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Caracterización del efecto de la mutación D211G

de la subunidad β2 sobre canal de sodio cardíaco.

Máster de Biomedicina y Biología Molecular

Universidad de Girona 2012

Olallo-Efrén Sánchez-Molero Núñez

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Índice

RESUMEN ............................................................................................................................ 3

1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 4

1.1 EL SISTEMA CARDIOVASCULAR .................................................................................................... 4

1.2 EL CORAZÓN HUMANO .............................................................................................................. 4

1.3 POTENCIAL DE ACCIÓN Y ELECTROCARDIOGRAMA .......................................................................... 6

1.4 ELECTROCARDIOGRAMA (ECG) .................................................................................................. 7

1.5 MUERTE SÚBITA CARDÍACA ........................................................................................................ 8

1.6 SÍNDROME DE BRUGADA ........................................................................................................... 9

1.7 CANAL DE SODIO OPERADO POR VOLTAJE ................................................................................... 11

1.8 ESTUDIOS PREVIOS DEL CENTRO DE GENÉTICA CARDIOVASCULAR ................................................... 14

1.9 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................................... 15

2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 16

2.1 SELECCIÓN DEL MODELO CELULAR EXPERIMENTAL ........................................................................ 16

2.2 VECTOR DE TRANSFECCIÓN ...................................................................................................... 16

2.3 TRANSFECCIÓN ...................................................................................................................... 17

2.4 ANÁLISIS DE EXPRESIÓN DE PROTEÍNAS: ..................................................................................... 17

2.4.1 Biotinilación ................................................................................................................ 17

2.4.2 Western Blot ............................................................................................................... 19

2.5 INMUNOFLUORESCENCIA ......................................................................................................... 19

2.6 ESTUDIOS DE ELECTROFISIOLOGÍA ............................................................................................. 20

3. RESULTADOS ................................................................................................................. 25

3.1 WESTERN BLOT ..................................................................................................................... 25

3.1.1 Proteína total: ............................................................................................................ 25

3.1.2 Proteína de membrana: ............................................................................................. 26

3.2 INMUNOFLUORESCENCIA: ........................................................................................................ 27

3.3 ELECTROFISIOLOGÍA ................................................................................................................ 30

3.3.1 Relación corriente-voltaje .......................................................................................... 30

3.3.2 Dependencia de voltaje de la activación .................................................................... 31

3.3.4 Recuperación de la inactivación ................................................................................. 32

4. DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES ......................................................................................... 33

5. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 34

3

Resumen El síndrome de Brugada es una enfermedad familiar asociada a alto riesgo de muerte súbita

cardíaca. Entre el 20 y 25 % de los casos de SBr están relacionados con mutaciones que son

responsables de la perdida de función del canal de sodio cardíaco. Mientras que la mayoría de

las mutaciones relacionadas con el SBr se han encontrado en gen SCN5A, también se han

encontrado mutaciones en los genes que codifican a distintas subunidades regulatorias. En los

estudios previos del centro de genética cardiovascular se identificó una mutación en el SCN2B,

que codifica a la subunidad β2, en una mujer de 47 años diagnosticada con SBr. Esta mutación

causa un cambio aminoacídico en la posición 211 (D211G) del dominio intracelular de la

subunidad β2. La caracterización funcional de esta mutación mostro una disminución de la

corriente de sodio en las células que expresaban la mutación en la subunidad β2 D211G con

respecto a la β2 wt, sin evidenciarse efectos la expresión en membrana de Nav1.5.

En el presente trabajo se estudiaron distintas características de la expresión de Nav1.5

coexpresado con la subunidad b2 wt o D211G en una relación molar de 0.5:6 para identificar si

la ausencia de diferencias en la expresión de Nav1.5 observada en los experimentos previos se

debía a un exceso de Nav1.5 con respecto a la subunidad β2. Para ello se llevaron a cabo

estudios de expresión de proteína mediante las técnicas de Western Blot y biotinilación de

proteínas de membrana. Se purificaron las proteínas Nav1.5 y β2 de membrana, pero no se

observaron diferencias en la expresión de Nav1.5 cuando esta estaba coexpresada con la

subunidad β2 wt o la β2 D211G. Por otro lado se hicieron estudios de localización celular de

Nav1.5 mediante inmunofluorescencia. Los resultados no dieron diferencias entre las

condiciones de coexpresión de Nav1.5 con la subunidad β2 wt o con la β2 D211G. Finalmente

se realizaron registros electrofisiológicos que permitieron observar la corriente de sodio en

células transfectadas en la condición 0.5:6 para Nav1.5: β2 wt. Se midió la relación corriente

voltaje y se obtuvo un valor de corriente máxima de -1200 pA. Los valores obtenidos de los

parámetros biofísicos de la corriente de sodio fueron: V1/2 de activación por voltaje =-25.5 mV;

V1/2 inactivación del estado estacionario=-26.29 mV y la constante de tiempo de la

recuperación de la inactivación=31.1 ms.

En conclusión, los resultados del presente trabajo no evidencian cambios en la expresión de

Nav1.5 coexpresada con la β2 D211G con respecto a la β2 wt. Estos resultados no descartan la

hipótesis planteada pero para comprobarla serian necesario estudiar distintas condiciones de

transfección o utilizar otros modelos celulares.

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1. INTRODUCCIÓN

1.1 El sistema cardiovascular

El sistema cardiovascular está constituido por un conjunto de órganos encargados de distribuir

la sangre al organismo para aportar oxígeno, nutrientes y otras sustancias a las células para su

metabolismo. También recoge las sustancias nocivas de origen metabólico para transportarlas

hasta los órganos de excreción.

El aparato circulatorio se puede dividir en dos tipos de circuito, la circulación mayor o

sistémica y la menor o pulmonar. La primera transporta sangre a todas las partes del cuerpo.

Las arterias transportan la sangre rica en oxígeno del corazón y las venas transportan sangre

pobre en oxígeno hacia el corazón. La sangre sale del corazón por la arteria aorta y retorna por

las venas cavas superiores e inferiores. En la circulación pulmonar el sentido de la circulación

con respecto al contenido de oxígeno se invierte. La arteria pulmonar transporta la sangre

pobre en oxígeno a los pulmones y la vena pulmonar retorna al corazón la sangre rica en

oxígeno.

Hay veinte arterias importantes que atraviesan los tejidos del organismo donde se ramifican

en vasos más pequeños denominados arteriolas y estas a su vez se ramifican en capilares. Los

capilares son los que transportan los nutrientes y el oxígeno a las células y recogen el dióxido

de carbono y otras sustancias [1]. Por lo tanto el sistema cardiovascular está constituido por

órganos tubulares: Los vasos sanguíneos (arterias, capilares y venas) y el corazón.

1.2 El corazón humano

Para que la sangre pueda circular como se ha explicado en el apartado anterior se necesita un

órgano que la pueda bombear, y esta función la cumple el corazón, un órgano muscular

situado en la cavidad torácica, especializado en impulsar la sangre. Se divide en cuatro

cavidades, aurícula derecha e izquierda (AD, AI respectivamente) y ventrículo derecho e

izquierdo (VD, VI respectivamente). Los ventrículos están separados por un tabique muscular

llamado “septum” interventricular y las aurículas por otro tabique más delgado llamado

“septum” interauricular. Entre la AD y el VD se encuentra la válvula mitral y entre la AI y el VI la

válvula tricúspide. Estas válvulas aseguran el paso unidireccional de la sangre entre las

cavidades del corazón.

La pared del corazón está formada por tres capas, pericardio, endocardio y miocardio.

5

Figura1. Esquema representativo de las diferentes partes del corazón y las capas principales del miocardio

El pericardio es una membrana que recubre todo el corazón, y se divide en dos, el pericardio

fibroso que es la capa más externa y dura, y el pericardio seroso hacia el interior. Dentro del

pericardio seroso tenemos la capa parietal (externa) y la visceral (en contacto con el músculo)

y entre estas existe una cavidad llena de líquido que facilita el movimiento del corazón.

El endocardio es una membrana serosa de endotelio y tejido conectivo de revestimiento

interno, que está en contacto con la sangre. A medida que la parte más interna de esta capa se

aproxima al miocardio se hace más rica en fibras elásticas y colágenas, y y se pueden observar

en ella vasos sanguíneos, nervios, y parte del sistema de conducción de impulsos llamado

fibras de Purkinje [2].

En medio de estas dos capas se localiza el miocardio o músculo cardíaco, está compuesto por

células involuntarias, estriadas y ramificadas. En la figura 1 se muestra un esquema

representativo de la disposición de éstas capas y otros aspectos de la anatomía general del

corazón.

Los cardiomiocitos son células uninucleadas que forman estructuras tridimensionales en forma

de red. Miden aproximadamente 100 µm de longitud y 15 µm de diámetro. Existen diferencias

estructurales entre las células de las aurículas y de los ventrículos, siendo las primeras más

6

pequeñas y con un sistema de túbulos t rudimentario. Los miocitos están interconectados por

uniones gap y discos intercalares. Estas uniones son de baja resistencia eléctrica y permiten el

paso de iones y por lo tanto la transmisión de señales eléctricas. El músculo cardíaco se

contrae de forma involuntaria y su contracción está regulada por células autoexcitables o

“marcapasos” que se encuentran agrupadas en la aurícula derecha próximas a la vena cava

superior formando el nodo sino auricular (S-A). La señal eléctrica generada en el S-A se

transmite hacia un segundo nodo situado por debajo del primero llamado nodo auriculo

ventricular (A-V). La señal eléctrica continúa hacia los ventrículos a través de pequeñas fibras

especializada en conducción (Haz de His) que se bifurca en dos ramas y se extiende en las

fibras de Purkinje. La elevada velocidad de conducción de estas fibras permite una contracción

sinérgica y coordinada de los ventrículos [3, 4].

1.3 Potencial de acción y electrocardiograma

En reposo, el potencial de membrana de los cardiomiocitos es aproximadamente de -85mV. La

despolarización está causada por la llegada de un impulso eléctrico que promueve la apertura

de canales operados por voltaje. Las corrientes iónicas que resultan de la apertura de estos

canales provocan los cambios de potencial que se observan en el potencial de acción (PA) [4].

El PA se compone de cinco fases tal y como se ve en la figura 2:

Fase 0 o despolarización rápida: Comienza con un cambio brusco y rápido en la

permeabilidad de la membrana al sodio. La corriente de entrada de sodio (INa) está

producida por la apertura de los canales de sodio operados por voltaje, que provoca la

despolarización de la membrana. En esta fase también se abren canales de corriente

de salida de potasio (Ito).

Fase 1 o repolarización precoz: En esta fase se desarrolla una repolarización temprana

de la célula llamada “notch”, producida por la inactivación de los canales de sodio

operados por voltaje, y por el mantenimiento de la apertura de los canales Ito.

Fase 2 meseta o repolarización lenta: Esta meseta o “plateu” característica del

potencial de acción cardíaco se produce por la apertura de canales de Ca2+

dependientes de voltaje, que produce una corriente de (ICa). En esta fase el potencial

comienza a disminuir lentamente por la activación de los canales de salida de K+ (IKs,

IKr), diferentes a los canales Ito.

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Fase 3 o repolarización rápida tardía: En esta fase se observa la caída del potencial de

acción ya que se inactivan los canales ICa y quedan abiertos canales de salida de K+ (IKs,

IKr), que continúan abiertos hasta que se restablece el potencial de reposo en la fase 4.

Fase 4 o periodo entre dos potenciales: La célula recupera su potencial de reposo (-

85mV) como se muestra en la figura 2, pero tiene un exceso de sodio. La bomba sodio-

potasio bombea iones de Na+ al exterior celular restableciendo el gradiente inicial.

Figura 2. Representación del potencial de acción de un cardiomiocito y corrientes implicadas. Benito B., et al 2009

1.4 Electrocardiograma (ECG)

El ECG, es el resultado de la representación de todos los potenciales de acción cardíacos del

corazón (figura 3). La figura 4 representa un ECG típico. En esta figura se observa como la onda

P corresponde a la despolarización auricular, el complejo QRS representa la despolarización

ventricular, y la onda T corresponde a la repolarización ventricular. La repolarización auricular

no se observa ya que queda “silenciada” por el complejo QRS ya que suceden al mismo

tiempo.

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Nodo

Sinusal

Músculo

Nodo

Nodo A-V

HazComún

RamasDel haz

Auricular

Fibras dePurkinje

MúsculoVentricular

Tiempo, ms

Figura 3. Izquierda: Esquema de las zonas de despolarización del corazón y sus respectivos potenciales de acción, la

suma formará el ECG.

Figura 4. Representación de un electrocardiograma típico. Brugada R., 2012 Universitat de Girona.

1.5 Muerte súbita cardíaca

Cuando hay defectos en la despolarización del corazón puede ocurrir lo que se llama “muerte

súbita cardíaca” (MSC) generalmente definida como una forma de muerte natural debida a

causas cardíacas, inesperada en el tiempo y en su forma de presentación, que viene precedida

por la pérdida brusca de conciencia en la hora siguiente como máximo de la aparición de los

primeros síntomas (dolor de pecho, palpitaciones, síncope y disnea). En estos tipos de

patología se incluyen individuos con cardiopatías conocidas o sin diagnosticar aún.

9

La muerte súbita tiene una gran incidencia en la población ya que tan solo en Estados Unidos

se lleva de 250 000 a 300 000 vidas al año. Entre Norte América y Europa las MSC tienen una

incidencia de entre 50 a 100 por cada 100 000 personas en la población general [5, 6].

Las muertes súbitas cardiacas se clasifican en dos tipos:

Canalopatías: Estan relacionadas con mutaciones que alteran la estructura de canales

iónicos y por lo tanto afectan a su funcionalidad. Los canales afectados principalmente

son de Na+, Cl- , Ca2+ y K+.

Algunos ejemplos son el síndromes del tipo Brugada, QT corto, QT largo y la

Taquicárdia Catecolaminérgica Polimórfica Ventricular.

Cardiomiopatías: Estas estan relacionadas con alteraciones estructurales anatómicas

del corazón.

Algunos ejemplos son la cardiomiopatía hipertrófica o la displásia arritmogénica de

ventrículo derecho.

1.6 Síndrome de Brugada

Un tipo de muerte súbita asociada a canalopatías es el Síndrome de Brugada (SBr) que fue

descrito en 1992 como “una enfermedad heredable causante de muerte súbita cardíaca que se

transmite de un modo autosómico dominante con penetrancia incompleta”. Afecta

principalmente a jóvenes de entre 35 y 40 años, sin una patología previa ni alteraciones

estructurales cardíacas. Entre el 20%-50% de los pacientes presentan una historia familiar de

muerte súbita cardíaca [7], y se calcula que el SBr es responsable de entre un 4 y un 12% de

este tipo de muertes.

Ésta enfermedad tiene un patrón típico de ECG donde se observa una elevación del segmento

ST en las derivaciones precordiales derechas (V1-V3), también conocido como un ECG de

“aleta de tiburón”, figura 5 [8].

El síndrome de SBr es una enfermedad relacionada con anomalías genéticas. Entre un 18% y

un 30% de los casos de SBr ocurren por mutaciones en SCN5A. Éste gen codifica a la subunidad

α del canal de sodio cardíaco (Nav1.5), el primer gen descrito relacionado con el SBr. Desde

entonces, centenares de mutaciones en SCN5A han sido ligadas al SBr. Éste gen está localizado

en el cromosoma 3p21. En los últimos años se han encontrado variaciones en otros genes que

son responsables de aproximadamente un 1% de los casos de esta enfermedad [9]. Dentro de

la lista de estos otros genes que afectan a la función del Nav1.5, relacionados con el SBr, se

encuentran los genes SCN1B y SCN3B, que codifican a subunidades asociadas a Nav1.5.

10

Distintos grupos de investigación han estudiado los cambios funcionales provocados por

mutaciones en el canal de sodio. Estos estudios realizados en sistemas de expresión

heteróloga han mostrado que las mutaciones relacionadas con el SBr provocan pérdida de la

función del canal. Esta puede deberse a distintos factores como cambios en la dependencia del

voltaje, tiempo de activación, inactivación del canal y recuperación del estado de inactivación.

Una de las teorías más aceptadas que explica el patrón del ECG observado en SBr se basa en

que en condiciones normales existe una heterogeneidad transmural del potencial de acción

cardíaco entre epicardio y endocardio, como se puede ver en el patrón “normal” de la figura 5.

Cuando hay una pérdida de la función de Nav1.5 la región más afectada es el epicardio

produciendo así una acentuación del gradiente de voltaje transmural.

Como se puede observar en la figura 5, esta alteración en la primera fase del potencial de

acción se traducirá en el ECG como una elevación del segmento ST.

Una explicación sobre la ocurrencia de arritmias es que haya zonas del epicardio donde el

potencial de acción cardíaco se extingue prematuramente. La repolarización precoz de estas

células provocaría que los canales de Na+ de estas células sean susceptibles de volver a

activarse si les llega otro estímulo. Así, el desfase entre epicardio y endocardio pueden hacer

que se forme “loops” de despolarización que provocarían que la señal eléctrica no fluya

unidireccionalmente provocando así alteraciones en la contracción del músculo cardíaco [10].

Figura 5. Modelo de potencial de acción en relación con el ECG que se propone para explicar la elevación del

segmento ST en síndrome de Brugada. Cuando hay una acentuación de esta caída de potencial del epicardio

respecto al endocardio provoca un gradiente transmural de voltaje, cuanto más se acentúa esta diferencia el

potencial de acción del epicardio se alarga respecto al del endocardio provocando una elevación del segmento ST y

ondas T negativas. Benito B., et al. 2008.

11

1.7 Canal de sodio operado por voltaje

Los canales de sodio operados por voltaje (VGSCs) son proteínas transmembranales de 227

kDa y tienen entre 2015 y 2016 aminoácidos, según la variante de splicing. La subunidad α

(forma el poro) se asocia a subunidades β (proteínas transmembrana auxiliares) formando

complejos macromoleculares en una estequiometria 1:1. Estas subunidades están altamente

expresadas en células excitables, incluyendo neuronas y células musculares cardíacas. La

función de la subunidad α es permitir el paso de iones de sodio a través de la membrana

plasmática en las direcciones dictadas por el potencial electroquímico del Na+ [11]. La

subunidad α contiene cuatro dominios homólogos de seis segmentos transmembranales como

se puede observar en la figura 8. El segmento 4 es el que contiene el sensor de voltaje [12].

Los canales iónicos tienen diferentes estados conformacionales que permitirán o no el pasaje

de iones (figuras 6 y 7). En reposo la conformación del canal obstruye el poro central y evita el

pase de iones. Cuando hay una despolarización pequeña se desencadena un movimiento de las

cargas positivas, que se encuentran en las hélices α que conforman el sensor de voltaje, hacia

la superficie exoplasmática y causan un cambio conformacional en el canal dejando libre el

flujo de iones. Alrededor de 1 milisegundo después ocurre un movimiento del segmento

inactivador del canal hacia el interior del canal abierto. Mientras la membrana permanezca

despolarizada, la inactivación persiste. Cuando la membrana celular vuelve a un potencial

negativo de reposo, el segmento inactivador del canal se balancea afuera del poro, y el canal

retorna al estado cerrado de reposo.

Figura 6. Esquema de la disposición tridimensional del canal de sodio.

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Figura 7. Esquema de los estados conformacionales del canal de sodio operado por voltaje. (2) Cuando llega la

despolarización se activa el canal abriéndose y dejando el libre paso de iones. (3) Mientras está abierto el canal el

segmento inactivador se va cerrando lentamente hasta que obtura el canal impidiendo el paso de los iones, dejando

el canal en un estado de inactivación. (3) Con la repolarización se cierra el poro y se aparta el segmento inactivador

(1).

Hasta el momento se han descrito cinco subunidades β (β1, β1b, β2, β3, β4) codificadas por los

genes SCN1B, SCN2B, SCN3B y SCN4B. Estas subunidades contienen un dominio extracelular

llamado “Inmunoglobulin loop” (“Ig loop”), y otro dominio C-terminal intracelular [13]. β1 y β3

no están unidas covalentemente a la subunidad α, mientras β2 y β4 lo están a partir de

puentes disulfuro [14].

Figura 8. Representación topológica de un canal de sodio operado por voltaje con sus subunidades α y β

(Brackenbury W., Isom L, 2011).

13

Subunidades β Gen Localización Tisular Proteínas que

interactúan

Enfermedades

β1 SCN1B SNC, corazón, SNP,

musculo esquelético

Anquirina B,

Anqurina G, Kv4.3,

NF155, NF186, N-

caderina, NrCAM,

RPTBβ.

Epilepsia, arritmias,

cáncer

β1B SCN1B Glandula adrenal,

SNC, SNP, músculo

esquelético.

β1 Epilepsia

β2 SN2B SNC, corazón, SNP Anquitina G, β1, β2,

Tenascina C,

Tenascina R

Arritmias, SM,

convulsiones,

alteración del dolor

β3 SCN3B Glandula adrenal,

SNC, corazón, riñon,

SNP

NF186 Epilepsia, arritmias,

lesiones nerviosas

β4 SCN4B SNC, corazón, SNP,

músculo

esquelético.

β1 Hungiton, síndrome

de QT Largo

Tabla 1. Familia de subunidades β: localización en los tejidos, proteínas que interactúan, e información de enfermedades relacionadas. Modificada de Brackenbury W., Isom L, 2011. SNC, sistema nervioso central; SM, esclerosis múltiple; NF, neurofascina; SNP, sistema nervioso periférico; RTPβ, receptor tirosina fosfatasa β.

Las subunidades β no tienen una función por sí mismas sino que participan modulando la

actividad de las subunidades α [14]. Tienen efectos en la excitabilidad celular in vivo a través

de sus efectos sutiles, pero funcionalmente significativos, sobre la corriente de sodio. La

subunidad β2 juega un papel importante estabilizando la expresión del canal en la superficie

celular, lo cual contribuye a mantener un umbral de potencial acción constante [15].

Como se puede observar en la Tabla 1 las subunidades β alteradas están implicadas en un gran

número de enfermedades. Las mutaciones en los genes que codifican para subunidades β

también están asociadas a anormalidades cardíacas [16]. Las mutaciones en SCN1B, SCN2B y

SCN3B están asociadas con fibrilación auricular.

Investigaciones recientes han relacionado mutaciones en éstas subunidades β con el SBr. Se ha

demostrado que hay mutaciones en el gen SCN1B (subunidad β1) que alteran la funcionalidad

del canal de sodio reduciendo la INa [17]. Por otro lado se ha descrito que una mutación en

SCN3B causa un defecto en el paso de la corriente en Nav1.5 y por lo tanto un defecto en la

14

funcionalidad del canal [18]. Las mutaciones en SCN2B y SCN4B se han relacionado con

fibrilación auricular y QT largo respectivamente [19].

La subunidad β2 codificada por el gen SCN2B está asociada a la subunidad Nav1.5 en

cardiomiocitos según experimentos de coinmunoprecipitación [20].

1.8 Estudios previos del Centro de Genética Cardiovascular

En el centro de genética cardiovascular se investigaron previamente la genética, biofísica y las

propiedades bioquímicas de Nav1.5 coexpresado con la subunidad β2 modificada con una

mutación identificada en un paciente con el SBr. Los experimentos se centraron en investigar si

el gen SCN2B es un nuevo candidato responsable de SBr.

El caso estudiado es de una mujer de 47 años que ha estado sufriendo episodios de síncopes

desde los 12 años. En el año 2003 se la diagnosticó con SBr después de la identificación del

segmento ST elevado en las derivaciones precordiales derechas en el ECG. Después del

examen médico de la paciente se examinaron también 9 miembros de su familia, resultando

dos clínicamente afectados, una hermana y el padre. El padre, pese a mostrar un patrón de

ECG alterado, resultó asintomático y la hermana mostró una elevación del segmento ST no

diagnosticada.

Se realizó un análisis de 13 genes asociados a SBr (SCN5A, SCN1B, SCN3B, CACNA1C, CACNA2B,

CACNA1D, GPD1L, HCN4, MOG1, KCND3, KCNE3, KCNE5 y KCNJ8) en el cual no se encontraron

mutaciones. Entonces se hipotetizó que podría haber mutaciones en los genes SCN2B y SCN4B

que podrían causar SBr. El resultado obtenido fue la identificación de una mutación “missense”

c.632 A>G en el exón 4 de SCN2B, que provoca un cambio en la proteína de p.Asp211Gly

(p.D211G). Una vez encontrada ésta mutación se realizaron pruebas genéticas a los 9

familiares que se habían estudiado clínicamente. Tres familiares además de la paciente

resultaron portadores de la mutación (+) y seis no resultaron portadores (-).

Figura 9. Pedigrí de la familia estudiada. Los miembros estudiados genéticamente son los que aparecen con el

símbolo + o – indicando de esta manera si son portadores o no de la mutación. Comunicación personal de H. Riuró.

15

Los efectos de la mutación sobre la INa se estudiaron mediante experimentos

electrofisiológicos en células “CHO” transfectadas con Nav1.5 fenotipo salvaje en ausencia o

en presencia de β2 fenotipo salvaje, y β2 D211G. En los resultados de la los estudios

electrofisiológicos se mostró una reducción del 39,4% en la INa cuando Nav1.5 estaba

coexpresado con β2 D211G respecto a Nav1.5+β2. Los resultados de expresión no mostraron

que la disminución de INa fuera debida a una reducción de la concentración de Nav1.5 en

presencia de la subunidad β2 D211G.

1.9 Hipótesis y Objetivos

Hipótesis

En los análisis hechos en los estudios previos con la condición 1:1 se observó una

sobreexpresión de subunidad Nav1.5 en el citoplasma y poca en membrana tanto en células

con fenotipo salvaje como en las de fenotipo mutado. Debido a éste exceso se hipotetizó que

la sobreexpresión de la sobreexpresión de la subunidad Nav1.5 podría estar enmascarando los

efectos de la interacción de la subunidad β2 con la misma. Por lo tanto si se disminuía Nav1.5,

y se aumentaba la β2 (condición 0.5:6) podrían maximizarse las diferencias entre los fenotipos

salvaje y mutado.

Objetivos

Los objetivos principales del presente trabajo fueron:

Analizar las diferencias entre la cantidad de proteína citosólica y de membrana para la

condición 0.5:6, en los estudios de coexpresión de Nav1.5+β2 wt y Nav1.5+β2 D211G.

Estudiar mediante inmunodetección la localización celular de Nav1.5, en los estudios

de coexpresión de Nav1.5+β2 wt y Nav1.5+β2 D211G en la condición 0.5:6.

Realizar análisis de corriente de Nav1.5 mediante estudios de electrofisiología en las

diferentes condiciones de transfección.

16

2. Materiales y métodos

2.1 Selección del modelo celular experimental

Como modelo celular se eligió la línea celular K1 de ovario de hámster chino (CHO). Este

modelo fue escogido basándose en las pruebas que previamente se habían hecho en el

laboratorio para la expresión de subunidades β del canal de sodio y en que es el utilizado

normalmente en el laboratorio de Genetica Cardiovascular para la expresión de estas

subunidades. Las células fueron cultivadas en medio de cultivo F-12 (Invitrogen) suplementado

con un 10% de suero fetal bovino (Sigma-Aldrich) y 1% de antibiótico-antimicótico y

mantenidas en incubadora a 37º y 5% CO2.

2.2 Vector de Transfección

Como vectores de transfección se utizaron plásmidos pcDNA3.1 (Invitrogen Carlsbad CA) en los

cuales se había insertado el cDNA de los genes SCN5A (CCDS46799) y SCN2B (CCDS8390) tal y

como muestra la figura 10. La mutagénesis de la subunidad β2 habia sido realizada

previamente al presente trabajo en el centro de genética cardiovascular utilizando un Kit de

mutagénesis dirigida “kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis system (Stratagene, La Jolla,

CA, USA).

Figura 10. La figura muestra un esquema representativo de los plásmidos que contienen los genes utilizados en este

trabajo. El vector de la izquierda lleva incorporado los genes SCN2B+IRES-GFP (SCN2Bwt). El vector de la derecha

lleva incorporado el gen SCN5A (SCN5Awt).

El vector SCN2Bwt se utilizó como molde para poder generar la mutación de estudio D211G y

los siguientes “primers” (mutación marcada en la secuencia):

5’ GGTGAAGGCAACCCGGGTGATGGCGCCAAGTAG 3’ and

5’ CTACTTGGCGCCATCACCCGGGTTGCCTTCACC 3’

17

De esta manera se obtuvo la construcción del plásmido de transfección con la secuencia

SCN2B D211G. Para la comprobación se procedió a hacer la secuenciación del plásmido.

2.3 Transfección

Se realizó una cotransfección heteróloga de los genes codificantes para la subunidad α del

canal de sodio y la subunidad β2wt o con la mutación D211G. La figura 11 esquematiza a dos

células CHO-K1 que han incorporado el plásmido portador del SCN5A y del SCN2B wt

(izquierda) o D211G (derecha).

Figura 11. Esquema representativo después de la cotransfección en células CHO K1. Los vectores amarillos

representan el gen SCN5A, y los vectores verde y rojo representan los genes SCN2B wt y SCN2B D211G

respectivamente.

Las células fueron sembradas en placas de Petri de 35 mm y transfectadas al alcanzar una

confluencia de un 60-70% después de 24h en una incubadora de CO2 a 37ºC. Las

transfecciones se realizaron manteniendo una relación molar de 0,5:6 para SCN5A:SCN2Bwt o

SCN2B D211G. Para la transfección se utilizó un Kit de transfección “TransIT®-CHO” (Mirus Bio

LLC., Madison, WI, USA) utilizando las especificaciones del fabricante. Los estudios bioquímicos

y electrofisiológicos se estudiaron a 48 h de haber hecho la transfección. Los plasmidos que

incluyen a la secuencia del SCN2Bwt o SCN2B D211G, tienen incorporado el gen de la “Green

fluorescent protein” (GFP) que permite la visualización de las células transfectadas una vez que

se expresa la proteína fluorescente.

2.4 Análisis de expresión de proteínas:

2.4.1 Biotinilación

Este método se basa en la unión de la biotina, añadida externamente, a las proteínas de

membrana a través de la cadena lateral de lisinas y el N-terminal que contienen grupos amino.

La reacción se produce a partir de un ataque nucleofílico del enlace éster del Sulfo-NHS-LC-

Biotina y el grupo amino de la proteína a ph 7 o superior, y forma un enlace amida (-CO-NH-)

18

con la proteína y un grupo sulfo-NHS (sulfonato cargado iónicamente), como muestra la figura

12. Los grupos sulfonato cargados no son capaces de atravesar la membrana plasmática

pudiendo de esta manera marcar exclusivamente las proteínas de la membrana celular. El

segundo paso de este procedimiento es la unión de la biotina a la neutravidina (glicoproteína

que tiene una alta afinidad por la biotina). Lo cual permite aislar las proteínas que se han unido

a la biotina. El brazo largo de la molécula de biotina reduce impedimentos estéricos y permite

aumentar la interacción entre la biotina y la avidina pudiendo de esta manera purificar la

proteína.

Figura 12. Proceso de reacción de la biotina con el grupo amino proteico, formando dos productos en la reacción,

los “grupos salientes sulfo-NHS” cargados y las moléculas biotinizadas.

El procedimiento se describe a continuación:

Se lavaron las células con DPBS suplementado con 0.49 mM MgCl2 y 0.9 mM CaCl2 (DPBS+) a pH

7.4. La incubación con biotina se hizo con 1,6 mg/ml de EZ-link sulfo-NHS-LC-LC-biotin, biotina

de doble cadena larga (figura 13, Pierce) en DPBS+ 30 minutos a 4ºC.

Figura 13. Esquema químico del tipo de Biotina utilizada para los experimentos que contiene una doble cadena

larga para evitar impedimentos estéricos con la purificación de las proteínas.

19

Luego de la incubación, se lavaron las células sucesivamente con DPBS+, glicina 100 mM y

glicina 20 mM. A continuación se lisaron con el “buffer” de lisis Tritón X-100 (1% Triton X-100,

50 mM Tris/HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1mM EDTA) durante 1h a 4ºC. El material insoluble se

eliminó mediante centrifugación. Del sobrenadante obtenido se guardaron 30 μl para la

determinación de la concentración de proteína total. El sobrenadante restante se incubó con

esferas de NeutrAvidina (Immobilised Ultralink NeutrAvidin beads, Pierce) durante toda la

noche a 4ºC. Los complejos precipitados se lavaron, primero con el “buffer” de lisis

anteriormente descrito, y luego con solución salina (5mM EDTA, 350 mM NaCl y 0,1% TX-100

en DPBS+ pH 7.4); y finlamente en 10 mM Tris/HCl, pH 7.4. Las proteínas precipitadas se

disolvieron en “Loading Buffer”, y se incubaron 5 minutos a 70ºC.

2.4.2 Western Blot

En primer lugar se cuantificaron las concentraciones de proteínas provenientes de los lisados

celulares mediante el método colorimétrico kit BCA (“bicinchoninic acid”), y Albumina de

Suero Bovino (BSA). Como controles negativos se utilizaron células no transfectadas y

transfectadas únicamente con GFP.

En el siguiente paso las muestras de interés fueron resueltas mediante electroforesis de SDS-

PAGE (“sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) al 6% de acrilamida y

fueron transferidas a una membrana de PVDF (Polivinildenedifloride, Millipore, Billerica, MA,

USA). La membrana se incubó con anticuerpos primarios anti-Nav1.5, y anti-NaK ATPasa

(Alomone labs, Jerusalem) durante 16h a 4ºC. Posteriormente fue incubada a temperatura

ambiente con un anticuerpo secundario conjugado con la peroxidasa HRP (Hoseradish

Peroxidasse: ThermoScientific, Rockfor, IL, USA), para poder ser revelada mediante

quimioluminiscencia (“chemiluminiscent substrate” Pierce). Para evitar una unión inespecífica

de anticuerpos con la membrana durante la incubación del anticuerpo primario se hizo una

primera incubación con leche en polvo desnatada durante 1h a temperatura ambiente. El

anticuerpo anti-NaK ATPasa se utilizó como normalizador de la carga.

2.5 Inmunofluorescencia

Para detectar la localización de la proteína en la célula se utilizó la técnica de la

inmunofluorescencia en células COS-7 transfectadas con los genes de interés. Estas células son

más grandes que las CHO-K1 y tienen una relación citoplasmática mayor respecto al núcleo, lo

cual permiten ver mejor la disposición de las proteínas en la célula.

20

Las células se fijaron en paraformaldehido al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente.

A continuación se utilizó la solución de “quenching”, que contiene 75mM de Glicina, 20 mM de

NH4Cl en DPBS+ durante 10 minutos. El bloqueo y permeabilización se hizo con una solución

con 0,7% de gelatina, 0,02% NaN2, 0,025% saponina en DPBS+ durante 30 minutos a 37ºC. Las

células se incubaron con los anticuerpos primarios de conejo anti-Nav1.5 y anti-β2 (1:200) toda

la noche a 4ºC. A continuación se incubaron con el anticuerpo secundario anti-conejo

conjugados con el fluoróforo “tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) (Sigma-Aldrich) 1

hora a temperatura ambiente. Para analizar la localización de las proteínas se utilizó un

microscopio Nikon de epifluorescencia, conectado a una cámara digital (Nikon Digital-Sight DS-

2Mv). Las imágenes se adquirieron con el programa Nis-Element BR 3.0.

2.6 Estudios de electrofisiología

Se realizaron estudios electrofisiológicos para registrar corrientes de sodio mediante la técnica

“patch-clamp whole cell”, mediante la cual se registra corriente producida a través de todos

los canales de la célula.

En ésta técnica se utiliza una micropipeta de vidrio con un electrodo y una solución iónica en

su interior. Mediante el uso de un micromanipulador se posiciona la micropipeta sobre la

célula elegida. Cuando la micropipeta entra en conctacto con la célula se produce un sello de

alta resistencia (Gohms) entre la punta de esta y la membrana celular. Mediante succión se

produce una ruptura en la porción de membrana sellada como se observa en la figura 14.

Figura 14. Representación de la técnica “whole cell”, donde podemos observar la pipeta con la porción de

membrana celular rota. Dentro de la pipeta se encuentra una solución iónica con un electrodo en su interior.

Con la ruptura se pone en contacto la solución intracelular con la solución de la micropipeta

(130 mM CsCl, 1mM EGTA, 10 mM Hepes, 10 mM NaCl, 2 mM ATP Mg2+, pH 7,2). Las células se

21

mantienen en una solución de baño (140 mM NaCl, 3 mM KCl, 10 HEPES, 1,8 mM CaCl2, 1,2

mM MgCl2, pH 7,4) en donde se coloca un electrodo de referencia, o “tierra”. Las soluciones

que se utilizan para el interior de la pipeta y el baño imitan, respectivamente, las condiciones

intracelulares y extracelulares fisiológicas con modificaciones que permiten aislar las

corrientes de sodio del resto de las corrientes iónicas que se producen por la activación de

otros canales presentes en la membrana celular. Esta disposición permite que, una vez

obtenida la configuración de “whole cell”, se registre la corriente que circula, entre el

electrodo que se encuentra dentro de la pipeta y el que se sitúa en el baño. Para el registro de

corrientes se utiliza un amplificador de corriente, un conversor de digital a analógico y a la

inversa (D/A, A/D respectivamente) y un ordenador con un “software” específico.

Mediante el programa del ordenador podemos imponer un voltaje determinado a la célula que

generará una corriente. La señal pasa por el conversor D/A que la convierte en analógica y de

aquí será amplificada por el amplificador y llegará hasta el electrodo de la micropipeta. Esto

generará una diferencia de potencial eléctrico entre los dos electrodos. La corriente generada

será captada por el amplificador a través de los mismos electrodos y recorrerá el camino

inverso por el conversor A/D. La señal de corriente, una vez digitalizada, será registrada por el

programa informático, y de esta manera la podremos adquirir y analizar, como se muestran en

las siguientes figuras 15, 16, 17 y 18.

Figuras 15. La foto muestra una célula sellada con la pipeta

Figura 16. La foto muestra una placa de células transfectadas

montada sobre un microscopio invertido de epifluorescencia. Se

observan la micropipeta de vidrio y cable de tierra.

22

Figura 17. La foto muestra, de izquierda a

derecha el microscópio, el tubo

succionador, el amplificador de corriente

y el micromanipudador de tres ejes con

el programador.

Figura 18. La foto muestra una imagen del monitor del ordenador en

donde se ve un registro de la corriente durante uno de los protocolos

utilizados.

Para estudiar las propiedades del canal y establecer si hay o no diferencias con respecto a la

condición utilizada en los estudios previos, se establecieron diferentes protocolos de pulsos de

voltaje:

La relación corriente-voltaje se determina a partir de las corrientes evocadas por

diferentes pulsos de voltaje cada vez más despolarizantes, de -80 a +80 en

incrementos de 5 mV, volviendo siempre después de cada pulso a -100 mV para que el

canal se recupere de la inactivación. Por lo tanto la corriente registrada resultante es

proporcional al número de canales que pasan al estado abierto a cada voltaje. El

parámetro estudiado en este caso es el pico de la corriente medida en la región del

trazo marcado con un círculo rosa de la figura 19.

23

Figura 19. Esquema representantivo del estado conformacional del canal respecto a los diferentes pulsos

de voltaje y la cantidad de corriente máxima representada por el pico de la curva.

Con los mismos registros se determina la dependencia de voltaje de los canales de Na+,

es decir, relación entre la conductancia (la capacidad del canal de dejar pasar iones) y

el voltaje aplicado. Para poder medir la conductancia del canal (g) respecto cada

voltaje, se grafican los valores de la conductancia dividida por la conductancia máxima

(g/gmax) en función del voltaje. Estos valores se obtienen dividiendo el pico de

corriente por cada potencial de corriente máxima (I/Imax) y por el “driving forcé” que

es la diferencia entre el potencial aplicado y el potencial de equilibrio del ion. Los

puntos de este gráfico se ajustan a la ecuación de Boltzmann que tiene la forma:

G=Gmax/(1+exp(V1/2-V)/k), donde G es la conductancia para cada voltaje, G es la

conductancia máxima de la celula, V1/2 es el potencial al cual el 50% de los canales

están abiertos, V es el potencial aplicado y k es la constante de linealidad (pendiente

de la gráfica resultante).

La inactivación del estado estacionario de INa se estudia midiendo las corrientes en

respuesta a un pulso de voltaje en el cual la corriente es máxima (-20mV) precedido

por pulsos largos de 500 ms de diferentes voltajes. La relación entre la corriente

medida a cada voltaje y la máxima da una medida de los canales que no se han

inactivado y que aún se pueden activar (figura 20). Los puntos de la gráfica se ajustan a

24

la ecuación de Boltzmann, descrita anteriormente que, en este caso, indica la relación

entre la proporción de canales cerrados (disponibles para activarse) y el voltaje. En

este caso V1/2 representa el valor de voltaje para el cual el 50% de los canales se

encuentran disponibles para ser activados.

Figura 20. Representación esquematica de los estados conformacionales del canal, esquema del segundo

protocolo utilizado, trazos de tres colores (verde, rojo y azul) que ejemplifican la corriente a -20mV

precedida por pulsos de voltaje de diferente valor por cada uno de los tres ejemplos.

La determinación de la recuperación de la inactivación del canal, se mide a partir de un

protocolo de dos pulsos de voltaje (-20 mV) al cual la INa es máxima, separados por

pulsos hiperpolarizantes (-100 mV) de duración creciente (1-100 ms) (figura 21). La

relación entre el pulso 2 (P2) y el primero (P1) se grafica en función de la duración del

pulso a -100 mV para determinar, mediante un ajuste a una función exponencial, las

constantes de tiempo de recuperación de la inactivación (τ) que indica el tiempo en el

cual se ha recuperado el 63% de la corriente.

25

Figura 21. Representación esquemática de los estados del canal, el tiempo de recuperación de la

inactivación del canal (arriba) y de tres trazos de corriente en tres colores que ejemplifican la corriente

del segundo pulso a diferentes intervalos de tiempo de la recuperación del canal (abajo).

3. Resultados

3.1 Western Blot

Para poder estudiar las diferencias a nivel de expresión entre las condiciones anteriormente

descritas en el laboratorio (relación estequiométrica 1:1 de las subunidades Nav1.5 y β2) y las

condiciones de transfección utilizadas en este trabajo, 0.5:6, se utilizó la técnica de Western

Blot.

Para los análisis se utilizaron las proteínas provenientes del lisado celular, y por otro lado las

proteínas de membrana purificadas gracias a la técnica de biotinilización.

3.1.1 Proteína total:

Los análisis de proteína total proveniente del lisado muestran la presencia de bandas

correspondientes a Nav1.5 para las trasfecciones de Nav1.5, Nav1.5+ β2wt y Nav1.5+β2

D211G. No se observaron diferencias en la expresión de Nav1.5 entre las condiciones

Nav1.5+β2wt y Nav1.5+β2 D211G (figura 23). Como control de la carga se utilizó la proteína

ATPasa y no se observaron diferencias entre las distintas condiciones de expresión por lo cual

asumimos que las bandas específicas para el Nav1.5 correspondientes a las coexpresión con β2

wt y D211G son comprables entre sí.

26

Estos experimentos fueron replicados 5 veces y se obtuvieron resultados similares.

Figura 23. Experimento representativo del western blot de proteína total, utilizando un anticuerpo anti Nav1.5, y

como normalizador de carga un anticuerpo anti ATPasa. El primer carril corresponde al extracto proteico de células

no transfectadas, el segundo al extracto proteico de células transfectadas con SCN5A, el tercer y cuarto carril

corresponden al extracto proteico de células cotransfectadas con SCN5A+SCN2B wt y SCN5A+SCN2B D211G,

respectivamente. En las cuatro condiciones por encima de la banda correspondiente a Nav1.5 aparecen bandas por

unión inespecífica del anticuerpo.

3.1.2 Proteína de membrana:

Nav1.5 y β2 son proteínas de membrana. Por lo tanto, a pesar de no encontrar diferencias en

la expresión de proteína total era importante estudiar las posibles diferencias de la expresión

de Nav1.5 en la misma. Con este fin se realizaron experimentos para detectar la expresión de

esta proteína mediante la purificación de las proteínas de membrana obtenidas con el método

de la biotinilación (ver métodos).

Los análisis de proteína de membrana proveniente de la biotinilación muestra la presencia de

bandas correspondientes a Nav1.5 para las transfecciones de Nav1.5, Nav1.5+ β2wt y

Nav1.5+β2 D211G. Al igual que en los experimentos de proteína total, no se observaron

diferencias de expresión de Nav1.5 entre las condiciones Nav1.5+β2wt y Nav1.5+β2 D211G,

figura 25. Como controlador de la carga también se utilizó la proteína ATPasa.

Estos experimentos también fueron replicados 5 veces y se obtuvieron resultados similares.

27

Figura 25. Resultados del western blot de proteína de membrana, utilizando un anticuerpo anti Nav1.5, y como

normalizador de carga un anticuerpo anti ATPasa. El primer carril corresponde al extracto proteico de células no

transfectadas, el segundo al extracto proteico de células transfectadas con SCN5A, el tercer y cuarto carril

corresponden al extracto proteico de células cotransfectadas con SCN5A+SCN2B wt y SCN5A+SCN2B D211G

respectivamente.

3.2 Inmunofluorescencia:

Para evaluar si había un defecto del tráfico de Nav1.5 causado por la coexpresión de la

subunidad β2 D211G se realizaron análisis de inmunofluorescencia celular. De esta manera se

obtuvieron los resultados de la localización celular de la proteína.

En primer lugar se hizo una comparación con los análisis de inmunofluorescencia de la

proteína entre las líneas celulares CHO-K1 y COS-7 con la condición de transfección Nav1.5+

β2wt. Como se puede observar si comparamos las figuras 27 y 28, la diferencia entre estas dos

líneas celulares además de la diferencia de tamaño se centra en su relación entre el núcleo y el

citoplasma, por lo tanto las células COS-7 son mejores para el estudio de localización de la

proteína.

Los resultados de la localización de Nav1.5, figuras 28 y 29, mostraron que no hay diferencias

observables entre las condiciones de transfección Nav1.5+β2 y Nav1.5+ β2 D211G. La proteína

se concentra principalmente en el citoplasma en las dos condiciones y apenas es perceptible

en la membrana, por lo tanto no se observa un cambio en la expresión de la proteína de

membrana.

28

Figura 27. Células CHO-K1 cotransfectadas con SCN5A+SCN2B wt.

Figura 28. Células COS-7 cotransfectadas con SCN5A+SCN2B wt. Se puede observar el mayor tamaño celular y

citoplasmático de las células COS-7. En azul se pueden observar los núcleos celulares y en rojo la localización de la

proteína Nav1.5.

29

Figura 29. Células COS-7 cotransfectadas con SCN5A+SCN2B wt.

Figura 30. Célula COS-7 cotransfectadas con SCN5A+SCN2B D211G. Como se puede observar en las células

marcadas con el recuadro no hay diferencias en la localización de la proteína Nav1.5, acumulada en el citoplasma y

poco visible en la membrana.

30

3.3 Electrofisiología

En los estudios previos a este trabajo, en los que se utilizó una relación molar para la

transfección de 1:1 para las subunidades α y β2, se observó que la presencia de la β2D211G

produce una disminución en la densidad de corriente medida en experimentos de “patch

clamp”. A pesar de no haber encontrado diferencias en la expresión proteica en las

condiciones de transfección utilizadas para el presente trabajo, se diseñó una serie

experimental para registrar las corrientes de sodio en dicha condición de transfección. Los

registros electrofisiológicos tienen una gran sensibilidad. Por lo tanto esperábamos encontrar

una diferencia en la densidad de corriente aun mayor que la encontrada previamente.

3.3.1 Relación corriente-voltaje

Utilizando el primer protocolo explicado en el apartado de metodología de la caracterización

electrofisiológica se registraron corrientes de sodio en las células transfectadas con los genes

SCN5A+SCN2B wt. La figura 29 A muestra trazos representativos de las corrientes de sodio

obtenidas. Al poder registrar INa, demostraron la expresión de Nav1.5 en la membrana cel·lular.

Figura 29. A: Trazos de las corrientes registradas aplicando un protocolo como el que se ejemplifica en la parte

inferior. B: Grafico de corriente-voltaje donde los puntos representan la densidad de corriente máxima para cada

voltaje.

A B

31

La figura 29 B muestra la relación entre la densidad de corriente (Imax) y el voltaje. Los

resultados muestran por lo tanto que existe corriente INa. A aproximadamente -10 mV aparece

el pico máximo de corriente, y a los sucesivos voltajes la corriente empieza a disminuir por que

el ión empieza a llegar a su equilibrio electroquímico.

3.3.2 Dependencia de voltaje de la activación

Figura 30. Curva de la dependencia de voltaje de la activación. Los puntos representan la conductancia relativa a la

conductancia máxima en función del voltaje. Dentro de la figura se expresa el valor V1/2 y la pendiente K al ajustar

los puntos de la gráfica a una ecuación de Boltzmann.

Para estudiar la dependencia de voltaje de la activación se partió de los valores anteriores

dividiendo el pico de corriente a cada potencial para la corriente máxima, la cual está cerca de

los -10 mV. Esto permitió calcular a partir de la relación entre la corriente (I) y la conductancia

(g), los valores de g y gmax para cada voltaje. Estos valores graficados en función del voltaje se

muestran en la figura 30. De esta manera se logró establecer el voltaje al cual el 50% de los

canales están abiertos, V1/2 a -25.5 mV.

3.3.3 Inactivación del estado estacionario

Los valores de corriente obtenidos aplicando el segundo protocolo explicado en la

metodología, proporcionó la curva de la inactivación de la corriente en el estado estacionario.

Como muestra la figura 31 el voltaje al que el 50% de los canales inactivados es V1/2 = -26.29

mV.

32

Figura 31. A: Gráfico donde se representa la inactivación en estado estacionario. Los puntos representan los valores

de la corriente relativa a la corriente máxima para cada voltaje. Dentro de la figura se muestra el valor de V1/2 y K

obtenidos al ajustar los puntos de la gráfica a una ecuación de Boltzmann.

3.3.4 Recuperación de la inactivación

El tercer protocolo descrito en la metodología permitió medir la recuperación de la

inactivación de la corriente. La relación entre el valor de la corriente medida en P2 y P1 se

graficó en función del tiempo entre ambos pulsos, originó la curva de la figura 32. De esta

manera se pudo calcular el tiempo en que la corriente tarda en recuperarse un 63%,

ms.

Figura 32. Gráfico representativo de la recuperación de la inactivación. Los puntos representan la relación entre la

corriente a P1 y P2 en función del tiempo entre los dos pulsos. El valor de se obtuvo a partir del ajuste de los

puntos de la gráfica a una función exponencial.

-20mV

B

A

33

4. Discusión y conclusiones El objetivo de este trabajo era verificar si había cambios en la expresión de Nav1.5 cuando se

contransfectaba en las condiciones 0.5:6 con la subunidad β2 wt y β2 D211G. El estudio se

basó en los resultados obtenidos en el estudio anterior del centro de genética cardiovascular

donde se midió una disminución de la corriente en un 40.4% cuando Nav1.5 estaba

cotransfectada con β2 D211G en las condiciones 1:1. Los análisis electrofisiológicos no

mostraron diferencias en las propiedades del canal aparte de la reducción de la corriente, y los

análisis de expresión tampoco mostraron diferencias. Lo que sí se observó fue un exceso de

Nav1.5 en el citoplasma celular y entonces se hipotetizó que si se cambiaban las condiciones

de cotransfección disminuyendo Nav1.5 y aumentando la subunidad β2 podría verse algún

cambio en la expresión de la proteína.

Como se ha dicho en la introducción las subunidades β interaccionan con los canales Nav1.5, y

se puede pensar que la expresión de estas proteínas en la membrana está ligada. La hipótesis

del presente trabajo se basó en que un exceso en la expresión de la subunidad alfa con

respecto a la β2 podía estar dificultando la determinación del mecanismo por el cual la

mutación D211G produce una disminución en la corriente de sodio. Se esperaba así, que la

expresión de β2 en exceso aumentaría la sensibilidad de nuestros métodos experimentales.

Sin embargo los resultados del presente estudio no mostraron diferencias en la expresión de

Nav1.5 en membrana. Los estudios de Western Blot mostraron bandas prácticamente

idénticas para las condiciones de cotransfección de Nav1.5 con β2 wt y β2 D211G. Y los

estudios de inmunofluorescencia seguían mostrando que la mayoría de Nav1.5 estaba

concentrada en el citoplasma celular. Para complementar el trabajo se iniciaron los análisis

electrofisiológicos. La funcionalidad del Nav1.5 estudiado mediante la INa se puede observar

por el patrón típico de las curvas de los análisis, ya que se ajustan perfectamente a la función

que las describe. Lamentablemente, a la fecha de finalización de este trabajo no se ha podido

determinar aun si el efecto de la mutación de la subunidad β2 sobre la corriente de sodio, es

mayor en la condición 0.5:6 que en la anterior condición (1:1).

En conclusión, los resultados analizados no muestran diferencias en la expresión del canal, y se

sigue observando una sobreexpresión de la subunidad Nav1.5 que es retenida en el

citoplasma. Al no haberse podido concluir los estudios de electrofisiología queda por

responder si el efecto de la mutación en la condición 0.5:6 es mayor que el observado en la

condición 1:1. Es necesario realizar estos estudios para sacar conclusiones sobre cómo afectan

las diferentes condiciones de transfección al efecto de la subunidad β2 sobre la corriente de

34

sodio. Por otro lado se tendría que probar otras condiciones de cotransfección o probar otros

modelos celulares más cercanos a la estructura celular de un cardiomiocito.

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36

5. Agradecimientos Este trabajo de máster fue posible gracias al laboratorio de genética cardiovascular IDiBGi.

Especialmente dar las gracias al Dr. Ramón Brugada que me permitió realizar las prácticas en

su grupo de investigación, a la Dra. Fabiana Scornik que me tutorizó las prácticas, a Helena

Riuró que me ayudó en todo momento tanto en el laboratorio como en sus impresiones sobre

el presente trabajo, al Dr. Marcel Vergés por su ayuda con los productos bioquímicos, y al resto

del laboratorio por su acogida.