MORAN (CRASSULACEAE), VÍA ORGANOGÉNESIS” · Al Centro de Investigación y Asistencia en...

Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología

y Diseño del Estado de Jalisco, A. C.

“REGENERACIÓN IN VITRO DE ECHEVERIA CALYCOSA

MORAN (CRASSULACEAE), VÍA ORGANOGÉNESIS”

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE

MAESTRA EN CIENCIAS DE LA FLORICULTURA

PRESENTA

Q.F.B. MARÍA DE JESÚS SALGADO GUTIÉRREZ

GUADALAJARA, JALISCO, MÉXICO. DICIEMBRE DE 2015.

a

REFERENCIAS

El presente trabajo fue realizado en el laboratorio de cultivo de tejidos Vegetales en la Unidad de

Biotecnología Vegetal del Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado

de Jalisco, A.C. (CIATEJ), bajo la dirección de la Dra. Noemí Obledo Vázquez.

Formó parte del proyecto “Desarrollo de protocolos de propagación de dos especies vegetales

endémicas de Michoacán: Echeveria purhepecha y Echeveria calycosa”.

Se realizó en colaboración con el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo

Integral Regional Unidad Michoacán del Instituto Politécnico Nacional y con el Colegio de

Michoacán.

Financiado por el Fondo Mixto CONACYT – Gobierno del Estado de Michoacán.

La autora de la presente tesis contó con el apoyo de la beca CONACYT, como parte del “Programa

Nacional de Posgrados de Calidad”

Con agradecimiento al fondo mixto CONACYT- gobierno del Estado de Jalisco, proyecto 2008 –

04 – 99210 “Fortalecimiento de la maestría de ciencias de la floricultura”, programa del posgrado

de nueva creación del CIATEJ.

b

AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco (CIATEJ,

A.C.), por haberme dado la oportunidad de, una vez más formarme tanto académica como

profesionalmente, así como por proporcionarme los conocimientos durante el periodo de la maestría

así como brindarme el apoyo y las facilidades para realizar el presente trabajo de investigación y

obtener el grado de Maestra en Ciencias de la Floricultura.

A la Dra. Noemí Obledo Vázquez que fungió como directora de esta tesis; por el apoyo brindado,

por transmitir sus conocimientos y experiencia para la realización de este trabajo.

Al comité tutorial: Dr. Rodrigo Barba G. y el Mtro. Ignacio Ruíz, por su colaboración y apoyo en

la realización de este trabajo.

A los Doctores y Maestros de la unidad de biotecnología vegetal que colaboraron en mi formación

profesional y que me apoyaron para lograr esta meta.

A todos los compañeros del posgrado y del laboratorio, con quien tuve el gusto de compartir este

periodo, cada uno de ellos contribuyó para que yo pudiera seguir sin desistir, con su aceptación,

sus consejos y su experiencia profesional.

GRACIAS

c

DEDICATORIAS

A mi esposo: Felipe

A mis hijos: Andrea, Felipe y Alan

Sin su apoyo no hubiera sido posible terminar este grado, no hay palabras para expresar

mi agradecimiento y mi amor incondicional para Uds. “mi familia”.

A LA MEMORIA DE

Mis padres

Sr. Jesús Salgado Salgado

Sra. Otilia Gutiérrez García

a quien debo lo que soy

A Dios por el milagro de la vida

Regeneración in vitro de Echeveria calycosa Moran

(CRASSULACEAE), vía organogénesis

I

TABLA DE CONTENIDO

Página

REFERENCIAS ______________________________________________________________ a

AGRADECIMIENTOS ________________________________________________________ b

DEDICATORIAS _____________________________________________________________ c

ABREVIATURAS _____________________________________________________________ i

INDICE DE TABLAS __________________________________________________________ ii

INDICE DE FIGURAS _________________________________________________________ v

RESUMEN ___________________________________________________________________ 1

SUMMARY __________________________________________________________________ 2

1 ANTECEDENTES ___________________________________________________________ 2

1.1 FAMILIA CRASSULACEAE ______________________________________________ 4

1.2 EL GÉNERO ECHEVERIA _________________________________________________ 5

1.2.1 Echeveria calycosa ____________________________________________________ 6

1.3 PROPAGACIÓN DEL GÉNERO ECHEVERIA ________________________________ 8

1.3.1 Reproducción sexual __________________________________________________ 8

1.3.2 Reproducción asexual__________________________________________________ 8

1.4 REGENERACIÓN POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS in vitro ______________ 8

1.4.1 Medio de cultivo in vitro _______________________________________________ 10

1.4.2 Auxinas ____________________________________________________________ 10

1.4.3 Citocininas _________________________________________________________ 11

1.4.4 Etapas del cultivo in vitro ______________________________________________ 11

1.4.5 Trabajos publicados del cultivo in vitro en diferentes especies de Echeveria _______ 13

2 JUSTIFICACIÓN _________________________________________________________ 15

3 HIPOTESIS ______________________________________________________________ 16

4 OBJETIVOS _____________________________________________________________ 17

4.1 General ________________________________________________________________ 17

4.2 Específicos ____________________________________________________________ 17

5 METODOLOGÍA _________________________________________________________ 18

5.1 Material Vegetal ________________________________________________________ 18

5.2 Propagación por semilla (sexual) ___________________________________________ 18



II

5.3 Propagación por esqueje de hoja (asexual) ____________________________________ 19

5.4 Propagación in vitro _____________________________________________________ 19

5.4.1 Establecimiento _______________________________________________________ 19

5.4.1.1 Explantes ______________________________________________________ 19

5.4.1.2 Desinfección de los explantes ______________________________________ 21

5.4.1.3 Establecimiento de los explantes ____________________________________ 22

5.4.2 Propagación ___________________________________________________________ 22

5.4.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui. ______________ 22

5.4.2.2 Propagación, experimentos bifactoriales con 4 niveles. _____________________ 23

5.4.2.2.1 Primer experimento de propagación_________________________________ 23

5.4.2.2.2. Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E.calycosa obtenidas

in vitro. _______________________________________________________________ 26

5.4.2.2.3 Primer experimento de propagación utilizando E. purhepecha ____________ 26

5.4.2.3.1 Segundo experimento de propagación _______________________________ 27

5.4.2.3.2 Segundo experimento de propagación utilizando E. purhepecha ___________ 29

5.5 Enraizamiento __________________________________________________________ 30

5.6 Aclimatación (periodo ex vitro) _____________________________________________ 32

5.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro ______________________________ 34

6 RESULTADOS y DISCUSIÓN _______________________________________________ 36

6.1 Propagación por semilla (sexual) ___________________________________________ 36

6.2 Propagación por esqueje de hoja (asexual) ____________________________________ 39

6.3 Propagación in vitro _____________________________________________________ 40

6.3.1 Establecimiento ______________________________________________________ 40

6.3.1.1 Explantes _______________________________________________________ 42

6.3.1.2 Desinfección de los explantes. _______________________________________ 44

6.3.2 Propagación _________________________________________________________ 45

6.3.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui _____________ 45

6.3.2.2 Propagación con diferentes tratamientos de RCV experimentos bifactoriales con 4

niveles ________________________________________________________________ 47

6.3.2.2.1 Primer experimento bifactorial de propagación ________________________ 47

6.3.2.2.2 Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E. calycosa

propagadas in vitro ______________________________________________________ 57

6.3.2.3.1 Primer experimento de propagación con E. purhepecha __________________ 61

6.3.2.4. Segundo experimento de propagación ________________________________ 65

6.3.2.4.1 Segundo experimento bifactorial de propagación con Echeveria purhepecha 72

6.4. Inducción de brotes a partir de callo ______________________________________ 78



III

6.5 Enraizamiento __________________________________________________________ 82

6.5.1 Enraizamiento de hojas _______________________________________________ 89

6.6 Aclimatación (periodo ex vitro) ____________________________________________ 91

6.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro ______________________________ 94

7. CONCLUSIONES _________________________________________________________ 96

8. BIBLIOGRAFÍA __________________________________________________________ 98

9. ANEXO 1. Tablas y figuras del análisis estadístico _____________________________ 104

10. APENDICE _____________________________________________________________ 116



i

ABREVIATURAS

ANA Ácido naftalen acético

ANOVA Análisis de varianza

AZ sacarosa

BAP bencil amino purina

°C grados centígrados

C.A. carbón activado

CIATEJ Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco

cm centímetros

col. colaboradores

conc. concentración

fig. figura

g/l gramos por litro

HCl ácido clorhídrico

HSA hemisulfato de Adenina

IBA ácido indol butírico

KIN cinetina

lb libras

LSD Least Significant Difference, (prueba de Fisher)

mg miligramos

min minutos

ml mililitro

MS Murashige and Skoog (medio de cultivo)

µ micras

N Normalidad: equivalentes gramo del soluto por litro de solución

NaOH Hidróxido de sodio

pH potencial hidrógeno; (medida de acidez o alcalinidad de una disolución).

® Marca Registrada

RCV reguladores de crecimiento vegetal

SA sulfato de Adenina



ii

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Procedimientos para establecer los explantes de E. calycosa in vitro ------------------------- 20

Tabla 2. Tratamiento de desinfección de los explantes de E. calycosa ---------------------------------- 21

Tabla 3. Concentraciones de RCV utilizadas en el primer experimento de propagación -------------- 24

Tabla 4. Tratamientos que componen el primer experimento de propagación ---------------------------- 25

Tabla 5. Concentraciones de RCV utilizadas en el segundo experimento de propagación ------------ 27

Tabla 6. Tratamientos que componen el segundo experimento de propagación ------------------------ 28

Tabla 7. Tratamientos para enraizar las rosetas de E. calycosa obtenidas en la propagación in

vitro ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 31

Tabla 8. Procedimiento para aclimatar rosetas de E. calycosa obtenidas mediante enraizamiento

in vitro ------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 33

Tabla 9. Tratamientos para la aclimatación – enraizado ex vitro -------------------------------------------- 35

Tabla 10. Resultados de los tratamientos para establecer los explantes de E. calycosa in vitro ---- 40

Tabla 11. Resultados de la propagación de E. calycosa con la combinación de RCV utilizada en

E. laui -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 45

Tabla 12. Número de explantes de E. calycosa establecidos al inicio y los que sobrevivieron

después de 120 días en el primer experimento de propagación --------------------------------------------- 47

Tabla 13. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta de regeneración a los 30

días de establecidos in vitro ----------------------------------------------------------------------------------------- .49


días de establecidos in vitro ------------------------------------------------------------------------------------------ 50





Tabla 17. Resumen del comportamiento de los explantes de E. calycosa durante el primer

experimento de propagación ---------------------------------------------------------------------------------------- 53

Tabla 18. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que se establecieron

y los que sobrevivieron después de 90 días ----------------------------------------------------------------------- 58



iii

Tabla 19. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que presentaron

respuesta a los 120 días ----------------------------------------------------------------------------------------------- 59

Tabla 20. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron después

de 120 días--------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 62

Tabla 21. Número de explantes de E. purhepecha que presentaron respuesta a 120 días. ------------- 63

Tabla 22. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 120

días, en el primer estudio de propagación ------------------------------------------------------------------------- 64

Tabla 23. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que sobrevivieron después de

90 días en el segundo experimento de propagación ------------------------------------------------------------- 66

Tabla 24. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que presentaron respuesta a los

30 días -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 67


60 días. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 69


90 días -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 71

Tabla 27. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron después

de 90 días en el segundo experimento de propagación -------------------------------------------------------- .73

Tabla 28. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que presentaron respuesta a

los 90 días --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 74

Tabla 29. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 90 días,

en el segundo estudio de propagación ----------------------------------------------------------------------------- 75

Tabla 30. Área en cm2 de los callos producido por los tratamientos 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15 y 16

en el primer estudio de propagación -------------------------------------------------------------------------------- 78

Tabla 31. Respuesta obtenida al establecer los callos obtenidos del primer estudio de

propagación de E. calycosa, en los tratamientos donde se produjeron brotes ------------------------------ 80

Tabla 32. Resultados obtenidos en los diferentes tratamientos de enraizamiento ----------------------- 83

Tabla 33. Presencia de tallos fusionados en plántulas de E. calycosa, enraizadas en diferentes

concentración de sacarosa -------------------------------------------------------------------------------------------- 88

Tabla 34. Número de hojas enraizadas y con roseta ---------------------------------------------------------- 89

Tabla 35. Resultados de la aclimatación de las plántulas obtenidas del periodo de enraizamiento

in vitro -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 91



iv

Tabla 36. Resultados de la aclimatación y enraizamiento simultáneos de plántulas de E.

calycosa. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 94

Tabla 37. Resumen del análisis estadístico de la influencia del tratamiento para establecer

explantes de E. calycosa en la respuesta obtenida por los explantes -------------------------------------- 104

Tabla 38. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de los tratamientos de desinfección

en la calidad de explantes de E. calycosa. ------------------------------------------------------------------- 105

Tabla 39. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la especie de Echeveria en la

respuesta de los explantes de las dos especies de Echeveria en el segundo estudio de propagación

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 106

Tabla 40. Resumen Análisis de varianza de la influencia de los 16 tratamientos de RCV en la

respuesta del explante de E. calycosa en el primer estudio de propagación ---------------------------- 107

Tabla 41. Resumen del análisis estadístico de la influencia de la especie de Echeveria con

respecto a la respuesta obtenida por los explantes de las dos especies de Echeveria comparadas

en el primer estudio de propagación -------------------------------------------------------------------------- 108

Tabla 42. Resumen Análisis de varianza de la influencia de los tratamientos de enraizado en la

respuesta de las rosetas de E. calycosa ---------------------------------------------------------------------- 109

Tabla 43. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa

sobre el tamaño de la roseta de E. calycosa ----------------------------------------------------------------- 110

Tabla 44. Resumen del Análisis de varianza de la influencia del carbón activado sobre el

tamaño de la roseta de E. calycosa ------------------------------------------------------------------------------- 111

Tabla 45.- Resumen del Análisis de varianza de la influencia del carbón activado sobre sobre el

para largo de raíz ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 112

Tabla 46. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa

sobre el largo de la raíz --------------------------------------------------------------------------------------------- 113

Tabla 47. Resumen del Análisis de varianza de la influencia del carbón activado sobre el largo

de raíz ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 114

Tabla 48. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa en

la respuesta de formación de tallos fusionados en las rosetas de E. calycosa en la etapa de

enraizamiento --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 115



v

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1.Distribución del género Echeveria en la república Mexicana -------------------------------------- 6

Figura 2. Planta de E. calycosa floreciendo ----------------------------------------------------------------------- 7

Figura 3. Inflorescencia de E. calycosa --------------------------------------------------------------------------- 7

Figura 4. Plantas de E. calycosa en su hábitat natural y en invernadero -------------------------------- 18

Figura 5. Rosetas obtenidas por cultivo in vitro a partir de un explante de E. Calycosa

propagado en medio MS 50% suplementado con ANA: KIN, 4: 6 mg/l ----------------------------------- 26

Figura 6. Semillas de E. calycosa ----------------------------------------------------------------------------- 36

Figura 7. Semillas de E. Calycosa germinadas ------------------------------------------------------------------ 37

Figura 8. Plántulas obtenidas por germinación de semilla --------------------------------------------------- 38

Figura 9. Plantas de E. calycosa obtenidas de semillas -------------------------------------------------------- 38

Figura 10. Explantes de hoja de E. calycosa establecidos en tepojal – peat moss ---------------------- 39

Figura 11. Presencia de contaminación de explantes de E. calycosa --------------------------------------- 41

Figura 12. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa ------------------------------- 41

Figura 13. Procedencia de los explantes que se utilizaron en el tratamiento no. 4 del

establecimiento in vitro de E. calycosa. --------------------------------------------------------------------------- 42

Figura 14. Sobrevivencia de los explantes de E. calycosa al proceso de desinfección ----------------- 43

Figura 15. Calidad de los explantes de E. calycosa de acuerdo al tejido que le dio origen ------------ 43

Figura 16. Explante de hoja de E. calycosa dañado por el tratamiento de desinfección ---------------- 44

Figura 17. Explantes de E. calycosa muestran organogénesis directa ------------------------------------- 46

Figura 18. Rosetas de E. calycosa hiperhidratadas ------------------------------------------------------------- 46

Figura 19. Porcentaje de sobrevivencia de explantes de E. calycosa establecidos en 4 diferentes

estudios------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 48

Figura 20. Variación de la calidad de los explantes de E. calycosa, durante el tiempo de estudio

inicial, 30 60, 90 y 120 días ---------------------------------------------------------------------------------------- 53

Figura 21. Calidad en % de los explantes de hoja e inflorescencia de E. calycosa, a los 120

días ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 54

Figura 22. Respuesta que presentaron los explantes de E. calycosa a los 120 días dependiendo

del tipo de explante ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 54



vi

Figura 23. Respuesta representativa de los explantes de E. calycosa a los tratamientos del

primer estudio de propagación -------------------------------------------------------------------------------------- 56

Figura 24. Respuesta de los explantes de rosetas obtenidas in vitro de E. calycosa a los

tratamientos del primer estudio de propagación los 180 días ------------------------------------------------ 60

Figura 25. Número de explantes de E. purhepecha que presentaron respuesta dependiendo del

tipo de explante a los 120 días --------------------------------------------------------------------------------------- 64

Figura 26. Número de explantes de E. calycosa que presentaron un calidad de entre 1 y 5

durante los primeros 30 días de propagación --------------------------------------------------------------------- 68

Figura 27. Porcentaje de sobrevivencia de explantes de E. calycosa a los 30 días de iniciada la

etapa de propagación -------------------------------------------------------------------------------------------------- 68

Figura 28. Número de explantes de E. calycosa que presentaron una calidad entre 1 y 5 a los

60 días de iniciada la propagación ---------------------------------------------------------------------------------- 70

Figura 29. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa a los 60 días de iniciada

la propagación ---------------------------------------------------------------------------------------------------------- 70

Figura 30. Número de explantes de E. calycosa durante el periodo de la propagación ----------------- 71

Figura 31. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa, en el periodo de

propagación a los 90 días --------------------------------------------------------------------------------------------- 72

Figura 32. Organogénesis indirecta, en explantes de E. calycosa con 180 días ----------------------- 76

Figura 33. Organogénesis directa en explantes de E. calycosa con 90 días ------------------------------- 77

Figura 34. Organogénesis directa en diferentes épocas del año --------------------------------------------- 77

Figura 35. Callos producidos en el primer estudio de propagación ----------------------------------------- 79

Figura 36. Formación de brotes a partir del callo del explante 25.7.1 -------------------------------------- 81

Figura 37. Formación de brotes a partir de callo del explante 212.1 ---------------------------------------- 81

Figura 38. Rosetas enraizadas en el medio de cultivo adicionado con ANA (0.1 mg/l) ---------------- 82

Figura 39. Rosetas enraizadas a partir de medios de cultivo sin RCV ------------------------------------- 84

Figura 40. Rosetas enraizadas en medio de cultivo sin RCV: ----------------------------------------------- 85

Figura 41. Rosetas enraizadas en medio de cultivo adicionado con KIN (0.1 mg/l). -------------------- 85

Figura 42. Rosetas con exposición a la KIN, in vitro ------------------------------------------------------ 86

Figura 43. Rosetas enraizadas en medios de cultivo adicionados con KIN ------------------------------- 87

Figura 44. Relación entre la alteración de tallos fusionados en las plántulas de E. calycosa con

respecto al aumento de la concentración de sacarosa en el medio de enraizamiento --------------------- 88



vii

Figura 45. Hojas que formaron raíz y roseta en los medios de enraizamiento in vitro sin adición

de RCV ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 90

Figura 46. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de aclimatación. ------------------------------ 92

Figura 47. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de aclimatación por grupo de estudio

de enraizamiento del que proceden --------------------------------------------------------------------------------- 92

Figura 48. Parte de las plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de

aclimatación, en invernadero ---------------------------------------------------------------------------------------- 93

Figura 49. Plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de enraizado -

acondicionado simultaneo ex vitro ----------------------------------------------------------------------------- 96

Figura 50. Análisis de medias de la influencia de grupo de tratamiento sobre la respuesta del

explante en el establecimiento. ------------------------------------------------------------------------------------ 104

Figura 51. Análisis de medias de la influencia del tipo de explante en la calidad obtenida en el

establecimiento de los explantes ---------------------------------------------------------------------------------- 105

Figura 52. Análisis de medias de la influencia de la especie de Echeveria en la respuesta en el

segundo experimento de propagación ---------------------------------------------------------------------------- 106

Figura 53. Análisis de medias de la influencia de los tratamientos de RCV del primer estudio de

propagación sobre la respuesta obtenida en los explantes de E. calycosa ------------------------------- 107

Figura 54. Análisis de medias de la influencia de la especie de Echeveria en la respuesta en el

primer experimento de propagación ------------------------------------------------------------------------------ 108

Figura 55. Análisis de las medias de la influencia de los 14 tratamientos para enraizamiento de

rosetas de E. calycosa en la respuesta de altura de la roseta ------------------------------------------------ 109

Figura 56. Análisis de medias de la influencia de la concentración de sacarosa utilizada en el

enraizamiento sobre la altura de la planta ---------------------------------------------------------------------- 110

Figura 57. Análisis de medias de la influencia del carbón activado en la altura de la planta -------- 111

Figura 58. Análisis de medias de la influencia del carbón activado en el largo de la raíz ----------- 112


enraizamiento en el largo de la raíz------------------------------------------------------------------------------- 113

Figura 60. Análisis de medias de la influencia del carbón activado en lo largo de la raíz ------------ 114


medio de enraizamiento en la formación de tallos fusionados en rosetas de E. calycosa -------------- 115



Página 1

RESUMEN

Echeveria calycosa Moran, planta suculenta, pertenece a la familia Crassulaceae y al género

Echeveria con forma de roseta, atractiva, destinada a planta ornamental. Endémica del Estado de

Michoacán, expuesta a diferentes situaciones que ponen en riesgo su prevalescencia dentro de su

hábitat natural.

Para contribuir a su propagación y a su conservación, se probaron diferentes técnicas de

propagación ex vitro e in vitro.

Ex vitro se trabajó: propagación por esqueje de hoja de roseta, se establecieron en contendores de

plástico con tepojal: peat moss (1:1) como sustrato, bajo condiciones controladas; no se obtuvo

éxito en esta propagación; propagación por semilla, se desinfectaron y sembraron semillas de E.

calycosa en contenedores de plástico con tepojal: peat moss (1:1) como sustrato, se mantuvieron

bajo condiciones de temperatura, humedad y luz controlada, obteniendo un índice de germinación

de 15%.

In vitro se establecieron hojas de roseta y fragmentos de inflorescencia, en medio de cultivo

Murashige – Skoog (MS) a temperatura, humedad y luz controlada. El establecimiento se logró con

tratamiento de desinfección y utilizando la etapa 0 con el fungicida amistar ®, obteniendo una

sobrevivencia de 62%. En la propagación, los esquejes establecidos se estimularon con diferentes

proporciones de reguladores de crecimiento vegetal: ácido naftalen acético (ANA) y cinetina (KIN)

adicionados al medio de cultivo, donde el tratamiento que contenía 4:2 (mg/l) de ANA: KIN fue el

que produjo mejor respuesta, hasta 50 brotes por explante a los 180 días.

En la etapa de enraizamiento, se utilizó medio de cultivo MS (100 y 50%); con y sin carbón

activado (2 g/l); con y sin ANA o KIN (0.1 mg/l); y sacarosa (30.0, 15,7.5 y 0.0 g/l); obteniendo

plántulas de mayor tamaño en el medio de cultivo MS – sacarosa 30 g/l – KIN 0.1 mg/l y raíz de

mayor tamaño en medio MS - Sacarosa 30 g/l - Carbón activado (2g/l).

Aclimatación ex vitro.- Las plántulas obtenidas se sembraron en maceta con tepojal: peat moss 1:1,

como sustrato la sobrevivencia fue 75.7%.

Enraizamiento y aclimatación simultanea ex vitro.- se utilizó ácido Indol butírico (IBA) (0.2 y 0.1

mg/ml) en plantas sin raíz y plantas con raíz (con y sin hemisulfato de adenina); las plantas con raíz

adicionadas con HSA tuvieron el mejor resultado, con una sobrevivencia de 100%.

Se logró la propagación in vitro de Echeveria calycosa utilizando métodos biotecnológicos,

contribuyendo a su preservación y posiblemente a la de otras especies que pertenecen al género

Echeveria.



Página 2

SUMMARY

Echeveria calycosa Moran. Succulent plant, belong to the genus Echeveria of the Crassulaceae

family, with rosette shape, attractive, intended as an ornamental plant. Endemic to Michoacán state,

it is exposed to different situations that are threatening its existence in the wild.

To contribute to its propagation and conservation, different multiplication techniques were tested,

ex vitro and in vitro.

In ex vitro: 1) propagation by rosette leaf cuttings, they were established in pots containing soil

tepojal:peat moss (1: 1) with controlled temperature, humidity and photoperiod; this propagation

wasn’t successful. 2) Propagation by seed; seeds of E. calycosa were disinfected and planted in soil

tepojal:peat moss (1:1), kept in controlled conditions of temperature, humidity and light obtaining a

germination rate of 15%.

In vitro: rosette leaves and cincinni fragments were settled on MS medium, with controlled

temperature, humidity and light. The establishment was achieved with disinfection treatment using

stage 0 with the fungicide Amistar ®, obtaining 62% survival. For propagation, cuttings were

stimulated with different growth regulators ratios: naphthaleneacetic acid (NAA) and kinetin (KIN)

added to the culture medium to produce a regenerative response, the best response was obtained

with the treatment containing: ANA: KIN (4: 2, mg/l), obtaining up to 50 shoots per explant after

180 days.

For rooting, MS (1, ½) medium was used; with and without activated carbon (2 g/l); with and

without ANA or KIN (0.1 mg/l); and sucrose (30, 15, 7.5 and 0.0 g/l); obtaining the biggest plants

in MS medium - sucrose 30 g/l - KIN 0.1 mg/l and the higher root production was achieved in MS -

Sucrose 30 g/l - Activated charcoal (2 g/l).

"Ex vitro" Acclimatization- the obtained plantlets were planted in pots with soil, tepojal: peat moss,

1: 1; the survival was 75.7%.

Simultaneous ex vitro rooting and acclimatization.- Indole butyric acid (IBA) (0.2 and 0.1 mg/ml)

was used in plants with and without roots (both with and without presence of HSA); plants with

root-spiked with HSA, had the best result, with 100%survival.

The in vitro propagation of Echeveria calycosa was achieved using biotechnological methods,

contributing to its preservation and possibly to other species belonging to the genus Echeveria.



Página 3

1 ANTECEDENTES

En nuestro país existen numerosas especies florales cuya importancia ambiental, científica, médica,

económica o cultural es esencial para el buen funcionamiento de los ecosistemas, contribuyendo al

bienestar y a la salud humana. Al proteger y conservar la biodiversidad se cuida las fuentes de

alimentación y el medio ambiente. Al hablar de biodiversidad es necesario incluir desde la cultura e

identidad de los pueblos, hasta la investigación científica, pasando por la educación e incluso la

religión, pudiendo llegar a trascender en el ámbito moral. Al perder una especie, con ella se pierde

toda la información, los bienes y servicios que proporciona, así como los usos potenciales que

podría prestar. Lamentablemente a pesar de que es reconocido el gran valor y la importancia de la

biodiversidad, la pérdida de ésta es una realidad debido principalmente a actividades del ser

humano, como son agricultura, ganadería, urbanismo y sector industrial entre otros, seguido de la

pérdida causada por catástrofes naturales como son inundaciones, erosiones, deslaves, etc.

reconociendo que algunos de estos desastres son también causados por intervención del ser humano,

siendo esta pérdida tan rápida que en la mayoría de los casos no se llega a conocer su importancia.

La flora de México es una de las más diversas del planeta. Se han hecho estimaciones sobre su

riqueza florística, la cual oscila entre las 22 000 y las 31 000 especies, de las cuales alrededor de 9

300 presentan algún endemismo. La evaluación más reciente, realizada por Villaseñor (2004),

indica que la flora de México tiene más de 23 424 especies de plantas vasculares (helechos y

plantas afines, gimnospermas y plantas con flores) y 2 663 géneros, de los cuales 218 se consideran

endémicos al país. También se estima que entre el 40% y 50% de la flora vascular es endémica del

territorio mexicano (Rzedowski, 1991; Toledo, 1993; Villaseñor, 2003, 2004; Sosa y De Nova,

2012).

Echeveria calycosa es una especie endémica del Estado de Michoacán, el cual presenta una gran

diversidad florística la que se explica principalmente por su complejidad geológica y climática.

El clima que predomina en la región de la barranca del río Cupatitzio es semicálido sub-húmedo

con abundantes lluvias en verano, 630.6 mm en la zona, la temperatura media anual fluctúa entre 18

y 20 °C (Hernández, 2009).

La vegetación del Área de Río Cupatitzio no ha sido descrita en detalle, aunque se considera que

incluye elementos florísticos de bosque de pino-encino, mesófilo de montaña y de galería,

perturbados por la introducción de plantas exóticas.

En el Parque Nacional Barranca del Cupatitzio se ha registrado un total de 563 especies de plantas;

495 de éstas son nativas, de las que 50 son helechos, 10 son coníferas y 435 plantas con flor,

además de 68 especies introducidas.

De la especie Echeveria calycosa perteneciente a la familia Crassulaceae, endémica del estado de

Michoacán, se han reportado poblaciones en el cañón del rio Cupatitzio en la localidad de Tinaja

Verde perteneciente al municipio de Uruapan. Es una especie apreciada como planta de ornato, por



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lo cual es comercializada utilizando para ello ejemplares obtenidos directamente de su hábitat

natural. Esta actividad, aunada a su lento crecimiento, las pocas poblaciones que se tienen

localizadas, las dificultades que presenta para su propagación y el cambio de uso de suelo

circundante a su hábitat, amenazan su prevalencia.

Por esta razón se decidió realizar un trabajo de investigación con la finalidad de incrementar su

índice de propagación utilizando técnicas biotecnológicas como es el cultivo de tejidos vegetales in

vitro.

1.1 FAMILIA CRASSULACEAE

Crassulaceae, del latín (“crassus”= hoja gruesa) es una familia de angiospermas morfológicamente

diversa y compleja que está integrada por cerca de 1 500 especies repartidas en 35 géneros (Berger,

1930). Es uno de los grupos más importantes conformado por plantas que poseen hojas, tallos o

raíces suculentas, cultivadas ampliamente como ornamentales por su gran atractivo natural. Se

distribuyen casi en todo el mundo, pero la mayoría se encuentran en cinco centros de diversidad: en

primer lugar se encuentra México con aproximadamente 330 especie de las cuales cerca del 89,2 %

son endémicas del país y el 37,3 %, endémicas de algún Estado; le sigue Asia oriental con

aproximadamente 300 especies, Sudáfrica con cerca de 225 especies; la cuenca del Mediterráneo

con aproximadamente 100 especies y en quinto lugar se encuentra Macronesia con

aproximadamente 63 especies. En general, las especies crecen mejor en zonas áridas y semiáridas y

ambientes rocosos montañosos con climas templados (Reyes y col., 2011; Oviedo, 2003).

Las crasuláceas son plantas tipo CAM, que a diferencia de las plantas C3 y C4, asimilan CO2

atmosférico en ácidos de cuatro carbonos, principalmente de noche y subsecuentemente, lo fijan

durante el siguiente día vía ciclo de Calvin. Los estomas de las plantas CAM permanecen abiertos

durante la noche y cerrados durante la mayor parte del día, resultando de esta manera en una

pérdida mínima de agua y fotorrespiración reducida (Herppich y Peckmann, 2000). Las plantas

CAM exhiben tasas en la eficiencia del uso del agua de cinco a diez veces más altas que las plantas

C4, resultando en una considerable ventaja competitiva en ambientes en que el agua es el factor

limitante, como por ejemplo desiertos o ambientes epífitos (Cushman, 2001).

Son plantas desde herbáceas hasta arbustivas, solitarias o cespitosas con hojas dispuestas en forma

de roseta (Oviedo, 2003), o a lo largo de un tallo, dando lugar a una roseta floja. El color de las

hojas muestra diferentes tonalidades de verde, en ocasiones se observa la presencia de máculas

rojas. Con frecuencia perennes, aunque también hay anuales o bienales. Las inflorescencias pueden

ser centrales, terminales, axiales o laterales.

Las flores son actinomorfas, los sépalos, pétalos y carpelos tienen igual número, en ocasiones tienen

el mismo número de estambres. Los frutos con 4 a 5 folículos membranosos, dehiscentes por valvas

con numerosas semillas pequeñas.

Muchas están en peligro de extinción y en la gran mayoría de los casos su estatus está pobremente

documentado.



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La descripción más amplia de Crassulaceae es de Berger en 1930, que reconoce 35 géneros en seis

subfamilias que han sido colocadas en dos linajes, el linaje Crassula que incluye tres subfamilias

(Crassuloideae, Cotyledonoideae y Kalanchoideae) encontrándose predominantemente en el sur de

África y el linaje Sedum que incluye también tres subfamilias (Echeverioideae, Sedoideae, y

Sempervivoideae) encontrándose predominantemente en el hemisferio norte (‘t Hart y Eggli, 1995).

Dentro de estos dos linajes, Berger delimitó subfamilias basadas principalmente en la morfología

floral, la posición de las hojas y de las inflorescencias.

En tiempos recientes han surgido otras propuestas de clasificación para casi todos los grupos de

organismos. Dos factores han disparado este fenómeno: 1) el concepto de monofilia como base para

reconocer y nombrar grupos. Todos los miembros incluidos en alguna de las categorías taxonómicas

deben tener un origen común. 2) los estudios sobre las secuencias del ADN que han sido utilizadas

para generar hipótesis sobre la historia evolutiva, estos estudios conocidos como filogenias

moleculares, han modificado profundamente la idea de la evolución y consecuentemente, la

clasificación de muchos grupos de plantas, incluida las de la familia Crassulaceae. A pesar del uso

de numerosas fuentes de datos, las relaciones sistemáticas dentro Crassulaceae no son aún claras y

requieren de estudios más profundos.

1.2 EL GÉNERO ECHEVERIA

Es un grupo exclusivo de América. La Mayoría de las especies crecen mejor en las zonas templadas

del Hemisferio Norte. Está conformado por 127 especies conocidas y registradas de las cuales el

83% se restringen exclusivamente al territorio Mexicano (Reyes y Carrillo, 2011). México es el

centro de mayor diversidad y endemismo de este grupo de plantas. El nombre fue propuesto en el

año 1831 por el botánico Agustín Pyramus de Candolle, en honor al ilustrador botánico mexicano

Atanasio Echeverría y Godoy, quien asistió en el siglo XVIII a José Mariano Mociño y Martin de

Sessé y Lacasta, durante la Real Expedición Botánica a la Nueva España, cuyo objetivo era

compilar un inventario de la flora y fauna de este territorio (Reyes y col., 2011).

El género Echeveria se distribuye en casi todos los estados de la República Mexicana como puede

observarse en la Figura 1. Las especies de este género muestran preferencia por sitios con

afloramientos rocosos tales como riscos, laderas escarpadas, paredes más o menos verticales de

cañadas y cañones.

Las plantas que pertenecen al género Echeveria tienen la capacidad de almacenar agua en sus hojas

en forma de jugos mucilaginosos, principalmente durante los periodos de humedad de ahí que sean

llamadas plantas suculentas.



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Figura 1. Distribución del género Echeveria en la república Mexicana (Reyes y col., 2011).

1.2.1 Echeveria calycosa

Fue descrita en 1967 por Reid Moran, quien especifica que fue descubierta por el profesor Charles

H. Uhl y su equipo de la Universidad de Cornell, al sur de Uruapan, Michoacán, en la primavera de

1965, dándole el nombre de calycosa debido a su prominente cáliz (Moran, 1967)

Es una planta glabra, florece de julio a agosto, presenta un espesor de 0.5 a 1.5 cm, la roseta no

plana de 0.5 a 1.5 dm de diámetro, de 15 a 25 hojas muy juntas de color verde claro, en forma de

espátula, redondeada en el ápice. De 2.5 hasta 9 cm de largo, de 1.5 a 3.5 cm la parte más ancha, de

4 a 10 mm de ancho en la base. Los tallos florales (figura 2) de color verde a rosa en la parte

superior, de 0.5 a 2 dm de altura, de 1.5 a 5 mm de espesor en la base, los tallos florales viejos

suelen persistir unidos firmemente por varias temporadas.

Los cincinos o inflorescencias se presentan principalmente solitarios, de vez en cuando 2 y

raramente 3, tienen de 5 a 38 flores con apertura a intervalos de 3 días aproximadamente apuntando

primero hacia abajo con 45°, llegando a horizontal; Pedicelos de color rosa; cáliz de color rosa en la

base, de color verde claro arriba, corola amarilla por encima, rosa por debajo y apareciendo a

continuación anaranjado, pentagonal con lados aplanados de 7.5 a 10 mm de largo. Gineceo de

color rosado de 5 a 6 mm de altura y grosor de 3 a 3.5 mm, en la figura 3 se muestra un cincino. Los

pistilos erectos, los estilos amarillos con puntas verdes. Cromosomas: n=31 (Moran, 1967).



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Figura 3. Inflorescencia, cincino o vara floral de Echeveria calycosa

Fotografía tomada por MC I. García

Localmente se le conoce como “conchita”.

Figura 2. Planta de Echeveria calycosa floreciendo.

Fotografía tomada por MC I. García.



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1.3 PROPAGACIÓN DEL GÉNERO ECHEVERIA

La técnica de propagación de especies suculentas es relativamente reciente remontándose a los años

80’s (Villalobos y col., 1993). Las plantas suculentas se multiplican por dos vías distintas, la

reproducción sexual mediante semillas y la propagación vegetativa, por esquejes, vástagos y hojas.

1.3.1 Reproducción sexual

La reproducción sexual es prioritaria en el género Echeveria, ya que representa muchas ventajas

principalmente el mantenimiento de la diversidad genética, factor muy importante para un programa

de restauración ecológica.

Se requiere de la polinización entre dos o más plantas al inicio de la época reproductiva con la

finalidad de obtener semillas y posteriormente frutos. En la familia de las crasuláceas las semillas se

forman dentro de cápsulas después de un mes de la floración aproximadamente. En la mayoría de

las especies las semillas miden alrededor de 1 mm, son de color de paja a verde y cambian a color

rojo púrpura cuando están maduras (Reyes, 2013).

1.3.2 Reproducción asexual

La reproducción asexual puede ser por los siguientes métodos (Uhlig, 2008).

Vástagos.- brotes que emergen alrededor de la planta madre, los cuales con el tiempo emiten raíces

y forman un nuevo individuo idéntico a la planta madre.

Esquejes.- porciones de la planta que se desprenden o se toman de ella, como: hojas, tallos o raíces

a partir de los cuales se formará un nuevo ejemplar.

1.4 REGENERACIÓN POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS in vitro

El cultivo de tejidos in vitro se puede definir como el cultivo de células, tejidos y órganos bajo

condiciones físicas y químicas bien definidas manteniendo la asepsia. Con la ayuda de esta

tecnología se exploran las condiciones que promueven la división celular y la reprogramación

genética en condiciones in vitro, por efecto de los reguladores de crecimiento vegetal (RCV)

(Loyola y col., 2006); se aplica en la producción masiva de plantas comestibles, medicinales y

ornamentales las cuales presentan un interés económico o biológico, resultando también una

excelente alternativa tecnológica para conseguir una propagación clonal rápida en plantas cuyos

cultivos presentan bajos rendimientos y para el rescate de especies vegetales en peligro de

extinción.

El éxito en la propagación in vitro de una especie vegetal dependerá de la posibilidad de expresar su

potencialidad celular total, es decir, que algunas de sus células recuperen su condición

meristemática, concepto conocido como totipotencia celular, el cual sugiere que las células

vegetales tienen la información necesaria como unidad fundamental, para regenerar un organismo

completo. La regulación de la morfogénesis fue descrita por Miller y Skoog quienes establecieron

que se regula por la concentración de auxinas y citocininas en el medio de cultivo. Se ha observado



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que cada especie vegetal puede responder de manera diferente a las condiciones y a los reguladores

del crecimiento usados en el cultivo in vitro, por lo que es necesario trabajar con cada una de ellas

para encontrar las condiciones de regeneración más adecuadas, (Retes y col., 2007).

Las plantas están compuestas de diferentes órganos, estos están constituidos de tejidos, los cuales a

su vez se componen de células los cuales tienen la capacidad de responder a diferentes estímulos en

igual o diferente forma (Jacobs, 1977; Kerstetter, 1997), característica que es aprovechada por el

cultivo in vitro.

Esta técnica se inicia con material vegetal obtenido in vivo de diferentes partes de la planta

denominados “explantes”; El explante es el tejido vivo separado de su órgano propio y transferido a

un medio de cultivo artificial estéril apropiado. El medio de cultivo más utilizado es el desarrollado

por Murashige y Skoog, mejor conocido como MS el cual muestra particularmente concentraciones

muy altas de N03 y NH4 (Thorpe, 2007). Se requieren condiciones de asepsia para la disección

microscópica de la planta para transferir su punto de crecimiento o tejido meristemático al

recipiente estéril que contiene el medio de crecimiento seleccionado. Las células y tejidos que

crecerán y se desarrollarán, dependen de los objetivos del cultivo de tejidos y de los inductores que

se utilicen. En algunos casos las células formarán una masa aparentemente desorganizada, conocida

como callo, induciendo posteriormente la formación de órganos. Este proceso es llamado

organogénesis indirecta. En otros casos estarán presentes estructuras reconocibles como tallos,

órganos, raíces, bulbos u otros órganos. Este proceso es conocido como organogénesis directa.

Ambos procesos dependerán de la relación de fitohormonas, la división celular, la desdiferenciación

para adquirir la capacidad organogénica, de iniciación de órganos y desarrollo (Duclercq y col.,

2011).

La inducción de callo representa un proceso de desdiferenciación y división celular intensiva, que

dependerá principalmente del explante, genotipo, medio de cultivo, tipo de regulador de

crecimiento así como de su concentración y combinación (Larson et al. 2006, Feeney et al. 2007,

Rashmi y Trivedi 2014).

La organogénesis indirecta a menudo induce la variación somaclonal y permite exponer

características diferentes que no están expresadas normalmente en la naturaleza o bien eliminar

alguna indeseable (Sala y Labra 2003). Por otra parte, los callos pueden ser utilizados para hacer

suspensiones celulares para la producción de embriones somáticos. Normalmente, esta vía requiere

de una elevada concentración de auxinas en la etapa de inducción de callo.

Aun cuando técnicamente cualquier tejido es capaz de responder al tratamiento al que se exponga,

la selección del explante dependerá de

- El tipo de cultivo que se realice

- El propósito del cultivo propuesto

- La especie de planta utilizada.



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La elección correcta del tipo de explante puede tener un efecto importante en el éxito del cultivo de

tejido.

Los tipos de explantes más comúnmente utilizados son: embriones, órganos reproductores o

segmentos de tejido vegetativo como hojas, tallo o raíz. (Ammirato, 1985).

El cultivo in vitro permite obtener altas tasas de multiplicación partiendo de poco material vegetal

lo que es importante cuando se trata de poblaciones extremadamente reducidas, si se cuenta con un

número reducido de semillas o si el desarrollo de la planta es lento. (Iriondo, 2001).

Debido a que los explantes deben ser cultivados en medio nutritivo que también favorece el

crecimiento de microorganismos, en la medida de lo posible, los explantes deben estar libres de

contaminantes microbianos.

1.4.1 Medio de cultivo in vitro

Los medios de cultivo artificiales, involucran nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo

de una planta. Se componen de macronutientes, micronutrientes y vitaminas. El medio de cultivo,

provee de compuestos orgánicos e inorgánicos, particularmente contiene concentraciones muy altas

de N03 y NH4 (Thorpe, 2007), se adiciona con sacarosa como fuente de carbono; para su

solidificación se utiliza agar o phytagel. Normalmente está contenido en recipientes de vidrio donde

es esterilizado.

El medio de cultivo también puede estar adicionado con reguladores de crecimiento vegetal (RCV)

que son incorporados en concentraciones muy bajas, regulando el desarrollo, crecimiento y

nutrición de las plantas.

Durante el cultivo in vitro, las plántulas crecen en condiciones controladas dentro de recipientes de

cultivo relativamente herméticos, con el fin de evitar la contaminación microbiana dentro del

recipiente. Los medios de cultivo se complementan con fuentes de carbono (azúcares) como fuentes

de energía. Esta adición reduce considerablemente el potencial hídrico del medio y aumenta el

riesgo de contaminación bacteriana y fúngica. A las plántulas normalmente se les suministra

reguladores de crecimiento. Estas condiciones dan como resultado la formación de plántulas de

morfología, anatomía y fisiología diferente a la que se presenta en la naturaleza, (Kozai y Smith

1995).

Existen varias clases de reguladores de crecimiento vegetal reconocidas, los grupos principales son:

Auxinas, citocininas, giberelinas y etileno, aunque se han descubierto otras como los

brasinoesterioides y el ácido jasmónico que ya se encuentran bien caracterizados. A continuación se

describen los RCV utilizados en este trabajo.

1.4.2 Auxinas

La palabra auxina tiene su origen del griego y significa alargamiento o crecimiento (George y col.,

2008). Este grupo de hormonas vegetales fue el primero en descubrirse, regulan muchos aspectos

del desarrollo y crecimiento de las plantas; ya que son capaces de iniciar la división celular, en los



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tejidos están involucradas en el establecimiento y mantenimiento de la polaridad y en plantas

enteras tienen un marcado efecto en el mantenimiento de la dominancia apical y mediación de

tropismos (Friml, 2003). En las plantas se encuentran como ácido indolacético (AIA), otras formas

naturales son el ácido 4-cloro-idolacético (4-Cl-IAA), ácido fenilacético (PAA), ácido indol butírico

(IBA) y ácido indol propiónico (IPA), (Ludwing-Muller, 2000). Se encuentran en todos los tejidos

de la planta, una mayor concentración ocurre en las regiones en crecimiento activo, como

meristemos apicales, hojas jóvenes y frutos en desarrollo. Sus análogos sintéticos como el ácido

naftalenacético (ANA y el ácido 2,4 – diclorofenoxiacetico (2,4-D), son metabólicamente más

estables por lo que son ampliamente utilizados.

En el cultivo de tejidos se emplean auxinas para promover en combinación con la citocininas la

formación de callo y la inducción de raíces adventicias. Promueven la división y el alargamiento

celular. De manera general, una concentración de auxina similar a la concentración de citocinina

promueve la formación de callo. En concentraciones bajas de auxinas con respecto a las citocininas

se promueve la formación de brotes, y el uso único de auxinas promueve la formación de raíces.

La elección de la concentración de auxinas en el cultivo de tejidos, dependerá de: el tipo de

crecimiento y desarrollo requerido; los niveles endógenos dentro del explante; la sensibilidad del

tejido de la planta a las auxinas; la interacción si existe, entre auxinas aplicadas y las sustancias

endógenas naturales.

1.4.3 Citocininas

Se sintetizan principalmente en la raíz, aunque también en el meristemo apical y en semillas

inmaduras. Al igual que las auxinas las más utilizadas son las de origen sintético como la

benciladenina (BA) y la furfurilaminopurina (Cinetina). Se ha sintetizado otro tipo de moléculas

con estructura totalmente diferente, sin la base adenina, pero de acción biológica idéntica a la

citocininas como el tidiazurón (TDZ). Todos ellos más potentes que las hormonas naturales

endógenas (zeatina, o isopentiladenina).

Las citocininas regulan el crecimiento de brotes y raíces. Controlan la tasa de diferenciación celular

durante el desarrollo del meristemo radicular, suprimiendo el transporte y señalización de las

auxinas. En el cultivo in vitro se utilizan para promover la formación de brotes y de embriones, en

combinación con auxinas, estimulan la división celular y controlan de la morfogénesis (George y

col., 2008). Se ha encontrado que la adición de 0,5 mg/l cinetina y auxinas al medio de

enraizamiento la citocinina tiene un efecto bacteriostático (Boxus y Terzi, 1988).

1.4.4 Etapas del cultivo in vitro

El cultivo in vitro se divide en 4 etapas generales (Castillo, 2008), pero Debergh y Maene (1981),

sugirieron una etapa adicional conocida como etapa 0.

Las etapas se describen de la siguiente manera:



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Etapa 0.- Es el paso inicial de la micropropagación en el que las plantas destinadas para ser

utilizadas como fuente de material vegetal en una propagación in vitro, se cultivan bajo condiciones

controladas en invernadero, para incidir sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos

(Olmos y col. 2010). Esta etapa de pre-acondicionamiento de la planta donadora incluye establecer

medidas para la reducción de contaminantes tanto superficiales como endógenos.

Etapa 1.- Establecimiento. Consiste en mantener explantes en condiciones de cultivo in vitro,

libres de microorganismos y de oxidación, desarrollándose en un medio de cultivo sintético. La

razón por la que los explantes deben encontrarse libres de microorganismos, aun cuando en la

naturaleza, éstos no sean patógenos e incluso puedan ser benéficos, es debido a que en el cultivo in

vitro la planta cambia su metabolismo de autótrofo a mixotótrofo, es decir su actividad fotosintética

se disminuye de manera significativa y la mayor parte de fuente de carbono lo constituye la

sacarosa que es el componente mayoritario del medio de cultivo. Esta fuente de carbono es también

una fuente de carbono para los microrganismos, los cuales independientemente de su nicho

ecológico, tienen una tasa de propagación mucho mayor que las células vegetales y en

consecuencia, pueden causar daño a los explantes. Por esta razón, los explantes deben pasar por un

proceso de desinfección antes de sembrarse en el medio de cultivo previamente esterilizado. La

selección y concentración de los desinfectantes y el tiempo de exposición a ellos, se determina, en

gran medida, por las características del explante; en la práctica, se establecen experimentalmente

por ensayo y error (Roca y Mroginski, 1991).

Etapa 2.- Propagación o multiplicación. En esta etapa, el explante establecido, encuentra en el

medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo, poniéndose en contacto

con reguladores de crecimiento que inducen su multiplicación. El número de plantas que se

obtienen depende de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo, el cual puede

alcanzar incrementos exponenciales cuando se han optimizado todos los factores que afectan el

crecimiento.

En los sistemas de regeneración vía organogénesis es necesario establecer la fuente de tejido

vegetal, un protocolo de desinfección y evaluar diferentes tejidos como explante, probar diferentes

interacciones de concentraciones de RCV para establecer la inducción de callo, brotes y /o raíz

(Rico, 2013).

Etapa 3.- Enraizamiento. En esta etapa, las partes aéreas de las plantas obtenidas se transfieren a

medio de cultivo inductor de raíces logrando de esta manera la obtención de plantas completas.

Un sistema radicular funcional y adecuado en las plantas garantiza no solo su supervivencia, sino un

desarrollo apropiado durante y después de la etapa de aclimatación en invernadero, en vivero y

posteriormente en el campo (Goncalves J. y col. 1998)

Etapa 4.- Aclimatación. Durante ésta etapa las plántulas procedentes de cultivo in vitro, se

adaptan a condiciones ex vitro, se busca establecer un cambio gradual que le permita a la planta



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sobrevivir, recuperar su metabolismo autótrofo, abandonando el metabolismo mixótrofo de la etapa

de cultivo in vitro.

Al transferir a condiciones ex vitro las plántulas tienen que cambiar las condiciones antes

mencionadas. En el invernadero, y especialmente en el campo, la irradiación es mucho mayor y la

humedad del aire mucho menor que en los recipientes.

El potencial hídrico del sustrato es mayor que el potencial hídrico del medio de cultivo con

sacarosa, las plántulas pueden marchitarse rápidamente debido a que la pérdida de agua de sus hojas

no está restringida. Además, el suministro de agua puede ser limitante debido a la baja

conductividad hídrica de raíces (Fila y col., 1998). Muchas plántulas mueren, durante este período.

Por lo tanto, después del trasplante a ex vitro de plántulas por lo general necesitan algunas semanas

de aclimatación con reducción gradual de la humedad del aire (Preece y Sutter 1991, Kadlecek,

1997, Bolar y col., 1998). Se han desarrollado unidades de aclimatación con la temperatura, la

humedad, la radiación, la concentración de CO2 y la velocidad del flujo del aire controlado por un

ordenador (Hayashi, y col., 1988).

1.4.5 Trabajos publicados del cultivo in vitro en diferentes especies de Echeveria

En el caso de Echeveria calycosa al igual que en la mayoría de las especies de su género, no se ha

reportado un sistema de regeneración in vitro a pesar que se trata de una planta con gran potencial

ornamental y económico.

Dentro del género Echeveria se han publicado contados estudios sobre propagación in vitro, entre

los cuales se encuentran los siguientes:

- “In vitro Propagation of Echeveria elegans, a Species of the Flora Endangered Mexican”

El objetivo de este estudio fue realizar la propagación in vitro de esta especie a partir de

brotes axilares como una alternativa de multiplicación y preservación, utilizando una

combinación de 6 Bencil Aminopurina (6-BAP) con Ácido Naftalen Acético (α-NAA) en

diferentes concentraciones (Solís y col., 2013).Obteniendo un máximo de 4.21 brotes

promedio por explante en las concentraciones: 6.66 µM of 6-BAP + 1.35 µM of α-NAA a

los 40 días de su establecimiento.

- “Establecimiento de métodos de propagación vegetativa in vivo e in vitro de Echeveria laui

(CRASSULACEAE)” El objetivo general fue propagar mediante reproducción sexual y

vegetativa in vivo e in vitro individuos de Echeveria laui. Para los experimentos realizados

en este trabajo se utilizaron hojas tomadas directamente de la planta madre. (Verastegui,



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2009). Se obtuvo formación de brotes con 6 mg/l de Cinetina y 4 mg/l de Ácido naftalen

acético, sin mencionar la tasa de propagación.

- “Obtención in vitro de plantas de Echeveria pumila cv. 'Glauca' libres de bacterias y

fitoplasmas asociados a la fasciación del tallo”. El objetivo de este trabajo fue propagar

mediante cultivo in vitro esta planta para obtener material vegetal y desarrollar una

metodología para eliminar patógenos (Bulbarela, 2014). Utilizando la combinación de BA

0.2 mg/l y ANA 0.02 mg/l se obtuvieron 3.6 brotes por explante y con Thidiazuron (0.6

mg/l) 2.5 brotes por explante libres de bacterias y fitoplasmas.

- “Comparación de la tasa de propagación in vitro y ex vitro de la especie endémica de

Michoacán, Echeveria purhepecha”. El objetivo fue propagar in vitro y ex vitro la especie y

comparar los resultados obtenidos de las tasas de propagación. Por observaciones hechas en

campo, E. purhepecha se ha considerado como una especie en posible situación de

vulnerabilidad ocasionada, principalmente, por el cambio de uso de suelo en su hábitat

natural. La tasa de propagación bajo condiciones de cultivo in vitro de E. purhepecha con 4

mg/l de 6 Bencil aminopurina (BAP) y 0.2 mg/l de ácido indol acético (AIA) a partir de

hoja y tallo fue 1.6 puntos mayor respecto a la de propagación obtenida ex vitro, (Ayala y

Obledo, 2015).



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2 JUSTIFICACIÓN

Echeveria calycosa es una especie vegetal que al igual que la mayoría de los individuos que

pertenecen al género Echeveria tiene gran valor como planta ornamental, muchas especies de este

género aunque no aparecen en el listado de la Norma Oficial Mexicana NOM-059-SEMARNAT-

2010, (Protección ambiental-Especies nativas de México de flora y fauna silvestres- Categorías de

riesgo y especificaciones para su inclusión, exclusión o cambio- Lista de especies en riesgo), se ha

considerado como una especie en posible situación de vulnerabilidad.

Al encontrarse en una zona muy delimitada posee un alto grado de endemismo lo que la hace más

vulnerable que aquellas que se encuentran ampliamente distribuidas.

En la actualidad enfrenta varias amenazas como son el cambio de uso de suelo en la región donde es

endémica, la conversión de áreas de vegetación natural a zonas frutícolas diversas; se han

localizado pocas poblaciones que están formadas por un número pequeño de individuos las cuales

tienen un lento crecimiento; la extracción ilegal de poblaciones silvestres en su hábitat natural con

fines de comercialización, frecuentemente esta actividad recolectora supera la tasa natural de

reproducción; existe poca o nula información sobre su propagación.

Debido a la problemática que presenta E. calycosa es importante realizar estudios de regeneración,

principalmente de propagación in vitro debido a que por medio de este método se han reportado

estudios de propagación masiva de otras especies vegetales en las cuales probando diferentes

combinaciones de reguladores de crecimiento vegetal y variando las proporciones de los mismos se

ha logrado encontrar la combinación más adecuada para el propósito, contribuyendo así a su

conservación, multiplicación y posiblemente asegurar su persistencia.



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3 HIPOTESIS

La tasa de propagación que presenta Echeveria calycosa bajo condiciones de invernadero se puede

incrementar, mediante el desarrollo de un sistema de regeneración in vitro evaluando diferentes

concentraciones de los reguladores de crecimiento vegetal Acido Naftalen Acético (ANA) y

Cinetina (KIN).



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4 OBJETIVOS

4.1 General

Establecer un sistema de regeneración in vitro para la especie Echeveria calycosa

que incremente su tasa de propagación como alternativa para su preservación.

4.2 Específicos

Implementar una metodología para la propagación por esqueje de hoja de

Echeveria calycosa.

Conocer el índice de germinación de las semillas de Echeveria calycosa.

Implementar una metodología para el establecimiento in vitro de explantes de

Echeveria calycosa.

Seleccionar el tejido vegetal que presente la mejor respuesta de regeneración in

vitro de E. calycosa.

Evaluar diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento vegetal:

Ácido Naftalen Acético (ANA) y Cinetina (KIN) para establecer cuáles son las

concentraciones que incrementan la tasa de propagación de Echeveria calycosa.

Evaluar diferentes medios de cultivo para enraizamiento in vitro.

Determinar las condiciones de aclimatación de las plantas de E. calycosa,

propagadas in vitro, sin pasar por la etapa de enraizamiento in vitro, utilizando

ácido indol butírico como inductor de formación de raíz en condiciones ex vitro.



Página 18

5 METODOLOGÍA

5.1 Material Vegetal

Se utilizaron plantas de Echeveria calycosa colectadas en su hábitat natural: la cañada del rio

Cupatitzio en el municipio de la Tinaja Verde al sur de Uruapan en el Estado de Michoacán, por el

M. C. Ignacio García; mismas que fueron mantenidas en el invernadero del CIATEJ (Figura 4).

Figura 4. A) Plantas de E. calycosa en su hábitat natural, B) Planta de E. calycosa mantenida en

condiciones de invernadero y tratada con fungicida Amistar®

5.2 Propagación por semilla (sexual)

Las semillas fueron obtenidas de la inflorescencia de plantas en floración mantenidas en

condiciones controladas dentro del invernadero del CIATEJ. Los frutos se dejaron madurar y secar

para la posterior recolección de las semillas, con la ayuda del microscopio estereoscopio se

separaron semillas que presentaron características indicativas de viabilidad: color rojo y turgentes,

las semillas se observaron por medio de microscopio óptico binocular a través del objetivo 10X, se

observó con detalle la estructura, su tamaño (menor de 1 mm), para tener un mejor criterio de

selección. Se contaron 100 semillas, las cuales se desinfectaron sumergiéndolas en cloro al 10 % (a

partir de cloro comercial) durante 1 minuto. Después de este tratamiento se sembraron en botes de

plástico con tapa del mismo material con sustrato conformado por tepojal – peat moss 1:1, pasado a

través de malla 10 – 12 y esterilizado en autoclave durante 15 min a 15 lb de presión. Los botes con

semillas se mantuvieron en cámaras de incubación en condiciones controladas: temperatura de

23°C, iluminación que les proporcionó un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica

de 25 μmoles·m-2

·s-1

). Se mantuvieron en estas condiciones durante 150 días. Variables a medir,

número de semillas que germinaron, considerando como semilla germinada aquella que da origen a

una nueva planta de la misma especie. Con los datos generados se obtuvo el porcentaje de

germinación de semillas de E. calycosa = (Número de semillas germinadas / número total de

semillas puestas a germinar) x 100.



Página 19

5.3 Propagación por esqueje de hoja (asexual)

Se utilizaron hojas de la parte media de la roseta de la planta adulta de E. calycosa, se procuró hojas

jóvenes de tamaño medio. Con cuidado se separaron las hojas de la base del tallo, la herida se trató

con Captan® (fungicida) polvo con el fin de promover la cicatrización del tejido y evitar su

contaminación, se dejaron en lugar fresco y seco durante dos semanas, transcurrido este lapso de

tiempo se procedió a propagarlas, adicionando en la base de cada hoja gel enraizador (Clonex®) y

estableciendo una hoja por maceta (dimensiones 6 X 6 X 6 cm) conteniendo sustrato [tepojal

(pasado a través de malla 10 – 12) – peat moss en una proporción 1:1] (Verastegui, 2009),

esterilizado en horno de microondas, durante 25 min. Se mantuvieron en cámaras de incubación

controladas a una temperatura de 25°C, proporcionándoles iluminación con un fotoperiodo de 16:8

luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2

·s-1

), el sustrato se mantuvo siempre húmedo

por medio de riego con agua de garrafón. Se mantuvieron en estas condiciones durante 45 días,

pasado este tiempo se registraron los resultados. Se establecieron 3 hojas, no se aplicaron

tratamientos, ni se realizaron repeticiones debido al poco material vegetal con el que se contó. Las

variables a medir fueron, número de explantes enraizados, número de rosetas formadas por

explante, sobrevivencia y calidad del explante. En esta etapa no se realizó análisis estadístico.

5.4 Propagación in vitro

La metodología para la propagación in vitro de E. calycosa, se llevó a cabo en cuatro etapas:

Establecimiento de explantes en condiciones de cultivo in vitro, Regeneración de los explantes que

sobrevivieron a la etapa de establecimiento, utilizando reguladores de crecimiento vegetal,

inducción de enraizamiento y aclimatación de plantas de E. calycosa a condiciones ex vitro.

5.4.1 Establecimiento

Se diseñaron cuatro diferentes procedimientos para inducir la mayor sobrevivencia de los explantes

de E. calycosa en la etapa de establecimiento in vitro; en la tabla 1 se muestra a detalle los cuatro

procedimientos.

5.4.1.1 Explantes

Los explantes se obtuvieron de las plantas mencionadas en el párrafo de material vegetal, se

utilizaron cuatro diferentes tipos de explantes para seleccionar el tejido vegetal que produjera la

mejor respuesta en los estudios de propagación para esta especie, la medida del explante fue de

aproximadamente 1 cm de largo, el ancho dependió del tejido vegetal del cual se tratara, en hoja se

procuró que fuera también de 1 cm, todos ellos se trataron con el mismo método de desinfección el

cual se detalla en el apartado correspondiente, el tipo de explante, el número de ellos y su

distribución en los tratamientos se encuentra detallado en la tabla 1. De acuerdo a los resultados

obtenidos, los tratamientos se fueron adecuando de manera progresiva hasta alcanzar el objetivo de

su establecimiento en condiciones in vitro, los tres primeros tratamientos se realizaron con plantas



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tomadas directamente de su hábitat natural y el cuarto de plantas mantenidas en cuarentena durante

2 meses a las cuales se les aplicó el producto Amistar® siguiendo las indicaciones del fabricante

(etapa 0 o de acondicionamiento).

Tabla 1.- Procedimientos para establecer explantes de E. calycosa in vitro, su origen y cantidad

utilizados en cada caso.

# Procedimiento Explante

Tipo Cantidad

1 Se utilizaron explantes de plantas obtenidas directamente de su hábitat

natural, se procedió a su desinfección y establecimiento en medio de

cultivo Murashige - Skoog (MS).

Hoja 160


natural, antes de realizar la desinfección se sometieron a un choque

térmico. Los explantes se lavaron, se colocaron en un envase con agua a

60°C durante 2 min, pasándolas inmediatamente después a otro envase

conteniendo agua a 0°C. se procedió a su desinfección y establecimiento

en medio MS.

Hoja 20


natural, antes de realizar la desinfección se sometieron a un choque

térmico, esto con el fin de eliminar microorganismos endógenos. Los

explantes se lavaron, se colocaron en un envase con agua a 60°C

durante 2 min, pasándolas inmediatamente después a otro envase

conteniendo agua a 0°C. se procedió a su desinfección y establecimiento

en medio MS al cual se le adiciono 0.48 ml de PPM*/l de medio de

cultivo MS.

Hoja 40

4 Las plantas de E. calycosa obtenidas de su hábitat natural se les aplicó

en forma de spray una solución de Amistar®** fungicida de amplio

espectro con doble poder translaminar y sistémico a una conc. de 20

mg/100ml aplicación foliar a las hojas de la roseta, las plantas de E.

calycosa recibieron este tratamiento de acondicionamiento cada 10 días

durante dos meses. Las plantas se mantuvieron en condiciones

controladas de humedad y temperatura durante este periodo. Una vez

que la planta contó cuando menos con 4 aplicaciones, se tomaron los

explantes, se procedió a su desinfección y establecimiento en medio de

cultivo MS.

Hoja

Tallo

floral

Tallo

Raíz

84

125

20

15

*PPM, Plant Preservative Mixture, (5-Cloro-2-Metil-3[2H]-Isotiazolone 0,1350 % + 2-Metil-3[2H]-Isotiazolone 0,0412 % +

ingredientes inertes 99,8238 %) es un conservador de amplio espectro, que puede tener acción biocida o biostática, recomendado

para controlar la contaminación microbiana en el cultivo de tejidos vegetal.

**Amistar ® contiene 500 g /kg de azoxistrobi : Metil (E)-2-2-6-(2-cianofenoxi) pirimidin-4-iloxi-fenil-3-metoxiacrilato.



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5.4.1.2 Desinfección de los explantes

Los pasos para la desinfección de los explantes seguidos en este trabajo se describen en la tabla 2.

En cada etapa se colocó el tejido vegetal dentro de un recipiente de tamaño adecuado a los

explantes conteniendo el tratamiento correspondiente y se mantuvo bajo agitación durante el tiempo

requerido.

Tratamiento Tiempo (min)

1.- Solución antioxidante* 3

2.- Solución jabonosa** 5

3.- Agua destilada 2

4.- Alcohol etílico al 80% 1.5

5.- Agua destilada 2

6.- Cloro 6%*** 30

7.- Agua destilada estéril 2 min en cada enjuague****

8.- Solución antioxidante estéril * 2

* Ácido cítrico 200 mg/l – ácido ascórbico 150 mg/l

** Detergente Axón® al 3%

*** Hipoclorito de sodio 25 % (a partir de cloro comercial) + 2 gotas de tween 20 + 2

gotas de microdyn® ****Se realizaron tres enjuagues

Tabla 2. Tratamiento de desinfección de los explantes de E. calycosa.



Página 22

5.4.1.3 Establecimiento de los explantes

Los explantes desinfectados se establecieron en cajas Petri con 25 ml de medio de cultivo

Murashige y Skoog, (MS) (1962) adicionado con 30 g de sacarosa y 4.5 g/l de phytagel, el pH se

ajustó a 5.7 antes de la adición de phytagel con HCl 1 N o NaOH 1 N según era necesario. Se

esterilizó en autoclave a 121°C, 15 lb de presión por 20 min. (Gauchan, 2012), este procedimiento

se realizó en campana de flujo laminar en condiciones de asepsia. Las cajas Petri se colocaron en

cámaras de incubación en condiciones controladas de temperatura (20°C) e iluminación con un

fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2

·s-1

), Se mantuvieron en

estas condiciones por un periodo mínimo de ocho días para su adaptación al medio y comprobación

de ausencia de microorganismos. Las variables de respuesta fueron el número de explantes libres de

contaminación y la calidad del explante. La calidad del explante se determinó utilizando una escala

ordinal de 0 a 100 donde el explante con calidad inicial es un valor de 100 hasta 0 donde representa

explante completamente blanco o contaminado.

Los resultados se analizaron utilizando ANOVA y la prueba de rangos múltiples de diferencia

mínima significativa con apoyo del programa estadístico Statgraphics centurión XV.I, comparando

plantas con tratamiento y sin tratamiento antimicrobiano, la contaminación y calidad del explante

con respecto al tipo de explante.

5.4.2 Propagación

5.4.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui.

El objetivo de esta etapa fue evaluar la respuesta del explante previamente establecido a la adición

de RCV utilizados en estudios preliminares realizados en el laboratorio y en trabajos publicados en

otras especies de Echeveria, que han dado buenos resultados, para comprobar si en la especie E.

calycosa produce una respuesta positiva en su regeneración utilizando los mismos RCV y cumple el

objetivo general de este trabajo que es propagar esta especie.

Los reguladores de crecimiento vegetal probados fueron cinetina (KIN) y ácido naftalenacético

(ANA) en concentraciones de 6 mg/l y 4 mg/l respectivamente, concentraciones que han producido

brotes en otra especie de Echeveria (Verastegui, 2009), no se reporta tasa de propagación.

Se utilizaron los explantes que sobrevivieron a la etapa de establecimiento, obtenidos de hojas de

roseta y de las inflorescencias, los cuales se traspasaron a frascos de vidrio con tapa de plástico que

contenían 25 ml de medio de cultivo MS al 50% suplementado con 6 mg/l de cinetina (KIN) y 4

mg/l de ácido naftalenacético (ANA) + sacarosa 15 g/l + phytagel 4.5 g/l, el pH = 5.7 se ajustó

antes de la adición de phytagel con HCl 1 N o NaOH 1 N según fue necesario. Se esterilizó en

autoclave a 121°C, 15 lb de presión por 20 min. (Gauchan, 2012).



Página 23

Los frascos se colocaron en cámaras de incubación con condiciones controladas de temperatura

(20°C) y de iluminación con un fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25

μmoles·m-2

·s-1

), Se mantuvieron en estas condiciones hasta un periodo de 120 días. Se realizaron

observaciones semanales, registrando los cambios observados. Las variables de respuesta fueron:

sobrevivencia, presencia de callo, de raíz y/o de rosetas, tiempo de respuesta, la cantidad de brotes

nuevos y calidad presentada por el explante, en este caso por tratarse de una variable cualitativa la

calidad se midió de acuerdo al color del explante con la siguiente escala: 1= explante verde fuerte,

2= explante verde claro, 3= explante blanco o casi blanco, 4= explante café, 5= explante negro

(totalmente oxidado). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del

programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

5.4.2.2 Propagación, experimentos bifactoriales con 4 niveles.

Se realizaron 2 experimentos completos, cada uno formado por 16 tratamientos de diferentes

concentraciones de los dos RCV que se seleccionaron a partir de estudios que presentaron

organogénesis en otras especies de Echeveria; al conjunto de 16 tratamientos se le identifico como

un estudio factorial.

5.4.2.2.1 Primer experimento de propagación

El objetivo fue probar combinaciones de las concentraciones de los mismos reguladores de

crecimiento vegetal que probaron estimular al explante dando una respuesta mayor sobre la tasa de

regeneración que tiene E. calycosa en invernadero.

Se diseñó un experimento bifactorial con cuatro niveles. Donde los factores fueron los RCV: KIN y

ANA; y los niveles las concentraciones de estos RCV se muestran en la tabla 3.

Las concentraciones se eligieron tratando de que entre ellas se encontrara el tratamiento que ya dio

respuesta de organogénesis directa y abarcar concentraciones más altas y más bajas para observar el

comportamiento del explante al exponerlo a ellas.



Página 24

Los tratamientos a probar en este estudio son el resultado de las combinaciones de los cuatro

niveles de los RCV mostrados en la tabla 3. Los 16 tratamientos resultantes se muestran en la tabla

4.

El tipo de explante y su manejo se encuentra descrito al inicio de la propagación in vitro

Las variables de respuesta fueron sobrevivencia del explante, presencia de callo compacto, callo

friable, presencia de raíz y/o brotes, la cantidad y calidad presentada; tiempo de respuesta, en cada

una de las diferentes concentraciones del diseño bifactorial. La calidad de los brotes y callo se

determinará con ayuda de una escala ordinal del 1 al 3, donde: 1 verde; 2 verde claro – beige; 3

beige – blanco. La calidad del explante se midió utilizando una escala ordinal de 1 a 5 donde: la

calidad 1 corresponde a verde intenso (aspecto fresco); la calidad 2 (verde seco – claro), la calidad 3

(verde muy claro a blanco), la calidad 4 (café claro transparente), la calidad 5 (negro; oxidación

completa).

El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático

STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

CITOCININA AUXINA

Nivel KIN (mg/ ml) ANA (mg/ml)

1 0.0 0.0

2 2.0 4.0

3 6.0 8.0

4 18.0 16.0

Tabla 3. Concentraciones de RCV utilizadas en el primer experimento de

propagación.



Página 25

Tratamiento RCV (mg/l)

ANA KIN

1 0.0 0.0

2 4.0 0.0

3 8.0 0.0

4 16.0 0.0

5 0.0 2.0

6 4.0 2.0

7 8.0 2.0

8 16.0 2.0

9 0.0 6.0

10 4.0 6.0

11 8.0 6.0

12 16.0 6.0

13 0.0 18.0

14 4.0 18.0

15 8.0 18.0

16 16.0 18.0

Tabla 4. Tratamientos que componen el primer experimento de propagación.



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5.4.2.2.2. Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E. calycosa

obtenidas in vitro.

En este primer experimento de propagación se incluyó otro tipo de explante que fue rosetas de E.

calycosa obtenidas mediante propagación in vitro en medio de cultivo MS al 50 % suplementado

con RCV ANA: KIN, 4: 6 mg/l respectivamente. En la figura 5 se observa el tamaño y la cantidad

de rosetas obtenidas mediante su propagación por cultivo in vitro, las cuales se expusieron a los 16

tratamientos. Solo se realizó un estudio factorial de acuerdo al material vegetal con el que se

contaba. Al encontrarse en condiciones de asepsia, no hubo necesidad de pasar por la etapa de

establecimiento, los explantes se distribuyeron en los 16 tratamientos en condiciones de asepsia en

el factorial identificado con el número 4.

Figura 5. Rosetas obtenidas por cultivo in vitro a partir de un explante de E. Calycosa propagado en

medio MS al 50% suplementado con ANA: KIN, 4: 6 mg/l.

5.4.2.2.3 Primer experimento de propagación utilizando E. purhepecha

Con el fin de tener una referencia más sobre el comportamiento de explantes de plantas del género

Echeveria, se utilizó la especie E. purhepecha planta de la cual ya se han obtenido resultados

positivos en propagación con otros RCV. Los explantes se obtuvieron de plantas donantes que se

tienen en el invernadero del CIATEJ, los cuales fueron expuestos a las mismas concentraciones de

reguladores utilizados en esta propagación. Las variables a medir fueron las mismas ya

mencionadas para las pruebas realizadas en Echeveria calycosa,



Página 27

5.4.2.3.1 Segundo experimento de propagación

El objetivo de realizar este segundo estudio de propagación fue buscar si existe un tratamiento que

incremente la tasa de regeneración que tiene E. calycosa en el invernadero, utilizando concentraciones

más bajas de los RCV. Se ha comprobado que mediante modificaciones en la composición química del

medio de cultivo, especialmente del balance citocininas/auxinas, así como de otras condiciones físicas y

químicas del cultivo, es posible inducir la diferenciación del tejido; sin embargo, pueden ocurrir algunas

variaciones en la respuesta, dependiendo de la variedad y de las condiciones del cultivo (Roca, 1983).

Se diseñó un experimento bifactorial con cuatro niveles. Donde los factores los factores fueron los

RCV: KIN y ANA; y los niveles las concentraciones de estos RCV se muestran en la tabla 5.

CITOCININA AUXINA

Nivel KIN (mg/ ml) ANA (mg/ml)

1 0.0 0.0

2 0.6 3.0

3 4.0 6.0

4 8.0 12.0

Loa tratamientos a probar en este estudio son el resultado de las combinaciones de los cuatro

niveles de RCV mostrados en la tabla 3. Los 16 tratamientos resultantes se muestran en la tabla 6.

El tipo de explante y su manejo es el que se describió al inicio de la propagación in vitro. Las

variables de respuesta fueron sobrevivencia del explante, presencia de callo compacto, callo friable,

presencia de raíz y/o brotes, la cantidad y calidad presentada; tiempo de respuesta, en cada una de

las diferentes concentraciones del diseño bifactorial. La calidad de los brotes y callo se determinó

con ayuda de una escala ordinal del 1 al 3, donde: 1 verde; 2 verde claro – beige; 3 beige – blanco.

La calidad del explante se midió utilizando una escala ordinal de 1 a 5 donde: la calidad 1

corresponde a verde intenso (aspecto fresco); la calidad 2 (verde seco – claro), la calidad 3 (verde

muy claro a blanco), la calidad 4 (café claro transparente), la calidad 5 (negro; oxidación

completa).

Tabla 5. Concentraciones de RCV utilizadas en el segundo experimento de

propagación.



Página 28

El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD con apoyo del programa informático

STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

Tratamiento RCV (mg/l)

ANA KIN

1 0.0 0.0

2 3.0 0.0

3 6.0 0.0

4 12.0 0.0

5 0.0 0.6

6 3.0 0.6

7 6.0 0.6

8 12.0 0.6

9 0.0 4.0

10 3.0 4.0

11 6.0 4.0

12 12.0 4.0

13 0.0 8.0

14 3.0 8.0

15 6.0 8.0

16 12.0 8.0

Tabla 6. Tratamientos que componen el segundo experimento de propagación.



Página 29

5.4.2.3.2 Segundo experimento de propagación utilizando E. purhepecha

Con el fin de corroborar los datos obtenidos en los explantes de E. calycosa en este segundo estudio

se tomó como referencia nuevamente la especie E. purhepecha. Los explantes fueron expuestos a

las mismas concentraciones de reguladores utilizados en esta propagación. Las variables a medir

fueron las mismas ya mencionadas para las pruebas realizadas en E. calycosa mostradas en el

segundo experimento de propagación,



Página 30

5.5 Enraizamiento

Esta etapa de propagación se diseñó para encontrar la mejor respuesta entre la composición de los

medios de cultivo que se ha reportado que inducen la formación de raíz en plántulas obtenidas en

propagación in vitro.

Las auxinas cumplen un papel importante en el enraizamiento adventicio, siendo su aplicación

común en la mayoría de los sistemas de propagación. Los ácidos naftalenacético (ANA) e indol

butírico (IBA) son las fitohormonas más empleadas y la forma en que se apliquen incide en el éxito

del proceso morfogénico (Luna y col. 2004). Las altas concentraciones de citocininas (0,5 a 10

mg/l) inhiben o retardan la formación de raíces (Schraudolf y Reinert, 1959; Harris y Hart, 1964;

Ben-Jaacov y col., 1991). A pesar de estas observaciones, hay informes de que las citoquininas a

veces pueden inducir o promover el crecimiento de la raíz (Fries, 1960), o la formación de raíces

adventicias, en ausencia de auxinas (Nemeth, 1979). Concentraciones bajas (0,5 mg/l) de cinetina

sin presencia de auxinas son eficaces para enraizar brotes (Konwar y Coutts, 1990). Algunas

especies requieren la adición de citocininas para la inducción y desarrollo de la raíz. Se ha reportado

que el uso del carbón activado en medio sin reguladores ha inducido rizogénesis y plántulas más

grandes (Debnath & McRae, 2001), así como se ha reportado que el incremento de la sacarosa en el

medio de cultivo aumenta tanto el peso de la materia fresca como el de la materia seca (Kubota y

col., 2002; Shim y col., 2003).

En base a esta información se diseñaron 14 tratamientos para observar el efecto en la inducción de

raíz en los brotes obtenidos en la propagación in vitro, los tratamientos se describen en la tabla No.

7. La exposición de los brotes a Cinetina se realizó en cuatro diferentes periodos de tiempo y

terminado este periodo se procedió a pasarlos a medio MS – 30 g/ de sacarosa – 2 g/l de carbón

activado, para que completaran el periodo de tiempo de 40 + 2 días que tienen los demás

tratamientos.

Se utilizaron frascos de vidrio con tapa de plástico que contenía 25 ml de medio de cultivo

correspondiente a cada uno de los tratamientos descritos en la tabla 7. A cada medio se le ajusto el

pH a 5.7 antes de la adición del agar, con HCl 1 N o NaOH 1 N según fue necesario. Se

esterilizaron en autoclave a 121°C, 15 lb de presión por 15 min. Este procedimiento se realizó en

campana de flujo laminar en condiciones asépticas.

Se establecieron los brotes obtenidos de la segunda propagación in vitro, uno por frasco. Cada

tratamiento tuvo cuarenta repeticiones, excepto el de la KIN que fueron 8 repeticiones por periodo

de exposición dando un total de 32 repeticiones) esto debido a la cantidad de material vegetal con el

que se contó, los frascos se mantuvieron en incubación a una temperatura de 23 °C con un

fotoperiodo de 16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2

·s-1

) por un periodo de 40

+ 2 días, al término de este periodo se procedió a medir las variables.



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# MS % Sacarosa g/l Carbón activado ANA 0.1 mg/l KIN 0.1 mg/l

1 100 30 + - -

2 100 30 - - -

3 50 15 + - -

4 50 15 - - -

5 50 7.5 + - -

6 50 7.5 - - -

7 50 0.0 + - -

8 50 0.0 - - -

9 50 15 + + -

10 50 15 - + -

11 100 30 + - +1

12 100 30 + - + 2

13 100 30 + - + 3

14 100 30 + - + 4

(1) una semana de exposición a la KIN; (2) dos semanas de exposición a la KIN; (3) tres semana de exposición a la KIN;

(4) cuatro semanas de exposición a la KIN; En todos los tratamientos el agente gelificante fue agar 8 g / l.

Las variables a medir fueron: presencia o ausencia de raíz, largo de la raíz, tipo de raíz [en caso de

presentar: R= ramificada, S= separadas, A= adventicias (sin un lugar específico en la plántula)],

tamaño de la plántula (largo y ancho en mm). El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y

LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I.

Tabla 7. Tratamientos para enraizar las rosetas de E. calycosa obtenidas en la

propagación in vitro.



Página 32

5.6 Aclimatación (periodo ex vitro)

Una vez transcurridos 40 + 2 días después de iniciado el periodo de enraizamiento se procedió a

retirar las plántulas obtenidas del medio de cultivo in vitro. Las plántulas obtenidas se pasaron a

macetas con un diámetro de 5 cm conteniendo sustrato peat moss – tepojal (1:1) con un tamaño de

partícula de malla 10 - 12 esterilizado en autoclave a 121°C y 15 libras de presión por 25 min, se

aplicó el enraizador comercial clonex® (ácido Indol butírico 3g/l), con el objetivo de mejorar el

desarrollo y funcionalidad de la raíz. Se diseñó un experimento unifactorial con dos niveles con la

finalidad de evaluar el efecto del producto “Liquido rojo” patentado por el CIATEJ (número de

patente 265,785) utilizado para preservar e incrementar la supervivencia de plantas en el

invernadero, disminuyendo el estrés considerablemente fuerte que se genera cuando las plántulas se

sacan del ambiente in vitro y se llevan a condiciones ex vitro en el invernadero (Paz, 2015). Los

niveles fueron presencia y ausencia del producto. En los tratamientos con presencia de líquido rojo,

éste se adicionó de manera foliar, el protocolo que se siguió para la etapa de aclimatación de E.

calycosa se describe en la tabla 8.

Las macetas conteniendo las plántulas se mantuvieron a una temperatura de 23°C con una humedad

relativa del 100% los primeros quince días, una iluminación con un fotoperiodo de 16:8

luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2

·s-1

).

La variable a medir fue: sobrevivencia. El análisis estadístico se realizó utilizando ANOVA y LSD

con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I



Página 33

Etapa Descripción del procedimiento

1 Eliminación del medio de cultivo adherido a las raíces, mecánicamente con mucho

cuidado o lavándolo en el chorro del agua.

2 Adición de gel enraizador

3 Transferencia a macetas que contienen el sustrato descrito en la propagación ex vitro

(Verastegui, 2009):

4 Riego con solución de Captan® – Bactrol® (1 g/l de c/u) para evitar la contaminación del

sustrato.

5 Proporcionar una humedad relativa alta (100%) cubriendo la maceta con una bolsa de

plástico transparente y ajustarla al tamaño de la misma.

6 Riego diario durante la primera semana continuando cada tercer día hasta transcurrido el

primer mes de aclimatación.

7 Transcurridos 15 días, apertura de la bolsa por una esquina superior, asegurándonos que

exista transferencia de aire del exterior al interior.

8 Transcurridos 20 días, apertura de la bolsa por la segunda esquina superior

9 Transcurridos 25, apertura completa de la bolsa por la parte superior

10 Transcurrido un mes eliminación de la bolsa y transferencia de la maceta a condiciones

de invernadero

Tabla 8. Procedimiento para aclimatar rosetas de E. calycosa obtenidas por enraizamiento in vitro.



Página 34

5.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro

En ocasiones en el enraizamiento in vitro la zona de transición entre la raíz y el tallo es anormal,

con unas conexiones vasculares débiles y malformadas, lo que produce problemas en la absorción y

circulación de agua desde las raíces al tallo (Grout y Aston, 1977). Esta disfunción se corrige, al

menos parcialmente, tras una adecuada aclimatación. En otras ocasiones las raíces que crecen en

agar son defectuosas, carecen de pelos radicales y suelen necrosarse al trasplantar las plántulas,

dejando de crecer la planta (Deberg y Maene, 1981). Se ha observado raíces formadas in vitro,

gruesas, con pelos radicales engrosados y anormales, siendo sus sistemas vasculares anómalos, en

comparación con raíces formadas en un sustrato arenoso. En las raíces que no mueren durante el

proceso de trasplante se producen nuevas raíces laterales y adventicias normales durante el proceso

de aclimatación y estas crecen activamente. Por ello la proporción raíz: tallo siempre es más grande

en plantas enraizadas ex vitro que in vitro.

Muchas veces el enraizamiento in vitro, puede resultar problemático, difícil y caro. No es posible

generalizar, ya que la elección del método de enraizamiento va a depender totalmente de la especie

y de sus características: porcentajes de enraizamiento y supervivencia final, que varían

enormemente de unas especies a otras. Cuando el enraizamiento y aclimatación se pueden realizar

simultáneamente, sin que haya demasiada pérdida de plantas, tanto los costes como la eficiencia de

la producción se ven muy favorecidas.

Debido a que el enraizamiento ex vitro junto con la aclimatación de plantas aumenta el estrés

debido a la evapotranspiración acelerada de las plantas en las primeras etapas del trasplante

pudiendo reducir mucho la supervivencia, se decidió utilizar el hemisulfato de adenina, para

fortificar a la planta en esta difícil etapa ya que se ha reportado (Gatica y col., 2010) que el sulfato

de adenina (SA) juega un importante rol en la inducción de estructuras organogénicas in vitro. La

adenina es una fuente alternativa de nitrógeno reducido que puede ser aprovechada en el

crecimiento y desarrollo. Por ejemplo, en Brassica campestris se encontró que las plantas cultivadas

en medios de cultivo con SA presentaron mayor masa fresca y la coloración de las hojas fue de un

verde oscuro (Paek y col., 1987).

El experimento se realizó en 3 grupos de plantas que formaron 6 tratamientos diferentes que se

muestran en la tabla 9 y se describen a continuación:

Primer grupo de plantas, se les extirpó la raíz, se les colocó en una solución de ácido indol butírico

(0.2 mg/ml) durante 2 horas, se procedió a sembrarlas siguiendo el protocolo de aclimatación

descrito en la tabla no. 8, la mitad de las plantas se trató con 5 ml de solución de hemisulfato de

adenina (160 mg/l).

Segundo grupo de plantas, se les extirpo la raíz, se les coloco en una solución de ácido indol

butírico (0.1 mg/ml) durante 2 horas, se procedió a sembrarlas siguiendo el protocolo de

aclimatación descrito en la tabla no. 8, la mitad de las plantas se trató con 5 ml de solución de

hemisulfato de adenina (160 mg/l).



Página 35

Grupo testigo: plantas con raíz, se procedió a sembrarlas siguiendo el mismo protocolo de

aclimatación descrito en la tabla no. 8, la mitad de las plantas se trató con 5 ml de solución de

hemisulfato de adenina (160 mg/l).

Las macetas con las plántulas recién sembradas y cubiertas con bolsa de plástico, se mantuvieron a

una temperatura de 23°C, una humedad relativa del 100%, una iluminación con un fotoperiodo de

16:8 luz/oscuridad (intensidad lumínica de 25 μmoles·m-2

·s-1

).

Las variables iniciales a medir fueron: sobrevivencia, apariencia, diámetro; después de 26 días de

sembradas se midió él diámetro y la sobrevivencia. El análisis estadístico se realizó utilizando

ANOVA y LSD con apoyo del programa informático STATGRAPHICS CENTURION XVI.I

No. de

tratamiento

Tratamiento con

IBA Presencia de raíz HSA No de muestras

1 0.2 mg/ml - 160 mg/l 9

2 0.2 mg/ml - - 9

3 0.1 mg/ml - 160 mg/l 9

4 0.1 mg/ml - - 9

5 - + 160 mg/l 9

6 - + - 9

Tabla 9.- Tratamientos para la aclimatación – enraizado ex vitro.



Página 36

6 RESULTADOS y DISCUSIÓN

6.1 Propagación por semilla (sexual)

Se logró la propagación de E. calycosa por método de semilla,

Al observar las semillas a través del microscopio óptico se pudo distinguir perfectamente las

características particulares de las semillas del género Echeveria que de acuerdo a (Verastegui 2009),

son viables Estas presentaron un aspecto robusto y un color rojizo a diferencia de las no viables que

se presentan incoloras, con aspecto casi blanco – transparente.(figura 6).

Las plantas obtenidas a partir de semilla empezaron a emerger a partir de los 20 días de haber sido

sembradas (Figura 7 y 8), se obtuvieron 15 plantas. A los 5 meses se pasaron a macetas

individuales (figura 9).

Figura 6. Semillas de E. calycosa vistas a través de microscopio óptico. La semilla A de color

rojizo, turgente; la semilla B aspecto seco y sin vida.



Página 37

Resultados obtenidos:

No. de semillas sembradas = 100 semillas

No. de semillas germinadas= 15 semillas

% índice de germinación = 15 semillas germinadas X 100 = 15%

100 semillas sembradas

Este es el primer reporte de la germinación de semillas de E. calycosa Su porcentaje de germinación

es bajo si se compara con el obtenido en el grupo de trabajo para E. purhepecha que fue del 92%.

En la familia Crassulaceae; en algunos estudios se han reportados resultados muy variados en el

porciento de germinación que va desde 0% hasta 92% (Carque y col., 1996) y están en función del

tiempo de almacenamiento de las semillas, de la exposición a luz y de la temperatura (Jiménez, A.,

Flores, J., 2010).

0 0 2 3 6 12 14 15 15 15 15

0

100

0 10 20 24 28 32 36 40 44 48 52

Nú

me

ro d

e s

em

illas

días

Figura 7. Semillas de E. Calycosa germinadas con respecto al tiempo.



Página 38

Figura 8. Plántulas obtenidas por germinación de semilla a los 25 días después de sembradas.

Figura 9.- Plántas de E. calycosa obtenidas de semilla (15) después de 150 días de sembradas en

macetas de 6x6 cm.



Página 39

6.2 Propagación por esqueje de hoja (asexual)

No se logró la propagación de Echeveria calycosa por el método de esqueje de hoja, los esquejes no

respondieron a las condiciones en que se les mantuvo, muriendo la totalidad de los esquejes dentro

del periodo de un mes posterior a su establecimiento. Por la limitada cantidad de material vegetal,

no fue posible hacer mayor número de repeticiones en condiciones variadas hasta encontrar las

condiciones adecuadas para su propagación por esqueje de hoja. En la figura 10 se muestran

esquejes de hoja de Echeveria calycosa en maceta al inicio de su propagación por este método.

A pesar de la creencia de que las plantas que pertenecen al género Echeveria se propagan fácilmente por

esqueje de hoja, en el caso de E. calycosa, no fue posible lograr su propagación por este método, en la

literatura se reporta que a nivel mundial se ha realizado poca investigación de la familia Crassulaseae,

con respecto a la reproducción in vivo. Pocas especies se han reproducido utilizando diferentes sustratos y

mezclas artificiales junto a reguladores de crecimiento, se han evaluado diferentes intensidades de luz y

cantidad de nutrimientos, para obtener la regeneración de individuos a partir de esquejes de hoja

(Verastegui, 2009), esto implica una gran cantidad de experimentos a realizar, en nuestro caso no fue

posible realizar un número mayor de pruebas debido al poco material vegetal con el que contamos para

diseñar nuestros experimentos, pero la realización de una investigación más exhaustiva en este campo

pudiera proporcionar muy buenos resultados en la propagación por esqueje de E. calycosa y de esta forma

poder aprovechar las ventajas que nos ofrece la propagación in vivo por esqueje de hoja.

Figura 10. Explantes de hoja de E. calycosa establecidos en sustrato tepojal – peet moss

(1:1) A) aspecto inicial, B) aspecto después de 15 días de su establecimiento.



Página 40

6.3 Propagación in vitro

6.3.1 Establecimiento

Se realizaron cuatro diferentes tratamientos para el establecimiento. En los primeros tres se perdió

cerca el 100% de los explantes como puede observarse en la tabla 10.

Tabla 10.- Resultados de los tratamientos para establecer los explantes de E. calycosa in vitro.

Tra

tam

ien

to

Explantes

Tipo

Cantidad Contaminación muerte % de

sobrevivencia - +

1

Hoja 160 3 157 1.9

2 Hoja 20 ---- 20 0

3 Hoja 40 40 0

4

Hoja

cincino

Tallo

Raíz

84

125

20

15

62

89

0

0

22

36

20

15

73.8

71.2

0

0

Total 244 151 93 62

Como se describió en el apartado 5.4.1.3 de metodología del establecimiento de explantes, los

tratamientos 1, 2 y 3 corresponden a explantes procedentes de plantas obtenidas directamente de su

hábitat natural sin recibir un tratamiento previo para disminuir la cantidad de microorganismos de

tipo endógeno, en los tratamientos 1 y 2 la perdida de material vegetal fue ocasionada por

contaminación y en el tratamiento 3 por muerte del tejido. La contaminación bacteriana se observa

en la figura no. 11.



Página 41

Figura 11.- Presencia de contaminación microbiana en explantes de E. calycosa, en los grupos 1 y

2 en la etapa de establecimiento.

El tratamiento 4, que incluyó el programa de acondicionamiento de las plantas con el producto

Amistar®, mostró la mayor sobrevivencia de los explantes como se muestra en la tabla 10 y en la

Figura 12. Estos resultados demostraron la importancia de la etapa 0 en la propagación in vitro

(Razdan, 2003) de E. calycosa.

Figura 12. Porcentaje de sobrevivencia de explantes provenientes de plantas de Echeveria calycosa,

en cada uno de los tratamientos probados en el establecimiento.

1.9 0 0

62

0

10

20

30

40

50

60

70

1 2 3 4

% d

e so

bre

vivi

enci

a

Tratamientos



Página 42

El análisis estadístico (anexo 1 fig. 50 y tabla 37) mostró que existe una influencia significativa del

tratamiento sobre la sobrevivencia de los explantes; el tratamiento 4 fue diferente a los tratamientos

1, 2 y 3, ofreciendo un mejor resultado en la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa.

La contaminación por microorganismos, hongos y bacterias, es una de las limitaciones principales

en el cultivo in vitro sobre todo cuando son obtenidos de plantas adultas procedentes directamente

en el campo (Ramírez y col., 1999). Por esta razón es importante tener un método de desinfección

endógeno y exógeno adecuado, E. calycosa siendo una planta suculenta de consistencia turgente

presentó una gran pérdida de explantes por presencia de contaminación microbiana, también

demostró que la consistencia en su tejido vegetal es susceptible a los métodos de desinfección y un

tratamiento fuerte puede conducir a la muerte del tejido, por lo que se evaluó el método de

desinfección, el tratamiento de los explantes y análisis de la planta hasta encontrar el método

apropiado para reducir tanto la contaminación endógena como exógena y lograr el establecimiento

de los explantes. La aplicación de la etapa cero del cultivo in vitro, fue determinante para el

establecimiento de los explantes.

6.3.1.1 Explantes

El tipo de explante mostró una relación directa con la respuesta a su establecimiento in vitro. Los

explantes que presentaron la mayor sobrevivencia fueron los provenientes de la hoja de roseta

seguidos de los provenientes de la vara flora de plantas de E. calycosa (Fig. 14) con un 73.8 % y un

71.2%, respectivamente, los explantes de raíz y tallo, no sobrevivieron, debido a que el tratamiento

de acondicionamiento aplicado a la planta donadora no fue suficiente o él adecuado para disminuir

la cuenta microbiana y evitar la presencia de microorganismos durante el establecimiento. En la

figura 13 se muestra el número de explantes establecidos según el tipo de tejido de donde se

extrajeron. Los resultados obtenidos concuerdan con lo observado en otros estudios previos con

respecto a los explantes que se encuentran en contacto directo con el sustrato induciendo una alta

contaminación en los explantes, especialmente cuando estos son extraídos de plantas provenientes

del campo (Villalobos y Pérez, 1979).

Figura 13. Procedencia de los explantes que se utilizaron en el tratamiento no. 4 del establecimiento in vitro de E. calycosa.

84

125

20 15

hoja

inflorescencia

tallo

raíz



Página 43

Figura 14. Sobrevivencia de los explantes de E. calycosa al proceso de desinfección

Con respecto a la calidad de los explantes de E. calycosa, utilizados en el establecimiento in vitro se

encontró que el de la vara florar, fue el tipo de explante que conservó mejor su aspecto inicial,

dando los mejores resultados en la escala de la calidad establecida en la metodología, seguidos de

las hojas, como puede verse en la Figura 15.

Figura 15. Calidad de los explantes de Echeveria calycosa de acuerdo al tejido que le dio origen.

El análisis estadístico (anexo 1 figura 51 y tabla 38) mostró que existe una influencia significativa

del tipo de explante sobre la calidad del mismo en la etapa del establecimiento. Los explantes de

hoja e inflorescencia ofrecen un resultado semejante que es mejor al obtenido por los explantes de

tallo y raíz en la etapa del establecimiento.

0%

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

hoja inflorescencia tallo raíz

73.80% 71.20%

0.0% 0.0%

0

2

4

6

8

10

U. A

hoja inflorescencia tallo raiz



Página 44

La selección del explante es un parámetro a considerar en los experimentos de regeneración. En este

trabajo se observó que diferentes tejidos presentan variación en el potencial de respuesta, por lo que

la elección del tejido se volvió crítico al igual que la evaluación de los reguladores de crecimiento

vegetal y las condiciones del cultivo, esto concuerda con lo reportado por otros autores como

Piqueras y col., (2010). De los cuatro tipos de explante utilizados dos sobrevivieron a la etapa de

establecimiento: 1) hojas de roseta y 2) segmentos de inflorescencia.

6.3.1.2 Desinfección de los explantes.

En el método utilizado para la desinfección de los explantes se observó que su calidad después de la

desinfección fue directamente proporcional al tamaño del mismo, un explante pequeño mostró

mayor daño en su superficie que uno desinfectado en las mismas condiciones pero de mayor

tamaño, factor que también conduce a la pérdida del material vegetal (figura 16). Debido a estas

observaciones se optó por seguir el método de desinfección propuesto por Verastegui , (2009), solo

para la desinfección de explantes con tamaño medio a grande y realizar modificaciones para la

desinfección de explantes pequeños. Se redujo el tiempo de exposición al cloro por medio de

observación al momento de realizar el procedimiento de desinfección, para evitar el posible daño

del explante y con ello finalmente su pérdida; cuando el explante comenzó a presentar daño

evidente se retiró de la solución de hipoclorito. En el caso de la desinfección de hojas de rosetas

muy pequeñas, se procedió a realizar el proceso de desinfección como una unidad, es decir sin

separar las hojas de la roseta siempre inspeccionándola visualmente para evitar daño o muerte del

tejido.

Figura 16. Explante de hoja de E. calycosa dañado por el tratamiento de desinfección.

La pérdida del explante se presentó por diferentes razones siendo la principal la contaminación

microbiana, la segunda por obscurecimiento del tejido (oxidación) y la última por muerte del

explante sin una razón aparente como lo muestra la tabla 10. La contaminación puede provenir del



Página 45

tejido vegetal en forma exógena, ser introducida durante la manipulación del tejido o por no

conseguir las condiciones de asepsia requeridas para cumplir este objetivo. El obscurecimiento que

conduce a la pérdida del explante es el resultado de la oxidación de compuestos fenólicos liberados

en los extremos del corte de los tejidos, por acción de polifenol oxidasa, peroxidasa o el oxígeno

presente en el aire. Los productos de oxidación, pertenecientes al grupo de las quinonas, son

altamente reactivos e inhiben la actividad enzimática pudiendo conducir a la muerte de los

explantes (Bhat y Chandel, 1991).

El establecimiento in vitro de E. calycosa se vio influenciado por los tres factores evaluados:

tratamiento para el establecimiento, tipo de explante y método de desinfección, siendo determinante

el tratamiento de la planta donante para lograr esta etapa del cultivo in vitro.

6.3.2 Propagación

6.3.2.1 Propagación, concentraciones de RCV publicadas para E. laui

Se utilizó el medio de cultivo descrito en la metodología, se establecieron 20 explantes uno por

frasco. En el periodo de los primeros 30 días no mostraron respuesta, a los 60 días inició la

formación de raíz, a los 90 días se observó la formación de rosetas. Se obtuvieron 12 rosetas que

corresponden a 60% de organogénesis directa con 1.2 brotes/explante a los 90 días de iniciada la

propagación. tabla 11.

La supervivencia del explante en fue de 50%, la pérdida de explantes no se debió a contaminación

sino a la muerte del tejido vegetal.

Tiempo de

respuesta Raíz Rosetas

Explantes

con

respuesta

No explantes Rosetas/

explante

% organogénesis

30 días --- --- ---

20 1.2 60% 60 días presencia --- 10

90 días presencia 12 10

En la figura 17 se muestran explantes que presentan organogénesis directa con presencia de roseta

y raíces.

Tabla 11. Resultados de la propagación de E. Calycosa con la combinación de RCV utilizada en

E.laui



Página 46

Las rosetas obtenidas se pasaron a medio de cultivo MS al 50% donde continuaron su desarrollo. La

mayoría de ellas presentó hiperhidricidad, a pesar de las técnicas que se aplicaron para evitar que

avanzara este comportamiento (figura 18), lo que condujo a su pérdida, otras se contaminaron antes

de los 150 días.

Figura 17. Explantes de E. calycosa mostrando organogénesis directa en el medio

de propagación.

Figura 18. Rosetas de E. calycosa hiperhidratadas. a) roseta con inicios de

síntomas de hiperhidricidad; b) a la misma roseta con los síntomas más

avanzados.



Página 47

6.3.2.2 Propagación con diferentes tratamientos de RCV experimentos

bifactoriales con 4 niveles

6.3.2.2.1 Primer experimento bifactorial de propagación

Para documentar este primer experimento de propagación se realizaron 4 repeticiones del estudio

bifactorial. En la tabla 12 se enlista el número de explantes establecidos y su sobrevivencia a los

120 días para cada repetición.

No. de

factorial 1 2 3 4

Tratamiento inicial 120

días inicial

120

días inicial

120

días inicial

120

días

1 1 0 --- --- 4 0 2 1

2 2 0 2 1 3 2 3 0

3 1 1 1 0 3 1 2 1

4 1 0 3 1 3 2 2 0

5 2 0 2 0 3 0 2 2

6 1 1 --- --- 3 3 2 2

7 1 0 1 0 4 3 2 2

8 1 0 --- --- 3 3 2 0

9 1 0 1 0 3 0 2 0

10 1 0 --- --- 3 3 3 3

11 2 0 1 0 3 2 2 0

12 1 1 1 0 3 3 2 2

13 2 0 1 0 3 0 2 0

14 2 0 --- --- 2 0 2 0

15 2 0 --- --- 2 0 2 1

16 2 0 1 0 3 3 2 0

Total 23 3 12 2 48 25 36 14

Con los resultados de la tabla 12, se calculó la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa,

dividiendo el número de explantes vivos entre el número total de explantes establecidos. Se obtuvo

Tabla 12. Número de explantes de E. calycosa establecidos al inicio y los que sobrevivieron

después de 120 días en el primer experimento de propagación.



Página 48

un 44.5% de sobrevivencia de E. calycosa. La pérdida de los explantes se debió principalmente a la

muerte del explante.

En la figura 19 se representa la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa en este segundo

estudio de propagación.

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 16 tratamientos, después de 30 días de iniciado el

estudio se muestra en la tabla 13.

37% 67 % sobrevivencia

mortandad

Figura 19. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa, establecidos en

4 diferentes estudios.



Página 49

Tratamiento No

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta* Calidad

Explantes

vivos

Muertos/

contaminados

1 7 1 1 1 5 2

2 10 0 0 1 8 2

3 7 0 0 1 7 0

4 9 1 2 1 7 2

5 9 0 0 2 6 3

6 6 0 0 1 6 0

7 8 0 0 1 6 2

8 6 0 0 1 5 1

9 7 0 0 2 3 4

10 7 0 0 1 6 1

11 8 0 0 1 6 2

12 7 0 0 1 6 1

13 8 0 0 1 5 3

14 6 0 0 1 1 5

15 6 0 0 1 4 2

16 8 0 0 2 5 3

Total 119 2 86 33

* en respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En el periodo de 30 días se tuvo una sobrevivencia de 72.3 %.

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 60 días de iniciado el estudio se muestra en la tabla 14.

Tabla 13. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta a los 30 días de

establecidos in vitro.



Página 50

Tratamiento No

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta* Calidad

Explantes

vivos

Muertos/

contaminados

1 5 1 1 1 5 0

2 8 2 1 1 7 1

3 7 2 1 1 6 1

4 7 2 1 y 2 1 4 3

5 6 2 1 2 5 1

6 6 3 1, 2 y 4 1 6 0

7 6 3 1, 2 1 6 0

8 5 2 2 1 3 2

9 3 0 0 4 0 3

10 6 0 0 1 6 0

11 6 0 0 1 4 2

12 6 1 1 y 2 1 6 0

13 5 0 0 2 5 0

14 1 1 4 1 1 0

15 4 0 0 1 4 0

16 5 0 0 2 4 1

Total 86 19 72 14

* en respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de brotes

En este periodo se obtuvo una sobrevivencia de 60.5%.

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 90 días de iniciado el estudio se muestra en la

tabla 15.





Página 51

Tratamiento No

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta*

calidad

Explantes

vivos Muertos/

contaminados

1 5 1 1 1 4 1

2 7 4 1 y 2 1 4 3

3 6 2 1 1 3 3

4 4 2 1 1 3 1

5 5 1 1 2 3 2

6 6 4 1, 2 y 4 1 6 0

7 6 5 1, 2 1 5 1

8 3 1 2 1 3 0

9 0 0 0 -- 0 --

10 6 5 2 1 6 0

11 4 1 1 y 2 2 3 1

12 6 1 1 y 2 1 6 0

13 5 0 0 4 0 5

14 1 1 4 1 1 0

15 4 1 2 3 1 3

16 4 1 2 3 3 1

Total 72 30 51 21

* en la columna respuesta 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En el periodo de 90 días se tuvo una sobrevivencia de 42.8 %.

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 120 días de iniciado el estudio se muestra en la

tabla 16.

Tabla 15. Número de explantes de E. calycosa vivos y con respuesta a los 90 días de establecidos

in vitro.



Página 52

Tratamiento No

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta*

calidad

Explantes

vivos

Muertos/

contaminados

1 4 1 1 1 1 3

2 4 2 1 y 2 2 3 1

3 3 2 1 y 3 1 3 0

4 3 2 1 y 3 1 3 0

5 3 1 1 1 2 1

6 6 6 1, 2 y 4 1 6 0

7 5 5 1, 2 1 5 0

8 3 1 2 1 3 0

9 0 0 -- -- 0 --

10 6 6 2 1 6 0

11 3 2 2 2 2 1

12 6 1 1 y 2 1 6 0

13 0 0 0 - 0 -

14 1 0 -- -- 0 1

15 1 1 2 1 1 0

16 3 1 2 2 3 0

Total 51 31 44 7


En el periodo de 120 días se tuvo una sobrevivencia de 37.0%.

El análisis estadístico (anexo 1 figura 53 y tabla 40) nos indica que existe una diferencia

significativa para p< 0.05 entre las respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa a los 16

tratamientos expuestos a los 120 días en el primer estudio de propagación.

En la tabla 17 se resumen los resultados obtenidos de la respuesta obtenida por los explantes de E.

calycosa en los diferentes periodos de tiempo establecidos.





Página 53

Periodo

días

No. de

explantes

presentes

No. de

explantes

con

respuesta

Sobrevivencia Tipo de

respuesta* No. de brotes

0 119 --- 100 0

30 86 2 72.3 1

60 72 19 60.5 1 - 2

90 51 30 42.9 1 – 2 - 4 4 (1 / explante)

120 42 31 37.0 1 – 2 – 3 - 4 4 (1 / explante)


En la figura 20 se ve el comportamiento de la calidad de los explantes de E. calycosa al paso del

tiempo que duró este estudio de propagación.

.

La figura 21 representa la variación de la calidad en porcentaje de los explantes de E. calycosa

dependiendo del tipo de explante que se utilizó (hoja o inflorescencia) después de 120 días de

94

72

53 49

36

18 14

18

0 5

2 1 2 1 2 2 0 5 5 7

12

3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 30 60 90 120

No

. de

exp

lan

tes

días

1 verde

2 verde claro

3 blanco

4 cafe

5 negro

Calidad

Figura 20. Variación de la calidad de los explantes de E. calycosa, durante el tiempo de

estudio inicial, 30 60, 90 y 120 días de su establecimiento.

Tabla 17. Resumen del comportamiento de los explantes de E. calycosa durante el primer

experimento de propagación.



Página 54

inducidos, se encontró que los explantes de tipo inflorescencia presentan ligeramente una mejor

calidad que los explantes de tipo hoja, aunque la calidad no es un parámetro indicativo de que se va

a tener una mejor respuesta como podemos ver en la figura 22.

Figura 22.- Respuesta que presentaron los explantes de E. calycosa a los 120 días

dependiendo del tipo de explante.

Figura 21. Calidad en % de los explantes de hoja e inflorescencia de E. calycosa, a los 120

días de iniciada la propagación



Página 55

De 119 explantes que se establecieron en este estudio de propagación para E. calycosa, 44 explantes

se obtuvieron de partes de la inflorescencia y 75 de la hoja de roseta, en la figura 22 se representa

gráficamente la respuesta que se obtuvo de los explantes que seguían vivos después de 120 días

de iniciado este estudio.

Analizando los resultados mostrados en la figura 22 aparentemente el explante de hoja presenta

mayor número de respuestas que la inflorescencia, pero haciendo el análisis estadístico se observa

que no existe una diferencia significativa en la respuesta entre los dos tipos de explantes ya que se

obtiene un valor de p= 0.22.

En la figura 23 se encuentran fotografías realizadas a través del microscopio estereoscopio de las

respuestas obtenidas por los explantes que sobrevivieron en este segundo estudio de propagación

para E. calycosa. Se encontró una relación entre la respuesta obtenida de acuerdo a la fila y a la

columna en la cual se encuentran los explantes; la respuesta de los explantes al tratamiento depende

de la combinación de reguladores de crecimiento vegetal utilizado.



Página 56

Figura 23.- Respuesta representativa de los explantes de E. calycosa a los tratamientos

(identificados por los números 1 al 16) de los reguladores ANA y KIN en el primer estudio de

propagación;

Los tratamiento 5, 9 y 13 donde solo se adiciono KIN al medio de cultivo, no hubo respuesta, los

explantes tienden a secarse y morir; En los tratamientos 6, 10 donde la cantidad de ANA es baja y



Página 57

la de KIN es semejante se observa la presencia de brotes a partir de callo; En el tratamiento 14

donde la cantidad adicionada de ANA menor con respecto a la de KIN se observó la presencia de

roseta sin etapa de formación de callo.

Los tratamientos 7, 8, 11, 12 15 y 16 se observó formación de callo. En estos tratamientos donde las

concentraciones de ANA y KIN son menos altas el callo es más friable y con respecto a las

concentraciones más altas de los dos reguladores tiene a compactarse.

Al aumentar la concentración de KIN en presencia de ANA la respuesta fue más efectiva para la

formación de brotes, hasta llegar a un punto que fue demasiada elevada que detiene el crecimiento

de las células, como se observa en las filas 3 y 4 donde solo se forma callo, las concentraciones

altas de ANA reprimen la formación de brotes y forman callo. Los tratamientos 2, 3 y 4 donde solo

se adicionó ANA al medio de cultivo tendieron a formar callo compacto.

De cada uno de los tratamientos al menos se realizaron 5 repeticiones.

6.3.2.2.2 Primer experimento de propagación utilizando rosetas de E. calycosa

propagadas in vitro

Sobrevivencia.- la perdida de explantes en este estudio no se debió a la contaminación sino a la

muerte del tejido que pudo ser ocasionado por el tamaño pequeño de los explantes ya que existe

también un tamaño mínimo debajo del cual no se obtiene la respuesta deseada. (Hernán, 2007) o

debido a las concentraciones de los RCV utilizados. La sobrevivencia fue de 56%, se calculó de la

misma manera que en los casos anteriores.

El número de explantes obtenido de las rosetas sobrevivientes se dividió entre el número total de

explantes establecidos. En la tabla 18 se indica el número de explantes establecidos por

combinación de RCV al inicio del estudio y al término de 120 días.



Página 58

Tabla 18. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que se establecieron y los que

sobrevivieron después de 90 días.

No. explantes

tratamiento inicial 120 días

1 1 0

2 3 2

3 2 2

4 3 2

5 2 2

6 2 2

7 1 0

8 1 0

9 3 0

10 2 0

11 1 0

12 2 2

13 1 0

14 3 0

15 2 0

16 1 0

Total 30 12

En la tabla 19 podemos observar la respuesta de los explantes de roseta a los diferentes tratamientos

establecidos para este estudio bifactorial.



Página 59

Tratamiento

No

explantes

Con

respuesta Raíz

Callo

friable

Callo no

friable

No de

rosetas

1 1 0 0 0 0 0

2 3 3 2 0 3 1

3 2 2 0 0 2 2

4 3 3 0 0 3 0

5 2 2 2 0 0 2

6 2 2 2 0 1 4

7 1 0 0 0 0 0

8 0 0 0 0 0 0

9 0 0 0 0 0 0

10 0 0 0 0 0 0

11 0 0 0 0 0 0

12 3 2 0 0 0 2

13 0 0 0 0 0 0

14 0 0 0 0 0 0

15 0 0 0 0 0 0

16 0 0 0 0 0 0

Total 17 22 21 13 0 11

La respuesta obtenida fue diferente a la obtenida por explantes de origen in vivo, en este caso el

callo que se formó fue de tipo compacto y en algunos casos como en el tratamiento no. 4 las rosetas

iniciales terminaron formando callo.

Esto se explica ampliamente si hacemos referencia a la siguiente cita: “Diferentes tejidos presentan

variación en el potencial de respuesta, por lo que la elección del tejido se vuelve crítico al igual que

Tabla 19. Número de explantes de roseta de E. calycosa obtenidos in vitro que presentaron

respuesta a los 120 días de establecidos y la respuesta presentada. Donde se observan respuesta de

callo friable=1, callo compacto=2, raíz= 3 y formación de roseta= 4.



Página 60

la evaluación de los reguladores de crecimiento vegetal y las condiciones del cultivo” (Piqueras y

col., 2010).

En la figura 24 se observan los resultados obtenidos en el factorial número 6, donde se muestra

formación de rosetas, callo y raíz .

Durante el periodo de propagación in vitro, la pérdida de explantes fue debida a la contaminación

de los explantes, esto se puede atribuir a malos manejos en la manipulación, a no tener las

condiciones requeridas de asepsia en el lugar de trabajo o en la campana de flujo laminar, o a la

contaminación endógena en el explante que no se había manifestado en la etapa anterior del

establecimiento. La contaminación por microorganismos es la causa más importante de pérdidas en

el cultivo de células y tejidos vegetales, considerando que las plantas, están asociadas a

microorganismos endógenos y exógenos que encuentran condiciones favorables de desarrollo en

dichos medios nutritivos (Perla, 2007).

Figura 24. Respuesta de los explantes de rosetas obtenidas in vitro de E. calycosa a los 16

tratamientos del primer experimento de propagación a los 180 días, donde se observan respuesta

de callo friable=1, callo compacto=2, raíz= 3 y formación de roseta= 4.

a) tratamiento no. 2: 4 mg/l de ANA – 0 mg/l de KIN (resp= 2, 3 y 4)

b) tratamiento no. 12: 16 mg/l de ANA – 6 mg/l de KIN (resp= 1 ,3 y 4)

c) tratamiento no. 3: 8 mg/l de ANA – 0 mg/l de KIN (resp= 2 ,3 y 4)

d) tratamiento no. 6: 4 mg/l de ANA – 6 mg/l de KIN (resp= 3 y 4)

e) tratamiento no. 4: 16 mg/l de ANA – 0 mg/l de KIN (resp= 2 y 3)

f) tratamiento no. 5: 0 mg/l de ANA – 2 mg/l de KIN (resp= 3 y 4)



Página 61

Otra causa de pérdida de explantes fue debido a la muerte del explante, que se puedo atribuir al

daño sufrido desde la etapa de desinfección o a su oxidación. También la composición de algunos

tratamientos de reguladores no permite la sobrevivencia del explante.

La calidad del explante se midió como indicativo de sobrevivencia, observándose que una buena

calidad del explante no es sinónimo de respuesta, ya que los explantes deteriorados o aparentemente

muertos presentaron respuesta a la presencia de RCV en el medio de propagación, el explante de

inflorescencia mantuvo una mejor calidad, pero el explante de hoja presentó un mayor porcentaje de

respuesta como muestra la figura 22.

6.3.2.3.1 Primer experimento de propagación con E. purhepecha

En este el primer estudio de propagación en el que se utilizó la especie E. purhepecha, se realizaron

2 estudios de 16 tratamientos de RCV (descritos en la tabla no. 4) debido a la cantidad de material

vegetal con el que se contaba, que ya había pasado la etapa de establecimiento, en la tabla 20 se

describe el número de explantes que se estableció en cada combinación de acuerdo a la cantidad de

tejido vegetal que se disponía después de pasar por la etapa de establecimiento, cabe señalar que el

primer estudio se realizó con partes de la inflorescencia y el segundo con hojas. También en este

caso se obtuvo la sobrevivencia en base a los tablas 20 y 21, dividiendo el número de explantes

vivos (27) después de 120 días que fue el periodo que se extendió este estudio entre el no. total de

explantes establecidos al inicio de este estudio (77), nos dio un resultado de 35.1 % de

sobrevivencia en los dos factoriales establecidos.



Página 62

No.

factorial 1 2

Tratamiento inicial 120 días inicial 120 días

1 1 0 2 1

2 4 4 3 2

3 4 0 3 2

4 4 0 3 0

5 4 0 3 0

6 4 4 2 2

7 3 2 3 1

8 1 0 3 2

9 1 0 3 0

10 1 0 3 0

11 2 0 2 0

12 2 1 2 2

13 1 0 2 0

14 1 0 4 1

15 1 0 3 1

16 1 0 2 2

Total 34 11 43 16

Los explantes de E. purhepecha se monitorearon semanalmente y se reportó la respuesta y la

calidad a los 30, 60, 90 y 120 días de iniciado el diseño factorial.

Por no ser el motivo de este estudio solo se reporta la calidad y respuesta de los explantes de

Echeveria purhepecha al después de 120 días de iniciado el estudio y se encuentran recopilados en

la tabla 21.

Tabla 20. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron

después de 120 días.



Página 63

Tabla 21. Número de explantes de Echeveria purhepecha que presentaron respuesta a los 120 días

de establecidos y la respuesta que presentaron.

Tratamiento No.

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta*

calidad

Explantes

vivos Muertos/

contaminados

1 1 1 1 1 1 -

2 6 6 1 1 6 -

3 2 2 1 1 2 -

4 --- 0 0 - - -

5 --- 0 0 - - -

6 6 6 1 y 4 1 7 0

7 2 2 2 y 4 1 2 -

8 2 2 3 y 4 2 2 -

9 1 0 0 5 - 1

10 --- 0 0 - - -

11 --- 0 0 - - -

12 3 3 1, 2 y 4 2 3 0

13 1 0 0 5 - 1

14 2 0 0 1 1 1

15 1 1 2 y 4 1 1 0

16 2 2 2 y 4 1 2 -

Total 30 25 27 3

* tipo de respuesta: 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

En la figura 25 se observa la respuesta que presentaron los explantes de Echeveria purhepecha a los

120 días después de su inducción; de acuerdo al origen del explante, hoja o inflorescencia.



Página 64

En la tabla 22 se comparan los resultados tanto para E. calycosa y E. purhepecha obtenidos al

finalizar este estudio bifactorial de propagación.

Tabla 22. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 120 días en

el primer estudio de propagación.

Especie Total de

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta*

Explantes

vivos

% de

respuesta

% de

Sobrevivencia

calycosa 119 31 1, 2, 3 y 4 44 26.1 37.0

purhepecha 77 26 1, 2, 3 y 4 27 33.7 35.1

* tipos de respuesta: 0 = sin respuesta; 1= presencia de raíz; 2= callo friable; 3 =callo compacto; 4= presencia de roseta

El análisis estadístico (anexo 1, figura 54 y tabla 41) nos indica que existe una influencia

significativa para p < 0.05 de la especie de Echeveria sobre la respuesta obtenida por los explantes

al tratamiento a los 120 días en el primer estudio de propagación. La Especie E. calycosa es

significativamente diferente a la especie E. purhepecha con respecto a la respuesta que presenta a

los tratamientos de RCV en este primer estudio de propagación.

11

3

0

4

9

5

2

17

raíz callo friable callo compacto rosetas

a los 120 días

inf hoja

Figura 25. Número de explantes de E. purépecha que presentaron respuesta a los 16 tratamintos

del primer estudio de propagación, según el tipo de explante a los 120 días de iniciado el estudio.



Página 65

6.3.2.4. Segundo experimento de propagación

En la tabla 23 se resume el número de explantes establecidos en cada uno de los 16 tratamientos

(factorial), se realizaron dos repeticiones identificadas como factorial no. 3 y no. 5, se reporta el

número de explantes sobrevivientes al final del estudio, establecido a los 90 días.

En base a los resultados de la tabla 22, se calculó la sobrevivencia, dividiendo el número de

explantes vivos al final del estudio (90 días) entre el no. total de explantes presentes al inicio del

estudio en los dos factoriales realizados. Se obtuvo un 2.9 % de sobrevivencia. Las causas de la

pérdida de explantes fueron: en mayor parte se debió a muerte del explante y como segunda causa

contaminación microbiológica del explante.

En el factorial no. 3 se utilizaron explantes de hojas de la roseta y en el factorial no. 5 se utilizaron

tallos, hojas e inflorescencias de la vara floral, que fueron los dos tipos de explante que

sobrevivieron a la etapa del establecimiento.

Los explantes de E. calycosa se monitorearon semanalmente, pero solo se reportó la respuesta

obtenida y la calidad que presentaron los explantes a los 30, 60 y 90 días.



Página 66

Tabla 23. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que sobrevivieron después de 90

días en el segundo estudio de propagación.

La respuesta de los explantes de E. calycosa a los 30 días se presenta en la tabla 24.

No. factorial 3 5

Número de explantes vivos

Tratamiento inicial 90 días inicial 90 días

1 1 0 3 0

2 1 0 3 0

3 1 0 3 0

4 1 0 3 0

5 1 0 4 0

6 1 0 3 0

7 1 0 3 0

8 1 0 1 0

9 1 0 4 0

10 1 1 3 0

11 1 0 3 0

12 2 0 4 0

13 1 1 3 0

14 2 0 3 0

15 2 0 4 0

16 1 0 3 0

Total 19 2 50 0



Página 67

Tabla 24. Número de explantes de E. calycosa establecidos y los que presentaron respuesta al

tratamiento a los 30 días.


En la figura 26 se muestra la calidad de los explantes de Echeveria calycosa a 30 días de iniciado el

periodo de regeneración.

Tratamiento No

explantes respuesta vivos calidad muertos contaminados

1 4 0 0 4 1 3

2 4 0 3 2 1 0

3 4 0 0 5 4 0

4 4 0 0 4 4 0

5 5 0 0 3 5 0

6 4 0 0 4 4 0

7 4 0 1 2 3 0

8 2 0 0 4 2 0

9 5 0 5 2 0 0

10 4 0 1 1 2 1

11 4 0 4 2 0 0

12 6 0 4 2 0 2

13 4 0 3 1 0 1

14 5 0 4 1 1 0

15 6 0 2 1 0 4

16 4 0 0 5 0 4

Total 79 0 27 27 15



Página 68

La sobrevivencia de los explantes de E. calycosa a los 30 días fue de 39.13 %. En el segundo

estudio de propagación se observa una alta mortandad de explantes desde el primer periodo de 30

días, figura 27.

Los resultados a los 60 días de iniciado el segundo estudio de propagación se muestran en la tabla

25.

10

17

5

14

23

0

5

10

15

20

25

1 2 3 4 5

No

. de

exp

lan

tes

39.13

60.87

Explante vivo

Explante muerto

Figura 26. Número de explantes de E. calycosa que presentaron una calidad entre 1 y 5 durante

los primeros 30 días de propagación.

Figura 27. Porcentaje de sobreviviencia de explantes de Echeveria calycosa a los 30 días

después de iniciada la etapa de propagación

Calidad



Página 69

Tabla 25. Número de explantes de Echeveria calycosa establecidos y los que presentaron respuesta

a los 60 días de establecidos.

Tratamiento No

explantes

Con

respuesta vivos calidad muertos contaminados

2 3 0 0 5 3 0

7 1 0 1 2 - 0

9 5 0 1 2 4 0

10 1 0 1 3 1 0

11 4 0 0 4 4 0

12 4 0 0 5 0 4

13 3 0 2 2 1 0

14 4 0 0 1 0 3

15 2 0 0 4 2 0

Total 27 0 5 15 7


En la figura 28 se muestra el número de explantes de E. calycosa que se mantuvieron en el rango

de calidad entre 1 y 5 a los 60 días, se observa que sigue la tendencia de perdida de la calidad y

muerte de los explantes de E. calycosa.

En la figura 29 se muestra la sobrevivencia de los explantes de E. calycosa después transcurridos

60 días de iniciado el experimento que fue de 7.25%.

Los resultados obtenidos por los explantes de E. calycosa sobrevivientes a los 90 días de cultivo se

describen en la tabla 26.



Página 70

7.25

92.75

sobrevivencia

mortandad

Figura 28. Número de explantes de E. calycosa que presentaron una calidad entre 1 y 5

en el periodo de 60 días de iniciada la propagación.

Figura 29. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de E. calycosa después de

transcurrido un periodo de 60 días de iniciada la propagación.



Página 71


90 días.

Tratamiento No

explantes

Con

respuesta

vivos

calidad

muertos contaminados

7 1 0 0 5 1 0

9 1 0 0 5 1 0

10 1 0 1 1 0 0

13 2 0 1 1 1 0

Total 5 0 2 3 0

La figura 30 muestra el no. de explantes que sobrevivieron durante este estudio de propagación y la

figura 31 muestra el % de sobrevivencia de los mismos.

Figura 30. Número de explantes de E. calycosa durante el periodo de propagación. 1) total de

explantes establecidos, 2) explantes que sobrevivieron, 3) explantes muertos en el periodo de 90 días.



Página 72

Transcurridos 90 días se dejó de monitorear estos estudios factoriales debido a que la pérdida de

explantes se acercó al 100% y no se presentó respuesta en los explantes sobrevivientes.

6.3.2.4.1 Segundo experimento bifactorial de propagación con Echeveria

purhepecha

Los explantes utilizados para la propagación in vitro de E. purhepecha, fueron los que

sobrevivieron a la etapa de su establecimiento. Se realizaron 4 repeticiones de los 16 tratamientos

(factoriales) que se monitorearon durante 90 días. En la tabla 27 se muestra el número de explantes

de E. purhepecha establecidos en cada tratamiento (los tratamientos se encuentran descritos en la

tabla no. 6).

En base a los resultados de los tablas 27 y 28, se calculó la sobrevivencia, dividiendo el número de

explantes vivos entre el no. total de explantes establecidos. Se obtuvo un 41.4 % de sobrevivencia

en los cuatro factoriales establecidos; es importante hacer notar que en los estudios factoriales 1 y 2

se utilizaron hojas como explantes y en los estudios 3 y 4 se utilizaron fragmentos de cincinos, esto

para ser comparativo con los estudios realizados con la especie E. calycosa.

Los explantes de E. purhepecha se monitorearon semanalmente y se reportó la respuesta y la

calidad a los 30, 60, y 90 días de iniciado el diseño factorial.

Por no ser el motivo de nuestro estudio los resultados de Echeveria purhepecha, solo se reporta la

calidad final y respuesta a los 90 días y se compara con los resultados de Echeveria calycosa.

Los resultados obteniendo a los 90 días de iniciados los estudios de los explantes de E. purhepecha

se encuentran recopilados en la tabla 28.

2.9

97.1

sobrevivencia

mortandad

Figura 31. Porcentaje de sobrevivencia de los explantes de Echeveria calycosa, en el

periodo de propagación a los 90 días.



Página 73

No.

factorial 1 2 6 7

Tratamiento inicial 90 días inicial 90 días inicial 90 días inicial 90 días

1 1 1 1 1 4 0 2 0

2 1 1 1 1 3 0 2 2

3 2 0 1 0 3 0 2 0

4 1 0 1 0 3 0 2 1

5 1 0 2 0 4 2 2 2

6 2 2 1 1 2 2 2 2

7 1 1 1 1 3 0 3 1

8 1 1 2 1 2 0 --- ---

9 1 0 1 0 2 0 2 0

10 1 1 1 1 2 0 2 2

11 1 1 1 1 2 0 2 2

12 1 1 2 2 3 0 2 0

13 1 1 1 1 3 0 1 1

14 1 1 1 1 3 0 2 2

15 1 1 1 1 2 0 2 0

16 1 1 1 1 3 0 2 1

Total 18 13 19 13 44 8 30 15

Tabla 27. Número de explantes de E. purhepecha establecidos y los que sobrevivieron

después de 90 días.



Página 74

Tratamiento No

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta*

calidad

Explantes

vivos Muertos/

contaminados

1 8 0 0 1 2 6

2 7 2 1 y 4 1 4 3

3 8 0 0 4 0 8

4 7 1 2 4 1 6

5 9 4 1 y 4 4 4 5

6 7 1 2 2 7 0

7 8 1 1 y 4 1 3 5

8 5 0 0 4 2 3

9 6 0 0 2 0 6

10 6 2 1 y 2 1 4 2

11 6 2 2 2 4 2

12 8 2 2 2 3 5

13 6 2 2 1 3 3

14 7 2 2 1 4 3

15 6 2 2 1 2 4

16 7 2 2 5 3 4

Total 111 21 46 65


Tabla 28. Número de explantes de E. purhepecha y los que presentaron respuesta a los 90 días

de establecidos.



Página 75

En la tabla no. 29 se comparan los resultados de la respuesta de E. calycosa y E. purhepecha

transcurrido un periodo de 90 días de iniciado este estudio de propagación.

Especie Total de

explantes

Con

respuesta

Tipo de

respuesta* Explantes

vivos

% de

respuesta

% de

Sobrevivencia

Calycosa 79 0 0 2 0 2.9

Purhepecha 111 21 1, 2 y 4 46 18.9 41.4


El análisis estadístico (anexo 1 figura 52 y tabla 39) mostró influencia de la especie vegetal

utilizada sobre la respuesta de sobrevivencia y regeneración obtenida. Estos resultados evidencian

que especies del mismo género responden de manera diferente al mismo tratamiento recibido en la

etapa de propagación.

El tipo de explante a usarse en los procesos de propagación depende de la especie y de los objetivos

que se persigan

En los estudios de propagación realizados se encontró que la concentración de RCV que generó una

mejor respuesta en los explantes de E. calycosa fue la que conformó al tratamiento no. 6 del

segundo estudio de propagación (medio de cultivo: MS ½,, suplementado con los RCV: ANA 4.0

mg/l de – 2.0 mg/l de KIN + sacarosa 15 g/l + phytagel 4.5 g/l, con un pH = 5.7 ajustado antes de

la adición de phytagel con HCl 1 N o NaOH 1 N según fue necesario.

Los estudios bifactoriales se realizaron en diferentes épocas del año, se observó un comportamiento

de los explantes diferente, dependiendo de la época del año y a su contenido hormonal endógeno,

los explantes inoculados en otoño e invierno sobrevivieron menos y casi todos formaron callo que

en algunos tratamientos produjo organogénesis indirecta. Los inoculados en primavera se adaptaron

mejor al medio de cultivo y presentaron una respuesta más rápida a la exposición de RCV y no

pasaron por la formación de callo, (organogénesis directa) esté fue el caso de la primera

propagación que se realizó en una sola concentración 6 mg/l de KIN y 4 mg/l de ANA ver figura

33; los explantes que se inocularon en invierno en este miso tratamiento, a los 120 días comenzaron

a dar respuesta de formación de roseta mediante organogénesis indirecta.

Tabla 29. Respuestas obtenidas por los explantes de E. calycosa y E. purhepecha a los 90 días

de iniciado el segundo estudio de propagación.



Página 76

En la figura 34 incisos a y b) se observa la formación de rosetas en dos explante de hoja a través

del microscopio estereoscopio, ambos explantes se inocularon en primavera en el tratamiento no. 6

del segundo estudio bifactorial en donde el medio de cultivo MS ½ esta adicionado con RCV 2 mg/l

de KIN y 4 mg/l de ANA. Se observa claramente el inicio de la organogénesis directa y el mayor

número de brotes formándose. En la figura 34 incisos c y d) se observa dos explantes inoculados en

el mismo tratamiento 6, en época de invierno, tardaron más tiempo en dar respuesta e inicialmente

se observó la formación de callo, a partir del cual se formaron los brotes. En la figura 32 se observa

un explante en el mismo tratamiento de 2 mg/l de KIN y 4 mg/l de ANA que formó hasta 50

rosetas por explante por organogénesis indirecta después de 180 días de inoculado, fue establecido

en diciembre.

Los explantes extraídos de plantas donadoras en diferentes épocas del año pueden no dar resultados

reproducibles en cultivo de tejidos. Esto puede ser debido a la variación en el nivel de

contaminantes externos o debido a cambios estacionales en los niveles de reguladores del

crecimiento endógenos (George y col., 2008).

Figura 32. Organogénesis indirecta, en explante de E. calycosa en medio de cultivo MS 50 %

adicionado de 2:4 mg/l (KIN : ANA). Experimento iniciado en diciembre, explante con 180 días.



Página 77

Figura 33. Organogénesis directa en explantes de E. calycosa en medio de cultivo MS 50%

adicionado de 6:4mg/l de KIN : ANA. Experimento iniciado en mayo, explante con 90 días.

Figura 34. A y B.- organogénesis directa en explantes de E. calycosa experimento iniciado en abril

explantes con 80 días; C.- organogénesis indirecta en explantes de E. calycosa experimento iniciado

en enero explante con 150 días; D.- organogénesis indirecta, en explantes de E. calycosa

experimento iniciado en diciembre, explante con 120 días. Todos los explantes estuvieron expuestos

al tratamiento 6: medio de cultivo MS al 50% adicionado con 2 mg/l de KIN y 4 mg/l de ANA.



Página 78

6.4. Inducción de brotes a partir de callo

Los tratamientos del primer experimento de propagación que produjeron callo fueron: no. 2, 3, 4, 7,

8, 11, 12,15 y 16. En todos estos tratamientos no se observaron cambios en los callos producidos

solo el aumento del tamaño después de los 120 días de inoculados, por lo que se procedió a medir el

tamaño del área de los callos formados (ver tabla no. 30).

Tabla 30. Área en cm2 de los callos producido por los tratamientos 2, 3, 4, 7, 8, 11, 12, 15 y 16 en

el primer estudio de propagación.

Tratamiento No.

factorial

Medida del área del callo en

cm2 por explante

Total

cm2

2 3 0.80 0.24 --- 1.04

3 25.1 1.32 2.16 0.56 4.04

4 25.1 1.68 1.56 --- 3.24

7 25.1 3.04 1.32 1.32 5.68

8 25.1 0.99 1.20 1.30 3.49

11 25.1 0.64 0.70 0.30 1.64

12 1 1.44 1.68 1.17 4.29

12 25.1 1.50 2.40 3.60 7.50

15 25.2 1.21 0.50 --- 1.71

16 25.2 3.00 2.25 2.70 7.95

16 25.1 1.44 1.17 2.04 4.65

Los callos que se obtuvieron de estos tratamientos se muestran en la figura no. 35, se puede observar

que los callos de la primer columna (tratamientos 2, 3 y 4) tienden a formar callo compacto,

frecuentemente con presencia de raíz que con el tiempo tiende a degenerar en callo compacto; los de

la segunda y tercera columna son callos de tipo friable, los tratamientos 7, 11 y 15 presentan un

color más pálido y se obtuvieron en menor cantidad que los de los tratamientos 8, 12 y 16.



Página 79

Los callos obtenidos y separados de los explantes que los produjeron, fueron segmentados e

inoculados en frascos de vidrio conteniendo medió de cultivo estéril de los tratamientos que

produjeron brotes (tratamientos no. 6, 10 y 14) utilizando medio de cultivo 1/2 MS sin reguladores

como testigo, para comprobar si la presencia de callo puede degenerar en la obtención de brotes al

colocarlos en las concentraciones apropiadas de RCV que si produjeron brotes.

Los callos que se establecieron en los nuevos tratamientos se monitorearon cada 8 días durante un

mes observando que algunos produjeron respuesta y otros no; ver tabla 31. En las figuras 36 y 37

podemos observar la respuesta de los callos que pertenecen a los tratamientos 7 y 12 mostrando

presencia de brotes.

Figura 35. Callos producidos en el primer estudio de propagación. En la primera columna

observamos callos tipo compacto, de color obscuro; en la segunda columna callo friable, un poco

más flojo y un color más pálido que los de la tercera columna donde la producción de callo fue

mayor, de un verde más obscuro y una textura más compacta. Se produce callo compacto en

concentraciones altas de auxinas (Cruz, 2013).



Página 80

Tabla 31. Respuesta obtenida al establecer los callos obtenidos del primer estudio de propagación

de E. Calycosa, en los tratamientos donde se produjeron brotes.

Tratamiento

de donde

proviene el

callo

Tipo de

callo

Tratamiento

Testigo MS

sin RCV No. 6 No. 10 No. 14

2 compacto 0 0 0 0

3 compacto 0 1 (1 mes) 0 0

4 compacto 1 (1 mes) 1 (1 mes) 0 0

7 friable 0 0 0 2 (4 días)

8 friable 0 0 0 0

11 friable 0 2 (1 mes) 0 0

12 friable 0 2 (1 mes) (2) 1 mes 0

15 friable 0 0 0 0

16 friable 0 0 0 2 (1 mes)

Dónde: 0= sin respuesta, 1= formación de raíz, 2= formación de roseta.

La respuesta obtenida en el cultivo in vitro dependerá de la ubicación del tejido vegetal utilizado en

la planta, del tipo de tejido que se trate, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido

endógeno de hormonas entre otros, etc. . Es indudable que la falta de respuesta o la contaminación

del explante sean indeseables, pero respuestas como proliferación de callos son de gran valor para

iniciación de suspensiones celulares y la proliferación de vástagos que pueden ser ideales si

se pretende micropropagar plantas (Mroginski y Roca, 1991). El balance exógeno de auxinas y

citocininas en el medio, es esencial para la organogénesis, jugando un rol importante en la

determinación morfológica del callo. Donde la obtención de órganos está regulada por la relación

de auxinas y citocininas (Zhao y col., 2008).



Página 81

Figura 36. Formación de brotes a partir del callo del explante 25.7.1 después de 18 días (A) y 23

días (B) inoculado en el tratamiento no. 14 (4 mg/l de ANA, 18 mg/l de KIN).

Figura 37. Formación de brotes a partir de callo del explante 212.1 después de 23 días de inoculado

en los tratamientos no. 6 (4 mg/l de ANA, 2 mg/l de KIN) y no. 10 (4 mg/l de ANA, 6 mg/l de

KIN), en ambos tratamientos presenta formación de brotes.



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6.5 Enraizamiento

Los tratamientos y las respuestas obtenidas en cada uno de los diferentes parámetros que se

establecieron para el control del enraizado se describen en la tabla 32, cada dato representa el valor

promedio de las mediciones realizadas en cada grupo.

La adición de ANA indujo la producción de callo, plantas en forma de racimo con varias rosetas

pequeñas, con raíz de tipo adventicio o sin raíz, figura 38.

El carbón activado, en todos los casos produjo una raíz y roseta más grande, su presencia influyo

en el tamaño de la raíz, pero no fue significativo en el no. de raíces presentes.

La concentración más alta de sacarosa 30g/l en medio de cultivo MS, proporcionó raíz más grande

y abundante, así como plantas más grandes, pero más frágiles.

La ausencia de sacarosa reportó plantas pequeñas con poca raíz o sin ella.

En los medios de cultivo donde se adicionó KIN, en general se obtuvieron plantas más grandes que

las obtenidas en los demás tratamientos de enraizamiento, no presentaron la fragilidad que las que

no se adicionaron con KIN, se formaron menos raíces y más delgadas en las plántulas obtenidas, se

presentó con mayor frecuencia y más acentuado la alteración que consiste de tallos fusionados

En el Anexo 1, en los tablas 42 al 47 y en las figuras 55 al 60 se encuentran el análisis estadístico

para la altura de planta y largo de raíz; en donde se indica que existe una influencia significativa

para p< 0.05, del número de grupo, el contenido de sacarosa y de la presencia de carbón activado en

la altura de la planta y largo de la raíz obtenidos en los tratamientos de enraizamiento. Se muestra

cuáles son los tratamientos que son significativamente diferentes en la etapa de enraizamiento.

En la figura 39 podemos apreciar las rosetas representativas que se desarrollaron junto con sus

raíces, en los 8 tratamientos de enraizado realizados en medio de cultivo que no estaban adicionados

con RCV.

Figura 38.- Rosetas enraizadas en el medio de cultivo adicionado con ANA (0.1 mg/l), con

presencia de callo en la base de las pequeñas rosetas y raíces de tipo adventicio.



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Tabla 32.- Resultados obtenidos en los diferentes tratamientos de enraizamiento.

# MS % AZ C.A. ANA 0.1

mg/l

KIN 0.1

mg/L

Raíz Roseta

Largo

cm

No. tipo Alto

cm

Ancho

cm

1 100 30 + - - 3.14 17.12 1 2.18 2.52

2 100 30 - - - 2.51 16.06 1 1.46 1.81

3 50 15 + - - 2.08 7.80 1 2.03 2.04

4 50 15 - - - 1.87 11.07 1 1.50 1.72

5 50 7.5 + - - 1.58 6.95 1 1.95 1.96

6 50 7.5 - - - 1.51 8.75 1 1.44 1.59

7 50 0.0 + - - 0.91 3.63 1 1.32 1.44

8 50 0.0 - - - 1.32 6.77 2 1.21 1.41

9 50 15 + + - 0.71 1.76 3 0.79 1.07

10 50 15 - + - 0.24 0.59 3 0.76 0.93

11 100 30 + - +1 1.98 12.43 1 2.30 2.26

12 100 30 + - +2 1.94 13.83 1 2.45 2.81

13 100 30 + - +3 2.90 11.64 1 2.59 2.78

14 100 30 + - +4 2.04 10.67 1 3.13 3.08

Donde C.A. = carbón activado; ANA= ácido naftalenacetico; tipo de raíz obtenida: 1= fibrosa, 2= escasa o nula,

3= adventicia; MS= medio de cultivo Murashige-Skoog, AZ= sacarosa.



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La figura 40 es una muestra representativa de los diferentes tipos de rosetas que se presentaron en

los 8 tratamientos de enraizado realizados en medio de cultivo que no estaban adicionados con RCV

Figura 39.- Rosetas enraizadas en medios de cultivo que no contenían RCV, después de 40 días de

iniciado este periodo, los medios de cultivo fueron: 1= MS ½ + 7.5 g/l de az.; 2= MS ½ + 7.5 g/l de

az + C.A; 3= MS ½ + 15 g/l de az + C.A; 4= MS ½ + 15 g/l de az; 5= MS + 15 g/l de az. ;

6= MS 100+ 15 g/l de az + C.A; 7= MS ½ ; 8= MS ½ + C.A;

Donde MS= Medio de cultivo Murashige and Skoog, az= sacarosa, C.A.= carbón activado.

nota: Es importante tomar en cuenta la escala para apreciar el tamaño real.



Página 85

En la figura 41 se muestra las rosetas que se obtuvieron en los medios de cultivo que se

adicionaron con KIN en el tratamiento de enraizamiento, se observan rosetas de un tamaño grande

que aumenta con el tiempo de exposición a la KIN, la raíz, no alcanzó el tamaño de la obtenida en

el medio de cultivo equivalente sin reguladores de crecimiento, conforme aumenta el tiempo de

exposición a KIN la raíz es más escasa y delgada. No se observaron raíces con vellosidades o con

ramificaciones. En la figura 42 podemos apreciar diferentes desarrollos de las plántulas expuestas al

tratamiento de KIN todavía en los frascos de cultivo in vitro,

Figura 40. Rosetas obtenidas durante el enraizamiento: A y C= rosetas solas , B y D= rosetas en

racimo; E, B= rosetas hiperhidratadas, F,G,H = rosetas con tallos fusionados.

Figura 41. Rosetas obtenidas del enraizamiento con medio de cultivo adicionado con KIN (0.1

mg/l). A: 1 semana; B: 2 semanas; C: 3 semanas; D: 4 semanas de exposición a KIN.



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En la figura 43 se presentan algunas rosetas procedentes de medios de cultivo para enraizamiento

que estuvieron expuestas a KIN, en las cuales se presenta la alteración de tallos fusionados en

diferente grado o con una forma alargada, perdiendo la forma típica de una roseta de E. calycosa. en

su mayoría estas rosetas no sobrevivieron.

Se realizó un análisis estadístico para la presencia de la alteración de tallos fusionados ver anexo 1

figura 61 tabla 48 el cual muestra que existe una influencia significativa para p < 0.05 de la

concentración de sacarosa para la presencia de la alteración de tallos fusionados. Entre más alta es

la concentración de sacarosa en el medio de cultivo in vitro para el enraizamiento, mayor es el

porciento de la presencia de esta alteración, la presencia de sacarosa en 30 g/l en el medio de

enraizamiento aumenta significativamente la presencia de tallos fusionados en las rosetas. En la

tabla 33, se muestra los resultados obtenidos de la frecuencia con la que se presentó esta alteración

con respecto al grupo de enraizamiento, al realizar el análisis estadístico de la presencia de

Figura 42.- Rosetas con exposición a la KIN, A y F) con forma de roseta alargada, B) con tallos

fusionados en la punta, C y D) con roseta floja y alargadas; E) con la forma típica de una roseta.



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reguladores o de carbón activado el análisis estadístico arrojo que ninguno de estos parámetros es

significativo en su influencia para la presencia de esta alteración.

Figura 43. Rosetas enraizadas en medios de cultivo adicionados con KIN, las cuales presentaron

algún tipo de alteración en su desarrollo. A, B, C D y E presentan la alteración de tallos fusionados

en diferente grado en B, C y F se observan rosetas alargadas.

El enraizamiento se logró con todos los tratamientos, La inducción de raíz se realiza generalmente

por la aplicación de auxinas en el medio de cultivo, ya que promueve la formación de raíz, en

ocasiones el utilizar medio libre de RCV representa una buena alternativa y puede producir mejores

resultados. En nuestro caso pudimos observar que la presencia de auxinas en el medio no produjo la

mejor respuesta a la rizogénesis, que el medio de cultivo sin RCV produjo una formación de raíz de

mayor longitud a la obtenida en presencia de ANA, también se observó la perdida de la arquitectura

de la raíz, e indujo la formación de callo. En el caso de la exposición de KIN, no produjo mayor

formación de raíz que en los medios de cultivo sin RCV, las raíces obtenidas fueron más finas y no

presentaron la formación de vellosidades, con respecto a la plántula obtenida pudimos observar que

fue de un tamaño mayor al obtenido en los otros medos de cultivo lo cual es de esperarse ya que la

presencia de citocininas



Página 88

Tabla 33. Presencia de tallos fusionados en plántulas de E. calycosa, enraizadas en diferentes

concentración de sacarosa.

Conc. de

sacarosa mg/l

No de plántulas con

presencia de tallos unidos

Total de plántulas

obtenidas por grupo

% de presencia de

tallos fusionados

0 0 39 0

0 0 44 0

0 1 40 2.5

0 1 40 2.5

7.5 1 39 2.6

7.5 6 41 14

30 5 40 12.5

30 6 40 15

30 7 40 17

30 8 40 20

30 9 40 22.5

En la Figura 44 se muestra como aumenta la el fenómeno de tallos unidos en las plántulas de E.

calycosa obtenidas en los medios de enraizamiento con respecto a la concentración de sacarosa.

Figura 44. Relación entre la alteración de tallos fusionados en las plántulas de E. calycosa con respecto al

aumento de la concentración de sacarosa en el medio de enraizamiento.

0 0 2.5 2.5 2.6

14.6 12.5

15 17.5

20 22.5

0

5

10

15

20

25

0ANA,

CA

0ANA

0 0CA

7.5 7.5CA

15CA

15 30 30CA

30KINCA

%

Concentración de sacarosa



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La respuesta del explante se ha atribuido a la composición del medio: sales nutrientes, agentes

gelificantes y especialmente RCV, sin embargo también se pueden deber a la interacción entre el

genotipo y el medio ambiente, dando como resultado una expresión fenotípica diferente. Las

plantas herbáceas propagadas in vitro con frecuencia se ven afectadas por la presencia redundante

de varios factores que conducen a trastornos metabólicos y morfológicos (Ziv, 1991, 1999), en

varios estudios se muestra que las principales alteraciones en cultivo in vitro conducen a grandes

espacios intercelulares que tienden a aparecer dando una apariencia de tejido semidesintegrado,

llevando en gran medida a un tallo de diámetro más grande de lo normal, el número de estomas es

reducido en su superficie adaxial, lo que explica en parte la perdida de estas plantas con este tipo de

alteraciones.

6.5.1 Enraizamiento de hojas

Al realizar el procedimiento de establecimiento de rosetas en los medios de cultivo para

enraizamiento donde no se adicionó RCV, se separaron pequeñas hojas de la roseta y se dejaron

sobre el mismo medio de cultivo para observar si era posible su enraizamiento de acuerdo a su

composición. Se obtuvo enraizamiento de hojas y también formación de rosetas a partir de estas

hojas enraizadas en la mayoría de estos medios. Se puede decir que el tratamiento no. 3 fue el más

propicio para enraizar hojas y el tratamiento no. 1 fue el más propicio para que las hojas enraizadas

formaran rosetas. Los resultados obteniendo se muestran en la tabla 34.

Tabla 34.- Número de hojas enraizadas y enraizadas con presencia de roseta en los tratamientos

utilizados para enraizar sin adición de RCV.

# MS % AZ

g/l C.A.

Hoja

Solo raíz

con

roseta

1 100 30 + 6 4

2 100 30 - 7 2

3 50 15 + 10 1

4 50 15 - 8 2

5 50 7.5 + 5 2

6 50 7.5 - 5 2

7 50 0.0 + 5 0

8 50 0.0 - 3 1



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Este no fue un experimento controlado ya que no se puso el mismo número de hojas de roseta en

cada uno de los tratamientos probados. En la figura 45 se observa las hojas enraizadas y con

presencia de roseta.

Figura 45. Hojas que formaron raíz y roseta en los medios de

enraizamiento in vitro



Página 91

6.6 Aclimatación (periodo ex vitro)

Se establecieron un total de 371 plantas en macetas con sustrato tepojal – peat moss (1:1) siguiendo

el protocolo mencionado en la tabla 9 de las cuales sobrevivieron 281 dando un total de 75.74 % de

sobrevivencia (figura 46), después de transcurrido un mes. Estas plántulas se obtuvieron de los 8

tratamientos de enraizamiento realizado sin utilizar RCV, en la tabla 35 se reportan los resultados

por número de tratamiento.

Tabla 35. Resultados de la aclimatación de las plántulas obtenidas del periodo de enraizamiento in

vitro.

Tratamiento de enraizado

No. rosetas

establecidas

No. plantas

después de 1mes

sobrevivencia

No. medio AZ C.A. inicio vivas muertas %

8 MS - 50 --- con 47 27 20 57.4

6 MS - 100 30 g/l con 52 33 19 63.5

4 MS - 50 15 g/l sin 42 32 10 76.2

1 MS - 50 7.5 g/l sin 44 34 10 77.3

7 MS - 50 --- sin 44 34 10 77.3

3 MS - 50 15 g/l con 51 41 10 80.4

2 MS - 50 7.5 g/l con 43 35 8 81.4

5 MS - 100 30 g/l sin 48 45 3 93.8

TOTAL 371 281 90

Los resultados obtenidos por grupos de enraizamiento se encuentran dentro de un rango que va de

57.4 a 93.8 % de sobrevivencia como podemos ver en la figura 47, no se encontró ninguna relación

con respecto al tratamiento de enraizado, el grupo de tratamiento con menos sobrevivencia que fue

el no. 8 que presento plantas muy pequeñas y con muy poca presencia de raíz, pero el grupo

siguiente en cuanto a menor sobrevivencia fue el grupo 6 donde se obtuvieron las rosetas más

grandes y con mayor tamaño de raíz; el grupo que presento mayor sobrevivencia fue el no. 5 que

presento plantas grandes con raíz larga y abundante.



Página 92

Figura 46. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de iniciada la aclimatación.

Figura 47. Sobrevivencia de las plantas en el primer mes de aclimatación por grupo de estudio de

enraizamiento del que proceden.

La acción del líquido rojo adicionado a la mitad de las plantas de cada grupo se relacionó con su

sobrevivencia y se realizó un análisis estadístico de los datos obtenidos observándose que no existió

una diferencia significativa entre las plantas que recibieron el tratamiento y las que no lo recibieron.

La adición del reactivo hemisulfato de adenina en este grupo de plantas se realizó después de 25

días de iniciado el periodo de aclimatación, no se observó una diferencia significativa entre las

plantas que recibieron el tratamiento y las que no.

Al mes de establecidas las plántulas, se midió la sobrevivencia, no encontrando alguna relación

entre el grupo de enraizado de donde proceden. Las de menor sobrevivencia fueron las del grupo 8

donde se obtuvieron rosetas más pequeñas y con menos tamaño de raíz, seguidas de las del grupo 6

que fueron las de mayor tamaño de planta y raíz.

75.74

24.26

vivas

muertas

57.4 63.5

76.2 77.3 77.3 80.4 81.4

93.8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

8 6 4 1 7 3 2 5

% d

e p

lan

tas

viva

s al

mes

grupos



Página 93

Transcurrido un mes de que las plantas se pasaron a condiciones de invernadero se observó que la

gran mayoría de las sobrevivientes presentaban la forma de típica de una roseta, no se presentaron

formas alargadas o tallos fusionados que no lograron sobrevivir ver fig. 48. Se observó que las

rosetas muy pequeñas que sobrevivieron fueron aquellas obtenidas de hojas enraizadas, que

mostraron gran posibilidad de sobrevivencia.

Figura 48. Parte de las plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de aclimatación,

en invernadero.

La etapa de aclimatación es el paso que constituye la transferencia de las plántulas obtenidas del

enraizamiento in vitro a el medio externo ex vitro, se puede considerar la etapa final del cultivo in

vitro, si esta no es realizada con extremo cuidado puede resultar en la perdida significante del

material propagado. Al iniciar este periodo, las plantas obtenidas pierden rápidamente agua, en

algunas especies los estomas no son capaces de cerrarse completamente bajo condiciones de

humedad relativa baja, esto se compensó tapando la maceta con una bolsa de plástico para obtener

una humedad relativa cercana o igual al 100%, para evitar su perdida. El adicionar sacarosa al

medio produjo plantas más grandes y el alto contenido de carbohidratos los cuales resultan en

energía que la planta acumula durante la etapa de crecimiento in vitro, esto las ayuda a sobrevivir en

la etapa de aclimatización. Se observó la presencia de raíz con vellosidad en los medios que no

tenían carbón activado, produciendo una raíz más funcional, que condujo a una mayor

sobrevivencia en el periodo de aclimatación.



Página 94

6.7 Enraizamiento y aclimatación simultánea ex vitro

En la tabla 36 se muestran los 6 tratamientos que se aplicaron para realizar el experimento de

enraizado y aclimatación juntos en condiciones ex vitro.

Tabla 36.- Resultados de la aclimatación y enraizamiento simultáneos de plántulas de E. calycosa.

No. de

tratamiento IBA raíz HSA

No de

muestras

Plántulas

sobrevivientes

Aumento

tamaño

1 0.2 mg/ml - 160 mg/l 8 6 0.27

2 0.2 mg/ml - - 8 3 0.17

3 0.1 mg/ml - 160 mg/l 8 8 0.24

4 0.1 mg/ml - - 9 5 0.05

5 - + 160 mg/l 8 8 0.47

6 - + - 10 8 0.37

En todos los tratamientos que se adiciono hemisulfato de adenina (HSA), arrojaron mejor resultado

en sobrevivencia y crecimiento de la planta que en sus homólogos sin este reactivo, la permanencia

de la raíz en la planta hizo que se obtuvieran mayor crecimiento que en plantas que no tenían raíz,

además presentaron un aspecto más saludable. Ver figura 49.

Es posible realizar el paso de enraizamiento junto con el de aclimatación, obteniéndose plantas un

poco más pequeñas que las obtenidas provenientes de un periodo de enraizado in vitro, corriendo el

riesgo que la sobrevivencia de las plantas sea menor. Las plantas necesitan producir su propio

requerimiento de carbón y de nitrógeno reducido, el HSA es un reactivo que nos proporciona

nitrógeno reducido, el cual se emplea en el cultivo de tejidos in vitro, no existen reportes de la

adición de este compuesto en la aclimatación ex vitro, pero en este trabajo pudimos comprobar que

si se adiciona en el momento en que se inicia el periodo de aclimatación, puede ayudar a la plántula

a su adaptación a condiciones ex vitro.



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Figura 49. Plantas obtenidas después de un mes de iniciado el periodo de enraizamiento y

acondicionado en condiciones ex vitro. 1) Tratamiento: 0.2 mg/ml de IBA + HSA – sin raíz;

2) tratamiento: 0.2 mg/ml de IBA – sin raíz; 3) tratamiento: 0.1 mg/ml de IBA + HSA;

4) tratamiento: 0.1 mg/ml de IBA – sin raíz; 5) tratamiento HSA – con raíz;

6) grupo de plantas con raíz y sin tratamiento. Donde IBA= ácido indol butírico; HSA= hemisulfato

de adenina.



Página 96

7. CONCLUSIONES

Se logró la propagación de Echeveria calycosa por semilla.

Con la metodología probada para la propagación de esqueje de hoja en este trabajo, no se logró la

propagación por esqueje de hoja, en condiciones de invernadero.

La tasa de propagación que presenta E. calycosa bajo condiciones de invernadero se puede

incrementar, mediante el desarrollo de un sistema de regeneración in vitro evaluando diferentes

concentraciones de los reguladores de crecimiento vegetal ácido naftalen acético (ANA) y cinetina

(KIN).

El sistema de regeneración in vitro de E. calycosa desarrollado en este trabajo, utilizando los

reguladores de crecimiento vegetal ANA y KIN indujo un incremento de 2,500% de la tasa de

propagación obtenida en invernadero.

El periodo de cuarentena al que se sometió la planta donadora, fue decisivo para la

sobrevivencia de explantes de E. calycosa en la regeneración in vitro

Los tres factores evaluados: tratamiento para el establecimiento, tipo de explante y método de

desinfección, tuvieron influencia sobre el establecimiento in vitro de explantes de E. calycosa.

La hoja de roseta procedente de cultivo in vitro, fue el tipo de explante con mejor respuesta de

regeneración in vitro de E. calycosa

La presencia de carbón activado en el medio de cultivo para enraizamiento, contribuyo a obtener

plántulas de E. calycosa más grandes y con raíces más largas.

El aumento en la concentración de sacarosa en el medio de enraizamiento produjo plántulas más

grandes con raíces más largas y de mayor numero

Los reguladores de crecimiento vegetal que se evaluaron en el presente trabajo en la etapa de

enraizamiento in vitro no contribuyeron con una mejor formación de raíces de E. calycosa.

La adición de Ácido naftalen acético al medio para enraizamiento in vitro produce plantas más

chicas, formación de callo y raíz, adventicia,

La adición de cinetina al medio de enraizamiento in vitro, incrementó el tamaño de las plantas, y

disminuyó la formación de raíces.

Se presentó la alteración de tallos fusionados en las rosetas enraizadas in vitro; esta alteración

aumentó conforme se aumentó la concentración de sacarosa en el medio de cultivo para

enraizamiento.

Las concentraciones exógenas elevadas y similares de ANA y KIN indujeron callo friable y

productivo en E. calycosa



Página 97

Las concentraciones exógenas medias y similares de ANA y KIN indujeron la formación de rosetas

de E. calycosa

Concentraciones elevadas de KIN en ausencia de ANA indujeron la muerte del tejido de E.

calycosa.

Concentraciones elevadas de ANA en ausencia de KIN indujeron la formación de callo compacto

improductivo

Se logró el enraizamiento ex vitro de E. calycosa de forma simultánea al periodo de

aclimatación utilizando el ácido indol butírico.



Página 98

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Página 104

9. ANEXO 1. Tablas y figuras del análisis estadístico

Tabla 37. Resumen del análisis estadístico de la influencia del tratamiento para establecer explantes de E.

calycosa en la respuesta obtenida por los explantes. Se observa que los valores obtenidos son

significativos donde p< 0,05,

Tabla ANOVA para respuesta por grupo

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

Entre grupos 105.494 3 35.1648 267.38 0.0000

Intra grupos 60.497 460 0.131515

Total (Corr.) 165.991 463

Figura 50. Análisis de medias, muestra la influencia del tipo de tratamiento sobre la respuesta

del explante en el establecimiento. El tratamiento 3 y 4 fueron significativamente diferentes entre

sí y entre los grupos 1 y 2 con respecto a la respuesta del explante en el establecimiento de E.

calycosa,

1 2 3 4

Medias y 95.0% de Fisher LSD

grupo

1.3

1.6

1.9

2.2

2.5

2.8

3.1

resp



Página 105

Tabla 38 Resumen del análisis estadístico con respecto a la calidad del explante entre los cuatro

tratamientos de desinfección realizados para el establecimiento de explantes de E. calycosa. Se observa

que los valores obtenidos son significativos donde p< 0,05,

Tabla ANOVA para calidad por tipo de explante


Entre grupos 276478 3 92159.2 62.25 0.0000

Intra grupos 681066 460 1480.58

Total (Corr.) 957544 463

Figura 51. El análisis de medias muestra que existe influencia del tipo de explante en la calidad

obtenida. Se observa que los grupos no son homogéneos. El explante 2 (inflorescencia) presento la

mejor respuesta, seguido de hoja (1), raíz y tallo (3 y 4 respectivamente) su calidad fue 0.

(donde calidad 0 corresponde a explante muerto, 100 corresponde a aspecto como en el inicio).

1 2 3 4


tipo exp

-14

6

26

46

66

86

cali

dad



Página 106

Tabla 39 Resumen del análisis estadístico con respecto a la respuesta del explante

de las dos especies de Echeveria comparadas en el segundo estudio de propagación. Se observa que

los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para respuesta por las plantas E. calycosa y E. purhepecha


Entre grupos 21.2868 1 21.2868 9.41 0.0026

Intra grupos 278.121 123 2.26115

Total (Corr.) 299.408 124

Figura 52. El análisis de medias muestra que la respuesta obtenida entre las dos especies de

Echeveria en el segundo experimento de propagación es diferente entre las dos plantas (donde 1

corresponde a E. calycosa y 2 E. purhepecha).

1 2


planta

1.5

1.8

2.1

2.4

2.7

3

resp

uesta



Página 107

Tabla 40 Resumen del análisis estadístico con respecto a la respuesta del explante

de E. calycosa a los 16 tratamientos en el segundo estudio de propagación. Se observa que los valores

obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para resp 120 por trat


Entre grupos 171.665 15 11.4443 2.81 0.0011

Intra grupos 418.89 103 4.06689

Total (Corr.) 590.555 118

Figura 53. El análisis de medias muestra que los 16 tratamientos de RCV del primer estudio de

propagación influyen significativamente en la respuesta obtenida en los explantes de E. calycosa.

Los tratamientos 6 y 10 influyeron de manera diferente en los explantes.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16


trat

-1.2

0.8

2.8

4.8

6.8

resp

120



Página 108

Tabla 41. Resumen del análisis estadístico de la influencia de la especie de Echeveria con respecto a la

respuesta obtenida por los explantes de las dos especies de Echeveria comparadas en el primer estudio de

propagación. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para resp 120 por planta


Entre grupos 34.9354 1 34.9354 6.87 0.0096

Intra grupos 849.775 167 5.08847

Total (Corr.) 884.71 168

Figura 54. El análisis de medias muestra que se trata de dos especies de Echeveria que son

significativamente diferentes para la respuesta a los tratamientos del primer experimento de

propagación (donde 2 corresponde a E. purhepecha y 1 E. calycosa).

1 2


planta

1.3

1.7

2.1

2.5

2.9

3.3

resp

120



Página 109

Tabla 42. Resumen del análisis estadístico para la respuesta a los tratamientos del enraizamiento de

plántulas de Echeveria. Se observa que los valores obtenidos son significativos con una p< 0,05.

Tabla ANOVA para alto por grupo


Entre grupos 150.898 13 11.6076 41.29 0.0000

Intra grupos 137.469 489 0.281123

Total (Corr.) 288.367 502

Figura 55. El análisis de las medias muestra que se trata de grupos heterogéneos con respecto a la

respuesta de altura de la planta, obtenida de los 14 tratamientos para el enraizamiento de rosetas de

E. calycosa. El grupo 14 mostró ser significativamente diferente a los demás grupos influyendo más

en el enraizamiento.



Página 110

Tabla 43. Resumen del Análisis estadístico para Alto de la planta por la concentración se

sacarosa.- se observa que existe significancia entre las concentraciones de sacarosa utilizadas.

Tabla ANOVA para alto por conc sac


Entre grupos 58.0515 3 19.3505 41.92 0.0000

Intra grupos 230.316 499 0.461555

Total (Corr.) 288.367 502

Figura 56. El análisis de medias muestra que se trata de grupos heterogéneos con respecto a la

concentración de sacarosa utilizada. La concentración de sacarosa 30 g /l (100%) mostro ser

significativamente diferente a las otras tres concentraciones y fue la que influyo mayormente en la

altura de la planta seguida de la concentración de 25%.

0 25 50 100


conc sac

1.1

1.3

1.5

1.7

1.9

2.1

2.3

alt

o



Página 111

Tabla 44. Resumen del análisis estadístico para Alto de la planta como lo influye el carbón

activado en los tratamientos del enraizamiento de plántulas de Echeveria. Se observa que los

valores obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para alto por carbón act


Entre grupos 39.6098 1 39.6098 79.77 0.0000

Intra grupos 248.758 501 0.496522

Total (Corr.) 288.367 502

Figura 57. El análisis de medias para la influencia del carbón activado en la altura de la planta

muestra que se trata de grupos heterogéneos, donde 1 presencia de carbón 2 ausencia de carbón

activado; podemos observar que la presencia de cartón activado influyo significativamente en la

altura de la planta obteniendo un mejor resultado al adicionarlo al medio. .

1 2


carbón act

1.2

1.4

1.6

1.8

2

alt

o



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Tabla 45. Resumen del análisis estadístico para la influencia de carbón activado sobre el largo de

la raíz en los tratamientos del enraizamiento de plántulas de Echeveria. Se observa que los valores

obtenidos son significativos con una p< 0,05,

Tabla ANOVA para l raíz por grupo


Entre grupos 347.873 13 26.7594 32.12 0.0000

Intra grupos 409.038 491 0.833071

Total (Corr.) 756.91 504

Figura 58. El análisis de medias para la influencia del carbón activado en lo largo de la raíz

muestra que se trata de grupos heterogéneos. que los grupos 8 y 13 que ambos contienen 100 % de

sacarosa con presencia de carbón activado influyeron mayormente en lo largo de la raíz, siendo

significativamente diferentes a los otros grupos, el grupo dos que contenía ANA sin carbón

activado fue el que menos influyo en lo largo de la raíz.



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Tabla 46. Resumen del Análisis estadístico para la influencia de la concentración de sacarosa en lo

largo de raíz muestra que existe significancia para una p< 0.05

Tabla ANOVA para l raíz por conc sac


Entre grupos 209.375 3 69.7916 63.86 0.0000

Intra grupos 547.536 501 1.09289

Total (Corr.) 756.91 504

Figura 59. El análisis de medias para la influencia de la concentración de sacarosa en lo largo de la

raíz muestra que se trata de grupos heterogéneos. Que el grupo que contiene 100 % de sacarosa

influye mayormente en lo largo de la raíz, siendo significativamente diferente a los otros grupos, el

grupo que contienen sacarosa.

0 25 50 100


conc sac

0.9

1.3

1.7

2.1

2.5

2.9

l ra

iz



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Tabla 47. El resumen del Análisis estadístico para la respuesta de largo de raíz influenciada por el

carbón activado muestra que los resultados son significativos para una p< 0.05.

Tabla ANOVA para l raíz por carbón act


Entre grupos 13.7905 1 13.7905 9.33 0.0024

Intra grupos 743.12 503 1.47738

Total (Corr.) 756.91 504

Figura 60. El análisis de medias para la influencia del carbón activado en lo largo de la raíz

muestra que se trata de grupos heterogéneos. Los grupos con carbón activado influyeron

mayormente en lo largo de la raíz, siendo significativamente diferente al grupo sin carbón activado

que fue el que menos influyo en lo largo de la raíz.

1 2


carbón act

1.3

1.5

1.7

1.9

2.1

l ra

iz



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Tabla 48. Resumen del Análisis de varianza de la influencia de la concentración de sacarosa en la

respuesta de formación de tallos fusionados en las rosetas de E. calycosa en la etapa de

.enraizamiento, se muestra que los resultados son significativos para una p< 0.05.

Tabla ANOVA para respuest por sacarosa


Entre grupos 1.39447 3 0.464825 3.78 0.0108

Intra grupos 43.8027 356 0.123041

Total (Corr.) 45.1972 359

Figura 61.- En el análisis de medias muestra que existe una influencia significativa de la

concentración de sacarosa en la formación de tallos fusionados en rosetas de E.calycosa, enraizadas.

El aumento en la concentración de sacarosa influyó en la presencia de los tallos fusionados en E.

calycosa. Dónde: respuesta 1.- tallo fusionado, 2.- tallo normal.

0 7.5 15 30


sacarosa

1.7

1.8

1.9

2

2.1

resp

uest



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10. APENDICE

Composición del medio MS

Compuesto mg/l

NH4NO3 1650.00

KNO3 1900.00

CaCl2 333.00

MgSO4 181.00

KH2PO4 170.00

Kl 0.830

H2BO3 6.200

MnSO4·H2O 16.900

ZnSO4·7H2O 8.600

Na2MoO4·2H2O 0.250

CuSO4·5H2O 0.025

CoCl2·6H2O 0.025

FeEDTA 6.200

FeSO4·7H2O 27.80

Na2EDTA 4.123

Myo-inositol 100

Piridoxina 0.5

Tiamina 0.1

Sacarosa 30 g/l

PHYTAGEL 4.5 g/l

/ AGAR 8.0 g/l

MORAN (CRASSULACEAE), VÍA ORGANOGÉNESIS” · Al Centro de Investigación y Asistencia en...

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