Métodos de muestreo aeromicológico

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SEMINARIO DE LAS ESPORAS AEROVAGANTES4.‐MÉTODOS DE MUESTREO AEROMICOLÓGICO

II JORNADA DE LA ASOCIACIÓN ESPAÑOLA DE AEROBIOLOGÍA (AEA) XV Congreso Español y V Congreso Iberoamericano de Salud Ambiental

Belén Elvira Rendueles y José María Maya ManzanoSEMINARIO DE LAS ESPORAS AEROVAGANTES 1

• Están proyectados para determinar la fuente, cantidad e identificación delas esporas fúngicas transmitidas y dispersadas por vía aérea.

• Están basados en:

• el tipo de muestreo (captadores), su identificación (métodos no viables)su recuperación y subsiguiente cultivo de microorganismos ( métodosviables).

• Estos métodos pueden ser clasificados de acuerdo con el procedimientode toma de muestra o el manejo de la muestra tomada, e incluyen:gravitación, impactación, centrifugación, burbujeo y filtración.

Métodos de muestreo de las esporas aerovagantes

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CLASIFICACIÓN• MÉTODOS NO VOLUMETRICOS

• MÉTODOS GRAVIMÉTRICOS: • DEPOSICIÓN GRAVIMÉTRICA: MÉTODO DE DEPOSICIÓN EN PLACAS• GRAVITACIÓN O IMPACTACIÓN NATURAL. CAPTADOR DURHAM

• MÉTODOS VOLUMETRICOS:

• FILTRACIÓN:• MÉTODO MCV

• IMPACTACIÓN:• MÉTODO IMPACTACIÓN INTERMITENTE:

• CAPTADOR ROTOROD (METRONIC)• IMPACTO ACTIVO:

• IMPACTADORES DE BAJO VOLUMEN TIPO HIRST• BURBUJEO O IMPINGER• IMPACTO EN CASCADA:

• IMPACTADOR ANDRESEN DE 1-6 ETAPAS• IMPACTADOR DE MAY• IMPACTADOR DE ETAPA SIMPLE O SAS.

• POR CENTRIFUGACIÓN:• RCS BIOTEST.

• CICLONES: BURKARD CICLÓN


MÉTODOS GRAVIMETRICOS: TIPO DURHAM

• Basados en la sedimentacióngravimétrica del contenido del aerosolen estudio, mediante la exposición deplacas o portaobjetos.

• La eficiencia de la colección de laspartículas depende de su tamañoaerodinámico y se ve muy afectadapor el viento y las turbulencias.

• Partículas de pequeño tamaño comoconidios fúngicos, ascosporas ybasidiosporas quedan muyinfravaloradas ( Lacey,1996)

• El método no es cuantitativo• Es un procedimiento útil para estudios

iniciales aire interior


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MÉTODOS VOLUMETRICOS: FILTRACIÓN

• El aire es aspirado a través de un medio de filtración en el cual las partículas se depositan.

• El tipo de filtro más utilizado es el demembrana de policarbonato ya que laspartículas pueden ser removidasfácilmente de su superficie por agitaciónen líquidos adecuados, procediéndose ala posterior inoculación de la suspensiónformada en los medios de cultivosespecíficos.

• Su flujo es función del tipo de filtro, sutamaño y de la bomba de aspiración,oscilando habitualmente entre 1‐500L/min. Dificultad de su standarizacióny comparación de resultados


MÉTODOS VOLUMETRICOS: FILTRACIÓNMÉTODO MCV

• En España se utiliza un captador defiltración, y el M.C.V.; y 1/2 filtro setransparenta con aceite de inmersiónpara la visualización óptica directa y 1/2filtro se cultiva en placas con mediosespecíficos MEA, SCA, CZX.

• El MCV de diseño español, combina lametodología viable con la no viable loque lo hace ideal para el estudio dehongos atmosféricos. Es un captador debajo volumen 4L/hora y trabaja porfiltración activa.

• Método se ha usado en Cartagena encombinación con el impactador de Hirstpara el estudio aeromicológico delbioaerosol atmosférico


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MÉTODOS VOLUMÉTRICOS IMPACTADORES• Impactación: El aire, aspirado por una bomba de

vacío que forma parte del muestreador, pasa a travésde un orificio y es dirigido a la superficie receptora(medio de cultivo contenido en una placa, cintamelinex filtro, u otro soporte).

• Las partículas con suficiente momento de inerciaabandonan la corriente e impactan sobre la superficie.

• El orificio de entrada puede consistir en una rendija oen un cabezal con un elevado número de orificios deigual diámetro y el medio de recogida puede ser agarsobre una placa, un portaobjetos u otros soportes.

• Ejemplos de estos muestreadores por impactaciónincluyen los de rendija (Casella), impactadores deetapa simple (SAS), impactadores en cascada de Mayo Andersen de 1, 2 y 6 etapas o placas (este últimoconsiderado como método de referencia)

• caudal de aspiración varía en el rango de 10 a 180L/min

• Impactadores multiorificio: Air Sampler (MAS‐100), Microflow,Millipore Air Tester (M Air T), Sterilizable Microbial Atrium(SMA) o Surface Air System (SAS)


Impactador de May

Esquema de funcionamiento de impactación

Impactador Andersen

MÉTODOS VOLUMÉTRICOS IMPACTADORES• la placa se incuba a la temperaturaadecuada, produciéndose el crecimientode las esporas mediante la formación deuna colonia en el punto de impacto.

• Posteriormente se procede al recuentode dichas colonias y al cálculo de sunúmero referido a un volumen fijo de airede 1m3 , a partir de las coloniasencontradas en el volumen de airemuestreado, expresándose los resultadoshabitualmente como ufc/m3 (unidadesformadoras de colonias en un metrocúbico de aire).

• La identificación específica de la esporaaerovagante supone habitualmente quese proceda a su resiembra, en medioidóneo, y la posterior identificación oestudios por morfología directa otinciones específicas.


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MÉTODOS VOLUMÉTRICOS: IMPACTADORESIMPACTADORES DE BAJO VOLUMEN TIPO HIRST

– El captador volumétrico de Hirst modificado posteriormentepor Burkard (semanal) puso en evidencia y revolucionó elconcepto de contenido en esporas del bioaerosolatmosférico al demostrar mediante su método devisualización microscópica la gran variedad de ascosporas,basidiosporas y balistosporas tipo Sporobolomycesexistentes en el aire normal.

– El aire aspirado (10L/min) impacta sobre una superficietransparente (cinta melinex) impregnada con diferentessustancias adherentes (glicerina/gelatina 12,5%;silicona/tetracloruro de carbono 2%; vaselina/hexano 10%;parafina).Tiene una eficiencia del 95% para partículas de<10µ y del 99% para partículas mayores.

– La muestra se visualiza microscópicamente montada enportaobjetos con glicerogelatina jelly teñida con fucsina

– El muestreo se realiza en continuo lo que permite el estudiode la evolución de las esporas, durante el día (variaciónintradiurna) y a lo largo del año ( variación estacional


Manual calidad de la REA

MÉTODOS VOLUMÉTRICOS: IMPACTADORESIMPACTADORES DE BAJO VOLUMEN TIPO HIRST

• Los resultados que se obtienen de un captador Hirst sonconcentraciones medias diarias de pólenes y esporas(pólenes/m3 y esporas/m3).

• Para obtener estos valores basta realizar un simplecálculo matemático en el que intervienen como factores:

• el número de partículas contadas (n).

• la superficie de muestra analizada. Para calcularla senecesita conocer el número (n) de líneas contadas y sulongitud (K2) y anchura (K3) (ambas dependen delmicroscopio y del objetivo que se use en la lectura). Conestos parámetros se calcula la proporción analizadarespecto de toda la superficie útil de la preparaciónmicroscópica (K4).

• el volumen de aire que aspira el captador, normalmente 10l/minuto, que, al cabo de un día equivalen a 14,4 m3 de aire(K5).


Manual calidad de la REA

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Cálculo de las concentraciones método Hirst

• Caso práctico: Considerando un diámetro del campo de visión de 0.45 mm:

• Volumen de succión: 10 l/min = 600 l/hora = 14400 l/día = 14,4 m3

• W =Diámetro medio del campo de visión al microscopio: 0,45 mm

• Área de 1 barrido horizontal= 48 mm x 0,45 mm = 21,6 mm2

• Superficie analizada = 21,6 x 4 barridos = 86,4 mm2

• Superficie total muestreada = 48 mm largo x 14 mm ancho = 672 mm2

• N = número de granos de polen en los cuatro barridos.

• Contenido de partículas por metro cúbico de aire = N x 0.54

• Cartagena

• W Ø50x=0,398 mm

• Superficie leída=76,63mm2

• Factor 0,61

MÉTODOS VOLUMÉTRICOS : IMPACTADORESIMPACTADORES DE BAJO VOLUMEN TIPO HIRSTMétodo de detección continua de esporas aire exterior, visualización directa, identificación características morfológicas de las esporas


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MÉTODOS VOLUMÉTRICOS: IMPACTADORESIMPACTADORES EN CASCADA TIPO ANDERSEN

• Presentan una alta eficiencia en la captura departículas de pequeño tamaño, siendo idealespara el aislamiento y cultivo de hongosaerovagantes, bacterias y alergenos libres(técnicas de inmunodetección y ELISA‐enzimoinmunoensayo, biologia molecular ).

• ANDERSEN Se trata de un muestreadormultiorificio en cascada que separaautomáticamente las partículas en fraccionessegún su tamaño. Existen modelos de 2 y 6niveles, que constan de cabezales perforados de200 y 400 orificios, respectivamente, cuyodiámetro disminuye progresivamente en sentidodescendente, y operan a un caudal de 28,3 l/min.Suele utilizarse como muestreador de referenciapara valorar la eficacia de otros muestreadores.También existe la versión de una etapa, adaptadade la última fase del muestreador Andersen de 6etapas.


6 Muestreadores de bioaerosoles partículas <10µm hasta 0,3µm ypotencialmente nanopartículas<100nm


Impactadores líquidos Impactadores sólidos de hendidura y en cascada

filtros

Flujo de salida del aire

Flujo de entrada del aire

Methods for Sampling of Airborne VirusesDaniel Verreault 2008

técnicas de identificaciónInmunodetecciónenzimoinmunoensayo,biologia molecular

ciclones

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MÉTODOS volumétricos: CICLONES


El ARN ribosómico ARNr 16S es la macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía bacterianas(Carl Woese,1970) DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) , FISH(Fluorescence In Situ Hybridization), y cuantitativas, como qPCR (Real Time Quantitative PolymeraseChain Reaction). técnicas FISH‐ARNr 16S gene restriction analysis (ARDRA) Especificidad de las técnicas biomoleculares : Uso de Sondas Taqman grupos filogenéticos

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Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)• La PCR cuantitativa (en inglés, quantitative polymerase chain reaction; qPCR o Q‐PCR)

o PCR en tiempo real (en inglés real time PCR) es una variante de la reacción encadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamentecuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácidodesoxirribonucleico (ADN). Para ello emplea, al igual que la PCR convencional, unmolde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón dereacción adecuado y una ADN polimerasatermoestable. A dicha mezcla se le adicionauna sustancia marcada con un fluoróforo que permita medir la tasa de generación deuno o más productos específicos.1 en un termociclador provistode sensores de fluorescencia, tras excitar el fluoróforo a la longitud deonda apropiada. Dicha medición se realiza tras cada ciclo de amplificación, y es poresto que se le denomina PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea).

• Detección de fitopatógenos

• Se han desarrollado sistemas basados en sondas específicas Taqman capaces dedetectar una cantidad de 10 a 100 fg mezclados en el ADN de Phytophthora en laplanta hospedadora.

• Calidad aire interior

• INDICE EXPOSICIÓN A HONGOS INTERIORES MEDIANTE PCR ERMI Evaluates "Indoor moldiness"Identifies 36 species of mold (EPA Protocol and License)

• Diagnostico del asma alérgico fúngico

• identificación a las especies fúngicas es esencial para determinar la etiología del asmaPringle A (2013) uso de herramientas moleculares TERMOCICLADOR

EPA Technology for Mold Identification and Enumeration

ERMI Evaluates "Indoor moldiness" Identifies 36 species of mold (EPA Protocol and License)Bacterial & Mold Detection Identification & Quantitationhttps://www.envirobiomics.com/

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EPA's Environmental Relative MoldinessIndex (ERMI):

• índice de Mohos relativo ambiental (ERMI) que permite evaluarobjetivamente la carga fúngica intradomiciliaria (Vesper et al. 2007). Latécnica basada en un análisis específico del ADN de los 36 hongosintradomiciliarios más frecuentes , de una base de 130, mediante PCRcuantitativo denominado MSQPCR (Mold Specific Quantitive PCR) incluye,las 26 especies de grupo 1 asociadas a casas con daños por agua y 10especies que el grupo 2, especies que se encuentran en casas sinhumedades, constituye la base de la ERMI. Después se calculan estos dosgrupos, al grupo 1 entonces se resta de grupo 2 para puntuar ERMI.Idealmente, la puntuación debe ser inferior a 2.

• Sin embargo, también es importante conocer las especies individuales dehongos identificados y sus cantidades para evaluar los resultados de laprueba. La desviación estándar es un máximo de +‐3. Este valor luego segrafica de menor a mayor con la escala desde ‐10 hasta 20. y se divide encuartiles. Los domicilios en el cuartil más bajo tienen la menorcontaminación fúngica interior. Cada cuartil superior indica mayorcontaminación fúngica presentes en el domilicio. El cuarto cuartil indicaviviendas con la mayor carga de hongos.

INDICE ESPOSICIÓN A HONGOS INTERIORES MEDIANTE PCR

MSQPCR TECHNOLOGY IS PATENTED BY THE U.S. EPA, INDEX ERMI VESPER 2007

B.ELVIRA 2017

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METODOS DIAGNOSTICO CLÍNICO DE LAS ALERGIA A HONGOS

• Halogen Immunoassay, a New Method for the Detection of Sensitization to Fungal Allergens; Comparisons with Conventional Techniques Allergology International 55(2):131‐139 ∙ December 2006 Green et al 2006

• The Halogen Assay ‐ A New Technique for Measuring Airborne Allergen.Article in Methods in molecular medicine 138:227‐46 ∙ February 2008 with24 Reads DOI: 10.1007/978‐1‐59745‐366‐0_19 ∙ Source: PubMed Toveyet al 2008

• Collection of Air Samples to Quantify Exposure to Airborne Allergens Susan Gordon (2008) Collection of Air Samples to Quantify Exposure to Airborne Allergens. In: Jones M.G., Lympany P. (eds) Allergy Methods and Protocols. Methods in Molecular Medicine, vol 138. Humana Press DOIhttps://doi.org/10.1007/978‐1‐59745‐366‐0_17.Print ISBN978‐0‐89603‐896‐7

• Aeroallergen Immunoblotting with Human IgE Antibody. Takahashi and Nilsson 1995

• Allergen detection from 11 fungal species before and after germination Journal of Allergy and Clinical Immunology 111(2):285‐9 ∙ February 2003 Green Tovey y Mitakakais

• Molecular methods for bioaerosol characterization Richard Summerbell et al2011.El desarrollo de anticuerpos policlonales y monoclonales (mAbs y PAB) ha sido instrumental en lograr especificidad del ensayo así como que confiere mayor sensibilidad (Schmechel et al. 2003, 2008).

• INUMOENSAYO INDIRECTO, ELISA (Trout et al . 2004, alarmante et al. 2008), CITOMETRÍA DE FLUJO (Rydjord et al. 2007), INMUNOTINCIÓN directo e indirecto (Popp et al. 1988, Reijula et al. 1991, Takahashi et al. 1993, Takahashi y Nilsson 1995, Portnoy et al. 1998, Schmechel et al. 2003), western blot inmunoblot o electrotransferencia (Barnes et al. 1993, Cruz et al. 1997, Bisht et al. 2004) y el halógeno, inmunoensayo de HIA (Mitakakis et al. 2001, Poulos et al. 2002, green et al. 2003, Mitakakis et al. 2003, green et al. 2006

Halogen Immunoassay, a New Method for the Detection of Sensitization to Fungal Allergens


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IDENTIFICACIÓN DE LAS ESPORAS AEROVAGANTES EN BASE AL MÉTODO DE CAPTURA

Método no viable Método viable


Placa petri

Cubreobjetos

Disco papel filtroSaturado de agua

Varilla de vidrio en forma herradura

Inóculo

Microcapa de agar

microcultivo

ESTUDIO DE LA ONTOGENIA CONIDIAL

Belén Elvira

X 20

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Beauveriaconidios blásticos‐radulosporas

MICROCULTIVO

Belén Elvira


COMPARACIÓN SENSIBILIDAD METODOLOGIAS

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CONCLUSIONES

• Todos los métodos de muestreo y análisis basados en la detecciónmediante cultivo de hongos viables, deja a un lado un número considerablede hongos no cultivables. Es importante asociar estos métodos clásicos deanálisis a métodos de análisis por detección directa (microscopía óptica) ymétodos cualitativos y cuantitativos basados en técnicas moleculares(PCR...)El futuro desarrollo de estándares, incluyendo la ISO 14698 de aireinterior, debe considerar estas cuestiones en el estudio de lacontaminación fúngica en ambientes interiores

• La norma ISO 14698‐1 lista las actuaciones que deben realizarse en las salas limpias y ambientes controlados asociados desde el punto de vista de la biocontaminación

• ISO 14698‐2:2003 Cleanrooms and associated controlled environments ‐‐Biocontamination control ‐‐ Part 2: Evaluation and interpretation of biocontamination data


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