Molecular FINAL Final

Universidad de La Frontera.

Facultad De Ciencias Agropecuarias y Forestales

PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Iván Faundez

Nelson Peña

Osvaldo Pradel

Álvaro Suazo

Profesora: Alejandra Sandoval

Asignatura: Laboratorio Biología Molecular

Carrera Biotecnologia

Temuco - Chile

2010

INTRODUCCIÓN

Con el avance de los años la tecnología está creciendo a gran escala, de ahí que se han desarrollado técnicas que en siglos pasados ni siquiera fueron imaginadas por los investigadores, pero que hoy son indispensables para el desarrollo de la ciencia; una de esas técnicas es la extracción de ácidos nucleicos (ADN/ARN), a través del método de Chomczynski.

Los ácidos nucleicos son macromoléculas formados por distintas secuencias de nucleótidos (unión entre bases nitrogenadas, azúcares y fosfatos) y se unen a través de enlaces fosfodiester. Existen dos tipos de ácidos nucleicos, los ácidos desoxiribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son polímeros de nucleótidos formados por un azúcar de cinco carbones (desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN), una base nitrogenada (que puede ser adenina, timina, citosina, guanina o Uracilo) y una molécula de fosfato. El ADN es la macromolécula que contiene la información genética de las células procariontes, eucariontes y de los adenovirus. Está involucrado en la síntesis de proteínas y constituye el material genético de los retrovirus; la expresión de los genes es la base del metabolismo celular, y por ésta se entiende que el ADN se transcribe en ARN, que a su vez se traduce en proteínas. Esta secuencia ADN-ARN-proteínas constituye el dogma central de la biología molecular. (1)

Para la extracción de ácidos nucleicos a través del método de Chomczynski descrito en el año 1987, se desarrolla una serie de pasos llevados a cabo en el laboratorio, que tienen como objetivo final una muestra libre de residuos celulares. Este se desarrolla tras varios pasos que tienen como función: desintegrar las membranas celulares con una solución Guanidino Tiocianato, centrifugar para separar los contenidos por peso molecular, desnaturar las proteínas ( tras la acción del cloroformo) y otra serie de pasos que se deben realizar purificar y finalmente realizar una electroforesis. En el presente informe se detallará el proceso de extracción en 2 laboratorios diferentes, donde se extrajo DNA plasmidial, DNA geonómico y RNA. En el primero realizamos una extracción simultánea de DNA plasmidial y genómico, el DNA y genómico se extrajo de material vegetal proveniente de hojas de tabaco y el DNA plasmidial se obtuvo de bacterias, en este caso de E. Coli. En el segundo laboratorio extrajimos RNA a partir de hojas de tabaco al igual que para DNA genómico. Es importante destacar que el método de Chomczynski tiene varias etapas similares para la extracción de los ácidos nucleicos sin embargo hay consideraciones fundamentales para el empleo de la solución en DNA o RNA.

Finalmente debemos visualizas nuestras muestras y un método que permite visualizar ácidos nucleicos o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual el material genético se separa en función de su tamaño. Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de DNA depositadas en un gel de agarosa a un campo eléctrico (3).

“Dado que la fuerza impulsora es proporcional a la carga eléctrica, el parámetro que rige el avance (aceleración = fuerza/masa) es realmente la relación carga/masa.”

(Prof. Tom Jack y Prof. Bob Gross) (1998)

Por otro lado, hay cuidados que tener a la hora de trabajar en el laboratorio, por esto y a modo de introducción a los laboratorios, se ha de presentar el espacio físico donde se trabajará y las debidas precauciones que se deben guardar.

NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Es evidente que cada laboratorio, como es el caso de un Laboratorio de Biología Molecular, el personal está sometido a diversos riesgos, unos de tipo general y otros específicos propios de la actividad desarrollada en los mismos. Debido a que un laboratorio debe de ser un lugar donde debe

prevalecer la seguridad personal, es preciso mencionar que las normas de seguridad de laboratorio son indispensables para conseguirlo, estas son difíciles de elaborarlas tratando de abarcar completamente todas las instancias y riesgos que puedan suceder en laboratorios en general, por ello es necesario elaborarlas de acuerdo a las practicas, ensayos y materiales que allí se utilicen , bajo criterios de orden general, basados en legislación al respecto. Un punto importante más allá de lo dicho anteriormente, es necesario que los usuarios de laboratorio cuenten con mínimo de sentido común y conocimiento de los riesgos a los que están expuestos al realizar experimentos no autorizados o sin la adecuada supervisión.

Protección personal básica

Ya que no tenemos la certeza de que los medios de protección colectiva ofrecen el máximo de seguridad es indispensable utilizar los métodos de protección personal básica, dejando claro que es necesario que este tipo de protección deba ser utilizado durante todo el tiempo que se está en el laboratorio.

Es conveniente la utilización de delantal, ya que evita que posibles proyecciones de sustancias químicas lleguen a la piel. Por supuesto además, evitarás posibles deterioros en las prendas de vestir.

Es indispensable el uso de guantes de látex para evitar el contacto de sustancias toxicas con la piel.

En el caso de usar cabello largo es necesario llevarlo recogido.

Es aconsejable el uso de gafas de seguridad.

Si se está manipulando sustancias fuertemente corrosivas se deben usar guantes de goma.

Está terminantemente prohibido fumar, ni tomar bebidas ni comidas.

Durante la jornada de trabajo no se deben usar aros, reloj de pulsera, colgantes, bufandas, entre otros.

Es necesario contar con zapatos cerrados.

Instrumentación y equipamiento de seguridad

Debido al tipo de experimentación realizada en este tipo de laboratorio es de carácter obligatorio contar con el tipo de equipamiento antes mencionado ya que son de vital importancia a la hora de evitar un accidente. A su vez es necesario conocer y averiguar el correcto funcionamiento de cada uno de los equipos ubicados en el laboratorio.

Accesorios de protección personal : Este cuenta con variados accesorios como lo son gafas protectoras, guantes de látex, gorro de polipropileno, inhaladores filtrantes, mascarillas, entre otros.

Campana de extracción : Es indispensable su uso en aquellas instancias donde el personal esta expuesto al contacto o inhalación de gases emanados de categoría tóxica.

Extractor: Elimina los productos no deseables del ambiente, ya que este facilita la renovación del aire del interior de laboratorio.

Extintor: La presencia de este instrumento en buenas condiciones y en un lugar estratégico contribuye un rápido control de un accidente de tipo inflamatorio.

Partes generales del laboratorio

El laboratorio de Biología Molecular está organizado de tal forma que distintas tareas o procedimientos se realicen en áreas o sectores diferentes dentro del mismo laboratorio, con ello logramos conseguir mantener en zonas específicas aquellos procedimientos que son de mayor peligrosidad, como también, mantener ubicaciones exclusivas de materiales de similar índole.

Sector de electroforesis : Ésta área de trabajo utilizada para la visualización de ácidos nucleicos presenta solo instrumentación que se realiza para este tipo de prácticas, con esto evitamos contaminación presentada por aquellos reactivos aquí utilizados. Principalmente consiste en la cámara de electroforesis, transiluminador UV, PC, entre otros.

Mesones de trabajo : Ésta es una de las áreas de mayor confluencia de personal de trabajo ya que es este lugar donde se realizan todo tipo de mediciones, preparación de muestras, etc. Aquí es posible encontrar una gran variedad de instrumentación, como lo son: centrifugas, micropipetas, microondas, vórtex, balanzas, agitador magnético, entre otros.

Zona húmeda : En un trabajo de laboratorio es indispensable contar con variados tipos de agua, ya sea para lavados, diluciones, etc. Para ello el laboratorio cuenta con un área donde encontramos agua potable como también agua destilada, esto con contenedores necesarios para depositar allí material sucio o para fines que lo ameriten.

Área de refrigerado : Muchas veces en necesario conservar muestras u reactivos que necesitar permanecer a bajas temperaturas, para ello es necesario mantener un área de este tipo en este tipo de laboratorio. El equipamiento aquí utilizado son solo aparatos de también de uso domestico, como lo son refrigeradores o congeladoras.

Vitrina de reactivos : El objetivo de este lugar es para mantener aislado o simplemente reunido todo tipo de material reactivo que podría causar algún tipo de peligrosidad por su mala manipulación preciso mantenerlo en un área apartada o bien reunidos en un solo lugar para así mantener allí solo este tipo de material tipo de reactivos

Señalización de precaución

El laboratorio presenta señalización necesaria para advertir lugares donde la peligrosidad es mayor, como es el caso del lugar donde se encuentran los reactivos como también aquellos donde

se llevan a cabo practicas en las que podrían haber adheridos residuos de reactivos de alto riesgo de contaminación del personal o usuario del laboratorio, como es el área de electroforesis

Anexo

Para un correcto funcionamiento y para llevar a cabo un trabajo de laboratorio en condiciones seguras, es necesario contar con todo lo dicho anteriormente, por ello ésta es la instancia para mencionar aquellas implementaciones de seguridad que en nuestro laboratorio están ausentes;

o La ducha de disparo rápido, que debería presentarse en el punto de mayor paso o bajo el dintel de la entrada principal, este es de vital importancia en aquellos accidentes que lo ameriten.

o Una fuente de lavaojos es imprescindible tenerla cercana a los mesones de trabajo, esto porque no estamos ajenos a tener un contacto de sustancias que podrían causarnos problemas oculares.

OBJETIVO GENERAL

Extraer DNA genómico, DNA plasmidial y RNA por el método de Chomczynski.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

Conocer los procedimientos específicos para la extracción de ácidos nucleicos.

Observar los distintos procesos a los que se somete a las muestras para obtener una buena muestra de DNA o RNA.

Diferenciar las propiedades de cada uno de los ácidos nucleicos; las que hacen diferentes los protocolos empleados.

Emplear y conocer diferentes reactivos y sus propiedades.

Conocer los pasos que se realizan en una electroforesis.

Precauciones

1. Se deben utilizar guantes para protección personal en especial con el Bromuro de Etidio que se intercala entre las bases del DNA provocando mutaciones de origen canceroso y para evitar contaminar las muestras.

2. Realizar con mucho cuidado todos los pasos de la extracción de ácidos nucleicos ya que cualquier error se refleja en el gel de la electroforesis.

3. Tener precaución de no contaminar la muestra.

4. Trabajar siempre sobre un mesón limpio.

5. Utilizar una punta de micropipeta por cada muestra en cada paso para evitar contaminación entre muestras.

6. Las condiciones de electroforesis para correr un gel varían y de acuerdo a ello también los resultados, por ejemplo entre más voltaje, más rápido avanza la muestra por el gel, al tener mucho voltaje queda una mancha en el gel es por eso que se utiliza una intensidad baja para correr los geles; entre más bajo el voltaje más lento avanza la muestra más uniforme queda.

MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Utensilios en general:

Espátulas

Mortero

Pinzas

Bisturí

Pistilos

Gradilla

Guantes

Termo

Hielo

Tubos Eppendorf

Micropipetas

Puntas micropipetas

Toalla nova

Mondadientes

Equipos:

Centrífuga TA

Centrifuga Refrigerada

Cámara de electroforesis horizontal

Fuente de poder

Transluminador UV

Campana de extracción

Reactivos en General:

Solución de Chomczynski (Guanidino Tiocianato)

Solución de Chomczynski c/Fenol (Guanidino Tiocianato)

Agua desionizada estéril

Agua desionizada estéril/DEPC (pirocarbonatos de dietilo)

Cloroformo Isoamilico (24:1)

Alcohol etílico absoluto

Alcohol etílico 95%

Alcohol isopropanol

Alcohol etílico 75% (DEPC)

Marcador de peso GeneRuler 1kb DNA Ladder.

Acetato de Sodio 3M pH 5.2

Agarosa

Gel Red

Buffer de carga 6X

Buffer TAE 1X

Otros:

Nitrógeno Liquido (-196°C)

Medio LB Ampicilina (100 mg/ml)

Escherichia coli cepa DH5α, Pgem-T Easy GRX

Placas de agar LB ampicilina (100 mg/ml)

METODOS

Protocolo de extracción de DNA Genómico con solución Chomczynski

La solución Chomczynski tiene como función desnaturalizar proteínas y romper la membrana plasmática. Para DNA este adquiere un pH básico no superior a 11 ya que si supera ese valor el DNA pierde estabilidad y se desnaturaliza. Por otro lado se usa alcohol absoluto con el fin de precipitar la molécula de DNA ya que hace que este pierda contacto con las moléculas de agua que lo rodean y queda libre de impurezas producto de este aislamiento y precipitación. El alcohol

isopropanol no solubiliza algunas sales que a veces continúan con el DNA así que es recomendable usar el etanol absoluto.

Reactivos exclusivos:

Solución de Chomczynski (Guanidino Tiocianato)

Cloroformo

Alcohol etílico absoluto

Alcohol etílico 95%

Agua desionizada estéril

Método:

1. Pulverizar el tejido (100 mg. aprox. Para cada tubo) en un mortero con la ayuda de nitrógeno líquido (-196°C).

2. Homogeneizar 100 mg de tejido en 1 ml de reactivo Chomczynski. A cada uno de los tubos Eppendorf, la finalidad al utilizar este tipo de solución es hacer lisis de las membranas celular y nuclear rompiendo los enlaces más débiles (no covalentes) de las membranas y así facilitar la obtención y posterior extracción de ADN. La solución de Chomczynski es un agente desnaturante que provoca la pérdida de la estructura tridimensional del ADN (2).

3. Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos a T.A. Luego de esto en cada uno de los tubos se logra apreciar 2 fases. La fase superior contiene proteínas y organelos, incluido el ADN, mientras que en la fase que precipitó al fondo del tubo, se encuentran elementos de alto peso molecular.

4. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo; agregar 200 μl de cloroformo, cerrar muy bien, agitar vigorosamente. Centrifugar a 10.000 g durante 10 minutos a T.A. Aplicamos el cloroformo con el objetivo de limpiar y purificar (4) el ADN de las proteínas, ya que el ADN no es soluble en cloroformo (3), pero en cambio las proteínas y los lípidos si son solubles, y como el ADN tiene menor peso molecular queda en suspensión y de esta manera lo podemos separar.

5. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, agregar 500 μl de alcohol etílico absoluto.

6. Mezclar por inversión e incubar por 1-3 minutos a T.A. de modo de buscar una buena interacción entre los componentes. El producto de la mezcla se aprecia como pequeñas fibras de algodón blanco que flotan en el tubo, ya que el alcohol lo deshidrata e inicia la sedimentación. La idea es que sedimente todo el contenido de ácidos nucleicos.

7. Centrifugar a 4000 g durante 2 minutos a T.A. para obtener un sedimento que contenga lo ácidos nucleicos.

8. Lavar en alcohol etílico 95% mediante aplicación de un spin. Repetir este paso. Alcohol etílico 95% (5% de agua) para lavar el pellet y eliminar las sales y elementos copurificantes (95% de etanol provoca que el ADN no solubilice.

9. Secar el pellet a T.A.; resuspender en 50 µl ADESI estéril.

10. Guardar a -20°C.

Protocolo de extracción de DNA Plasmidial por lisis alcalina

Los plásmidos son moléculas pequeñas de DNA circular muy comunes en bacterias, se replican de forma autónoma e independiente del genoma bacteriano (6). Constituyen una herramienta fundamental en Biología Molecular e Ingeniería Genética ya que son usados como vectores para introducir en ellos genes de interés y así conseguir su amplificación natural (7).

El desarrollo de técnicas de extracción de DNA plasmidial consta de los siguientes pasos: el crecimiento del cultivo bacteriano; segundo, la cosecha y lisis de las bacterias; y finalmente, la purificación del material plasmídico. Muchos de los plásmidos que se usan actualmente se pueden replicar en alto número mediante su inserción en Escherichia coli (6), luego pueden ser purificados en grandes cantidades a partir de cultivos que se dejan crecer en medio de cultivo selectivo estándar (medio LB). Después del cultivo las bacterias son cosechadas por centrifugación y lisadas por alguno de los métodos que se han reportado para este fin. La elección del método adecuado para la lisis depende del tamaño de la construcción, la cepa de E. coli empleada como hospedero, y la técnica elegida para la subsiguiente etapa de purificación del plásmido (6).

El objetivo de este práctico es el aislamiento y purificación de un DNA plasmídico con resistencia a ampicilina, PGem-T easy (10), que contiene un fragmento de cDNA correspondiente a un gen que expresa α Tubulina introducido en la cepa DH5-α de Escherichia coli para lo cual el método de extracción de DNA plasmidial fue basado según protocolo de extracción y purificación por lisis alcalina y el uso del detergente SDS (dodecilsulfato sódico) a partir del cultivo de E. coli cepa portadora de la construcción de 3215 pb. (10).

El tratamiento con detergentes en medio alcalino rompe la estructura celular y permite la liberación del DNA puesto que en estas condiciones el DNA se desnaturaliza (pierde la estructura de doble hélice). La estructura de las proteínas, se ve afectada también por el pH alto. Si después de la lisis, se neutraliza el medio, el DNA cromosomal forma agregados insolubles con las proteínas y estos complejos pueden ser separados por centrifugación mientras que el DNA de los plásmidos, permanece estable en la solución (11). Esto se debe a que la estructura del DNA plasmídico es mucho menos compleja que la del ADN cromosomal, además posee menor peso molecular, por lo que neutralizar el medio, lo renaturaliza en forma reversible adoptando una estructura estable en medio acuoso (pH 8) (11).


LB líquido: 10gNaCl, 5g Yeast Extract, 10g Tristona

GTE: 50 mM Glucosa, 25 mM Tris-HCL ph 8.0, 10mM EDTA

NaOH/SDS: 0,2 N NaOH, 1% SDS, preparar fresco cada vez

Acetato de Potasio 5M: 29.5 mL ácido acético glacial, KOH en grano hasta pH de 4.8, H2O hasta 100 mL, Guardar a temperatura ambiente, no esterilizar

RNAsa

5M LiCl2

Alcohol Isopropanol

70% Etanol

ADESI (agua desionizada estéril)

Método

1. Centrifugar el cultivo de E. coli DH 5-alfa portadora de la construcción en LB líquido (10gNaCl, 5g Yeast Extract, 10g Triptona) a 12.000 rpm por 3 min.

2. Remover el sobrenadante (medio de cultivo) y mondadientes lo que reduce la posibilidad de contaminación por fragmentos de la pared celular del huésped que ha sido usado con el propósito de generar un sustento al cultivo (9).

3. Resuspender el pellet con 100 µl del amortiguador GTE a 4°C (25 mM Tris-HCL ph 8.0, 10mM EDTA).

4. Agregar las RNAsa e incubar 5 minutos a temperatura ambiente, de esta forma se elimina RNA presente en la muestra (6).

5. Agregar 200 µl NaOH/SDS, (0,2 N NaOH, 1% SDS) y mezclar, este es el detergente responsable de la lisis celular.

6. Dejar en hielo durante 5 minutos ya que la temperatura es responsable en gran medida de la degradación del DNA (8).

7. Agregar 150 µl Acetato de Potasio (29.5 mL ácido acético glacial, KOH en grano hasta pH de 4.8, H2O hasta 100 mL) y mezclar para producir la unión de las hebras de DNA y la remoción de contaminación.

8. Dejar en hielo durante 5 minutos.

9. Agregar 450 µl LiCl2 a temperatura ambiente y mezclar el uso de esta sal ayuda a la precipitación del DNA (7).

10. Dejar en hielo durante 5 minutos.

11. Centrifugar a T. A por 3 min a 12.000 rpm. Recuperar solo el sobrenadante dado que el precipitado corresponde a los restos celulares como proteínas.

12. Llenar el tubo con Isopropanol para lograr la precipitación del DNA.

13. Centrifugar por 3 minutos a T.A. a 12.000 rpm.

14. Lavar el pellet con 1ml etanol 70% lo que permite además eliminar restos de sales u otros contaminantes (11).

15. Volver a centrifugar como en el paso anterior y eliminar el sobrenadante.

16. Secar el pellet de DNA a T.A. y resuspender en 50 µl de ADESI para guardar a -20°C.

Protocolo de extracción de RNA con solución Chomczynski

La extracción del RNA también se realiza a partir de un homogenizado, en presencia de Guanidino Tiocianato, por adición de fenol y cloroformo, seguido de agitación vigorosa y centrifugación, el RNA aparece en la fase acuosa superior. A partir de ella se obtiene el RNA por

precipitación con etanol isopropanol. En el caso del ARN la solución de Chomczynski debe poseer un pH ácido, ya que sobre pH 7,5 el ARN se hidroliza.

Existen otras técnicas más simples que no requieren dicha extracción, como el empleo de soluciones de urea y cloruro de litio, que también inactivan RNAsas y solubilizan el RNA. A la hora de trabajar con RNA, deben tomarse las máximas precauciones para evitar contaminaciones con RNAsas y la degradación del RNA. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNAsas, y debe tratarse todo el material para su eliminación. Deben usarse guantes a lo largo de todo el proceso e intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la degradación del RNA durante la manipulación. Con el fin de obtener los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida. Si es necesario acumular muestra, congelar las muestras tras su recogida en nitrógeno líquido y almacenarlas a -70 ºC.


Solución de Chomczynski

Fenol Cloroformo

Alcohol isopropanol

Alcohol etílico 75% (DEPC)

Água desionizada estéril/DEPC (pirocarbonatos de dietilo)

Método

1. Introducir en un tubo Eppendorf hasta un máximo de 100mg de material vegetal (por cada 100mg de material se agregan 1ml de reactivo). Tras sucesivas congelaciones (con la ayuda de nitrógeno líquido -196°C). Es muy importante que el material este constantemente congelado ya que el RNA es más inestable que el DNA; por lo mismo no se utiliza mortero y la molienda se lleva a cabo directamente en el tubo Eppendorf con la ayuda de un pistilo. Otro elemento importante que debe ser tomado en cuenta es que para garantizar un triturado ideal, es recomendable nunca sacar el pistilo una vez dentro del tubo.

2. Homogenizar el tejido en 1 ml de Chomczynski (fenol y tiocianato de guanidina). Incubar las muestras homogeneizadas por 5 minutos en hielo, esto porque con una Tº superior a 4Cº el RNA se desnaturaliza.

3. Remover el material insoluble del homogenizado por centrifugación a 12000 g por 10 minutos a 4 ºC. Nótese que para realizar esta centrifugación debe ser estrictamente realizada e un centrifuga refrigerada. Transferir la fase acuosa a un tubo eppendorf nuevo.

4. Agregar 200 µl de cloroformo. Tapar bien y agitar vigorosamente por 15 segundos. Incubar durante 3 minutos en hielo y centrifugar a 12000 g por 15 minutos a 4 ºC. Repetir este paso si el material está muy sucio.

5. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo, precipitar el RNA con 500 µl de isopropanol, incubar las muestras en hielo por 10 minutos; centrifugar a 12000 g por 10 minutos a 4 ºC.

6. Remover el sobrenadante, lavar el pellet con 1 ml de etanol 75% y centrifugar a 7500 g por 5 minutos a 4 ºC.

7. Secar el pellet a T.A. y disolver el RNA en 50 µl agua con DEPC.

8. Guardar RNA a -80°C.

Electroforesis

Método

1. Preparar una solución de agarosa al 1% (p/v) buffer TAE (Tris Acetato EDTA) 1x (1 gramo de agarosa por 100 ml de buffer TAE), que logra mantener el pH estable. Este gel tiene como función retardar el paso de las moléculas al actuar como filtro de ácidos nucleicos de modo de separar las moléculas por fuerza de roce según su peso molecular tras someterlas a un campo eléctrico. El EDTA es un quelante de cationes, captura los magnesios libres debido a que es un cofactor.

2. Calentar en el microondas la solución hasta que esta se homogenice, la temperatura en un factor importante en este proceso. El punto de fusión de la azarosa es de 65ºC

3. Cuando se tenga una solución liquida agregar 2 µl de GEL RED por cada 100 ml de solución, Gel Red es una tinción fluorescente de ácidos nucleicos diseñada para reemplazar al Bromuro de Etidio (BE) en la tinción de dsDNA, ssDNA o RNA en geles de agarosa, poliacrilamida y geles prefabricados. Este fluoróforo posee la característica de ser muy estable en el tiempo, no mutagénico ni citotóxico y seguro para el medio ambiente. No representa un riego directo para la salud, incluso puede ser directamente desechado en el drenaje.

4. Llenar la cámara con el gel con una solución de buffer TAE hasta cubrir por completo el gel de agarosa.

5. En una lámina de papel parafilm colocar 2 µl de buffer de corrida 6X (por cada 6 µl de muestra agregar 1 µl de buffer, en el caso de este práctico en particular, se le agregaron 2 µl de buffer ya que éste estaba más diluido) por cada una de las muestras que se van a cargar, el buffer contiene Azul de Bromofenol que es un indicador de pH y Xilen Cianol que es el colorante del buffer, que permiten identificar el frente de corrido en el gel de agarosa.además entre sus componentes tiene glicerol, que le proporciona peso a los ácidos nucleicos para que precipiten al fondo del pocillo.

6. Posterior a esto se toman 5ul de la muestra que contiene el ADN y depositar sobre el Buffer de carga y succionar todo el componente que se forma en un conjunto (el Buffer de carga mas la muestra de ADN) y se deposita sobre un carril del gel de la electroforesis.

7. Cargar los carriles con ADN, siendo primer carril correspondiente a 1ul de un marcador de peso GeneRuler 1kb DNA Ladder. Este es ideal para determinar el tamaño de DNA de doble cadena que va desde 50 pb. hasta 1 kb. de modo de obtener una referencia al momento de la lectura. El resto de los carriles son cargados con las muestras en si.

8. Para finalizar el proceso de extracción de ADN se corre el gel por 20 minutos a 100 volts y 250mA, donde las moléculas con carga positiva (cationes) migran hacia el polo captador de cationes (ánodo) y las moléculas con carga negativa (aniones) migran hacia el polo receptor de cargas negativas (cátodo); que son las condiciones más estables para que el gel corra correctamente, pasado este tiempo el gel se debe visualizar en un transluminador de luz UV.

RESULTADOS Y

DISCUSIÓN

En la siguiente imagen podemos observar el resultado de la electroforesis correspondiente al grupo N°1, el gel se compone de 20 carriles, siendo los dos primeros de cada columna (1 y 11) los indicadores de carga y el resto de los carriles corresponden a los ácidos nucleicos de todos los compañeros del práctico.

El primer carril de cada fila corresponde a los marcadores de peso de 10.000pb pero los podemos observar un tanto menos corridos de lo que se esperaba y sin gran diferencia en los marcajes aun así estos son los que mejor representan la corrida de electroforesis.

El numero tres corresponde a las dos extracciones de DNA genómico del grupo 1 que fueron extraídas desde champiñón.

El numero 5 corresponde a las dos extracciones de DNA genómico del grupo 2 que fueron extraídas desde plantas de tabaco cultivadas in vitro.


El numero 9 corresponde a las dos extracciones de DNA genómico del grupo 4 que fueron extraídas desde plantas de tabaco cultivadas in vitro, estas son las extracciones realizadas por nuestro grupo.

1

107 981 6

2 3 54


De las muestras visualizadas en el gel, todas presentan contaminación, el marcador de peso no está lo suficientemente claro como para establecer un patrón, esto puede ser causa de poco tiempo de corrida del gel a un muy alto voltaje.

Las bandas que se presentan en el fondo de los pocillos pueden pertenecer a DNA degradado producto de todo el proceso de extracción, los carriles presentan bandas inespecíficas pueden ser producto de contaminaciones por fenoles, siendo visibles en la electroforesis, otro motivo es que en muestra cargada también se encuentren fragmentos de RNA no degradado completamente los que al igual pueden se visualizan en la electroforesis.

En ninguno de los carriles de DNA genómico es posible distinguir si existe DNA producto de la extracción. Las bandas visibles en la parte superior de los pocillos, son signos de contaminación, que puede deberse a errores de manipulación o un mal deposito de la muestra sobre estos.

Los carriles rotulados como 2, 4, 6 y 8 corresponde a la extracción de DNA plasmidial extraído desde la cepa DH5-Alfa de E. Coli con la construcción de PGem-T easy y alfa-tubulina donde se puede observar que en el carril 4 y 8 no hay presencia de contaminantes, posiblemente se trata de DNA genómico, esto no ocurre así en los carriles 2 y 6 donde a la altura de los marcajes de peso molecular cercanos a los 10.000 pb. Se aprecia una línea tenue que evidencia la presencia de contaminación por DNA genómico.

Como se había mencionado anteriormente los carriles 2, 4, 6 y 8 presentan contaminación en sus pocillos al igual que la mayoría de las cargas en el gel lo que se podría atribuir a deficiencias en la manipulación por parte del personal que efectuó el procedimiento, podría deberse también a contaminación por mala ejecución del protocolo de extracción del material genético.

Los carriles cargados con DNA plasmidial tienen una alta concentración de material alrededor de los 200 a 250 pb. lo que indica que el material genético fue degradado, se determina la posibilidad de esta por la ausencia de material genético en los rangos de 3000 a 3500 pb.

Las muestras realizadas por el grupo 4, presentan claros signos de contaminación, no se distinguen las bandas de extracción, presentan una clara línea blanca en el fondo propia de una degradación del material genético, pero en el centro de la barra de corrido hay otras líneas que indican signos de contaminación por fenoles lo que indica un error de procedimiento o una mala aplicación de los reactivos.

En cambio los carriles que presenta demasiada fluorescencia, puede deberse a una contaminación por proteínas, o simplemente por la mala aplicación de algún reactivo u error de procedimiento.

Muestra 1 128mg/µl Muestra2 170mg/µl

260/280 1,71 260/280 1,89

230/260 0,64 230/260 0,92

260/320 0,033 260/320 0,060

Conclusiones

Luego de terminado el práctico se puede concluir lo siguiente:

Es posible la extracción de ácidos nucleicos de células vegetales a través del método de Chomczynski, el cual nos detalla todos los pasos y reactivos a utilizar.

Los ácidos nucleicos no son solubles en cloroformo, por lo que este puede ser utilizado para desintegrar las proteínas y lípidos que acompañan al DNA para que este quede libre de contaminación.

El etanol absoluto deshidrata el ADN, asiéndolo visible como pequeñas fibras de algodón que al dejarlo reposar comienzan a sedimentar, en cambio el alcohol de 95% tiene como objetivo lavar el pellet y eliminar las sales.

El gel de agarosa nos permite separar las moléculas de acuerdo a su peso molecular, tras ser sometidas a un campo eléctrico, debido a la porosidad del gel, es por ello que si tenemos moléculas de gran tamaño debemos utilizar bajas concentraciones de agarosa.

Las moléculas de ácidos nucleicos tras ser sometidas a un campo eléctrico son separadas por carga; las positivas migran al polo negativo y las cargas negativas migran hacia el polo positivo.

Para realizar la extracción de DNA plasmidial es necesario realizar lisis alcalina. Este método explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico y el DNA cromosómico. La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico (SDS), provoca la lisis de la pared celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. Los plásmidos se ven menos afectados por su pequeño tamaño y estructura superenrollada. La aplicación de fenol y cloroformo provoca la precipitación de las proteínas. Los agregados insolubles de proteínas y DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa.

La utilización del RNAsa o ribonucleasa se realizó para no tener presencia de ARN, ya que esta enzima degrada el ARN en componentes más pequeños.

En el caso del ARN es mucho más complicado que en el ADN realizar el protocolo de extracción, ya que siempre hay que mantener la muestra en frio para evitar la degradación de este, en este caso la lisis celular se realiza con un detergente acido y se sigue el mismo procedimiento que para DNA.

Referencias

1. Luisa I. Falcón y Aldo Valera Extracción de ácidos nucleicos Las herramientas Moleculares.

2. Luque José Herráez Ángel Biología Molecular e Ingeniería Genética tema 13 año 2000.

3. J. Clàriaa, M. Sánchezb y R. Queraltc Herramientas básicas de análisis genético.

4. M. Somma Análisis de la Presencia de Organismos Genéticamente Modificados en Muestras de Alimentos Sesión nº 4 Extracción y Purificación de ADN

5. Gene X-Press 19 de junio de 2009

6. Prácticas Biología Molecular, Técnicas básicas en el laboratorio de biología Molecular. Daniel Yero Corona, Yamilé López, Instituto Finlay.

7. Purificación de ADN plasmídico y electroforesis del mismo en gel de agarosa, José Luís Caballero Repullo, Enriqueta Moyano, Juan Muñoz Blanco, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.

8. Manual de procedimientos de electroforesis para proteínas y ADN, Blgo. Carlos Augusto Yábar Varas División de Biología Molecular Centro Nacional de Salud Pública Instituto Nacional de Salud, Lima-Perú

9. Purificación y análisis de DNA cromosómico bacteriano, Gabriel Dorado Pérez, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Univer

10. Technical Manual Promega Corporation, Madison, WI., The pGEM(R)-T Easy Vector has been linearized with EcoRV at Base 60 of this sequence (indicated by an asterisk *) and a T added to both 3' -ends.

11. GENÉTICA MICROBIANA, Capítulo 4, MÉTODOS DE AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LOS ACIDOS NUCLEICOS, Lojo M.M.

Bibliografía

Normas de seguridad – laboratorio de química y física, universidad de Pablo de Olavide Normas de Seguridad en el Laboratorio - Anatomía patológica y citológica. Citopreparación. Seguridad. Riesgos de uso de sustancias químicas - Efectos tóxicos. Riesgo biológico.Anatomía patológica. Responsabilidad legal http://www.cienciafacil.com/paginanormas.html

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