ÍNDEX - UdG · el medicament (Vincrisul) ja que degut a les seves propietats no s’autoritza la...
51
ÍNDEX 1 Presentació 01 2 Introducció 03 2.1 Esponges 03 2.1.1 Patata de mar (Chondrosia reniformis) 04 2.1.2 Esponja roja (Crambe crambe) 05 2.2 Eriçó comú (paracentrotus lividus) 05 2.3 Desenvolupament embrionari 07 2.4 Cicle cel·lular 10 2.5 Càncer 13 2.6 Fàrmacs anticancerígens 14 2.6.1 Estudi de nous fàrmacs 18 3 Disseny experimental 20 4 Resultats 30 4.1 Resultats del control 30 4.2 Resultats del Vincrisul 32 4.3 Resultats de l’extracte de Chorndrosia reniforis 34 4.4 Resultats de l’extracte de Crambe crambe 36 5 Discussió 38 6 Conclusions 48 7 Bibliografia 50
Transcript of ÍNDEX - UdG · el medicament (Vincrisul) ja que degut a les seves propietats no s’autoritza la...
ÍNDEX
1 Presentació 01
2 Introducció 03
2.1 Esponges 03
2.1.1 Patata de mar (Chondrosia reniformis) 04
2.1.2 Esponja roja (Crambe crambe) 05
2.2 Eriçó comú (paracentrotus lividus) 05
2.3 Desenvolupament embrionari 07
2.4 Cicle cel·lular 10
2.5 Càncer 13
2.6 Fàrmacs anticancerígens 14
2.6.1 Estudi de nous fàrmacs 18
3 Disseny experimental 20
4 Resultats 30
4.1 Resultats del control 30
4.2 Resultats del Vincrisul 32
4.3 Resultats de l’extracte de Chorndrosia reniforis 34
4.4 Resultats de l’extracte de Crambe crambe 36
5 Discussió 38
6 Conclusions 48
7 Bibliografia 50
1 PRESENTACIÓ
El treball de recerca que teniu a les mans és un estudi sobre el comportament de les
substàncies que certes espècies d’esponges produeixen com a mètode defensiu. Com
s’explicarà més endavant, entre els animals sèssils (que viuen permanentment fixats a les
roques) com les esponges, hi ha una forta competència pel substrat per això les esponges
segreguen components químics que eviten el desenvolupament d’organismes al seu
voltant.
Concretament el meu objectiu és confirmar o desmentir la hipòtesi que aquests
components tenen propietats citostàtiques, és a dir, aturen el cicle cel·lular impedint el
creixement i renovació cel·lular dels possibles organismes en competència pel substrat.
Amb aquest propòsit empraré embrions, en continua mitosis que es veuran
clarament afectats si aquestes substàncies són realment antimitòtiques. Utilitzaré
embrions de la garota Paracentrotus lividus degut a la seva fàcil obtenció, fecundació in
vitro, i observació en el microscopi. Així doncs, per tal de validar aquesta hipòtesi, el
mètode seguit ha estat sotmetre gàmetes femenines i masculines de Paracentrotus lividus
als fluids de dues espècies d’esponges diferents (la Chondrosia reniformis i la Crambe
crambe) i comparar la evolució de les mateixes en un medi normal i sota l’efecte d’un
fàrmac anticancerígen d’activitat coneguda, concretament el Vincrisul.
D’aquesta manera he treballat amb quatre solucions: una tan sols amb aigua de
mar, una altre amb Vincrisul dissolt en aigua marina i finalment dues més amb els fluids
de les dues esponges respectivament. Cal sotmetre cada medi a les mateixes condicions de
temperatura, moviment, etc. per poder-ne contrastar l’evolució posteriorment.
Val a dir que degut als meus coneixements i materials de que puc disposar, els
meus límits han estat considerables. Tot i que m’hauria agradat treballar només amb les
substàncies citades, separar-les és molt difícil i conseqüentment he hagut de treballar amb
tots els fluids corporals d’ambdues esponges. No obstant cal dir que els límits més grans
amb què m’he topat han estat de temps ja que un experiment d’aquestes característiques
requereix moltes hores de dedicació. I també de coneixements, degut a que hi ha pocs
escrits sobre aquest tema molt nou, pel que la majoria d’informació l’he buscat a Internet,
on sovint el nivell no es l’adequat o no en conec l’idioma. En la realització de
l’experiment, el primer problema amb que m’he trobat ha estat que les dates del treball no
coincidien amb l’època de fertilitat màxima dels eriçons (els mesos gener i febrer), fet que
m’ha obligat a fer l’experiment el mes de novembre en què els eriçons no estan del tot
madurs. Això ha comportat, a part del evident poc marge de temps per fer l’experiment,
que els resultats de l’experiment no hagin estat en ocasions tan significatius com ho
haurien estat en època de màxima fertilitat. D’altre banda, també ha estat difícil obtenir
el medicament (Vincrisul) ja que degut a les seves propietats no s’autoritza la venda en
farmàcies sense recepta. Així com la obtenció d’alguns dels organismes.
En quant a l’estructura del treball, el podem dividir en dues parts; la part
bibliogràfica i l’experimental. La primera part és introductòria i permet adquirir els
coneixements que m’han permès realitzar l’experiment. Consta d’una breu explicació
sobre la reproducció dels eriçons, embriologia, les esponges, el càncer a nivell cel·lular,
els principals anticancerígens i la recerca de nous antimitòtics. La segona part és el treball
experimental i el cos principal del treball. Consta primerament del disseny de
l’experiment, seguidament del mètode pas a pas, l’exposició dels resultats, la discussió i
finalment les conclusions.
Les fons citades, com ja he explicat, han estat majoritàriament Internet i llibres
molt concrets i especialitzats. També han estat molt importants les persones que m’han
proporcionat informació essencial; m’agradaria agrair en aquest àmbit, l’ajuda d’en
Francesc Camps (de l’Escola de Mar de Badalona) i de la Jus López, la meva tutora.
2 INTRODUCCIÓ
2.1 LES ESPONGES
Les esponges són un grup molt nombrós d’animals macroinvertebrats de la família dels
porífers. Viuen en hàbitats aquàtics molt variats i, encara que segons les espècies poden
resistir salinitats molt diferents la majoria (més del 97 % de les espècies), viuen al mar
a totes les profunditats i latituds.
Morfològicament parlem d’uns animals molt simples que tot i ser pluricel·lulars,
no tenen òrgans ni teixits, sinó que les seves cèl·lules tenen un alt grau d’independència,
tan sols estan unides en una matriu1 gelatinosa que les relaciona entre si. A nivell
d’organisme, les esponges presenten una forma i mida molt diferent segons l’espècie.
Tots els organismes adults tenen en comú el sistema de filtració que els permet
retenir l’aigua per tal de nodrir-se. Consta de múltiples orificis exteriors microscòpics
que mitjançant llargs conductes de diàmetres reduïts, condueixen l’aigua a cavitats
allargades on té lloc l’absorció de nutrients i que posteriorment conduiran la part no
aprofitable junt amb substàncies de rebuig als òsculs (porus d’excreció) on s’alliberaran
al mar altre cop.
Aquest mètode de nutrició els permet una vida totalment sedentària, fixats al
substrat, sense desenvolupar cap moviment fora de certes contraccions que permeten
propulsar l’aigua, tancar o obrir els porus i algun moviment local. Això determina que
visquin una forta competència, ja que el substrat és imprescindible per un gran nombre
d’organismes marins, i que hagin desenvolupat mètodes defensius.
1 Matriu: nom que prenen les parets cel·lulars de les cèl·lules animals.
Les esponges es defensen alliberant agents químics que ataquen els organismes
del voltant. Tan aferrissada és la lluita per mantenir l’espai, que sovint les substàncies
alliberades poden, fins i tot, arribar a destruir el substrat calcari.
Els components que alliberen les esponges varien segons l’espècie, i tot i que es
creu que alguns són tòxics, se’n desconeixen els components exactes. De fet és aquest
camp que em disposo a estudiar, prenent com a hipòtesi que algunes esponges alliberen
substàncies citostàtiques. És a dir, components químics que eviten la multiplicació
cel·lular dels possibles organismes en competència.
Concretament les dues espècies d’esponges que tractaré són la patata de mar
(Chondrosia reniformis) i l’esponja roja (Crambe crambe ).
2.1.1 La patata de mar (Chondrosia reniformis) La patata de mar és una dermosponja de color gris marronós. Habita a la Mediterrània a
profunditats considerables.
Té un gran interès econòmic ja que conté col·lagen. Això provoca la consistència
com de goma que caracteritza aquesta espècie i que molt provablement dificultarà el seu
maneig alhora de fer l’experiment.
En qualsevol cas el què m’ha portat a triar aquesta espècie, és la seva gran
rapidesa expansiva que em
porta a pensar que
probablement conté les substàncies
d’efecte antimitòtic que busco.
En aquesta foto de l’esquerra podem veure una colònia d’esponges d’aquesta espècie on
s’aprecia la seva gran capacitat expansiva per sobre les altres esponges del voltant.
2.1.2 L’esponja roja (Crambe crambe)
La Crambe crambe és una esponja incrustant de coloració taronja o vermellosa. És un
dels macroinvertebrats més abundants de les costes d’Espanya, Itàlia i França i pot
arribar a recobrir grans extensions de roques. La trobem entre 1 i 15 metres de
profunditat normalment evitant la llum directe del sol.
Aquesta espècie no té depredadors coneguts, però
sí una gran competència pel substrat. Per això es
sap que té gran activitat bioquímica contra altres
invertebrats bentònics; no obstant, s’ignora el seu
mecanisme d’acció. Degut a que no presenta En aquesta imatge podem veure un seguit efectes tòxics o irritants en contacte amb la pell d’esponges en competència, destaca per la efectes tòxics o irritants en contacte amb la pell seva eficiència l’esponja. Roja que ocupa gran part del substrat. humana dedueixo que els components alliberats ppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppppper la Crambe crambe podrien tenir efectes antimitòtics i per això l’estudiaré en aquest treball.
2.2 L’ERIÇÓ COMÚ (Paracentrotus lividus)
L’eriçó comú (Paracentrotus lividus) ha estat des
de l’època neolítica una espècie coneguda i
apreciada pel seu consum com a aliment altament
nutritiu. Avui en dia encara es consumeix, però
una altre de les seves aplicacions molt més actual
és en el camp de la investigació química i mèdica com a model de la mitosis degut a la
facilitat de reproduir el seu medi natural de fecundació (l’aigua marina) en el laboratori.
És per aquest motiu que l’utilitzaré en el meu treball.
Les garotes d’aquesta espècie són normalment herbívores i el seu hàbitat
compren part del mar Mediterrani i l’oceà Atlàntic Nord.
Morfològicament presenten una per una closca sòlida de forma convexa formada
per peces calcàries, longitudinalment aplanada per la part inferior. Mesura des de cinc a
vuit centímetres de diàmetre. Aquesta closca està coberta per un teixit sobre el qual
trobem les espines articulades bastant llargues que donen al eriçó una coloració externa
marronosa més o menys fosca.
A nivell de sistemes els eriçons, com la resta dels
equinoderms, són animals poc complexos de sistemes
senzills disposats dins la cavitat celomàtica que engloba la
part central del cos i els diferents apèndix.
En aquesta imatge podem veure un esquema dels òrgans interns de les garotes.
Reproducció
Els eriçons són gonocròrics, és a dir, des del seu naixement tenen gònades que en
l’època de fertilitat s’ompliran de gàmetes. Conseqüentment tenen sexe definit duran
tota la seva vida que no podem determinar exteriorment. Les gònades estan situades a
l’interior de la closca en forma de 5 saquets separats entre ells de coloració molt
característica: en l’època de fertilitat gònades femenines són vermell ataronjat, mentre
que les masculines groc ataronjat. Estan situades sobre la cara interna de la closca i
comuniquen amb l’exterior per la part superior per uns conductes anomenats gonaductes
mitjançant els quals expulsen les gàmetes, ja que la fecundació és externa.
L’època de reproducció, en les nostres costes, té lloc, normalment, entre els
mesos de setembre i abril, tot i que els millors mesos són desembre, gener i febrer.
El cicle reproductor s’inicia amb una acumulació de nutrients que permetran la
maduració i multiplicació de les cèl·lules sexuals. Quan les condicions del medi són
favorables es procedeix a l’alliberació, mitjançant la contracció de les capes musculars
de les gònades. Les gàmetes s’alliberen directament a l’aigua marina i de manera
independent a cada gònada. D’aquesta manera moltes gàmetes són alliberades i
dispersades per les corrents. Aleshores els espermatozoides són atrets cap als òvuls de la
seva espècie. Finalment es fecunden els òvuls i en unes hores evolucionen les larves.
Les larves de garota comuna , s’anomenen Pluteus i
formen part del zooplàncton durant un curt període a partir del
qual iniciaran la metamorfosi. Aquesta que dura un mes
aproximadament, culminarà amb la formació de l’esquelet adult
que té lloc al fons marí.
Imatge d’una larva Pluteus
2.3 DESENVOLUPAMENT EMBRIONÀRI
Un cop les gàmetes són alliberades a l’aigua comença un procés que culminarà amb la
formació d’una larva d’eriçó de mar.
Les poblacions de Paracentrotus lividus acostumen a estar formades per
individus d’ambdós sexes, i per tant és imminent que les gàmetes masculines i
femenines es trobin. D’altre banda cal apuntar la capacitat dels espermatozoides per
arribar fins on es troben els òvuls de la seva mateixa espècie.
Al centre, foto de dos espècimens de Paracentrotus lividus alliberant les gàmetes en dos vasos de precipitats amb aigua de mar; una femella a l’esquerra i un mascle a la dreta. Imatge d’un òvul a l’esquerra i d’espermatozoides a la dreta.
En qualsevol cas el desenvolupament embrionari s’inicia amb la fecundació d’un
òvul; i immediatament després de l’entrada del primer espermatozoide es crea la
membrana de fecundació que impedeix la polifecundació (fecundació d’un òvul per més
d’un espermatozoide) que duria a un embrió inviable.
En aquesta seqüència d’imatges es pot veure com apareix la membrana de fecundació
A continuació s’inicia la fase de divisió en què el zigot passa a ser una pilota de
cèl·lules anomenat blastòmer. La cèl·lula inicial es divideix verticalment en dues
d’iguals, posteriorment en quatre i finalment en vuit. Cada divisió es realitza
sincrònicament (totes les cèl·lules es divideixen alhora) i simètricament (totes les
cèl·lules són iguals i totipotents, és a dir, a partir de la seva divisió es poden obtenir
totes i cada una de les cèl·lules que després integraran el nou embrió).
En aquesta seqüència d’imatges podem constatar la primera divisió del blastòmer en dues cèl·lules (a la esquerra), posteriorment el pas de quatre cèl·lules a vuit ( al centre) i finalment l’estadi de vuit cèl·lules on s’aprecia clarament la diferenciació de la mida de les cèl·lules.
De vuit cèl·lules es passa a setze, no obstant, en aquest pas, tot i mantenir-se la
sincronia, la simetria desapareix. Les cèl·lules prenen tres mides diferents segons la
posició i passen a ser pluripotents, en d’altres paraules, cada una d’elles pot donar un
gran ventall de cèl·lules diferents, però no totes les que necessita l’embrió i per tant les
tres classes de cèl·lules són imprescindibles.
Aquesta pilota massissa de cèl·lules compactes en contínua
multiplicació pren el nom de mòrula. Poca estona després la mòrula
entra en un procés de blastulació en què les cèl·lules s’agrupen en
imatge.d’una mòrula forma esfèrica formant un buit interior anomenat blastocel.
Això comporta la desaparició de la membrana de fecundació i l’inici de la
gastrulació en què la blàstula perd la seva forma esfèrica i es replega sobre ella mateixa
de manera que es comença a formar un tub intern (arquènteron) que posteriorment serà
el tub intestinal de l’embrió.
A partir d’aquest punt l’arquènteron s’expandeix fins a ocupar gairebé tot el blastocel.
Un cop s’ha format completament l’arquènteron
esdevenint el tub digestiu de l’embrió; la gàstrula
comença a prendre forma triangular i la simetria
radial, que fins ara mantenia, esdevé bilateral.
En aquesta fotografia podem veure com l’arquènteron està ocupant el blastocel.
A partir d’aquest moment es formen les expansions que permetran el moviment
a la larva i lentament aquesta pren la seva forma definitiva.
En aquesta seqüència d’imatges podem veure l’evolució de l’antiga gàstrula fins a esdevenir la larva Pluteus (dreta).
2.4 CICLE CEL·LULAR
El cicle cel·lular és el conjunt de canvis que experimenta una cèl·lula mare amb
l’objectiu de donar lloc a dues cèl·lules filles idèntiques a la inicial. La durada depèn del
tipus de cèl·lula , però normalment oscil·la entre unes hores i uns quants anys.
Aquest procés és el que permet la renovació de les cèl·lules mortes en els teixits
i el desenvolupament d’un nou ésser a partir d’un zigot; així com la proliferació de les
cèl·lules canceroses. En les cèl·lules eucariotes22podem distingir tres fases: la interfase,
la mitosi i la citocinesi.
La interfase: durant aquest període, que ocupa la major part del cicle, hi ha
gran activitat en el metabolisme33de la cèl·lula que comporta un augment de la
mida. Es distingeixen tres períodes en la interfase: La fase G1, la fase S i la G2.
Fase G1: En aquest interval són sintetitzades les
proteïnes necessàries per l’augment de mida de la cèl·lula.
Fase S: La informació genètica de la cèl·lula que
està continguda en cromatina es duplica.
Fase G2: Aquesta fase, de curta durada, permet a
la cèl·lula augmentar lleugerament de volum així com
formar les proteïnes necessàries per la posterior divisió
de la cèl·lula i la duplicació dels dos centriols. La fase
esquema de la cèl·lula en la interfase finalitza amb l’inici de la condensació dels
cromosomes.
22
Cèl·lula eucariota: tipus de cèl·lula característica de tots els vegetals, animals i fongs. Es caracteritza principalment pel fet de tenir el material genètic protegit pel nucli i compartiments intracel·lulars anomenats òrganuls. 33 Metabolisme: conjunt de reaccions bioquímiques que tenen lloc en els ésser vius.
La mitosi: És en aquesta part on succeeix la reproducció del material
genètic. Es divideix en diverses fases: la profase, la metafase, l’anafase i la
telofase. És divideix en diverses fases: la profase, la metafase, l’anafase i la
telofase.
Profase: És en aquesta fase on l’ADN ja
duplicat, s’estructura formant els cromosomes que es
podran distingir amb el microscopi. Cada cromosoma està
format per dues cromàtides, cada una de les quals conté la
mateixa informació, i estan unides pel centròmer.
Els centriòls que s’han duplicat en la fase anterior Esquema d’una cèl·lula en profase .................................................................. es col·loquen lentament als pols oposats de la cèl·lula formant lentament entre ells, a mesura que es separen, els microtúbuls polars que
..............................................................................................…........................................
constitueixen el fus acromàtic.
La membrana nuclear es trenca i desapareix el nucli de manera que els
cromosomes queden dispersos pel citoplasma i els centròmers de cada cromosoma
alliberen els microtúbuls anomenats cinetocòrics.
Metafase: Els cromosomes arriben al màxim grau
de condensació. El fus acromàtic s’acaba de formar i es
disposa entre els dos pols de la cèl·lula. Simultàniament, els
microtúbuls cinetocòrics arrosseguen els cromosomes fins a
situar-los a l’equador de la cèl·lula on s’ha estès el fus
acromàtic. Els centròmers col·loquen els cromosomes
Esquema de la metafase perpendicularment orientant cada cromàtida cap a un pol.
Anafase: Les dues cromàtides de cada cromosoma
es separen pel centròmer i sincrònicament es dirigeixen cap
als pols oposats arrossegades pels microtúbuls polars que
s’allarguen per polarimerització. Degut a que una
cromàtida de cada cromosoma se situa a cada pol; a cada
un hi arriba exactament la mateixa informació genètica.
Esquema de l’anafase
Telofase: Tornen a construir-se les membranes
nuclears envoltant els cromosomes, reapareixen els nuclis i
els cromosomes es descondensen deixant de ser visibles.
Esquema de la telofase i inici de la citocinesi
La citocinesi: Aquest procés permet que la cèl·lula que fins ara tan sols
ha duplicat el seu material genètic divideixi també el citoplasma i orgànuls de la
manera més equitativa possible . Aquest procés varia substancialment segons es
tracti d’una cèl·lula vegetal o animal. Degut a que l’experiment que aquest
fonament teòric pretén recolzar és sobre cèl·lules animals explicaré aquest cas
particular. En les cèl·lules animals la citocinesi s’inicia amb l’estrangulació de la
membrana de la cèl·lula mare dividint-se en dues. A l’equador apareix un anell
contràctil format per filaments proteics, que estreny la membrana fins a formar
un solc de segmentació que s’estrenyerà fins a estrangular la cèl·lula totalment;
aconseguint que les cèl·lules filles siguin completament independents.
2.5 CÀNCER
Quan ens referim al càncer hem de tenir en compte que parlem de més d’un centenar de
malalties diferents que afecten teixits diferenciats.
Tot i que les causes de totes elles són sovint diferents i dependents de més d’un factor,
tenen en comú el seu origen.
El càncer s’inicia quan una cèl·lula a causa d’una acumulació de mutacions
genètiques (canvis en la informació genètica ) es comença a dividir de manera
incontrolada. Una de les característiques de les cèl·lules canceroses és que perden la
capacitat de reconeixement, fet que provoca el seu creixement desordenat, la formació
de tumors (acumulacions desordenades de cèl·lules), així com el seu avanç envaint els
òrgans i teixits veïns. A mida que la malaltia evoluciona es pot produir la metàstasi en
què les cèl·lules emigren a través dels sistema circulatori o limfàtic afectant altres
òrgans i teixits.
D’aquesta manera el què fa del càncer la segona causa de mort en els països
desenvolupats és la continua divisió de les cèl·lules canceroses. Això implica que molts
dels medicaments anticancerígens continguin un component que eviti la divisió cel·lular
o bé provoqui la apoptosi (suïcidi cel·lular) de les cèl·lules en divisió.
Esquema sobre l’evolució del
Esquema sobre l’evolució del càncer
2.6 FÀRMACS ANTICANCERÍGENS
Com ja s’ha explicat en el punt anterior el càncer s’origina quan un seguit de cèl·lules
anormals comencen a reproduir-se massivament escampant-se per tot el cos envaint i
fent malbé altres teixits i òrgans.
S’utilitzen per aquest propòsit fàrmacs d’efecte citostàtic; és a dir, fàrmacs que
impedeixen la mitosis aturant el cicle o fins provoquen la destrucció de la cèl·lula.
Segons el seu mecanisme d’actuació els podem dividir en els quatre grups següents:
1. Els que afecten factors extracel·lulars: No afecten la reproducció cel·lular
i per tant no els estudiaré en aquest treball.
2. Els que actuen sobre el sistema immunitàri: No afecten la reproducció
cel·lular i per tant tampoc els estudiaré en aquest treball.
3. Els que actuen sobre l’ADN : Intervenen indirectament en la mitosis .
4. Els que actuen directament sobre la mitosis .
Descriuré els fàrmacs d’efecte citostàtic, en d’altres paraules, els que actuen
directe o indirectament sobre la mitosis:
Agents que actuen sobre l’ADN: el fet d’actuar sobre l’ ADN condiciona
directament la mitosis. Tot i que normalment actua sobre la cèl·lula en un moment
qualsevol del seu cicle, els efectes no es fan palesos fins al pas de la fase G1 a la
S, en què les cadenes d’ ADN que s’han unit o bé no es poden separar ni per tant
replicar; o bé són considerades defectuoses i provoquen l’activació del gen p53,
que duu a la destrucció programada de la cèl·lula.
Químicament aquests components acostumen a tenir dos radicals que els
permeten formar enllaços químics amb les bases púriques i piramídiques de les
dues cadenes de doble hèlice de l’ADN simultàniament de manera que resulta
impossible que se separin alhora de replicar-se.
A aquest grup pertanyen els anticancerígens més freqüents. Es divideixen en
grups segons el seu mètode particular d’actuació:
Agents alquilants: Provoquen l'acció citotòxica mitjançant la formació
d'enllaços covalents entre els grups alquil d’aquests components i les
molècules nucleofíliques cel·lulars provocant alteracions irreversibles en
l’ADN i, per tant impedint la reproducció cel·lular. Són alquilants la Ifosfamida
(IFM) i el Cis-diclorodiaminoplatí (CIS-DDP).
Antimetabòlits: són químicament anàlegs de les bases púriques i
piramídiques i, per tan, intervenen en els mecanismes de síntesis del ADN,
degut a la seva gran semblança provocant cadenes que segons els defectes que
pateixin que poden ser reparades o bé comportar la destrucció cel·lular. Cal
apuntar que tot i que sembla ser un mètode eficaç no s’ha estudiat gaire.
Alguns antimetabòlits són la Citarabina i el Fluorourat.
Antibiòtics citostàtics: compostos elaborats per certs bacteris que tenen
la capacitat d’aturar el creixement cel·lular. S’uneixen a la molècula d’ADN,
bloquejant-ne la elaboració o transcripció d’ARN de manera que la replicació o
síntesi de proteïnes esdevé impossible. Tot i que cal apuntar que actuen de
manera lleugerament diferent entre ells. En formen part la Actinomicina D
(ACD) i la Mitomicina C (Mit. C).
Derivats de la epipodofilotoxina: Aquests components tenen la
capacitat de formar un triple complex (molècula formada per tres subunitats)
amb la seva pròpia molècula, la cadena d’ADN i la topoimerasa II (enzim
corrector dels errors d’ADN i restauradora) . Això comporta no només que les
cadenes d’ADN siguin anòmales sinó que no es poden corregir sense la
topoimerasa sinó únicament tallar. Alguns derivats de la epipodofilotoxina són
l’ Etopàsit i el Tenipòsit.
Complexes de platí: Aquests components reaccionen quan entren dins
la cèl·lula de manera que queden lliures dues valències del ió platí això permet
que s’uneixin simultàniament a dues bases de l’ADN amb un enllaç estable.
Normalment s’uneixen a dues molècules de Guanina en la mateixa cadena o
formant ponts entre cadenes diferents.
Això comporta errors de transcripció (en cas que els pons siguin en la
mateixa cadena) o dobles hèlixs impossibles de separar ni conseqüentment
duplicar (en cas que els pons siguin entre cadenes diferents).Alguns fàrmacs
complexes de platí són l’ Oxaliplatí i el Carboplatí.
Campototecines: Derivats de la campotecina. Actuen sobre la
topoisomerassa II (encarregada d’evitar les tensions trencant i reunint les
cadenes, en la duplicació de l’ADN i transcripció de l’ARN) acoblant-se a ella
i estabilitzant-la. D’aquesta manera que quan la topoimerassa s’uneix amb les
cadenes d’ ADN s’hi uneix establement de manera que un cop reparada la
tensió es manté unida a la cadena impedint que la replicació o transcripció
continuï.
El què fa especialment eficaços aquests tipus de fàrmacs és que
actuen sobretot en les cèl·lules canceroses ja que presenten una major quantitat
de topoisomerassa i, per tant, el seu efecte sobre la resta de cèl·lules normals és
menor. Alguns exemples concrets són l’ Irinotecà i el Topotecà.
Els que actuen sobre la mitosis (sense afectar l’ADN): inhibeixen la
mitosis sense pràcticament afectar l’ ADN ni les cèl·lules en la interfase.
Influeixen en els microtúbuls que formen el fus acromàtic i microtúbuls
cinetocòrics indispensables en el repartiment dels cromosomes.
Els microtúbuls es regeixen per un estret equilibri entre la despolimerització i la
polimerització , és a dir, el pas de tubulina a microtúbuls i viceversa. D’aquesta
manera aquests components trenquen l’ equilibri i eviten la divisió cel·lular. Hi ha
bàsicament dos tipus de fàrmacs amb una actuació d’aquesta mena:
Els Alcaloides de la Vinca: són substàncies naturals extretes dels
vegetals; actuen sobre la tubulina i eviten que es polimeritzi en microtúbuls de
manera que el fus acromàtic el fus acromàtic i microtúbuls cinetocòrics no es
poden formar. Això provoca que en la metafase el cicle s’aturi i els
cromosomes es dispersin o agrupin anormalment. Són alcaloides La
Vinblastina i La Vincristina (VCR) : Aquest és el component actiu del fàrmac
que utilitzaré (amb nom comercial Vincrisul).
Taxoides: Aquests components provoquen la formació precipitada de
microtúbuls en unir-se a la B-tubulina. En conseqüència els microtúbuls són
anormals o massa estables i no poden despolimeritzar-se en tubulina i per tan
no són aptes per a la mitosis.
Tot i que gràcies a als anteriors fàrmacs; en el transcurs d’aquests últims anys s’ha
aconseguit guarir algunes malalties malignes i disminuir l’efecte de moltes altres,
augmentant la qualitat de vida dels pacients, cada vegada més persones presenten
resistència a un nombre important de medicaments, cosa que impedeix prosseguir amb
el tractament. També cal tenir en compte que sovint els medicaments citats tenen una
actuació tan violenta i poc selectiva que afebleix dràsticament als pacients.
És per això que s’estan investigant encara nous medicaments de diferent mètode
d’actuació que no afectin la resta de cèl·lules no canceroses.
2.6.1 Estudi de nous fàrmacs
Tenint en compte la gran biodiversitat del nostre planeta, ressalta sobretot la diversitat
marina ja que parlem del 70% de la superfície planetària. Alguns d’aquests organismes
han desenvolupat mecanismes biològics de defensa que permeten la seva supervivència
mitjançant la emissió d’agents químics naturals que podrien proporcionar-nos fàrmacs
amb nous mètodes d’acció per tal d’aplicar-los als pacients amb resistència als actuals.
Aquesta riquesa biològica durant molt de temps no ha estat gairebé emprada en
el món de la medicina degut a la dificultat d’obtenir els organismes o compostos i la
inversió tan costosa que comporta. No obstant, les recents innovacions tecnològiques en
el camp de l’anàlisi han permès que s’iniciïn investigacions molt més eficients en la
recerca de components de medicaments. A continuació citaré alguns dels compostos que
s’han obtingut i que encara estan en període d’avaluació:
YondelisTM (ET-743): deriva d’un tunicat44(Ecteinascidia turbinata) dels
mars del Carib i Mediterrani. Actua sobre diversos tipus de sarcoma, càncer de
mama, d’ovari i de pulmó. Està en període d’assaig clínic avançat.
44
Tunicat: Grup d'animals pertanyent als cordats, que es caracteritzen perquè en estat larval presenten un cordó nerviós dorsal .
ET-743 s’acobla al ADN impedint-ne la replicació, això comporta en la
majoria de casos que la cèl·lula pateixi una apoptosi, és a dir, una autodestrució
programada de la cèl·lula. Aquest mètode d’acció, tot i presentar molts avantatges
afecta les cèl·lules normals en divisió; que es tradueix en importants efectes
secundaris.
Aplidin®: Deriva d’un altre tunicat (Deshidrodidemnina B). Actua mitjançant
el bloqueig de la mitosis en la fase G1/G2 del cicle de les cèl·lules en divisió
provocant apoptosi cel·lular. També evita la secreció d’una proteïna (VEGF)
imprescindible per la circulació sanguínia i creixement en determinats tumors.
kahalalide F: Aquest component prominent del molusc (Elysia rufescens)
encara està en assaigs clínics inicials. S’ha demostrat la seva eficiència contra el
càncer hepàtic, un dels més freqüents a nivell mundial. Kahalalide F altera la funció
de la membrana dels lisosomes5. Es creu que manté una selectivitat pels tumors.
Variolina B: Aquest compost derivat d’una esponja, es presenta prometedor
en diversos tipus de càncer. La seva eficiència rau en què ataca preferentment les
cèl·lules que tenen funcional el gen p53; gen que normalment té un paper clau en el
desenvolupament dels tumors. Això permet una actuació selectiva en vers les
cèl·lules cancerígenes.
ES-285: aquest agent anticancerigen que deriva de la cloïssa (Mactromeris
polinyma), està en fase de desenvolupament selectiu en diversos tipus de tumors .
Actua mitjançant l’alteració del citoesquelet65de les cèl·lules canceroses.
5 Lisosoma: vesícula situada al citoplasma cel·lular que conté enzims digestius. 65Citoesquelet cel·lular: Conjunt de filaments proteics situats al citoplasma cel·lular .
3 DISSENY EXPERIMENTAL
Per poder demostrar que els fluids de certes esponges tenen propietats antimitòtiques
sotmetré embrions (les cèl·lules dels quals estan en divisió constant) de Paracentrotus
lividus als fluids de dues esponges concretes . D’aquesta manera comparant l’evolució
dels embrions sotmesos a cada un dels fluids, podré determinar si actuen de la mateixa
manera i si cap d’elles té efecte antimitòtic.
Amb aquest propòsit hem d’obtenir gàmetes d’eriçó comú de mar
(Paracentrotus lividus).Els embrions d’aquest tipus d’eriçons són molt utilitzats en
embriologia degut a que poden desenvolupar-se de forma senzilla in vitro (fora del cos),
que la seva mida permet una bona observació en el microscopi i que el seu
desenvolupament no acostuma a durar més de 48 hores.
La primera esponja que estudiarem és la Chondrosia reniformis, perquè com ja
s’ha exposat en la part teòrica, té una gran capacitat extensiva que li permet
desenvolupar-se amb molta rapidesa; cosa que ens indueix a pensar que aquesta esponja
pot contenir les substàncies que busquem.
La segona esponja que estudiarem és la Crambe crambe, que té una gran
activitat química demostrada.
Per obtenir els fluids de les dues esponges seria adequat estudiar els líquids que
emana en el seu habitat natural, o bé separar els components citats amb un cromatògraf
de líquids. No obstant degut a que no tenim el temps, els coneixements ni els recursos
suficients per fer-ho, treballarem amb els líquids obtinguts a partir de triturar les dues
esponges. Això implica que els components de possible actuació antimitòtica que
estudiem es barregin amb la resta de fluids vitals i que possiblement altres components
com enzims digestius afectin els embrions.
A més a més, per poder assegurar que els resultats obtinguts són només fruit de
l’actuació d’aquests components i no de les manipulacions que comporta l’experiment;
és necessari contrastar l’evolució dels embrions sotmesos als líquids de les esponges
amb l’evolució dels mateixos en aigua marina (el control) i sota els efectes d’un
anticancerigen demostrat.
D’aquesta manera si realitzem l’experiment en els quatre medis diferents ( un
amb una determinada concentració de fluids de l’esponja Chondrosia reniformis en
aigua de mar, un altre amb fluids de l’esponja Crambe crambe en aigua marina, l’altre
només amb aigua de mar i l’últim amb un anticancerigen dissolt en aigua de mar)
sotmesos a les mateixes condicions, podrem afirmar que les diferències entre l’evolució
dels embrions en el medi d’extracte d’esponges i en el control són fruit de l’actuació
dels components de les esponges.
I comparant-ne l’evolució amb els embrions del medi amb un anticancerigen
podrem acabar de confirmar si les esponges tenen o no poder antimitòtic.
Utilitzarem com a antimitòtic el Vincrisul, un anticancerigen comercial amb la
Vincristina com a component actiu, d’origen natural que com ja hem explicat en la
introducció (anticancerígens) afecta al material genètic.
És evident que els embrions han de desenvolupar-se en aigua de mar com a
suport i considerant que s’han de prendre diverses mostres, podem determinar que els
quatre medis siguin de 200 ml d’aigua de mar amb els components que calgui dissolts.
Un cop haguem obtingut el fluid de les dues esponges, cal filtrar-lo per evitar
que trossos d’òrgans o esquelet ens dificultin la posterior observació dels embrions amb
el microscopi. Si considerem que les substàncies que busquem actuen en dissolució en
l’aigua marina, és evident que cal dissoldre els fluids de les esponges que hem obtingut,
en aigua salada.
Tenint en compte que no podem consultar precedents de cap experiment de les
mateixes característiques és difícil triar-ne la concentració i per tant el volum de fluids
que n’hem de prendre.
No obstant, basant-nos en que la secreció de components químics al seu voltant
és una activitat secundària i només portada a terme per un tipus determinat de cèl·lules
hem de considerar que la proporció d’aquestes substàncies amb possibles
característiques antimitòtiques és ínfima respecte a la resta de fluids corporals de
l’esponja. Però també que actuen en quantitats molt petites afectant organismes
bentònics molt més grans i protegits que els embrions.
Per això hem d’agafar un volum de fluids d’esponja suficientment gran com
perquè aquestes substàncies tinguin efecte i alhora que no produeixin problemes
osmòtics als embrions molt sensibles a concentracions diferents a la marina.
Totes les anteriors consideracions ens porten a dissoldre en aigua marina els
fluids d’esponja a menys del 10% concretament al 7’5 %. És a dir, que per cada
mil·lilitre d’aigua marina hi afegirem 0’075 mil·lilitres dels fluids d’esponja filtrats fins
a obtenir els 200 ml amb que volem treballar.
La concentració de fluids en l’aigua marina ha de ser la mateixa per les dues
esponges ja que volem que siguin comparables entre elles de manera que els resultats no
depenguin de la quantitat dels fluids, sinó de la qualitat d’aquests.
També cal determinar la concentració de Vincrisul en els 200 ml amb que
treballem. Per tal de determinar-la tindrem en compte la dosi recomanada per nadons de
menys de 10 kg. La dosi recomanada en aquests casos és de 0’05mg en 10 kg és a dir en
700ml si tenim en compte que en els nadons tenen aproximadament un 70% d’aigua. Si
en 700 ml tenim 0’05mg podem deduir que en 200ml n’hi hauran 0’0143 mg
aproximadament.
0’05 mg = X mg 700 ml 200ml X = 0’0143 mg aproximadament. I considerant que els embrions estan en contacte directe amb la dissolució i que la
quantitat de mitosis és molt superior n’utilitzarem només la meitat: uns 0’007 mg.
Preparem els quatre medis: un amb només aigua de mar, un altre amb el
Vincrisul dissolt, el tercer amb extracte d’esponja Chondrosia reniformis i el quart amb
extracte d’esponja Crambe crambe. Col·loquem els òvuls i espermatozoides de garota a
cada vas de precipitats procurant sotmetre els quatre vasos a les mateixes condicions:
mateixa temperatura (a uns 17ºC amb fortes oscil·lacions tèrmiques), qualitat d’aigua
similar, mateixa fertilitat de les gàmetes, mateixa quantitat de gàmetes, etc.
Així prenent mostres a diferents temps podrem determinar el desenvolupament
normal dels embrions en el control, el desenvolupament sota l’efecte d’un antimitòtic
demostrat i contrastant-los amb el desenvolupament dels mateixos sota l’efecte dels
fluids de les dues espècies diferents d’esponja, podrem acabar determinant si realment
tenen substàncies de propietats anticancerígenes.
MATERIAL NECESSÀRI :
Utensilis:
- Vareta - Embut - Paper de filtre - Batedora - Proveta (a poder ser de 100 ml per a una major precisió) - Microscopi ( el més òptim és que pot augmentar la imatge 40 i 100
vegades) - 2 agulles emmanegades - 1 safata - guants gruixuts - guants de metge - mascareta - 4 pipetes petites (jo he utilitzat 3 xeringues per la seva facilitat de
maneig) - comptagotes
- pipetes - tisores - portaobjectes - 4 vasos de precipitats de 200ml - 2 pinces - 2 càpsules de petri - 28 pots petits de vidre ( o dels carrets de les fotos ) - 2 espàtules - una pipeta de 10 ml - una pera - un retolador permanent
Substàncies:
- solució de formol - Vincrisul
Organismes:
- 6 garotes - 2 esponges( una de l’espècie Chondrosia reniformis i l’altre de
l’espècie Crambe crambe )
PROCEDIMENTS
Preparació del medi amb esponja1 (Chondrosia reniformis):
1. Agafem la primera esponja (Chondrosia reniformis) i la triturem amb la batedora
afegint-hi si cal unes gotes d’aigua de mar.
2. Quan al fons del recipient tinguem una base líquida, podem deixar de triturar ja que
aquestes esponges tenen un esquelet de col·lagen que ens impedeix una trituració
completa.
3. Col·loquem l’embut sobre la proveta i retallem el paper de filtre de manera que
encaixi a l’embut. Seguidament hi aboquem la part líquida i esperem que es filtri. Fins
a obtenir-ne 14 ml que conformaran el 7’5 % en volum de la dissolució. Els col·loquem
en un vas de precipitats.
4. Hi afegim aigua de mar fins a obtenir 200 ml.
Preparació del medi amb esponja Crambe2 (Crambe crambe):
5. Repetim el procés amb la següent esponja (Crambe crambe) que també hem de
triturar. Aquesta, degut a la seva constitució no calcària la podem triturar amb molta
més facilitat.
6. Quan tinguem una quantitat considerable de fluid, procedim a filtrar-lo amb l’embut
i un nou paper de filtre fins a obtenir 14 ml que de la mateixa manera aboquem al vas de
precipitats.
7. Acabem d’omplir el vas de precipitats amb aigua de mar.
Preparació del medi amb medicament Vincrisul:
8. Cal considerar la naturalesa antimitòtica d’aquest medicament abans del seva
manipulació, aquesta requereix l’ús de guants i de mascareta.
Com ja s’ha justificat en el disseny de l’experiment hem de dissoldre 0’00745
mg aproximadament de Vincrisul en 200 ml d’aigua salada.
9. Per tal d’evitar la manipulació directa podem dissoldre el medicament per fases. En
primer lloc dissolem la pastilla sencera de 100 mg de Vincrisul en 1 litre d’aigua salada.
10. Un cop totalment dissolta, agafem amb la pipeta graduada amb pera 10 ml i els
tornem a dissoldre en un altre litre d’aigua salada. Això ens permet que agafant 7 ml
d’aquesta segona dissolució obtinguem aproximadament els 0’0143 mg necessaris.
1ª dissolució: 2ª dissolució:
100 mg = X mg 1 mg = 0’007 mg 1000 ml 10 ml X= 1mg 1000ml Y ml Y= 7 ml
11. Col·loquem els 7ml en el tercer vas de precipitats i acabem d’omplir-lo amb aigua de
mar fins als 200 ml.
Preparació del medi del control:
12. Mesurem 200 ml d’aigua de mar i els aboquem a l’últim vas de precipitats.
Preparació de les gàmetes de les garotes:
13. Primerament cal obtenir un mínim de 6 eriçons vius d’aquesta espècie (per tal de
garantir la presència de mascles i femelles fèrtils) i extreure’n les gàmetes. Degut a l’època
de l’any en què ens trobem qualsevol mètode no traumàtic (que no suposi la mort de l’eriçó)
per extreure’n les gàmetes és inviable; ja que la quantitat d’aquestes és limitada i tan el sexe
de l’eriçó com la fertilitat d’aquests no es pot1determinar sense obrir-lo. Conseqüentment
hem d’obrir els eriçons1fins a trobar-ne dos de mascles (amb les gònades grogosses) i dues
femelles (amb les gònades vermelloses). Per evitar punxar-se podem utilitzar els guants
gruixuts tenint molt en compte que cal
obrir-les1amb les tisores no per la meitat
ja que trencaríem les gònades; sinó
1que per les dues terceres parts.
Esquema de com obrir les garotes sense malmetre les gònades
14.1Un cop obertes dues garotes femelles i dos mascles; les netegen en una galleda d’aigua
salada per tal d’extreure’n els òrgans no sexuals. Les restes que pugin quedar les podem
treure amb les pinces amb cura1de no trencar les gònades.
15. Comencem amb la manipulació de les femelles, ja que en cas contrari els
espermatozoides activarien el seu moviment en contacte1amb l’aigua de mar i degut al veu
petit volum i conseqüent1escassetat de nutrients en entrar en contacte amb els òvuls la
seva1mobilitat seria reduïda o nul·la amb la disminució de l’índex de fecundació que això
comporta.
A la imatge de la dreta podem veure una garota mascle i a l’esquerra una femella, ambdós fèrtils i ja netejades.
Amb un moviment de l’exterior cap a l’ interior de l’ espàtula extraiem les
gònades de les femelles sense trencar-les i les col·loquem en un vidre de rellotge.
Seguidament les obrim i n’extraiem les fibres que conformen el sac de manera que
s’alliberen els òvuls. Hi afegim amb el comptagotes aigua de mar i hi dissolem els òvuls
per possibilitar la posterior dosificació en els quatre vasos de precipitats mitjançant el
comptagotes.
16. Repetim el procés amb els mascles, procurant no afegir l’aigua de marina fins ben al
final.
17. Aboquem 5 gotes del contingut vidre de rellotge dels òvuls a cada vas de precipitats
i posteriorment 1 gota d’esperma del contingut vidre de rellotge dels
espermatozoides. Aquest moment és el que considerem t0 . Per tant cal tenir present
l’hora exacte per poder procedir a la presa de mostres posteriors amb exactitud.
Presa de mostres:
18. Prenem els 28 pots de vidre o dels carrets en els quals haurem de col·locar els
embrions de cada vas a cada temps. Per a una òptima fixació de les estructures, és
necessari que les mostres continguin un 4% (en volum) de formol. Així doncs si les
mostres volem que siguin de 2 ml, i el formol que tenim és del 20%, hi ha d’haver-hi
0’5 ml de formol aproximadament i uns 1’5 ml. És a dir:
2 ml de dó formol1 . 4 ml de formol . 120 ml de dó formol2 = 0’46ml 0’46 ml ( 0’5 ml 104 ml de dó formol1 20 ml de formol ( uns 0’5 ml)
dó de formol1: és la dissolució del 4% que volem obtenir. dó de formol2: és la dissolució del 20% que ja tenim.
19. Un cop hem col·locat a cada pot mig ml de formol, és útil marcar amb un retolador
permanent 7 pots com a control (C), 7 com a medicament (M) , 7 més com a
esponja1 (E1), i els restants com a esponja2(E2). D’aquests quatre grups cada un
segons un temps determinat (t1, t2, t3,t4,t5,t6 o t7).
20. Un cop marcats tots els pots i omplerts amb formol hem de començar la presa de
mostres. Per fer-ho podem fer ús de les 4 pipetes petites (en el meu cas 3 xeringues
per la seva facilitat de maneig i la pipeta gran amb pera).
Les primeres preses han de tenir lloc 1’5 hores després del temps 0. Cal prendre
1’5 ml de mostra de cada vas de precipitats. Tenint en compte que en aquest
moment els embrions no tenen capacitat pròpia de moviment, és convenient prendre
la mostra del fons del recipients fent servir els quatre estris diferents per no barrejar-
les i col·locar-les als seus respectius pots de vidre o de carrets prèviament marcats.
Seguint el mateix mètode s’han de dur a terme les següents preses:
- Les segones passades 2’5h del temps 0. També cal prendre-les del fons dels
recipients.
- Les terceres passades 4h del temps 0, del fons dels recipients.
- Les quartes passades 6h del temps 0, del fons dels recipients.
- Les cinquenes passades 10h del temps 0. En aquest moment prenent per
exemple d’altres experiments realitzats sobre embrions de garotes podem suposar que
hauran arribat a larves i per tant adquirit mobilitat pròpia. Això determina que es trobin
disperses per tot el vas i per tant prendrem les mostres de la part central dels vasos de
precipitats.
- Les sisenes passades 24h del temps 0, de la part central dels recipients.
- Les setenes passades 48h del temps 0, de la part central dels recipients.
Fotografia de la realització de l’experiment
Observació de les mostres:
21. Una vegada hem pres totes les mostres, només queda observar-les amb un
microscopi. Per determinar-ne els resultats, agafem 2 o 3 gotes d’un mateix pot i les
col·loquem en un portaobjectes que observarem amb l’objectiu de 40 augments.
Repetim la operació varies vegades, prenen les mostres del mateix pot i anotant
l’estat dels embrions que veiem fins a trobar-ne un mínim de 10. Pot donar-se el cas
d’observar tota la mostra i no arribar als 10 en aquest cas també cal deixar-ne
constància. Cal repetir l’esmentat procés per cada pot; netejant el comptagotes
emprat, amb aigua de mar per evitar barreges de mostres.
4 RESULTATS 4.1 Resultats del control
Òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gastrula Larva Aberració total CONTROL
NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº
t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h) 8 57% 5 36% 1 7% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 14
t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h) 6 46% 3 23% 3 23% 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13
t3 (4h)t3 (4h)t3 (4h)t3 (4h) 2 29% 0 0% 0 0% 1 14% 4 57% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 7
t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h) 2 40% 1 20% 1 20% 0 0% 0 0% 0 0 % 0 0% 0 0% 0 0% 1 20% 4
t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 2 100% 0 0% 2
t7 (48h)t7 (48h)t7 (48h)t7 (48h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 2 100% 0 0% 2
Els resultats ens mostren l’evolució dels embrions en el control, és a dir, el seu
desenvolupament sota les condicions concretes de l’experiment sense l’actuació de
substàncies antimitòtiques. Es pot observar que el percentatge d’òvuls que no han estat
fecundats és important des de el primer moment, en què el conjunt de fecundats també
és rellevant en front a una petita porció d’embrions que han cursat fins a dues cèl·lules.
En el segon temps es pot veure que continuen tenint molt de pes els òvuls, però
també destaca una gran part dels fecundats, no tan nombrosos, han cursat fins a l’estadi
de dues cèl·lules i una petita porció fins a dividir-se en quatre cèl·lules. En el tercer
temps veiem que el nombre de no fecundats disminueix i la de fecundats esdevé nul·la.
La quantitat d’embrions de 4 cèl·lules augmenta i sobretot la quantitat d’embrions de 8
cèl·lules que creix espectacularment situant-se a gairebé el 60%.
En el quart temps s’observa un augment dels òvuls no fecundats en detriment
dels altres estadis, ja que solament es pot veure un embrió dividit en dues cèl·lules i un
d’aberrant. En el cinquè temps no es troba cap embrió ni òvul no fecundat; mentre que
en el sisè temps tots els embrions es troben en estat larval, concretament larves inicials.
En l’últim temps també hi ha un 100% de larves, que a diferència de l’anterior la meitat
estan en un estadi més desenvolupat.
Control
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
t1 (1'5 h) t2 (2'5h) t3 (4h) t4 (6h) t5 (10h) t6 (24h) t7 (48h)
no fecundats
fecundats
2 cèl·lules
4 cèl·lules
8 cèl·lules
mòrula
blàstula
gàstrula
larva
aberracions
4.2 Resultats del Vincrisul
Òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gastrula Larva Aberració total VINCRISUL
%%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº
t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h) 6 46% 7 54% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13
t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h) 8 62% 1 8% 3 23% 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13
t3 (4h)t3 (4h)t3 (4h)t3 (4h) 2 25% 0 0% 2 25% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 4 50% 8
t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h) 2 29% 1 14% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 3 43% 7
t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
t7 (48h)t7 (48h)t7 (48h)t7 (48h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
Els resultats mostren l’evolució dels embrions sotmesos a un antimitòtic demostrat: el
Vincrisul, és a dir, si la hipòtesi d’aquest treball és correcta haurien de mostrar el model
de comportament de les esponges. Podem veure que el percentatge d’òvuls que no han
estat fecundats és important, però no tant com en el control, ja que en el primer temps la
quantitat de fecundats és lleugerament superior.
En el segon temps, en canvi, s’observa que els no fecundats prenen gran
importància davant d’un gran ventall d’estadis. Una petita porció estan fecundats, un
altre grup més nombrós s’ha dividit en dues cèl·lules i una altra minoria en quatre
cèl·lules.
En el tercer temps es pot veure que la quantitat de no fecundats disminueix i la
de fecundats esdevé nul·la. La quantitat d’embrions de 2 cèl·lules és lleugerament
inferior en front a l’aparició de la meitat d’aberrants.
En el quart temps torna a destacar una petita part de no fecundats i algun de
fecundat, la quantitat d’embrions de dues cèl·lules es pot constatar que s’ha reduït i la
quantitat d’aberracions es manté. En els successius temps, no la presència de cap embrió
ni òvul.
4.3 RESULTATS DE L’EXTRACTE DE L’ ESPONJA1 (Chondrosia reniformis)
òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gastrula Larva Aberració total Extracte de
l’esponja1 %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº
t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h) 6 46% 7 54% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13
t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h) 8 62% 1 8% 3 23% 1 8% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13
t3 (4ht3 (4ht3 (4ht3 (4h)))) 2 25% 0 0% 2 25% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 4 50% 8
t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h) 2 29% 1 14% 1 14% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 3 43% 7
t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
t7 (48t7 (48t7 (48t7 (48h)h)h)h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
Els resultats ens mostren l’evolució dels embrions sotmesos a la primera esponja,
aquests resultats que seran contrastats amb els del control i medicament són la part més
important d’aquest treball.
En el primer temps podem veure un alt percentatge d’òvuls, molt més gran que
en el control i medicament tan sols podem constatar una petita porció de zigots.
En el segon temps els òvuls disminueixen en front dels zigots i de l’aparició
d’un petit tan per cent d’aberracions.
En el tercer temps es pot veure que no hi ha presència de cap embrió o gàmeta;
situació que es manté durant tots els temps successius.
Esponja 1
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
t1 t2 t3 t4 t5 t6 t7
no fecundats
fecundats
2 cèl·lules
4 cèl·lules
8 cèl·lules
mòrula
blàstula
gàstrula
larva
aberracions
4.4 RESULTATS DE L’EXTRACTE DE L’ ESPONJA2 (Crambe crambe)
òvuls Fecundat 2 cèl·lules 4 cèl·lules 8 cèl·lules Mòrula Blàstula Gàstrula Larva Aberració total Extracte de
l’esponja2 %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº %%%% NºNºNºNº
t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h)t1 (1'5 h) 3 100% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 3
t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h)t2 (2'5h) 13 72% 4 22% 1 6% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 18
t3 (4h)t3 (4h)t3 (4h)t3 (4h) 9 90% 1 10% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 10
t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h)t4 (6h) 13 100% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 13
t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h)t5 (10h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h)t6 (24h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
t7 (48h)t7 (48h)t7 (48h)t7 (48h) 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0 0% 0
Els resultats mostren l’evolució dels embrions sotmesos a la segona esponja, resultats
que seran comparats amb els del control i medicament són la part més important
d’aquest treball.
En el primer temps només trobem òvuls.
En el segon temps els no fecundats disminueixen notablement, mentre que
apareixen zigots i embrions en estadi de dues cèl·lules.
En el tercer temps tornen a augmentar els òvuls sense fecundar i trobem una
proporció de zigots molt petita.
En el quart temps es tornen a trobar solament òvuls i a partir d’aquest moment,
en els temps successius no hi ha cap altre embrió o òvul.
5 DISCUSSIÓ
Aquest gràfic mostra l’estat dels embrions en els primer temps(després d’ una hora i
mitja de l’inici de l’experiment).
Es pot veure a primera vista una gran quantitat d’òvuls sense fecundar. El fet
que sigui una característica més o menys comuna en tots els medis ens suggereix que
possiblement es deu a condicions externes a l’experiment. Concretament és molt
probable que sigui fruit de l’escassa fertilitat de les garotes atesa l’època de l’any en que
ens trobem, just entrada l’època de reproducció.
En aquesta imatge, presa durant l’experiment, es pot constatar que de totes les garotes obertes tan sols trobem dues femelles (a baix als extrems) i una d’elles no està suficientment madura. En el cas dels mascles també només un té les gònades del tot preparades , el de la dreta. Aquesta escassetat d’eriçons amb les gònades preparades fa que depenguem de la fertilitat de les gàmetes dels dos únics individus madurs, els dos de la dreta.
tem ps 1
0 %
1 0 %
2 0 %
3 0 %
4 0 %
5 0 %
6 0 %
7 0 %
8 0 %
9 0 %
10 0 %
òv ul s
fe c
undats
2 cèl·lu
les
4 cè·lules
8 cè ·lules
mò ru le s
bl às tu le s
gà st rules
la rv e
s
abe r
r ac io n
s
contro l
extracte
d'esponja 1
extracte
d'esponja 2
vincr isu l
També és rellevant la gran quantitat d’òvuls fecundats en el Vincrisul respecte al
control. Provablement es deu a que la solució del Vincrisul és hipertònica respecte a la
marina, però de naturalesa semblant, això en alguns casos
pot confondre a l’òvul que activa la formació de la
membrana de fecundació prematurament. Per tant és
possible que alguns d’aquests òvuls no siguin
veritablement fecundats i no pugin desenvolupar-se.
En aquesta fotografia, presa durant l’experiment del medi del Vincrisul a 400 augments podem
veure clarament un zigot . Es distingeix la membrana de fecundació amb claredat. No obstant, és
possible que com s’ha explicat anteriorment sigui un fals fecundat i que no pugi passar als
estadis següents.
D’altre banda crida l’atenció l’absència de zigots en el medi amb extracte de la
segona esponja: Crambe crambe. Això que en principi es podria entendre com a un
efecte dràstic sobre els espermatozoides per part de les substàncies tòxiques de
l’extracte de l’esponja (el fet de triturar la totalitat de l’esponja provoca que s’alliberin
substàncies corrosives com ara enzims digestius) queda desmentit per l’aparició de
zigots en la següent etapa.
A més cal destacar que en la mostra sotmesa al extracte d’esponja 2 hi havia
pocs embrions (3) , i per tant, els resultats són molt poc representatius. Veient la poca
mostra obtinguda, de cara a una repetició de l’experiment, seria positiu agafar com a
mínim el doble de mostra (4 ml).
També destaca la reduïda presència de zigots en el filtrat de l’esponja 1 que ens
deixa oberta la hipòtesi, independent de la tractada en aquest treball, de si els fluids de
l’esponja són tòxics i per això dificulten la fecundació.
En aquest cas, tenint en compte que els embrions sotmesos a l’extracte de
Crambe crambe semblen molt més afectats per components tòxics es pot suposar que el
grau de toxicitat no és comuna en les dues esponges i que per tant en part no és causada
pels enzims digestius (comuns en totes les esponges) i altres substàncies que s’hagin
pogut alliberar quan hem triturat l’esponja, sinó que el seu grau de toxicitat depèn de
l’espècie en concret. I que per tant possiblement els elements químics que estic
estudiant no solament tenen propietats antimitòtiques sinó també tòxiques en el cas de la
Crambe crambe.
Aquestes dues fotografies preses durant l’experiment són òvuls sotmesos als extractes de les esponges a 400 augments. El de més a la dreta és el sotmès al extracte de Chondrosia reniformis i l’altre al de Crambe crambe. Comparant-les s’aprecia que la sotmesa a la segona esponja té una forma molt més perfecta, per tant sembla que
l’extracte de l’esponja Crambe crambe té propietats tòxiques, mentre que l’extracte de la Chordrosia reniformis no en té, o si més no, són més suaus.
Un altre aspecte que cal comentar és la presència d’un embrió de dues cèl·lules
al control, mentre que en la resta de medis els embrions van més endarrerits i que ens
podria fer plantejar si un augment de la concentració del medi alenteix el procés mitòtic,
però que és fàcilment desestimable tenint en compte que parlem d’un sol embrió i que
per tant pot no ser gaire representatiu del període. A més tampoc succeeix amb el medi
amb Vincrisul en que la concentració és molt similar.
En el segon temps (passades dues hores i mitja de l’inici de l’experiment) destaca la
similitud dels estadis dels embrions en els quatre medis i segueix essent apreciable la
gran quantitat d’òvuls no fecundats.
Es pot apreciar que el medi en què els no fecundats són més abundants és en
l’extracte de la esponja 2 seguida pràcticament per igual de l’extracte de l’esponja 1 i el
Vincrisul, modificant-se poc respecte al gràfic del temps anterior. Crec que això és més
aviat degut a la concentració del medi que a les característiques dels components.
D’altre banda és rellevant el fet que el Vincrisul, de demostrades propietats
antimitòtiques, tingui tants embrions en estat de dues i quatre cèl·lules; i per tant
descrigui el mateix comportament que el control. Tenint en compte que el Vincrisul
actua sobre la formació dels microtúbuls, és probable que ja en les primeres divisions, el
material genètic es distribueixi de manera anòmala. No obstant en les primeres fases de
la divisió, l’òvul domina el procés sense que una mala distribució del material genètic
aturi la divisió. D’aquesta manera a mida que aquests embrions evolucionin (a partir del
estadi de quatre cèl·lules); el material genètic serà necessari i l’embrió serà aberrant o
bé farà apoptosi directament.
Aquestes dues fotos, també preses durant l’experiment són embrions de dues cèl·lules a 400 augments. L’embrió de l’esquerra és del medi del control mentre que el de la dreta és del medi del Vincrisul. Tot i que l’embrió sotmès al Vincrisul segurament té el material genètic alterat externament s’hi distingeix cap diferència.
És també destacat el fet de no trobar en l’extracte de la primera esponja cap
embrió de 2 cèl·lules o estadis més avançats, sinó embrions aberrants; és a dir amb
característiques anormals. Concretament hi ha una asincronia del clivellant que suposa
un creixement desestructurat de l’embrió, en què cada cèl·lula es divideix a deshora.
Aquest comportament recolza la hipòtesi del treball ja que en aquest punt sembla que
l’extracte de l’esponja 1 afecta la divisió cel·lular des de l’inici provocant aberracions
que comportaran la apoptosi cel·lular. No obstant parlem d’una proporció molt petita de
la mostra que podria ser fruit de l’atzar. Conseqüentment per poder rebutjar o reafirmar
la tesi és necessari observar-ne l’evolució.
En quan a l’extracte de la segona esponja es veu que continua havent-hi un alt
índex d’òvuls no fecundats, tot i que la proporció de fecundats s’adiu amb el control i
observem una petita quantitat d’embrions de dues cèl·lules. Això podria significar que
aquesta esponja no té propietats antimitòtiques o que l’actuació de les substàncies que
estudiem és semblant a la del Vincrisul i permet les primeres divisions regides per
l’òvul.
En aquest temps ( a les quatre hores de l’inici de l’experiment) és apreciable a
primer cop d’ull una diferenciació important del comportament dels quatre medis. En
primer lloc destaca la disminució progressiva dels òvuls del control, deguda a que en no
ser fecundats durant tant de temps, els òvuls acaben morint. En qualsevol cas la resta
dels embrions segueixen un procés d’evolució normal, en què l’estadi de 4 cèl·lules pren
pes i sobretot destaca un augment important dels embrions de 8 cèl·lules.
El Vincrisul descriu el comportament previst, ja que mantenint una proporció de
no fecundats semblant a la del control i per tant normal, augmenten els embrions de
dues cèl·lules notablement i sobretot cal destacar l’aparició d’un gran nombre
d’embrions aberrants. Aquests responen a l’evolució dels embrions de 4 cèl·lules del
temps anterior que degut a les malformacions en el material genètic que havia provocat
el Vincrisul, no han pogut evolucionar quan les divisions requerien d’aquest i s’ha
produït una asincronia del clivellament com la descrita anteriorment pel medi amb
esponja.
Aquestes dues fotos són d’embrions aberrants del experiment, concretament del medi amb medicament en aquest temps a 400 augments. Podem veure que hi ha una asincronia del clivellament ja que les cèl·lules es divideixen sense cap ordre.
El comportament de l’extracte de l’esponja 1 és molt interessant en aquest
moment ja que tot i l’anàlisi minuciós de les mostres no hi apareix cap embrió. Aquest
fet té com explicació que possiblement; les cèl·lules aberrants que en el període anterior
s’havien format han fet apoptosi degut a les malformacions del material genètic
causants de les aberracions. Cal tenir en compte que quan una o un conjunt de cèl·lules
fan apoptosi els lisosomes (enzims digestius de les cèl·lules) s’alliberen al medi cel·lular
digerint tota cèl·lula des de dins comportant el trencament de la membrana. Això
provoca que no les pugui detectar.
D’aquesta mateixa manera es pot considerar que la resta d’embrions
possiblement afectats per l’extracte de l’esponja no s’han pogut dividir comportant
també apoptosi. Si aquesta teoria es vàlida, al llarg dels temps posteriors quedaran
demostrades les propietats antimitòtiques extremadament brusques dels components de
l’esponja Chordrosia reniformis ja que, a diferència del Vincrisul, no permet ni les
primeres divisions portades a terme per l’òvul. Això suggeriria un mètode d’actuació
diferent al del Vincrisul.
L’extracte de l’esponja 2 en canvi es manté en la línia d’actuació descrita fins a
aquest moment. Conserva una alta proporció d’òvuls i una ínfima quantitat de zigots
que tampoc evolucionen. El fet de no trobar formes embrionàries més desenvolupades
ens indiquen que provablement els fluids de la segona esponja tampoc permeten la
divisió cel·lular passats el primer estadi de dues cèl·lules. No obstant en aquest cas és
convenient acabar d’observar-ne l’evolució.
En aquest temps (passades sis hores) destaca l’estrany comportament del control, que no
presenta cap mòrula com li correspondria, sinó que deixant a part els òvuls, una part va
enrederida i la resta és aberrant. Amb tot cal apuntar que en aquest cas hi ha una manca
de mostra considerable (només treballem amb 4 embrions ) i per tant els resultats no són
del tot fiables. A més és important reconèixer certa ambigüitat en l’embrió,
possiblement aberrant, que podria haver estat un embrió de 8 cèl·lules d’estadi avançat.
El Vincrisul segueix accentuant la seva activitat antimitòtica i les aberracions
continuen tenint un paper rellevant. Això gairebé permet assegurar que els embrions
sota l’efecte del Vincrisul quan arriben a l’estadi de vuit cèl·lules esdevenen aberrants i
no segueixen el seu curs.
En el cas de l’extracte de la primera esponja no trobem cap embrió el què
confirma la hipòtesi d’apoptosi cel·lular i per tant corrobora la tesi d’aquest treball amb
les demostrades propietats citostàtiques.
En el de la segona esponja només trobem òvuls, fet que em porta a intuir que els
embrions, la divisió dels quals s’havia aturat, han fet apoptosi. En aquest cas també
podem afirmar que els fluids de la segona esponja (Crambe crambe) tenen propietats
antimitòtiques; però d’actuació molt més suau (segurament el seu mètode d’actuació és
més semblant al del Vincrisul) que els components de l’altre esponja.
Les mostres d’aquest temps ( deu hores després de l’inici de l’experiment) no
contenen cap embrió. Aquesta situació és fàcil d’explicar tenint en compte que són les
primeres mostres que no les he pres del fons dels vasos de precipitats, sinó del mig (ja
que segons els models de desenvolupament dels embrions consultats a partir d’aquest
moment els embrions haurien d’estar en estat larval i tenir mobilitat pròpia) no obstant,
observant les mostres del temps anterior es pot deduir que els embrions encara no han
arribat a l’estat larval i estan a la part inferior dels recipients. Això ens induiria, en una
possible repetició de l’experiment, a prendre dues mostres (una al fons i una altre al
mig) des del temps 5 per tal de poder veure també l’evolució dels altres medis.
Concretament podem suposar que els embrions del control deuen ser mòrules
que no tenen mobilitat pròpia i per tant resten al fons. Els del Vincrisul principalment
aberrants també sense mobilitat pròpia o ja destruïdes per l’apoptosi a que porta
l’aberració. Els sotmesos a l’extracte de la primera esponja, com en els punts anteriors
ja he justificat, han fet apoptosi i els que no han fet apoptosi del extracte de la segona
esponja en les fases anteriors eren principalment òvuls que també resten al fons.
Aquest endarreriment en el procés segurament es deu a que els experiments que
empraven embrions d’eriçons de mar comuns, i que he pres com a models alhora de
determinar l’hora de cada presa de mostres, es feien sota una elevada temperatura (més
de 20ºC) mentre que en aquest experiment s’ha treballat a una temperatura de menys de
17ºC amb moments de més fred. Això també suposa que tots els temps s’han vist
desplaçats, de manera que en certs intervals de temps no s’han pres mostres intermitges
que haurien pogut ser interessants d’analitzar.
En aquest gràfic s’adverteix només el control en què la totalitat dels embrions
estan ja en estat larval. En aquest moment (24 hores des de l’inici de l’experiment)
l’escassetat d’embrions és una dada important ja que verifica que s’ha efectuat
correctament l’experiment i el control a seguit el procés adequat. L’estat d’aquestes
larves és molt inicial i segurament si també s’hagués pres una mostra de la part inferior
del recipient del control s’haurien trobat molts més embrions en estats anteriors que no
larves.
També s’observen algunes malformacions esquelètiques segurament degudes a
la poca maduresa de les gàmetes. Evidentment no hi ha cap embrió en els altres estat ja
que degut a les propietats dels medis on es desenvolupen, no arribaran a un estadi amb
moviment propi sinó que han patit o patiran apoptosi.
Les mostres del temps 7 (48 hores des del inici del experiment) corroboren
l’explicació anterior. Potser l’únic matís a tenir en compte és l’estadi una mica més
avançat d’una de les larves.
Aquesta fotos són dues larves del control a 400 augments. La de l’esquerra és del temps 6 i l’altre del 7. Es pot apreciar
una evolució ja que la segona està molt més desenvolupada, no obstant ambdues presenten algun problema esquelètic degut a que no tenen una simetria lateral completa possiblement fruit de la poca maduresa de les gàmetes.
6 CONCLUSIONS
El control té una evolució satisfactòria, ja que els embrions arriben fins a l’estat
larval. Això demostra que l’experiment s’ha dut a terme amb èxit i que per tant els
resultats a què s’han arribat són vàlids.
Els resultats del experiment confirmen la nostra hipòtesi; els components
químics alliberats per ambdues esponges són de caràcter antimitòtic. Concretament en
les dosis utilitzades, sembla que les dues esponges tenen substàncies de propietats
antimitòtiques molt més agressives i contundents que el Vincrisul. Aquest fet suggereix
que provablement les esponges tenen un mètode d’actuació diferent al del Vincrisul.
Aquest afecta els microtúbuls i, per tant, la repartició del material genètic. Però, sembla
que tot i presentar una distribució anòmala del material genètic, l’embrió pot
evolucionar fins a l’estadi de quatre cèl·lules, ja que, en les primeres divisions l’òvul
domina el procés amb certa independència del material genètic. Tot i això, a partir de
l’estat de quatre cèl·lules el material genètic es fa indispensable i les malformacions
efectuades pel Vincrisul porten a l’aberració i conseqüent apoptosi de les cèl·lules de
l’embrió.
Contràriament l’efecte de les esponges és molt més abrupte, els components de
la primera Chondrosia reniformis sembla que no permeten ni la primera divisió, sinó
que directament produeixen aberracions o aturen la divisió portant en ambdós casos a
l’apoptosi cel·lular. L’efecte dels components de l’esponja Crambe crambe és una mica
més suau que l’anterior, tot i que més contundent que el Vincrisul en les dosis
utilitzades. Amb tota probabilitat permet l’estadi de dues cèl·lules a partir del qual els
embrions no cursen sinó que pateixen apoptosi.
A més, també és important esmentar que en els medis amb extracte d’esponja la
fecundació és molt baixa fet que ens indueix a pensar que les substàncies que estem
estudiant tenen propietats tòxiques a més d’antimitòtiques; sobretot en l’esponja
Crambe crambe.
En el cas d’una repetició de l’experiment, s’hauria de tenir en comte alguns
aspectes: utilitzar eriçons suficientment madurs (això reduiria la gran quantitat d’òvuls
sense fecundar i possiblement evitaria les malformacions esquelètiques de les larves);
prendre dues mostres (una al fons i una altre al mig) a partir de que els embrions del
control tinguin mobilitat pròpia; i tenir en compte per a la presa de mostres, que a una
temperatura inferior als 20ºC l’evolució dels embrions és molt més lenta .
També val a dir, que seguint la línia d’aquest treball seria molt interessant
determinar amb exactitud les molècules que tenen les esmentades propietats
antimitòtiques i sobretot comprovar el seu comportament en cultius cel·lulars. Per tal
que potser en un futur aquestes substàncies poguessin ser utilitzades com a
medicaments anticancerígens. Aquesta possibilitat ens dóna una visió nova del nostre
planeta en què la preservació de la biodiversitat del nostre entorn no només és un deure
moral, sinó una possible garantia de supervivència davant de les malalties actuals i
futures.
7 BIBLIOGRAFIA
Adreces d’Internet:
http://es.geocities.com/paleontofilo/equino6.gif
http://www.chez.com/biologypassion/horia/urchin/paracentrotus.jpg
http://www.farmaciasahumada.cl/stores/fasa/html/Mft/producto/p3554.htm
http://www.infomed.sld.cu/revistas/onc/vol14_2_98/onc07298.htm
http://www.cnio.es./es/cancer/cap105.htm
http://fai.unne.edu.ar/biologia/images/diagrep_1.gif
http://www.scienzemfn.uniroma1.it/uzi/IJZ/64-4.htm
http://enciclopedia-catalana.com
http://www.roche.com/pages/facets/9/onke.htm
http://sigremar.cesga.es/erizodin.html
http://www.nature.com/cgi-taf/DynaPage.taf?file=/nrc/journal/v3/n9/abs/nrc1168_fs.html
http://www.pharmamar.com/es/about/faq.cfm
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/oursinMDC/index.html
http://www.canal-h.net/webs/sgonzalez002/Biologia/POR%CDFERS.htm
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/oursinMDC/index.html
http://fai.unne.edu.ar/biologia/images/diagrep_1.gif
http://marenostrum.org/vidamarina/animalia/invertebrados/esponjas/ccrambe/
http://www.canal-h.net/webs/sgonzalez002/Biologia/NIVELORG.htm
http://waste.ideal.es/especies48.html
http://reo.nii.ac.jp/journal/HtmlIndicate/Contents
http://www.sre.urv.es/formacio/fmcs/Farmacologia
Llibres:
- Gómez, J.M. et al., Barcelona (1999). Ed. Cruïlla, BIOLOGIA CIÈNCIES DE LA
NATURALESA I SALUT.
- Altaba, C.R. et al., Barcelona (1991). Enciclopèdia Catalana S. A.
INVERTEBRATS NO ARTRÒPODES. HISTÒRIA NATURAL DEL PAÏSOS
CATALANS. VOL. 8.
- Hickman, C.P., Roberts, L.S., Madrid (1994). LLOC, Mc graw-hill Interamericana
de EspaZa S.A, ZOOLOGIA- PRINICIPIOS INTEGRALES
- Media-medicom, Madrid, (1991). Medimedia-medicom S.A. , VADÉMECUM
