INORMA CHILENA OFICIAL NCh1858.Of81

Cuerpos grasos de origen animal y vegetal - Deteccin degrasas animales en aceites y grasas vegetales -Determinacin del colesterol

Prembulo

El Instituto Nacional de Normalizacin, INN, es el organismo que tiene a su cargo elestudio y preparacin de las normas tcnicas a nivel nacional. Es miembro de laINTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISIONPANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esosorganismos.

La norma NCh1858 ha sido preparada por la Divisin de Normas del Instituto Nacional deNormalizacin, y en su estudio participaron los organismos y las personas naturalessiguientes:

Aceitera Talca S.A. Gustavo Arancibia B.Arellano y Labb Ltda. Guillermo Rob S.Compaa Productora Nacional de Aceites,COPRONA S.A. Oscar Guzmn F.CHIPRODAL S.A.I.C. Roberto Rojas M.Chocolates FRUTOS Ltda. Ral Ch. Vinet H.Direccin Intendencia Ejrcito Teresa Madrid P.Instituto Nacional de InvestigacionesAgropecuarias, INIA, La Platina Claudio Ciudad B.Instituto Nacional de Normalizacin, INN Elsa Samaniego E.Laboratorio Tecnoanlisis de AlimentosMc Kay S.A. Anbal L. Bravo B.Ministerio de Economa, DIRINCO M. Soledad Daz G.

Mabel Puerto G.Procesadora de Leche y AlimentosNaturales Ltda. Vctor Sandoval A.

NCh1858

II

Qumica Hoechst Chile Ltda. Rodrigo Urza O.Universidad Catlica de Chile, Depto.de Qumica Analtica Guido Concha G.Universidad de Concepcin, Depto. deBromatologa Claudio Villegas F.Universidad de Chile, Facultad deCiencias Bsicas y Farmacuticas Lilian Masson S.Universidad Tcnica del Estado, Depto.de Qumica Mario Calebotta D.

Esta norma tom como base de estudio el documento siguiente:

"Oficial Methods of Analysis of the Association of Oficial Analytical Chemists, AOAC,12 Edition 1975.

Los anexos no forman parte del cuerpo de la norma, se insertan slo a ttulo informativo.

Esta norma ha sido aprobada por el H. Consejo del Instituto Nacional de Normalizacin, ensesin efectuada el 23 de Octubre de 1981.

Esta norma ha sido declarada Norma Chilena Oficial de la Repblica, por Decreto N8 defecha 8 de Enero de 1982, del Ministerio de Agricultura, publicado en el Diario OficialN31.191, del 13 de Febrero de 1982.

Esta norma es una "reedicin sin modificaciones" de la Norma Chilena OficialNCh1858.Of81, "Cuerpos grasos de origen animal y vegetal - Deteccin de grasasanimales en aceites y grasas vegetales - Determinacin de colesterol", vigente porDecreto N8, de fecha 8 de Enero de 1981, del Ministerio de Agricultura.

1NORMA CHILENA OFICIAL NCh1858.Of81

Cuerpos grasos de origen animal y vegetal - Deteccin degrasas animales en aceites y grasas vegetales -Determinacin del colesterol

1 Alcance y campo de aplicacin

1.1 Esta norma se aplica a la deteccin de grasas animales en grasas vegetales, teniendopresente que puede haber pequeas cantidades de colesterol en el aceite o grasa vegetal,(ver anexo A).

1.2 Esta norma tambin se puede aplicar a la determinacin de colesterol en grasasanimales.

2 Referencias

NCh99 Cuerpos grasos de origen animal y vegetal - Determinacin de materiasinsponificables.

3 Preparacin de la muestra

3.1 Saponificar y extraer el insaponificable de 2,5 0,01 g de grasa, como se indica enNCh99; descartar la solucin acuosa.

3.2 Transferir el extracto etreo a un vaso de precipitado de 250 ml y evaporar asequedad en bao de vapor bajo corriente de nitrgeno.

3.3 Disolver la porcin insaponificable en 4 a 5 ml de cloroformo, transferir a un matrazpequeo y evaporar a sequedad. Lavar el vaso con tres porciones de cloroformo, disolvercualquier residuo que est adherido a las paredes del vaso de precipitado.

NCh1858

2

3.4 Transferir las aguas de lavado a un matraz y evaporar a sequedad bajo corriente denitrgeno, almacenar la muestra en el congelador.

4 Aislamiento de los esteroles por cromatografa en capa fina

4.1 Reactivos

a) Slica gel G o de calidad equivalente.

b) Cloroformo, destilado en vidrio.

c) Eter etlico anhidro con no ms de 0,01% de alcohol.

d) Eter de petrleo, destilado en vidrio de punto de ebullicin 30-60C.

e) Rodamina 6 G al 0,05% m/m u otro colorante o agente de deteccin que no reaccionecon los esteroles.

f) -sitosterol, solucin patrn de 3 g/l. Pesar 30,0 mg de -sitosterol patrn en unmatraz volumtrico de 10 ml y diluir hasta la marca con acetato de etilo.

NOTA - Comercialmente el material est mezclado con campesterol (componente que eluye primero) y-sitosterol.

4.2 Aparatos

a) Placas cromatogrficas de vidrio de 20 cm x 20 cm para capa fina.

b) Aparato para recubrimiento de placas formado por un soporte y un aplicador.

c) Microesptula o raspador de placa para cromatografa en capa fina.

d) Cubeta de desarrollo o frasco de vidrio de fondo plano, con tapa.

e) Micropipeta o microjeringa.

f) Estufa regulada a 105C-110C.

g) Secador.

h) Material usual de laboratorio.

NCh1858

3

4.3 Preparacin de las placas

a) Alinear cinco placas iguales de vidrio de 20 cm x 20 cm en el soporte [4.2 b)]; antesde cubrir limpiar con alcohol o acetona de tal modo que queden perfectamentelimpias, sin trazas de polvo ni grasa.

b) Ajustar el aplicador para obtener un recubrimiento de 0,5 mm de espesor.

c) Pesar 45 g de slica gel en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, agregar 130 ml de agua,agitar vigorosamente durante 25 a 30 s y verter en el aplicador. Inmediatamentecubrir las placas con la suspensin de slica gel, dejar las placas al aire hasta observarque la superficie haya gelificado (0,5-1 h) y a continuacin colocar en estufa a 105-110C durante aproximadamente 2 h; guardar sobre soporte metlico en desecadorhasta antes de usar.

4.4 Procedimiento

a) Introducir en la cubeta de desarrollo, 100 ml de ter etlico/ter de petrleo (1+1),tapar la cubeta y dejar en reposo durante unas 3 h con el fin de lograr el equilibriolquido-vapor en el interior.

NOTA - Esto se puede acelerar colocando una hoja de papel filtro en tres caras de la cubeta de tal modoque toque ligeramente el solvente.

b) Dibujar una lnea en la placa a una altura de 17 cm de la parte inferior y a alrededor de1 cm de cada lado.

c) Con ayuda de una micropipeta o una microjeringa, colocar 10 l de la solucin patrnde -sitosterol en una lnea imaginaria a 2 cm del borde inferior y a 3 cm del bordelateral de la placa.

d) Disolver la porcin insaponificable en 200 l de cloroformo y poner toda la muestra enporciones de 10 l en la lnea imaginaria a 2 cm del borde de la placa, de tal modoque la distancia entre una y otra sea de 0,75 cm aproximadamente.

e) Lavar el matraz con alrededor de 100 l de cloroformo y poner la solucin de lavadoen proporciones iguales sobre las manchas.

f) Inmediatamente introducir la placa en la cubeta, tapar hermticamente. Sacar la placade la cubeta cuando el frente del solvente alcance los 17 cm de la lnea tope.

g) Evaporar el solvente de la placa y observarla bajo luz ultravioleta en una habitacinoscura.

NOTA - Si la slica gel no contiene sustancia para el reveleado pulverizar la placa con un reactivo comorodamina 6 G que no reaccione con los esteroles y observar bajo luz U.V.

NCh1858

4

h) Marcar las bandas de esteroles (Rf = 0,2-0,3 como el -sitosterol patrn) con unaaguja y sacar las bandas de esteroles (no sacar la banda de -sitosterol),desprendiendo el trocito de la banda de esterol con una esptula de acero inoxidable ycolocar en un vaso de precipitado de 100 ml. Transferir con 20 ml de cloroformo aun embudo de 70 mm de dimetro que contenga un papel filtro plegado deaproximadamente 12,5 cm de dimetro.

i) Extraer los esteroles con cinco porciones de 10 ml de cloroformo y evaporar losextractos combinados casi a sequedad en bao de vapor bajo corriente de nitrgeno.

j) Transferir el residuo a un frasco pequeo (tapa rosca con cubierta de Al en el interior)con cloroformo y evaporar a sequedad bajo corriente de nitrgeno.

NOTA - En forma alternativa remover la banda de esteroles con un raspador de placa, eluir los esterolesde la slica gel con 70 ml de cloroformo (14 veces con porciones de 5 ml) y evaporar el solvente casi asequedad en bao de vapor bajo corriente de nitrgeno.

5 Cromatografa gaseosa de esteroles

5.1 Reactivos

5.1.1 Relleno

a) Fase estacionaria, JXR u OV-101 dimetilpolisiloxano; OV-17; OV-22metilfenilpolisiloxano.

b) Soporte, Gas Chrom Q. de 125-150 m (100-120 mallas) relleno preparadocomercialmente con 1-3% de fase estacionaria.

5.1.2 Acetato de etilo, destilado en vidrio.

5.1.3 Colestano, solucin patrn de 0,4 g/l. Pesar 40,0 mg de colestano patrn en unmatraz volumtrico de 100 ml y diluir hasta la marca con acetato de etilo.

5.1.4 Colestano, solucin patrn interna de 0,2 g/l. Diluir 10,0 ml de la solucin patrnanterior, a 20,0 ml con acetato de etilo.

5.1.5 Colesterol, solucin patrn de 1,2 g/l. Pesar 60,0 mg de colesterol patrn en unmatraz volumtrico de 50 ml y diluir hasta la marca con acetato de etilo.

5.1.6 Colestano-colesterol, mezcla patrn de 0,2 g de colestano y 0,6 g decolesterol/l. Mezclar volmenes iguales de solucin patrn de colestano (5.1.3) ysolucin patrn de colesterol (5.1.5).

5.1.7 Colesterol--sitosterol, mezcla patrn de 0,6 g de colesterol y 1,5 g de-sitosterol/l. Mezclar volmenes iguales de soluciones patrn de colesterol y de-sitosterol [5.1.5 y 4.1 f)].

NCh1858

5

5.1.8 Acetato de colesterilo, solucin patrn de 0,6 g/l. Pesar 30,0 mg de acetato decolesterilo patrn en un matraz volumtrico de 50 ml y diluir hasta la marca con acetatode etilo.

5.2 Aparatos

a) Cromatgrafo de gases, con un detector de ionizacin de llama de hidrgeno y unregistrador de 1 mv. La temperatura de la columna debe estar comprendida entre220C y 250C; temperatura del detector y de la cmara de inyeccin 240C a270C.

Velocidad de flujo: nitrgeno, ultra puro, con una velocidad de 30 ml/min; hidrgenocon una velocidad de 40 a 45 ml/min y aire a una velocidad de 300 a 340 ml/min.

Ajustar la sensibilidad del electrmetro de tal modo que 1,5 g de colesterol produzca,alrededor de 50% de desviacin. Repetir las inyecciones hasta que las alturas de lospicos sean constantes en inyecciones sucesivas de volmenes idnticos de la muestrapatrn.

b) Preparacin de la columna. Rellenar la columna de vidrio de 1,8 m por 4 mm dedimetro interno con 1 % a 3% de fase estacionaria comercial sobre Gas Chrom Q.de 125 m a 150 m (100 a 120 mallas) o disolver 0,4 a 1,2 g de polisiloxano en200 ml de tolueno o diclorometano-tolueno (1+1), (CH2Cl2/C6H5CH3) calentar hastaebullicin (el polisiloxano se disuelve lentamente en solucin mezcla).

NOTAS

1) Se pueden adquirir en el comercio las columnas preparadas; si se desea preparar en el laboratorio sedebe usar guantes y una buena ventilacin porque el siloxano es txico.

2) En anexo se sealan algunas instrucciones generales para el relleno de una columna.

c) Acondicionamiento de la columna. Calentar no menos de 8 h a 260C con una presinde nitrgeno que fluye por la columna de 34,5 a 69 kPa (5-10 psi). Cortar la presin yelevar la temperatura a 290C, continuar calentando no menos de 8 h. Reducir latemperatura a 260C, ajustar la presin de nitrgeno a 34,5-69 kPa y calentar untiempo adicional de 8 h.

d) Comportamiento. Cromatografiar alrededor de 2 l de mezcla patrn de colesterol--sitosterol (5.1.7) para determinar los tiempos de retencin y resolucin de la columna.Para el pico del -sitosterol se necesitan por lo menos 1 600 platos tericos.

Platos tericos = 16)/( 2 B!

en que:

! = distancia, en cm, del pico de colesterol desde el punto de inyeccin;

B = amplitud, en cm, de la base triangulada del pico de colesterol desde elpunto de inyeccin.

NCh1858

6

Adems, la altura de los picos de colesterol y campesterol expresado como resolucindel pico debe ser, a lo menos, de 2,2.

Resolucin del pico = 2D/(B + P)

en que:

D = distancia, en cm, entre los picos mximos del colesterol y el campesterol;

B = amplitud de la base triangulada del pico de colesterol;

P = amplitud de la base triangulada del pico de campesterol.

Determinar la resolucin del pico de la muestra, teniendo aproximadamente igualcantidad de colesterol y campesterol (aproximadamente iguales reas de los picos); lamuestra inyectada debera dar una altura de 25% a 50% del ancho de la carta.

5.3 Determinacin

a) Tomar con una pipeta 1,0 ml de solucin patrn interna de colestano (5.1.4) en unfrasco pequeo que contenga los extractos de esteroles, hacer girar el frasquito, paralavarlo bien con la solucin interna patrn y agitar hasta disolver los esteroles.

b) Inyectar 2 l de muestra por lo menos en duplicado. Repetir con 2 l de mezcla patrnde colestano-colesterol (5.1.6). Identificar el pico de colesterol en la muestra por eltiempo de retencin en la mezcla patrn.

c) Si la altura del pico de colesterol en la muestra es mayor de 60% de la desviacintotal de la escala, agregar en forma adicional 1,0 ml de solucin patrn interna decolestano (5.1.4) a la muestra y cromatografiar la muestra y la mezcla patrn como seindica arriba.

d) Medir la altura de los picos de colestano y colesterol en mm.

5.4 Clculos

Calcular los mg de colesterol/100 g de muestra, corrigiendo el patrn interno como sigue:

mg de colesterol/100 g = (Hi/Hx) (Cx/Ci) (Sx/Si) (Qi/Q) 100

en que:

Hi y Hx = altura, en mm, del pico de colestano y colesterol respectivamente en lamezcla patrn;

Sx y Si = altura, en mm, del pico de colesterol y colestano respectivamente en lamuestra;

NCh1858

7

Cx y Ci = g de colesterol y colestano/l respectivamente en la mezcla patrn;

Qi = g de colestano/l en la muestra;

Q = mg de muestra/l.

6 Determinacin de presencia de colesterol

La presencia de colesterol puede ser confirmada por cromatografa gaseosa de losacetatos de los esteroles. Despus de determinar el colesterol por cromatografa gaseosaevaporar la muestra a sequedad bajo corriente de nitrgeno en un bao de vapor.

Enfriar y agregar 3 ml de piridina y 1 ml de anhdrido actico (Ac2O). Tapar el frasco y

agitar en bao de vapor hasta que los esteroles se disuelvan y continuar calentando encorriente de vapor durante 1 h.

Evaporar usando corriente de nitrgeno hasta que no se detecte olor a piridina.Cromatografiar las soluciones patrones de los acetatos de esteroles y de colesterilo ycomparar los tiempos de retencin de la muestra y los picos de acetato de colesterilo.

NCh1858

8

Anexo A(Informativo)

Algunos aceites y grasas vegetales, principalmente el aceite de palma, contienenpequeas cantidades de colesterol segn se seala en:

"Contrle de la puret des margarines vgtales: problmes des mlanges invitables enmargarinerie", J.P. Wolff.

Institut des Corps Gras - Interg - Pars 26 annee - N1 - Janvier 1979.

Anexo B(Informativo)

B.1 Relleno de la columna

B.1.1 Rellenar la columna de vidrio con 1% a 3% de fase estacionaria comercial sobreGas Chrom Q. de 125 m a 150 m (100 a 120 mallas) o disolver 0,4 g a 1,2 g depolixiloxano en 200 ml de tolueno, o diclorometano-tolueno.

B.1.2 Calentar la solucin hasta ebullicin y agregar a 40 g de Gas Chrom Q., dejardurante 10 min con agitacin ocasional y suave.

B.1.3 Secar en evaporador rotatorio en un bao a 50C o calentar en corriente de aire conagitacin suave y ocasional, eliminar el residuo del solvente en estufa de vaco a 50C.

B.1.4 Lavar cuidadosamente el interior de la columna y pequeas cantidades de lana devidrio con 5% de solucin de diclorodimetilsilano en tolueno, enjuagar con metanol hastaque las aguas de lavado sean neutras al papel indicador, secar al aire.

B.1.5 Tapar la salida de la columna con una pequea mota de lana de vidrio silanizada yrellenar la columna.

B.1.6 Agregar material de empaque, usando un embudo y un tubo plstico, golpearsuavemente la columna durante la adicin.

B.1.7 Agregar de una vez la cuarta parte del material de empaque, quitar el embudo yaplicar una presin de 34,5 a 69 kPa de N (5 a 10 psi) a la entrada de la columnamientras se golpea suavemente para asentar el relleno. Rellenar 2,5 cm bajo el punto deinyeccin y tapar con lana de vidrio silanizada.

NORMA CHILENA OFICIAL NCh 1858.Of81

I N S T I T U T O N A C I O N A L D E N O R M A L I Z A C I O N ! I N N - C H I L E

Cuerpos grasos de origen animal y vegetal - Deteccin degrasas animales en aceites y grasas vegetales -Determinacin del colesterol

Animal and vegetable fats and oils - Determination of cholesterol

Primera edicin : 1981Reimpresin : 1999

Descriptores: cuerpos grasos, grasas vegetales, grasas animales, aceites vegetales,determinacin de materia grasa, aceites animales, ensayos, determinacin decontenido, colesterol

CIN 67.200.10

COPYRIGHT 1982 : INSTITUTO NACIONAL DE NORMALIZACION - INN * Prohibida reproduccin y venta *Direccin : Matas Cousio N 64, 6 Piso, Santiago, ChileCasilla : 995 Santiago 1 - ChileTelfonos : +(56 2) 441 0330 Centro de Documentacin y Venta de Normas (5 Piso) : +(56 2) 441 0425Telefax : +(56 2) 441 0427 Centro de Documentacin y Venta de Normas (5 Piso) : +(56 2) 441 0429Internet : inn@entelchile.netMiembro de : ISO (International Organization for Standardization) COPANT (Comisin Panamericana de Normas Tcnicas)