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MORFOLOGIA SOMÁTICA NEURONAL NA AMÍGDALA MEDIAL DE SERES

HUMANOS

Autora: Denise Gomes Rodrigues Ferme Orientador: Prof. Dr. Alberto Antônio Rasia Filho

Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal de Ciências da Saúde de Porto Alegre como requisito

para a obtenção do grau de Mestre

2010

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DEDICATÓRIA

______________________________

Aos meus pais Argeu e Arzony por terem me ensinado a persistência e

retidão para alcançar meus objetivos.

Ao meu marido Dionísio por ser incansável, trabalhar arduamente para

viabilizar e facilitar o andamento de meus estudos, além do companheirismo,

amizade e amor incondicional.

iiiII

AGRADECIMENTOS

______________________________

Ao meu orientador, Professor Doutor Alberto Antônio Rasia Filho,

pela confiança depositada em meu trabalho, pela orientação aos meus estudos

e elaboração desta dissertação.

À Aline Dall’Oglio, Doutoranda em Neurociências pela UFRGS, por

haver exercido, de fato, o papel de co-orientadora na elaboração desta

dissertação.

À Professora Helena Hubert Silva, professora da UFCSPA e Diretora

Técnico-Científica do DML/POA, por haver gentilmente aberto as portas

daquela instituição e haver favorecido o bom andamento do estudo naquele

ambiente.

Ao Professor Jorge Eduardo Moreira, professora da USP/Ribeirão

Preto, por haver cedido seu laboratório para realização de parte dos

experimentos que resultaram nas técnicas aqui descritas.

À Janaína Brusco, Doutoranda em Neurociências e Ciências do

Comportamento pela USP/Ribeirão Preto, por sua dedicação e apoio no

laboratório de Ribeirão Preto.

À Carmen Rocha, laboratório de Fisiologia da UFCSPA, por propiciar as

condições e materiais para o desenvolvimento dos experimentos.

Equipes de peritos e técnicos do DML.

Ao Professor Léder Leal Xavier, da PUCRS, pelo apoio técnico na

avaliação da técnica de Nissl.

Em especial aos familiares e responsáveis dos doadores que, mesmo

em um momento de pesar, compreenderam a dimensão do presente estudo.

III

SUMÁRIO

______________________________

DEDICATÓRIA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . II

AGRADECIMENTOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . III

SUMÁRIO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .IV

RESUMO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .V

ABSTRACT. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .VII

ABREVIATURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . IX

LISTA DE FIGURAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XI

LISTA DE TABELAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .XII

1. INTRODUÇÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

1.1. A AMÍGDALA HUMANA. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1

1.1.1. Histórico, Anatomia e Função Geral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.2. Subdivisões da amígdala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.1.3. Populações neuronais da amígdala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.2. GRUPO DE NÚCLEOS CORTICOMEDIAIS. . . . . . . . . . . . . . . . . .16

1.2.1. O Núcleo Medial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18

1.2.1.1. Caracterização neuroquímica da amígdala medial. . . . .20

1.2.1.2. Citoarquitetura da amígdala medial. . . . . . . . . . . . . . . . .26

1. 3. MORFOLOGIA NEURONAL. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28

2. REFERÊNCIAS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32

3. OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44

4. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46

5. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

6. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81

7. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

8. CONCLUSÃO. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122

9. ANEXOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .123

IV

RESUMO

______________________________

MORFOLOGIA SOMÁTICA NEURONAL NA AMÍGDALA MEDIAL

EM SERES HUMANOS

Palavras-chave: 1. Neurociências; 2. Amígdala humana; 3. Amígdala

medial; 4. Método de Golgi; 5. Método de Nissl-Tionina.

Introdução: A amígdala é uma estrutura neural no telencéfalo basal,

subcortical no lobo temporal anterior a médio, que compreende subnúcleos,

dentre eles o núcleo medial (Me). Até o momento não estão descritos os tipos

celulares nem as medidas básicas do soma neuronal locais em seres

humanos. Isto importa muito porque a descrição dos neurônios e células da glia

forma a base para a compreensão da funcionalidade de uma região nervosa

e/ou suas alterações anátomo-patológicas. Objetivos: Os objetivos do

presente estudo foram identificar o Me humano em cortes coronais seriados e

corados pela técnica da tionina, além de implantar e desenvolver uma técnica

de Golgi que pudesse ser aplicada para amostras de tecido nervoso

armazenadas em formol por um longo período. Com base nas imagens obtidas

pelas duas técnicas procurou-se descrever os tipos neuronais e quantificar

parâmetros morfológicos dos somas neuronais do Me de seres humanos.

Métodos: Amostras de lobo temporal foram obtidas durante necropsias após

autorização por parte de familiares ou responsáveis e com plenas condições

éticas de pesquisa. Após, o tecido foi submetido aos diferentes passos dos

métodos da tionina e de Golgi do tipo “single-section” anteriormente aplicados a

outros animais, mas agora adaptados para nossa espécie. Após a obtenção

das lâminas contendo cortes de tecido nervoso humano, estas foram

observadas em microscopia de luz para análise. Resultados: Os resultados da

técnica de tionina evidenciaram coloração celular adequada e homogênea no

Me humano. Os achados indicam que o Me de seres humanos apresenta

neurônios de tamanho médio a grande com corpos celulares que permitem sua

classificação como de neurônios multipolares de tipo “bitufted” ou estrelados.

Com a técnica de Golgi os neurônios e a glia aparecem bem impregnados,

V

confirmando e avançando os dados obtidos com a técnica da tionina. Dendritos

de comprimentos variados e com espinhos dendríticos, assim como astrócitos,

foram igualmente observados, alguns destes próximos a vasos sanguíneos.

Esta contribuição soma-se às técnicas básicas para o estudo das células do

tecido nervoso humano com as mesmas vantagens descritas para o método de

Golgi “single-section”. Ou seja, é tecnicamente fácil, rápida, exequível, que

requer equipamentos mínimos e fornece dados confiáveis a partir de tecido

fixado em formaldeído por longo período. Em conjunto, os presentes dados

iniciam a descrição da morfologia neuronal do Me de seres humanos e

direciona futuros esforços para a elucidação plena de sua organização celular.

VI

ABSTRACT

______________________________

NEURONAL SOMATIC MORPHOLOGY IN THE HUMAN MEDIAL

AMYGDALA

Keywords: 1. Neuroscience; 2. Human amygdala; 3. Medial amygdala;

Golgi method; 4. Thionin-Nissl staining.

Introduction: The amygdala is a telencephalic area, located

subcortically in the anterior to the intermediate part of the temporal lobe,

composed by different nuclei, among which is the medial one (Me). Currently, it

is not described the cellular types nor the basic morphometric data for the cell

body in the human Me. This is a relevant issue since revealing the neurons and

glial cells located in a brain region impacts on the comprehension of its

functionality and/or pathological conditions. Objectives: The aims of the

present study were to identify the human Me in coronal serial sections stained

by the thionin method, to develop another Golgi method suitable for the human

nervous tissue long-term fixed in formol. Based on the results from these two

experimental approaches, it was intended to describe the cellular types in the

Me and to quantify morphological parameters of the cell bodies from this human

brain area. Methods: Samples of the temporal lobe were obtained during

necropsies after formal authorization by the relatives or legal representatives,

obeying all ethical conditions for research. Tissue was submitted to the

procedures of the thionin technique and the "single-section” Golgi method

previously employed to other species, but now adapted to our own one.

Following them, brain slices were observed under light microscopy for further

study. Results: Thionin results showed an homogeneous staining in the Me

and revealed multipolar neurons with medium to great size that can be

classified as bitufted or stellate ones. Based on the Golgi method outcomes,

neurons and glia appeared well impregnated, supporting and advancing the

findings obtained with the thionin technique. Dendrites with variable lengths and

with spines as well as astrocytes could be observed, these latter sometimes

VII

near blood vessels. The present contribution adds to the other techniques

available for the study of the human brain cellular composition with the same

advantages that were already reported for the "single-section" Golgi method.

That is, it is rapid, easy, suitable, needs minimal equipments and allows the

obtention of reliable data from formalin-fixed human nervous tissue.

Altoghether, the present results provide the initial description of the neuronal

morphology of the human Me and address future efforts of the complete

elucidation of the cellular organization of this brain area.

VIII

ABREVIATURAS

______________________________

AAA = amigdaloide anterior

ACE = enzima conversora de angiotensina

AChE = acetilcolinesterase

ACo = núcleo cortical anterior

AHi = área de transição amigdalohipocampal

AMe = amígdala medial

ASP = aspartato

BDNF = fator neurotrófico derivado do cérebro

BSTM = divisão medial do núcleo do leito da estria

BuChE = butirilcolinesterase

CAB = calbindina

CART = transcrito regulado por cocaína e anfetamina

Ce = amígdala central

ChAT = colinoacetiltransferase

CR = calretinina

CRF = fator liberador de corticotropina

CSpVCo = subdivisão superior caudal do núcleo cortical ventral

DMeP = amígdala medial posterior dorsal

GABA = ácido gama-aminobutírico

GLU = glutamato

icm = massas fibrosas intermediárias caudomediais

Me = núcleo medial

MeA = amígdala medial anterior

MeP = amígdala medial posterior

MExA = amígdala medial estendida

NADPH-d = nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase

NT = neurotensina

OT = ocitocina

PALL = paladina

PAV = parvalbumina

IX

PMAHi = haste rostrodorsal da divisão posteromedial da área

amigdalohipocampal

SLEAM = amígdala estendida sublenticular medial

SP = substância P

SpVCo = região superior do núcleo cortical ventral

TH = tirosina hidroxilase

VCo = núcleo ventral cortical

VMeP = amígdala medial posterior ventral

VP = vasopressina

X

LISTA DE FIGURAS

______________________________

Figura 1. Localização da amígdala e sua adjacência

do hipocampo, em secções em ressonância

magnética.

......................................3

Figura 2. Fotomicrografias de secções coronais

humanas coradas pela técnica de Nissl para

demonstrar a localização dos núcleos

amigdalianos.

...................................12

Figura 3. Desenho esquemático da ultraestrutura do

espinho dendrítico.

...................................30

Figura 4. Representação das diferentes morfologias

dos espinhos dendríticos.

...................................31

XI

LISTA DE TABELAS

______________________________

Tabela 1. Subdivisões da amígdala humana

baseadas em Sorvari (1997).

................................111

Tabela 2. Quadro demonstrando a equivalência na

nomenclatura das áreas amigdalianas de seres

humanos em diferentes estudos.

...............................13

Tabela 3. Principais peptídeos encontrados na

amígdala humana. 15

...............................15

Tabela 4. Aspectos relevantes da quimioarquitetura

da amígdala medial de seres humanos.

...............................22

XII

1. INTRODUÇÃO

______________________________

1.1. A AMÍGDALA HUMANA

1.1.1. Histórico, Anatomia e Função Geral

Em 1878, Paul Broca chamou a atenção para o fato de que, na

superfície medial do cérebro dos mamíferos, logo abaixo do córtex, existe uma

área contendo diversos núcleos de substância cinzenta, os quais ele

denominou de lobo límbico (do latim limbus, aquilo que circunda, bordo).

Johnston (1923) foi um dos pioneiros a descrever a morfologia de um grupo

desses núcleos em mamíferos que, devido a seu aspecto lembrar o formato de

uma amêndoa, recebeu o nome de “amígdala”. A maior parte das descrições

incipientes do papel do lobo límbico nas emoções foi desenvolvida apenas em

1937, quando James Papez descreveu seu modelo anatômico da emoção, o

que veio a ser chamado de circuito de Papez. Basicamente nesta mesma

época, Klüver e Bucy relataram experimentos de lesão do terço anterior do lobo

temporal e suas conseqüências comportamentais marcantes em macacos. Em

1952, Paul D. MacLean expandiu essas ideias para incluir estruturas adicionais

em um “sistema límbico” mais disperso, as quais se desenvolveram com a

emergência dos mamíferos inferiores. A amígdala era parte do sistema límbico

nos mamíferos (Ledoux, 1998).

A amígdala (ou complexo amigdaloide ou amigdaliano1) dos primatas é

um conglomerado relativamente grande de substância cinzenta que se

encontra na base do lobo temporal anteromedial de forma ventral ao núcleo

piriforme, do qual é separado pelo complexo neuronal magnocelular basal do

prosencéfalo, constituindo o núcleo basal de Meynert e grupos celulares

relacionados, ou a chamada substantia innominata sensu ampliori (de Olmos,

2004).

1 Embora a terminologia anatômica nomeie esta estrutura como “corpo amigdaloide” na parte

basilar do telencéfalo, por definição encontrada em dicionário da língua portuguesa, “amigdaliano” é algo relativo ou pertencente à amígdala, enquanto “amigdaloide” é semelhante à amígdala (Rasia-Filho e Hilbig, 2005).

1

Feixes de axônios separam a amígdala dos demais elementos do

prosencéfalo basal e fazem parte de radiações telencefálicas e

diencefalotegumentais, conectando bidirecionalmente a amígdala e outras

formações cinzentas do lobo temporal com aquelas do telencéfalo basal e

medial, do diencéfalo, da ponte e até mesmo da medula espinal (Gloor, 1997).

A amígdala não faz parte do córtex cerebral, mas é uma estrutura telencefálica

basal subcortical. De forma filogênica e ontogênica, ela ocupa a porção caudal

do assoalho do ventrículo lateral (Gloor, 1997; Figura 1).

A amígdala é uma estrutura que compreende subnúcleos situados no

lobo temporal, lateral ao hipotálamo e ventral ao estriado, no prosencéfalo

basal de mamíferos (Alheid et al., 1995). Em primatas, é caracterizada como

uma massa ovoide de substância cinzenta, localizada na porção terminal e

rostral da formação hipocampal (Alheid et al., 1995; de Olmos, 1999). A

amígdala humana está localizada no lobo temporal medial, a aproximadamente

1 cm da extremidade rostral do lobo temporal. Caudalmente ela se alinha ao

hipocampo. O comprimento completo rostrocaudal da amígdala é em torno de

10 mm. Sua largura mediolateral é de aproximadamente 18 mm em sua porção

maior, e sua altura dorsoventral máxima é de 15 mm (Sorvari, 1997).

Embora Völsch (1906, 1911) tivesse sido pioneiro, a primeira descrição

anatômica da amígdala humana foi publicada por Johnson (1923) e seu

trabalho influenciou investigações futuras, incluindo as de Brockhaus (1938),

Crosby e Humphrey (1941) e de Olmos (1990). Entretanto, a nomenclatura dos

núcleos amigdalianos sempre foi confusa pelo uso de terminologia múltipla

pelos diferentes investigadores. A amígdala humana não é tão bem estudada e

detalhada como a dos primatas ou de ratos. Em geral, a nomenclatura utilizada

para os macacos foi adaptada para a amígdala humana (Gloor, 1997;

Schumann & Amaral, 2005; Sorvari et al., 1995). Segundo Whalen (2009), a

amígdala pode ser dividida em 13 núcleos e áreas corticais em humanos e

primatas, com diferenças em subdivisões de acordo com a espécie.

2

Figura 1. Localização da amígdala e, em sua adjacência do hipocampo, em secções em ressonância magnética. (a) é uma reconstrução tridimensional de imagens onde as linhas indicam a posição do plano horizontal (b), plano sagital (c) e plano coronal (d). A flecha em (b) indica a linha ao longo da substância branca que separa a amígdala do putâmen; a flecha em (c) representa a substância branca que forma a fronteira ventral da amígdala rostral. A = amígdala; EC = córtex entorrinal; H = hipocampo; PU = putâmen; TLV = corno temporal do ventrículo lateral; WM = substância branca subamigdaloide. Reproduzido de Whalen & Phelps, 2009.

3

http://www.jneurosci.org/content/vol24/issue28/images/large/zns0310492680001.jpeg

De Olmos (2004) reconhece na amígdala humana quatro grupos

nucleares maiores: complexo nuclear amigdaloide laterobasal, amígdala

estendida, amígdala olfatória superficial “tipo” cortical e formações

amigdaloides não classificáveis. O núcleo amigdaliano medial (Me), tema

principal desta dissertação, não parece receber projeções aferentes diretas do

bulbo olfatório principal em primatas. O Me é apenas uma parte de um grupo

nuclear maior, a amígdala medial estendida (MExA), que também compreende

a região sublenticular medial (SLEAM) e a divisão medial do núcleo intersticial

da estria terminal (BSTM).

A nomenclatura empregada por de Olmos está baseada no importante

estudo neuroanatômico comparativo de Johnston (1923). Da mesma forma, as

proteínas que se ligam ao cálcio parvalbumina, calretinina e calbindina mantêm

uma distribuição semelhante nas amígdalas humana e dos primatas, apenas

com diferenças sutis na frequência dos tipos celulares. Sorvari (1997) adota a

nomenclatura de Price et al. (1987), modificada por Amaral et al. (1992). Esse

autor divide a amígdala em núcleos profundos, superficiais e os demais. Os

núcleos profundos incluem os lateral, basal, basal acessório e paralaminar. Os

núcleos superficiais incluem: anterior, medial (Me) e cortical posterior, o córtex

periamigdaloide e o núcleo do trato olfatório lateral. Os demais núcleos incluem

o central, a área amigdaloide anterior, a área amígdalo-hipocampal e os

núcleos intercalados, como será descrito mais detalhadamente adiante no

texto.

Embora as fronteiras estruturais e funcionais da amígdala humana

permaneçam em debate, existe consenso que ela: (1) recebe informações de

diversas estruturas corticais e subcorticais; (2) desempenha um importante

papel na integração e na avaliação de estímulos sensoriais interoceptivos e

exteroceptivos e, desta forma, permite que o indivíduo atribua significados

emocionais aos eventos; (3) coordena respostas comportamentais e

emocionais adaptativas; e (4) modula o processamento cognitivo envolvendo

outras regiões do encéfalo (Whalen & Phelps, 2009).

Registros eletroencefalográficos na amígdala humana revelaram que ela

geralmente responde melhor a estímulos mais complexos, tais como a palavras

faladas, escritas ou sinalizadas do que a simples pulsos de luz ou estalidos.

Ainda, a estimulação elétrica da amígdala no decurso de neurocirurgias ou

4

crises epilépticas locais revelaram uma grande variedade de fenômenos,

incluindo-se alucinações de diversas formas, medo intenso acompanhado de

sensações viscerais (epigástricas e cardíacas) correlatas, sensação de dèja vu,

movimentos oro-mastigatórios e/ou perda de contato social momentânea

(Yakovlev, 1954; Sorvari, 1997). Lesões que comprometem a estrutura

amigdaliana em seres humanos parecem produzir uma diminuição na

agressividade, placidez, indiferença, alterações nos hábitos alimentares,

diminuição no desejo sexual, alteração nas respostas

simpáticas/parassimpáticas e distúrbio na modulação dos comportamentos

sociais emocionais (Sorvari, 1997; Gloor, 1997).

O papel potencial da amígdala em processos cognitivos e mnemônicos

sempre foi um assunto de interesse geral (Sorvari, 1997; Gloor, 1997). Em

estudos de lesão da amígdala nenhuma evidência até o momento demonstrou

convincentemente prejuízos, tais como déficits em inteligência, linguagem,

aprendizado ou de fluência verbal (Whalen & Phelps, 2009). Existe evidência

que sugere um papel modulador da amígdala na memória de longo prazo

envolvendo alguns neurotransmissores específicos, incluindo-se a

norepinefrina, os opioides e o GABA (Whalen & Phelps, 2009). Por outro lado,

maior atenção à atividade desta estrutura encefálica humana adveio de seu

envolvimento de forma importante em diversas doenças neurodegenerativas

em humanos, incluindo mal de Alzheimer, coreia de Huntington e lipofuscinose

ceroide neuronal (LCN) (de Olmos, 2004). Sabe-se que a amígdala pode se

apresentar alterada em diversas doenças neurológicas e psiquiátricas,

incluindo-se a epilepsia do lobo temporal, o mal de Alzheimer, a esquizofrenia,

o autismo e em casos de transtorno do estresse pós-traumático (de Olmos,

2004). Um achado comum post mortem em todas essas doenças é a perda

celular e gliose marcada ao longo da amígdala (Sorvari, 1997).

Baseado em estudos empregando ressonância magnética, identificou-se

a interrelação funcional entre a amígdala e as áreas corticais visuais do lobo

occipital, recebendo aferência diretamente do tálamo ou preferentemente da

via visual ventral para seu núcleo lateral. Tal informação sensorial que chega

ao núcleo lateral é avaliada para determinar se o estímulo ambiental é

conhecido ou é um risco potencial. Essa informação pode também ser avaliada

de outros modos (auditivo, por exemplo) que, de forma combinada, melhor

5

dimensionam a situação do ambiente e geram resposta mais rápida e precisa

(informações visuais e auditivas são segregadas ao núcleo lateral). Quando o

estímulo é sutil a porção ventral do núcleo lateral tem o potencial de integrar

outras modalidades para definir melhor o estímulo (à custa do atraso de um ou

mais processamentos sinápticos). Sendo de risco o estímulo percebido,

imediatamente surgem respostas neuroendócrinas, simpáticas/parassimpáticas

e comportamentais para gerar respostas de imobilidade (e evitar aproximação

com o estímulo aversivo), sobressalto (como indicação de medo) e atividades

motoras de esquiva ou luta contra o que for percebido (Gloor, 1997; de Olmos,

2004).

De fato, conexões com o neocórtex podem mediar atenção seletiva ao

estímulo de perigo, enquanto projeções para a área colinérgica basal do lobo

frontal podem aumentar a excitação generalizada cortical, em clara resposta de

alerta com direcionamento de atenção específica (Gloor, 1997; de Olmos,

2004). Projeções para diferentes núcleos do hipotálamo, especialmente

partindo do núcleo central, podem mobilizar componentes

simpático/parassimpático viscerais de uma resposta de fuga. Projeções para a

formação hipocampal podem amplificar memórias dos episódios perigosos

vivenciados, a fim de, pela avaliação das pistas sensoriais ambientais e sua

comparação com dados mnemônicos, tentar prevenir episódios semelhantes

no futuro ou, pelo menos, para modificar a emissão de comportamentos

quando o animal se sentir ameaçado novamente (Gloor, 1997; de Olmos,

2004). A amígdala pode também estar envolvida com o direcionamento da

atenção durante o aprendizado (Sorvari, 1997).

Já a principal informação cortical para o núcleo basal da amígdala vem

do córtex órbito-frontal, que pode fornecer informações sobre o contexto do

estímulo percebido. Assim, o núcleo basal recebe informações tanto do núcleo

lateral como de tal região cortical e age como um detector de coincidências. Se

um perigo potencial é detectado e o indivíduo estiver em uma situação perigosa

o núcleo basal ativa o núcleo central, o qual é o primeiro estágio na resposta do

medo. Se, por outro lado, o contexto não for perigoso o sinal de medo é filtrado

e impedido de atingir o núcleo central. É neste contexto que se tem descrito o

papel específico da amígdala nos processos de aprendizado e memória e seu

6

envolvimento na formação de respostas evocadas para estímulos

emocionalmente relevantes (Gloor, 1997; Whalen & Phelps, 2009).

Do ponto de vista filogenético, mesmo em roedores, evidências

envolvendo a amígdala no processamento emocional se baseiam em estudos

da resposta condicionada ao medo (Sorvari, 1997). Nesses casos, um estímulo

emocionalmente neutro, tal como som ou luz, é temporalmente associado

(condicionado) com um evento biologicamente adverso, como um choque

elétrico. O animal, quando posteriormente exposto apenas ao estímulo

condicionado, expressa os mesmos sinais de medo que quando exposto ao

choque. Esses sinais de medo incluem uma resposta aumentada de alerta com

vigília específica, aumento na frequência cardíaca e da pressão arterial,

taquipnéia, imobilização e, na ordem de horas, o desenvolvimento de úlceras

gástricas (Whalen & Phelps, 2009).

1.1.2. Subdivisões da amígdala

A organização morfológica básica da amígdala é a mesma em todos os

mamíferos, porém as principais mudanças que ocorrem filogeneticamente em

direção aos primatas, especialmente aos humanos, são os aumentos no

tamanho do grupo córtico-basolateral em contraste com o que ocorre no grupo

centro-medial (Sorvari, 1997; Gloor, 1997). Existe também uma redução no

volume do núcleo do trato olfatório lateral, o qual basicamente desaparece nos

símios e não é reconhecível/encontrado em seres humanos. Finalmente, uma

complexa rotação da amígdala em torno de um eixo anteroposterior e vertical

diferencia a amígdala dos primatas da dos mamíferos inferiores (de Olmos,

1990).

A amígdala humana pode ser dividida em alguns grupos nucleares

maiores, cada qual contendo diversos componentes (Sorvari, 1997; Gloor,

1997; Tabela 1; Figura 2). Por exemplo, a amígdala pode ser concebida como

tendo um grupo de núcleos basolateral e outro córtico-medial. Essa subdivisão,

introduzida por Humphrey em 1936, está baseada (embora com algumas

modificações) na terminologia de Johnston (1923). Com isso, o agrupamento

do núcleo cortical com os núcleos medial e central formou a subdivisão córtico-

7

medial da amígdala, enquanto o grupo basolateral incluía os núcleos basal,

lateral e basal acessório. Essa subdivisão se diferenciava daquela de Johnston,

que agrupava o núcleo cortical com os núcleos basal e lateral. O esquema de

Johnston de subdivisão serviu para os propostos por Stephan (1975) e Stephan

& Andy (1977), que também incluíam o núcleo cortical aos núcleos basolaterais

e, dessa forma, subdividiam a amígdala em grupos centro-medial e córtico-

basolateral. No esquema dos dois tanto as subdivisões centro-medial como

córtico-basolateral têm uma parte superficial que chega à superfície do cérebro

e outra parte profunda ou subcortical.

Brockhaus (1938) sugeriu que a amígdala haveria de conter dois

componentes de substância cinzenta cortical (ou pelo menos semelhante ao

córtex) e outro subjacente subcortical. A maior parte desses dois componentes

foi considerada como a amígdala propriamente dita, menos a área amigdaloide

anterior. O segundo menor componente que se posiciona de forma rostral à

amígdala imagina-se que esteja intimamente relacionado ao claustro e ao

córtex insular. Seu componente subcortical é representado pela área

amigdaliana anterior e parte do núcleo endopiriforme; seu componente cortical

em grande parte corresponde ao córtex periamigdaloide.

Outra subdivisão da amígdala foi proposta por de Olmos et al. (1985) e

pelo mesmo primeiro autor anos mais tarde (1990). Nessas, distinguem-se

quatro grupos nucleares principais: olfatório, medial, central e basolateral. O

grupo olfatório pode ainda ser subdividido em amígdala olfatória e amígdala

vomeronasal (de Olmos, 1990). Mesmo baseada em Sorvari (1997), a

subdivisão a ser empregada neste estudo acompanha aquela proposta por

Price et al. (1987), os quais subdividiram a amígdala em grupos basolateral,

córtico-medial e central. A principal diferença foi a exclusão da área

amigdaliana anterior do grupo central e sua inclusão entre as zonas

transicionais, bem como a diferente sobreposição (embora parcial) do córtex

periamigdaloide, o qual é incluído entre as zonas transicionais ao invés de

estar no grupo córtico-medial.

Não obstante, as terminologias utilizadas pelos diferentes autores

(Tabela 2) diferem e as fronteiras separando as subdivisões identificadas por

um determinado nome nem sempre são desenhadas por eles ao longo dos

mesmos bordos. Isso demonstra que as diferenças morfológicas entre os

8

vários núcleos que formam a amígdala são muitas vezes sutis. Para a definição

das subdivisões têm sido levadas em consideração diferenças

quimioarquitetônicas e as fronteiras criadas por sistemas de fibras mielinizadas

(Gloor, 1997). Por conta disso e outras considerações teóricas e experimentais,

persiste o debate sobre o que a amígdala realmente é, incluindo suas fronteiras

estruturais e funcionais (Swanson & Petrovich, 1998; de Olmos et al., 2004).

Desta forma, duas interpretações são possíveis. A primeira indica que a

amígdala não é nem uma unidade anatômica nem funcional. Já Aggleton e

Saunders (1997) afirmam que, embora exista considerável heterogeneidade

nas projeções de cada núcleo da amígdala, eles contêm intraconexões

múltiplas que de fato sustentam a noção de um todo coerente.

Embora matéria de debate ainda vigente (Alheid, 2003), dados obtidos

com ratos permitiram introduzir o termo “amígdala estendida” para se referir a

um grupo disperso de núcleos na área frontal basal e no estriado ventral que

parecem constituir uma extensão rostral dos núcleos central e medial (de

Olmos & Heimer, 1999). A amígdala estendida forma o leito de substância

cinzenta dos principais circuitos subcorticais da amígdala, núcleos da estria

terminal e o circuito ventral amigdalofugal. A porção dorsal da amígdala

estendida é muito reduzida no cérebro dos mamíferos até chegar a uma

minúscula e por vezes descontínua faixa de substância cinzenta que

acompanha a estria terminal em seu curso supracapsular ao longo do assoalho

do ventrículo lateral, o que representa a porção supracapsular do núcleo do

leito da estria terminal (Gloor, 1997). A extremidade ventral do núcleo do leito

parasseptal da estria terminal se funde com a área pré-óptica hipotalâmica e a

porção ventral da amígdala estendida (Gloor, 1997). A AMe, tema desta

dissertação, faz parte da amígdala estendida.

De fato, o núcleo central da amígdala e o Me constituem as extensões

posterior e inferior da chamada “amígdala estendida” (Alheid, 2003; de Olmos

& Heimer, 1999). Neurônios que são semelhantes àqueles encontrados nos

núcleos central e medial se estendem em uma direção superior e medial

através da região basal ventral do lobo frontal, permanecendo abaixo do núcleo

lentiforme enquanto seguem em direção à comissura anterior. Aqui uma

proporção desses neurônios se congrega para constituir parte do leito nuclear

da estria terminal. Esses neurônios então se estendem em uma direção

9

anterior, finalmente terminando no estriado ventral. Pela semelhança desses

neurônios com aqueles da amígdala central e do núcleo medial - em termos de

alvos de projeção e citoarquitetura e sua localização dentro da região basal

ventral do lobo frontal logo abaixo do núcleo lentiforme – esses neurônios

podem ser referidos como sendo da “amígdala estendida sublenticular” (de

Olmos & Heimer, 1999). Muito próximos e por vezes entremeados com esses

neurônios localizados imediatamente acima da extensão dorsal da amígdala

estão grandes neurônios corticopetais colinérgicos que formam o núcleo basal

de Meynert (Gloor, 1997).

Conforme anteriormente afirmado, a terminologia a seguir se baseia no

estudo de Sorvari (1997). A principal subdivisão da amígdala se faz entre a

amígdala principal ou temporal, localizada na porção média do lobo temporal, e

a amígdala estendida ou extratemporal, que ocupa o que corresponde ao

assoalho primordial do ventrículo lateral e partes da porção basal do lobo

frontal. O objeto de estudo desta dissertação será parte da amígdala estendida,

ou seja, a AMe humana.

10

Tabela 1. Subdivisões da amígdala humana baseadas em Sorvari (1997).

SUBDIVISÕES DA AMÍGDALA

NÚCLEOS BASOLATERAIS Núcleo lateral

Núcleo basal

Núcleo basal acessório

Núcleo paralaminar

NÚCLEOS CORTICOMEDIAIS Núcleo do trato olfatório lateral*

Núcleo do trato olfatório acessório*

Núcleo cortical

Núcleo medial

NÚCLEOS CENTRAIS Núcleo central

Núcleo instersticial da estria terminal

Núcleos intercalados

ZONAS TRANSICIONAIS Área amigdaloide anterior

Zona amígdalo-estriatal

Área de transição córtico-amigdaloide

Córtex periamigdaloide

Área amígdalo-hipocampal

* Não demonstrável em humanos

11

Figura 2. Fotomicrografias de secções coronais humanas coradas pela técnica de Nissl para demonstrar a localização dos núcleos amigdalianos em plano rostral (a, b), intermediário (c, d) e caudal (e, f) ao longo de sua extensão. Abreviaturas: AAA = área amigdaloide anterior; AB = núcleo basal acessório; AHA = área amigdalohipocampal; B = núcleo basal; C = núcleo central; COa = núcleo cortical anterior; COp = núcleo cortical posterior; EC = córtex entorrinal; H = hipocampo; I = núcleos intercalados; L = núcleo lateral; M = núcleo medial; NLOT = núcleo do trato olfatório lateral; OT = trato óptico; PAC = córtex periamigdaloide; PL = núcleo paralaminar; PU = putâmen; SAS = sulco semianular; VC = claustro ventral. Reproduzido de Amaral & Schumann (2005).

12

Tabela 2. Quadro demonstrando a equivalência na nomenclatura das áreas amigdalianas de seres humanos em diferentes estudos. Reproduzido e adaptado de Sorvari et al. (1995).

SORVARI (1995) BROCKHAUS (1938) CROSBY E de OLMOS (1990) SIMS E

HUMPHREY (1941) WILLIAMS (1990)

Núcleo lateral Amygdaleum profundum Núcleo amigdaliano Núcleo amigdaliano lateral, sub- Núcleo lateral, subdivisões medial,

divisões lateral e medial laterale partes magno-, lateral núcleos dorsal anterior, ventral, dorsal, lateral e external

medio- parvo- e gracicelular e dorsomedial, dorso-lateral e

pars limitans intermediário e pars limitans (sub-

núcleo ventral dividido em partes

medial e lateral)

Núcleo basal Amygdaleum profundum Núcleo amigdaliano basal. Núcleo amigdaliano basolateral, Núcleo basal, subdivisões lateral e

divisões magnocelular, intermedium partes magno-, Pars lateralis e parte subnúcleos dorsal, dorsolateral, central

intermediária e parvicelular medio- e parvocelular profunda da pars medialis. intermediário, ventro-lateral e

ventro-medial

Núcleo acessório basal Amygdaleum profundum Núcleo acessório basal, pars Núcleo amigdaliano basomedial, Núcleo acessório basal, subdi-

divisões magnocelular, mediale partes magno-, médio-, lateralis e medialis subnúcleos dorsomedial, dorso- visões dorsal e ventral

parvicelular e ventro-medial misto- e densocelular (magno- lateral, ventromedial, ventrolateral e

dividida em lateral e medial). caudomedial

Núcleo paralaminar Partes granular, supragranular e Porção superficial da parte medial Divisão paralaminar do núcleo Subdivisão medial do núcleo basal

partes medial e lateral glomerular do amygdaleum do núcleo amigdaliano basal. basolateral na parte medial (dividida

profundum ventrale em partes anterior e posterior) e

parte glomerular.

Núcleo cortical anterior Parte rostral da área peri-supra- Parte anterior do núcleo medial. Divisão dorsal do núcleo amigda- Parte rostral do núcleo medial

amigdaliana intermediária e liano cortical anterior

ventral (parcialmente)

Núcleo medial Parte caudal da área peri-supra- Parte caudal do núcleo medial. Núcleo medial, divisões anterior e Núcleo medial

amigdaliana intermediária e posterior (dividido em partes dorsal

ventral (parcialmente) e ventral)

Núcleo cortical posterior Parte caudal da áreas periamigda- Incluído no núcleo amigdaliano Partes medial e dorsal do núcleo Parte caudal da subdivisão lateral

lianas oral dorsal e caudal cortical; parte caudal pode ser cortical caudal ventral; parte do núcleo cortical

incluída na área de transição póstero-medial da área amígdalo-

amígdalo-cortical. hipocampal

NLOT Camadas superficiais: parte rostral Incluído no núcleo amigdaliano Núcleo cortical anterior ventral; Parte rostral da subdivisão lateral

núcleo do trato olfativo da área periamigdaliana oral cortical e no próprio NLOT. parte rostral do núcleo cortical do núcleo cortical

lateral dorsal e área peri-supra-amigda- ventral

liana ventral. Camadas profundas:

incluídas no amygdaleum

superficiale

AHA Partes do amygdaleum Incluída no núcleo amigdaliano Parte ântero-lateral da área Incluída na subdivisão medial

área amigdalo-hipocampal superficiale intermediária e cortical. amígdalo-hipocampal; partes do núcleo cortical

caudal ventral e lateral do núcleo

cortical caudal ventral

PAC1 Incluída no claustrocortex Incluído no núcleo amigdaliano Incluído na área de transição Incluído no córtex piriforme ou no

preamygdaleus cortical. amígdalo-piriforme núcleo cortical

PAC3 Camadas superficiais: incluídas na Incluído no núcleo amigdaliano Incluído no núcleo cortical Incluído na subdivisão medial

área periamigdaliana oral ventral. cortical. ventral do núcleo cortical

Camadas profundas: incluídas na

amygdaleum superficiale

PACo Incluído no claustrocortex Incluído tanto na área de transição Incluído na área de transição Incluído no córtex piriforme

preamygdaleus amígdalo-cortical como no lobo amígdalo-piriforme

piriforme.

PACs Camadas superficiais: incluídas na Incluído no núcleo amigdaliano Parte pôstero-medial da área de Incluído na subdivisão medial do

área periamigdaliana oral ventral. cortical, exceto a parte ventral do transição amígdalo-piriforme núcleo cortical, exceto a parte

Camadas profundas: incluídas na PACs, que forma a área de ventral, incluída na área de

amygdaleum superficiale. Parte transição amígdalo-cortical. transição amígdalo-cortical

ventral do PACs incluída na área

preamigdaliana

Núcleo central Incluído no griseum supra- Núcleo central Núcleo central, divisão lateral Núcleo central, subdivisões medial

divisões lateral e medial amygdaleum (partes apical, central, capsular e e lateral, com 3 grupos satélites:

paracapsular), divisão medial (partes ventro-lateral, dorso-lateral e

dorsal e ventral) intersticial

Área amigdaliana anterior Incluídos no claustro Incluída na área amigdaliana Incluída na área amigdaliana

preamigdaliano anterior. anterior

Núcleos intercalados Massas celulares intercaladas Massas celulares intercaladas Grupos celulares intercalados

13

1.1.3. Populações neuronais da amígdala

Em seu estudo de 1997, Sorvari baseia-se nas observações de Braak e

Braak (1983), que permitiram classificar os neurônios da amígdala humana em

três classes, a saber:

(a) Neurônios da classe I são células com corpo em forma piramidal com

um dendrito apical espesso e dois ou mais dendritos basais mais

finos. Os dendritos secundários e suas ramificações mais distais

apresentam espinhos. Essas células piramidais são consideradas as

principais células da amígdala. Assim como suas contrapartes no

neocórtex, as células piramidais amigdalianas são imunorreativas

para os neurotransmissores excitatórios glutamato e aspartato.

(b) Neurônios da classe II são caracterizados por terem dendritos com

espinhos esparsos. Morfologicamente, essas células são ditas “não

piramidais”, algumas com aspecto de interneurônios, embora

heterogêneas. Elas podem ter corpos multipolares arredondados,

ovóides ou angulares, com muitos dendritos emanando em várias

direções, ou podem ter corpos fusiformes, de tipo “bitufted” de onde

emanam dois dendritos opostos primários2.

(c) Neurônios da classe III são células morfologicamente similares às da

classe II, porém sem depósitos de lipofuscina.

Quanto à quimioarquitetura neuronal amigdaliana, a qual serviu para

auxiliar na determinação dos seus núcleos, a maioria dos peptídeos já

encontrados no sistema nervoso central dos mamíferos é particularmente

abundante no núcleo central e no leito do núcleo da estria terminal. Conforme a

Tabela 3, os seguintes peptídeos foram identificados na amígdala (inclusive na

amígdala estendida), tanto no pericário como nas terminações neuronais.

Notavelmente, a amígdala basolateral é mais semelhante ao córtex, uma

vez que seus neurônios principais semelhantes aos piramidais contêm

2 Neurônios com aspecto dendrítico como “bitufted” não têm uma tradução adequada para o

português, razão pela qual a palavra em inglês é usada aqui. “Bipenachado” é o termo mais próximo em português, embora ainda seu emprego não seja consagrado nem a melhor representação para o que significa a imagem dos ramos dendríticos. “Bipolar” não pode ser empregado neste caso porque se usa para classificação quando um corpo celular dá origem a um dendrito de um pólo e, a partir do outro, um axônio. Não é o que corresponde aos neurônios estudados.

14

aminoácidos excitatórios, enquanto os interneurônios não piramidais são

amplamente GABAérgicos com muitos deles contendo peptídeos. Essas

distinções não podem ser feitas para o núcleo central e o Me para o núcleo do

leito da estria terminal, onde muitos, se não a maioria, dos neurônios de

projeção contêm peptídeos. Esses achados dão sustentação à noção de

Carlsen (1988) sobre a amígdala basolateral, uma estrutura semelhante ao

córtex. Em contraste, o núcleo central, o Me e o núcleo intersticial da estria

terminal são semelhantes a certas partes do hipotálamo por apresentarem

semelhanças com essa estrutura e outros grupos neuronais que são os

principais componentes subcorticais daquilo que Nieuwenhuys (1985) chama

de “centro do neuroeixo” no que diz respeito à riqueza e grande densidade de

substâncias neuroativas diferentes dos transmissores químicos clássicos em

seus corpos celulares, bem como seus circuitos de projeção.

Tabela 3. Principais peptídeos encontrados na amígdala humana, conforme Gloor (1997).

Colecistoquinina (CCK)

Polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP)

Somatostatina (SS)

Neuropeptídeo Y (NPY)

Neurotensina (NT)

Substância P (SP)

Galanina (GAL)

Fator liberador corticotrópico (CRF)

Peptídeo calcitonina relacionado ao gene (CGRP)

Vasopressina (VP)

Angiotensina II (ANG-II)

Polipeptídeo natriurético atrial (ANP)

Hormônio tireotrópico (TTH)

Hormônio luteinizante relacionado a hormônio (LHRH)

Bombesina (BOM)

Peptídeos opioides

15

Além de peptídeos, a substância cinzenta amigdaloide também contém

grupos de neurônios que concentram hormônios esteróides, especialmente

estrogênios e corticosteroides (Gloor, 1997).

1.2. GRUPO DE NÚCLEOS CORTICOMEDIAIS

Esse grupo de núcleos constitui uma porção menor da substância

cinzenta amigdaliana que o grupo basolateral, especialmente no cérebro

humano. Os núcleos corticomediais de mamíferos são quatro: o núcleo do trato

olfatório lateral, o núcleo do trato olfatório acessório, o núcleo cortical e o

núcleo medial (Gloor, 1997). É difícil precisar seu tamanho comparativo, pois

em estudos de Stephan e cols. (1987) seu maior componente, o núcleo cortical,

foi anexado ao grupo de núcleos basolaterais dentro do grupo córtico-

basolateral, o qual é, num todo, mais desenvolvido na evolução dos primatas.

O grupo de núcleos corticomediais em mamíferos contém aquela parte

da substância cinzenta amigdaliana que é homóloga à amígdala primordial dos

anfíbios, o trato olfatório acessório, o qual media aferência quimiossensorial

preferentemente de feromônios e que se originam no órgão vomeronasal

(Gloor, 1997). Essa porção não está, porém, presente no cérebro humano pós-

natal, embora possa haver estado presente no embrião. Apenas uma parte dos

núcleos corticomediais, especialmente o Me, uma subdivisão do núcleo cortical

(o núcleo cortical posteromedial de roedores) e o núcleo do trato olfatório

acessório recebem sinais vomeronasais em mamíferos que possuem tal órgão

funcional (Winans e Scalia, 1970; Scalia e Winans, 1975; de Olmos et al.,

1978). Consequentemente, essa subdivisão do grupo de núcleos

corticomediais foi chamada “amígdala vomeronasal”. Apesar da ausência de

um órgão vomeronasal funcional nitidamente encontrável, esses núcleos

encefalina (ENK)

dinorfina (DYN)

β-endorfina (BE)

opiomelacortina (OPMC)

16

persistem nos cérebros de símios e humanos e, aparentemente, não

regrediram, à exceção do núcleo do trato olfatório acessório, o qual é

inexistente nessas formas.

O remanescente do grupo de núcleos corticomediais recebe os

principais sinais olfatórios pela via do trato olfatório lateral. As regiões que

recebem esses sinais olfatórios, nos mamíferos que possuem um órgão

vomeronasal, correspondem a parte do núcleo cortical e, nos roedores, aos

núcleos corticais anterior e posterior do trato olfatório lateral. Esses núcleos

foram, então, chamados de “amígdala olfatória”. Seus homólogos existem nos

cérebros de símios e de humanos, com a exceção do núcleo do trato olfatório

lateral, o qual não pode ser demonstrado na nossa espécie (de Olmos, 1990) e

tem sua demonstração apenas questionável em símios (Price et al., 1987). Em

símios e humanos, uma subdivisão entre uma amígdala “olfatória” e outra

“vomeronasal” pode ainda persistir, já que pelo menos parte do Me e uma

porção do núcleo cortical homólogos àqueles que recebem sinais

vomeronasais em roedores podem representar a homologia em símios e

humanos para a amígdala vomeronasal (de Olmos, 1990; Price et al., 1987).

Além de ser uma porção principal da amígdala para receber sinais

olfatórios e vomeronasais, o grupo de núcleos corticomediais ocupa uma

posição superficial e faz parte da superfície do cérebro, na porção do úncus

representada pelo giro semilunar e muito próximo do sulco entorrinal. Assim,

não surpreende que essa parte da amígdala tenha sido comparada ao córtex

periamigdaloide por alguns investigadores, especialmente Rose (1926, 1927a),

que a classificou como um exemplo de córtex “semiparietinus”. O principal

argumento para classificá-la como córtex, além de sua posição na superfície

cerebral, é que apresenta uma camada celular que lembra a da superfície

cortical, camada molecular. Existem, entretanto, outras estruturas de

substância cinzenta superficiais não-corticais telencefálicas que apresentam

uma camada similar a esta amigdaliana, como o tubérculo olfatório e parte do

septo pré-comissural e que, ainda assim, não são consideradas córtex.

Brockhaus (1938) considerou as camadas mais superficiais dos núcleos

cortical e medial (isto é, as camadas celulares molecular e a imediatamente

subjacente) como parte do semicortex amygdaleus, enquanto considerou a

17

porção mais profunda como parte do amygdaleum proprium, uma verdadeira

estrutura subcortical.

Uma vez que o núcleo do trato olfatório e o núcleo do trato olfatório

lateral não são demonstráveis em humanos, o grupo dos núcleos

corticomediais na espécie humana está reduzido a dois núcleos: o cortical e o

Me, este último tema desta dissertação.

1.2.1. O Núcleo Medial

O Me é uma zona relativamente pequena de substância cinzenta

localizada na profundidade e na adjacência do sulco entorrinal (Mai et al.,

2008). Forma a parede ventrolateral da fenda entre a amígdala e o trato óptico

assim que este entra nesse sulco. Em seres humanos e em macacos com um

úncus bem desenvolvido, o Me é uma estrutura alongada orientada de forma

rostrocaudal (Gloor, 1997). Sua fronteira medial com o núcleo cortical corre

longitudinalmente em uma direção rostrocaudal. Em não primatas essa

fronteira é mais oblíqua. Em primatas ela veio de uma rotação em torno do eixo

vertical no curso da evolução do úncus em primatas (Gloor, 1997).

O Me se estende ao longo da maior parte da extensão rostrocaudal da

amígdala humana. A fronteira rostral do núcleo é, entretanto, desenhada em

diferentes níveis por diferentes autores (de Olmos, 1990; Gloor, 1997). A

maioria a descreve como se tal núcleo se estendesse rostralmente na mesma

dimensão que a área amigdaloide anterior (Brockhaus, 1938; Crosby e

Humphrey, 1941; Sims e Williams, 1990). Porém, De Olmos (1990) descreve

como núcleo cortical anterior o que parece corresponder à porção rostral do

núcleo medial dos autores anteriores. A substância cinzenta da metade rostral

do núcleo medial continua imperceptivelmente em torno do fundo do sulco

entorrinal para a porção ventromedial da substantia innominata sublenticular,

uma parte da amígdala estendida. Uma vez que o trato óptico se acomoda no

fundo do sulco entorrinal, o Me ocupa apenas uma parte ventral, mas se

estende bastante caudalmente e alcança a extremidade caudal da amígdala.

No nível onde o núcleo central se junta à margem lateral do Me o limite entre

os dois é a princípio dificilmente definido (Gloor, 1997), o que explica porque é

desenhado diferentemente pelos diversos autores. Mais caudalmente os dois

18

núcleos são separados por algumas fibras mielinizadas. A margem

ventrolateral do Me em direção ao núcleo basal acessório é formada pela

porção dorsal da lâmina medular medial. A margem lateral do Me, a qual se

separa do núcleo cortical, é marcada por uma mudança no tamanho das

células e uma coloração mais escura das células do núcleo cortical. O Me é

formado de neurônios pequenos, alguns piramidais, outros fusiformes ou

poligonais. Não há laminação, embora a porção “cortical” tenha uma camada

molecular bastante ampla (Brockhaus, 1938; de Olmos, 1990, Sims e Williams,

1990).

Assim como faz com o núcleo cortical, Brockhaus (1938) subdivide a

substância cinzenta do Me em porções cortical superficial e subcortical

profunda, a primeira fazendo parte da sua semicortex amygdaleus e a segunda

como parte do supraamygdaleum. O componente “cortical”, conforme definido

por Brockhaus, tem, entretanto, uma extensão rostrocaudal muito mais limitada

que o subcortical e faz parte da superfície do sulco entorrinal apenas em sua

porção rostral antes que o trato óptico o invada. De Olmos (1990) divide o Me

em porções caudal e rostral.

Em seu estudo, de Olmos (2004) descreve que o Me é contínuo

dorsalmente à área amigdaloide anterior (AAA), é uma massa alongada de

substância cinzenta localizada na porção superficial da amígdala dorsomedial,

comprimindo-se através dos dois terços caudais do complexo amigdaliano. Em

secções coronais na altura de sua parte principal a Me apresenta um formato

de lua crescente, enquanto em secções sagitais ao longo de seu eixo

longitudinal principal o núcleo tem uma aparência colunar bastante regular. Em

seu terço rostral o Me está localizado adjacente ao sulco entorrinal, mas

próximo de sua extremidade caudal o Me ocupa apenas a elevação ventral

desse sulco e, finalmente, está deslocada de sua posição pela área de

transição amigdalohipocampal (AHi) que surge entre essa formação cinzenta e

a divisão medial da amígdala central (Ce). Ao longo de sua extensão, o Me

margeia ventralmente, sucessivamente, a subdivisão superior caudal do núcleo

cortical ventral (CSpVCo) e a haste rostrodorsal da divisão posteromedial da

área amigdalohipocampal (PMAHi). Dorsolateralmente a extensão estreita da

AAA surge entre o Me e a divisão medial da Ce. Na maior parte de sua

extensão rostral para caudal o Me é preenchido por um agrupamento

19

relativamente denso de fibras formando as “massas fibrosas intermediárias

centrais” de Brockhaus (1938), as quais rodeiam o núcleo dorsalmente,

lateralmente e, em parte, ventralmente. Em sua extremidade rostral esse

sistema de fibras desaparece em coincidência com a substituição do Me pelo

núcleo cortical anterior (ACo). Rostralmente e ventralmente um agrupamento

neuronal arredondado e pequeno, provavelmente representando a terminação

mais caudal da subdivisão ventral do ACo e da parte posterior do núcleo do

trato olfatório lateral emerge entre o Me e a subdivisão superior do núcleo

ventral cortical (VCo) (Gloor, 1997).

1.2.1.1. Caracterização neuroquímica da amígdala medial

Não há descrições completas para seres humanos para a característica

neuroquímica dos neurônios do Me. Não obstante, em outros animais, como

em ratos e outros roedores, o Me apresenta um conteúdo menor de glutamato

e aspartato que o grupo córtico-basolateral (Ottersen et al., 1986). GABA é

abundante na célula neuronal, mas há relativamente pouca coloração de GABA

no pericário (Ottersen et al., 1986; Nitecka & Bem-Ari, 1987; Nitecka &

Frotscher, 1989). O Me se cora menos para marcadores colinérgicos do que

qualquer outro núcleo amigdaliano (Hall & Geneser-Jensen, 1971; Parent, 1971

– não primatas e primatas; Nitecka e Narkiewicz, 1976 – humanos; Bem-Ari et

al., 1977; Girgis, 1980 – não primatas e primatas; Svendsen e Bird, 1985 –

humanos; Hellendall et al., 1986; Amaral & Bassett, 1989 – macacos; Nitecka e

Frotscher, 1989; Sims e Williams, 1990 – humanos). No cérebro humano, o Me

é corado intensamente com NADPH-d tanto no soma neuronal como nos

prolongamentos celulares (Sims e Williams, 1990).

O Me contém muitos peptídeos em seus neurônios. Em contraste com

os núcleos do grupo córtico-basolateral eles parecem estar localizados em

neurônios de projeção que emitem fibras que entram na estria terminal ou na

via amigdalofugal ventral ou ansa peduncularis (Lind et al., 1985; Caffé et al.,

1987; McDonald, 1985b). Ele compartilha essa propriedade com o núcleo

central. Os peptídeos a seguir foram demonstrados em quantidades grandes

ou moderadas no núcleo medial de diferentes animais, a saber:

20

Somatostatina (Roberts et al., 1981; Johansson et al, 1984;

McDonald, 1987b, 1989a; Amaral et al., 1989 – macacos).

Neuropeptídeo Y (Gustafsson et al., 1986; McDonald, 1989a;

Walter et al., 1990 – humanos), o qual é frequentemente colocalizado

com somatostatina na mesma célula (Mcdonald, 1989a).

Colecistoquinina (Roberts, 1981; Micevych et al., 1988; Oro et al.,

1988; Simerly et al., 1989; Simerly, 1990). É particularmente abundante

na porção posterodorsal do Me de ratos onde parece estar envolvido

com mecanismos de controle neuroendócrinos.

Substância P (Ljungdahl, 1978; Roberts et al., 1981; Shiosaka et

al., 1983; Malsbury & McKay, 1986, 1987; Neal et al., 1989; Simerly et

al., 1989; Simerly, 1990). Também é abundante na mesma porção

posterodorsal do Me de ratos e é frequentemente co-localizado com pró-

dinorfina nas mesmas células (Neal et al., 1989).

Pró-dinorfina (Neal & Newman, 1989 - abundante em hamsters,

mas não em ratos).

Peptídeo Intestinal Vasoativo (Roberts et al., 1980a; Shiosaka et

al., 1983; Sims et al., 1980). É moderadamente abundante no núcleo

medial de ratos.

Neurotensina (Shiosaka et al., 1983; Michel et al., 1986; Benzing

et al., 1990 – os dois últimos artigos realizados em humanos). É

igualmente moderadamente detectável no Me.

Vasopressina (De Vries et al., 1985; Caffé et al., 1985).

Desaparece do pericário de neurônios do Me em ratos adultos após a

castração.

Peptídeo Natriurético Atrial (Kawata et al, 1985; Skofitsch et al.,

1985).

Angiotensina II (Lind et al., 1985).

Fibras e terminações imunorreativas a alguns desses peptídeos

também se apresentam nos corpos celulares e os receptores

correspondentes estão presentes em quantidades abundantes ou

moderadas no Me. Alguns peptídeos também estão presentes em fibras

de passagem e em terminações no Me que não aparecem em números

21

significativos em suas células. Entre eles encontramos o hormônio de

liberação da corticotrofina (Swanson et al., 1983), a galanina (Gentleman

et al, 1989 – humanos) e o peptídeo relacionado ao gen da calcitonina

(Herkenham, 1987).

Em roedores, uma característica importante do Me, a qual está

indubitavelmente relacionada ao seu dimorfismo sexual, é sua capacidade de

responder com receptores específicos tanto a androgênios, estrogênios e

progesterona (Pfaff & Keiner, 1972, 1973; Stumpf, 1972; Keefer & Stumpf, 1975

– macaco; Sar & Stumpf, 1975, 1977; Stumpf et al., 1975; Krieger et al, 1976;

Pfaff et al, 1976 – macaco; Sheridan, 1979; Warembourg, 1981; Commins &

Yahr, 1985; Bonsall et al., 1986 – macaco; Morrell et al., 1986; Schleicher et al.,

1986; Michael et al., 1990 – macaco; Simerly et al., 1990 – receptores mRNA

para androgênio e estrogênio; Don Carlos et al., 1991; Fox et al., 1991; Rasia

Filho, et al., 2004, 2009). Somando-se aos esteróides gonadais, o Me3 de

humanos apresenta neurônios que contêm o hormônio liberador de

gonadotrofinas (Stopa et al., 1991). Algumas dessas células também estão

presentes no núcleo medial de macacos (Silverman et al., 1982).

Como complementação e mais especificamente para seres humanos, a

seguinte tabela descreve e comenta alguns parâmetros neuroquímicos

relevantes para o Me.

Tabela 4. Aspectos relevantes da quimioarquitetura da amígdala medial de seres humanos,

baseado em Gloor (1997) e demais autores indicados no texto.

Neurotransmissores e neuromoduladores

Marcadores colinérgicos

a) Acetilcolinesterase (AChE). A Me contém uma rede de ramificações que

se cora levemente com AChE e poucos neurônios isolados que contêm AChE.

b) Colinoacetiltransferase (ChAT). Conforme Emre et al. (1993), a Me em

humanos é a que contém a menor imunorreatividade (ir) para a ChAT dentre todos os

núcleos amigdalianos. Apenas alguns poucos axônios varicosos ChAT-ir estão

presentes nesse núcleo.

3 Stopa e cols. chamam a área de “núcleo cortical”, mas sua figura 2 sugere que a localização

corresponde ao núcleo medial.

22

Aminoácidos excitatórios

a) Glutamato e Aspartato (GLU / ASP). Um grupo considerável de neurônios

da Me, especialmente da divisão anterodorsal, são fonte de projeções

GLU/ASPérgicas tanto para o estriado ventral laterocaudal como para o pallidum

ventral, assim como para o núcleo hipotalâmico paraventricular e cercanias.

Aminoácidos inibitórios

a) Ácido γ-aminobutírico (GABA). Pitkännen e Amaral (1994) consideram

que nesse núcleo a distribuição padrão de GABA-ir é muito semelhante àquela da

ACo. Entretanto, encontraram que a densidade de neurônios expressando o mRNA

para sua enzima de síntese (GAD) é muito elevada.

Marcadores para monoaminas

a) Tirosina hidroxilase (TH). De acordo com Freeman e Shi (2001), existem

concentrações moderadas de fibras TH-ir na parte rostral da Me.

Neuropeptídeos

a) Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). De acordo com Murer et

al. (1999), neurônios e fibras BDNF-ir estão presentes em todos os núcleos da

amígdala humana, mas não há dados específicos em relação ao Me.

b) Cromogranina B. De acordo com Marksteiner et al. (1999), no cérebro

humano a AMe apresenta uma densidade moderada deste neuropeptídeo. Não

obstante, parece que a parte mais caudal da AMe contém uma alta densidade desse

neuropeptídeo e se dá exclusivamente devido às fibras presentes no local, mas não

em corpos celulares.

c) Transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART). De acordo com

Hurd e Fagergren (2000), a maior expressão mRNA para CART pode ser encontrada

na Me.

d) Fator liberador de corticotropina (CRF). No complexo amigdaliano

humano um denso acúmulo de fibras CRF-ir, com grandes varicosidades e

terminações pode ser encontrado em quase todos os núcleos amigdalianos. Esse

achado, junto ao fato de que o núcleo intersticial da estria terminal e a substantia

innominata sublenticular (SLEA) possuem uma grande quantidade de fibras e

terminações que contêm CRF, favorece a existência de um padrão de distribuição

23

semelhante na Me em componentes da amígdala estendida.

e) Neurotensina (NT). Mai et al. (1987) descreveram que a Me contém

grande quantidade de fibras NT-ir. Essa afirmação foi confirmada por Benzing et al.

(1992), que encontraram na Me uma densa rede de fibras NT-ir que é distribuída de

forma regular ao longo da extensão anteroposterior do núcleo. A maior parte da NT-ir

está confinada a pontos específicos, embora muitas fibras delgadas e algumas

grosseiras estejam presentes. Somando-se às fibras NT-ir, diversos neurônios com

coloração escurecida estão distribuídos por todo o núcleo, embora estejam

preferencialmente posicionados nas porções profundas (laterais) do núcleo. Como

pode ser deduzido pelas ilustrações e localização dos núcleos amigdaloides

apresentados por aqueles autores, sua área amigdaloide anterior não compreende

apenas a AAA conforme é aqui definido, mas também a ACo, enquanto seu

mapeamento do núcleo amigdaloide medial coincide aproximadamente com a Me aqui

definida. É interessante apontar as diferenças na densidade da NT-ir apresentadas

entre a AAA e sua Me, com a AAA se corando menos que os subnúcleos do grupo

centromedial. Além disso, de acordo com Heimer et al. (1999), as fibras e terminações

NT-ir se mesclam com o pericário NT-ir e formam uma coluna contínua partindo da

Me, através da AAA e, mais adiante, de forma medial até as ilhotas NT-ir na região

sublenticular do prosencéfalo basal.

f) Ocitocina (OT). De acordo com Fliers et al. (1986), na Me humana muito

poucas fibras e células OT-ir estão presentes.

g) Substância P (SP). De acordo com Bouras et al. (1986), no complexo

amigdaloide humano poucas células SP-ir de tamanho médio podem ser vistas em

setores dorsomediais, especialmente na Me.

h) Vasopressina (VP). De acordo com Sofroniev et al. (1981), podem ser

rastreadas fibras VP-ir que correm lateralmente sobre o trato óptico desde sua fonte

no hipotálamo medial – provavelmente dos neurônios VP-ir no núcleo

supraquiasmático – até a Me, que surge densamente inervada. De outra forma, Fliers

et al. (1986) encontraram poucas fibras VP-ir e nenhuma célula VP-ir na Me humana.

Enzimas

a) Enzima conversora de angiotensina (ACE). Assim como outros membros da

amígdala superficial, a Me apresenta pouca expressão dessa enzima. Isso contrasta

muito com os elevados níveis apresentados por qualquer divisão estriatal, com a qual

alguns autores propõem que a Me possa ser comparada.

b) Butirilcolinesterase (BuChE). A AMe contém poucos neurônios piramidais

BuChE positivos de tamanho pequeno a médio. Os processos de algumas dessas

24

células também foram corados. Aproximadamente 5% dos neurônios eram BuChE

positivos e foram encontrados predominantemente na porção medial da Me.

c) Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato diaforase (NADPH-d). À

exceção da AAA, uma densa rede de fibras NADPH-d-ir foi encontrada por todos os

núcleos amigdalianos, junto com uma distribuição bastante homogênea de células

NADPH-d-ir. De acordo com Brady et al. (1992), o Me apresenta uma atividade

moderada de NADPH-d. Além disso, essas células devem ser semelhantes em todas

as subregiões, e há uma sobreposição quase completa entre neurônios que contêm

NADPH-d e SOM ou NPY.

Proteínas que se ligam ao cálcio

a) Calbindina (CAB). De acordo com Sorvari et al. (1996b), o Me apresenta alta

densidade de neurônios CAB-ir. A coloração intensa da rede de ramificações auxiliou

Sorvari et al. (1996b) a distinguirem a Me dos núcleos vizinhos, como basomedial

(BM) e PMAHi. Não foram observados na Me feixes de fibras CAB-ir.

b) Calretinina (CR). De acordo com Sorvari et al. (1996a), o Me contém

consideravelmente menos células CR-ir que o DACo. A CR-ir no Me é

consideravelmente maior que nas áreas vizinhas, como o núcleo basomedial (BM) e a

PMAHi.

c) Parvalbumina (PAV). A AMe humana contém apenas alguns pequenos

neurônios PAV-ir sem dendritos visíveis, ou apenas alguns destes com menor

comprimento. A densidade de fibras e terminações PAV-ir é muito baixa, sendo

distribuída difusamente.

Outras proteínas

a) Paladina (PALL). Na AMe o padrão de distribuição Pall-ir é semelhante àquele

observado no estriado. A maior parte da paladina estava colocalizada (60%) com a

sinaptofisina distribuída por todo o núcleo. Essa proteína é predominantemente

presente nas sinapses excitatórias e é consistentemente encontrada em sinapses

glutamatérgicas.

1.2.1.2. Citoarquitetura da amígdala medial

Existe uma tendência dos neurônios da AMe de formarem camadas,

especialmente de forma superficial, permitindo a identificação de uma camada

molecular pobre em células (L1), uma camada celular densa superficial (L2) e

uma camada profunda (L3) com neurônios com menor densidade de

25

distribuição (Gloor, 1997). Baseando-se em critérios puramente morfológicos, a

AMe pode ser dividida em duas regiões: anterior (MeA) e posterior (MeP). Esta,

por sua vez, pode ser dividida em subnúcleos dorsal (DMeP) e ventral (VMeP).

O núcleo anterior da Me faz limite rostralmente com o núcleo cortical anterior

(ACo), o griseum amigdaloide superficial que ele substitui caudalmente até que

seja substituído pela subdivisão dorsal do subnúcleo posterior do Me. A MeP

se comprime até atingir o início da porção extramigdaloide da estria terminal na

terminação posterior da amígdala. É o subnúcleo ventral da amígdala medial

posterior que está separado da área de transição amigdalohipocampal por uma

cápsula de fibras destacada da lâmina medular medial, cuja densidade varia,

mas que sempre intervém entre essas duas formações cinzentas (Gloor, 1997).

A MeA, em contraste com a MeP, ainda apresenta uma camada

molecular relativamente ampla (L1), embora não tão ampla como aquela no

ACo (Gloor, 1997). Assim como nesse núcleo, ela é invadida, embora de

forma esparsa, por neurônios pequenos e alongados de várias conformações e

capacidade de coloração. As principais camadas celulares, a superficial (L2) e

a profunda (L3), são claramente segregadas da L1 e formam uma massa

celular relativamente homogênea, embora os neurônios localizados nos dois

terços superiores apresentem uma tendência de se agregarem de forma mais

compacta (Gloor, 1997). Ainda, as células de camadas mais profundas tendem

a ser levemente maiores e se coram de forma mais escura que as das

camadas mais superficiais.

A população neuronal da MeA é bastante heterogênea, sendo feita de

células de diferentes tamanhos piramidais, multiangulares, redondas e

fusiformes, mas ainda menores que aquelas da região superior do núcleo

cortical ventral (SpVCo) vizinha, e arranjadas de forma mais compacta e

regular que as da AAA. A MeA pode ser diferenciada do vizinho rostral, o ACo,

pela maior densidade celular da L2 e uma concomitante rarefação de sua

população neuronal mais profunda, bem como pelo estreitamento de L1 (Gloor,

1997).

Na MeP, sua subdivisão ventral ocupa o segmento mais dorsal da

elevação ventral do sulco entorrinal imediatamente antes que o trato óptico se

encontre com o fundo deste sulco, agora estreito (Gloor, 1997; Sorvari, 1997).

Ela é constituída por um agregado de células relativamente estreito,

26

encapsulado de forma ventromedial e lateral pelo septo fibroso que se ramifica

das massas fibrosas intermediárias caudomediais (icm) descritas por

Brockhaus (1938). Ela apresenta uma camada celular superficial bem definida

(L2) composta de neurônios de tamanho médio com coloração escurecida que

em setores mais caudais do subnúcleo VMeP tendem a se tornar arranjados de

forma mais densa ao se aprofundarem nesse griseum. A camada profunda (L3)

na VMeP é ainda mais densamente povoada e mais estreita que a L2,

contendo um corpo neuronal com coloração mais escura e sem orientação

especial. Finalmente, a área mais profunda da camada molecular (L1) da

VMeP parece invadida por células pequenas que apresentam o mesmo padrão

de distribuição e traços morfológicos gerais que os da L1 da MeA (Gloor,

1997).

Dorsalmente o subnúcleo VMeP se funde com sua contraparte dorsal

(DMeP). Este subnúcleo permanece, pela maior parte de sua extensão,

imediatamente adjacente à faceta lateroventral do trato óptico. Ele contém uma

população neuronal mais homogênea, formada por neurônios um pouco

maiores, agrupados mais densamente e com coloração mais escura que

aqueles do VMeP. Sua camada celular superficial (L2) contém neurônios

alongados e com orientação radial, de ovalados a fusiformes, agrupados mais

densamente que os da L3. Esta contém uma população mais heterogênea de

neurônios que se coram de forma escura e que não apresentam orientação

especial. Finalmente, a DMeP possui uma população glial mais rica que a de

sua contraparte ventral (Gloor, 1997).

A MeA apresenta um plexo moderadamente rico de fibras mielinizadas

de orientação aleatória que se tornam mais densas em suas camadas mais

superficiais (de Olmos, 1990). Esse padrão modifica-se dramaticamente no

nível da divisão MeP. Aqui a densidade do plexo de fibras mielinizadas

aumenta bruscamente em ambos os subnúcleos da MeP, embora

apresentando variações em relação a sua orientação predominante.

Consequentemente, enquanto o plexo de fibras mielinizadas na DMeP é

dominado por fibras de curso transversal, o plexo de fibras meduladas do

núcleo paraventricular (PV) é formado por fibras de orientação mais aleatória,

com alguma predominância de fibras de curso ventrodorsal que irradiam das

“massas fibrosas” de Brockhaus (1938). Ainda, a presença de feixes curtos de

27

fibras densamente mielinizadas intercaladas entre a camada celular superficial

e a margem lateral do trato óptico também marca a diferença entre os dois

subnúcleos da MeP. Corroborando o arranjo mieloarquitetônico acima descrito,

preparações neurofibrilares apresentam um arranjo semelhante, mas com uma

disposição muito mais densa (Gloor, 1997).

1. 3. MORFOLOGIA NEURONAL

Vários são os parâmetros morfológicos que servem para caracterizar os

neurônios presentes no sistema nervoso de vertebrados e invertebrados. As

descrições gerais iniciam-se pela localização e pelo aspecto do corpo celular,

sua área ou volume e a forma que apresenta. Muitas são as possibilidades de

descrição, como por exemplo, classificá-los com aspecto arredondado, ovóide,

fusiforme e, na medida em que vários ramos dendríticos primários surgem do

soma, conferem um aspecto piramidal ou estrelado com múltiplas variações.

Os dendritos primários podem ser igualmente contados e sua posição espacial

de surgimento descrita. Com isso neurônios multipolares de tipo “bitufted” ou

estrelados podem ser facilmente reconhecíveis. O primeiro tipo corresponde

àqueles neurônios que dão origem a dois ramos dendríticos geralmente em

pólos opostos do corpo celular. Os do segundo tipo são aqueles que originam

três ou mais ramos dendríticos primários. Nesta nomenclatura básica não se

pode confundir neurônios de tipo “bitufted” com os bipolares, uma vez que

nesses últimos um dos prolongamentos deve ser um dendrito, mas o outro é

um axônio (Rasia-Filho et al., 2004; Dall‟Oglio et a.l, 2007). Os dendritos

podem ser estudados quanto a seu padrão de ramificação e espalhamento em

relação ao soma e ao longo do neurópilo ou pela presença de espinhos

dendríticos (Rasia Filho et al., 2004; Dall‟Oglio et al., 2008).

O corpo celular representa o local de início do desenvolvimento de

prolongamentos neuronais (dendritos e axônios) e sua morfologia pode se

relacionar com o volume do núcleo e das organelas citoplasmáticas (Peters et

al., 1970; Hermel et al., 2006). Como os dendritos primários surgem a partir do

soma, pode-se interferir se um neurônio tem uma quantidade maior ou menor

de elementos de condução aferente ao corpo celular. Ademais, a área total e o

28

volume do soma podem se relacionar com as constantes de tempo e de

espaço para a computação da atividade sináptica e elétrica que se faz no

neurônio. Por isso, relacionada com a condutância de membrana celular, o tipo

e a quantidade de canais iônicos e o número de sinapses que se fazem

diretamente no corpo celular ou em dendritos, também a área do soma importa

para a ocorrência de potenciais de ação e a atividade neuronal dentro dos

circuitos neurais em que ela se enquadra funcionalmente (Peters et al., 1970;

Hermel et al., 2006; Peters et al., 1991).

Como revisado e descrito por Marcuzzo (2007), um espinho

característico tem a forma determinada pela presença de uma “cabeça”

(volume de aproximadamente 0,001 a 1 µm3) conectada ao neurônio por um

“pescoço” (diâmetro menor que 0,1µm; Harris & Kater, 1994). São encontrados

em várias populações neuronais, em praticamente todos os vertebrados e em

alguns invertebrados estudados até o momento (Nimchinsky et al., 2002). Sua

função específica é a transmissão sináptica e geralmente é um elemento pós-

sináptico (Nusser et al., 1998; Ethell & Pasquale, 2005; Popov et al., 2005;

Tada & Sheng, 2006). Os espinhos também podem funcionar como

compartimentos elétricos, onde a geometria do pescoço do espinho atua como

um elemento de resistência à passagem de corrente elétrica para o dendrito.

Assim, o pescoço do espinho pode causar uma diferença de potencial elétrico

localmente, podendo ativar canais iônicos dependentes de voltagem ou impor

uma diferença de capacitância com toda a árvore dendrítica, de acordo com as

propriedades ativa ou passiva existentes no local (Nimchinsky et al., 2002).

29

Figura 3. Desenho esquemático da ultraestrutura do espinho dendrítico onde se observam a cabeça e o pescoço do espinho que emergem do dendrito adjacente na base da figura. Alguns elementos constituintes da estrutura do espinho estão demonstrados. PSD, densidade pós-sináptica; REL, retículo endoplasmático liso; VE, vesícula endocítica. O aparelho do espinho, filamentos de actina e polirribossomos formam o citoesqueleto do espinho (adaptado de Hering & Sheng, 2001).

Os espinhos podem sofrer modificações em sua morfologia e esse

processo reflete o rearranjo rápido do citoesqueleto de actina em seu interior, o

que pode levar à mudança no tamanho e no número de espinhos (Oertner &;

Matus, 2005; Tada & Sheng, 2006). Em geral, os espinhos são classificados de

acordo com sua morfologia com a seguinte nomenclatura: “filopódio”, que não

apresenta uma cabeça definida e é fino e comprido, acredita-se que seja a

forma precursora dos espinhos; “fino”, o qual apresenta pescoço fino e pode

não ter uma cabeça bem definida; “espesso”, que não apresenta pescoço

diferenciado, e se mostra como uma elevação a partir do contorno dendrítico;

em forma de “cogumelo”, como se depreende da sua nomenclatura e que

parece ser o espinho mais estável (em termos de mudanças numéricas e

contatos sinápticos duradouros); e, “ramificado”, onde um pescoço pode dar

origem a mais de uma cabeça de espinho (Peters & Kaiserman-Abramof, 1970;

Peters et al., 1991; Hering; Sheng, 2001; González-Burgos, 2004).

30

Figura 4. Representação esquemática das diferentes morfologias dos espinhos dendríticos, como se observa à microscopia de luz, surgindo a partir de uma linha de base que representa o tronco dendrítico (adaptado de Hering & Sheng, 2001 e reproduzida de Marcuzzo, 2006).

O estudo dos espinhos dendríticos configura-se numa área muito

importante para o entendimento das bases celulares de funcionamento do

sistema nervoso. A determinação do número de espinhos por segmento

dendrítico (e, daqui, sua densidade por µm dendrítico) tem servido para estimar

a maior ou menor ocorrência de sinapses (Wooley & McEwen, 1993; Rasia

Filho et al., 2004; Hermel et al., 2006; de Castilhos, 2006; Marcuzzo, 2006).

Detalhes como as medidas de área do soma, aspecto dos ramos

dendríticos primários e classificação neuronal baseada nesses parâmetros,

além da presença e do tipo dos espinhos dendríticos, ainda não são

conhecidos para o Me de seres humanos. Aclarar esses pontos é o objetivo da

presente dissertação. Ao mesmo tempo em que todos esses dados são

inéditos e pioneiros em nosso meio, procurou-se desenvolver o protocolo de

uma técnica para a identificação da morfologia neuronal. Trata-se de uma

variante da técnica de Golgi originalmente nomeada “single-section Golgi

method” por causa de seus princípios técnicos. A técnica de Golgi se baseia na

reação entre o cromo e a prata, que pode ser intensificada pelo ósmio, e que

permite, quando gera resultados adequados, a identificação dos neurônios e de

células da glia que compõem a população do local em estudo. Isto foi feito em

seres humanos e está nos artigos a seguir.

FILOPÓDIO FINO ESPESSO COGUMELO RAMIFICADO

31

2. REFERÊNCIAS

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43

3. OBJETIVOS

______________________________

Os objetivos do presente estudo foram:

1) Implantar e desenvolver uma técnica de Golgi que pudesse ser

aplicada para amostras de tecido nervoso armazenadas em formol por um

longo período;

2) Identificar o Me humano em cortes coronais seriados e corados pela

técnica da tionina; e, com base nas imagens obtidas pela técnica anterior e

esta identificação

3) Descrever os tipos neuronais e quantificar parâmetros morfológicos

do soma neuronal do Me de seres humanos ao longo de seu comprimento

rostrocaudal. Como complementação, aspectos morfológicos relacionados às

células da glia foram igualmente relatados.

44

--- On Mon, 11/30/09, Greg Gerhardt <[email protected]> wrote:

From: Greg Gerhardt <[email protected]>

Subject: JNEUMETH-D-09-00549

To: [email protected], [email protected]

Date: Monday, November 30, 2009, 4:51 PM

Ref.: Ms. No. JNEUMETH-D-09-00549

THE "SINGLE-SECTION" GOLGI METHOD ADAPTED FOR FORMALIN-FIXED

HUMAN BRAIN AND LIGHT MICROSCOPY

Journal of Neuroscience Methods

Dear Dr. Rasia-Filho,

Your manuscript entitled "THE "SINGLE-SECTION" GOLGI METHOD ADAPTED

FOR FORMALIN-FIXED HUMAN BRAIN AND LIGHT MICROSCOPY" has been

assigned the following manuscript number: JNEUMETH-D-09-00549. Please use this

reference number for any correspondence to the Journal Office.

You will be able to check on the progress of your paper by logging on to the Elsevier

Editorial System as an author.

The URL is http://ees.elsevier.com/jneumeth/.

Thank you for submitting your work to this journal.

Kind regards,

Greg A. Gerhardt

Co-Editor-in-Chief

Journal of Neuroscience Methods

45

http://ees.elsevier.com/jneumeth/

4. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS

______________________________

THE “SINGLE-SECTION” GOLGI METHOD ADAPTED FOR FORMALIN-

FIXED HUMAN BRAIN AND LIGHT MICROSCOPY

Aline Dall‟Oglio1+, Denise Ferme2+, Janaína Brusco3,5, Jorge E. Moreira3,5,

Alberto A. Rasia Filho1,2,4

1Program in Neuroscience, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto

Alegre, Brazil

2Program in Pathology, Universidade Federal de Ciências da Saúde, Porto

Alegre, Brazil

3Laboratory of Synaptic Structure, Ribeirão Preto School of Medicine,

Universidade de São Paulo, Brazil

4Department of Basic Sciences/Physiology, Universidade Federal de Ciências

da Saúde, Porto Alegre, Brazil

5Program in Neuroscience & Behavior, Ribeirão Preto School of Medicine,

Universidade de São Paulo, Brazil

+ These authors contributed equally to the present study.

Number of pages: 19

Number of figures: 2

Corresponding author: Alberto A. Rasia Filho. UFCSPA/Physiology, R.

Sarmento Leite 245 (room 308), Porto Alegre 90170-050 RS, Brazil. Phone: +

55 51 91161643. Fax: + 55 51 33038752. E-mail: [email protected]

Aline Dall’Oglio, M.Sc.

Program in Neuroscience, Institute of Basic Sciences, Federal University of Rio

Grande do Sul, R. Sarmento Leite 500, Porto Alegre RS 90050-110, Brazil

Denise Ferme

Program in Pathology, Federal University of Health Sciences, R. Sarmento

Leite 245, Porto Alegre RS 90050-110, Brazil

46

mailto:[email protected]

Janaína Brusco

Laboratory of Synaptic Structure, Department of Cell/Molecular Biology and

Biopathogens, Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Av.

Bandeirantes 3900, Ribeirão Preto SP 14049-900, Brazil

Jorge E. Moreira, Ph.D.

Laboratory of Synaptic Structure, Department of Cell/Molecular Biology and

Biopathogens, Medical School of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Av.

Bandeirantes 3900, Ribeirão Preto SP 14049-900, Brazil

Alberto A. Rasia-Filho, M.D., Ph.D.

Department of Basic Sciences/Physiology, Federal University of Health

Sciences, R. Sarmento Leite 245, Porto Alegre RS 90050-110, Brazil

Phone: + 55 51 91161643

Fax: + 55 51 33038752

E-mail: [email protected]

47


ABSTRACT

The Golgi method has been used for over a century to describe the

general morphology of neurons in the nervous system of different species. The

“single-section” Golgi method of Gabbott and Somogyi (1984) and the

modifications made by Izzo, Graybiel and Bolam (1987) are easy, rapid to

perform, and able to produce consistent results when used in rats, ferrets, and

cats. Here, we describe procedures for revealing cortical and subcortical

neurons in unbuffered formalin-fixed human brains stored for months. The

tissue was sectioned with vibratome, post-fixed in a combination of

paraformaldehyde and picric acid in phosphate buffer, immersed in osmium

tetroxide and in potassium bicromate, “sandwiched” between microscopic cover

slips, and impregnated in silver nitrate. All these steps take between 5 and 11

days to provide good results. The Golgi method has its characteristic pitfalls but,

with this procedure, neurons and glia can appear well-impregnated, allowing

further qualitative and quantitative studies under light microscopy. This

contribution adds to the basic techniques for the study of human nervous tissue

with the same advantages described for the “single-section” Golgi method in

other species; it is easy, fast, and feasible, requires minimal equipments, and

provides reliable results from formalin-fixed material.

KEY WORDS: Golgi procedure, osmication, silver impregnation, neuronal

morphology, glial cells.

Running title: “Single-section” Golgi method for the human brain

48

1. INTRODUCTION

The colorazione nera from the silver impregnation procedure has been,

for a long time, the method used to reveal the general morphology of neurons

and glia in various areas of the nervous system of several species (Golgi, 1873;

Ramón y Cajal, 1909; Valverde, 1962; Fairén et al., 1977; Scheibel & Scheibel,

1978; Szentágothai, 1978; McDonald, 1982). Phylogenetic and ontogenetic

studies under normal or pathological conditions benefited from the Golgi

method (Ramón y Cajal, 1909). When successfully done, the Golgi method is a

reliable tool to identify different types of neurons, the detailed shape of single

cells, and to highlight some functional meanings from morphological data

(Woolley and McEwen, 1994; Dall‟Óglio et al., 2008a,b; Larriva-Sahd, 2008;

Gómez-Villalobos et al., 2009; Rasia Filho et al., 2009).

As other techniques, the Golgi method has advantages and restrictions.

Although it was demonstrated that the silver precipitation occurs intracellularly

(Fairén et al., 1977; Bolam, 1992), not all the factors that impact on the ultimate

results of the impregnation procedure are known. This leads to an unpredictable

number of usable colored neurons and not a homogeneous pattern of cellular

staining in each tissue section. Some variations have been made in the “family”

of Golgi techniques to serve as alternatives to provide useful results (Nauta &

Ebbesson, 1970; Rosoklija et al., 2003), such as the use of different solutions in

the “rapid Golgi” and the Golgi-Cox variations (Valverde, 1962; McDonald,

1982), the control of the diffusion rate, and the pH of the chromation solution

(Angulo et al., 1996), or the establishment of the best technique according to

the fixation and storage condition of the tissue along time (Rosoklija et al., 2003;

Melendez-Ferro et al., 2009). Further comments and relevant contributions

based on the Golgi method results can be found in different neuroanatomical

and citological reports and references (Kolb et al., 1981; Millhouse, 1986;

Somogyi, 1990; Jacobs et al., 1997; Fairén, 2005; Larriva-Sahd, 2008).

After the work of Freund and Somogyi (1983), Gabbott and Somogyi

(1984) merit the development of the “single-section” Golgi method that proved

to be easy to execute, reliable, and relatively unexpensive. For example, it was

succesfully applied to clue the notable neuroendocrine modulation of the

number of dendritic spines in different brain areas of male and female rats

49

(Woolley and McEwen, 1994; Rasia Filho et al., 2004; Brusco et al., 2007). This

technique consists in sectioning the brain following perfusion with a

paraformaldehyde and picric acid fixation solution, placing sections in

potassium bicromate and, afterwards, between microscopic cover slips to

“sandwich” them prior to the impregnation in silver nitrate (e.g., Rasia Filho et

al., 1999, 2004). Izzo, Graybiel and Bolam developed an elegant modification of

the “single-section” technique that provided other rapid and consistently good

Golgi tool (Izzo et al., 1987). In this method, osmium tetroxide was added to the

reaction prior to silver nitrate and brain slices were placed between microscopic

slides, which would also allow an easier handling of serial sections (see detailed

data in Bolam, 1992). This technique could be combined with

immunocytochemistry for neurotransmitters or related substances, as was the

case of Golgi-impregnated substance P- and [Met]enkephalin-immunoreactive

neurons in the caudate nucleus of cats and ferrets (Izzo et al., 1987). Electron

microscopy images could also be obtained using this protocol after a

deimpregnation procedure (Bolam, 1992).

Efforts have been devoted to provide a more suitable Golgi method to

reveal the neuronal morphology in cortical and subcortical areas of human

brains kept stored under different conditions (Rosoklija et al., 2003; Friedland et

al., 2006; Melendez-Ferro et al., 2009). Here we describe that a combination of

the original “single-section” Golgi method (Gabbott and Somogyi, 1984) and the

procedure proposed by Izzo et al. (1987) and Bolam (1992) is useful to study

the human brain and can be easily applied to formalin-fixed tissue stored for

months. Osmication provided best results. This contribution adds to the basic

procedures for the study of the human nervous tissue already available but with

the same advantages that made the original “single-section” Golgi method

useful and employed in other animals, i.e., it is easy, fast, requires minimal

equipments, and provides consistent results. Advantages and drawbacks of this

procedure will be depicted below.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Subjects

The subjects were 2 males, aged 47 and 68 years-old, who died of non

violent causes or acute/chronic neurologic diseases (in these cases, congestive

50

heart failure and heart infarction). Part of the temporal lobes from human brains

were obtained during necropsies from the Department of Legal Medicine from

the “General Institute of Legal Investigation” (Rio Grande do Sul, Brazil). No

perfusion of fixative solution was done prior to tissue removal. The interval

between the death and the necropsies varied from at least 6 h, according to

Brazilian laws, to 8 h at the most. Previous clinical and co-morbid data were

obtained during an interview directed to the relatives or legal representatives,

who also signed an informed consent prior to the inclusion in this study. All the

legal and ethical procedures were followed in accordance to international and

local regulations. regulatory standards (based on the 1964 Declaration of

Helsinki) and ethical committee approvals obtained from the Department of

Legal Medicine from the State of Rio Grande do Sul (process number 03/08),

the Federal University of Health Sciences of Porto Alegre (process number

541/07), and the Federal University of Rio Grande do Sul (process number

2008009), Brazil.

2.2. Tissue fixation and the impregnation procedure

Blocks containing the temporal lobe (appoximately 5 cm of length from

the anterior pole) were immediately immersed in unbuffered 10% formalin and

kept stored in this same fixative solution for approximately 20 months (fixative

solutions were around pH 4.0). Small samples were trimmed to ~1.5 cm3 to

contain the temporal cortex and the adjacent striatum (DeArmond et al., 1989).

Tissue samples were coronally sectioned in slices 200 µm thick using a

vibratome (Leica, Germany), and submitted to the following steps: (1) Free-

floating sections were post-fixed with 4% paraformaldehyde and 1.5% picric

acid in 0.1 M phosphate buffer solution (PBS, pH = 7.4) either for 24 h or 72 h in

the dark at 4°C. (2) The sections were quickly rinsed in PBS, transferred to a

0.02% osmium tetroxide solution in PBS for 10 to 30 min under gentle shaking

in the dark; quickly rinsed in PBS for 1 to 2 min, and (3) immersed in 3%

potassium dichromate (Merck, Germany) in deionized water, and kept in the

same solution in the dark at 4°C either for 24 h or 72 h after which the sections

were quickly rinsed again in distilled water (if necessary to remove excess of

chromation, repeat this step) and “sandwiched” between glass coverslips glued

51

(epoxy glue) in the four corners to allow small diffusion rate of solution. (4) The

slides were gently placed in the impregnation solution of 1.5% silver nitrate

(Merck, Germany) in deionized water at room temperature (RT) in the dark

either for 24 h or 72 h. After that period, the coverslips were broken, the

sections were removed and rinsed in distilled water to remove the excess of

crystals with a soft paintbrush and mounted on slides. Finally, the slides were

dried at RT (caution was taken to avoid overdrying), immersed in distilled water

(3 min, once) and dehydrated in ascending series of ethanol as follows: 70%

and 80% 3 min each; 95% and 100% twice, 3 min each; diaphanized in

xylene/ethanol 1:1 and 2:1, 3 min each; xylene 100%, two rinses of 3 and 6 min

each; mounted with coverslips and non-acidic synthetic balsam avoiding

bubbles, and left to dry at RT for 24 h.

As noted above, if the steps 1, 3, and 4 are going to be done at the

minimum time required (24 h), 5 days will be needed to finish the Golgi stain. If

72 h is going to be the choice as preferred time for these steps, 11 days will be

needed to obtain the final results.

2.3. Imaging

Slides were observed with a Nikon Eclipse E-600 microscope (400 X,

Japan) coupled to a Pro-Series High Performance CCD camera (or other of

high quality). Stacks of photomicrographs provided the final image using the

Image-Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, USA). Sharpening,

brightness or background contrast were slightly adjusted using the Adobe

Photoshop 7.0 software (USA).

3. RESULTS

As with other Golgi techniques, the present method impregnated a small

percentage of neurons and glial cells in the slices of cortex and striatum

(Figures 1 and 2), sometimes near the borders of the sections. The worst

images were produced without osmication (Figure 1A). However, even after all

methodological steps, some cells were not completely visible. That is, neurons

52

could appear with a fading staining or with “cut-off” branches. An example of

that can be found in Figure 1B, where it is shown a pyramidal neuron from the

temporal cortex with relatively short basal dendrites and the apical dendrite with

uncharacteristic short branches after bifurcation. Deceptive results can occur

when the formalin solution was renewed before processing the tissue.

Unbuffered 10% formalin solution with pH around 2.5 led to no remarkable

impregnation even after testing different variations in time of processing and/or

solute concentrations; also, unwanted silver crystals over the tissue or blood

vessels impregnated occurred in all samples tested.

On the other hand, after osmication, several well-impregnated cells

(neurons and glial cells) appeared black stained against a minimal soft yellow

background and with scatered non specific precipitation in the neuropil (Figures

1B-1F and 2). The quality of impregnation was very similar when visually

comparing the results obtained along 5 to 11 days of chromation/silver nitrate

after osmication. Different neuron types could be observed within the same

brain section, cell bodies with emerging dendrites that radiate in different

directions and branched accordingly, pleomorphic dendritic spines (even at a

lower microscopic magnification) and a profusion of thin axons and their

collateral processes (Figures 1C and D). In the striatum (head of the caudate

nucleus based on DeArmond et al., 1987), more complete multipolar medium-

spiny neurons were impregnated (Figures 2A and B). They appeared as in other

classical descriptions, with a round cell body and various primary dendrites that

branched and tapered along the section. Dendritic spines with a continuum of

different shapes and sizes could be easily identified, allowing the different

classifications by shape as thin, stubby, mushroom-like or wide (Figure 2C).

Glial cells in close apposition to blood vessels or perineuronal appeared

also well-impregnated (Figures 1E-F and 2A). Astrocytes with a profuse

ramification (Figure 1E) and with notable end-feet processes (Figure 1F) were

found in different areas.

4. DISCUSSION

The present use of the original “single-section” Golgi method (without

osmium) and its adaptation after Izzo et al. (1987) and Bolam (1992) represents

53

another technique to be used for the study of the morphology of human brain

cells. One of its advantages is that it can be applied to formalin-fixed human

tissue stored for a long time, allowing the study of neurons and glial cells in

brain samples maintained under the routinely fixation procedure done for

anatomical pieces. While we developed this technique in brain samples stored

for almost 2 years in formalin solution, other time periods could be tested as

well. The osmication provided the best results and all the experimental steps

could be done in few days. Drawbacks of using the Golgi method are the

absence of a complete neuronal impregnation or the intra- and inter-experiment

variability in the results (Scheibel and Scheibel, 1978; Rasia Filho et al. 1999).

Other intervening variables might affect final results, such as the age of the

subjects, their past health condition or use of uninformed medication, the

degree of cellular post-mortem necrosis, and/or variations in the diffusion rate of

the fixative solution.

Nevertheless, morphological data from Golgi results can allow relevant

insights regarding the cytoarchitectonic organization and function of different

brain areas (Ramón y Cajal, 1909; Szentágothai, 1978; Somogyi, 1990; Larriva-

Sahd, 2008). As previously stated, “Golgi staining requires a significant

investment in tissue, time, and materials, and unless great care is taken, it can

fail completely” (reviewed in Rosoklija et al., 2003). This is true under many

circumstances. Here, it is presented another procedure, which adds to the basic

ones for the study of the human nervous tissue, with the same advantages

described for the “single-section” Golgi method in other species. It is relatively

easy, fast (5-11 experimental days), and feasible, requires minimal equipments,

and provides suitable data from formalin-fixed human brain tissue. Moreover,

qualitative and quantitative studies can be conducted in well-impregnated

neurons under light microscopy (see examples in Rasia Filho et al., 2004; de

Castilhos et al., 2006; Brusco et al., 2008; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; de

Castilhos et al., 2008).

Comparatively to other current protocols, the Golgi-Cox method on long-

term fixed human tissue (10% neutral buffered formalin for up to 15 years) did

not render satisfactory results even when pretreatments (citrate bufferand

sodim borohydre) are used to remove excess of fixation prior to chromation

(Melendez-Ferro et al., 2009). Other procedures as the rapid Golgi and the

54

Golgi-Kopsch (also named Colonnier-Golgi or aldehyde Golgi) gave nice results

with tissues that were fixed in formalin, which lost its buffering capacity overt

time, and that were stored from 15 months up to 55 years (Rosoklija et al.,

2003). Here, sections were obtained without prior embedding in polymerized

plastic (Moss and Whetsell, 2004) and impregnation did not require microwave

heating for 6-8 h (Armstrong & Parker, 1986). The present method also allowed

the observation of glial cells, which can be compared to the Golgi-Hortega-

Lavilla silver impregnation technique for glutaraldehyde-paraformaldehyde

prolonged fixed brain tissue (D‟amelio, 1983). At the same time, the “single-

section” Golgi method provided akin and complementary data to other

stereological, immunocytochemical or immunohistochemical techniques for

confocal or electron microscopy (Fairén et al., 1977; Kisvárday et al., 1990;

Hermel et al., 2006; Martinez et al., 2006; Cunningham et al., 2007).

5. CONCLUSION

In conclusion, this contribution adds to other basic techniques for the

study of the human nervous tissue celularity, but has the advantages of the

“single-section” Golgi method previoulsy employed for other species. We would

like to consider it a procedure open to additional contributions, as occurred for

the original descriptions of this method (Freund & Somogyi, 1983; Gabbott &

Somogyi, 1984; Izzo et al., 1987; Bolam, 1992). Because this technique has

some relevant advantages for its execution, we look forward for its use and

improvement elsewhere. Some adaptations probably will be needed to meet

specific research interests, having this present approach as a guide.

6. ACKNOWLEDGEMENTS

Authors are thankful to the relatives that donated the tissue that resulted

in the present experimental study. Also, to Dr. Matilde Achaval (University of

Rio Grande do Sul, Brazil) for helpful comments during the preparation of the

55

manuscript. Grants from the Brazilian Federal Agency CNPq. JEM and AARF

are CNPq researchers.

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59

LEGENDS

Figure 1. Reconstructed digitized microscopic images of Golgi-impregnated

cells from the human cerebral cortex (temporal lobe) and striatum (head of the

caudate nucleus). An adaptation of the “single-section” Golgi method was used

in formalin-fixed samples, either without previous osmication (A, which

presented the worst results) or after osmication (B-F) and along different

processing periods (5-11 days). Compared to the local estimated population of

neurons, a small percentage of them were impregnated in the sampled brain

areas. Although some neurons showed branching dendrites, they still appeared

incomplete (B, C). Otherwise, a more extensive impregnation could be obtained

as well, revealing the axonal network close to a neuron (C) or the general

morphology of a neuronal subpopulation (D). Dark impregnated astrocytes were

found close to blood vessels (E) with characteristic end-feet processes (F). As a

rule, the lighter background enabled an adequate contrast for the cellular

impregnation result.

Figure 2. (A) Reconstructed digitized microscopic images of impregnated

neurons from the human caudate nucleus using an adaptation of the “single-

section” Golgi method for formalin-fixed samples. The selected area in A (dark

box) was zoomed up to show details of the neuronal morphology, i.e, cell body,

branching dendrites, and spines (B). Note the presence of pleomorphic dendritic

spines (C) classified as thin (t), “mushroom-like” (m), stubby (s) or wide (w).

60

Figure 1.

61

Figure 2.

62

5. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS

______________________________

MÉTODO DE GOLGI “SINGLE-SECTION” ADAPTADO PARA ENCÉFALO

HUMANO FIXADO EM FORMALDEÍDO E PARA MICROSCOPIA DE LUZ

Aline Dall‟Oglio1+, Denise Ferme2+, Janaína Brusco3,5, Jorge E. Moreira3,5,

Alberto A. Rasia Filho1, 2, 4

1 Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil

2 Programa de Pós-Graduação em Patologia, Universidade Federal de Ciências

da Saúde, Porto Alegre, Brasil

3 Laboratório de Estrutura Sináptica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Brasil

4 Departamento de Ciências Básicas/Fisiologia, Universidade Federal de

Ciências da Saúde, Porto Alegre, Brasil

5 Programa de de Pós-Graduação em Neurociência e Comportamento,

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil

+ Esses autores contribuíram igualmente para o presente estudo

Autor para correspondência: Alberto A. Rasia Filho, UFCSPA / Fisiologia.

Rua Sarmento Leite, 245 (sala 308), Porto Alegre 90170-050 RS, Brasil. Fone:

+ 55 51 9116-1643. Fax: + 55 51 3303-8752. E-mail: [email protected]

Aline Dall’Oglio, M.Sc.

Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Instituto de Ciências Básicas,

Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Rua Sarmento Leite, 500, Porto

Alegre, RS, Brasil, CEP 90.050-110

Denise Gomes Rodrigues Ferme

Programa de Pós-Graduação em Patologia, Universidade Federal de Ciências

da Saúde. Rua Sarmento Leite, 245, Porto Alegre, RS, Brasil, CEP 90.050-110

63


Janaína Brusco

Laboratório de Estrutura Sináptica, Departamento de Biologia Celular e

Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, Ribeirão Preto, SP,

Brasil, CEP 14.049-900

Jorge E. Moreira, Ph.D.

Laboratório de Estrutura Sináptica, Departamento de Biologia Celular e

Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Av. Bandeirantes, 3900, Ribeirão Preto, SP,

Brasil, CEP 14.049-900

Alberto A. Rasia-Filho, M.D., Ph.D.

Departamento de Ciências Básicas / Fisiologia, Universidade Federal de

Ciências da Saúde, Rua Sarmento Leite, 245, Porto Alegre, RS, Brasil, CEP

90.050-110

Fone: + 55 51 9116-1643

Fax: + 55 51 3303-8752

E-mail: [email protected]

64


RESUMO

O método de Golgi tem sido utilizado por mais de um século para

descrever a morfologia geral dos neurônios no sistema nervoso de diferentes

espécies. O método de Golgi nomeado “single-section” por Gabbot & Somogyi

(1984) e as modificações feitas por Izzo, Graybiel & Bolam (1987) é um

procedimento fácil, rápido de ser realizado e capaz de produzir resultados

consistentes quando usado em ratos, furões e gatos. Descrever-se-á a técnica

para que sejam impregnados neurônios corticais e subcorticais em encéfalos

humanos fixados em formaldeído não tamponado e armazenados nessa

condição por meses. O tecido foi seccionado em vibrátomo, pós-fixado em uma

combinação de paraformaldeído e ácido pícrico em tampão fosfato, imerso em

tetróxido de ósmio e em bicromato de potássio, submetido a “sanduíche” entre

lamínulas histológicas e impregnado em nitrato de prata. Todos esses passos

levaram entre 5 e 11 dias para fornecerem resultados úteis. O método de Golgi

tem algumas desvantagens características, mas, com o presente

procedimento, os neurônios e a glia aparecem bem impregnados,

possibilitando estudos quantitativos e qualitativos mais aprofundados sob

microscopia de luz. Esta contribuição soma-se às técnicas básicas para o

estudo das células do tecido nervoso humano com as mesmas vantagens

descritas para o método de Golgi “single-section” já empregado em outras

espécies. Ou seja, é técnica fácil, rápida, exequível, que requer equipamentos

mínimos e fornece dados confiáveis a partir de tecido fixado em formaldeído.

PALAVRAS CHAVE: método de Golgi, ósmio, impregnação por prata,

morfologia neuronal, células gliais

Título abreviado: Método de Golgi “single-section” para encéfalo humano

65

1. INTRODUÇÃO

A “colorazione nera”, termo original para o procedimento de

impregnação nervosa pela prata, tem sido há muito tempo o método utilizado

para revelar a morfologia geral de neurônios e glia em diferentes áreas do

sistema nervoso de diversas espécies (Golgi, 1873; Ramón y Cajal, 1909;

Scheibel & Scheibel, 1978; Somogyi, 1990). Estudos filogenéticos e

ontogenéticos sob condições normais ou patológicas tem se beneficiado dos

resultados obtidos com o método de Golgi (Ramón y Cajal, 1909). Quando

realizado com bom sucesso, o método de Golgi é uma técnica confiável para

revelar diferentes tipos de neurônios, sua estrutura geral detalhada e para

indicar possíveis relações funcionais para dados morfológicos (Wooley &

McEwen, 1994; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; Larriva-Sahd, 2008; Gómez-

Villalobos et al., 2009; Rasia Filho et al., 2009).

Assim como acontece com outras técnicas, o método de Golgi tem

vantagens e restrições. Embora tenha sido demonstrado que a precipitação da

prata ocorra no interior celular (Fairén et al., 1977; Bolam, 1992), nem todos os

fatores que modificam os resultados finais do procedimento para tal

impregnação são conhecidos. Isso leva a um número imprevisível de neurônios

corados utilizáveis e um padrão não homogêneo de coloração celular em cada

secção de tecido nervoso. Algumas variações foram feitas na “família” das

técnicas de Golgi para servirem como alternativas para a obtenção de

resultados úteis (Nauta & Ebbesson, 1970; Rosoklija et al, 2003), tais como o

uso de diferentes soluções no método de Golgi „rápido” e as variações de

Golgi-Cox (Valverde, 1962; McDonald, 1982), o controle da velocidade de

difusão e o pH da solução de coloração (Angulo et al., 1996) ou o

estabelecimento da melhor técnica de acordo com as condições de fixação e

armazenamento do tecido ao longo do tempo (Rosoklija et al., 2003; Melendez-

Ferro et al., 2009). Comentários adicionais e contribuições relevantes baseadas

nos resultados do método de Golgi podem ser encontrados em outras

referências (Kolb et al., 1981; Izzo et al., 1987; Jacobs et al., 1997; Rosoklija et

al., 2003; Fairén, 2005; Larriva-Sahd, 2008).

Após o trabalho de Freund & Somogyi (1983), Gabbott & Somogyi

(1984) tiveram o mérito do desenvolvimento do método de Golgi nomeado

66

“single-section” que provou ser fácil de ser executado, confiável e relativamente

barato. Por exemplo, ele foi e ainda tem sido aplicado para estudar a notável

modulação neuroendócrina do número de espinhos dendríticos em diferentes

áreas do cérebro de ratos machos e fêmeas (Woolley & McEwen, 1994; Rasia

Filho et al., 2004; Brusco et al., 2007). Essa técnica consiste na secção do

encéfalo seguida da perfusão com uma solução de fixação de paraformaldeído

e ácido pícrico, com as secções sendo colocadas em bicromato de potássio e,

após, entre lamínulas de vidro como se fora um “sanduíche” antes da

impregnação com nitrato de prata (vejam-se Rasia Filho et al., 1999, 2004).

Izzo, Graybiel & Bolam desenvolveram uma elegante modificação da técnica

“single-section” que gerou uma alternativa rápida, com boa qualidade e

consistentemente reproduzível (Izzo et al., 1987). Nesse método foi adicionado

tetróxido de ósmio à reação antes do nitrato de prata e secções do encéfalo

foram colocadas entre lâminas de vidro, o que também permitiu um manuseio

mais fácil de secções seriadas (ver detalhes em Bolam, 1992). Essa técnica

pode ser combinada com imunocitoquímica para neurotransmissores ou

substâncias relacionadas, como ocorreu para o estudo da substância P e de

neurônios imunorreativos à [Met]-encefalina do núcleo caudado de gatos e

furões (Izzo et al., 1987). Imagens de microscopia eletrônica também podem

ser obtidas utilizando-se esse protocolo e após um procedimento de remoção

parcial da impregnação pela prata (Bolam, 1992).

Vários esforços têm sido feitos para que se desenvolva um método de

Golgi que revele a morfologia neuronal em áreas corticais e subcorticais de

encéfalos humanos armazenados em diferentes condições laboratoriais

(Rosoklija et al., 2003; Friedland et al., 2006; Melendez-Ferro et al., 2009). Aqui

descrever-se-á que uma combinação do método de Golgi “single-section”

original (Gabbott & Somogyi, 1984) e o procedimento proposto por Izzo et al.

(1987) e Bolam (1992) é útil para o estudo do cérebro humano e pode ser

facilmente aplicada a tecidos fixados em formaldeído armazenados por meses.

O emprego concomitante de ósmio gerou os melhores resultados. Esta

contribuição soma-se às técnicas básicas para o estudo das células do tecido

nervoso humano já disponíveis, mas com as mesmas vantagens que tornaram

o método de Golgi “single-section” original útil e aplicado em outras espécies,

ou seja, é fácil, rápido, requer equipamentos mínimos e fornece dados

67

confiáveis. Vantagens e desvantagens desse procedimento serão descritos a

seguir.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Indivíduos

Foram estudados dois homens, com idades de 47 e 68 anos, que

morreram de causas não violentas e sem doenças neurológicas agudas ou

crônicas (nesses casos, advindos de insuficiência cardíaca congestiva e infarto

do miocárdio). Partes dos lobos temporais bilaterais foram obtidas durante as

necropsias no Departamento de Medicina Legal do Instituto Geral de Perícias

(Estado do Rio Grande do Sul, Brasil). Nenhuma solução de fixação ou

perfusão foi utilizada antes da remoção do tecido. O intervalo entre a morte e a

necropsia variou do mínimo de 6 horas (de acordo com a legislação brasileira)

até no máximo 8 horas. Dados clínicos e de comorbidades prévios foram

obtidos por meio de entrevista dirigida a familiares ou representantes legais, os

quais também assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido, o qual

foi detalhado anteriormente à inclusão neste estudo. Todos os procedimentos

éticos e legais foram seguidos de acordo com os padrões regulatórios

internacionais (baseados na Declaração de Helsinki de 1964), além da

aprovação dos Comitês de Ética do Departamento de Medicina Legal do

Estado do Rio Grande do Sul (processo nº 03/08), da Universidade Federal de

Ciências da Saúde de Porto Alegre (processo nº 541/07) e da Universidade

Federal do Rio Grande do Sul (processo nº 2008009).

2.2. Fixação do tecido e procedimento de impregnação

Blocos contendo o lobo temporal (aproximadamente 5 cm de distância a

partir do seu polo anterior) foram imediatamente imersos em formaldeído 10%

não tamponado e mantidos armazenados nessa mesma solução de fixação por

aproximadamente 20 meses (neste momento, as soluções de fixação estavam

com pH em torno de 4,0). Do bloco original, pequenas amostras com

68

aproximadamente 1,5 cm3 foram retiradas onde estavam o córtex temporal e o

estriado adjacente (DeArmond et al., 1989). As amostras de tecido foram

seccionadas (cortes coronais de 200 µm de espessura) utilizando-se um

vibrátomo (Leica, Alemanha) e submetidas às seguintes etapas: (1) Pós-

fixação com paraformaldeído a 4% e ácido pícrico a 1,5% em solução de

tampão fosfato (PBS) 0,1 M (pH = 7,4) por 24 h ou 72 h, protegidas da luz e à

4°C. (2) A seguir, as secções foram rapidamente lavadas em PBS, transferidas

para uma solução de tetróxido de ósmio a 0,02% em PBS entre 10 a 30

minutos com agitação suave e protegidas da luz, novamente lavadas com PBS

por 1 a 2 minutos e, (3) foram imersas em dicromato de potássio a 3% (Merck,

Alemanha) dissolvido em água deionizada e mantidas na mesma solução, no

escuro, à 4°C por 24 h ou 72 h. Após, as secções foram novamente lavadas

com água destilada (esse passo podia ser repetido, se necessário, para

remover o excesso de coloração) e delas foram feitos “sanduíches” entre

lamínulas de vidro, nos quais foi colocado cola epóxi nos quatro cantos para

permitir uma pequena velocidade de difusão da próxima solução a ser

empregada. (4) As lâminas foram cuidadosamente colocadas na solução de

impregnação de nitrato de prata a 1,5% (Merck, Alemanha) diluído em água

deionizada, à temperatura ambiente (TA) e no escuro por 24 h ou 72 h. As

lamínulas foram então quebradas, as secções foram removidas, lavadas em

água destilada e, para remoção de cristais sobre os cortes, utilizou-se um

pincel macio. Finalmente, os cortes foram colocados em lâminas, secos à

temperatura ambiente tomando-se cuidado para evitar secagem excessiva,

imersos em água destilada (3 minutos, uma única vez), desidratados em séries

ascendentes de álcool (70% e 80%, uma vez, 3 minutos cada; 95% e 100%,

duas vezes, 3 minutos cada), diafanizados em solução de xilol/álcool absoluto

1:1 e 2:1 (3 minutos, uma vez) e xilol 100% (2 vezes de 3 a 6 minutos cada),

acrescentado bálsamo sintético não ácido e lamínulas, evitando-se bolhas de

ar, e deixados para secagem à temperatura ambiente por 24 h.

Conforme descrito, se os passos 1, 3 e 4 forem feitos no tempo mínimo

necessário (24 h), serão utilizados 5 dias para a conclusão deste procedimento

de Golgi. Se a escolha for de 72 h como o tempo preferencial para esses

passos, 11 dias serão necessários para a obtenção dos resultados finais.

69

2.3. Obtenção de imagens

As lâminas foram observadas em um microscópio Nikon Eclipse E-600

(400 X, Japão) acoplado a uma câmara Pro-Series High Performance CCD (ou

outra de alta qualidade). O somatório das sequências de fotomicrografias

forneceu a imagem final utilizando-se o software Image-Pro Plus 6.0 (Media

Cybernetics, EUA). Pequenos ajustes de bordo, brilho ou contraste de fundo

foram obtidos utilizando-se o software Adobe Photoshop 7.0 (EUA).

3. RESULTADOS

Assim como ocorre com outras técnicas de Golgi, o presente método

impregnou um pequeno percentual de neurônios e células gliais nas amostras

de córtex cerebral e estriado estudadas (Figuras 1 e 2) e, em algumas vezes,

próximos das bordas das secções. As piores impregnações foram obtidas sem

o emprego do ósmio (Figura 1A). Não obstante, mesmo após todos os passos

metodológicos, algumas células não ficaram completamente visíveis. Isto é, os

neurônios podiam aparecer evidenciando uma perda gradual da impregnação

pela prata, com ramos seccionados ou evidenciando uma parada abrupta da

impregnação. Um exemplo disso é encontrado na Figura 1B, onde é mostrado

um neurônio piramidal do córtex temporal com dendritos basais relativamente

curtos e o dendrito apical com ramos anormalmente curtos e não

característicos logo após uma ramificação. Resultados decepcionantes

ocorreram quando a solução de formaldeído foi substituída antes do

processamento do tecido. Solução de formaldeído a 10% não tamponada e

com pH em torno de 2.5 não permitiu uma impregnação celular satisfatória,

mesmo após serem testadas diferentes variações de tempo de processamento

e/ou concentrações do solutos. Também foram encontrados cristais de

cromo/prata indesejados sobre o tecido ou vasos sanguíneos impregnados em

todas as amostras testadas.

Por outro lado, após o emprego de ósmio, diversas células bem

impregnadas (neurônios e células gliais) apareceram coradas de pardo ou

preto contra um fundo amarelo claro e com pouca precipitação inespecífica em

70

seu entorno (Figuras 1B-1F e 2). A qualidade da impregnação era semelhante

quando visualmente comparados os resultados obtidos ao longo de 5 ou 11

dias de processamento histológico. Diferentes tipos de neurônios puderam ser

observados na mesma secção tecidual, com corpos celulares dos quais

dendritos primários emergentes se projetavam em diferentes direções e se

ramificavam a seguir. Espinhos dendríticos pleomórficos (observáveis mesmo

com um pequeno aumento microscópico) e uma profusão de axônios finos e

seus processos colaterais foram igualmente encontrados (Figuras 1C e D). No

estriado (cabeça do núcleo caudado, segundo DeArmond et al., 1987),

neurônios multipolares mais completos e com uma quantidade média de

espinhos foram impregnados (Figuras 2A e B). Eles apareceram como em

outras descrições clássicas, com um corpo celular arredondado e vários

dendritos primários que, ao se ramificarem, tornavam-se menos espessos ao

longo da secção. Espinhos dendríticos com um continuum de diferentes

formatos e tamanhos foram facilmente identificados, permitindo as diferentes

classificações por formato como finos (“thin”), arredondados e sem um pescoço

definido (“stubby”), em forma de cogumelo (“mushroom-like”) ou largos (“wide”;

Figura 2C).

Células gliais em íntima aposição a vasos sanguíneos ou em localização

perineuronal apareceram igualmente bem impregnadas (Figuras 1E-F e 2A).

Astrócitos com uma ramificação profusa (Figura 1E) e com notáveis processos

em direção a vasos sanguíneos (“end-feet”) foram encontrados em diversas

áreas (Figura 1F).

4. DISCUSSÃO

O emprego do método de Golgi denominado originalmente de “single-

section” (sem ósmio) e sua adaptação segundo Izzo et al. (1987) e Bolam

(1992) representa outra técnica que pode ser empregada para o estudo da

morfologia das células do encéfalo de seres humanos. Uma de suas vantagens

é que ela pode ser aplicada a tecido humano fixado em formaldeído e

armazenado por longo tempo, permitindo o estudo de neurônios e células gliais

em amostras de encéfalo mantidas sob procedimento de fixação simples e

71

rotineiro aplicado a peças anatômicas. Embora se tenha desenvolvido esta

técnica em amostras armazenadas por quase 2 anos, outros períodos de

tempo poderiam também ser testados. O uso do ósmio forneceu os melhores

resultados e todas as etapas experimentais puderam ser realizadas em poucos

dias. As desvantagens do uso do método de Golgi são a ausência de

impregnação neuronal completa ou a variabilidade nos resultados intra e inter-

experimento (Scheibel & Scheibel, 1978; Rasia Filho et al., 1999). Outras

variáveis que podem ter interferido e afetado os resultados finais são a idade

dos indivíduos, sua condição de saúde passada ou o uso de medicação não

informada, o grau de necrose celular post-mortem e/ou variações na difusão da

solução fixadora.

Não obstante, os dados morfológicos obtidos a partir dos resultados da

técnica de Golgi permitem inferências em relação à organização

citoarquitetônica e à função de diferentes áreas encefálicas (Ramón y Cajal,

1909; Szentágothai, 1978; Larriva-Sahd, 2008). Conforme descrito por

Rosoklija et al. (2003), “a coloração pelo método de Golgi requer um

investimento significativo de amostras teciduais, de tempo e de materiais e, a

menos que grande cuidado seja tomado, ela pode falhar completamente”. Isso

é uma verdade sob muitas circunstâncias. Aqui, entretanto, é apresentado um

outro procedimento que se soma às técnicas básicas para o estudo do tecido

nervoso humano com as mesmas vantagens descritas para o método de Golgi

“single-section” em outras espécies. Ele é relativamente fácil, rápido (5–11 dias

de experimento) e exequível, requer equipamentos mínimos e fornece dados

confiáveis de tecido cerebral humano fixado em formaldeído. Além disso,

estudos qualitativos e quantitativos podem ser conduzidos em neurônios bem

impregnados sob microscopia de luz (ver exemplos em Rasia Filho et al., 2004;

de Castilhos et al., 2006; Brusco et al., 2008; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; de

Castilhos et al., 2008).

Em comparação com outros protocolos atualmente em uso, o método de

Golgi-Cox para tecido humano após longo período de fixação (formaldeído 10%

tamponado por até 15 anos) não forneceu resultados satisfatórios mesmo

quando foram usados pré-tratamentos (tampão citrato e boroidro de sódio) para

remoção de excesso dos fixadores teciduais antes da coloração (Melendez-

Ferro et al., 2009). Outros procedimentos, como o Golgi “rápido” e o de Golgi-

72

Kopsch (também chamado Colonnier-Golgi ou Golgi-aldeído), forneceram bons

resultados com tecidos que foram fixados em formaldeído, o qual perdeu sua

capacidade de tamponamento ao longo do tempo, e que foram armazenados

de 15 meses a 55 anos (Rosoklija et al., 2003). Aqui as secções foram obtidas

sem inclusão prévia em plástico polimerizado (Moss & Whetsell, 2004) e a

impregnação não necessitou de aquecimento em micro-ondas por 6-8 h

(Armstrong & Parker, 1986). O presente método também permitiu a observação

de células gliais que puderam ser comparadas à técnica de impregnação com

prata de Golgi-Hortega-Lavilla para tecido cerebral com fixação prolongada

com glutaraldeído e paraformaldeído (D‟amelio, 1983). Ao mesmo tempo, o

método de Golgi “single-section” forneceu dados similares e complementares

para outras técnicas estereológicas, imunocitoquímicas ou imunoistoquímicas e

para a microscopia eletrônica ou confocal (Fairén et al., 1977; Kisvárday et al.,

1990; Hermel et al., 2006; Martinez et al., 2006; Cunningham et al., 2007).

5. CONCLUSÃO

Em conclusão, esta contribuição soma-se às técnicas básicas para o

estudo das células do tecido nervoso humano, mas tem as vantagens do

método de Golgi “single-section” previamente aplicado a outras espécies.

Prefere-se considerá-la um procedimento aberto a contribuições adicionais,

como ocorreu com as descrições originais desse método (Freund & Somogyi,

1983; Gabbot & Somogyi, 1984; Izzo et al., 1987; Bolam, 1992). Uma vez que

esta técnica tem algumas vantagens relevantes para sua execução, esperamos

que seja utilizada e aprimorada de acordo com as necessidades de

experimentos futuros. Algumas adaptações provavelmente se farão

necessárias para que sejam atingidos objetivos específicos de pesquisa,

embora tendo a presente abordagem como um guia.

73

6. AGRADECIMENTOS

Os autores são gratos aos familiares que doaram o tecido que resultou

no presente estudo experimental. Também à Dra. Matilde Achaval

(Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brasil) pelos comentários úteis

recebidos durante o preparo deste artigo. Apoio financeiro da Agência Federal

Brasileira CNPq. JEM e AARF são pesquisadores do CNPq.

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77

LEGENDAS

Figura 1. Imagens microscópicas digitalizadas e reconstruídas em computador

de células do córtex cerebral humano (lobo temporal) e estriado (cabeça do

núcleo caudado) impregnados pela prata após uso de uma adaptação do

método de Golgi “single-section” para tecido fixado em formaldeído, tanto sem

emprego de ósmio (A, o que gerou os piores resultados) como após sua

utilização (B-F), e ao longo de diferentes períodos de processamento

histológico (5-11 dias). Comparada com a população neuronal local estimada,

um pequeno percentual de células foi impregnado nas áreas cerebrais

estudadas. Embora alguns neurônios tenham apresentado dendritos com suas

ramificações, eles ainda apareceram incompletos (B, C). Por outro lado, uma

impregnação mais extensa pôde também ser obtida, revelando a rede axonal

próxima a um neurônio (C) ou a morfologia geral de uma subpopulação

neuronal (D). Astrócitos impregnados pela prata foram encontrados próximos a

vasos sanguíneos (E) com processos terminais em direção a vasos sangüíneos

(“pés-vasculares”) característicos (F). Como regra, um fundo mais claro

permitiu um contraste adequado para o resultado da impregnação celular.

Figura 2. (A) Imagens microscópicas digitalizadas e reconstruídas em

computador de neurônios do núcleo caudado humano impregnados pela prata

após uso de uma adaptação do método de Golgi “single-section” para tecido

fixado em formaldeído. A área selecionada em A (quadro escuro) foi ampliada

para demonstrar detalhes da morfologia neuronal, ou seja, corpo celular,

dendritos e suas ramificações e espinhos dendríticos (B). Observe-se a

presença desses espinhos dendríticos pleomórficos (C) classificados como

finos (t), em forma de cogumelo (m), curtos e grossos (s) ou largos (w).

78

Figura 1.

79

Figura 2.

80

6. ARTIGO CIENTÍFICO EM INGLÊS

______________________________

STUDY ON CELL TYPES AND THE SOMATIC AREA OF NEURONS IN THE

HUMAN MEDIAL AMYGDALA

Denise Ferme1+, Aline Dall‟Oglio2+, Janaína Brusco3, 4, Jorge E. Moreira3,

4, Alberto A. Rasia-Filho1, 2, 5

1 Program in Pathology, Universidade Federal de Ciências da Saúde de

Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil

2 Program in Neuroscience, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,

Porto Alegre, Brazil

3 Program in Neuroscience and Behavior, Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brazil

4 Laboratory of Synaptic Structure, Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto, Universidade de São Paulo, Brazil

5 Department of Basic Sciences / Physiology, Universidade Federal de

Ciências da Saúde de Porto Alegre, Porto Alegre, Brazil

+ These authors contributed equally to this study

Correspondence to: Prof. Alberto A. Rasia-Filho, UFCSPA / Physiology. Rua

Sarmento Leite, 245 (room 308), Porto Alegre RS 90170-050, Brazil. Phone: +

55 51 9116-1643. Fax: + 55 51 3303-8752. E-mail: [email protected]

81

ABSTRACT

The medial nucleus of the human amygdala (Me) is one of the superficial

components of the amygdaloid complex and part of the "extended amygdala".

There are no detailed reports in the literature on the cells that make up this

nucleus in our species, which is relevant to normal conditions and pathological

aspects involving this structure. In this work we studied the cell types and the

area of the soma of neurons present in the Me in both right and left sides using

the thionin technique and an adaptation of the “single-section” Golgi method.

The studied Me neurons had cell bodies showing soma shape of rounded

contour, ovoid, fusiform or multiform and, adjacent to neurons in a satellite

position, somatic features with morphological characteristics identical to normal

glial cells. Dendrites with varying lengths and with spines were also observed.

The neurons of the Me presented different soma sizes, ranging from medium

(around 15 µm at the greatest length) to large (approximately 30 µm at the

greatest lenght) aspects. The mean (± standard deviation) cell body areas of

the neurons in the right Me was 208.5 + 86.1 µm2, while in the left Me it was

215.2 + 92.5 µm2. The minimum and maximum values for the soma areas of the

neurons from the right Me were 38.6 and 549.7 μm and for the left Me were

35.2 and 619.1 μm, respectively. The use of the Golgi technique turned

apparent protoplasmic astrocytes with extensive local branching and basically

two types of multipolar neurons classified as "bitufted" or stellate. These results

suggest a local cellular organization with little morphological variability along the

rostrocaudal axis and reveal some basic features of the neuro-glial composition

of the human Me in both hemispheres.

KEY WORDS: neuronal morphology, glial cells, thionin technique, “single-

section” Golgi method, hemispheric laterality, morphometry.

Running Title: Neurons in the human medial amygdala

82

1.INTRODUCTION

The primate amygdala is a relatively large cluster of gray matter that lies

at the base of the anteromedial temporal lobe, ventrally to the piriform nucleus,

from which it is separated by the basal magnocellular neuronal complex of the

prosencephalon, forming the nucleus basalis of Meynert and associated cell

groups, or the so-called substantia innominata sense ampliori (de Olmos,

2004). The amygdala is not part of the cerebral cortex and is rather a basal

telencephalic subcortical structure. Bundles of axons separate the amygdala

from other elements in the basal prosencephalon, establishing reciprocal

connections of the temporal lobe with the medial and basal telencephalon, the

diencephalon, the pons and spinal cord (Gloor, 1997). The amygdala is a

structure that includes different subnuclei in the temporal lobe, laterally to the

hypotalamus and ventrally to the striatum in the basal prosencephalon,

occupying the caudal floor of the lateral ventricle close to the rostral

hippocampal formation (Alheid et al., 1995; Gloor, 1997; de Olmos, 1999).

Similarly, the human amygdala is located in the medial temporal lobe, near 1

cm from the rostral end of the temporal lobe (Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de

Olmos, 2004).

According to Amaral et al. (1992), some nuclei in the amygdala can be

divided into deep and superficial located ones. For example, the deep nuclei

include the lateral, the basal, the basal accessory and the paralaminar, whereas

the superficial nuclei include the anterior, the medial (Me), the posterior cortical,

the periamigdaloid cortex and the nucleus of the lateral olfactory tract. The

remaining nuclei include the central, the anterior amygdaloid area, the

amygdalohippocampal transition area and the intercalated nuclei. Besides being

a major portion of the amygdala to receive olfactory and vomeronasal signals,

the corticomedial nuclear group occupies a superficial position where the uncus

is represented by the semilunar gyrus and in close association with the

entorhinal sulcus, forming the ventrolateral wall in the sulcus where the optic

tract runs through (Gloor, 1997; Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de Olmos,

2004). It is not surprising that this part of the amygdala was compared to the

periamigdaloid cortex (Rose, 1926, 1927a). The Me is considered part of a

larger group, the extended amygdala (MExA), which also includes the medial

83

sublenticular area and the medial division of the interstitial nucleus of the stria

terminalis (de Olmos, 2004).

However, it was not already described the cellular types present in the

human Me. This is a relevant issue since neurons and glial cells form the basis

of the functional organization of any nervous structure, also yielding relevant

information for both physiological and pathological conditions. That is,

morphological features of the neuronal cell body area, the aspects of primary

dendritic branches and neuronal classification based on these parameters, as

well as the presence and type of dendritic spines are currently unknown for the

human Me. In this study, we used two techniques to study neuronal

morphology, the thionin technique to locate and to study the neuronal

cytoarchitecture and a variant of the Golgi technique originally known as "single-

section Golgi method" to describe cell morphology. This latter is based on the

reaction between chromium and silver potentiated by osmium, which enables

the identification of brain neurons and glial cells. These novel results for the

human Me are described below.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1.Individuals

The criteria for inclusion in this study were arbitrarily determined to

include men aging over 25 years, not deceased from violent cause, previously

healthy relating to their neurological condition, with no previous neurosurgical

intervention, no treatment for any neuropsychiatric disorders, nor presented

infectious disease as the cause of death.

For the thionin technique 5 men were studied, aged 47, 52, 52, 56 and

68 (mean of 55 years-old), who matched the criteria for inclusion and who died

due to complications of cardiovascular diseases For the “single-section" Golgi

method 2 men we studied according to the including criteria, aged 47 and 68

years-old and that died due to worsening of congestive heart failure or

myocardial infarction, respectively. Parts of the bilateral temporal lobes were

obtained during necropsies at the Department of Forensic Medicine of the

84

Instituto Geral de Perícias (Rio Grande do Sul, Brazil). No perfusion procedure

or use of fixation solutions were employed before the removal of the tissue. The

time interval between death and necropsy ranged from a minimum of 6 hours

(in accordance to Brazilian laws) to a maximum of 8 hours. Clinical data and

information regarding previous comorbidities were obtained by direct interviews

with family members or legal representatives, who also signed a detailed

consentment form. Each necropsy received a code to protect the individual

identification, including medical and legal information obtained. All ethical and

legal procedures were followed according to international regulatory standards

(based on the Helsinki Declaration of 1964), in addition to the approval of the

Ethics Committees of the Departamento de Medicina Legal (State of Rio

Grande do Sul, process number 03/08), the Universidade Federal de Ciências

da Saúde de Porto Alegre (process number 541/07), and the Universidade

Federal do Rio Grande do Sul (processo number 20080/09).

2.2 The thionin technique and morphometric measures

Bilateral blocks containing the temporal lobe (approximately 5 cm away

from its rostral pole) were immediately immersed in 10% unbuffered

formaldehyde solution and stored in this same fixative solution along

approximately 20 months. From the original tissue block, small samples of

approximately 1.5 cm3 were removed from the medial and ventral temporal

cortex, using as anatomical references the parahippocampal formation, the

entorhinal sulcus and the optic tract (DeArmond et al., 1989; Figure 1). Both left

and right hemispheres were studied. Tissue samples were sectioned (coronal

sections of 50 and 200 μm thick, at a ratio of 4 slices to 1 slice cut in this order)

using a vibratome (Leica, Germany). The thinner sections were used for the

thionin technique, which produces results identical to those of the Nissl

technique and serves for to stain the rough endoplasmic reticulum and

polyribosomes in the cytoplasm of the cell body and proximal dendritic

branches. The thicker sections were used for the “single-section” Golgi method,

as depicted below.

The sections were placed on slides coated with gelatin and left to dry at

room temperature (RT) for 24 h. These slides were then dipped in a solution

85

containing 4% paraformaldehyde diluted in 0.2 M phosphate buffer solution

(PBS, pH 7.4), where they were left for 7 days under refrigeration (4°C) and

protected from light. After this period, they were left to dry for 24 hours at RT

and were placed in a 70% alcohol solution for 24 more h. Staining involved the

following subsequent steps: immersion in solutions of increasing concentration

of alcohol (95% and 100% for 3 min each); diaphanization in absolute xylene

for 3 min once, which was followed by an increasing period of 30 min.

Immersion in solutions of decreasing alcohol concentration (100, 95, 70 and

50% for 2 min each); washing in distilled water; immersion in a solution of

0.25% thionin for 3 min, removal of excess staining with distilled water, and

immersion in solutions of increasing concentration of alcohol (50, 70 and 95%

for 2 min each), immersion in a solution of 95% alcohol with acetic acid 1%,

immersion in a solution of 95% alcohol to remove the excess of acetic acid, and

in absolute alcohol 1 min each, another diaphanization time with absolute

xylene for 2 min and, afterwards, for 30 to 60 min, and, finally, mounting of the

slides with synthetic balsam and coverslips.

From each cerebral hemisphere, 9 serial sampling sections were studied

from the rostral to the caudal Me. Once identified the Me, 3 representative

images were obtained from each section under light microscopy (400 X,

Olympus BX -41, Japan). Each image was recorded on a computer and

subsequently analyzed for the neuronal soma measurements. In this regard,

each neuronal soma should have visible and sharp edges that would allow the

measuring of the corresponding area in the image obtained (Figure 2). A total of

523 cell bodies were measured on the right Me and 590 cell bodies on the right

side using the software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA).

2.3. The “single-section” Golgi technique

The use of the “single-section” Golgi technique followed the

methodological steps depicted in the companion article of this work. That is,

coronal slices of the Me of both hemispheres and with 200 μm in thickness were

submitted to post-fixation with 4% paraformaldehyde and 1.5% picric acid in

PBS (0.1 M, pH = 7.4) for 24 h or 72 h, protected from light and at 4°C.

Afterwards, the sections were quickly rinsed in PBS, transferred to a solution of

86

0.02% osmium tetroxide in PBS from 10 to 30 minutes under gentle agitation

and protected from light, washed again in PBS for 1 to 2 minutes, immersed in

3% potassium dichromate (Merck, Germany) dissolved in deionized water, and

kept in the same solution in the dark at 4°C for 24 h or 72h. Brain sections were

washed again in distilled water and were "sandwiched" between coverslips, in

which epoxy glue was placed at the four corners to allow a low rate of diffusion

of the impregnation solution. Then, the slides were carefully placed in a solution

of 1.5% silver nitrate (Merck, Germany) diluted in deionized water at RT and in

the dark for 24 h or 72 h. The coverslips were broken, the sections were

removed, washed in distilled water and a soft brush served to remove

unspecific crystals on the slices. Finally, the sections were placed on slides,

dried at RT, immersed in distilled water (3 minutes, once), dehydrated in

ascending series of alcohol (70% and 80% once, 3 minutes each; 95% and

100% twice, 3 minutes each), cleared in a solution of xylene/absolute alcohol

1:1 and 2:1 (3 minutes, once) and 100% xylene (twice, 3 to 6 minutes each),

covered with non-acid synthetic balsam and coverslips and left to dry at RT for

24 h.

2.4. Me location and imaging

The location of the Me in left and right brain hemispheres followed the

previous descriptions and recommendations found in the literature (Gloor, 1997;

Sorvari, 1997; de Olmos, 2004) and, as noted in this study, coincided with the

description provided by Mai et al. (2008). For this reason, an overlapping of

sequential images as those obtained in that atlas that shows the Me location in

the human brain is presented in Figure 1. Images and measures were done

employing a Nikon Eclipse E-600 optic microscope (400 X, Japan) coupled to a

Pro-Series High Performance CCD camera. The sum of the stacking

photomicrographs provided the final images by using the software Image-Pro

Plus 6.0 (Media Cybernetics, USA). Small adjustments of borders, brightness

and background contrast were done using the Adobe Photoshop 7.0 software

(USA).

87

3. RESULTS

The results obtained with the thionin technique showed suitable and

homogeneous cellular staining along the rostrocaudal length of the human Me.

In both hemispheres were observed neurons whose cell bodies had well-

defined cytoplasm, soma shape of rounded contour, ovoid, fusiform or multiform

(these latter according to the number of primary dendritic branches emerging

from the soma), large and vesicular nuclei, with smooth chromatin and an

evident nucleolus (Figure 3). Forming a continuum of different sizes of cell

bodies, these neurons showed primary dendrites that allowed their classification

as "bitufted" (with two primary dendrites emerging from the cell body) or stellate

ones (with three or more dendrites emerging from the neuronal soma). No cell

bodies were recognized with an evident pyramidal aspect. In a rather satellite

position, many evident nuclei with little adjacent cytoplasm and with denser

chromatin were also observed, being recognized as the classical description for

normal glial cells (Figure 3). The neuropil proved to be homogeneous, with the

presence of blood vessels and their endothelial cells.

The neurons of the human Me on both sides showed various soma sizes,

ranging from medium (around 15 µm at greatest length) to large (approximately

30 µm at greatest length; Figure 3) values. The mean (± standard deviation)

somatic area of the neurons in the right Me was 208.5 ± 86.1 µm2, while in the

left Me it was 215.2 ± 92.5 µm2. The minimum and maximum values for the

soma of the neurons in the right Me were 38.6 and 549.7 μm and in the left Me

were 35.2 and 619.1 μm, respectively.

Inherent to the Golgi technique, a small percentage of neurons and glial

cells were observed in the human Me (Figure 4). When successfully

impregnated, protoplasmic astrocytes could be identified with extensive local

branching characterized by delicate and thin extensions, some of them adjacent

to blood vessels (Figure 4A). Also, isolated neurons with dendritic branches of

varying lengths (Figure 4B) were observed stained brown or black constrasting

against a light yellow background with few unspecific precipitation in their

surroundings. Basically two types of multipolar neurons were observed in the

studied sections, confirming the images obtained by the thionin technique.

Again, the corresponding morphological descriptions allowed the neuronal

88

classification as ¨bitufted or stellate cells. From the cell bodies, emerging

primary dendrites protruded in different directions and then branched

accordingly (Figure 4B). Pleomorphic spines were also observed covering

different dendritic branches (Figure 4C). These spines seemed to be rather of

small size, with a stubby and/or thin shape, and whose heads were not bulky.

4. DISCUSSION

The present findings indicate that the human Me is composed by

neurons of medium to large size with cell bodies that allowed their classification

as multipolar neurons with a bitufted or a stellate appearance. There were no

neurons with a pyramidal aspect that could allow the identification of a local

cortical-like organization. When properly impregnated, the neurons observed

showed dendritic branches of varying length. Astrocytes with a general aspect

as protoplasmic ones were also impregnated in the human Me.

It is interesting to note that the description of the neurons from the human

Me is coincident with that already reported in rats (Rasia-Filho et al., 1999,

2004; Dall'Oglio et al., 2008a, b). In these two species, there is no evidence for

a cortical organization in the Me (Marcuzzo et al., 2007). Likewise, the presence

of protoplasmic astrocytes with long and thin branches was described in the Me

of rats (Rasia-Filho et al., 2002, Martinez et al., 2006). Altogether, these data

suggest an homology and/or phylogenetic conservation on the cellular types

that compose the Me. In effect, the basic morphological organization of the

amygdala is the same in all mammals, but the main changes that occur

phylogenetically toward the primates, specially humans, are the increases in the

size of the proportional volume of the cortico-basolateral nucleus in contrast to

what occurs in the medial-central group (Sorvari, 1997; Gloor, 1997).

It seems clear that in both right and left hemispheres, neurons show cell

body area with values close to each other. This is especially relevant because it

may suggest that laterality effects on morphology and/or functioning of the

human Me (Kandel et al., 2000) do not involve the soma area as their main

determinant. Similarly, the volume of the cell body did not show inter-

hemispheric differences in the posterior Me in rats (Hermel et al., 2006). In

89

addition, it could not be found striking differences in the general appearance or

other apparent morphological features in the cell bodies along the rostrocaudal

axis of the human Me. De Olmos (2004) had divided the Me in a anterior and a

posterior part according to citoarchitectonic criteria. Based solely on the

neuronal soma area, it does not serve as the neuronal morphological parameter

to support such a division.

The number of neurons and glial cells can be estimated by stereological

technique based on the results obtained with the thionin technique, the

description of the Me cell types, and the possibility of establishing the ultimate

borders for this nucleus (Mai et al., 2008). This is one future implication for the

present data. Another perspective is to compare and complement the images

obtained by impregnation of astrocytes with the results of an

immunohistochemical technique for glial fibrillary acidic protein (GFAP). Also,

silver impregnated neurons can be useful to associate the Golgi technique with

ultrastructural studies (adapting the technique described by Bolam, 1992).

Regarding the Golgi method employed here, some additional comments

are necessary. As with other techniques, it has advantages and limitations. The

Golgi method originally named "single-section" (without the use of osmium) and

its further adaptation by Izzo et al. (1987) and Bolam (1992) is another

technique that can be used to study the morphology of cells in the brain of

human beings. One of its advantages is that it can be applied to human tissue

fixed in formaldehyde and stored for a long time, allowing the study of neurons

and glial cells in brain samples kept in simple and routine fixative solutions.

When suitable results are obtained, the Golgi method reveals the different types

of neurons that constitute a brain area and their general morphology, which can

indicate relevant relationships between shape and neuronal function (Wooley &

McEwen, 1994; Dall'Oglio et al., 2008a, b; Larriva-Sahd, 2008, Gómez-

Villalobos et al., 2009; Rasia-Filho et al., 2009). On the other hand, one of the

Golgi method drawbacks is the unpredictable number of neurons that will

became properly impregnated and that can be studied in details, besides the

non-homogeneous cellular impregnation in each brain section.

Here, a small number of cases was studied, and in each one, a small

number of neurons could be observed. The best result for the neuronal

impregnation is shown in Figure 4. This indicates that new experiments are

90

needed to support the conclusions about the cell types that compose the Me

along its rostrocaudal location. Nevertheless, the results are consistent with the

morphology of neurons revealed by the thionin technique, indicating that some

random Golgi-impregnated neurons representative of the Me could already be

observed. The dendritic spines, an important neuronal component that can

increase the synaptic surface, are relevant for post-synaptic response and

plastic responses (Oertner &; Matus, 2005, Tada & Sheng, 2006), an initial but

insufficient amount of data was obtained in this study. These dendritic spines

appeared to have rather stubby or thin shapes. If this observation can be

confirmed, this may suggest that dendritic spines in the human Me belong to

less dynamic/plastic types than the mushroom-like ones (Peters, Kaiserman-

Abramof, 1970, Peters et al, 1991, Hering, Sheng, 2001, González-Burgos,

2004). Although electrophysiological studies are needed to clarify this issue,

they run into serious ethical restrictions and/or technical difficulties for obtaining

living tissue during neurosurgical procedures for removal of tissue with

epileptogenic features that commonly occur in the temporal lobe, for example.

In conclusion, these results suggest that the human Me has multipolar

neurons with cell bodies of medium to large sizes that, at principle, suggest a

local cellular organization with little morphological variability in both

hemispheres and along its rostrocaudal axis. These initial and novel data serve

to direct future efforts involving other methodologies in order to reveal the

neuro-glial components for the functioning of the human Me, as was done for

other species.

5. ACKNOWLEDGMENTS

The authors are thankful to the relatives who donated the tissue samples

that resulted in this experimental study. Grants from the Brazilian Agency

CNPq. JEM and AARF are CNPq researchers.

91

6. REFERENCES

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94

LEGENDS

Figure 1. Schematic representation of the human left cerebral

hemisphere and the location of the medial nucleus of the amygdala (filled with

black) along the rostrocaudal axis (anterior images above, posterior ones below

in the figure). Values in the right correspond to the scale presented in the atlas

of Mai et al. (2008), from which these images were obtained and adapted,

referenced to the section plan used in this same atlas (behind the anterior pole

of the temporal lobe and before the hypothalamic mammillary bodies). Ot =

optic tract.

Figure 2. Digitized microscopic image of the neurons in the human

medial amygdala stained with the thionin technique. From this sort of image the

area of the cell body were measured, bounded by closed lines on its border,

and emplying a software for morphometry (Image-Pro Plus 6.0, Media

Cybernetics, USA).

Figure 3. Digitized microscopic images of cells in the medial nucleus of

the human amygdala stained by the thionin technique. (A-B) Cell bodies of

larger size and with histological features that allowed their classification as

neurons with different shapes and with two or more primary dendrites. Cell

bodies in perineuronal position, with more intense staining of the nucleus and

without nucleolus apparently correspond to local glial cells. (C) Polymorphic cell

bodies with primary dendrites corresponding to stellate neurons. (D) Evident cell

body with two primary dendritic extensions corresponding to a bitufted neuron.

The same scale in (D) can be applied to all images.

Figure 4. Digitized and reconstructed microscopic images of the human

medial nucleus after the use of an adaptation of the "single-section" Golgi

method. Compared to the local neuronal population observed by the technique

of thionin, a small percentage of cells resulted impregnated. Protoplasmic

astrocytes became visible, some of them close to blood vessels (A). A notable

multipolar neuron of the stellate type is shown in (B), whose insert box was

placed in greater amplification in (C) to observe the presence of pleomorphic

95

dendritic spines. As a rule, a lighter background allowed an appropriate contrast

to the result of the cellular impregnation.

96

Figure 1.

97

Figure 2.

98

Figure 3.

99

Figure 4.

100

7. ARTIGO CIENTÍFICO EM PORTUGUÊS

______________________________

ESTUDO SOBRE OS TIPOS CELULARES E A ÁREA SOMÁTICA DE

NEURÔNIOS NA AMÍGDALA MEDIAL DE SERES HUMANOS

Denise Ferme1+, Aline Dall‟Oglio2+, Janaína Brusco3,4, Jorge E. Moreira3,4,

Alberto A. Rasia-Filho1, 2, 5

1 Programa de Pós-Graduação em Patologia, Universidade Federal de Ciências

da Saúde, Porto Alegre, Brasil

2 Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Universidade Federal do Rio

Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil

3 Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Comportamento, Faculdade

de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Brasil

4 Laboratório de Estrutura Sináptica, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

Universidade de São Paulo, Brasil

5 Departamento de Ciências Básicas/Fisiologia, Universidade Federal de

Ciências da Saúde, Porto Alegre, Brasil

+ Esses autores contribuíram igualmente para o presente estudo

Endereço para correspondência: Prof. Alberto A. Rasia-Filho, UFCSPA /

Fisiologia. Rua Sarmento Leite, 245 (sala 308), Porto Alegre 90170-050 RS,

Brasil. Fone: + 55 51 9116-1643. Fax: + 55 51 3303-8752. E-mail:

[email protected]

101


RESUMO

O núcleo medial da amígdala (Me) humana é um dos componentes

superficiais do complexo amigdaliano, parte da “amígdala estendida”. Não há

relatos detalhados na literatura sobre as células que compõem este núcleo na

nossa espécie, o que é relevante para o funcionamento normal e para quadros

patológicos que envolvem esta estrutura. No presente trabalho foram

estudados os tipos celulares e a área do soma neuronal presentes no Me dos

lados direito e esquerdo utilizando-se a técnica da tionina e uma adaptação da

técnica de Golgi de tipo “single-section”. Foram observados neurônios cujos

corpos celulares apresentavam formato do soma com contorno arredondado,

ovoide, fusiforme ou multiforme e, adjacentes aos neurônios e em posição

satélite, somas e núcleos com características morfológicas idênticas a células

gliais normais. Dendritos com comprimentos variados e com espinhos foram

igualmente observados. Os neurônios do Me apresentaram-se com tamanhos

do soma diversos, variando desde médios (em torno de 15 μm no maior

comprimento) a grandes (aproximadamente 30 μm no maior comprimento). A

média (+ desvio padrão) da área do soma dos neurônios do Me direito foi de

208,5 + 86,1 μm2 enquanto no Me esquerdo foi de 215,2 + 92,5 μm2. Os

valores mínimo e máximo para as áreas do soma dos neurônios do Me direito

foram de 38,6 e 549,7 μm e no Me esquerdo foram de 35,2 e 619,1 μm,

respectivamente. Pela técnica de Golgi evidenciaram-se astrócitos

protoplasmáticos com extensa ramificação local e basicamente dois tipos de

neurônios multipolares classificados como “bitufted” e estrelados. Os presentes

resultados sugerem uma organização celular local com pouca variabilidade

morfológica ao longo do eixo rostrocaudal, apresentando algumas

características básicas da composição neuroglial do Me humano AM ambos os

hemisférios.

PALAVRAS-CHAVE: morfologia neuronal, células gliais, técnica da tionina,

método de Golgi, lateralidade hemisférica, morfometria.

Título abreviado: Neurônios da amígdala medial humana

102

1. INTRODUÇÃO

A amígdala dos primatas é um conglomerado relativamente grande de

substância cinzenta que se encontra na base do lobo temporal anteromedial de

forma ventral ao núcleo piriforme, do qual é separado pelo complexo neuronal

magnocelular basal do prosencéfalo, constituindo o núcleo basal de Meynert e

grupos celulares relacionados, ou a chamada substantia innominata sensu

ampliori (de Olmos, 2004). A amígdala não faz parte do córtex cerebral, mas é

uma estrutura telencefálica basal subcortical. Feixes de axônios separam-na

dos demais elementos do prosencéfalo basal, ao mesmo tempo em que

estabelecem conexões recíprocas do lobo temporal com o telencéfalo basal e

medial, o diencéfalo, a ponte e a medula espinal (Gloor, 1997). A amígdala é

uma estrutura que compreende subnúcleos situados no lobo temporal, lateral

ao hipotálamo e ventral ao estriado no prosencéfalo basal, que ocupa a porção

caudal do assoalho do ventrículo lateral e que se localiza na porção terminal e

rostral da formação hipocampal (Alheid et al., 1995; Gloor, 1997; de Olmos,

1999). Identicamente, a amígdala humana está localizada no lobo temporal

medial, a aproximadamente 1 cm da extremidade rostral do lobo temporal

(Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de Olmos, 2004).

De acordo com Amaral et al. (1992), alguns núcleos da amígdala podem

ser dividida em núcleos profundos, superficiais e os restantes. Os núcleos

profundos incluem o lateral, o basal, o basal acessório e o paralaminar; os

núcleos superficiais incluem o anterior, o medial (Me), o cortical posterior, o

córtex periamigdaloide e o núcleo do trato olfatório lateral. Os demais núcleos

incluem o central, a área amigdaloide anterior, a área de transição amígdalo-

hipocampal e os núcleos intercalados. Além de ser uma porção principal da

amígdala para receber sinais olfatórios e vomeronasais, o grupo de núcleos

corticomediais ocupa uma posição superficial onde o úncus é representado

pelo giro semilunar e muito próximo do sulco entorrinal, formando a parede

ventrolateral da fenda entre a amígdala e o trato óptico assim que este entra

nesse sulco (Gloor, 1997; Sorvari, 1997; Mai et al., 2008; de Olmos, 2004).

Assim, não surpreende que essa parte da amígdala tenha sido comparada ao

córtex periamigdalóide (Rose, 1926, 1927a). O Me é considerado parte de um

grupo nuclear maior, a amígdala estendida (MExA), e que também compreende

103

a região sublenticular medial e a divisão medial do núcleo intersticial da estria

terminal (de Olmos, 2004).

Não obstante, não estão ainda descritos quais os tipos celulares

presentes no Me de seres humanos. Isso é assunto relevante, uma vez que

neurônios, juntamente com as células da glia, formam a base da organização

funcional de qualquer estrutura nervosa, também fornecendo importante

informação tanto em condição fisiológica como para quadros patológicos

diversos. Ou seja, detalhes morfológicos da área do soma neuronal, aspecto

dos ramos dendríticos primários e classificação neuronal baseada nesses

parâmetros, além da presença e do tipo dos espinhos dendríticos, ainda não

são conhecidos para a Me de seres humanos. No presente trabalho foram

utilizadas duas técnicas para estudo da morfologia neuronal, a da tionina para

localização e estudo da citoarquitetura neuronal e uma variante da técnica de

Golgi originalmente nomeada “single-section Golgi method” para a descrição da

morfologia celular. Esta se baseia na reação entre o cromo e a prata,

intensificada pelo ósmio, e que permite a identificação dos neurônios e de

células da glia. Os primeiros resultados, ainda inéditos, para o Me de seres

humanos são descritos a seguir.

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Indivíduos

Inicialmente, os critérios para inclusão neste estudo foram

arbitrariamente determinados e incluíam homens, com idade acima de 25 anos,

não terem sofrido morte violenta, terem sido previamente hígidos quanto à

condição neurológica bem como inexistência de intervenção cirúrgica

neurológica prévia, não ter estado sob tratamento para transtornos

neuropsiquiátricos nem ter apresentado doença infecto-contagiosa como causa

mortis.

Para o desenvolvimento da técnica da tionina foram estudados cinco

homens, com idades de 47, 52, 52, 56 e 68 anos (média = 55 anos), que se

enquadravam nos critérios de inclusão e que vieram a falecer devido a doenças

104

cardiovasculares. Para a técnica de Golgi de tipo “single-section” foram

estudados dois homens, com idades de 47 e 68 anos, que igualmente estavam

dentro dos critérios de inclusão deste trabalho e que faleceram por causa de

agravamento de insuficiência cardíaca congestiva e por infarto do miocárdio,

respectivamente. Partes dos lobos temporais bilaterais foram obtidas durante

as necropsias no Departamento de Medicina Legal do Instituto Geral de

Perícias (Estado do Rio Grande do Sul, Brasil). Nenhuma solução de fixação

ou perfusão foi utilizada antes da remoção do tecido. O intervalo entre a morte

e a necropsia variou do mínimo de 6 horas (de acordo com a legislação

brasileira) até no máximo 8 horas. Dados clínicos e de comorbidades prévios

foram obtidos por meio de entrevista dirigida a familiares ou representantes

legais, os quais também assinaram um termo de consentimento livre e

esclarecido. Cada perícia recebeu código para proteção de identificação, em

especial das informações médico-legais. Todos os procedimentos éticos e

legais foram seguidos de acordo com os padrões regulatórios internacionais

(baseados na Declaração de Helsinki de 1964), além da aprovação dos

Comitês de Ética do Departamento de Medicina Legal do Estado do Rio

Grande do Sul (processo nº 03/08), da Universidade Federal de Ciências da

Saúde de Porto Alegre (processo nº 541/07) e da Universidade Federal do Rio

Grande do Sul (processo nº 2008009).

2.2. Emprego da técnica de tionina e medida morfométrica

Blocos contendo o lobo temporal (aproximadamente 5 cm de distância a

partir do seu polo anterior) bilateral foram imediatamente imersos em

formaldeído 10% não tamponado e mantidos armazenados nessa mesma

solução de fixação por aproximadamente 20 meses. Do bloco original,

pequenas amostras com aproximadamente 1,5 cm3 foram retiradas onde

estavam as porções medial e ventral do córtex temporal, tomando-se como

referencial a formação parahipocampal, o sulco entorrinal e o trato óptico

(DeArmond et al., 1989). Ambos os hemisférios direito e esquerdo foram

selecionados para estudo. As amostras de tecido foram seccionadas (cortes

coronais alternados de 50 e 200 µm de espessura, na proporção de 4 cortes

para 1 corte, nesta ordem) utilizando-se um vibrátomo (Leica, Alemanha). Os

105

cortes de menor espessura foram destinados à técnica da tionina, a qual gera

resultados idênticos àqueles da técnica de Nissl e serve para identificação por

coloração azulada da localização do retículo endoplasmático rugoso e de

polirribossomos no citoplasma do corpo celular e de ramos dendríticos

proximais. As secções mais espessas foram utilizadas para o método de Golgi

“single-section”, conforme descrito a seguir.

Os cortes obtidos foram colocados em lâminas histológicas cobertas

com gelatina e deixados para secagem à temperatura ambiente por 24 h. Tais

lâminas foram então mergulhadas em solução contendo paraformaldeído a 4%

diluído em tampão fosfato 0,2 M (pH = 7,4), onde foram deixadas por 7 dias

sob refrigeração (4oC) e ao abrigo da luz. Após esse período, foram retiradas

da solução e deixadas para secar por 24 h à temperatura ambiente (TA), tendo

sido colocadas a seguir em álcool 70% por mais 24 h. A coloração envolveu as

seguintes etapas subsequentes: imersão em soluções de concentração

crescente de álcool (95% ((I e II)) e 100% ((I e II)) por 3 min. cada);

diafanização em xilol absoluto por 3 min. uma vez; imersão em soluções de

concentração decrescente de álcool (100, 95, 70 e 50% por 2 min. cada);

lavagem com água destilada; imersão em tionina 0,25% (por 3 min.) e retirada

de excesso de corante com água destilada; imersão em soluções de

concentração crescente de álcool (50, 70 e 95% por 2 min. cada); imersão em

uma solução de álcool 95% com ácido acético 1%; imersão em álcool 95%

para retirada do excesso de ácido acético, e 100% 1 min. cada; nova

diafanização com xilol absoluto por 2 min. e, a seguir, por 30 a 60 min. e, por

fim, montagem das lâminas com bálsamo sintético e lamínulas.

De cada hemisfério cerebral foram estudadas 9 secções obtidas por

amostragem uniforme desde a parte anterior do Me até sua parte posterior.

Uma vez localizado o Me, foram obtidas 3 imagens de cada secção (400 x,

Olympus BX -41, Japão). Cada imagem era gravada em computador e

posteriormente analisada quanto às medidas do soma neuronal. Para tanto,

cada soma neuronal deveria ter seus bordos visíveis e nítidos para que fosse

medida a área correspondente na imagem obtida (Figura 2). Um total de 523

corpos celulares foram medidos no Me do lado direito e 590 corpos celulares

no Me do lado esquerdo, utilizando-se o software Image-Pro Plus 6.0 (Media

Cybernetics, EUA).

106

2.3. A técnica de Golgi “single-section”

O emprego da técnica de Golgi de tipo “single-section” seguiu a

descrição do método apresentado em artigo anterior. Ou seja, cortes coronais

do Me de ambos os hemisférios e com 200 µm de espessura foram submetidos

a pós-fixação com paraformaldeído 4% e ácido pícrico 1,5% em solução de

tampão fosfato (PBS) 0,1 M (pH = 7,4) por 24 h ou 72 h, protegidas da luz e a

4°C. A seguir, as secções foram rapidamente lavadas em PBS, transferidas

para uma solução de tetróxido de ósmio 0,02% em PBS entre 10 a 30 minutos

com agitação suave e protegidas da luz, novamente lavadas com PBS por 1 a

2 minutos e foram imersas em dicromato de potássio 3% (Merck, Alemanha)

dissolvido em água deionizada e mantidas na mesma solução, no escuro, a

4°C por 24 h ou 72 h. Após, as secções foram novamente lavadas com água

destilada e delas foram feitos “sanduíches” entre lamínulas de vidro, nos quais

foi colocada cola epóxi nos quatro cantos para permitir uma pequena

velocidade de difusão da próxima solução a ser empregada. As lâminas foram

cuidadosamente colocadas em uma solução de nitrato de prata 1,5% (Merck,

Alemanha) diluído em água deionizada, à TA e no escuro por 24 h ou 72 h. As

lamínulas foram então quebradas, as secções foram removidas, lavadas em

água destilada e, para remoção de cristais sobre os cortes, utilizou-se um

pincel macio. Finalmente, os cortes foram colocados em lâminas, secos à

temperatura ambiente, imersos em água destilada (3 minutos, uma única vez),

desidratados em séries ascendentes de álcool (70% e 80%, uma vez, 3

minutos cada; 95% e 100%, duas vezes, 3 minutos cada), diafanizados em

solução de xilol/álcool absoluto 1:1 e 2:1 (3 minutos, uma vez) e xilol 100% (2

vezes de 3 a 6 minutos cada), acrescentado bálsamo sintético não ácido e

lamínulas, e deixados para secagem à temperatura ambiente por 24 h.

2.4. Localização do Me e obtenção de imagens

A localização do Me nos hemisférios cerebrais direito e esquerdo seguiu

as descrições prévias e as recomendações encontradas na literatura (Gloor,

107

1997; Sorvari, 1997; de Olmos, 2004) e, como observado no presente estudo,

coincidiram com a descrição apresentada por Mai et al. (2008). Por esta razão

uma sobreposição de imagens sequenciais como obtidas nesse atlas e

demonstrando sua localização no encéfalo humano está apresentada na Figura

1. Imagens e as medidas foram processadas utilizando um microscópio Nikon

Eclipse E-600 (400 X, Japão) acoplado a uma câmara Pro-Series High

Performance CCD. O somatório das sequências de fotomicrografias forneceu a

imagem final utilizando-se o software Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics,

EUA). Pequenos ajustes de bordo, brilho ou contraste de fundo foram obtidos

utilizando-se o software Adobe Photoshop 7.0 (EUA).

3. RESULTADOS

Os resultados da técnica de tionina evidenciaram coloração celular

adequada e homogênea ao longo do comprimento rostrocaudal do Me humano.

Em ambos os hemisférios cerebrais foram observados neurônios cujos corpos

celulares apresentavam citoplasma bem delimitado, formato do soma com

contorno arredondado, ovoide, fusiforme ou multiforme ( estes de acordo com o

número de ramos dendríticos primários surgindo do soma), núcleos grandes e

vesiculares, com cromatina frouxa e nucléolo evidente (Figura 3). Como que

formando um continuum de tamanhos diferentes do corpo celular, esses

neurônios apresentaram-se com dendritos primários que permitem a

classificação como sendo de tipos “bitufted” (com dois dendritos primários

surgindo do corpo celular) ou estrelados (com três ou mais dendritos surgindo

do soma neuronal). Não foram reconhecidos corpos celulares com aspecto

piramidal evidente. Em posição satélite, vários núcleos evidentes com pouco

citoplasma adjacente e com cromatina mais densa foram igualmente

observados e reconhecidos como classicamente descritos para células gliais

normais (Figura 3). O neurópilo mostrou-se homogêneo e com a presença de

vasos sanguíneos e suas células endoteliais.

Os neurônios do Me humano de ambos os lados apresentaram-se com

tamanhos do soma diversos, variando desde médios (em torno de 15 μm no

maior comprimento) a grandes (aproximadamente 30 μm no maior

108

comprimento; Figura 3). A média (+ desvio padrão) da área do soma dos

neurônios do Me direito foi de 208,5 + 86,1 μm2, enquanto no Me esquerdo foi

de 215,2 + 92,5 μm2. Os valores mínimo e máximo para as áreas do soma dos

neurônios do Me direito foram de 38,6 e 549,7 μm e no Me esquerdo foram de

35,2 e 619,1 μm, respectivamente.

Inerente à técnica de Golgi, um pequeno percentual de neurônios e

células gliais foram observados no Me humano (Figura 4). Quando bem

impregnados, foi possível identificar astrócitos protoplasmáticos com extensa

ramificação local, caracterizada por prolongamentos delicados e finos, alguns

deles na adjacência de vasos sanguíneos (Figura 4A), e neurônios isolados

com ramos dendríticos com comprimentos variados (Figura 4B) corados de

pardo ou preto contra um fundo amarelo claro e com pouca precipitação

inespecífica em seu entorno. Basicamente dois tipos de neurônios multipolares

puderam ser observados nessas secções, confirmando as imagens obtidas

pela técnica da tionina, e que correspondem às descrições morfológicas que

permitem a classificação como sendo de tipos “bitufted” ou estrelados. Desses

corpos celulares, dendritos primários emergentes se projetavam em diferentes

direções e se ramificavam a seguir (Figura 4B). Espinhos dendríticos

pleomórficos foram igualmente identificados (Figura 4C). Tais espinhos

pareceram ser preferentemente de pequeno tamanho, de aspecto arredondado

e/ou fino, com cabeças não muito volumosas.

4. DISCUSSÃO

Os presentes achados indicam que o Me de seres humanos apresenta

neurônios de tamanho médio a grande com corpos celulares que permitem sua

classificação como de neurônios multipolares, com aspecto “bitufted” ou

estrelados. Não foram observados neurônios com aspecto piramidal que

pudessem ser claramente relacionados com uma morfologia neuronal ou com

uma organização cortical local. Quando bem impregnados, os neurônios

observados apresentaram-se com ramos dendríticos com comprimento

variado. Astrócitos com aspecto que permite a classificação como de tipo

protoplasmático foram igualmente impregnados no Me humano.

109

É interessante notar que a descrição feita para os neurônios do Me em

nossa espécie é coincidente com aquela já elaborada em detalhes para ratos

(Rasia-Filho et al., 1999, 2004; Dall‟Oglio et al., 2008a,b). Nessas duas

espécies, não há evidência de uma organização cortical no Me (Marcuzzo et

al., 2007). Da mesma forma, a presença de astrócitos protoplasmáticos com

extensa e fina ramificação já foi descrita no Me de ratos (Rasia-Filho et al.,

2002; Martinez et al., 2006). Isto pode sugerir que, a princípio, há alguma

homologia e/ou conservação filogenética quanto aos tipos celulares que

compõem o Me, tomando-se o rato como modelo mais estudado até o

momento. De fato, a organização morfológica básica da amígdala é a mesma

em todos os mamíferos, porém as principais mudanças que ocorrem

filogeneticamente em direção aos primatas, especialmente aos humanos, são

os aumentos no tamanho do volume proporcional do núcleo córtico-basolateral

em contraste com o que ocorre no grupo centro-medial (Sorvari, 1997; Gloor,

1997).

Parece claro que tanto no hemisfério direito como no hemisfério

esquerdo os neurônios apresentam área do corpo celular com valores próximos

entre si. Esse é um fato relevante porque pode sugerir que efeitos de

lateralidade na morfologia e/ou funcionamento do Me humano (Kandel et al.,

2000) não têm na área do soma seu principal determinante. Similarmente, em

ratos o volume do corpo celular não apresenta diferenças inter-hemisféricas na

parte posterior do Me (Hermel et al., 2006). Aparentemente, tampouco

puderam ser encontradas diferenças notáveis quanto ao aspecto ou à

morfologia geral dos corpos celulares ao longo do eixo rostrocaudal do Me

humano. De Olmos (2004) havia dividido o Me em uma parte anterior e outra

posterior de acordo com critérios citoarquitetônicos. Baseado unicamente na

área do soma neuronal, isso não serve como parâmetro morfológico para dar

suporte a esta divisão.

O número de neurônios e células gliais pode ser estimado por técnica

estereológica baseada nos resultados obtidos pela técnica da tionina, pela

descrição dos tipos celulares do Me e pela possibilidade de serem

estaqbelecidos os limites externos desse núcleo (Mai et al., 2008). Essa é uma

implicação futura para os dados atuais. Outra perspectiva é a comparação e a

complementação das imagens obtidas pela impregnação de astrócitos com os

110

resultados de técnica imunohistoquímica para a proteína ácida fibrilar glial

(GFAP). Também neurônios impregnados pela prata no Me podem ser úteis

para associar a técnica de Golgi com estudos ultraestruturais (adaptando

técnica descrita por Bolam, 1992).

Com relação ao método de Golgi empregado aqui, alguns comentários

se fazem necessários. Assim como outras técnicas, ele apresenta vantagens e

restrições. O método de Golgi denominado originalmente de “single-section”

(sem ósmio) e sua adaptação segundo Izzo et al. (1987) e Bolam (1992)

representa outra técnica que pode ser empregada para o estudo da morfologia

das células do encéfalo de seres humanos. Uma de suas vantagens é que ela

pode ser aplicada a tecido humano fixado em formaldeído e armazenado por

longo tempo, permitindo o estudo de neurônios e células gliais em amostras de

encéfalo mantidas sob procedimento de fixação simples e rotineiro. Quando se

obtêm resultados adequados, a técnica de Golgi revela os diferentes tipos de

neurônios que constituem uma região nervosa e a morfologia celular detalhada,

o que pode indicar importantes relações entre a forma e a função neuronal

(Wooley & McEwen, 1994; Dall‟Oglio et al., 2008a,b; Larriva-Sahd, 2008;

Gómez-Villalobos et al., 2009; Rasia-Filho et al., 2009). Por outro lado, uma

das suas desvantagens é o número imprevisível de neurônios que se tornam

adequadamente impregnados pela prata e passíveis de serem estudados em

detalhes, além do padrão não homogêneo de impregnação celular em cada

secção de tecido nervoso.

No presente trabalho, um número reduzido de casos foi estudado e,

nesses, um número pequeno de neurônios pôde ser observado. O melhor

resultado foi apresentado na Figura 4. Isso indica que novos experimentos são

necessários para alicerçar as conclusões sobre os tipos celulares que

compõem o Me ao longo de sua distribuição rostrocaudal. Não obstante, os

resultados são congruentes com a morfologia dos neurônios revelada pela

técnica da tionina, o que indica que alguns neurônios aleatórios impregnados

por Golgi são representativos do Me e já puderam ser observados. Os

espinhos dendríticos, importante componente neuronal que pode aumentar a

superfície sináptica, são relevantes para o tipo de resposta pós-sináptica e

respostas plásticas (Oertner &; Matus, 2005; Tada & Sheng, 2006), uma

quantidade inicial, mas ainda insuficiente foi observada no presente estudo.

111

Esses espinhos dendríticos pareceram ser preferentemente classificáveis como

arredondados e/ou finos. Se este tipo de observação se confirmar em estudos

posteriores, isso pode sugerir que os espinhos dendríticos no Me humano

sejam preferencialmente menos plásticos que os com formato de cogumelo

(Peters, Kaiserman-Abramof, 1970; Peters et al., 1991; Hering; Sheng, 2001;

González-Burgos, 2004). Embora estudos eletrofisiológicos sejam necessários

para aclarar este ponto, eles esbarram em restrições éticas irrevogáveis ou

dificuldades técnicas sérias para obtenção de tecido vivo no decurso de

neurocirurgias para remoção de tecido com característica epileptogênica que

ocorrem comumente no lobo temporal, por exemplo.

Em conclusão, os presentes resultados sugerem que o Me de seres

humanos apresenta neurônios multipolares, com corpos celulares médios a

grandes e que indicam, aparentemente, uma organização celular local com

pouca variabilidade morfológica emambos os hemisférios e ao longo de seu

eixo rostrocaudal. Esses dados, embora iniciais, devem servir para direcionar

esforços futuros envolvendo outras metodologias no intuito de revelar os

componentes neurogliais para o funcionamento do Me humano, assim como foi

feito para outras espécies.

5. AGRADECIMENTOS

Os autores são gratos aos familiares que doaram o tecido que resultou

no presente estudo experimental. Apoio financeiro da Agência Federal

Brasileira CNPq. JEM e AARF são pesquisadores do CNPq.

6. REFERÊNCIAS

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Neurosci., 1994; 14: 7680-87.

115

LEGENDAS

Figura 1. Representação esquemática do hemisfério cerebral esquerdo

humano e a localização do núcleo medial da amígdala (preenchido com preto)

ao longo do eixo rostro-caudal (imagens anteriores acima, imagens posteriores

abaixo na figura). Os valores à direita correspondem à escala igualmente

apresentada no atlas de Mai et al. (2008), de onde foram obtidas e adaptadas

essas imagens, e com referência ao plano de corte usado neste mesmo atlas

(atrás do pólo anterior do lobo temporal e antes dos corpos mamilares

hipotalâmicos). Ot = trato óptico.

Figura 2. Imagem microscópica digitalizada de neurônios do núcleo medial da

amígdala humano corados pela técnica da tionina. A partir deste tipo de

imagem foram feitas as medidas em computador da área do corpo celular,

delimitadas pelas linhas fechadas no seu bordo, e empregando-se programa

para morfometria (software Image-Pro Plus 6.0, Media Cybernetics, EUA).

Figura 3. Imagens microscópicas digitalizadas de células do núcleo medial da

amígdala humano coradas pela técnica da tionina. (A-B) Corpos celulares de

maior tamanho e com características histológicas que permitem a classificação

como neurônios de cujos corpos celulares de diferentes formas e com dois ou

mais dendritos primários. Corpos celulares em posição perineuronal e com

coloração mais intensa do núcleo sem nucléolo correspondem aparentemente

a células da glia locais. (C) Somas com aspecto polimórfico com dendritos

primários correspondem a células estreladas. (D) Corpo celular evidente com

dois prolongamentos dendríticos primários, correspondendo ao de tipo

“bitufted”. A escala presente em (D) é válida e idêntica para todas as imagens.

Figura 4. Imagens microscópicas digitalizadas e reconstruídas de células do

núcleo medial da amígdala humano após o uso de uma adaptação do método

de Golgi “single-section”. Comparada com a população neuronal local

observável pela técnica da tionina, um pequeno percentual de células resultou

impregnado. Astrócitos protoplasmáticos se tornaram visíveis, alguns próximos

a vasos sanguíneos (A). Um neurônio multipolar de tipo estrelado é mostrado

116

em (B), e colocada em maior amplificação em (C) para observar a presença de

espinhos dendríticos pleomórficos. Como regra, um fundo mais claro permitiu

um contraste adequado para o resultado da impregnação celular.

117

Figura 1.

118

Figura 2.

119

Figura 3.

120

Figura 4.

121

8. CONCLUSÃO

______________________________

A técnica da tionina e o método de Golgi de tipo “single-section” foram

adaptados para permitir sua utilização satisfatória em tecido nervoso humano

não perfundido e armazenado em formol por longo período. Ambas as

metodologias puderam ser aplicadas ao estudo do Me humano e geraram

resultados inéditos sobre a organização celular desta estrutura. O Me em

ambos os hemisférios cerebrais possui neurônios multipolares com corpos

celulares com citoplasma bem delimitado, soma com contorno arredondado,

ovoide, fusiforme ou multiforme. Neurônios de tamanho médio a grande foram

observados e, baseado na morfologia dos corpos celulares e do número de

ramos dendríticos primários, foram classificados como “bitufted” ou estrelados.

Não foram observados neurônios com aspecto piramidal que pudessem ser

claramente relacionados com uma organização cortical local. Foram igualmente

observados ramos dendríticos com espinhos de aspecto arredondado ou

afilado bem como células gliais em situação perineuronal ou astrócitos

protoplasmáticos, alguns próximos a vasos sanguíneos. Esses dados

embasam e direcionam esforços futuros para compreensão da morfologia

celular e sua repercussão no funcionamento do Me humano.

122

9. ANEXOS

______________________________

ANEXO 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Título da pesquisa: Morfologia de neurônios da amígdala medial em seres

humanos

I. Justificativa e objetivos da pesquisa.

O sistema nervoso é composto por células que coordenam todos os

comportamentos do ser humano. No cérebro há uma região pequena chamada

amígdala que ainda não se sabe completamente sua função, mas que regula

atividades como o medo, por exemplo. A amígdala e as áreas vizinhas têm

cerca de 2 cm e ficam numa região mais anterior do cérebro que pode ser

estudada com técnicas que permitem ver os neurônios que a compõem para

que se possa avançar nos conhecimentos científicos. Isso pode ajudar a

compreender sua função normal e em casos de algumas doenças

neurológicas, como o mal de Alzheimer. O objetivo deste trabalho é estudar

essas células da amígdala e descrever como elas são em nós, seres humanos.

II. Os procedimentos a serem utilizados e guarda do material

Durante o procedimento habitual da necropsia deve-se analisar as

partes do cérebro também. Neste momento, uma pequena porção de não mais

do que 5 cm poderia ser retirada para este estudo. Nesta porção cerebral está

a amígdala. O material obtido será após analisado em laboratório para avançar

pesquisa científica. No laboratório, as células do cérebro serão vistas em

microscópio após serem empregadas técnicas que identificam as suas partes

e, com isso, serão estudadas. Todo esse material ficará guardado em

laboratório de pesquisa científica na Fundação Faculdade Federal de Ciências

Médicas de Porto Alegre, R. Sarmento Leite, 245, Porto Alegre - RS, guardado

o sigilo do doador.

III. Os desconfortos ou riscos esperados

123

Não há desconfortos ou riscos esperados para os familiares ou

responsáveis legais da pessoa falecida. O procedimento de necropsia a ser

realizado é o habitual e indicado por normas técnicas/acadêmicas e legais.

IV. Os benefícios que podem ser obtidos

O estudo desta pequena parte do cérebro pode contribuir para que se

entenda o tipo de célula que compõe e que faz funcionar esta região, a

amígdala. Com isso, o conhecimento científico pode aumentar e ajudar a

entender como a amígdala funciona normalmente e em casos patológicos. Esta

é uma das primeiras etapas de estudo de um órgão do ser humano, ou seja, de

saber como são as células que compõem esse órgão.

V. Os procedimentos alternativos que possam ser vantajosos (descrever)

Os procedimentos alternativos a este tipo de estudo são a realização

dos mesmos experimentos em animais, como ratos, camundongos, gatos e

cachorros. Esses experimentos já foram feitos. Neste momento, não há

alternativa para estudar como são as células da amígdala do ser humano a não

ser conseguir observá-las ao microscópio.

VI. Garantia de resposta a qualquer pergunta

Trata-se de uma pesquisa científica com finalidade de estudo da forma

das células da amígdala em nós, seres humanos. O familiar ou responsável

legal pela pessoa falecida tem assegurada a resposta a qualquer tipo de

pergunta que queira fazer sobre o procedimento de retirada desta pequena

parte do cérebro, da forma como vai ser estudada em laboratório e quais são

os resultados que se espera obter com esse tipo de pesquisa. A Dra. Helena

Terezinha Hubert Silva, médica legista do DML e/ou Denise Gomes Rodrigues

Ferme, que são co-autoras deste projeto e estão capacitadas a responder

todas as perguntas que se quiserem fazer sobre o procedimento aqui descrito.

VII. Liberdade de abandonar a pesquisa sem prejuízo para si

O familiar ou responsável legal pela pessoa falecida tem toda a

liberdade para não querer participar deste estudo, negando a retirada da

amígdala para estudo científico de suas células em laboratório. Isso não

124

implicará qualquer tipo de prejuízo no procedimento de necropsia. Da mesma

forma, têm a liberdade de abandonar esta pesquisa no momento que bem

entender, sem que isso acarrete necessidade de justificativas ou qualquer tipo

de indenização.

VII. Garantia de privacidade

Ressaltamos também que a concordância em participar deste estudo

não implica necessariamente qualquer modificação no procedimento de

necropsia que já está sendo feito, nem tampouco os resultados desse estudo

terão efeito de qualquer forma sobre ele. Da mesma forma, a não concordância

em participar deste estudo não irá alterar de forma alguma o procedimento de

autópsia já estabelecido.

Eu,......................................................(familiar ou responsável) fui

informado dos objetivos da pesquisa acima de maneira clara e detalhada.

Recebi informação a respeito de como será retirada parte do tecido cerebral

para estudo, como o estudo será feito, e esclareci minhas dúvidas. Sei que em

qualquer momento poderei solicitar novas informações e modificar minha

decisão se assim eu o desejar. A Dra. Helena Terezinha Hubert Silva (médica

legista e uma das pesquisadoras responsáveis pelo estudo) certificou-me de

que todos os dados desta pesquisa serão confidenciais e o procedimento de

necropsia não será modificado em razão desta pesquisa e terei liberdade de

retirar meu consentimento de participação na pesquisa, em face de estas

informações.

125

ANEXO 2 - ANAMNESE

PROTOCOLO DE IDENTIFICAÇÃO

Caso n°_________

IDENTIFICAÇÃO - Nome do familiar que informa dados: ___________________________ - Endereço: ________________________________________________ - Fone: _____________ - Nome da vítima: ___________________________________________ - Idade: ______ Profissão: ____________________________________ - Escolaridade: _____________________________________________

ANTECEDENTES - Clínicos: ( ) cefaléia freq. ( ) tonturas/vertigens

( ) desmaios ( ) tremores/ déficits motores ( ) convulsões ( ) deficiência de mobilidade congênita ( ) coma ( ) acidentes de trânsito ( ) meningites ( ) outros _______________________

- Patologias: ( ) AVC ( ) HAS ( ) diabetes ( ) Parkinson ( ) Alzheimer ( ) epilepsia ( ) depressão ( ) medo/stress pós-traumático ( ) HIV+ ( ) outros _______________________

- Psicossociais: ( ) tabagismo ( ) violência/agressividade ( ) bebidas alcoólicas ( ) desnutrição infantil ( ) abuso sexual ( ) drogas ilícitas/quais __________________ * Intervenções: ( ) internação hospitalar ______________________ ( ) UTI/motivo ______________________________ ( ) cirurgia/data _____________________________ ( ) medicamentos ___________________________

CONDIÇÕES DO ÓBITO - Data: ___/___/___ - Hora: ___:___ - Situação do óbito: __________________________________________

ENTREVISTADOR:

- Nome: ________________________________ - Assinatura: ______________________ - Data: ___/___/___ - Hora: ___:___

126

ANEXO 3 – PARECER UFCSPA

127

ANEXO 4 – PARECER DML

128

ANEXO 5 – PARECER UFRGS

130

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