NGAL 2012

Artculos de investigacin

NotiWiener N 157 - Octubre 2012 - 1

N157Ao XLVI 10/2012

Novedades

Chagatest ELISA recombinante v.3.0 de Wiener lab fue utilizado en el es-tudio de la prevalencia de la enfer-medad de Chagas en embarazadas en Bolivia.

Nuevo descubrimiento estrecha el vnculo gentico entre la enfermedad de Alzheimer y la diabetes Pag. 8

Revisiones

Aptmeros en dispositivos diagnsti-cos

Pag. 4

Dao Renal AgudoEl dao renal agudo es una prdida r-pida, en el orden de horas y das, de las funciones renales a causa de una lesin en ciertas reas de los riones (Figura 1). A pesar de que muchos clnicos usan dao renal agudo y falla renal aguda de manera prcticamente intercambiable, ac-tualmente el primer trmino es utilizado principalmente cuando el dao realmente ocurre en el rin mientras que el segun-do engloba todas las posibles causas de falla renal incluyendo azotemia pre-renal y uropatas obstructivas.1 Este cambio de terminologa ha puesto nfasis en un espectro mucho ms amplio de la con-dicin clnica. Esto viene acompaado del desarrollo del concepto por el cual el dao renal existe como un continuo que va desde un dao menor donde no se ob-servan cambios en los niveles sricos de creatinina o la evacuacin en orina hasta aquellos casos que presentan un dao re-nal terminal y necesitan dilisis. Algunos autores son ms estrictos an y slo utili-zan el trmino dao renal para referirse a casos de necrosis tubular aguda lo cual comprende slo una subpoblacin de los casos de falla renal aguda.En cuanto al aspecto clnico, la prevalen-cia de dao renal agudo es cercana al 5%

de los pacientes hospitalizados. Cerca del 30-50% de los pacientes que sufren operaciones cardiovasculares son suscep-tibles de sufrir un dao renal agudo inme-diatamente despus de la ciruga. Tradi-cionalmente, en estos casos el diagnstico se realiza a travs de la determinacin de creatinina en suero.2 La aparicin de un dao renal agudo est asociada invaria-blemente con un trnsito hospitalario complejo y a su vez con una alta tasa de mortandad. La Acute Kidney Injury Network es una en-tidad de reciente formacin que se origin como un esfuerzo para mejorar el cuida-do de aquellos pacientes que padecen un dao renal agudo o que se encuentran en riesgo de padecerlo. Este grupo de traba-jo defini al dao renal agudo como la presencia de una anormalidad funcional o estructural o la deteccin de marcadores de dao renal en sangre, orina o anli-sis de tejidos. El dao renal agudo est asociado con la retencin en sangre de creatinina, urea y otros desechos metab-licos que normalmente son evacuados por los riones. A pesar de que el dao renal agudo puede resultar en una oliguria, o incluso en una anuria, en muchos casos los volmenes de orina pueden mante-

El laboratorio prctico

Cuidados en el manejo de las prue-bas ELISA cualitativas en microplaca. Parte 3 variables post-analticas

Pag. 6

NGAL como biomarcador de dao renal agudoDr. Andrs A. Poeylaut-PalenaCentro de Investigacin y Biotecnologa - Wiener Laboratorios SAIC - Rosario Argentina.

nerse normales o incluso experimentar un aumento. A pesar de esto, el grupo de trabajo ha definido al dao renal agudo en base al incremento de los niveles sri-cos de creatinina y a cambios en el volu-men de orina. Inicialmente, el dao renal agudo fue dividido en cinco categoras en lo que se conoci como en criterio RIFLE (Tabla 1). Posteriormente, la Acute Kidney Injury Network redujo el nmero de cate-goras a tres (Tabla 2).

DiagnsticoDado que el dao agudo renal es una pa-

Figura 1. Vista general de la estructura renal y vista

ampliada de la estructura de un nefrn.

Artculos de investigacin NGAL como biomarcador de dao renal agudo

2 - NotiWiener N 157 - Octubre 2012

Tabla 1Criterios RIFLE para categorizar el dao renal agudo

Tabla 2Nueva Clasificacin para el dao renal agudo propuesto por la Acute Kidney Injury Network

GFR y Suero Cambios en Creatinina Cambios en Volumen de Orina

R (Riesgo) Aumento en S-Creat > 1,5X < 0,5 mL/Kg/h por ms de 6 h

Disminucin en GFR > 25%

I (Dao) Aumento en S-Creat > 2X < 0,5 mL/Kg/h por ms de 12 h

Disminucin en GFR > 50%

F (Falla) Aumento en S-Creat > 3X < 0,3 mL/Kg/h por ms de 24 h

Disminucin en VFG > 75%, Anuria por ms de 12 h

S-Creat > 4mg/dL

L (Prdida) Prdida total de funcin renal > 4 semanas

E (Enfermedad Terminal) Enfermedad renal terminal > 3 meses

VFG: Velocidad de filtracin glomerular, S-Creat: Creatinina Srica

tologa prcticamente asintomtica hasta el momento de prdida extrema de las funciones y no presenta manifestaciones clnicas muy precisas, su diagnstico se realiza con frecuencia en el marco de otra enfermedad aguda (sepsis, ciruga ma-yor, etc.).3 Las concentraciones sricas de creatinina y urea son utilizadas como los analitos estndares. Sin embargo, estos analitos nunca fueron lo suficientemente sensibles o especficos como marcadores del dao renal agudo. En la ltima dcada, muchos grupos de in-vestigacin se han lanzado a la bsqueda de nuevos biomarcadores para esta pato-loga. Al menos, unos veinte marcadores fueron estudiados en los ltimos diez aos.4 Hoy en da, existen varios marcado-res de dao renal agudo que se encuen-tran en uso clnico. Utilizando orina como matriz se han desarrollado los marcadores ms prometedores para la deteccin tem-prana del dao renal agudo. Estos mar-cadores urinarios pueden ser producidos por el rin a causa del dao o pueden ser filtrados por los glomrulos pero no reabsorbidos por los tbulos debido a una lesin en esta estructura del rin. Una excrecin renal aumentada es en parte porque alguno de estos marcadores uri-narios es producido en mayor cantidad a causa del dao renal o debido a alguna causa asociada a este. La ventaja de estos nuevos marcadores por sobre los marcadores convencionales

Estado Creatinina Srica Cambios en Volumen de Orina

1 > 0,3 mg/dL (26,4 mol/L) >150-200% < 0,5 mL/Kg/h por ms de 6 h

2 > 200-300% < 0,5 mL/Kg/h por ms de 12 h

3 > 300%, 4 mg/dL (354 mol/L), < 0,3 mL/Kg por ms de 24 h aumento agudo de > 0,5 mg/dL anuria por ms de 12 h

para el dao renal agudo, tal como creati-nina srica o nitrgeno ureico en sangre, es que sus niveles sufren cambios aprecia-bles mucho tiempo antes que los valores de creatinina o nitrgeno ureico en san-gre se perturben. La deteccin temprana de un dao renal agudo puede permitir un mejor manejo del paciente para as tomar las medidas teraputicas apropiadas y as evitar el progreso a etapas finales de la patologa. Por lo tanto, los biomarcadores para dao renal agudo ayudan a proveer un diagnostico antes de que aparezcan los primeros signos de perturbacin en los niveles sricos de marcadores clsi-cos como creatinina. En algunos casos, los biomarcadores para dao renal agudo tambin pueden ofrecer la posibilidad de conocer cul es la localizacin primaria del dao (tbulo proximal, tbulo distal, intersticio o a nivel vascular), pueden co-laborar tambin en la identificacin de los distintos tipos de dao renal agudo (pre-renal, renal intrnseco o post-renal) e in-cluso pueden delinear las posibles causas (isquemia, toxinas, sepsis o una combina-cin). La orina es la matriz con mayores chances de contener marcadores de ori-gen renal, por lo tanto los biomarcadores urinarios son los ms ampliamente utili-zados. Cabe destacar que las muestras de orina son ms susceptibles a la degrada-cin proteica y las concentraciones pue-den ser afectadas por el flujo de orina. Las muestras de sangre son ms estables a la

degradacin y son fcilmente accesibles. Sin embargo, la presencia de un biomar-cador en este tipo de matriz puede ser el reflejo de una respuesta sistmica a una enfermedad ms que involucrar a slo un rgano. Otro aspecto interesante de los nuevos marcadores de dao renal agudo es que su concentracin vara en funcin del tratamiento o la recuperacin. Esto sugiere que estos marcadores pueden ser utilizados para monitorear la intervencin mdica.3 Los marcadores urinarios tradicionales como protenas de gran peso molecular filtradas o protenas de los tbulos ca-recen de especificidad. La utilizacin de tecnologas novedosas hizo posible el descubrimiento de varios biomarcadores prometedores en el diagnstico tempra-no de dao renal agudo. De los cerca de veinte biomarcadores estudiados en los ltimos aos, cuatro de ellos son los ms prometedores: interleuquina 18 (IL-18), li-pocalina asociada a gelatinasa de neutr-filos (NGAL, de sus siglas en idioma ingls Neutrophil Gelatinase-Associated Lipoca-lin), molcula de dao renal 1 (KIM-1, de sus siglas en idioma ingls Kidney Injury Molecule) y la protena de origen hep-tico de unin a cidos grasos (L-FABP, de sus siglas en idioma ingls Liver-type Fatty Acid Binding Protein).1 Segn los ltimos resultados parece ser que NGAL y L-FABP son los marcadores ms tempranos mien-tras que IL-18 y KIM-1 sirven para mejorar la especificidad del diagnstico.

Lipocalina Asociada a Gelatinasa de Neu-trfilos (NGAL) NGAL es una protena relativamente pequea (25 kDa) que fue inicialmente identificada como una protena unida a la gelatinasa dentro de los grnulos de neutrfilos.5 Otros nombres por los cua-les comnmente se conoce a NGAL son lipocalina 2 y lipocalina de neutrfilos humanos. Como sus nombres alternati-vos lo indican, NGAL pertenece la familia de las lipocalinas, la cual est compuesta por protenas que unen pequeas mol-culas hidrofbicas. Otros miembros bien conocidos de la familia de las lipocalinas son 1-microglobulina, -lactoglobulina y Apo-D. Una de las funciones claves de NGAL toma lugar durante la respuesta in-nata del sistema inmune. Se ha propuesto que NGAL secuestra siderforos vitales para las bacterias y de esta manera acta como bacteriosttico. NGAL es sintetizada en un periodo de tiempo muy corto en la maduracin de los


Artculos de investigacin NGAL como biomarcador de dao renal agudo

granulocitos en la mdula sea pero pue-de ser inducida en clulas epiteliales ante la aparicin de inflamacin u otro tipo de dao. La expresin de NGAL est regula-da de manera positiva y la protena puede ser encontrada en menos de tres horas en orina y riones de ratones a los cuales se les induce intencionalmente un dao renal agudo por administracin de cispla-tino. NGAL fue propuesta como un claro marcador de dao renal agudo.6 Estudios clnicos mostraron que NGAL puede ser detectada en el lapso de 2 a 6 h luego de que el dao agudo ocurra.5 Haase y colaboradores publicaron una revisin sistemtica del uso de NGAL como biomarcador predictor de dao re-nal agudo.7 Los autores lograron detectar 244 estudios relevantes de los cuales, luego de un anlisis y seleccin, identifi-caron 19 publicaciones tiles para llevar adelante la revisin sistemtica (Figura 2). En cuanto a las matrices que fueron utilizadas para determinar las concentra-ciones de NGAL, diez de los estudios se basaron en muestras de orina, otros cinco estudios utilizaron plasma, mientras que los cuatro restantes se llevaron a cabo en ambas matrices (Tabla 3). En su totali-dad, los estudios fueron realizados sobre 2.358 pacientes. Las poblaciones de pa-cientes tuvieron un tamao medio de 123 pacientes. Como resultado de la revisin sistemtica los autores encontraron que la concentracin de NGAL puede ser uti-lizada como un predictor eficiente. Tanto los valores de NGAL en plasma u orina funcionan en forma similar. Otro hallaz-go del anlisis es que la concentracin de

NGAL tiene valor pronstico para distin-tos episodios clnicos tales como inicio de terapia de remplazo renal o mortandad.

Futuro de NGAL como marcadorEvidencia reciente sugiere que NGAL puede ser marcador de una variedad de condiciones renales y no-renales.8 Como biomarcador parece haber superado to-das las dificultades iniciales del proceso de desarrollo de biomarcador y las etapas iniciales de los ensayos clnicos. En aos recientes, los primeros ensayos comercia-les han obtenido aprobacin regulatoria. Utilizando estos nuevos ensayos se contri-buir a la estandarizacin de la determi-nacin y se podr potenciar la amplia uti-lizacin clnica de NGAL. Con seguridad, emerger como un componente principal de paneles para determinar dao renal agudo.

Referencias(1) McPherson, R. A.; Pincus, M. R. Henrys Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods; 22nd ed.; Saunders, 2011; p. 1568.(2) Xin, C.; Yulong, X.; Yu, C.; Changchun, C.; Feng, Z.; Xinwei, M. Urine neutrophil gelatinase-associated lipocalin and inter-leukin-18 predict acute kidney injury after cardiac surgery. Renal Failure 2008, 30, 904-13.(3) Bellomo, R.; Kellum, J. A.; Ronco, C. Acu-te kidney injury. Lancet 2012, en prensa.(4) Parikh, C. R.; Garg, A. X. Testing new biomarkers for acute kidney injury: associa-tion, prediction, and intervention. American Journal of Kidney Diseases 2009, 54, 987-9.

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Tabla 3Caractersticas de los estudios sobre NGAL

Figura 2. Diagrama de flujo del proceso de seleccin llevado adelante por Haase y colaboradores.7

244 estudios relevantes publicados en revistas

26 pedidos por datos completos

19 estudios includos en anlisis final

218 estudios fueron excluidos luego de ser analizados179 fueron in-vitro o en animales21 fueron sobre falla renal crnica13 no tenan datos originales5 estudios de intervencin usando NGAL

7 estudios fueron excludos4 sin datos completos3 con problemas de publicacin

CC: Ciruga cardaca, UTI: Unidad de terapia intensiva, NCI: Nefropata de contraste inducido, G: Guardia.

Referencia7 Tamao de la Tipo de Creatinina Afeccin Causa Matriz Sensibilidad Especificidad Poblacin Poblacin Basal (mg/dL) Renal (%)

Mishra y colab, 2005 71 Nios 0,45 0 CC Plasma + Orina 100 98Wagener y colab, 2006 81 Adultos 1,1 32,1 CC Orina 68,8 64,6Dent y colab, 2007 123 Nios 0,5 0 CC Plasma 84,4 93,6Zappitelli y colab, 2007 39 Nios 0,44 0 UTI Orina 75 69,6Hirsch y colab, 2007 91 Nios 0,73 0 NCI Plasma + Orina 72,7 100Wagener y colab, 2008 426 Adultos 1,08 27,2 CC Orina 64,7 52Bennett y colab, 2008 196 Nios 0,39 0 CC Orina 78,8 91,8Ling y colab, 2008 40 Adultos 0,83 0 NCI Orina 76,9 70,4Koyner y colab, 2008 72 Adultos 1,24 26,4 CC Plasma + Orina 66,7 64,8Nickolas y colab, 2008 541 Adultos 1,2 26,8 G Orina 87 96,9Lima y colab, 2008 52 Adultos 1,2 53,8 CC Orina 83,3 73,9Wheeler y colab, 2008 143 Nios 0,76 ? UTI Plasma 86,4 38,8Xin y colab, 2008 33 Nios + Adultos 0,77 0 CC Orina 66,7 73,3Cruz y colab, 2009 301 Adultos 0,97 6,7 UTI Plasma 73,4 80,6Makris y colab, 2009 60 Adultos 0,86 13,3 NCI Orina 90 88Makris y colab, 2009 31 Adultos 0,97 ? UTI Orina 85,7 70,8Tuladhar y colab, 2009 50 Adultos 1,1 42 CC Plasma + Orina 88,9 78,1Constantin y colab, 2009 88 Adultos 0,81 ? UTI Plasma 82,7 97,2Haase-Fielitz y colab, 2009 100 Adultos 1,04 27 CC Plasma 78,3 77,9


IntroduccinLos aptmeros son cidos nucleicos de cadena simple, ADN o ARN, que poseen alta afinidad por otras molculas. Desde su surgimiento hace dos dcadas, han sido propuestos como el remplazo de los anticuerpos.1 Por lo general, son molcu-las de pequeo tamao las cuales pueden contener entre 15 y 80 nucletidos. Cada aptmero posee un plegamiento tridi-mensional particular que depende de su secuencia y la unin con sus respectivos ligandos no ocurre a travs del clsico apareamiento de Watson y Crick (Figura 1).

Los aptmeros fueron descubiertos prc-ticamente en simultneo por dos grupos de investigacin a principios de la dca-da de 1990. Su nombre tiene races en el latn y su significado aproximado es ca-paz de ajustar la unin. El aspecto ms sobresaliente de los aptmeros es, quizs, su forma de obtencin. Se utiliza un pro-ceso conocido como SELEX cuyas siglas en idioma ingls significan Evolucin Sistemtica de Ligandos mediante Enri-quecimiento Exponencial. Este mtodo enfrenta a la molcula diana a un gran nmero de cidos nucleicos sintticos y logra seleccionar de este grupo a los que poseen alta afinidad por el ligando (Figura 2).2 El proceso es cclico y puede ser divi-dido en etapas. En un primer trmino se ponen en contacto la diana y la biblioteca de cidos nucleicos (A, B). Luego, se des-cartan las secuencias con baja afinidad y se contina trabajando con las que mos-traron alguna afinidad mnima (C). Estas secuencias son amplificadas por PCR y luego sometidas a otro ciclo de seleccin cada vez ms astringente (D, E). De esta manera, se logra ir seleccionando y am-

Aptmeros en dispositivos diagnsticosDr. Andrs A. Poeylaut-PalenaCentro de Investigacion y Biotecnologa - Wiener Laboratorios SAIC - Rosario - Argentina

Revisiones

Figura 1. Estructura de un aptmero unido a

su ligando.

Figura 3. Nucletidos modificados qumicamente comnmente presentes en aptmeros.

plificando las secuencias con mayor afini-dad. Finalmente, se clona y se secuencia la molcula de cido nucleico que demos-tr mayor afinidad por la diana (F). Una vez conocida la secuencia de nucletidos perteneciente al aptmero, este es sinte-tizado qumicamente. Es muy comn ob-tener aptmeros que logran una afinidad superior, o al menos igual, a la mostrada por un anticuerpo.

Actualmente existe un sinnmero de va-riantes de SELEX, todas han nacido para subsanar defectos de la versin original o adicionar nuevas cualidades al proceso.3 Versiones modernas, en el proceso de am-

plificacin utilizan enzimas que pueden funcionar con nucletidos modificados qumicamente a fin de obtener mayor va-riedad estructural (Figura 3).1

El trabajo en el rea de los aptmeros es intenso, desde sus comienzos, la actividad cientfica en torno a estos ha incremen-tado continuamente. Esto se puede ver reflejado claramente en el nmero de publicaciones que se pueden encontrar referidas al tema en revistas cientficas de primera lnea mundial (Figura 4). En la ac-tualidad, existen al menos 905 aptmeros registrados. Un estudio reciente muestra que la mayor parte de los aptmeros son

Figura 2. Diagrama esquemtico del proceso de SELEX.2

Aptmeros

Inicio de un nuevo ciclo

Biblioteca inicialAprox. 10s sequencias diferentes

Molcula diana

Miembres de la biblioteca que se unen a la molcula diana

Descartar las secuencias con poca afinidad

Separacin de secuencias con afinidad

por la molcula diana

Enriquecimiento de la biblioteca

Clonacin y secuenciacin

AE

F

B

C

D

NN

NN

NH2

O

O

O

O

O

O

O

NO

O-O P

H

H H

H

OHHN

H

H H

H

-l & -Br Entrecruzamientos fotoqumicos

-SH & Entrecruzamientos qumicos

NH2

Variedad Estructural

Variedad Estructural

-F & -NH2 Resistencia a las Nucleasas

Amino cidos

0-

RevisionesAptmeros en dispositivos diagnsticos


de ARN y la molcula diana de eleccin son las protenas (Figura 5).4 Sin embar-go, existen muchos otros tipos de dianas como por ejemplo los nucletidos, los azcares, colorantes y toxinas.

Ventajas y desventajas de la utilizacin de aptmerosComo se mencion anteriormente, los ap-tmeros suelen ser propuestos como un futuro remplazo a la utilizacin de anti-cuerpos como herramientas teraputicas y diagnsticas. Por lo tanto, es comn encontrar un gran nmero de publicacio-nes que se dedican a resaltar las ventajas comparativas de la utilizacin de aptme-ros por sobre anticuerpos.58 Como princi-pal ventaja se puede mencionar el hecho de que, al menos en teora, utilizando SE-LEX se puede generar aptmeros con es-pecificidad para cualquier molcula diana que se desee. Incluso, es posible plantear la obtencin de un aptmero dirigido slo a un epitope en particular de muchos que pueda poseer la diana. La posibilidad de obtener aptmeros bajo condiciones di-ferentes a las fisiolgicas abre la puerta para la seleccin de elementos de recono-cimiento en condiciones no convenciona-les. Un ejemplo de la versatilidad en este aspecto es la toxicidad de una molcula diana.2 La seleccin de aptmeros no se ve limitada en ningn caso por la toxici-dad u otras condiciones diferentes a las fisiolgicas, dado que el proceso se lleva a cabo in vitro. Esta es una ventaja de los aptmeros con respecto a los anticuerpos, que generalmente solo pueden ser gene-rados en condiciones fisiolgicas, en las que la toxicidad es un factor determinante.Otra ventaja importante a remarcar es la uniformidad entre lotes de produccin, dado que los aptmeros son sintetiza-dos qumicamente es de esperarse que tengan una gran uniformidad de un lote a otro. El hecho de obtener los aptme-ros va sntesis qumica tambin permite otorgarle a los aptmeros una buena va-riabilidad qumica. Es posible agregar mo-lculas fluorescentes, marcadores de afi-nidad (e.g. biotina) y otras modificaciones qumicas en forma relativamente sencilla. La estructura terciaria de los aptmeros es sumamente flexible. Un aptmero puede ser fcilmente desnaturalizado y vuelto a naturalizar sin experimentar de-masiados problemas. Este no es el caso de los anticuerpos, para los cuales el pro-ceso de desnaturalizacin es irreversible. Si bien, el hecho de obtener estructuras terciarias muy flexibles, puede ser tomado

como una ventaja, en ciertos casos pue-de ser visto en forma contraria. Dada la alta flexibilidad de la estructura terciaria frente a un gran nmero de factores, la afinidad de un aptmero por su molcula diana puede variar en forma apreciable en funcin, por ejemplo, de la temperatura, el pH o la fuerza inica. Esto, probablemente, convierte a los aptmeros en herramien-tas analticas con puntos flojos. Es para destacar que la mayor parte de las publi-caciones tienden a resaltar puntos fuertes y ventajas del uso de aptmeros. Como es comn, muchas veces es difcil identificar las desventajas tan claramente.

Aptmeros en ensayos diagnsticosMs de dos dcadas despus de su descu-brimiento, an no hay aptmeros que ha-yan alcanzado el mercado del diagnstico in vitro. A la fecha, organismos regulato-rios como la FDA no han aprobado ningn ensayo diagnstico que utilice aptmeros en lugar de anticuerpos. Por el contrario, a nivel acadmico, es decir en revistas cientficas, existen varios ejemplos de la utilizacin de aptmeros en ensayos diagnsticos. Desde el primer momento surgieron ejemplos de ensayos de ELISA llevados adelante utilizando aptmeros. Estos ensayos fueron rebautizados con varios nombres, por ejemplo, ELONA9

(de sus siglas en idioma ingls: Enzyme-linked oligonucleotide assay) o ALISA10

(de sus siglas en idioma ingls: Aptamer-

linked immunosorbed assay). Sin embar-go, ninguno de estos ejemplos ha llegado al mercado an. Quizs esto se deba en gran parte a que estas publicaciones uti-lizan condiciones de reaccin extraas o las muestras ensayadas son matrices muy sencillas.11,12 Sin embargo, en aos recien-tes comenzaron a surgir publicaciones de ensayos diagnsticos que emplean apt-meros los cuales son llevados a cabo en suero o plasma.14 Otro posible motivo del retraso en alcanzar el mercado, es lo que se dio en llamar el problema de la trom-bina.13 El aptmero que tiene afinidad por la trombina es un oligo de 15 nucle-tidos que puede ser conseguido por muy pocos dlares. Es as que la mayor parte de las publicaciones cientficas son reali-zadas utilizando este aptmero por lo cual no se desarrollan ensayos para dianas in-teresantes desde el punto de vista clnico.

AptasensoresUn biosensor es un instrumento para la medicin de parmetros biolgicos o qu-micos. Suele combinar un componente de naturaleza biolgica y otro fisicoqumi-co. Por lo general, la mayora de los bio-sensores establecidos en el mercado de diagnstico in vitro utilizan un elemento de reconocimiento biolgico (e.g. enzima, anticuerpo) unido a un sistema de reco-nocimiento electroqumico como principio fisicoqumico de deteccin. El caso ms reconocido son los biosensores para me-

Figura 4. Estadsticas de las publicaciones sobre aptmeros segn el paso de los aos.

Figura 5. Distribucin de la poblacin existente de aptmeros.

200

150

100

50

0

1990 1992 1994 1996 1998 2000 2002 2004 2006 2008 2010 2012

Aptamer + assay

Aptasensor

Aptamer

Protena (76)Nucletido (7)cido Nuclico (6)Amino cido (6)Pptido (5)Anticuerpo (4)Carbohidrato (4)Clula (2)Colorante (1)Lpido (1)Toxina (1)Virus (1)

A B

ADN: 328

ARN: 577


Revisiones Aptmeros en dispositivos diagnsticos

dir glucosa.15

Los biosensores son un campo de apli-cacin donde los aptmeros han logrado un gran desempeo. Generalmente, los biosensores que utilizan aptmeros como elemento biolgico de reconocimiento son denominados aptasensores.16 Los mtodos ms refinados involucran ap-tmeros funcionalizados con una sonda electroqumica (Figura 6).17 Tomando provecho de los cambios conformaciona-les que sufren los aptmeros luego de la unin de la diana, la sonda electroqumica es alejada del electrodo por lo que la se-al electroqumica disminuye en funcin de la unin. Existen varios ejemplos de este tipo de aptasensores que funcionan de buena manera en plasma, suero, e in-cluso, en sangre entera.

Aptmeros en el ambiente farmacuticoClaramente, donde los aptmeros han alcanzado los mejores es en el ambiente farmacutico. En 2006, Macugen fue el primer aptmero en ser aprobado por la FDA. Se trata de un aptmero con afini-dad por VGEF y se lo utiliza en el trata-miento de la degeneracin macular aso-ciada a la edad. Se lo puede considerar como una alternativa a anticuerpos mo-noclonales utilizados en la terapia. Esta enfermedad oftalmolgica se caracteriza por el deterioro de la mcula, tejido de co-lor amarillento sensible a la luz, localizado en el centro de la retina, cuya funcin est ligada a la nitidez visual. Macugen se une a VEGF inhibiendo la unin a su receptor natural. Es as que se evita la proliferacin y migracin de vasos sanguneos hacia el humor vtreo. En la actualidad ms de 50.000 pacientes han sido tratados con Macugen con resultados satisfactorios. Con base en aptmeros hay, sin lugar a dudas, una posibilidad real de desarrollar nuevos enfoques teraputicos y cabe des-tacar que se estn adelantando pruebas clnicas para otros aptmeros de los que se tendrn noticias en los prximos aos. Se espera entonces que el aptmero anti-VEGF sea solo el inicio de una generacin de nuevos agentes teraputicos.

ConclusinLos aptmeros son molculas muy ver-stiles que se han adaptado a diversas plataformas de deteccin, contribuyen-do a mejorar principalmente el campo de los biosensores. Entre sus principales ventajas se encuentran la facilidad para producirlos y modificarlos qumicamente. En cuanto a su aparicin en el mercado

Figura 6. Aptasensor electroqumico basado en el cambio conformacional del aptmero.

formando parte de ensayos diagnsticos, es probable que a corto plazo comiencen a surgir los primeros ejemplos exitosos. El problema de la trombina est siendo superado, cada vez un nmero mayor de pruebas de concepto son desarrolladas con analitos interesantes desde el punto de vista clnico. Asimismo, hoy en da exis-ten ejemplos de la utilizacin de aptme-ros en matrices complejas como plasma, suero o sangre entera. Lo ms factible es que el establecimiento a nivel comercial de los aptmeros en el ambiente del diag-nstico in vitro se de en primera instan-cia a travs de los aptasensores. Desde el punto de vista teraputico, se los puede considerar como los nuevos candidatos en el desarrollo de estrategias biotecno-lgicas. Dado el nmero de aptmeros que se encuentran actualmente en fase clnica, es muy probable que un nmero significativo de ellos est disponible co-mercialmente en un futuro cercano.

Referencias(1) Jayasena, S. D. Aptamers: An Emerging Class of Molecules That Rival Antibodies in Diagnostics. Clinical Chemistry 1999, 45, 1628-1650.(2) Hernndez, F. J.; Botero Hincapi, J. A. Ap-tmeros: agentes diagnsticos y teraputicos. Iatreia 2012, 25, 159-168.(3) Stoltenburg, R.; Reinemann, C.; Strehlitz, B. SELEX- A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering 2007, 24, 381-403.(4) Cruz-Toledo, J.; McKeague, M.; Zhang, X.; Giamberardino, A.; McConnell, E.; Francis, T.; DeRosa, M. C.; Dumontier, M. Aptamer Base: a collaborative knowledge base to describe aptamers and SELEX experiments. Database 2012, bas006.(5) Mascini, M. Aptamers in Bioanalysis; Wiley-VCH, 2007; p. 334.

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Aptmero

Electrodo

SondaElectroqumica

Trombinano eT


Bioq. Marcelo GarcaAsesor Tcnico Wiener lab.

El laboratorio prctico Cuidados en el manejo de las pruebas ELISA cualitativas en microplaca. Parte 3 Variables Post Analticas.Una vez obtenidos los resultados de un ensayo inmunoanaltico es necesario controlar las variables post-analticas previamente al informe de los mismos.Como primera medida, es imprescindible conocer si el proceso cumpli con los requisitos de calidad mediante las herramientas respectivas: Controles positivos y negativos provistos en el equipo;Estos controles se utilizan para verificar el cumplimiento de los requerimientos de validacin establecidos por el fabricante. Control del correcto funcionamiento del instrumental; si bien este control debe realizarse previamente al proceso analtico, es importante tenerlo en cuenta como una fuente de error en los resultados. Control del estado de las muestras; Es importante considerar el efecto de la coagulacin incompleta, de la lipemia, hiperbilirrubi-nemia o hemlisis como interferentes de la reaccin. Controles internos del laboratorio; Es imprescindible contar con sueros de control interno para constatar la estabilidad del proceso analtico. Muchos de los problemas analticos solo son detectados por estos controles, an habiendo sido validados los controles del fabricante.Es importante considerar las reglas utilizadas para la validacin de los controles. Reglas adecuadas para procesos de qumica cl-nica pueden no ser tiles para los inmunoensayos. Es convenien-te elegir aquellas reglas con alta sensibilidad de deteccin de errores y baja cantidad de falsos rechazos.La validacin de los controles del proceso analtico no garantiza que cada resultado obtenido sea verdadero. Por eso es necesario tener conocimiento de la metodologa usada, as como de la his-toria clnica del paciente.

Los mtodos analticos pueden clasificarse en mtodos de screening o tamizaje, y mtodos confirmatorios.Los primeros se caracterizan por tener una sensibilidad elevada y su objetivo es detectar la ms mnima sospecha de que un pa-ciente pueda estar infectado o enfermo. La limitacin de estos mtodos es que presentan una proporcin de resultados falso-positivos superior a la de los mtodos confirmatorios. Esta es la razn por la cual las pruebas de tamizaje no diagnostican per-se ningn tipo de infeccin o patologa clnica.Las pruebas confirmatorias se caracterizan por su especificidad elevada y su objetivo es asegurar el diagnstico serolgico. Su principal limitacin es su sensibilidad, inferior a la de los mtodos de tamizaje.El algoritmo ms general de diagnstico serolgico implica las siguientes etapas:

1. Ante un resultado reactivo proveniente de un proceso analtico validado, la muestra debe repetirse por duplicado en la prxima corrida analtica.

2. Previamente a la repeticin debe analizarse nueva-mente el estado de la muestra y la historia clnica del pacien-te, con el objeto de conocer si existen interferentes potenciales que orienten a un resultado falso-positivo, as como sospechas clnicas que orienten a un resultado positivo verdadero. Es con-veniente realizar una centrifugacin exhaustiva de la muestra

Cuidados en el manejo de las pruebas ELISA cualitativas en microplaca. Parte 3 - Variables Post Analticas.

antes de iniciar el proceso analtico para eliminar los posibles interferentes de una coagulacin incompleta. La repeticin de las muestras tiene como objetivo descartar cualquier inconveniente no detectado en la corrida analtica, as como la presencia de interferentes potenciales del suero fresco.

3. Si al menos uno de los duplicados arroja un resultado reactivo, la muestra debe considerarse sospechosa y debe con-firmarse con un mtodo confirmatorio, o al menos, realizar una segunda prueba. El objetivo de la confirmacin del diagnstico es detectar posibles resultados falso-positivos producidos por interferentes que afectan al mtodo de tamizaje.

4. En el caso de que haya discordancias entre pruebas es conveniente realizar una nueva extraccin al paciente a los 7 a 21 das posteriores a la primera una con el objeto de evaluar la evolucin, y en caso de persistir las discordancias iniciar un seguimiento peridico.

Como se indic anteriormente, las pruebas de tamizaje son al-tamente sensibles y pueden ser afectadas por pequeas con-centraciones de interferentes relacionados con la muestra o la situacin particular del paciente (embarazo, autoinmunidad, inmunizacin, terapia farmacolgica, etc.). Muchos de estos in-terferentes producirn resultados falsamente reactivos inclusive en las repeticiones. Por esta razn es importante confirmar el resultado antes de emitir el informe.Es conocido que diferentes situaciones producen anticuerpos causantes de reacciones cruzadas con varios inmunoensayos, ya sea por similitud antignica entre microorganismos diferentes o en diferentes situaciones del paciente. Por ejemplo, T. cruzi y Leishmania sp presentan ciertos antgenos que son similares en-tre s; y en la hepatitis autoinmune con ciertos antgenos del Virus de la Hepatitis C, etc.Por otra parte, hay situaciones especiales que producen resul-tados falso-negativos en las pruebas confirmatorias. Por ej. la etapa de seroconversion puede dar resultados positivos para un ELISA de 3 g. antes que el confirmatorio de positivo.Por ltimo, es importante la correcta trascripcin de los resulta-dos. Un resultado perfectamente controlado puede ser malogra-do por una mala trascripcin. En sntesis, los inmunoensayos son mtodos altamente sensi-bles, capaces de detectar muy poca concentracin de analito en las muestras, y por lo tanto los cuidados que deben tomarse para obtener un resultado correcto son mucho mayores que los recaudos a tomarse en el laboratorio de qumica clnica. La comprensin de las mismas permitir tomar conciencia de las limitaciones metodolgicas y establecer las medidas necesarias para lograr un resultado correcto, o en su defecto, generar pro-tocolos para dilucidar incompatibilidades entre pruebas o entre el resultado y el contexto clnico del paciente.


Boletn del Servicio Bibliogrfico de Wiener Laboratorios S.A.I.C.Nmero 157 - Ao XLVI - Ocubre de 2012Director: Gustavo A. CapriottiRedactor: Centro de Investigacin y Biotecnologa (CIBIO) - MarketingEditor Responsable: Wiener Laboratorios S.A.I.C.www.wiener-lab.com.ar

Wiener Laboratorios S.A.I.CRiobamba 2944,

S2003GSD Rosario, Argentina Tel.: +54 341 4329191/6

Moreno 1850, 2 piso, C1094ABB Buenos Aires, Argentina

Tel.: +54 11 43754151/[email protected] - www.wiener-lab.com.ar

Novedades y Agenda

Novedades Agenda

Del 4 al 6 de Octubre de 2012Chubut - Argentina

II Jornadas Patagnicas de Bioqumi-ca y VII Jornadas Da del BioqumicoSede: Auditorio Centro Cultural Como-doro Rivadavia - Chubut Ms informacin: [email protected]

Del 17 al 19 de Octubre de 2012Buenos Aires - Argentina

VI Congreso Argentino de Parasito-loga y II Jornadas Bioqumicas del Sudoeste BonaerenseSede: Saln de Actos y Anexos Rectora-do - Universidad Nacional del SurAvda. Coln, 80. Baha Blanca, Pcia. de Buenos AiresMs informacin:www.parasitologiarg.com.ar

Del 23 al 26 de Octubre de 2012Per

III Congreso Internacional de Labo-ratorio Clnico y Anatoma Patol-gicaSede: Universidad Nacional Mayor de San MarcosMs informacin: http://www.3cilcap.com/

Del 24 al 27 de Octubre de 2012 Mxico

XXI Congreso Latinoamericano de Patologa Clnica - XLII Congreso Mexicano de Patologa Clnica Sede: Cancn Center - Cancn, Quintana RooMs informacin: tinyurl.com/79vd5hx

Chagatest ELISA recombinante v.3.0 de Wiener lab fue utilizado en el estudio de la prevalencia de la enferme-dad de Chagas en embarazadas en Bolivia.La transmisin congnita de la enfermedad de Chagas per-manece como un problema importante para la salud pblica. En una publicacin recientemente aparecida en Acta Tropica, investigadores de Bolivia (Instituto Nacional de la Salud) y Francia (Universit Paris Descartes) llevaron adelante un es-tudio epidemiolgico en tres maternidades de la ciudad de Santa Cruz de la Sierra, Bolivia desde 2006 a 2008. El tamizaje serolgico de la infeccin por Trypanosoma cruzi se realiz en 15.767 mujeres embarazadas. La infeccin de Chagas fue detectada en 3725 las mu-jeres (23,6%), que dieron a luz a 125 recin nacidos infectados por T. cruzi al nacer, lo que representa una incidencia de 790 por cada 100.000 nacimientos durante un perodo de 16 meses y una tasa de transmisin vertical en un 3,4%. Chagatest ELISA recombinante v.3.0 fue utilizado para llevar adelante la confirmacin del diagnstico de los pacientes luego de 9-16 meses de haber nacido. En el estudio hubo una dife-rencia significativa entre los hospitales que podran ser explicadas por los orgenes socio-econmicos de las madres y las limitaciones de diagnstico.Clavijo, N. A. S.; et al. Prevalence of Chagas disease in pregnant women and incidence of congenital transmission in Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. Acta Tropica 2012, 124, 87-91. Nuevo descubrimiento estrecha el vnculo gentico entre la enfermedad de Alzheimer y la diabetesUn nuevo giro a nuestra comprensin de la relacin entre la enfermedad de Alzheimer y la diabetes fue publicado en la revista Genetics. En el artculo, cientficos estado-unidenses muestran que la presencia de un gen en el gusano Caenorhabditis elegans correlaciona con la enfermedad de Alzheimer. Este gen est involucrado en mltiples vas metablicas, incluyendo la va de la insulina, y es similar a un gen presente en el genoma humano.Las mutaciones en tres genes, incluyendo la protena precursora amiloide (APP), se han correlacionado con la forma hereditaria de la enfermedad de Alzheimer en los seres humanos. Debido a que el gen equivalente que estamos estudiando en el orga-nismo modelo C. elegans est involucrado en muchas vas metablicas, esto sugiere que la versin humana del gen probablemente tambin juega un papel, no slo en la enfermedad de Alzheimer, sino tambin en la diabetes.Este descubrimiento es importante porque ayuda a explicar cmo estos genes estn vinculados funcionalmente en una va comn, y da una posible explicacin para la aparente relacin entre el Alzheimer y la diabetes en los seres humanos. Los cientfi-cos esperan que esta nueva visin ayudar a centrar la investigacin en formas que podran conducir a nuevas terapias en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y la diabetes.Es sabido que existe una relacin entre el Alzheimer y la diabetes, pero hasta ahora, era algo de un misterio. Este hallazgo podra abrir nuevas puertas para el tratamiento y la prevencin de ambas enfermedades. Collin Y. Ewald, Daniel A. Raps, and Chris Li. APL-1, the Alzheimers Amyloid Precursor Protein in Caenorhabditis elegans, Modulates Multiple Metabolic Pathways Throug-hout Development. Genetics 2012, 191, 493-507.

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