mahmood A, Lu D, Qu C, Goussev A, Chopp M. Treatment of traumatic brain injury with a combination therapy of marrow stromal cells and atorvastatin in rats. Neurosurgery 2007;60:546-553.
26
Mahmood A, Lu D, Wang L, Chopp M. Intracerebral transplantation of marrow stromal cells cultured with neurotrophic factors promotes functional recovery in adult rats subjected to traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma 2002;19:1609-1617.
Mahmood A, Lu D, Wang L, Li Y, Lu M, Chopp M. Treatment of traumatic brain injury in female rats with
intravenous administration of bone marrow stromal cells. Neurosurgery 2001;49:1196-203; discussion
1203-4.
Masuda T, Isobe Y, Aihara N, Furuyama F, Misumi S, Kim T, Nishino H, Hida H. Increase in neurogenesis and neuroblast migration after a small intracerebral hemorrhage in rats. Neuroscience Letters 2007;425:114-119. Mezey E, Chandross KJ, Harta G, Maki RA, Mckercher SR. Turning blood into brain: cells bearing neuronal antigens generated in vivo from bone marrow. Science. 2000; 290: 1779-1782. Miles DK, Kernie SG. Activation of neural stem and progenitor cells after brain injury. Progress in Brain Research 2006;157:187-197. Morales C, Zurita M, Vaquero J. Antitumoral effect of irinotecan (CPT-11) on an experimental model of maligna neuroectodermal tumor. J Neuro-oncol 2002; 56:219-226. Morganti-Kossmann MC, Yan E, Bye N. Animal models of traumatic brain injury: is there an optimal model to reproduce human brain injury in the laboratory? Injury 2010; 41:S10-S13. Narayan RK, Michel ME, Ansell B, Baethmann A, Biegon A, Bracken MB, et al. Clinical trials in head injury. J Neurotrauma 2002; 19:503–57. Otero L, Zurita M, Aguayo C, Bonilla C, Rodríguez A, Vaquero J. Video-Tracking-Box linked to Smart software as a tool for evaluation of locomotor activity and orientation in brain-injured rats. J Neurosci Methods 2010; 188:53-7. Pandey DK, Yadav SK, Mahesh R, Rajkumar R. Depression-like and anxiety-like behavioural aftermaths of impact accelerated traumatic brain injury in rats: a model of comorbid depression and anxiety? Behav Brain Res 2009; 205, 436–42. Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissue. Science 1997;276:71-74. Qu C, Lu D, Goussev A, Schallert T, Mahmood A, Chopp M. Effect of atorvastatin on spatial memory, neuronal survival, and vascular density in female rats after traumatic brain injury. Journal of Neurosurgery 2005;103:695-701. Qu C, Mahmood A, Lu D, Goussev A, Xiong Y, Chopp M. Treatment of traumatic brain injury in mice with marrow stromal cells. Brain Res 2008; 1208:234–9. Reilly PL. Brain injury: the pathophysiology of the first hours. “Talk and Die revisited.” J Clin Neurosci 2001; 8:398–403. Richardson RM, Sun D, Bullock MR. Neurogenesis after traumatic brain injury. Neurosurgery Clinics of North America 2007;18:169-181. Romanko MJ, Rola R, Fike JR, Szele FG, Dizon ML, Felling RJ, Brazel CY, Levinson SW. Roles of the mammalian subventricular zone in cell replacement after brain injury. Progress in Neurobiology 2004;74:77-99. Royo NC, Shimizu S, Schouten JW, Stover JF, McIntosh TK. Pharmacology of traumatic brain injury. Curr Opin Pharmacol 2003; 3:27–32. Saatman KE, Contreras PC, Smith DH, Raghupathi R, McDermott KL, Fernandez SC, Sanderson KL, Voddi M, McIntosh TK. Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) improves both neurological motor and cognitive outcome following experimental brain injury. Experimental Neurology 1997;147:418-427. Sánchez-Ramos J, Song S, Cardozo-Pelaez F, Stedeford T, Willing A, Freemant B, Saporta S, Janssen W, Patel N, Cooper D R, Sanberg P R. Adult bone marrow stromal cells differentiate into neural cells in vitro. Experimental Neurology 2000;164:247-256.
27
Schwarzbach E, Bonislawski DP, Xiong G, Cohen AS. Mechanisms underlying the inability to induce area CA1 LTP in the mouse after traumatic brain injury. Hippocampus 2006; 16, 541–50. Schwarzbold ML, Rial D, De Bem T, Machado DG, Cunha MP, dos Santos AA, dos Santos DB, Figueiredo CP, Farina M, Goldfeder EM, Rodrigues ALS, Prediger RDS, Walz R. Effects of traumatic brain injury of different severities on emotional, cognitive, and oxidative stress-related parameters in mice. J Neurotrauma 2010; 27:1883–93. Sundholm-Peters NL, Yang HK, Goings GE, Walker AS, Szele FG. Subventricular zone neuroblasts emigrate toward cortical lesions. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 2005;64:1089-1100. Tagliaferri F, Compagnone C, Korsic M, Servadei F, Kraus J. A systematic review of brain injury epidemiology in Europe. Acta Neurochir (Wien) 2006; 148:255–68. Thurman D, Guerrero J. Trends in hospitalization associated with traumatic brain injury. Journal of American Medical Association 1999; 282:954–7. Tsenter J, Beni-Adani L, Assaf Y, Alexandrovich AG, Trembovler V, Shohami E. Dynamic changes in the recovery after traumatic brain injury in mice: effect of injury severity on T2-weighted MRI abnormalities, and motor and cognitive functions. J Neurotrauma 2008; 25: 324–33. Urrea C, Castellanos DA, Sagen J, Tsoulfas P, Bramlett HM, Dietrich WD. Widespread cellular proliferation and focal neurogenesis after traumatic brain injury in the rat. Restorative Neurology and Neuroscience 2007;25:65-76. Vaquero J, Zurita M. Bone marrow stromal cells for spinal cord repair: a challenge for contemporary neurobiology. Histology and Histopathology 2009;24:107-116. Vaquero J, Zurita M. Functional recovery after severe CNS trauma: Current perspectives for cell therapy with bone marrow stromal cells. Prog Neurobiol, 2010 Dec 14. [Epub ahead of print]. Werner C, Engelhard K. Pathophysiology of traumatic brain injury. Br J Anaesth 2007; 99:4–9. Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate to neurons. Journal of Neuroscience Research 2000;61:264-370. Xiong Y, Mahmood A, Chopp M. Emerging treatments for traumatic brain injury. Expert Opin Emerg Drugs 2009a; 14:67-84. Yoo SW, Kim SS, Lee SY, Kim HS, Lee YD, Suh-Kim H. Mesenchymal stem cells promote proliferation of endogenous neural stem cells and survival of newborn cells in a rat stroke model. Experimental and Molecular Medicine 2008;40:387-397. Yoshimura S, Teramoto T, Whalen MJ, Irizarry MC, Takagi Y, Qiu J, Harada J, Waeber C, Breakefield XO, Moskowitz MA. FGF-2 regulates neurogenesis and degeneration in the dentate gyrus after traumatic brain injury in mice. J Clin Invest 2003; 112:1202–10. Yoshizaki T, Inaji M, Kouike H, Shimazaki T, Sawamoto K, Ando K, Date I, Kobayashi K, Suhara T, Uchiyama Y, Okano H. Isolation and transplantation of dopaminergic neurons generated from mouse embryonic stem cells. Neurosciences Letters 2004;363:33-37. Zhang H, Huang Z, Xu Y, Zhang S. Differentiation and neurological benefit of the mesenchymal stem cells transplanted into the rat brain following intracerebral hemorrhage.Neurological Research 2006;28:104-112. Zhang ZX, Guan LX, Zhang K, Zhang Q, Dai LJ. A combined procedure to deliver autologous mesenchymal stromal cells to patients with traumatic brain injury. Cytotherapy 2008;10:134–9. Zhou Z, Chen H, Zhang K, Yang H, Liu J, Huang Q. Protective effect of nerve growth factor on neurons after traumatic brain injury. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology 2003;14:217-224. Zimmet JM, Hare JM. Emerging role for bone marrow derived mesenchymal stem cells in myocardial regenerative therapy. Basic Research in Cardiology 2005;100:471. Zurita M, Aguayo C, Oya S, Vaquero J. Implicación de factores neurotróficos en la transdiferenciación neuronal de células madre mesenquimales adultas. Mapfre Medicina 2007a; 18(3):201-208.
28
Zurita M, Bonilla C, Otero L, Aguayo C, Vaquero J. Neural transdifferentiation of bone marrow stromal cells obtained by chemical agents is a short-time reversible phenomenon. Neuroscience Research. 2008a;60(3):275-280. Zurita M, Otero L, Aguayo C, Bonilla C, Ferreira E, Parajon A, Vaquero J. Cell therapy for spinal cord repair: optimization of biologic scaffolds for survival and neural differentiation of human bone marrow stromal cells. Cytotherapy 2010; 12, 522–537.
Zurita M, Vaquero J, Oya S, Bonilla C, Aguayo C. Neurotrophic Schwann-cell factors induce neural differentiation of bone marrow stromal cells. Neuroreport 2007b; 18:1713-1717.
Zurita M, Vaquero J. Bone marrow stromal cells can achieve cure of chronic paraplegic rats: functional and
morphological outcome one year after transplantation. Neurosci Lett 2006; 402: 51-6
Zurita M, Vaquero, J, Bonilla C, Santos M, De Haro J, Oya S, Aguayo C. Functional recovery of chronic paraplegic pigs after autologous transplantation of bone marrow stromal cells. Transplantation 2008b; 86:845-853.