Nematodos Entomopatogenos

NEMATODOS COMO AGENTES DE

CONTROL BIOLÓGICO

EDNA PAOLA BECERRA E

Ing. Agronómica

Seminario elementos de

microbiología agrícola 2008-II

CONTENIDO

� Introducción

� Familias

� Plagas que controlan

� Ubicación taxonómica de los nematodos � Ubicación taxonómica de los nematodos entomopatógenos

� Ciclo de vida

� Relación simbiótica (Bacterias)

� Modo de acción

� Formulación y comercialización

� Estudio de casoSeminario elementos de


CONTENIDO

� Introducción

� Principales familias



� Ciclo de vida


� Modo de acción




INTRODUCCIÓN� Los nematodos son organismos invertebrados,

multicelulares de forma alargada y cilíndrica asemejándose a un gusano

� (Nematoda, del griego nema, "hilo", eidés u oidos, "con aspecto de").

Estos presentan cuerpo no segmentado y simetría � Estos presentan cuerpo no segmentado y simetría bilateral.



NEMATODOS ENTOMOPATÓGENOS

�Agentes de Control Biológico

Organismos que parasitan larvas de insectos causando su muerte.insectos causando su muerte.

� Fácil producción, adaptabilidad en campo, buena capacidad de búsqueda (Parada, 2001).



CONTENIDO

� Introducción

� Familias



� Ciclo de vida


� Modo de acción




Familias

� Tetradonematidae

� Allantonematidae

� Sphaeruliidae

� Phaenopsitylenchidae Heterorhabditis megidis

� Mermithidae

�Heterorhabditidae

�Steinernematidae



Heterorhabditis megidis

Steinernema feltiae

CONTENIDO

� Introducción




� Ciclo de vida


� Modo de acción




Plagas que controlan�Coleópteros

Chizas



Phyllophaga spp. (Coleoptera:

Melolonthidae)

creatures.ifas.ufl.edu/field/white_grub4.htm

Ancognatha scarabaeioides

(Coleoptera: Scarabaeidae)

Plagas que controlan� Otros coleópteros de importancia económica



Premnotrypes vorax

(Coleoptera: Curculionidae)

Hypothenemus hampei

(Coleoptera: Curculionidae)

Plagas que controlan � Lepidópteros



Tecia solanivora

(Lepidoptera: Gelechiidae), Galleria mellonella

(Lepidoptera: Pyrallidae)

Phthorimaea operculella

(Lepidoptera: Gelechiidae)

Plagas que controlan

�Otras

Cyrtomenus bergi



Cyrtomenus bergi

(Hemíptero: Cydnidae)

Chinche de la yuca

CONTENIDO

� Introducción




� Ciclo de vida


� Modo de acción




Ubicación taxonómica

� Reino: Animalia

� Phylum: Aschelmyntes (Nematoda)

� Clase: Secernentea

� Orden: Rhabditida� Orden: Rhabditida

� Familia: Heterorhabditidae y Steinernematidae

� Genero :Heterorhabditis y Steinernema

� Especie: spp.



Especies

�Steinernema feltiae

�S. scarabaei

�S. carpocapsaeS. carpocapsae

�S. carpocapsae

�Heterorhabditis

Bacteriophora

H. megidisSeminario elementos de


S. carpocapsae

H. bacteriophora

CONTENIDO

� Introducción




� Ciclo de vida


� Modo de acción




Ciclo de vidaCiclo de Nematodos

� Huevo JI

� Primera muda J2

� Segunda muda J3 (infectivo)

� Tercera muda J4 � Tercera muda J4

� Cuarta muda adulto



El hospedante

muere y se

torna crema

Juveniles infectivos

Localizan el

1 Generacion

de adultos

hermafroditas

Eficiente reproducción

Y desarrollo de huevos

Ingresan por

la cutícula

JI liberan toxinas

Y fase I del

bacterio

produce

antibióticos

Y toxinas

Juveniles infectivos J3 emergen

Del cadaver del hospedante

Localizan el

hospedante

Fase I del

bacterio

Coloniza

nematodos

Y desarrollo de huevos

J1, J2, J3 y J4

2da Generación

De adultos

Tamaño 50% menor

Que la 1GEficiente

producción

Y desarrollo

de

Huevos J1, J2, J3Seminario elementos de


CONTENIDO

� Introducción




� Ciclo de vida


� Modo de acción




RELACIÓN SIMBIÓTICA

• Photorhabdus luminiscens

Heterorhabditis

BACTERIAS



luminiscens

• Xenorhabdus bovienii Steinernema

Bacteria simbionte

� Familia Enterobacteriaceae� Bacilos Gram negativos � Móviles por medio de flagelos o cilios � No se encuentran en estado libre en la naturaleza� Photorhabdus spp son bioluminiscentes y producen pigmentos

amarillos o rojos (no es común en Enterobacteriaceae)

� Fijan el cadáver del hospedante en color rojo purpúreo, anaranjado, amarillo, castaño.

� Produce antibióticos� Xenorhabdus spp presenta fase I y fase II ( estacionaria). es

catalasa negativa y no reduce nitrato (no es usual en Enterobacteriaceae)

� Se encuentra en el intestino posterior de los J3.



Diferencias (Forst y Nealson, 1996)



Relacion simbiotica

� Es incapaz de vivir en el suelo y se debe alojar en el intestino del juvenil

� Depende del juvenil infectivo para llegar al

� La bacteria mata al hospedante rápidamente y crea un ambiente conveniente para el desarrollo del nematodo, produciendo antibióticos que suprimen competencia de

BACTERIA NEMATODO

Fuente:

www.cost850.ch/welcome.html

� Depende del juvenil infectivo para llegar al hemocele (cavidad sanguínea) del hospedante

� Recibe protección del nematodo, el cual inhibe las defensas antibacterianas del hospedante.

que suprimen competencia de microorganismos.

� La bacteria transforma los tejidos del hospedante en una fuente de comida para el nematodo.

� La bacteria sirve como fuente de comida para el nematodo ( Parada et al 2002).

� La reproducción es optima cuando esta en simbiosis con la bacteria.



� Heterorhabditis bacteriophora infected waxmoth larvae. 36 hours post-infection, these larvae glow due to the symbiotic bacteria, P. luminescens.



Cranberry rootworm larvae and

pupa (middle) infected with

H. bacteriophora

http://www.oardc.ohio-

state.edu/nematodes/using_insect_parasitic_n

ematodes.htm

(a) Larva sana (crema);(b) Steinernema feltiae - cafe (c) Steinernema carpocapsae - infected (marron claro)

(d) Heterorhabditis bacteriophora -infectado (rojo) larvae of Galleria mellonella.



Características de las bacterias bacterias simbiontes


microbiología agrícola 2008-II(Forst y Nealson, 1996)

Características de las bacterias simbiontes (Forst y Nealson, 1996)

� Antibióticos: Xenorhabdinas, xenocumacinas, Hydroxistilbenes, Indoles derivados de antibióticos.

� Pigmentos: derivados de Antraquinona

� Menor actividad en la fase IISeminario elementos de


Especies de bacteria y hospederos



(Forst y Nealson, 1996)

A dissected Japanese beetle larva showing later stages

of the Heterorhabditis bacteriophora nematode.

http://www.pueblo.gsa.gov/cic_text/housing/japanese-beetle/jbeetle.htmlSeminario elementos de


Fuente: http://el-atracio.blogspot.com/search/label/CuscoSeminario elementos de


CONTENIDO

� Introducción




� Ciclo de vida


� Modo de acción




Modo y mecanismo de acción� Búsqueda de su hospedero,

� Producción de secreciones enzimáticas para entrar al cuerpo a través de la boca, ano y espiráculos del insecto hasta llegar a la hemocele.hemocele.

� El nematodo obtiene el alimento de la hemolinfa

� El nematodo regurgita la bacteria

� El hospedero muere 48 horas posterior a la inoculación

� Los infectivos salen del cadáver a los 12-14 días después de la infección.



CONTENIDO

� Introducción




� Ciclo de vida


� Modo de acción




Requerimientos medioambientales

Objetivo: mantener la movilidad y viabilidad del nematodo

�Temperatura: 12-18ºCTemperatura: 12-18ºC� Luz: Aplicación en la tarde para que la radiación UV no afecte los nematodos y aplicar con protectantes

�Humedad del suelo: capacidad de campo�Textura del suelo: no compactada



Formulación Descripción Almacenamiento

Gel alginato Contenedor de 0,5 litros, 10

millones de nemátodos

atrapados en matriz.

Contenedor de 4 litros, 250

millones de nemátodos

atrapados en matriz.

5 meses a temperatura

ambiente, 12 meses con

refrigeración.



refrigeración.

Gel poliacrilamida 3 billones de nemátodos por

caja (25 x 40 x 60 cm), 109

5 días a temperatura

ambiente, 3 meses concaja (25 x 40 x 60 cm), 109

nemátodos atrapados en 2

kg.


refrigeración.

Arcilla 50 millones de nemátodos

dispersos en 80 g de arcilla.

3 meses con refrigeración.

Gel soluble 250 millones de nemátodos

suspendidos en matriz

encerrada en bolsa plástica

(40 x 50 cm).



refrigeración.



Comercialización

� NemaSeek - Beneficial Nematodes - H. bacteriophora10 milliones de nematodos

� NEMOPAKH

heterorhabditis bacteriophoranematodos entomopatógenos de larvas de coleópteros.nematodos entomopatógenos de larvas de coleópteros.50 millones de larvas infectivas de nematodos

� B-Green

Dependiendo del envase, contiene 50 ó 500 millones de nemátodos juveniles. Los envases de 50 y 500 millones de nemátodos permiten respectivamente el tratamiento de una superficie de 100 m² y 1.000 m².

� PROBIONE

� Guardian T - Heterorhabitis bacteriorphoraProd. ID: 2210BT Seminario elementos de


CONTENIDO

� Introducción




� Ciclo de vida


� Modo de acción




Estudio de caso

�Aislamiento de Xenorhabdus bovienii, simbionte de Steinernema feltiae(Rhabditida: Steinernematidae), cepa (Rhabditida: Steinernematidae), cepa colombiana (Triviño et al., 2006).



Aislamiento de Xenorhabdus bovienii, simbionte de Steinernema feltiae (Rhabditida: Steinernematidae), cepa colombiana

�Objetivo

Aislamiento de X. bovienii, simbionte de S. feltiae, cepa simbionte de S. feltiae, cepa colombiana como etapa

inicial para determinar la cinética de población en medios de cultivo.



Introducción

� La bacteria presenta dos fases:

La fase I es de gran importancia en el proceso patogénico, provee mas nutrientes al nematodo.nutrientes al nematodo.

La fase II se observa cuando los nematodos abandonan el cadáver, en esta fase pierde algunas funciones metabólicas aun no es claro los mecanismos de variación de fase.



Introducción

� FI forman colonias redondas pequeñas, adsorbe rojo neutral en McConkey y en NBTA adsorbe Azul de Bromotimol y degradan cloruro de trifeniltetrazoliocloruro de trifeniltetrazolio

� FII Las colonias son mas grandes y no adsorben colorantes pero se tiñes de rojo al degradarse el CTT

� Es un proceso reversible identificado como fase de variación inversa



Materiales y métodos

� AISLAMIENTO:

Aislamiento a partir de hemolinfa de larvas de G. mellonella de ultimo instar.

� CARACTERIZACIÓN

Medio NBTA (agar + 0,0025% azul de bromotimol + 0,004% de cloruro de trifeniltetrazolio)

Agar McConkey para evidenciar las dos formas de la bacteria

Criterio de selección de la bacteria asimilación de azul de bromotinol a las 42 horas después de incubación.

Descripción de las colonias y pruebas bioquímicas



Materiales y métodos

� El cultivo base se inicio transfiriendo una de las colonias aisladas a un medio liquido YS, incubando a 25ºC durante dos días, en agitación a 200rpm.

� Las bacterias Fase I y fase II fueron almacenadas en medio con glicerol al 15%, en Eppendorf a -80 ºC.glicerol al 15%, en Eppendorf a -80 ºC.

ACTIVIDAD ANTIBIOTICA:

Se evaluó en fase I sobre Bacillus cereus, inoculando una placa de esta con 24 horas de crecimiento en medio nutritivodistribuyéndolo en el agar.

Se pusieron discos de papel filtro impregnados con X. bovienii de 24 horas de crecimiento en medio nutritivo.

Registro del tamaño de las zonas de inhibición a las 24 horas.



Materiales y métodos�Patogenicidad:

Soluciones (10ml) buffer fosfato (50nM)

90.000.000 - 900.000 - 90.000 - 9.000 - 900 - 9 células/ml. ( 25 larvas por dosis)

Fueron inyectadas vía oral con jeringa, en el hemocele de las larvas de últimos instares de G. mellonella.

Las larvas se dispusieron en cajas de petri y se incubaron a 21ºC en oscuridad.

Se registro la mortalidad y cambio de coloración de la cutícula durante 24 – 72 horas.

Control: solución salina



Resultados y discusión� Aislamiento y caracterización de X. bovienii

Fase I Fase II

Descripción de la

colonia

circulares convexas,

granuladas, opacas,

Planas, traslucidas,

con margen regular y



colonia granuladas, opacas,

con borde irregular

con margen regular y

mayor diámetro

Agar McConkey Coloración rojo y

rosado

Blancas o amarillas

Agar NBTA Color azul-verde con

zona clara alrededor

Rojas- marrón sin

zona clara alrededor

Resultados y discusiónNo Bioquímicas Aislamiento Literatura

1 Arabinosa + -

2 Manosa + +

3 Sacarosa - -

4 Melibiosa - -

5 Ramnosa - -

6 Sorbitol - -

7 Manitol - -

8 Adonitol - -

9 Galactosa - -

10 Inositol - -

11 p-n-p-fosfato + +

12 p-n-p-a- glucosido + +

13 p-n-p-galactosido + +

Bioquímicas complementarias

1 lactosa - -

2 sacarosa -

3 glucosa - +

4 producción de gas - -

5 rojo de metilo + -

6 voges Proskauer - -

7 sulfuros - -13 p-n-p-galactosido + +

14 Prolina nitroanilida - -

15 p-n-p-bis fosfato + +

16 p-n-p-xilosido + +

17 p-n-p-a-arabinosido + +

18 p-n-p-fosforilcolina + +

19 p-n-p-a- glucoronido - -

20 p-n-p-N- acetil glucosamida + +

21 L-glutamil p-nitroanilida + +

22 Esculina + +

23 p-nitro-DL-fenilalanina - -

24 urea + -

25 glicina + +

26 citrato - -

27 acido malonico - -

28 cloruro de trifenil tetrazolio D D

29 arginina + -

30 lisina - +Seminario elementos de


7 sulfuros - -

8 indol D +

9 movilidad - +

10 nitratos + -

11 gelatina -

12 catalasa - -

13 oxidasa + -

14 patogenicidad en larvas + +

15

adsorcion de azul de

bromotinol + +

16

colonia en Agar

McConkey Roja Marrón

Resultados y discusión

� Actividad antibiótica

Se presentaron zonas de inhibición de crecimiento con áreas promedio de 0,43 cm2 de Bacillus cereus por actividad antibiótica de X. bovienii.actividad antibiótica de X. bovienii.

El control no presento crecimiento de B. cereus .

La actividad antibiótica permite un ambiente adecuado para el nematodo ya que infecta invasores secundarios.



Resultados y discusión

� Patogenicidad

Transcurridas 24 horas se registro un 70% de mortalidad de larvas de G.mellonella.de larvas de G.mellonella.

Se obtuvieron cultivos puros de X. bovienii y se observo la rápida patogenicidad sobre el hospedante comparadas con otras sepas evaluadas por otros autores.



Conclusiones Generales� Los nematodos son Agentes de Control Biológico que

pueden ser usados en MIP.

� Las principales especies son Heterorabditis bacteriophora y Steinernema spp.

� El Nematodo es efectivo gracias a las bacterias � El Nematodo es efectivo gracias a las bacterias simbiontes de los géneros Xenorhabdus y Photorhabdus.

� Se ha comprobado su acción en plagas de importancia económica.

� Es eficaz gracias a que el nematodo busca a su hospedero y la bacteria permite la entrada y muerte del mismo.



GRACIAS



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