i nves t·igo " ' lO ll

Patrones de diversidad neutral y adaptativa de la abeia iberica

Jn proyecto de investigoci6 e l lo penh su lo lberico que integ1 o lo m6s ovonzados recno'ogios moleculores y anal lticos

Textos: MARiA ALICE PINTO Coordinadora Cientlfica del Proyecto. JOA.O CARlOS AZEVEDO FlliPE COSTA JOHN C. PATION J. SPENCER JOHNSTON PILAR DE LA RUA Centra de lnvestiga~ao de Monfanha (CIMO} lnstitufo Politecnico de Bragan~a (JPB}.

Fotos: M. A. PINTO

La pen in ula lb rico es cc:nocido co mo un import nte foco [h otspot) de

d ivers idod y endemisrnos d e nurn ero os espec ies de plan ta s y animo­

le represe'1 1ond o po r ell un a de Io s region es pr io ritonos po ro la

c nservaci on en Europo Var ios facto res ge -m or f log ico s y ambi enio­

les conlribuyen a esto ri queza, concretomente: la localizoc ion geog r6-

f ica en el ex tremo sucl oeste de Europo . el o i slamiento en re lac ion ol

resto de Europa por la barr·era geogr6 fico de Ios Pir ineos, la complej i­

dad fisiogr6 fica y la dive! si dad c! imo tico resu lionte de la heterogenei­

dod fisi og rofico y de Ios d isti ntas influencios del Atlontico y del Medi­

terraneo. Una con jugaci6n de es t s factores hacen de la pen insu la

lberica no solo uno cu na de dife re ncioci6n y especioci 6n sin tombien

un importo nte re fug io que alberg6 durante varios peri odos glociales

del Pleistoceno muchas de lds especies de plantos y anima les que hoy

colon izon el N orte y el Centra de Europa {Hewitt, 1999).

541 VIDA APlCOLA N° 173 I 20 12

La abeja negra (Apis mellifera melli­fera), por ejemplo , es uno de esos or­ganismos cuya historia esta es trecha­mentc ligada a la penfnsul<~ Iberica . Los cstudios mulecul ares su gieren que csta subespecie de abeja melffera tiene su origen en un refugio glacial Jberico a partir del cual se expandi6 (Miguel et al. , 2007) hasta ocupar el area actual que va desde Francia hasta Escandinavia y desde las Islas Brita­nicas hasta Ucrania.

A Ios factores mencionados anterior­mente, se suma la proximidad al con­tinente Africano, la cual posibilit6 un intercambio de genes entre Ios orga­nismos de Ios dos continentes habien­do contribuido consecucntement.e a la notable diversidad y complejidad ge­netica documentada en muchos orga­nism os ibericos (G6me z y Lunt , 2007) , im:luyendo a la abeja. De he­cho, varios cstudios de la abeja iberi ­ca basados en el ADN mitocondrial atestiguanla co-existencia de Ios lina­jes Africano y Europeo formando un gradiente caracterizado por la predo­minancia de hap lo tipos (tipos de ADN mitocondrial) de origen africa­no (linaje A) en la parte sur/noroeste y de Europa (linaje M) en la parte nor­te/nordeste de la penin sula Ibcrica (Serrano et al., 2011) . Es decir, la abe­ja iberica (A. m. iberiensis) comparte haplotipos con subespecies africanas (por ejemplo A. 111. intermissa , A. m. scutel/ata , A . m . adansoni) y con la abeja negra de Europa occidental.

Por otro ]ado, cicrtos marcadores moleculares del ADN nuclear, como es el caso de Ios microsatelites, cucn­tan una historia diferente a la del ADN mitocondrial , ya que no diferen­cian a la abeja iberica de la abeja ne­gra y revelan niveles residuales de in­trogresi6n de genes de origen africano en la abeja iberica ( Franck et al. , 1998). Para complicar alin mas las co­sas , estos resultados contrastan con otros marcadores geneticos nucleares como la morfologfa, feromonas y alo­zimas (ver referencias bibliograficas en De la Rlia et al. , 2009), que como el ADN mitocondrial sugieren una re­laci6n de proxim.idad genetica con las abejas del norte de Africa. Asi , ape­sar de Ios numerosos estudios realiza­dos con la variedad de marcadores

FIG.l /Mopa con la local izoci6n de Ios apiaries muestreados. Codo punto rep resento un opio rio . En coda opiario se to moron muestms de tres colmenos .

·o oo·w ;·ao .,,.,'

N 43 ' GO'N W ~ E 42 1C'( . N s

·11'0 (' '\ -~ ·x :.:~.

40' 00' •,, ..... · ., ":!.O=J

«l:' :g-ry:f'l\1 ·~.

3" C ·)"N ~

.- ? Jo c·c ·"

1o·o·o v·; 5··:.'(1 \\

FIG.2/ Detolles del muestreo de Ios obejos ibericas.

(b) Preparaci6n de Ios muestras inmediatamente despues de su colecta de Ios colmenas.

300

..

o·o o s o·c ·~

A J·~, (I N .. .42'J ~~ N .. . . . ~ ~ 0'G' N ... .. .!0 O'G''N

wo·c .. ,

~. JB 'O 0 '· Sistemos

de coordenodas geogrOficos 37'0 0 I'

WGS 1984

150 0 J,() 3e: ·o:;· N

6metros

0 0 Q

(a) Tome de z6nganos de Ios cuodros .

(c) localizoci6n del apiario con GPS y detalle de la fiche de campo.

20 I 2 / r ' l 73 VtDA A Pi ()_A / 55

inves t1go- i6n

gcneticos mencio nados antcriormen­tc, Ios patrones de diversiclad de la abeja iberica y Ios procesos evoluti­vos que cst;in en su genesis. esuln lc­jos de scr rea lme nte identificados y comprendidos . Por tanto , la abeja ibe­rica se ha revelado como un verdade­ro desaffo para Ios cientfficos , proba­blemente aun miis diffcil que otros or­ganismos ibericos por la complejidad anadida de Ios procesos contempon'i­neos realizados por Ios hurnanos (por ejemplo: el movimienlo de colonias, introduccion de reinas foraneas . se­lecci6n de colonias. introducci6n ac­cic.lental de nuevos partisitos y enfer­meuades) .

Tras la secuenciaci6n del genoma de la abcja melffera (Weinstock et a l ., 2006) , se di spone actualmentc de po­derosas he rramie ntas molecularcs y analfticas para diseccionar la comple­jidad de Ios patrones de diversidad ge­netica exhibidos por la abeja iberica. En este contcxto queremos dar a co­nocer un proyecto de investigaci6n que recurrc a !as mas avanzadas tcc­nologfas molccularc s y Ios recursos gen6micos disponibles en la platafor­ma BeeBase [http://hymenopterage­nome.org/beebasc/ j para el estudio a gran escalade la abeja iberica . Este proyecto esta financiado por la Fun­daci6n para la Ciencia c Tecnologia (PTDC/BIA-BEC/099640/2008) y esta siendo realizado por un equipo internacional que integra a investiga-

e mte1 pret 1 Ios patron s de d1ver 1dad genet1co l' eLtro y bo1o

selec ion) de la obeja iber ico y desentl a nor y comp1ender

Ios diferen tes pr c s s h1s oncos y contem o16 neos que han dodo

forma a la divers1dad que encontlamo hay n dio

See pero que e e enfoque sirvo pa ra idenh f1cor reg1ones

del genomo de la abejo ibim ca moldeadas por la s lecc ion

natural, y par ello 1mpo1 to nte po1 la adopt Kion al rn edio ,

y eventuolmente comp1ender, la base genetlco de la odaptoci6n

lo que constituye uno de Ios objeti vos fund amenta les ~·

y m6s ambic i( so de la bi logia evoluhva .

56/ VIDA APiCOLA N2 l 7 3 I 20 1 2

do res de dos centros de investigaci6n portugueses, e l Centra de lnvestiga­cion de Montanh<~ do lnstituto Poli ­tecnico d e Bragan\a (Marfa A! ice Pinto e .loan Carlos Azeve do"l y e l Centro de Biologia Molc:cular e Am­biental da Universidade do Minho (Filipe Costa) . una Univcrsidad espa­nola , la de Murein (Pilar De la Rua) , y dos Universidades Americanas, la de Texas A&l\1 (.f. Spencer Johnston) y la de Purdue (John C. Patton) .

El proyec to se inici6 en mayo de 20 I 0 con la rccogida de muestras en apiarios localizados en tres transectos dispuestos a lo lurgo de las costas Atltintica y Mcclitcrninea y cl centro de la peninsula lbcrica (Fig .l ). La to­made muestras de Ios apiarios ibcri ­cos (Fig . 2) tcrmin6 en julio de 20JO y fue posihle gracias a la colaboraci6n de numerosos apicultores y tecnicos de !as asociacioncs. que pusierona nuestra disposicion su precioso ticm­po para ayudar en esta ardua tarea, por otro ]ado muy cmiquecedora gracias a lo que. aprendimos tras el contacto con Ios apicultores . Se tornaron muestras de 7 11 colmenas re presentando 235 apiarios de 203 apicultores de Portu­gal y Espafia. Parale lamente a la co­lecci6n iberica , se ha construido una importante colcccion de referencia (en total 145 colonias) de !as subespe­cies A . m.mellifera (77), A. m. inter­missa (31 ), A.m . ea mica (20) y A. m. ligustica ( 17 ), provenientes de Fran­cia, Dinamarca, Holanda, Suiza, Rei­no Unido. Noruega, Argelia , Marrue­cos , Croacia , Serbia e Italia . Esta ta­rea finali z6 con exito en Agosto de 2011 gracias a la inestimable colabo­raci6n de muchos colegas investiga­dores de Europa y el Norte de Africa.

El genotipado del ADN nuclear de Ios 856 individuos se termin6 en octu­bre de 20 11 . Para este objetivo se re­COJTi6 a unos marcadores moleculares conocidos como "polimorfismo de nucle6tido simple" o SNP por sus si­glas en ingles (single nucleotide poly­morphism). Los SNP son unos de Ios marcadorcs moleculares mas intere­santes y prometedores debido a su abundancia en el genoma y su elevada variabilidad, la co-dominancia y la ca1idad de Ios datos, y la posibilidad

FIG .3/Detolles del procedim iento anal itico para la obtenci6n de Ios SNPs.

(oj Preporaci6n del BeadChip.

(b) iSconReader de !I lumina se usa para onalizar la seiial de fluorescencia del BeodChip .

(c) lmogen de BeodChip producido por el iScanReader. (d) Genolipado aulomotico con el software Genome Studio de lllumino® .

de uti l i;:.~c ion u gr;m escala (11° de SNP~ y de incli I· iduos J gracias a !as nuevas tecnologias moleculares . Pa­ralelamente al proyel'to de secuencia­ci6n de la abeja. se ha dcsarrollado un chip para la plataforma lllumina®, que wntempla 1536 SNPs dispersos por Ios 16 cromosomas de la abcja.lo que permite eJ analisis de todo cl ge­noma. Asf pues. recurriendo a la tec­nologia de lllumina® . disponible en la Universidad Texas A&M. el gena­mu de Ios R56 individuos fue analiza-. do a traves del genotipado de Ios 1536'. SNPs usando elllamado Golden Gate

...... -

Genotyping Assay de 11lumina@ (fig. 3) y un panel de ol igonucle6tidos di­seiiado por encargo (cusTOm aligu po­

ol assay) cuya utilizaci6n fue gentil­mcntc autorizada por Danny Vleaver. Los datos producidos para cada indi­viduo genotipado consisten en una ea­den a de 1536 nucle6tidos (por cjem­plo: GAAGGCGGCAAG ... ) coiTcs­pondientes a 15 36 po s iciones dispersas por Ios 16 cromosomas. Ac­tualmente. se estan analizando Ios da­tos de Ios SNPs , habiendose obtenido resultados preliminares bastante inte­resantes que senln oportunamcntc di-

vulgaclos (en conferencias y revi stas cientfficas y tccnicas) a ]as comunida­des cientffica y apicola.

Adem:is del componente nuclear. la composicion materna del conjunto de las mucstras sera exarninada a !raves de la secuenciaci6n de la region inter­genica del ADN mitocondrial situada entre Ios genes del .A.RN transferente de la Ieuci na (tARN'"') y el de la cito­cromo oxidasa Il (coxii). Esta region mitocondrial tambien has sido am­pliamente utilizada en estud ios dedi­versidad de la abeja en todo ei m undo. y en especial de la peninsula Iberica

20 i 2 1 I'· ' - 73 VIDA A.PiCOLA. / 57

~i11vestig J C... IOn

Noto de la outora

Aquellos opicultores que coloboro ron con este proyecto y que estem inferesodos en conocer el tipo de ADN mitocondriol de sus colonies (si tienen origen ofricono o

europeo accidental] pueden enviar un e-mail (con la identificaci6n del apicultor y la

localizaci6n del apiaria) a la direcci6n apinto@ipb.pt para solicitor esa informa­

ci6n. Dichos on61isis estar6n conclu idas a mediados de 2012 .

Agradecimientos

,.

r•

p I '

ln7 I

11 I

1 r I •

58/ VIDfl. APiCOlA ~~- 173 / 20 1 2

I, I

11

0

I I'

( ver Ginovas et a 1. . 2008) . A pcsar de que In composici6n matema de la abc­ja ibcrica es conocida a p~111ir de estu­dios anteriores, e l aniili s is del ADN mitocondrial complementara la inter­pre tacion y represenraci6n de Ios pa­trom::s de divt~rsidad genemdos por Ios SNPs .

Este proyecto tiene como objetivos (I) identificar, representar e interpre­tar los patrones de divcrsidad gcnetica (neutra y bajo se leccion) de la abeja iberica y (2) desentraiiar y compren­der los diferemes procesos historicos y contemporaneos que han dado fo r­ma ::1 la diversidad que encontnupos hoy en dfa. Se espera que cstc cnfoque sirva para identificar regioncs del ge­noma de la abeja iberica moldeaclas por la seleccion natural, y por cllu im­portantes por la adaptacion al media , y eventualmente comprender, la base genetica de la adaptacion. lo que constituye uno de los objctivos funda­mentales y mas ambicioso de la biolo­gfa evoluriva .

L<o~ supervivencia a largo plazo de cualquier ser vivo depende de su di­versidad genetica , que sera menor cuanto mayor sea la dificult<o~d de adaptaci6n al medio. En un contexto de cam bios ambientales nipidos y profundos , Ios desaffos a Ios que se enfrenran la abejas van en aumento . Por tanto , es un imperativo preservar la dest.acable herencia genctica que ha llegado hasta nuestros dfas. despues de miles de aiios de evoluci6n. La di­versidad genetic:l es la materia prima que pe rmite a la abeja responder y adaptarse a un crecienre numero de invasores exoticos (enfermedades , parasitos , dcpredadores) , la poluci6n, Ios pesticidas, el cambio climatico y las demandas de una apicultura cada vez mas competit i va. Mediante la identificac i6n de Ios patrones y los procesos de Ios componentes de la di­versidad y la importancia adaptativa del genoma de la abeja iberica , este proyecto proporcionani una informa­ci6n basica para Ios programas de me­jora y de gestion a largo plazo y para la conservaci6n de la abeja iberica. Conservar la diversidad genetica de la abeja iberica es asegurar la materia prima de la apicultura y por lo tanto la sostenibilidad de la industria apfcola .

REFERE NCIAS BIBLIOGRAFICAS

C \" •\ ' '· I .: D 1 1 \ R1 \. 1' .. \ 1 IU' · ' ' •. L (j ~ I I \ ' .. .I . t ~ lli_l!) I. vcup,q•hic·:d l'"l ln m ,,f lllll<'Lihllltlrt:t

0' \ \ ari:H i•"' n 111 . \_,;, dl1 /lifcJ u li'' rit'n~is 1 Hymcnopt~r~1 : .\.r·ii.lat.· l . ./1J! •J l • < tl ~~ l ZcJ1JiP .t: in ll Sntj· ll it t­

l il ' und F.·. tluric 'il<ir'\ f..\ \( t l r~ ·l; --lr, · ' -J- 311 D J L \ R t .1 .• P .. J \, 11 . R .. }) .l.l t 01 I' 1. R .. \l t "\. , •L. J . . ~F HI·! \ '• l .. 1. 1 ~Jifi 11 . Uin Jj.., ~.r .... i l~ . L'l)l1;:.( ·n .. lli ,•n

a nu ~. UtT~ IH ! hrca l~ it • EurPpcan h 0J h.' ~ lh .. 'l.·:- . : \ }) ir/oln t!u -J!l: 263-~ -

r,, \ , ... '". P .. G -\ R'\ 1 !~ ). L .. s. ,, l( i\ ·V. j L. CttR,\ T T . .1 \J I l ')l10 t. I'll~..'~ 'fig_ in uf \1 t." ... t J:. u n~p..:- : m ~uJ ... :-.p ~ ­

I.:IL' ~ ~ > f l1nfll.' ~ b~,.\,' ' ~ \ ,P I .. llll'l/i{i.,.d): n1..'\\ i n~ i t!fn -.. !'rc un micnl~ale lli l e ! tlHI 111ll tlL ill )JJ d l j;,JI d;tta . [J'r'/11-

l ic•ll ·' c: I l l '! 11 _1..j _

Cl{ )\H-L \ ; I.t ' 1. D.l {. 1 :;no7 L R,: u~ i a " it hin n·!'ugw: l"'~iH t c- rn, of pJJ: J , \~l.·u~r:.tph i ~- L' t 'Jh't) r :.tnL'L' in the lhrt !: 111 Pcnnbt J!a s,~,.;u .... ·,_r Dnrdrc~..~ Jn .

Hn\ t l . G.\ ·] 119tilJI . Pn ... t ~~ ~h.: J. d rt.'- l.' ~' hl ni 7at l tl n ul l:: urPJ"'~ <;' i.ln hint:1. /iio /r tt• ir ul loutuul oJ th !' i.II J­

If!.'W! S n r lt / 1 (J ~:~ 7 - I J~ .

.\ ]tea r . I . li' i' ''l" '·M .: Li ~ l ! '-1.1" . T.. . Sm Pnl< o ·. \\' .S : E'1""" -.. . -\ . r 2()P71. Cit-nc fl c•ll' 11 i1 b i11 the ~I C\l'ltll i,rnar) Jineaf!t: , , 4{11 ~ mciiU'c nr rnlcot thL' P~rcnee ~. i'tl ln1i 011 b~ Ui:-. tJ lk"C :1 11d pu:-- t - ~ Ja~..·l.J I re

~..- ~ l l n niLtt ti• 111 JHUh!·, in t h~ · \\ ~..· :--. I t:rn E un1pf'. Aritf,~ lr ' ~.' it· -~ ;>\: 1-41 155.

SrHI< '"-' · J .: (' -\'-\1\ -\ .' . F: I-ILR '- " I)) I (_j \I<( I \ . R .: c \I I"-. 1.: Dl· l \ Rl ' \ . I'. (~(II I o. o,• r\ fr ic:l " L l<

nlp .. lJXh:mJLl por lh:.:r i<L H i--h H'Ji.t t'\ Piuli \ .t d .. · la dbc_i.J i )~ ri L < L1 n. -\ r {11 ' ' ckl \ I ( Ol i t!. rt -"'' ~'Vor ·i< 11WI r/1·

A:>i, tt/!w,,. . pp. 7- 22. Do11 F' 'l i11. (\\rih•l.'" 1 IS!3f\ l/n-R-l - I:' Ill:' ::::9 -' lJ.

\\ '1 "' I• ''h . l i.~l.. G .L. RoB!'-' '><'!'. R .•\. (iJIIU>. K .C. \\ ' <~ 1 < 1 f\. J .D. E\ \'\ \. R. \ ·1 \ I > <; r. 1. H .ill. Reo­

Ill " 1 ,, '' - 0 tl. W 1 \\ L R • • \l . BnT. I'. At,l< r. . C. G. EL\ 11-.. 1, 1-1 -IRTI!: I.lli·H. Ci..l. l lo ''· E.l\l. Znr ll<'• ".

G.\. t\ \ I!J -111. 'vl..~I.G. BIT• r\1•1. \ .~1. C<>t.LI'" · ·-" .S. C . ,, .11'-'" · H.\ T.G. I . \r o<>HH C.H . Lnnn . R .r .-\. \ I• >H i l l . 1'. \ 1T. :'-Jt '<[ ' . RJ- . f' 'ovc. Z.L.P. SI )I • >I '· IJ . \\' fi~L L~ K . P. (' 11~--: 1 >:1 I. S FL i;L D .~. \ . l l " .,, 1!1 -

/ i "l C . k \ 1 J ].; \ 1\11 !\: S II-. ILL \ll .D S \:. -. r. J. I\I. T II'I '>li.S.A i nrrn.G 1:1\GG LR \l-'\. K T

B ~""'. t : KLUUI. li. (' \ '1/ \ \ ) \ LI ' )I l . C> >Ill''. \'I.()_ Oi< \l' l \ I . D. 1:-.h l \ll ~ fl 11 1. c. c \l <lRI . 1\·l.A

!:I\ 1'.:<.. S.E. F.\ ! IH U -ICI-! . S. 1'< >IW I . C .J .P. C: R. I\I\ 1 ~1 l hH I IJ£1-i\ . F. H \1 \ I . ·\.B . Ht \1\10 , _ J. I lt I ­

t< ll t.<"~ll' . .-\ K . .ln\t , _ l . K I L>"" \1, 1. :--1 . 1, \1 '1 " · R . K Ll' ll \R -i ~i. G . T.1 1: <>1·1 u. M. Ll:-. 1-1 1. LT. l.o •-

11 r: 1 " '· \ R. \ lERCI.l<. T.A R.iCH\ItlXD . S.t .. R""" li..cL u -Z IS.l: .B. R HI'-. D.B. S \TJTo 1 r. n. So HI I­

" '• I 11 '' · L. Sn J11nr s. Y. SllLJoll SH . .1. '. SlnFnl ' " · R. \ ' LL. \ IUJI .. l'. \'1 1<> "'1 ' · E. \ ' II ·H,TRAo· n . \J.R

\\-'nr t '-' I'll !'- . S .A. A"~ " l - ~.J.l.lR, .,,_., _ i\ 1.l'O I<~>' ·I . P.K . Dt \R t•r --:. \\" .. ·\ . D"'"- \ l.\1. 1:11 ''""'H. T. r _,. 1 , " 1. 1. ': •TT~"" "" " R. r. G L \I I'L. '"L 11 \ » !:L ' I, _,..,. E. K ,, " . .:1. r: -\~ ll h• ,, , ' Ill. r. t-.: 1 ""· T KL ­

"il 11-\ , 1\1 D . 1.• >RI VI'- .!\ \ :- 111 'li l ' 1. ~1. 1\ lu!tll.>f; \ . K. 011 l>fil. R. 01 tR I1I.n .. C. A. Rfl \!1. 1\ 1. St Hlilc f l. ]. SHII'i' \ . H. TIKEL"Clll . -~-'-- r oo H. J.l-1. \\ lLl iS. !\1..1. w., "'"· K .H.J. Cin r{DI>:'-' . I. LUL'"' "· K . H \('h.fTI. ,I. PF 1 1 - I{~(J :'\' . ; \_ i-IL~E'\1Tl n. t: 1 \ I . {~PUb 1. lnsi_t;ht-. inh' :-.n~o: iul ilL"'c'Ch f JPI ) ll hc gcnomt:

" f The· honeybee .-\pi 1 llll'ilit~ · ru . Ncll((l'c· -1-L'-:9.1 1 -9-l 'i.