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Marín De Luna Lorena.

88339740.

8 41 05 56.

Ing. Bioquímica Industrial.

Ciencias Biológicas y de la Salud.

Iztapalapa.

99-1.

Identificaci6n microbiana de importancia clínica.

Instituto Nacional de Cancerología.

15 de Junio de 1998.

1 5 de Diciembre de 1998.

lB1.020.98

COORDMACION DE SEPTMeOS DOCUMENTAlES - BIBLIOTECA

Jefe de Laborat Instituto Naciona Universidad Autónoma Metropolitana4

Marín e Luna Lorena P

iNDlCE 222131

Introducción ............................................................................................. 1

1 . Generalidades ...................................................................................... 2

1 . 1 . Siembras ................................................................................. 3 1.2. Urocultivos ................................................................................ 5 1.3. Hemocultivos ............................................................................. 6 1.4. Cultivos diversos ........................................................................ 7 1.5. Método de Kirby-Bauer .............................................................. 1 0

2.Objetivos ............................................................................................ 13

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 . Metodología 14

3 . 1 . Siembras. ............................................................................... 14

3.2. Análisis de los medios de cultivo inoculados ................................... 17 3.2.3. Urocultivos .................................................................. 17 3.2.4. Hemocultivos ............................................................... 17 3.2.5. Cultivos diversos ........................................................... 17

3.6. Identificación de bacterias .......................................................... 18 3.3. 1 . Preparación de la suspensión bacterial ............................... 18 3.3.2. Adición de la suspensión a las placas inoculadoras .............. 18

3.3. Identificación de levaduras ......................................................... 20 3.4.4. Preparación del inoculo .................................................. 20 3.4.5. Inoculación del panel ..................................................... 21 3.4.6. I ncu bación .................................................................. 21

3.7. Examen de sensibilidad antimicrobial ........................................... 21

3.8. Método de Kirby-Bauer .............................................................. 21 3.6.9. Preparación del inoculo .................................................. 22 3.6.1 O . Prueba de antibióticos .................................................. 22 3.6.11. Medida de los diámetros de zona .................................... 23

3.12. Prueba de catalasa ................................................................. 23

3.13. Prueba de la oxidasa ............................................................... 23

4 . Actividades realizadas .......................................................................... 24

5 . Objetivos y metas alcanzadas ................................................................ 24

6 . Resultados ......................................................................................... 25 6.7. Siembras ................................................................................ 25 6.8. Urocultivos .............................................................................. 26 6.9. Hemocultivos ........................................................................... 30 6.1 O . Cultivos diversos .................................................................... 33

7 . Conclusiones ...................................................................................... 48

8 . Criterios de evaluación .......................................................................... 48

9 . Bibliografía ......................................................................................... 49

Bacteriología juega un papel muy importante en el Instituto Nacional de Cancerología (INCan) porque es en donde se lleva a cabo la identificación de los microorganismos patógenos que afectan tanto a pacientes ambulatorios corno a hospitalizados ayudando así al medico para el mejor tratamiento del paciente.

Las muestras se clasifican en urocultivos (cultivos de orina), hemocultivos (cultivos de sangre) y cultivos diversos (ejemplo, exudado vaginal, secreción, exudado nasal, entre otros).

Las muestras son llevadas al laboratorio en donde se cultivan (inoculación de los medios), en los diferentes medios de cultivo, y se incuban a 35°C de 18 a 24 horas, dependiendo de la muestra. Pasado este tiempo se analizan los cultivos para observar si hubo crecimiento bacterial. Si hubo suficiente crecimiento, se lleva a cabo la identificación de la bacteria así como el análisis de la sensibilidad a diferentes antibióticos de dichas bacterias, aunque se consideran algunos criterios para decidir si se realiza o no la identificación a pesar de que haya suficiente crecimiento: puede ser que la caja se contamino durante la inoculación, puede ser flora normal, etc.

En muestras de pacientes que estén en tratamiento medico o inmunosuprimidos cualquier crecimiento es importante (aunque sea poco) y hay que realizar la identificación de la bacteria, ya que dicha bacteria se puede estar haciendo multirresistente.

Las bacterias que más afectan a pacientes son Bacilos Gram Negativos (BGN), luego le siguen los Cocos Gram Positivos (CGP) y finalmente las levaduras (LEV). Por ejemplo, en urocultivos el BGN que más se identifica, afectando a más pacientes, es la Escherichia coli, con un porcentaje de 75 a 80 de frecuencia en relación a otras bacterias y los pacientes son generalmente mujeres.

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1 .GENERALIDADES

En nuestro cuerpo existe una gran flora bacterial que es normal para éI, pero cuando por alguna razón el sistema de defensa del cuerpo falla o se hace débil, algunas bacterias de esta flora encuentran las condiciones optimas para su crecimiento invadiendo el organismo causando alguna enfermedad. A los pacientes que tienen afectado su sistema de inmunidad se les llama inmunosuprimidos (por ejemplo, los que sufren de leucemia o SlDA ) y son los pacientes que se atienden en el Instituto Nacional de Cancerología (INCan), ya que de alguna manera es un problema de cáncer. En el INCan se cuenta con una sección de Bacteriología en donde se realiza la identificación de las bacterias que afectan a los pacientes con el fin de ayudar al medico para la mejor atención de los enfermos.

Gran parte de los bacilos entéricos gramnegativos que son patógenos para los humanos o que habitan en el tracto gastrointestinal normal pertenecen a la familia Enterobacteriaceae. Los géneros de esta familia están a su vez divididos en cinco tribus: Escherichieae, Klebsiellae, Proteae, Yeminieae y Erwinieae. Todas las especies de esta familia son anaerobios facultativos gramnegativos que fermentan la glucosa.

Las enterobacterias son bioquímicamente muy activas y fermentan un elevado número de carbohidratos. Existen otras pruebas bioquímicas que también se utilizan para identificar y diferenciar especies.

La fermentación de la glucosa es una característica de todas las enterobacterias. Como consecuencia de esta fermentación se producen ácidos orgánicos tales como el láctico, fórmico y acético. Algunas especies también producen gas hidrógeno y gas dióxido de carbono durante la fermentación de la glucosa.

La fermentación de la lactosa se utiliza para clasificar las enterobacterias en dos grupos: las fermentadoras de lactosa y las no fermentadoras de lactosa. Se han desarrollado diversos medios selectivos y diferenciales para la separación de estos grupos, posiblemente el que se utiliza más comúnmente es el agar de MacConkey.

El genero Pseudomonas y otros géneros de la familia Pseudomonadaceae son bacilos gramnegativos aerobicos obligados. Algunas especies de esta familia son causales de enfermedades en humanos. La Pseudomonas aeruginosa es el agente etiológico más común de enfermedades en humanos.'

I Kingsbury, David T. '"and de Microbiología Médica" Vol. 2. Primera edición. Limusa. Mthico, D.F. 1 9 9 1 . P ~ s . : 171-172.

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El departamento de bacteriología del Instituto Nacional de Cancerología se divide en cuatro secciones, estas son: siembras (inoculación de las muestras), urocultivos, hemocultivos y cultivos diversos.

Siembras. Los medios que se utilizan para realizar la siembra y el cultivo de las muestras se clasifican según el uso a que se destinan :

Medios enriquecidos. Medios diferenciales o de aislamiento. Medios selectivos e inhibitorios. Medios de transporte y mantenimiento. Medios de uso general.’

En general, el medio selectivo se define como aquel que permite el desarrollo de ciertos organismos, a la vez que permite o retarda el de otros. La selección se efectúa mediante (1) el control de los ingredientes del medio, (2) la alteración de los componentes atmosféricos o (3) el ajuste de temperatura de incubación. Por otro lado, el medio diferencial, que puede evitar el desarrollo de diversos organismos, hará que ciertas colonias se desarrollen de un modo distinto (se diferencien) a otros organismos presentes. En este caso, la diferencia se debe a la presencia de ciertos compuestos en el medio y a factores ambient ale^.^

El propósito de los medios de cultivo es respaldar el desarrollo de los microorganismos, además de exhibir una morfología colonial y microscópica típica. Las variaciones en la composición del medio pueden alterar estas características. Los medios que se utilizan en el Instituto son los siguientes:

El medio Agar Sangre es un medio enriquecido de uso general, en este medio crecen todas las bacterias grampositivas y gramnegativas, así como hongos y levaduras, la suplementación del medio con un seis por ciento de sangre, proporciona un mejor crecimiento a los microorganismos más difíciles de crecer. Se incuba a 37°C durante 24 horas.

Agar MacConkey, es un medio selectivo ya que sólo crecen bacilos gram negativos, (contiene sales biliares que inhiben el desarrollo de cocos grampositivos), también recomendado para aislamiento y diferenciación de microorganismos fermentadores y no fermentadores de lactosa. Las colonias de los microorganismos que no fermentan la lactosa son incoloras así como el medio de cultivo (lactosa negativa), y las que si fermentan la lactosa son color rosa al igual que el medio ( lactosa positiva). El medio se incuba a 37°C durante 24hrs.

* Manual de Bacteriología del INCan.

págs. 61,65, 145. Wktreich,George A. ‘‘Prácticas de Laboratorio en Microbiología.’’ 2’ Edición. Limusa. México, D. F. 1983,

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Agar Chocolate, es un medio enriquecido de uso general, se utiliza para procedimientos cualitativos, como el aislamiento y el cultivo de microorganismos de difícil crecimiento. Este medio se debe de incubar a 37°C por 24 hrs., y colocarse en atmósfera de COZ al 10% para bacterias que necesitan COZ para su crecimiento ( los medios ya inoculados se introducen en una "jarra" - frasco - junto con una vela se tapa la "jarra" y se coloca en la incubadora).

Agar Sabouraud, en placa, es un medio selectivo, es útil para el desarrollo de hongos y levaduras, ya que es un medio que contiene cicloexamida, antibiótico que evita el desarrollo bacteriano. El medio se incuba a 37°C durante 24hrs., y también requiere una atmósfera de COZ al 10%

Sabouraud en tubo, tiene la misma función que el Sabouraud en placa, la diferencia que existe es que al inocular la muestra, obtendremos un desarrollo optimo de las colonias, debido a que el agar se mantiene en posición vertical, además estas se mantienen por mayor tiempo en incubación, sin que el medio se llegue a deshidratar, aproximadamente mes y medio.

Agar S.S. (Salmonella - Shigella), es un medio altamente selectivo que inhibe el desarrollo de la mayoría de los coliformes y permite el de especies de Salmonella y Shigella, de muestras clínicas. Las altas concentraciones de sales biliares y citrato de sodio inhibe a la mayoría de las bacterias gram positivas y gram negativas.

Caldo Selenito, es usado como medio de enriquecimiento para el aislamiento de Salmonella y algunas especies de Shigella (para resiembras), provenientes de muestras de materia fecal, agua, alimentos y otras muestras sanitarias.

Agar Loweinstein-Jensen, medio en tubo, es un medio enriquecido para bacilos alcohol ácido resistentes, género de micobacterias. Se deja en incubación de uno a dos meses a una temperatura de 35°C.

Agar Mueller - Hilton, medio recomendado para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana por difusión radial (antibiograma).

Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI), es un medio líquido enriquecido con el propósito de usarlo en el cultivo de microorganismos difíciles y no difíciles, incluyendo bacterias aerobias y anaerobias, a partir de una variedad de muestras clínicas y sanitarias. Este es, además usado para preparar el inoculo empleado en pruebas de susceptibilidad antimicrobiano. El caldo BHI es usado para el cultivo de una gran variedad de microorganismos incluyendo bacterias, levaduras y hongos. También puede ser un medio de transporte de muestras.

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Urocultivos. El urocultivo es el cultivo bacteriológico de la orina, esto es para poder determinar si existe una posible infección de vías urinarias y cual es el agente causal, es posible identificar tanto bacterias como levaduras aunque no se puede conocer el nivel exacto; por lo que se incluye cualquiera de las siguientes infecciones: infección renal (pielonefritis) de vejiga (cistitis), o de uretra (uretritis).

Las partes que integran las vías urinarias son: uretra, uréteres y riñones. La infección de la vía urinaria (IVU) se diagnóstica con base a la sintomatología y en los datos de laboratorio que sean significativos. Aunque una serie de factores físicos, anatómicos y metabólicos predisponen a la IVU.

La manipulación fisica con aparatos mecánicos tales como catéteres, sondas e hisopos pueden introducir microorganismos a la uretra y vejiga, lo que da como resultado la IVU. En la mujeres el uso inadecuado de tampones, lavados e hisopos vaginales puede producir la inoculación de la punta de la uretra con flora vaginal nativa.

Las anormalidades en la estructura anatómica de las vías urinaria especialmente aquellas que producen obstrucción o reflujo y vaciamiento incompleto de la orina, predispone a la {VU. La presencia frecuente, recurrente y crónica de la IVU sugiere la posibilidad de que exista una anormalidad anatómica.

También los trastornos metabólicos pueden predisponer a la IVU; por ejemplo, la diabetes melitus incrementa de manera importante el riesgo de una infección. Los cálculos renales, entidades que impiden el funcionamiento normal de los riñones y que resultan de trastornos metabólicos, también incrementan el riesgo de infección urinaria.

Los pacientes hospitalizados tienen un mayor riesgo de desarrollar IVU en comparación con los pacientes ambulatorios. A pesar de las precauciones en la técnica de asepsia y el mantenimiento, los pacientes con catéteres fijos inevitablemente desarrollan IW. El riesgo de una infección aumenta de acuerdo con el tiempo en que esté colocado el catéter

El hallazgo de una bacteriuria (bacterias en orina), no autoriza a concluir se trate de una infección urinaria. En la actualidad se tiende a enjuiciar su valor clínico mediante el cultivo cuantitativo de la orina sospechosa. Debe recogerse directamente la orina, despreciando la inicial de una micción y recogiendo durante ella el chorro intermedio de la orina, prescindiendo también de la final. Se ha llegado a la conclusión de que si el cultivo arroja una cifra de bacterias inferior a 10 mil por ml, la infección urinaria no es probable. Entre 10 O00 y 100 000, es probable y por encima de 100 O00 la infección es prácticamente ~egura .~

4 Keingsbury, David T. “Manual de Microbiología Médica.” vo1.3, 1’ edición. Limusa. México, D.F. 1 9 9 1

Balcell Gorina, Alfonso. “La clínica y el laboratorio, interpretación de análisis y pruebas funcionales.” 14O pags. 403404,4334336,

edición. Marín. Mexico, D. F. 1986. Pags: 45-46.

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Hemocultivos. Se realiza este cultivo bacteriológico de sangre para determinar el crecimiento bacteriano y/o de levaduras en sangre, ya que esta es un fluido estéril. Se indican hemocultivos cuando hay sospecha de bacteremia y10 septicemia.

Bacteremia, se refiere a la condición en la que hay presencia de bacterias en la sangre. La bacteria puede introducirse en la circulación por medios físicos (por ejemplo, traumatismo), o puede propagarse al flujo sanguíneo desde un foco de infección. En Europa, la bacteremia se diferencia de la septicemia porque en la primera no hay sintomatología clínica importante. Estudios recientes indicaron que bacterias como Staphylococcus epidermidis, Bactemides melaninogenicus y Clostridium perfringes con frecuencia pueden obtenerse de la sangre de individuos aparentemente normales. La bacteremia es una condición transitoria o temporal.

Septicemia (tres o más focos infecciosos) hace referencia a algo más que la simple presencia de bacterias en el torrente sanguíneo. En la septicemia, las bacterias en realidad deben estar reproduciéndose y creciendo. Desde el punto de vista clínico, la septicemia implica que está desarrollándose una enfermedad, pudiéndose presentar toxemia. La presencia de toxemia implican que las bacterias están creciendo y produciendo un efecto tóxico. AI igual que la bacteremia, el agente etiológico puede introducirse mediante traumatismo o propagación de las bacterias a partir de un foco infeccioso. La septicemia tiende a ser una condición persistente, hasta la aplicación de una terapia efectiva o la muerte del paciente.

Por lo general, el término bacteremia gramnegativa se reserva para aquellos casos de bacteremia producida por miembros de las familias Entembacteriaceae y fseudomonadaceae. Con frecuencia el tracto intestinal y urinario, además de la piel, son los sitios donde se propaga la infección.

Fiebre, es el resultado de cualquier alteración de la actividad termorreguladora del hipotálamo.

Sepsis, presencia de microorganismos patógenos en tejidos.

Asepsis, eliminación de microorganismos patógenos en tejidos.

Debido a que la bacteremia es intermitente, deben de hacerse más de un hemocultivo por paciente para así tener mayor oportunidad de aislar algún microorganismo. La punción debe efectuarse durante el periodo de escalofrío y pico febril del enfermo; entre una toma y la siguiente debe de esperarse por lo menos media hora y hacerse en una localización diferente (por ejemplo, brazo derecho y luego izquierdo).

En el INCan existe un procedimiento bacterioldgico, inoculando de 8 a 10 ml de sangre, este es el Sistema Bactec 9120. El sistema Bactec ha sido diseñado para la detección automatizada y temprana de microorganismos presentes en sangre y líquidos de origen estéril por medición de COZ. Cuando los

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microorganismos están presentes en la muestra, metabolizan los nutrientes que se encuentran en el medio de cultivo, liberando dióxido de carbono al medio. El colorante del sensor de la botella reacciona con el C02 y modula la cantidad de luz que es absorbida por el material fluorescente, en el sensor. El foco detector del instrumento mide el nivel de fluorescencia el cual corresponde a la cantidad de COS liberado por los microorganismos. Esta medición se interpreta por el sistema de acuerdo a los parámetros de positividad preprogramados. En el sistema la computadora efectúa el diagnóstico a acuerdo a las instrucciones de operación del instrumento. El instrumento inicia un commiento continuo automático. La luz emitida por los diodos (LEDs) que está detrás de las botellas en la hilera, activa el sensor fluorescente de las mismas. Después de un período de incubación, el foto detector lleva las lecturas que son transmitidas al sistema de cómputo. Un ciclo de lectura de todos las hileras se completa cada 10 minutos. Los cultivos positivos son inmediatamente localizados por un indicador de luz en la parte frontal del instrumento y aparece en la pantalla del monitor. Cuando las botellas son identificadas como positivas, estas se sacaran del instrumento para resultados de confirmación, aislamiento de identificación del microorganismo. La temperatura del instrumento es de 35°C.

Los frascos Bactec. son botellas con vacío para diferentes drenados, no requieren unidades de ventilación, botellas con etiquetas con código de barras. Estos medios de cultivos son enriquecidos para que hasta el microorganismo más fastidioso (de difícil crecimiento) pueda reproducirse. Se ofrecen medios de cultivo en su formulación resinas, las cuales tienen las siguientes funciones básicas: bloquear la acción de antimicrobianos presentes en la muestra y lisis de células de la muestra para promover el desarrollo de los microorganismos. La utilización de medios de cultivo con resinas es altamente ventajoso dado el alto índice de muestras que llegan al laboratorio con tratamiento antimicrobiano. Esto incide en una mayor detección de muestras positivas.

Cultivos diversos. En este tipo de cultivos están todas las muestras que no entran en urocultivos y hemocultivos y estos son:

Exudado faringeo, este cultivo es para determinar el tipo de bacteria cuando existen abscesos, úlceras o inflamación en amígdalas o área faringea. Tomar el exudado sin aseo bucal, en ayunas y de preferencia sin tratamiento antimicrobiano previo. El hisopo estéril se pasa suave y rápidamente con un movimiento hacia arriba y hacia abajo, por detrás de la úvula y entre los pilares amigdalinos.

Exudado vaginal, sirve para identificar patógenos de importancia para el área genital como son N. gonorrheae y Haemophilus ducreyi. Así mismo, es de interés bacterias gramnegativos, hongos y levaduras.

Punta de catéter, identificar infecciones relacionadas al catéter, puede tratarse de infección local, celulitis y10 bacteremia. El catéter debe ser retirado previa asepsia del sitio de inserción. Se coloca la punta (cortar con tijeras estériles)

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en tubo estéril, llevándose al laboratorio donde se deberá procesar la muestra io más rápido posible (no mayor a 30 min.).

Expecforacidn y vías respiratorias bajas, el objetivo es determinar la bacteria u hongo causante de infección pulmonar, para esta institución es vital por el gran número de pacientes inmunosuprimidos. La muestra debe ser flema, no saliva, recolectándose en frasco estéril. Debe de hacerse un escrutinio microsujpico haciendo una tinción de gram.

Líquidos corporales (ascitis, pleural, cefaloraquideo), es para determinar si existe infección por bacterias u hongos en la cavidad pleural o abdominal, y meningitis o encefalitis. AI tomar la muestra los líquidos a cultivar se depositan en tubos estériles o jeringas estériles.

Heridas quirúrgicas y abscesos, determinar el tipo de bacteria que existen en el material purulento. La secreción de la herida debe ser tomada con hisopo estéril, sin previo aseo de la región. De los abscesos se toma el material con jeringa estéril.

Coprocultivo, este cultivo sirve para determinar si la diarrea es debida a patógenos bacterianos. La muestra diarreica se debe depositar en un frasco estéril y enviarlo al laboratorio inmediatamente. No se procesan muestras de heces compactas.

Biopsias, se busca crecimiento por hongos, micobacterias y bacterias en diversos tejidos que han sido extraídos quirúrgicamente. En ocasiones este tipo de estudio es necesario postmortem por lo que se pueden recibir gran variedad de tejidos. Las muestras se recolectan en frasco estéril y en BHI, llevándose inmediatamente al laboratorio.

Una vez que las muestras se han sembrado se incuban a 35°C durante 24 horas, pasado este tiempo se revisan las cajas y si se observa crecimiento de microorganismos, se procede a su identificación (se utilizan algunos criterios según sea el caso) y al análisis de sensibilidad a diferentes antibióticos. Esto se realiza con Paneles de Microscan, son unas placas de aproximadamente 15 x 24 cm, que contienen 96 pozos, los paneles están divididos en dos partes: una parte tiene el examen de sensibilidad antimicrobial, los antimicrobianos están deshidratados y están en concentraciones determinadas, de menor a mayor concentración. Estas concentraciones, son las cantidades más pequeñas de agentes quimioterapéuticos requeridos para inhibir el desarrollo del organismo, in vitn>, y se les conocen como Concentraciones Mínimas lnhibitorias (CMI) y la otra parte tiene las bioquímicas para la identificación del microorganismo. Los paneles son leídos en un instrumento llamado Microscan, el cual esta interfasado a un sistema de manejo de datos.

La determinación de CMl’s y la identificación de microorganismos esta basada en la turbidez de los pozos y en los cambios de color de los paneles de

microdilución. Los paneles contienen antimicrobianos en varias concentraciones, la turbidez esta ausente en aquellos pozos en los cuales el desarrollo esta inhibido. La identificación de microorganismos se complementa con la medición de una serie de bioquímicas contenidas en el panel diseñado para la identificación de microorganismos del nivel de especies médicamente significativos. Las bioquímicas al reaccionar con la bacteria provocan un cambio de color debido a : cambios en el pH, adición de reactivo, o a la presencia o ausencia de crecimiento en ciertos pozos.

Paneles para bacterias gramnegativas. Para la identificación de Bacilos gramnegativos fermentadores y no fermentadores se utilizan pruebas convencionales cromogénicas, basadas en cambios de pH, utilización de sustratos y crecimiento en presencia de antimicrobianos después de incubar a 35°C durante 24 hrs en ausencia de COZ. En caso de bacilos gramnegativos provenientes de cultivos urinarios se utiliza el urinario combo 6, y de cualquier otro cultivo se utiliza negativo combo tipo 12, 14.

Figura 1.1 Paneles para identificación de bacterias.

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Panel para identificación rápida de levaduras. Se utilizan pruebas convencionales modificadas y cromógenicas para la identificación de levaduras aisladas de muestras clínicas: El panel es una placa de microdilución de 96 pocillos que utiliza 27 sustratos deshidratados. Unicamente se identifica la levadura.

En las muestras que llegan al laboratorio lo primero que se realiza es una tinción. Las tinciones que se manejan en el laboratorio son: tinción de Gram y tinción Baar. La tinción de Gram se realiza para observar las características morfológicas de las bacterias. Lo cual nos ayuda para una identificación presuntiva del microorganismo.

La tinción de Gram descubierta por Hans Christian Gram, se utiliza para el examen microscópico directo de muestras y subcultivos. En este procedimiento, el frote bacteriano teñido se somete a las soluciones siguientes en el orden que se indica: cristal violeta, solución de yodo, alcohol (decolorante) y safranina. La tinción de Gram nos permite dividir a las bacterias en dos grandes: grupos bacterias grampositivas, son las que retienen el cristal violeta y se observan de color violeta profundo; y las bacterias gramnegativas que no son tefiidas por el cristal violeta y por el contraste de la safranina aparecen rojas.6

La tinción B M R (Bacilos Acido-Alcohol Resistentes). Miembros del género Mycobacterium y ciertas Nocardias sp., poseen grandes cantidades de lípidos, ácidos grasos y parafinas dentro de sus células. Estas substancias impiden la penetración de colorantes al citoplasma por métodos ordinarios. Cuando se someten a altas concentraciones de colorantes básicos con aplicación de calor, se logra su tinción: una vez teñidos, resisten la coloración con una mezcla de ácido alcohol, siendo estos organismos los únicos que resisten. Por ese motivo, estas bacterias se conocen como acidorresistentes , un fenómeno descubierto por Ziel- Neelsen en 1882.’

Cuando un microorganismo es multirresistente, esto es, que no se inhibió su crecimiento con los antibióticos de los paneles, se realiza una prueba de susceptibilidad de difusión en disco (método de Kirby-Bauer). El método de Kirby- Bauer consiste en la difusión radial del antibiótico a través de la superficie húmeda del agar, tan pronto como el disco se coloca en la superficie del agar, el agua es absorbida por el papel y el antibiótico difunde al medio que lo rodea, figura 1.2.

Los discos para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, se utilizan para pruebas semicuantitativas de susceptibilidad in vitro de patógenos bacterianos comunes de crecimiento rápido y de ciertos patógenos bacterianos de crecimiento fastidioso, por medio del procedimiento de prueba de difusión en agar. Estos incluyen las especies de Enterobacteriaceae, Staphylococcus, Pseudomonas, Enterococcus, y algunos estreptococos no enteroccicicos. Los métodos de difusión

Pelczar, Michael J. ‘‘Microbiología.’’ 2 O edición. Mdiraw-HiU. México, 1990. Pag 58-60. Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology (instructivo) 7

de agar que utilizan discos de papel filtro seco impregnados con concentraciones específicas de agentes antimicrobianos se desarrollaron en los años 1940. Para eliminar o reducir al mínimo la variabilidad de esta prueba, Bauer y colaboradores desarrollaron un procedimiento estándar en el que se seleccionó el agar Mueller- Hinton como el medio de esta prueba. Varias agencias reguladoras y organizaciones normativas publicaron más tarde procedimientos de referencia estándar basados en el método de Kirby-Bauer. Entre los primeros y más ampliamente aceptados están los publicados por la U.S. Food and Drug Administration (FAD) y la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Figura 1.2 Principio de difusión de antibióticos en agar. La concentración del antibiótico disminuye a medida que aumenta la distancia del disco.

Los discos que contienen agentes antimicrobianos se colocan en la superficie de las placas de agar Mueller-Hinton inoculadas con cultivos puros de aislados clínicos. Después de la incubación, se examinan las placas y se miden y comparan las zonas de inhibición que rodean los discos con los limites de zona ya establecidos para agentes antimicrobianos individuales a fin de determinar el (los) agente(s) más conveniente(s) en la terapia antimicrobiana. Los discos miden 6 mm y se preparan impregnando papel absorbente de alta calidad con cantidades exactas de antibióticos o de otros agentes quimioterapéuticos. Los discos están

marcados en ambos lados con letras y números que indican el agente y el contenido de la droga?

En Bacteriología se realizan pruebas para la identificación correcta del microorganismo, dichas pruebas son: la prueba de la catalasa y la prueba de la oxidasa.

La prueba de la catalasa, se utiliza para diferenciar entre los géneros: (1) Streptococcus (-) del Micmoccus (+) y10 Staphylococcus (+), (2) Bacillus (+) del Clostridium (-). Esta diferencia se realiza con la presencia de la enzima catalasa.

La enzima catalasa se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo; la excepción principal es el Streptococcus. Por lo general, los organismos que no poseen el sistema citocromo carecen también de la enzima catalasa y por lo tanto no pueden descomponer el peróxido de hidrógeno, que es el reactivo que se utiliza para esta prueba. Cuando se lleva a cabo la reacción hay desprendimiento de gas 02, por lo tanto la prueba es positiva (catalasa positiva) y tenemos la presencia de Staphylococcus, si no hay desprendimiento de gas (catalasa negativa) es Streptococcus.

Con la prueba de la oxidasa se determina la presencia de la enzima oxidasa. Esta prueba se utilizó originariamente para identificar todas las especies de Neisseria, pero más adelante se le usó para diferenciar las Pseudomonadaceae de los miembros oxidasa negativos de las Enterobacteriaceae. Muchos de los bacilos gramnegativos, aparte de las Enterobacteriaceae, tienen una actividad oxidasa variable. Esta prueba también se aplica para ayudar a la identificación de: Aeromonas (+),Neisseria (+), Pseudomonas (+), Yersinia (-),Enterobacteriaceae (-) entre otras. Todas las especies de Pseudomonas y Neisseria producen una enzima oxidasa que, cuando se encuentra en presencia de oxigeno atmosférico, citocromo c y un reactivo oxidasa, oxidan al reactivo para formar un compuesto coloreado. AI realizar estas pruebas ayudamos a una mejor identificación del agente patógeno. ‘ O

* Koneman, Elmer W. “Diagnostico microbiológico, texto y atlas de color” 3 O edición. Panamericana. México, 1997. PQ. 582-583. 9

10 Becton Dickinson Microbiology Systems. Becton Dickinson and Company. hhual, 1998. Mac Faddin, Jean F. ‘‘Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica.“

Editorial Medica Panamericana México, 1990. Pags. 3943,154159.

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2. OBJETIVOS GENERALES

* Apoyo clínico al medico para el diagnostico y tratamiento del paciente en la terapia antimicrobiana.

* Conocer la resistencia a antibióticos de los microorganismos patógenos e informar al departamento de infectología de dicha resistencia para el mejor control de antimicrobianos.

2.1. OBJETIVOS ESPECíFICOS

* Conocer el desarrollo Técnico en el departamento de Microbiología del INCan.

* Identificación de los microorganismos que están involucrados en las infecciones y10 enfermedades de pacientes oncológicos. Así como la respuesta que ellos presentan a los antimicrobianos en el INCan.

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3. METODOLOGíA

Antes de desarrollar la metodología, cabe aclarar que estuve un tiempo determinada en cada sección de Bacteriología. La forma de trabajo fue: siembras, urocultivos, hemocultivos y cultivos diversos. En el esquema 1 se presenta un panorama general del trabajo en Bacteriología.

MUESTRA

UROCULTIVO 4 HEMOCULTIVO CULTIVO DIVERSO

+ CULTIVO

+ IDENTIFICACI~N

.. I I I 1

BGN BGP CGP CGN LEV

SENSiBlLlDAD (en levaduras no)

Esquema 1. Panorama general del trabajo de Bacteriología.

3.1. Siembras.

Las muestra llegan al laboratorio y se eligen los medios de cultivo adecuados, para sembrarlas. La inoculación de los medios con las diferentes muestras se realizan en condiciones estériles ( cerca de un mechero).

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Para la siembra de la muestra de orina, primero se utilizar un asa calibrada de 0.001 ml, luego con otra asa se estría la caja, figura 3. la. La forma de estriar el cultivo de orina se muestra en la figura 3.1 b. Las asas se deben de esterilizar para cada muestra, se ponen a la flama del mechero, con las demás siembras se utiliza un asa no calibrada y la estría es cruzada, figura 3.1 c.

4 asa calibrada

[al

"---o asa no calibrada

Inoculo, urocultivo Estría perpendicular al inoculo

En la tabla 3.1 se indica el tipo de muestra, como se debe de sembrar y los medios que se deben de utilizar.

Tabla 3.1. Metodología que se utiliza para realizar las siembras y los medios de cultivo a utilizar.

Muestra Siembra Laminillas Medio Inoculo recto en medio de la caja con asa calibrada y estriar perpendicularmente al inoculo con otra asa estéril.

Estría cruzada

Estría m a d a

Rotar el cateter sobre el medio, tomarlo con las pinzas

Estría cruzada. Depositar inoculo en tubos de SB* y L-J"

Estría cruzada

Estría cruzada 1 tubo de L-J

Estría cruzada

Estría cruzada con hisopo est6ril. Inocular en caldo selenito

Dejarlo en caldo BHI, 24hrs. Estría cruzada

8 o 10 ml de sangre

Urocultivo

Ex. Faringe0

Ex. Nasal

P. de catéter

LCR, líq. Pleural u otro liq. Estéril

Expectoración

Liq de vias respiratorias bajas

Ex. Vaginal

Coprocultivo

Biopsia Secreciones

Hemocuttivo

- -

Liq. Estéril Todo el líquido se utiliza 2 frotes Fco. De Bactec * Sabouraud Tubo O Medios que se deben incubar en una atm6sfera de CO2

1 frote(Gram)

2 frotes (Gram y BAAR)

2 frotes

2 frotes

1 frote

2 frotes

1 frote (Gram)

G. Sangre

G. Chocolate

G. Sangre G. Chocolate

G. Sangre G. Chocolate

G. Sangre

G. Sangre G. Chocolate Sabouraud O

MacConkey

G. Sangre G. Chocolate Sabouraud MacConkey

G. Sangre G. Chocolate Sabouraud MacConkey

G. Sangre G. Chocolate Sabouraud MacConkey

G. Chocolate Sabouraud S.S.

G. Sangre G. Chocolate Sabouraud MacConkey

Fco. de Bactec

" Lowestein Jenssen Tubo

16

Todos los medios, excepto los hemocultivos, se deben incubar durante 24 horas a 35°C. Los hemocultivos deben incubarse por 5 días a 35°C y los líquidos estériles durante 20 días.

3.2. Análisis de los medios de cultivo inoculados.

Después de incubar los medios, ya inoculados, debe de realizarse un análisis de las diferentes cajas.

3.2.1. Umcultivos.

1. Sacar las cajas de petri de la incubadora. 2. Observar las cajas. 3. Si se observan bacilos gramnegativos, debe de haber una cuenta mayor o igual

a 1 O0 Unidades Formadoras de Colonias (UFC) - 100 O00 col/ml- para poder realizar la identificación.

4. En el caso de observar cocos grampositivos, con cuenta de 10 UFC (1 O O00 col/ml) se realiza la identificación. Se debe tomar en cuenta los resultados del EGO y de como fue tomada la muestra.

5. Si se observan levaduras, se resiembra en Sabouraud y micobiotico, e incubarse por 24 horas a 35°C para obtener un cultivo más puro y poder realizar una mejor identificación.

3.2. l. Hemocuffivos.

1. Sembrar la muestra e introduciría en el equipo Bactec, para su incubación. 2. En caso de que la muestra haya sido sangre, la se le da un tiempo de 5 días al

3. Si hay crecimiento en el transcurso de este tiempo el aparato nos lo indica. 4. En caso de crecimiento, sacar el frasco Bactec y realizar subcultivo en las cajas

correspondientes, incubar las cajas por 24 horas y en incubadora con COZ a 35°C.

5. Después de este tiempo se realiza la identificación de cualquier microorganismo que haya crecido.

6. Si no hubo crecimiento en el frasco, este se saca del aparato y se desecha (después del periodo de protocolo).

7. Si la muestra fue un líquido estéril se incuba durante 20 días. 8. Seguir el mismo procedimiento que la muestra de sangre.

microorganismo para que crezca.

3.2.3. Cultivos diversos.

l. Sacar las cajas de la incubadora. 2. Observar cada una de ellas. 3. Si se observan colonias con morfología características de microorganismos

patógenos se realiza la identificación.

17

3.3. Identificación de bacterias.

Para la identificación de los microorganismos patógenos en urocultivos, hemocultivos y cultivos diversos se sigue el mismo procedimiento. Las levaduras no entran aquí porque se consideran hongos y no bacterias.

3.3. l. Preparación de la suspensión bacterial.

l . Elegir de tres a cinco colonias, de preferencia aisladas, morfológicamente similares.

2. Con una aguja de inoculación picar perpendicularmente a la superficie del agar, las colonias elegidas, como se muestra en la figura 3.3. la; no penetrar el agar, no raspar ni arrastrar la punta cruzando las colonias.

3. La aguja tiene como una especie de collar, quitarlo después de picar las colonias para quitar el exceso del material a analizar, figuras 3.3.1 b y 3.3.1~.

4. Abrir un frasco de inoculación Prompt, que contiene solución estéril (agua desionizada esterilizada). Figura 3.3.1 d.

5. Colocar la aguja de inoculación dentro del frasco y presionar hacia abajo con un movimiento circular para obtener un buen cerrado. Figura 3.3.le.

6. Agitar vigorosamente el frasco por 8 o 1 O seg., para realizar la inoculación de la solución estéril. Figura 3.3. If.

3.3.2. Adición de la suspensión en las placas inoculadoras.

1. Quitar la aguja de inoculación de el frasco y desecharla. 2. Vaciar la suspensión bacterial dentro de la placa inoculadora . Ver figura 3.3.2. 3. Con un microdiluctor tomar la suspensión y colocarla en el panel para la

4. Los paneles se pueden colocar de dos en dos (sobrepuestos) y se colocan en

5. Se incuban de 15 a 24 horas a 35°C. 6. Pasado el tiempo, se sacan de la incubadora y en el lector del Microscan se

realiza la identificación y susceptibilidad del microorganismo. 7. Capturar estos datos en la computadora para llevar un control.

identificación de la bacteria así como su sensibilidad a antibióticos.

bolsas de polietileno para tener una adecuada distribución térmica.

18

Qi

.. * a

Figura 3.3.1 Preparación de la susupensión bacterial, a) picar la colonia; b) y c) quitar el collar; d) abrir el frasco; e)poner la aguja en el frasco 9 ajitar el frasco.

19

r

Figura 3.3.2. Adición de la suspensión en las placas.

3.4 Identificacich de levaduras

La identificación de levaduras es rápida, claro después de obtener un cultivo puro, ya que su identificación se realiza en cuatro horas, después de inoculada la placa.

3.4. I Pmparacidn del inoculo.

l . El panel para identificación de levaduras debe s e r inoculado con organismos que crezcan activamente (de la resiembra).

2. Sacar la muestra de la placa de agar y emulsionar en 3 ml de agua para inóculo (agua desionizada estérilizada en un tubo de 13 x 84 mm). Cada suspensión debe compararse y ser equivalente al Patrón de turbidez de levaduras de Microscan. No tomar agar junto con la muestra.

3. Mezclar la suspensión hasta que se vea homogénea. Utilizar vórtex si es necesario.

20

3.4.2 Inoculación del panel.

Añadir 80 pI de suspensión de levaduras en cada pocillo que contenga sustrato y en los pocillos control.

3.4.3 Incubación.

Apilar los paneles en grupos de dos a tres con una bandeja cubridora encima para evitar la evaporación.

L. incubar los paneles inoculados 4 horas a 35 - 37 "C. 3. Pasando este tiempo, los paneles se sacan de la incubadora y se pueden leer

en el Microscan para la identificación de la levadura.

3.5 Examen de sensibilidad antimicrobial

AI inocular el panel para la identificación, también se inocula la parte de la placa para el examen de sensibilidad. AI leer el panel en el Microscan en la pantalla del monitor aparecen los antimicrobianos como viene en la placa (figura 1 .I). Si hubo crecimiento en el pozo el microorganismo es resistente, si no lo hubo es sensible (la lectura se realiza por Concentraciones Mínimas Inhibitorias.

Se utilizan diferentes combinaciones de antibióticos según sea el panel. En nuestro caso utilizamos los siguientes antibióticos.

Los antimicrobianos para BGN son: tetraciclina, piperacilina, ampiciclina, cefalotina, cefuroxima, ceftriaxone, ceftazidima, gentamicina, tobramicina, amikacina, ciprofloxacina, lomefloxacina, norfloxacina, ofloxacina, trimetoprim/ sulfametoxazole, cefazolina, amoxacilina/ k clavulanato, ampicilinal sulbactama, sulfametoxazole, trimetoprim.

Los antimicrobianos para CGP son: amoxacilind k Clavulanato, ampicilina, cefazolina, cefotaxima, ciprofloxacina, clindamicina, eritromicina, gentamicina, imipenem, nitrofurantoina, norfioxacina, ofloxacina, axacilina, penicilina, piperacilind tazobactama, rifampina, tetraciclina, trimetopriml sulfametoxazole, vancomicina.

3.6 Método de Kirby-Bauer

Este método lo utilizan cuando las bacterias presentan multirresistencia ( no se inhibe su crecimiento con los antibiótiticos presentes en el paneles) o cuando no se realiza la identificación del microorganismo por este sistema.

21

3.6.1 Preparación de/ inoculo.

1. Se toca la superficie de cuatro o cinco colonias de apariencia similar, bien aisladas, de un cultivo en una placa de agar, con un asa de alambre o un hisopo de Dacron, se transfiere el crecimiento a un tubo que contenga 4 o 5 ml. Del medio BHI.

2. Se ajusta la suspensión hasta que la turbidez coincida con el estándar McFarland (ya preparado).

3. Después del ajuste de la turbidez, se sumerge un hisopo de algodón, no tóxico, estéril, en la suspensión del inóculo y se le rota varias veces, ejerciendo una presión firme sobre las paredes internas del tubo para quitar el exceso de líquido.

4. Se inocula la superficie seca de una placa de Mueller-Hinton, a temperatura ambiente, pasando el hisopo tres veces por toda la superficie del agar, rotando la placa aproximadamente 60" para asegurar una distribución pareja del inóculo. Se coloca la tapa de la placa. Se esperan de 3 a 5 min para que la superficie del agar se impregne, antes de colocar los discos de antibióticos.

3.6.2 Prueba de antibióticos.

1. Se colocan los discos impregnados con el antimicrobiano adecuado sobre la superficie del agar mediante una pinza estéril.

2. Se presionan con suavidad los discos sobre el agar para permitir un contacto uniforme, porque parte de la droga difunde casi inmediatamente. Los discos deben tener una distribución pareja sobre el agar, de modo que estén separados por no menos de 24 mm de centro a centro. Figura 3.6.1

3. Se invierten las placas y se incuban a 35" C de 18 a 24 horas. 4. Todo este procedimiento se realiza en condiciones estériles (cerca de un

mechero).

Figura 3.6.1. Colocación adecuada de los sensidiscos.

22

3.6.3 Medida de los diámetros de zona.

1. Medir cuidadosamente la zona de inhibición completa alrededor del disco, mediante reglas o plantillas, con aproximación al milímetro; el diámetro del disco esta incluido en esta medición.

2. Todas las mediciones se toman visualmente. Las placas deben verse en línea directamente vertical para evitar cualquier paralelismo que resulte en falsas lecturas. En la figura 3.6.2 se observa un ejemplo de corno se debe ver la zona de inhibición.

Figura 3.6.2. Ejemplo de corno se debe de observar la zona de inhibición.

3.7 Prueba de la catalasa

1. Con una aguja de inoculación recoger el centro de una colonia pura de 18 a 24 horas de incubación y colocarlo sobre un portaobjetos de vidrio limpio.

2. Agregar una gota de Hz02 sobre el organismo del portaobjetos. Usar un gotero o una pipeta Pasteur. No invertir el orden del método porque pueden producirse resultados falsos positivos. No mezclar con la aguja o el asa de inoculación, no es necesario la mezcla.

3. Observar la inmediata formación de burbujas (liberación del gas). 4. Desechar el portaobjetos poniéndolo en un desinfectante.

23

3.8 Prueba de la oxidasa

1. Colocar un trozo de aproximadamente 6 cm2 de papel filtro de Whatman No. 1

2. Agregar de 2 a 3 gotas del reactivo N,N,N’,N’ - tetrametil p - fenilenediamina

3. Hacer un extendido con el asa de inoculación de una colonia sospechosa, en el

4. La reacción de color positiva se produce a los 5 a 10 seg. 5. Si se observa un color morado la reacción es positiva. En caso contrario no se

en una caja de petri.

(diidrodcloride) en el centro del papel.

papel impregnado con el reactivo.

presenta color.

4. ACTIVIDADES REALIZADAS

Las actividades que se realizaron en el laboratorio fueron:

1. Actividades propias del laboratorio. 2. Acudir a sesiones cada semana donde se exponían diversos temas, de interés

para el laboratorio clínico, por el personal del mismo laboratorio (cada viernes). 3. Los jueves bacteriología tenia sesión, donde cada integrante de este

departamento exponía un tema asignado para ampliar los conocimientos con respecto a bacteriología. Durante mi estancia en el laboratorio expuse en dos ocasiones.

5. OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Los objetivos que se propusieron fueron alcanzados. Además de que pude aprender y aplicar otras técnicas de laboratorio, así como también reafirmé algunos conocimientos que obtuve durante la licenciatura y la aplicación de los mismos.

24

6. RESULTADOS

A continuación presento los resultados que obtuve durante mi estancia en el hospital así como el análisis de los mismos.

6. l . Siembras.

En la tabla 1 se muestra el número de muestras sembradas durante un mes.

Tabla 1. Muestras sembradas.

I Muestras Urocultivos

Coprocultivos

Punta de catéter

Expectoración

Secreciones

Ex. F aringeo

Ex. Vaginal

Ex. Nariz

Ex. Oído

Líq de vías respiratorias

Lavado bronquial

Exudado (secreción de herida)

Biopsia

Hemocultivos

Tinción BAAR

Tinción de Gram

Cantidad de muestras que sembré I 462

27

14

16

20

26

6

4

4

2

2

5

1

20

40 laminillas

30 laminillas

25

6.2. Urocultivos.

Del total de muestras sembradas, que fueron 900, sólo 227 resultaron positivas a las cuales se les realizó el procedimiento de identificación. Las muestras positivas están integradas por 175 bacilos gramnegativos, 41 cocos grampositivos y 11 levaduras.

En la tabla 1 se muestran los nombres y la frecuencia de las bacterias identificadas. En la figura 1 se puede ver la representación gráfica de los resultados, la gráfica 1 están los BGN, los CGP y LEV en las gráficas 2 y 3 respectivamente, en la figura 2.

Tabla 1. Nombre de los microorganismos identificados, así como el número de veces que se identificaron, en muestras de urocultivos.

I BACILO: BACTERWS PATOGENAS cedesea lapapi c. freundii E. agglomemns E. cloacae E. Coli Hafnia alvei K. oxytoca

K ascorbata M. morganii P. tni?ahk P. pennen P. rettgeri P. stuartii P. vulgaris S. matcescens Y. entervbacter A. baumanni A. hili¡ B. pickettii

Pseudomonas sp. P. fluomcens

K m

P,¿#&U@sm -

;RAM NEGATIVOS PACIENTES

EXTERNO ]INTERNO 1 O 3 2 1 O 1 O

78 28 1 O 4 O 12 4 1 O 2 2 3 5 O 1 1 O

cocos- BACTERlAS PAT6GENAs Beta Str non A,B E* E. faecium Pediococcus sp. S- "B S. agalact no H S. agakt H s. h i s S. millen s. sums S. epidennids S. simulans

3" POSITIVOS PACIENTES

EXTERNOS llNTERNOS 1 O 6 4 1 4 1 O 4 O 2 O 2 1 1 O O 1 8 1 3 2 O 1

2 O LEVADURAS 2 O LEVADURAS PACIENTES 1 O 1 O 2

O I 4 O T. gtabmta O ' I c:iirrrpioa9b.

1 1 O I O

Gráfica 2. CGP

Gráfica 3. Levaduras

C. C. T. T. albicans troprcalis glabrata beigelii

LeMduraS

Figura 2. Gráficas: [a] CGP; [b] LEV, pertenecientes a urocultivos

3Q

Las enterobacterias, las cuales son flora nativa del tronco gastrointestinal, producen la mayoría de los casos de Infecciones de Vías Urinarias (IVU).

La mayoría de las muestras que llegan al laboratorio para urocultivos son de pacientes mujeres, el 90%. Las edades de estas oscilan entre 35 y 45 años. Este número de pacientes se divide entre pacientes ambulatorios y pacientes hospitalizados. Como se puede ver en la tabla 1 y figura 1, el agente etiológico más común de la bacteria gramnegativas es la Escbericbia coli, con un alto parcentaje, seguida de Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis y Pseudomonas aeroginosa, esto concuerda con un articulo de investigación del The New England Journal of Medicine.

Es más probable que las mujeres desarrollen la IVU en comparación con los hombres, debido en parte, a que tiene una uretra más corta. Otros factores que aumentan el riesgo de infección, incluyendo las relaciones sexuales, el uso de diafragma y espermicidas (el espermicida induce la colonización de la vagina con la Escherichia colo, micción postcoital retardada e historia de una infección urinaria reciente. Por otra parte, la susceptibilidad podría ser genética, ya que las mujeres que no secretan antígenos de grupo sanguíneo (no secretoras) están entre las que padecen infecciones recurrentes y las células uroepiteliales de dichas mujeres tiene glucolipidos específicos ligados a E. coli que están ausentes en mujeres que secretan antígenos de grupo sanguíneo.

Las IVU son raras en hombres menores de 50 años de edad. Generalmente se han considerado indicativas de una anormalidad urológica que se complica con infecciones. Sin embargo, cepas uropatógenas de E. coli que causan infecciones en mujeres, también las pueden causar a hombres jóvenes. Los factores de riesgo incluyen la homosexualidad (asociada con exposición a E. coli por coito anal), falta de circuncisión (asociada con colonización elevada del glande y del prepucio por €. coh), y tener una pareja con colonización vaginal por uropatógenos.

La bacteriuria asociada con sonda continúa siendo la fuente más común de bacteremia por gramnegativos en pacientes hospitalizados. La bacteria se adhiere a la superficie de los catéteres urinarios e inicia el crecimiento.

Al observar la figura 2, gráfica 2 nos damos cuenta que el Enterococcus faecalis es el agente etiológico más común de bacterias grampositivas, seguido del Staphylococcus epidennidis. Las infecciones causadas por enterococos son difíciles de tratar, por lo que se deben combinar antibióticos para su erradicación .

Con respecto a las levaduras identificadas, misma figura pera gráfica 3, sólo se le informa al medico que levadura se identifico y éI a su juicio decidirá que tratamiento antimicrobiano dar al paciente.

6.3. Hemocultivos

De un total de 208 muestras cult6ivadas, sólo 30 de ellas fueron positivas. De estas 30 muestras se identificaron: 21 bacilos gramnegativos, 9 cocos grampositivos y sólo una levadura. En la tabla 1 presento los nombres de BGN, CGP y LEV identificados así como el número de veces que se identificaron y en la figura 1 , la gráfica1 representa a los BGN y en la gráfica los CGP. En este caso no se presenta gráfica de levaduras pues solamente se identifico a una, en la tabla 1 se presenta el nombre de dicha levadura.

muestras de hemocultivos.

BGN Aer. hydro E. crcraCae E. taylorae E. cdi K. oxytoca K. pneumoniae K . ascorbata S. liquefaciens A. lwofii S. maltophilia

Tabla 1. Nombre de los microorganismos identificados, de

-

P. aerugnosa E. faecium CGP

O 1 O 1

A

PACIENTES EXTERNO I INTERNO

- ~ ~-

O 2 o 3 O 1 O 6 1 1 O 1 O 1 1 O O 1 O 2

O 1

S. hominis-homin O 1 C. tropicalis LEV 1 O

30

222131 Este tipo de cultivo (hemocultivos) generalmente se realiza a pacientes

internos. Cuando se presenta el caso de un paciente externo es porque fue a consulta y se le detecto temperatura alta, y probablemente su catéter esta infectado.

Como se puede ver en la tabla 1 la Escherichia coli es la bacteria que más afecta a los pacientes y esta es muy agresiva ya que son pacientes inmunosuprimidos. También en la tabla se observa que el S. aureus y el S. epidennidis son los que se presentan con mayor frecuencia, coincidiendo con la literatura; el segundo se puede deber a que es un microorganismo presente en la piel por lo que puede infectar el catéter del paciente. Con respecto a las levaduras en este caso sólo una muestra la presento, cabe mencionar que en el tiempo que estuve en esta sección llegaron muy pocas muestras, volviendo con las levaduras estas son muy peligrosas para los pacientes inmunosuprimidos ya que pueden ser mortales para ellos.

Los estafilococos son habitantes normales de la piel, así se explica que se encuentran en dondequiera. Como patógenos causan muchos procesos supurativos que van desde firúnculos, ántrax y abscesos hasta septicemias mortales. Muchas ocasiones invasores secundarios en peritonitis, cistitis y meningitis. Viven tanto en la piel, nariz, boca e intestinos normales como en el aire, agua, leche, drenajes y objetos. Las infecciones ocurren cuando penetran en el cuerpo por grietas, cortes y rozaduras de la piel, aunado a otros factores. Sólo dos de las tres especies del género Staphylococcus, S. aureus y S. epidennidis, tiene importancia médica. S. aureus es la especie patógena; S. epidennidis rara vez produce infecciones a los humanos; es patógeno oportunista en personas con defensas antimicrobianas defectuosas.

NOTA: En el tiempo que estuve en esta sección pocas muestras resultaron positivas.

3 1

Eksam SaraS Shirrns m

Figura 1. Gráfica de los microorganismos identificados de muestras de hemocultivos: [a] BGN, [b] CGP.

32

6.4. Cultivos diversos

En esta sección se manejan varios tipos de muestras. AI estar en esta sección las muestras que procesamos fueron de:

Coprocultivos. De las 72 muestras positivas que analice, 49 corresponden a bacilos gramnegativos y 23 a levaduras; en este caso no se presentaron cocos grampositivos, pero si se presento una muestra de un paciente de la unidad de Trasplante de Medula Osea. En la tabla 1 se presentan los microorganismos identificados así como las veces que aparecieron. Y en la figura 1 están representados gráficamente estos resultados, en la gráfica 1 se representa a los BGN y en gráfica 2 a las levaduras.

Tabla l . Nombre de los microorganismos identificados, en muestras de coprocultivos.

BACTERIAS PATOGENAS C. freundii E. C d i K. oxytoca

BGN K. peuminiae P. vulgaris S. typhi P. aerugnosa

LEV S. cerevisiae Levaduras sp.

c. dbicans

PACIENTES

O 2 O EXTERNOS I INTERNOS I TMO

5 21 1 4 1 6 O 2 O 2 1 3 O 13 O 3 O 8

33

Gráfica l. BGN

[a] ."

Gráfica 2. LEVADURAS 1 u I

O

#EXTERNO 1 ~

WINTERNO ~ j

albicans cerevisiae S v.

Levaduras

Figura 1. Representación gráfica de los microorganismos identificados en muestras de coprocultivos: [a] BGN, [b] LEV.

Como se puede ver en la tabla 1, los microorganismos que más se identificaron fueron: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Candida albicans. La literatura nos indica, que uno de los grupos importantes de bacterias que se encuentran en el tubo digestivo es la familia Enterobacteriaceae, o bacterias entéricas. En este grupo encontramos algunos patogenos bacterianos como Shigella y Salmonella, otros oportunistas o patógenos ocasionales como Proteus y Klebsiella, y otros más esenciales que normalmente habitan en el intestino y sólo bajo condiciones muy excepcionales producen enfermedad, en este grupo se encuentra Escherichia y Enfembacter. La E. coli causa gastroenteritis aguda en el tubo digestivo principalmente a los recién nacidos o los niños hasta de 2 años, pero rara vez a los adultos excepto cuando tienen muy disminuida su resistencia. Su facultad única de infección se basa en su capacidad para penetrar las dlulas epiteliales de la mucosa intestinal y reproducirse dentro de estás. Este mecanismo

34

de infección causa el síndrome denominado disenteria que se caracteriza por: dolor abdominal ( retortijones), tenesmo, y presencia de pus y sangre en las materias fecales. Estos síntomas son resultado de la necrosis epitelial así como de la ulceración y respuesta inflamatoria aguda que se manifiesta por la presencia de glóbulos rojos en las materias fecales.

Exudado vaginal. En este tipo de cultivo de las 28 muestras que llegaron al laboratorio sólo 14 resultaron positivas y están formadas por 6 BGN y 8 levaduras.

Tabla 2. Nombre de microorganismos identificados.

M. morganii

2 1 C. tropicalis 3 2 C. albícans LEV 2 1

Y EXTER INTER

NO NO Pacienter

m Grdfica 4. LEVADURAS 3 I .C. aibicans i

i i .C. tropicalis i

0.5

LL EXTER INTERN NO O

PaCiellteS

Figura 2. Gráficas de microorganismos encontrados en muestras de exudado vaginal: [a] BGN, [b] LEV.

35

Como se puede ver en la tabla 2, nuevamente la Escherichia coli es la que se presenta con mayor frecuencia en este tipo de muestras y la Candida albicans es la que sobresale en las levaduras.

Expectoración. De las 42 muestras positivas que resultaron, 17 son BGN, 11 CGP y 14 levaduras. Este tipo de muestra consiste en la flema que el paciente arroja. En la tabla 3 se presentan los nombres de los microorganismos patógenos así como el número de veces que se presentaron. En la figura 3a, la gráfica representa a los BGN, los CGP y las LEVADURAS se representan en las gráficas [b] y [c] respectivamente.

Tabla 3. Nombre de los microorganismos identificados, en muestras de expectoración.

BACTERIA EXTERNO I INTERNO PATOGENAS

PACIENTE

1 2 E. coli 1 O E. cloacae

BGN K. oxytoca 1 2 K. p n e m t n n * % e 1 4 M. magmi? 1 3 Pseudomonas sp. 1 O s. pneumordae 1 3

CGP Sfn#cmxclrs s p . . 1 3 Viridans Strp 1 O S. aureus 1 1

LEVADURAS C. &&&&S 5 5 Levaduras SD. 1 3

36

a, Gráfica 5. BGN

u g 4 'G cn u 3 ((J c o . 2 2 5 E % 0 5 1 U

O 0 E. cloacae K. oxytoca M. morganii

Bacterias

Gráfica 6. CGP

~ EXTERNO ~

! ~ mlNTERNO ~

Bacterias

m Gráfica 7. LEVADURAS

L EXTERN INTERN O O

Pacientes

Figura 3. Gráficas de los microorganismos identificados en muestras de expectoración, [a] BGN; [b] CGP; [c] LEV.

37

En el presente caso los microorganismos que más frecuencia tuvieron fueron, en el caso de BGN Klebsiella pneurnoniae y Morganelli rnorgani, en los CGP Streptococcus pneumoniae y Streptococcus sp., y en levaduras Candida albicans, como se observa en la tabla 3 al igual que en la figura 3, en las respectivas gráficas. Estos resultados no concuerdan mucho con la literatura, en ella se indica que la bacteria más frecuente es el Streptococcus pneumoniae que produce la neumonía lobar (congestión de los lóbulos de los pulmones) aunque la producen muchos microorganismos diferentes, el 95% la causa la bacteria antes mencionada, que también produce pericarditis, artritis, meningitis, otitis media y otras enfermedades.

Cultivo aerobio, en este cultivo se presentaron 68 muestras de las cuales 35 resultaron positivas: 15 fueron BGN, 16 CGP y 4 levaduras. En la tabla 4 se presentan los nombres de los microorganismos identificados y en la figura 4 la representación gráfica de cada caso.

Tabla 4. Nombre de las bacterias identificadas en muestras de cultivo aerobio.

BACTERIAS PACIENTES

C. freundii 2 1 PATOGENAS EXTERNO I INTERNO

1 BGN E. codi

O 1 S. marcescens 1 O P. vulgaris 1 1 K. oxytoca 1 4

s. PYOgeneS O 2 Streptococcus sp. 2 O Micrococcus sp. O 1 :s. %wws 2 4 S. intermedius 1 O ,c. albicsr?ss 1 2 T @abrata O 1

38

GrAfica 8. BGN

' BEXTERNO ~ l l N T E R N O I

C.freundii K . oxytoca S . marcescens

Bacterias

.- Grdfica 9. CGP B 4

= x 'Tis 2 gE

1 o s

""

B o I E EXTERNOS ~

I E INTERNOS ~

I

L o

m Bacterias

Gráfica 1 O. LEVADURAS

EXTERNO INTERNO S S

Pacientes

rcl

Figura 4. Gráficas de los microorganismos identificados [a] BGN; [b] CGP; [c] LEV.

39

Herida quirúrgica. De las 5 muestras sembradas, 4 resultaron positivas con bacilos gramnegativos y sólo de pacientes internos. En la tabla 5 se muestran los nombres de los mismos y en la figura 5 se representa esquemáticamente.

Tabla 5. Nombre de los microorganismos identificados en muestras de heridas quirúrgicas.

BACTERIAS PACIENTES PATOGENAS EXTERNO INTERNO C. freundii

P. aeru ‘nosa

Gráfica 11. BGN. v) O

MEXTERNO j MINTERNO i

L L 2 C. freundii K. P.

pneumoniae aeruginosa

Bacterias

Figura 5. Gráfica de los microorganismos identificados en muestras de heridas quirúrgicas.

Como se observa en la figura 5, la Klebsiella pneumoniae fue la que se presento con más frecuencia. Esta es una bacteria oportunista.

40

222131 Cultivo de punta de inserción. Para este cultivo se presentaron 29 muestras

de las cuales 16 resultaron positivas, estas están formadas por: 10 bacilos gramnegativos y 6 cocos grampositivos.

Tabla 6. Nombre de los microorganismos identificados en muestras de punta de inserción.

BACTERIAS

1 2 E. cloacae EXTERNO I INTERNO PATOGENAS

PACIENTES

BGN K. pneumoniae 1 3 S. marcescens 1 2

CGP 1 2 S. epidermids 1 2 S.aureus

Gráfica 12. BGN I

E. cloacae K. S. pneumonia marcescen Bacterias S

[al

a Grafica 13. CGP

EXTERNO INTERNOS S

Pacientes

Figura 6. Gráficas de los microorganismos identificados, [a] BGN; [b] CGP

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Como se puede ver en la figura 6a, en la gráfica la bacteria que más aparece es la Klebsiella pneumoniae, la gráfica b muestra que el Staphylococcus epidennidis es el CGP que más se identifica, esta bacteria se encuentra en la piel por lo que es común encontrarla en este tipo de cultivo.

Punta de cat6ter. Se recibieron 45 muestras para este cultivo y sólo 6 de ellas resultaron positivas. Los nombre de las bacterias identificadas se presentan en la tabla 7.

Tabla 7. Nombre de los microorganismos identificados en muestras de punta de catéter.

BACTERIAS EXTERNO I INTERNO PATOGENAS

PACIENTES

BGN E. coli 2 O K. pneumoniae

O 3 S. epidermidis CGP O 1

I v ) Gráfica 14. BGN

I 1 K. pneumoniae I

EXTERNO INTERNOS S

Pacientes

Figura 7. Gráfica de los microorganismos identificados en muestras de punta de catéter.

La figura 7 muestra que la E. coli es la bacteria que más se identifie, y en la tabla 7 también se puede observar que el S. epidennidis fue el que se presento. Con respecto al segundo es una bacteria característica de la piel por lo que fácilmente puede contaminar el catéter, por lo que se deben de tener todos los cuidados higiénicos necesarios.

42

Exudado nasal. De las 28 muestras que se sembraron, 9 resultaron positivas. En este caso las muestras fueron de pacientes internos y de la sección de Trasplante de Medula Osea (TMO).

Tabla 8. Nombre de los microorganismos identificados en - muestras de exudado nasal.

BACTERIAS INTERNO 1 TMO PATOGENAS

PACIENTES

BGN 1 2 S. aureus

Gráfica 15. CGP

-___ ' as. aureus

S. epidermidis

INTERNO TMO

Pacientes

I m Gráfica 15. CGP I T."'

-. "~~""""""I__

-___

.i .a 2 ' as. aureus

$ 6 1 o .S

o . z 2 0

C S. epidermidis

INTERNO TMO

Pacientes

Figura 8. Gráfica de los microorganismos identificados en muestras de exudado nasal.

El S. epidermidis también se encuentra en las vías respiratorias como flora bacteriana normal, al encontrar las condiciones necesarias para su crecimiento invade esta zona del cuerpo provocando posibles infecciones. Se recibieron muestras de la unidad de Trasplante de Medula Osea las cuales resultaron positivas, en estos pacientes por su estado oncológico su sistema inmunológico esta comprometido por lo que pueden ser presa fácil de alguna bacteria, en este caso fue de S. epidermidis.

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Secreción. En este cultivo se registraron 29 muestras, resultaron positivas 22, que están formadas por 17 bacilos gramnegativos y 5 cocos grampositivos. Llegaron tres muestras de la Unidad de Terapia Intensiva (UTI). Los nombres de las bacterias identificadas se presentan en la tabla 9 así como el número de veces que se presentaron y en la figura 9 se observa su presentación gráfica, respectiva.

Tabla 9. Nombre de los microorganismo identificados en muestras de secreción.

PAT~GENA ’ EXTERNO I INTERNO I UTI BACTERIAS

O 1 1 C. freundii

PACIENTES

E. cloacae E. C M

BGN K.Qw)ltoca P. mirabilis p. vdgxis P. aercryjnosa

1 1 O 1 2 O 1 2 O 1 O O O 2 O 1 O 2

Ps fluor/putida O 2 O S. pneumoniae CGP 1 O O

2 1 O s. aureus

Como lo muestra la figura 9a, las bacterias que más se presentaron fueron Escherichia coli, Pmteus vulgaris y Pseudomonas aeruginosa. Estas bacterias son causan de infecciones en los pacientes

En misma figura, pero en la gráfica I 7 muestra que el S. aureus es el que se presento en más ocasiones.

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Gráfica 16. BGN

v) Gráfica 17. CGP P

EXTERN O

INTERNO

Pacientes

Figura 9. Gráficas de los microorganismos identificados en muestras de secreción, [a] BGN; [b] CGP.

45

Exudado faringeo. Se registraron 54 muestras, resultando 21 positivas. Se cultivaron muestras de la sección de TMO. Las muestras positivas están compuestas por: 6 BGN, 12 CGP y una levadura. En la tabla 10 se presentan los nombres de las bacterias identificadas.

Tabla I O . Nombre de los microorganismos identificados en muestras de exudado faringeo.

BACTERIAS

2 o O E. cloacae EXTERNO I IMERNO I "M0 PATOGENAS

PACIEME

BGN K. pneumoniae 1 1 1 Alcalipnes sp. 1 O O S. pneuminiae

2 1 1 S t r m m u s sp. O 1 O

CGP Viridans Strep. O 3 o S. aureus 1 2 O S. lugdunensis O 1 O

, LEV C. albicans O 3 O

Como ya se ha mencionado, las infecciones son producidas por los microorganismos que constituyen la microbiotica normal habitual del huésped humano y también en los hospitales, se tienen que extremar los cuidados en estos pacientes por su mismo padecimiento.

46

Gráfica 18. BGN

L L EXTERN INTERNO TMO

O Pacientes

[al

Gráfica 19. C G P v) O 3

$2.5 2

‘5 ~ 1 . 5

o 2 0 . 5 1 [IITMO

m 3 ~ HEXTERNO I

2 s = - 1 ~ HINTERNO ¡

-

g o ~

L L

S. Viridans S. pneumini Strep. lugdunen

ae sis

Bacterias

47

7. CONCLUSIONES

En este momento hay un aumento en la frecuencia de las infecciones por los microorganismos que constituyen la microbiótica normal habitual del huésped humano, más que por las floras de fuentes exógenas. La amenaza más seria de las infecciones, hoy en día, es el de la flora normal del ser humano y no lo de otros microbios como los de la peste, viruela, cólera u otra enfermedades epidémicas. Por ejemplo, las infecciones más importantes que se ven actualmente en los pacientes que acuden al INCan son producidas con más frecuencia por Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidemidis, (observar gráficas); estas bacterias se encuentran en varias partes del cuerpo humano sano. La razón de este cambio en el tipo de microorganismos que producen infección se debe a las modificaciones en la resistencia del huésped y en su flora microbiana.

La disminución de la resistencia en el huésped puede ser por muchos factores, como: desnutrición, diferentes tipos de enfermedades, traumatismo o supresión intencional de la respuesta inflamatoria o inmunitaria mediante drogas específicas. Las modificaciones de la flora microbiana del huésped implica disturbios en esta población, debido en gran parte al uso generalizado de las drogas antimicrobianas, especialmente los antibióticos. Estos agentes hacen que la flora normal sea reemplazada por microorganismos resistentes a todos los agentes que el paciente recibe.

8. CRITERIOS DE EVALUACIdN

La evaluación que se considero para el pasante, fue el que realizará correctamente el procedimiento de diferentes cultivos, de acuerdo a la metodología que se lleva a cabo en cada una de las secciones del laboratorio de Bacteriología, además de que estuvo respaldado por la contestación del examen que se presento de acuerdo a cada sección.

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222131 9. BIBLIOGRAFíA

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