Deteccin de mutaciones moleculares.

DETECCIN DE MUTACIONESLa deteccin de mutaciones es la base del diagnstico molecular del cncer hereditario. Es tambin muy importante en el diagnstico de pacientes asintomticos ya que se puede estudiar el modo de herencia en una familia.Existen tres tipos de mutaciones: moleculares o gnicas y cromosmicas. Las mutaciones a nivel molecular afectan a la estructura de los genes de una manera puntual. En las mutaciones cromosmicas el cambio afecta a una regin de un cromosoma alterando su estructura. Las mutaciones epigenticas son aquellos cambios reversibles del ADN que conllevan cambios o modulaciones en la expresin de los genesDeteccin de mutaciones molecularesLas mutaciones moleculares o puntuales se pueden dar por insercin o delecin o por un cambio de nucletido:

Insercin o delecin de uno o varios nucletidos en la secuencia del gen. Este tipo de mutacin conlleva un cambio en el marco de lectura de nucletidos producindose una protena con una secuencia de aminocidos errnea. Se pueden dar simultneamente una insercin y una delecin en un punto (mutaciones in-del)

Cambio de un nucletido. En este tipo de mutaciones nos encontramos que en lugar de un nucletido nos encontramos otro (mutacin missense). Este cambio de un nucletido por otro puede conllevar o no un cambio de aminocido o podra generar un codn de terminacin (mutacin nonsense). Hay otros cambios de nucletidos que no afectan a la secuencia codificante de aminocidos como veremos un poco ms abajo.

Si el cambio de nucletido no conlleva un cambio de aminocido la protena resultante no sufre ningn cambio (polimorfismo). Si el cambio de nucletido s conlleva cambio de aminocido entonces podramos tener dos situaciones diferentes. Por un lado, si el aminocido resultante del cambio es similar en cuanto a estructura y polaridad la protena resultante ser funcional ya que el nuevo aminocido no va a afectar a la estructura proteica y por lo tanto a su funcin. Por otro lado, el cambio de aminocido podra afectar a la estructura proteica si el nuevo aminocido es diferente en cuanto a estructura y polaridad y por lo tanto afectara funcionalidad de la protena. Si el cambio de nucletido genera un codn de terminacin, la protena resultante se interrumpe en ese punto y resulta no funcional.Como hemos comentado antes, tambin existen cambios de nucletidos que no afectan a la secuencia de aminocidos directamente pero s a la estructura o a la expresin de la protena (figura 2). Hay cambios de nucletidos que no estn en secuencias codificantes sino en los intrones. En los intrones hay unas secuencias consenso responsables de la correcta maduracin del ARN mensajero. Si el cambio de nucletido afecta a estas secuencias se poda dar un proceso de corte y empalme (splicing) de los exones incorrecto y por lo tanto el ARN mensajero maduro no ser funcional.Otros cambios podran afectar al promotor de un gen (figura 2). En este caso, la alteracin de la secuencia promotora podra modificar las secuencias donde se unen los factores de trascripcin del gen impidiendo su unin y por tanto la expresin final de la protenaMutacin conocida de gen conocidoLa determinacin de una mutacin conocida en cncer hereditario puede utilizarse para confirmar el diagnstico de dicha enfermedad en pacientes sintomticos o, juntamente con el consejo gentico, para establecer a los portadores y establecer el riesgo porcentual del paciente a tener dicha enfermedad. Si la prueba es negativa para la mutacin y el paciente est asintomtico, es muy probable que el paciente no tenga la enfermedad.

Para disear una prueba para determinar una mutacin conocida debemos conocer la secuencia del gen al que pertenece la mutacin y disear una pareja de cebadores para amplificar mediante PCR la regin en la que se encuentra la mutacin. Una vez amplificada podemos analizarla de varias maneras

Restriccin. Si la mutacin se encuentra en la diana de una endonucleasa de restriccin podemos determinar la presencia de la mutacin mediante una digestin del producto de PCR amplificado sometindola posteriormente a electroforesis en gel de agarosa. Este mtodo es el ms laborioso pero resulta muy econmico.

Secuenciacin. Podemos determinar la presencia de la mutacin mediante secuenciacin del producto de PCR. Con este mtodo obtenemos una lectura de la secuencia real y eliminamos artefactos debidos a digestiones parciales.

PCR en tiempo real. Se puede determinar tambin la presencia de la mutacin mediante PCR en tiempo real diseando dos sondas diferentes capaces de discriminar los dos alelos. La PCR en tiempo real es un mtodo capaz de cuantificar el ADN en cada ciclo de PCR en forma de fluorescencia. Esta fluorescencia aparece por la modificacin que sufren las sondas en cada ciclo de amplificacin. La discriminacin allica se produce cuando utilizamos dos sondas marcadas con distinto flourocromo y que son especficas de la secuencia nativa y de la mutada. Al final del proceso, las curvas de fluorescencia para las dos sondas nos indicarn el genotipo. Este mtodo es muy rpido ya que en una sola reaccin de PCR obtenemos el genotipo pero resulta ms caro. Mutaciones de gen conocidoEn numerosas ocasiones no es una nica mutacin puntual sino un conjunto de mutaciones de un gen (o genes) las causantes de cncer hereditario. En este caso es necesario estudiar el gen o genes implicados. Cuando estudiamos un conjunto de mutaciones gen decimos que hacemos un screening de mutaciones de dicho gen.

Existen varias maneras de abordar el screening de mutaciones de un gen dependiendo en gran parte del tamao del mismo y del nmero de mutaciones descritas para dicho gen. Si el gen no es muy grande se puede hacer un screening completo. Si el gen tiene gran tamao un screening completo resultara muy laborioso y se podra acotar el estudio reducindolo a las regiones del gen donde se encuentran la mayor parte de las mutaciones descritas.

Para disear una estrategia de screening de un gen debemos conocer la estructura exn-intrn de ste. Una vez conocido el nmero de exones y su secuencia disearemos cebadores intrnicos que nos permitan amplificar cada uno de los exones (figura 6). Si los exones tuviesen un tamao muy grande deberamos disear fragmentos solapados que cubran la totalidad de dicho gen.

Una vez obtenidos los productos de PCR (amplicones) se secuenciaran para obtener una lectura de su secuencia nucleotdica y la compararamos con la secuencia consenso para dicho gen (figura 6). De esta manera podramos determinar la presencia de mutaciones en toda la regin codificante del gen. Mediante este mtodo podemos analizar tambin los extremos de los intrones en busca de mutaciones, ya que es en esos extremos donde se encuentran las secuencias consenso para el proceso de splicingdel gen. Las mutaciones en estos puntos son responsables de procesos de maduracin del ARN incompletos o errneos. Para completar el screening completo de un gen deberamos secuenciar tambin la regin promotora del gen para estudiar posible cambios en los sitios de unin a factores de trascripcin que seran responsables de la correcta expresin del gen

Como se ha comentado antes, si el tamao del gen es grande podemos acotar el estudio. En este caso en lugar de estudiar la totalidad de los exones slo analizaramos aquellos donde se encuentran las mutaciones ms frecuentes.Otra manera de abordar el estudio de un gen grande es mediante anlisis de heterodplex utilizando tcnicas como SSCS o DHPLC.

El SSCP (polimorfismo de conformacin de cadena individual de ADN) es una tcnica que permite detectar mutaciones puntuales muy til, tanto por su sensibilidad en la deteccin (alrededor 80% en condiciones ideales), como por su implementacin fcil y econmica. El mtodo del SSCP se basa en que bajo condiciones no desnaturalizantes una hebra individual de ADN adopta una conformacin espacial especfica. El cambio de una sola base inducira una configuracin diferente y podra ser detectada en una migracin electrofortica en poliacrilamida (figura 7). La tcnica es simple, verstil y econmica, pero exige la optimizacin de parmetros en la composicin del gel para cada fragmento a evaluar. Cuando el gen tiene gran tamao, realizaramos un SSCP de la totalidad del gen y analizaramos que fragmentos tienen una migracin electrofortica diferente a la normal. De esta manera slo secuenciaramos estos fragmentos.

EL DHPLC (cromatografa lquida desnaturalizante de alta presin) es otra tcnica que nos va a permitir el screening de mutaciones basada en el anlisis de heteroduplex. A partir del ADN extrado, se amplifican los fragmentos del gen a estudiar por medio de una PCR convencional; posteriormente, se realiza una desnaturalizacin de dichos fragmentos una renaturalizacin de las hebras de ADN progresiva y lenta. Con este proceso se podrn detectar las mutaciones sobre la base de las diferentes uniones formadas despus de la renaturalizacin entre los fragmentos de gen amplificados ya que al renaturalizar lentamente provocamos que se forme de nuevo la doble hebra de ADN, unindose las hebras exactamente igual que las originales, a las que llamaremos homodplex, y adems provocamos que se unan combinaciones de las cadenas originales con las mutadas para formar los llamados heterodplex. As pues, se puede decir que el DHPLC detecta las mutaciones segn los diferentes homodplex y heterodplex que se forman del fragmento de gen estudiado. Los heterodplex, que son trmicamente menos estables que su correspondiente homodplex, se separan por cromatografa lquida (figura 8). Al igual que con el SSCP secuenciaramos solo los fragmento que han detectado la presencia de heterodplex.

Finalmente, hay un grupo de mutaciones moleculares que se han de estudiar. Nos referimos a deleciones de un exon o de un conjunto exones. Este tipo de mutaciones se pueden estudiar mediante MLPA. El MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) Es un mtodo de PCR multiplex (permite amplificar hasta 40 secuencias simultneamente) que detecta el nmero de copias de la secuencia del genoma, permitiendo averiguar si hay duplicaciones o deleciones tanto para fragmentos de del orden de varios exones como secuencias que difieran en un solo nucletido.

La tcnica cosiste en hibridar el ADN que queremos estudiar con una serie de sondas de MLPA. Por cada regin que vamos a estudiar se hibridan dos sondas cuyas secuencias son adyacentes. Estas sondas podemos unirlas mediante una ligacin. El producto de ligacin se somete a PRC de manera que slo se amplificarn las sondas que se hayan ligado. El nmero de producto amplificado se mide usando un secuenciador capilar. La cantidad amplificada ser una medida del nmero de copia de ADN de partida. Una vez analizados y normalizados los datos resultantes podremos saber la cantidad de partida de cada regin. En nuestro caso, lo que nos interesar saber es si tenemos dos copias o una copia por cada exn del gen analizado y as podremos determinar la presencia de inserciones o deleciones en un gen.

Una vez finalizado el anlisis de un gen o genes se procede al estudio de las variaciones obtenidas de dicho anlisis. Como primer paso debemos definir correctamente la variacin. Para ello, con una secuencia nucleotdica numerada, tenemos obtener con exactitud en qu nucletido se produce el cambio, ya que la numeracin nos va a permitir la bsqueda en las distintas bases de datos adems de la numeracin debemos definir, si se trata de un cambio de un nucletido, cuales son los nucletido intercambiados y en el caso de tratarse de una insercin o una delecin del nmero de nucletidos insertados o delecionados y su secuencia. Podemos tambin deducir el aminocido implicado en la variacin ya que en ocasiones las bases de datos detallan las mutaciones atendiendo a la secuencia de aminocidos.

La numeracin correcta de un gen la podemos obtener de la pgina del centro nacional de biotecnologa (National Center for Biotechnology: www.ncbi.nlm.nih.gov/) o de la pgina del proyecto Ensembl (The Ensembl Project: www.ensembl.org/index.html) aunque a veces es tal la cantidad de informacin que podemos encontrar en estos portales de Internet, ya que adems de las secuencias correctas podemos encontrarnos con secuencias de pseudogenes o secuencias alternativas o truncadas con las que podramos obtener una numeracin o secuencia errnea. Por otro lado, si estamos estudiando un tipo de cncer concreto podemos contar con portales especficos. Uno de los portales donde encontramos secuencias de cDNA nicas para cada gen es la base de datos mutaciones genticas humanas (The Human Gene Mutation Database: www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php). Aqu podremos encontrar para cada gen tanto su numeracin correcta como la numeracin por codones.

Una vez deducido el nmero de nucletido pasamos a describir la mutacin. Para ello debemos saber de qu cambio de nucletido o qu nucletidos se han insertado o delecionado. La nomenclatura correcta aceptada para una mutacin la podemos obtener siguiendo recomendaciones que podemos encontrar en Internet (www.hgvs.org/mutnomen/recs-DNA.html). Finalmente, una vez definida la variacin es necesario valorar su efecto, para ello nuevamente accederemos a bases de datos en Internet donde podremos ver el efecto causal o polimrfico de una variacin. Existen multitud de bases de datos en las que podemos consultar. Una de las ms recomendadas es la base de datos de mutaciones humanas mencionada antes (The Human Gene Mutation Database:

www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php). En este portal de Internet encontramos por cada gen un listado de mutaciones, clasificadas por grupos dependiendo de la naturaleza de la variacin. Adems, incluye una referencia al efecto fenotpico as como enlaces a publicaciones donde se describen dichas mutaciones. Adems de este portal as como el portal del centro nacional de biotecnologa (National Center for Biotechnology: www.ncbi.nlm.nih.gov/) donde hay abundante informacin, existen otros portales especficos de distintos tipos de cncer. Entre ellos nos encontramos con bases de datos de mutaciones de cncer de mama (http://research.nhgri.nih.gov/bic/), de cncer gastrointestinal (www.insight-group.org/) o de genes reparadores de ADN asociados a sndrome de lynch (www.med.mun.ca/MMRvariants/) , de mutaciones del gen p53 (www-p53.iarc.fr/references2.html), entre otras.

Aunque el nmero de mutaciones descritas en las bases de datos mencionadas es muy elevado y son objeto de actualizaciones peridicas (revisiones, ampliaciones), hoy en da siguen apareciendo nuevas variaciones que no estn descritas que han de ser objeto de valoracin. Hay casos claros, cuando hay una delecin o una insercin ya que estaramos ante un cambio en el marco de lectura de los nucletidos y generando una protena errnea. Ocurre lo mismo cuando el cambio de nucletido genera un codn de terminacin que generara una protena truncada.

El problema surge cuando la variacin descrita se trata de un cambio puntual que genera un cambio de aminocido que no aparece en ninguna base de datos, o en su defecto en ninguna publicacin reciente ya que a veces nos encontramos con mutaciones publicadas que todava no se han registrado en las bases de datos. Cuando nos encontramos con un individuo con una variacin de este tipo lo primero que debemos hacer es estudiar su rbol familiar y analizar la variante, descrita en el primer individuo, en todos los casos afectos de cncer. Con este estudio se puede demostrar que la variante segrega con la enfermedad en la familia, pero hay que tener en cuenta que mientras no se valide como mutacin causal, el anlisis de esta variante tendr un valor pronstico en los individuos no afectos de dicha familia pero nunca un valor diagnstico.

Los pasos que debemos seguir para validar esta variante son los siguientes: en primer lugar hay que secuenciar un mnimo de 100 ADN diferentes de individuos control. Si el resultado de la secuenciacin de estos 100 individuos es negativo nos encontramos con que la prevalencia est por debajo del 1% en la poblacin general y podemos decir que la variante descubierta se trata de una mutacin. En caso contrario, se tratara de un polimorfismo.

El siguiente paso sera estimar el riesgo de que la mutacin pueda considerarse causal en este caso en necesario estudiar por un lado la naturaleza de los aminocidos intercambiados y por otro lado la posicin en la protena. Conociendo naturaleza del aminocido podemos predecir su implicacin en la estructura proteica. As, hay aminocidos apolares que al ser sustituidos por uno de naturaleza polar (o viceversa) pueden alterar la estructura terciaria de la protena y hacer que sta pierda su funcionalidad. Ocurre algo similar con los aminocidos voluminosos o rgidos (prolina) que desestabilizan las estructuras secundarias (como hlices alfa o lmina beta). Conociendo la posicin que ocupan en la protena podemos predecir si la protena puede perder funcionalidad ya que en ocasiones afectan a centros activos, a dominios de unin otras protenas, sitios de fosforilacin etc Se puede conocer en qu estado de validacin se encuentra una mutacin en la pagina del instituto nacional del cncer (Nacional Cancer Institute: http://snp500cancer.nci.nih.gov/home_1.cfm?CFID=3676326&CFTOKEN=50294791)

Cuando se trata de una mutacin que afecta a una secuencia consenso para el splicing de un intrn concreto debemos validar el efecto de la mutacin comprobando el efecto que tiene en la trascripcin del ADN genmico a ARN mensajero ya que en estos casos el splicing suele ser errneo y el mecanismo de corte y empalme suele eliminar el exn que est adyacente a la mutacin. En este caso realizaremos un experimento de RT-PCR, que es una tcnica que nos va a permitir obtener cDNA a partir de ARN mensajero. En una primera parte y utilizando una enzima denominada Transcriptasa Reversa convertiremos el ARN mensajero en cDNA. Este cDNA ser es sustrato para realizar una amplificacin por PCR utilizando cebadores de secuencia basada en los exones adyacentes. El tamao de esta amplificacin nos indicar si ha habido un splicing alternativo. Por ejemplo, si la mutacin se da en el final del intrn 9 (prximo al exn 4) cabe esperar que el splicing afecte al exn 4 y lo elimine, y que el trnscrito final empalme el exn 3 con el exn 5. Si realizamos una PCR con una pareja de cebadores basados en los exones 3 y 5 sabremos por el tamao si se ha eliminado el exn 4 (figura 9)

Si la variacin encontrada ha sido mediante MLPA y nos indica un nmero de copia menor (la mitad) para uno o varios exones entonces deberemos repetir el experimento de MLPA pero en esta ocasin utilizaremos diferentes sondas de MLPA que cubran otra regin de los mismos exones para validar que se trata de deleciones genmicas. Otra manera de validar sera mediante PCR en tiempo real, pero el diseo y puesta a punto resultara laborioso y con un coste elevado. Es muy recomendable secuenciar los exones que han resultado con un nmero de copia menor ya que en numerosas ocasiones podremos encontrarnos con mutaciones puntuales en la zona de las sondas de MLPA que influyen en la hibridacin de la sonda y por lo tanto en el resultado del MLPAMutaciones de genes desconocidosEl gran nmero de genes que causan cncer hereditario, as como la gran cantidad de mutaciones hace que el estudio gentico sea complicado y laborioso. Aunque esta variabilidad ha sido un gran impedimento por la cantidad de trabajo que genera, as como el gasto que supone, ahora pueden ser resueltos, en parte, gracias a los altamente tecnolgicos microarrays desarrollados en la ltima dcada. Un microarray de deteccin de mutaciones se disea para escoger variantes de secuencia identificadas previamente en otros pacientes. Los microarrays contienen mutaciones de genes de acuerdo con el fenotipo de la enfermedad esperado y el patrn de herencia. Este tipo de microarray ofrece una alternativa de conseguir el genotipo de los pacientes de una forma rpida y con un coste asequible. Hay otro tipo de microarrays que son capaces de escanear un gran nmero de genes y algunos son capaces de detectar tanto mutaciones conocidas como desconocidas.

Sin embargo, otro uso de los microarrays es su potencial capacidad para facilitar el descubrimiento de la funcin de genes desconocidos. Por anlisis del perfil de expresin de transcriptos (ARN mensajeros) relevantes en cncer o incluso para tratamientos. De esta manera se puede llegar a comprender la funcin de los genes individuales y sus respectivas protenas. Esta tcnica muestra un alto nmero de falsos positivos, por lo que la puesta a punto es realmente laboriosa y obliga a la repeticin de experimentos en diferentes muestras. Por otro lado, hay que tener en cuenta que las tcnicas clsicas utilizadas para comprobar la expresin de un gen, como son las tcnicas de northern blot, RT-PCR, hibridizacin in situ son necesarias e indispensables para validar los estudios de microarrays.Estos microarrays nos permitirn determinar variaciones en la expresin de miles de genes de forma simultnea y reproducible. Los anlisis de expresin mediante microarrays de expresin constituyen actualmente una herramienta estndar para la identificacin de la huella gentica de las diversas formas de cncer, permitiendo un diagnstico preciso y una estimacin del riesgo de fallo con las diversas terapias existentes. Adicionalmente, permiten identificar dianas teraputicas potenciales y conducir a estudios experimentales basados en la firma molecular de los tumores.

La secuenciacin masiva de ADN permite obtener importante informacin funcional de los genes para su posterior utilizacin en estudios de variaciones gnicas y diversos estudios mdicos.

Otra innovadora tecnologa es la llamada secuenciacin masiva que ofrece un mximo rendimiento sin precedentes: entre 100-3.000 millones de pares de bases en cada reaccin. Esta tecnologa de alta precisin est basada en secuenciacin por clusters: pirosecuenciacin o ligacin y permite gran flexibilidad de aplicacin. El Proceso est automatizado minimizando riesgos de contaminacin. Y nos permite deferentes aplicaciones como secuenciacin completa de genomas, secuenciacin de novo, resecuenciacin (identificacin de mutaciones, determinacin de polimorfismos, reordenamientos, mutaciones somticas en baja frecuencia, etc.) en numerosas muestras de forma simultanea. Permite estudios epigenticos (metilacin del ADN y modificacin de nucleosomas) as como estudios de regulacin de la trascripcin (pequeos ARNs y unin de factores de trascripcin). Hay sistemas capaces de analizar cuatro genomas humanos en una sola corrida.

La mayor limitacin de esta tcnica es el Precio del equipamiento y de la reaccin. El equipo necesita una gran capacidad informtica tanto de procesado de datos como de almacenamiento (24.000 Gb) as como un servicio bioinformtica capaz de gestionar toda la informacin.