Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de … · 2019-04-03 ·...

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Tesis Doctoral

Modulación de genes involucrados en laModulación de genes involucrados en lapluripotencia bovina: desarrollo de unapluripotencia bovina: desarrollo de una

plataforma biotecnológica para laplataforma biotecnológica para laobtención y cultivo de célulasobtención y cultivo de células

pluripotentespluripotentes

Canizo, Jesica Romina

2017

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Canizo, Jesica Romina. (2017). Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina:desarrollo de una plataforma biotecnológica para la obtención y cultivo de célulaspluripotentes. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6244_CanizoCita tipo Chicago:

Canizo, Jesica Romina. "Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina:desarrollo de una plataforma biotecnológica para la obtención y cultivo de célulaspluripotentes". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2017.http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6244_Canizo

http://digital.bl.fcen.uba.ar

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http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6244_Canizo

http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n6244_Canizo

mailto:[email protected]

UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales

Departamento de Química Biológica

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para la

obtención y cultivo de células pluripotentes

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica

Msc. Ing. Química Jesica Romina Canizo

Directores de tesis: Dr. Ramiro Alberio Dr. Dante Agustín Paz

Consejero de Estudios: Dr. Mario Galigniana

Lugar de trabajo: IQUIBICEN, CONICET-UBA

Buenos Aires, 2017

Fecha de defensa: 30 de Marzo de 2017

“Somos el puente hacia el infinito, arqueado sobre el mar, buscando

aventuras para nuestro placer, viviendo misterios, eligiendo desastres,

triunfos, desafíos, apuestas imposibles, sometiéndonos a prueba una y otra

vez aprendiendo el amor.”

Richard Bach

http://akifrases.com/frase/197961




4

AGRADECIMIENTOS

Escribo estas palabras habiendo concluido la escritura de este manuscrito. Este manifiesto de resultados acumulados

durante toda mi experiencia doctoral no hubiera sido posible sin la ayuda de muchas de las personas que aquí nombro en orden

cronológico, es decir de acuerdo a cómo fueron apareciendo con sus consejos, ayudas de todo tipo, enseñanzas o solo prestando su

tiempo para hacerme el apoyo moral que siempre se necesita en desafíos personales de esta envergadura. Definitivamente la Jesica

que entró al doctorado y la que sale, ahora después de más de 5 años, no son la misma persona. Hubo tantos obstáculos, tantas

pruebas que superar, y tantos aprendizajes que me llevo más que un título de doctora. A todo eso, le sumo los amigos que hice en esta

etapa, las personas que no siendo amigas conocí, y los lugares, culturas, costumbres y experiencias por las que pasé durante este largo

y sinuoso camino.

De mis comienzos como becaria de INTA agradezco al Dr. Ricardo Alberio quien fuera mi primer director de beca y

responsable de que yo empezara este camino al seleccionarme como nueva integrante del Grupo de Biotecnología de la

Reproducción. Allí conocí a Glenda Rios y Jorgelina Buschiazzo, entre otras tantas personas. A ellas agradezco las primeras

enseñanzas que me adentraron en el mundo de la biología del desarrollo. Viviendo en Balcarce me hice de mi familia balcarceña:

Irene, Edu y Tití quienes estuvieron conmigo en los momentos más difíciles de mi doctorado, cuando parecía que no había un rumbo

claro y quería tirar todo por la borda. También Amelia, mi amiga de sus 90 y tantos años que me sorprendió con su mente abierta y ni

hablar de Laura Macor, la cordobesa que me topé en la calle de casualidad y que luego me tendió una mano amiga en aquellos

tiempos que parecían inhóspitos conmigo, pero que de lejos veo fueron necesarios para llevar a cabo mi aprendizaje personal dentro

de esta experiencia laboral.

En un curso de células madre en México conocí a Carlos Luzzani, gracias a él decidí inscribirme en el doctorado de

Química Biológica de la UBA y conocí a Ale Guberman y su grupo de trabajo en la FCEN. El universo siempre equilibra, y la buena

onda de este grupo es la primer prueba de ello en mi doctorado. Primero me topé con la calidez y predisposición para ayudarme de

Claudia Solari (mi primera guía en reprogramación), Ariel Waisman y Soledad Cosentino (tandas de transducciones compartidas,

horas extras de fines de semana alternadas para ocuparnos de los sobrenadantes lentivirales); luego la de Victoria Petrone, Marcos

Francia y Camila Vazquez Echegaray. No me olvido de Noe Losino quien me brindó una amistad que ha trascendido más allá de

sus enseñanzas en cultivos de células BGC y stem, comenzando en el labo y continuando luego con sus consejos, apoyo y horas de

Mc Donalds, y Green eat entre charlas y comida. El mate, las risas, el gajito de mandarina después del almuerzo que Ale compartía

con cada uno, y el “uno para todos y todos para uno” que parece ser el lema tácito de ese grupo que tuve la suerte de conocer. LES

AGRADEZCO POR TODO ESO, por recibirme y hacerme parte de su grupo y por hacerme el aguante muchas, muchas veces…

especialmente Cami en este último tiempo.

En mi recorrido de Balcarce a Mar del Plata conocí a Haly, mi compa que hizo de mi casa un hogar, haciéndome sentir

que mis días en solitario terminaban. Poco nos duró igual la convivencia porque a los meses me tuve que mudar a Buenos Aires, de

manera permanente. Las primeras y últimas en hacerme el aguante en la big city fueron Carla Filippi y Gise Villarroel. Qué decir!

GRACIAS GRACIAS GRACIAS es poco para todo lo que les debo por ser tan generosas conmigo al abrirme su hogar y brindarme

todo tipo de apoyo. Para mi se convirtieron en mi familia por adopción. En Buenos Aires tuve la suerte de poder ver crecer en sus

primeros añitos a Guada y Mía, las mellis de Gise que muchas veces alegraron mi día al recibirme con un abrazo y la emoción

5

espontánea propia de los niños marcada en sus sonrisas de oreja a oreja. Agradezco también a mi prima Laura Canizo, con quien

compartí su hogar un año entero allí en la ciudad de la furia.

Cuando parecía que todo se complicaba en mi doctorado, por diversas circunstancias mas bien de índole administrativo,

me dieron su apoyo para continuar Dante Paz y Juan Aller, quienes se convirtieron en mi nuevo director de tesis y mi nuevo director

de beca de INTA. Gracias porque sin su ayuda no hubiese podido seguir. Y en lo experimental también había un vacío, y la ayuda

vino de mano de Daniel Salamone y su grupo de becarias. Primero Ines Hiriart, luego Eugenia Ynsaurralde y Mariana Suvá.

GRACIAS, GRACIAS, GRACIAS! Por su fuerza laboral, sus consejos y acompañarme aún en las horas más alocadas para hacer

FIVs y embriones. Fines de semana, o tarde en la noche. Su colaboración también ha sido muy valiosa para mi. Al mismo tiempo,

cuando todo se pone a tu favor para que sigas adelante, apareció la ayuda económica. Debo agradecer entonces a Naty de la UAFI

por su predisposición para resolver todas mis dudas administrando el PICT. Y desde el lado de INTA, a Estela Colavita quien

también me diese un apoyo importante en todo lo referente a mi beca y ya al final a Alba Ledesma quien me facilitó una ayuda

importante para conseguir unos reactivos que necesitaba con urgencia para concluir mi tesis.

De Bs As a Nottingham, una de las experiencias más enriquecedoras del doctorado. Allí me sentí muy cómoda trabajando,

aun a pesar de mi inglés precario, y mi forma poca fluida de comunicarme. Agradezco de todo corazón, a Ramiro Alberio, director

de mi tesis y a cada uno de los integrantes de su grupo (Doris, Haixin, Adam). Sentí finalmente en toda esta experiencia que hablaba

el mismo lenguaje en lo técnico, las mismas dudas, las mismas preguntas y dificultades. Recibí una de las ayudas más importantes

para culminar esta tesis. GRACIAS, GRACIAS, GRACIAS! Y en esa experiencia también surgieron las amistades: Judith, Mamen,

Luisa el trio español conque recorrimos parte de Inglaterra, sumada a Vivian de México. Mis compas de residencia Toby y Nico

Galarce hicieron de esos días invernales de Inglaterra los más amenos y cálidos. Me la pasé tan bien jugando a las cartas, yendo a las

festividades típicas de allá, o solo charlando. Y lo más lindo, la visita de mi esposo Gustavo Funes y mi papá, Enrique Canizo.

Recorrer parte de Europa con ellos es una de las memorias más felices de mi estancia allá. Y mi viejo no solo me acompañó hasta

Europa, también lo hizo en cada lugar que recorrí. GRACIAS POR ACOMPAÑARME, PA!

Tengo que reconocer que, a diferencia de cómo imaginé que sería esto del doctorado, los hechos sucedieron de una forma

sin igual, pero siempre que iba a bajar las manos que fueron creo que 3 en total, todo el universo conspiraba para que pudiera seguir.

Y acá estoy, escribiendo esto….

INFINITAS GRACIAS A TODOS….

6

DEDICATORIA

En memoria de mi madre, quien partió en los comienzos de esta etapa y a quien extraño infinitamente. Me he perdido de

sus palabras de aliento en el doctorado, pero he tratado de imaginarla cada vez que alguna ocasión me inspiraba a bajar los brazos.

A mi bebé Alondra Aimé que es la cereza del postre en la culminación de este largo y sinuoso camino que me ha llevado

por Balcarce, Mar del Plata, Buenos Aires y Nottingham. La amo infinitamente.

Y a mi esposo Gustavo, con quien no tengo palabras de agradecimiento suficientes que expresen todo el apoyo que me ha

brindado a lo largo del doctorado. Un apoyo de varias dimensiones: emocional, financiera, y de infinita paciencia y amor. Espero

tener suficientes días para compensarle por tanto esfuerzo compartido.

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Índice

7

ÍNDICE

Agradecimientos ___________________________________________________________________________________________ 4

Dedicatoria _______________________________________________________________________________________________ 6

Índice ____________________________________________________________________________________________________ 7

Índice de tablas ___________________________________________________________________________________________ 13

Índice de Figuras _________________________________________________________________________________________ 16

Índice de Abreviaturas _____________________________________________________________________________________ 23

Resumen ________________________________________________________________________________________________ 26

Abstract _________________________________________________________________________________________________ 28

Introducción general_______________________________________________________________________________________ 30

1. Transgénesis animal ______________________________________________________________________________ 30

1.1. Qué es y para qué sirve. _______________________________________________________________________ 30

1.2. Metodologías y sus limitantes. __________________________________________________________________ 33

2. Otros potenciales usos de las células pluripotentes de animales de granja __________________________________ 35

3. Células madre ___________________________________________________________________________________ 35

3.1. Definición __________________________________________________________________________________ 35

3.2. Tipos de células madre ________________________________________________________________________ 36

3.2.1. Según el origen ________________________________________________________________________ 37

3.2.2. Según el estado: naïve o primed ___________________________________________________________ 39

4. Células madre embrionarias _______________________________________________________________________ 43

4.1. Método de obtención en relación con los mecanismos que mantienen la pluripotencia ______________________ 43

4.1.1. Ratón y humano _______________________________________________________________________ 43

4.1.2. Animales de granja: el modelo bovino. _____________________________________________________ 48

4.2. Limitaciones en los protocolos de derivación ______________________________________________________ 48

5. iPSC ___________________________________________________________________________________________ 50

5.1. Qué son y cómo se obtienen ____________________________________________________________________ 50

5.2. Mecanismos y etapas de la reprogramación ________________________________________________________ 53

5.3. Limitantes en animales de granja ________________________________________________________________ 56

6. Hipótesis de trabajo ______________________________________________________________________________ 58

7. Objetivo general _________________________________________________________________________________ 58

8. Objetivos particulares _____________________________________________________________________________ 58


8

Producción in vitro de embriones: modulación de las vías de señalización en el establecimiento de la pluripotencia bovina. ___ 59

1. Marco Teórico ___________________________________________________________________________________ 59

1.1. Desarrollo embrionario temprano en mamíferos ____________________________________________________ 59

1.1.1. División celular en mamíferos ____________________________________________________________ 59

1.1.2. Diferencias en el desarrollo temprano de mamíferos ___________________________________________ 62

1.2. Mecanismos y factores de transcripción involucrados en el establecimiento de la pluripotencia _______________ 64

1.3. Planteamiento del problema y justificación ________________________________________________________ 68

2. Hipótesis ________________________________________________________________________________________ 69

3. Objetivos _______________________________________________________________________________________ 69

3.1. Objetivo General ____________________________________________________________________________ 69

3.2. Objetivos Particulares ________________________________________________________________________ 69

4. Materiales y Métodos _____________________________________________________________________________ 71

4.1. Producción in vitro de embriones: FIV corta _______________________________________________________ 71

4.1.1. Maduración ovocitaria __________________________________________________________________ 71

4.1.2. Fecundación in vitro ____________________________________________________________________ 71

4.1.3. Cultivo embrionario ____________________________________________________________________ 72

4.1.4. Composición de medios utilizados en producción embrionaria (FAUBA) __________________________ 73

MC-BGC (utilizado en la puesta a punto, ver anexo) ___________________________________________________ 73

Medio N2B27 (para cultivo embrionario sin suero) ____________________________________________________ 74

4.2. Aislamiento de ESC a partir de embriones tratados en N2B27 t2iGö h-LIF _______________________________ 75

4.2.1. Protocolo _____________________________________________________________________________ 75

4.2.2. Reactivos: ____________________________________________________________________________ 75

Medio N2B27 utilizado para el aislamiento de ESC ____________________________________________________ 75

4.3. . Producción in vitro de embriones: FIV larga ______________________________________________________ 76

4.3.1. Maduración ovocitaria __________________________________________________________________ 76

4.3.2. Fecundación in vitro ____________________________________________________________________ 76

4.3.3. Cultivo embrionario ____________________________________________________________________ 78

4.4. Extracción de RNA, síntesis de c-DNA y qPCR de pooles de embriones _________________________________ 78

4.4.1. Extracción con trizol ____________________________________________________________________ 78

Protocolo modificado para muestras con poco RNA ___________________________________________________ 79

4.4.2. Tratamiento de DNAsas _________________________________________________________________ 79

4.4.3. Síntesis de c-DNA ______________________________________________________________________ 80

4.4.4. PCR tiempo final _______________________________________________________________________ 80

4.4.5. qRT-PCR _____________________________________________________________________________ 81

4.5. Inmunofluorescencia de embriones ______________________________________________________________ 82

4.5.1. Protocolo _____________________________________________________________________________ 82


9

4.5.2. Análisis de imágenes de microscopía por Fiji (ImageJ) _________________________________________ 83

4.5.3. Soluciones ____________________________________________________________________________ 83

4.5.4. Reactivos _____________________________________________________________________________ 84

4.6. Inmunofluorescencia de células _________________________________________________________________ 84

4.7. Análisis estadístico ___________________________________________________________________________ 84

5. Resultados y Discusión ____________________________________________________________________________ 85

5.1. Producción in vitro de embriones bovinos, sin suero ________________________________________________ 85

5.2. Marcadores de epiblasto e hipoblasto ____________________________________________________________ 88

5.3. Dinámica de expresión de NANOG, SOX2 y SOX17 durante el desarrollo embrionario temprano de bovinos ___ 92

5.4. Modulación de las vías de señalización durante el desarrollo embrionario temprano ________________________ 94

5.4.1. Resultados en colaboración con el Grupo de Biotecnología de la Reproducción (FAUBA) _____________ 94

Producción embrionaria __________________________________________________________________________ 94

Efecto en el primer evento de segregación (formación de ICM y TE) ______________________________________ 95

Efecto en el segundo evento de segregación (formación del epiblasto y PE) _________________________________ 96

Aislamiento de ESC a partir de embriones tratados ____________________________________________________ 98

5.4.2. Resultados en colaboración con el Grupo de la Universidad de Nottingham (Reino Unido) ___________ 102

Producción embrionaria _________________________________________________________________________ 102

Efecto en el primer evento de segregación (formación de ICM y TE) _____________________________________ 103

Efecto en el segundo evento de segregación (formación del epiblasto y PE) ________________________________ 108

5.4.3. Modulación in vitro de las vías de señalización: MAPK/ERK y Wnt, en el embrión bovino ___________ 110

Resultados análisis de la producción embrionaria _____________________________________________________ 110

Resultados análisis de segregación de linajes embrionarios _____________________________________________ 111

5.4.4. Curva dosis respuesta de PD0325901 y su efecto en la producción y segregación de embriones bovinos _ 114

6. Discusión ______________________________________________________________________________________ 116

6.1. Efecto del medio t2iGöLIF en el desarrollo embrionario bovino ______________________________________ 116

6.2. Efecto de la inhibición de Wnt y ERK/MAPK en el desarrollo embrionario bovino _______________________ 118

6.3. Efecto de la concentración de PD0325901 en el desarrollo embrionario bovino __________________________ 119

7. Conclusiones ___________________________________________________________________________________ 121

8. Perspectivas ____________________________________________________________________________________ 123

Generación de células iPSC bovinas _________________________________________________________________________ 124

1. Marco Teórico __________________________________________________________________________________ 124

iPSC en bovinos: logros y limitaciones __________________________________________________________________ 124

2. Hipótesis _______________________________________________________________________________________ 126

3. Objetivos ______________________________________________________________________________________ 126


10

4. Materiales y Métodos ____________________________________________________________________________ 127

4.1. Preparación de BEF y cultivo primario __________________________________________________________ 127

4.1.1. Protocolo ____________________________________________________________________________ 127

4.1.2. Medios y reactivos utilizados ____________________________________________________________ 128

Medio BEF___________________________________________________________________________________ 128

4.2. Preparación de MEF y stock de MEF inactivadas mitóticamente ______________________________________ 129

4.2.1. Preparación de MEF ___________________________________________________________________ 129

4.2.2. Inactivación de MEFs __________________________________________________________________ 130

4.2.3. Congelamiento de células somáticas (MEF, PEF, BEF, 293T) __________________________________ 130

Protocolo ____________________________________________________________________________________ 130

Reactivos: medio de congelamiento _______________________________________________________________ 131

4.2.4. Plaqueo de MEF inactivadas mitóticamente _________________________________________________ 131

4.3. Reprogramación con vectores episomales ________________________________________________________ 131

4.3.1. Protocolo de una transfección ____________________________________________________________ 132

4.3.2. Protocolo de transfecciones seriadas_______________________________________________________ 133

4.4. Protocolo de reprogramación con lentivirus ______________________________________________________ 134

4.4.1. Protocolo de preparación del plásmido STEMCCA ___________________________________________ 134

4.4.2. Cultivo de 293T (HEK)_________________________________________________________________ 134

4.4.3. Protocolo de preparación de partículas lentivirales ___________________________________________ 135

4.4.4. Reprogramación medio FGF+ MEF + KSR _________________________________________________ 135

Protocolo de reprogramación de BEF y PEF _________________________________________________________ 135

4.4.5. __________________________________________________________________________________________ 136

Caracterización de colonias: Extracción de RNA y RT-PCR ____________________________________________ 136

Caracterización de colonias: Fosfatasa Alcalina ______________________________________________________ 138

4.4.6. Reprogramación en medio SB43 _________________________________________________________ 138

Composición de medio SB43 ____________________________________________________________________ 139

Pasaje de células semejantes a células pluripotentes inducidas ___________________________________________ 139

Congelamiento de colonias semejantes a iPSC _______________________________________________________ 139

Caracterización de colonias: detección del casete h-STEMMCA en células reprogramadas ____________________ 140

Extracción de DNA genómico _________________________________________________________________ 140

PCR tiempo final ___________________________________________________________________________ 140

Caracterización de colonias semejantes a iPSC: Inmunofluorescencia de células ____________________________ 141

Caracterización de colonias: RT-PCR ______________________________________________________________ 142

5. Resultados y Discusión ___________________________________________________________________________ 143

5.1. Reprogramación con vectores episomales ________________________________________________________ 143

5.2. Reprogramación con STEMCCA en medio FGF+ MEF + KSR _______________________________________ 146

5.3. Reprogramación con STEMCCA y medio SB43 ___________________________________________________ 153


11

5.3.1. Reprogramación de PEF ________________________________________________________________ 153

Establecimiento de colonias y pasajes ______________________________________________________________ 153

Caracterización de colonias ______________________________________________________________________ 157

Detección del casete h-STEMCCA en colonias p-IPSC like __________________________________________ 157

Inmunofluorescencia de genes de pluripotencia ___________________________________________________ 158

Inmunofluorescencia de marcadores de membrana _________________________________________________ 160

Fosfatasa alcalina ___________________________________________________________________________ 162

Expresión de genes de pluripotencia y control de inhibición del mecanismo TGFβ _______________________ 163

Detección de la expresión del casete STEMCCA en pasajes tardíos ____________________________________ 165

5.3.2. Reprogramación de BEF ________________________________________________________________ 166

Establecimiento y pasajes _______________________________________________________________________ 166

6. Conclusiones ___________________________________________________________________________________ 169

7. Perspectivas ____________________________________________________________________________________ 170

Anexo __________________________________________________________________________________________________ 171

1. Puesta a punto de RT-qPCR ______________________________________________________________________ 171

2. Puesta a punto de Anticuerpos para IF ______________________________________________________________ 172

3. Alineamiento de secuencias de aminoácidos de LIF ratón, humano y bovino ______________________________ 173

4. Transfección de fibroblastos bovinos con episomas: puesta a punto ______________________________________ 175

5. Reactivos y medios utilizados en el capítulo 1 ________________________________________________________ 177

5.1. Composición de medios utilizados en producción embrionaria (FAUBA) _______________________________ 177

5.1.1. Hialuronidasa ________________________________________________________________________ 177

5.1.2. TALP-H ____________________________________________________________________________ 177

5.1.3. Medio de maduración __________________________________________________________________ 177

5.1.4. Medio de fecundación __________________________________________________________________ 178

5.1.5. Medio de cultivo embrionario ____________________________________________________________ 178

5.1.6. TCM HEPES (utilizado en la puesta a punto, ver anexo punto 1) ________________________________ 179

5.1.7. H-SOF 1 % PVA (utilizado en la puesta a punto, ver anexo punto 1) _____________________________ 179

5.2. Composición de medios utilizados en producción embrionaria (Nottingham) ____________________________ 180

5.2.1. Medio de lavado ______________________________________________________________________ 180

5.2.2. Medio de maduración __________________________________________________________________ 180

5.2.3. Medio de fecundación __________________________________________________________________ 180

5.2.4. Medio de cultivo embrionario ____________________________________________________________ 181

5.2.5. Medio de cultivo embrionario día 5 a 8 ____________________________________________________ 182

6. Protocolos generales de bilogía molecular utilizados en el capítulo 2 _____________________________________ 182


12

6.1. Resuspención del plásmido ___________________________________________________________________ 182

6.2. Preparación de bacterias ultracompetentes _______________________________________________________ 183

6.2.1. Protocolo ____________________________________________________________________________ 183

6.2.2. Soluciones: Medio SOB ________________________________________________________________ 183

6.2.3. PIPES 0.5 M pH 6.7 ___________________________________________________________________ 184

6.2.4. Buffer Inoue _________________________________________________________________________ 184

6.3. Transformación de E. coli ____________________________________________________________________ 184

6.4. Purificación del plásmido (miniprep) ____________________________________________________________ 185

6.5. Purificación de DNA plasmídico (midi prep) _____________________________________________________ 185

6.6. Soluciones ________________________________________________________________________________ 186

6.6.1. Medio LB ___________________________________________________________________________ 186

6.6.2. Soluciones de miniprep _________________________________________________________________ 186

6.7. Control de identidad del plásmido por digestión enzimática __________________________________________ 186

6.8. Extracción de DNA genómico _________________________________________________________________ 187

Referencias _____________________________________________________________________________________________ 189


13

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1: Comparación de las características principales entre los sistemas de producción de proteínas recombinantes, PR (6) _____ 31

Tabla 2: Comparación de los costos de producción de PR producidas en cultivo de células animales (CHO) versus animales

transgénicos (6) ______________________________________________________________________________________ 32

Tabla 3: Comparación de sistemas de producción de leche transgénica en diferentes especies (9) ___________________________ 32

Tabla 4: Ejemplos de expresión de PRs humanas en la leche de animales transgénicos (4) _________________________________ 33

Tabla 5: Evaluación de las metodologías de transferencia de genes (12) _______________________________________________ 33

Tabla 6: Clasificación de células según su capacidad de diferenciación ________________________________________________ 37

Tabla 7: Fuente de células madre y tipos celulares obtenidos experimentalmente ________________________________________ 37

Tabla 8: Expresión génica en embriones pre-implantatorios (32) _____________________________________________________ 39

Tabla 9: Características de células de ratón naïve (N) y primed (P): medios de cultivos en los que se presentan (32). ____________ 41

Tabla 10: Características de células naïve (N) y primed (P) humanas: medios de cultivos y condiciones en los que se presentan. __ 42

Tabla 11: Similitud (%) de las secuencias de aminoácidos de OKSM y NANOG de diferentes especies comparadas con humano/ratón

(25) _______________________________________________________________________________________________ 52

Tabla 12: Eficiencia de generación de h-iPSC a partir de fibroblastos de piel en humanos, revisado en (49) ___________________ 53

Tabla 13: Cambios de expresión génica y epigenética ocurridos durante el proceso de reprogramación. Los genes en verde

incrementan su expresión y los de color rojo la disminuyen. Las marcas epigenéticas en verde están asociadas a loci activos

mientras que los de rojo están relacionados a reprimidos. Las flechas arriba y abajo indican incremento o disminución. (30) 54

Tabla 14: Ejemplos de estudios recientes publicados en la generación de iPSC de animales domésticos (26) __________________ 57

Tabla 15: Estructura general de embriones bovinos protruidos (59) ___________________________________________________ 64

Tabla 16: Medio base para acondicionar por cultivo de BGC ________________________________________________________ 73

Tabla 17: Medio de crecimiento de células BGC-1 (medio BGC) ____________________________________________________ 73

Tabla 18: Composición de medio N2B27 (para embriones) _________________________________________________________ 74

Tabla 19: Medio N2B27 para cultivo de ESC (adaptado de Boroviak et al., 2015) _______________________________________ 75

Tabla 20: Gradiente de Bovipure para lavado de semen ____________________________________________________________ 77

Tabla 21: Mezcla inicial para síntesis de c-DNA _________________________________________________________________ 80

Tabla 22: Master mix para síntesis de c-DNA ____________________________________________________________________ 80

Tabla 23: Master mix para muestras de PCR tiempo final __________________________________________________________ 80

Tabla 24: Ciclo de PCR tiempo final (programa para el termociclador) ________________________________________________ 81

Tabla 25: Secuencia de primers utilizados en bovinos (5’ a 3’) ______________________________________________________ 81

Tabla 26: Ciclo de PCR cuantitativa (qRT-PCR) _________________________________________________________________ 82

Tabla 27: Producción in vitro de embriones bovinos en condiciones libre de suero. ______________________________________ 86

Tabla 28: Producción in vitro de embriones bovinos de día 8 en condiciones libre de suero. _______________________________ 86

Tabla 29: Cuantificación de células marcadas con genes relacionados a la pluripotencia (SOX2 y NANOG) y a la diferenciación a PE

(GATA6, SOX17 y GATA4); y su porcentaje de co-localización celular en embriones bovinos de día 8 producidos por FIV y

cultivados en BBH7. __________________________________________________________________________________ 92


14

Tabla 30: Producción in vitro de embriones bovinos en medio N2B27 t2iGö CHO LIF. __________________________________ 95

Tabla 31: Producción de embriones bovinos de día 8 en medio N2B27 t2iGö CHO LIF. __________________________________ 95

Tabla 32: Efecto en el número de células totales (N), del trofoectodermo (TE) y macizo celular interno (ICM) de embriones bovinos

de día 8 producidos por FIV en SOF con 2.5 % de SFB y cultivados desde el día 5 en medio N2B27 (control y tratamientos).

__________________________________________________________________________________________________ 96

Tabla 33: Efecto en el número de células NANOG positivas (NANOG) y SOX17 positivas (SOX17) en embriones bovinos de día 8

producidos por FIV en SOF con 2.5 % de SFB y cultivados a partir del día 5 en medio N2B27 (control y tratamientos). ___ 97

Tabla 34: Análisis de proporciones, NANOG/ICM y SOX17/ICM (expresado en %). ____________________________________ 98

Tabla 35: Número de ICM adheridos en well de placa 4 well con m-MEF. _____________________________________________ 99

Tabla 36: Efecto del medio t2iGö h-LIF en la producción embrionaria. * día 8 y 9. _____________________________________ 103

Tabla 37: Efecto del medio IWP2 + PD032+ en la producción embrionaria. * día 8. ____________________________________ 110

Tabla 38: Análisis estadístico del efecto de la modulación de MAPK/ERK y Wnt en el primer y segundo evento de diferenciación.111

Tabla 39: Efecto de la concentración de PD032 en la producción embrionaria. * día 8. __________________________________ 114

Tabla 40: Análisis estadístico del número de células totales (DAPI), ICM, TE, NANOG+ y SOX17+ de embriones tratados con

diferentes concentraciones de PD0325901. _______________________________________________________________ 114

Tabla 41: Resumen de iPSC generadas en bovinos (103) __________________________________________________________ 124

Tabla 42: Composición de medio para fibroblastos (BEF, MEF, PEF) _______________________________________________ 128

Tabla 43: Composición del medio de reprogramación, basado en Beers et al., 2012 (111).________________________________ 132

Tabla 44: Mezcla de transfección de células 293T para la producción de partículas lentivirales h-STEMCCA y EOS. __________ 135

Tabla 45: Esquema de transducción de fibroblastos porcinos (rojo) y bovinos (verde) ___________________________________ 136

Tabla 46: Mezcla de reacción para síntesis de c-DNA. ____________________________________________________________ 136

Tabla 47: Mezcla de reacción de PCR para detección de genes de pluripotencia y diferenciación __________________________ 137

Tabla 48: Secuencia de primers para RT-PCR utilizados en la caracterización de células porcinas. _________________________ 137

Tabla 49: Protocolo de PCR para genes porcinos ________________________________________________________________ 138

Tabla 50: Composición medio stem SB43 (112) _________________________________________________________________ 139

Tabla 51: Mezcla de reacción para PCR de detección STEMCCA en gDNA __________________________________________ 140

Tabla 52: Secuencia de primers para detección en gDNA del casete STEMCCA _______________________________________ 141

Tabla 53: Programa INTEGRA para detección de STEMCCA en gDNA _____________________________________________ 141

Tabla 54: Dilución de anticuerpos primarios y secundarios utilizados en IF de células. __________________________________ 142

Tabla 55: Condiciones de transfección de BEF __________________________________________________________________ 175

Tabla 56: Composición de TALPH, medio de mesada. ____________________________________________________________ 177

Tabla 57: Medio de maduración utilizado en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la FAUBA _______________________ 177

Tabla 58: Medio BO para fecundación in vitro (66) ______________________________________________________________ 178

Tabla 59: Composición medio SOF citrato para cultivo e embriones bovinos __________________________________________ 178

Tabla 60: Composición de medio de mesada, TCM HEPES ________________________________________________________ 179

Tabla 61: Composición de HSOF como medio de mesada _________________________________________________________ 179

Tabla 62: Composición de soluciones para FIV _________________________________________________________________ 181


15

Tabla 63: Composición medio de cultivo embrionario ____________________________________________________________ 181

Tabla 64: Buffer TE _______________________________________________________________________________________ 182

Tabla 65: Composición medio SOB __________________________________________________________________________ 183

Tabla 66: Solución PIPES para Buffer Inoue ___________________________________________________________________ 184

Tabla 67: Buffer Inoue para ultracompetentes ___________________________________________________________________ 184

Tabla 68: Composición medio LB ____________________________________________________________________________ 186

Tabla 69: Soluciones para miniprep __________________________________________________________________________ 186

Tabla 70: Mezcla de reacción enzimática del vector STEMCCA ____________________________________________________ 187


16

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1: Los métodos de transferencia de ácidos nucleicos ex vivo requieren la manipulación in vitro de embriones o gametos y

posterior transferencia a madres receptoras. (a) Inyección pronuclear, (b) transducción con vectores virales (c) electroporación

de embriones, (d) transfección con liposomas, (e) inyección en la cavidad blastocélica o citoplasmática del cigoto, (f)

transferencia mediada por espermatozoides co incubados con material genético e (g) ICSI de espermatozoides co incubados

con material genético. La tecnología de edición del genoma (ZFN, TALENs y CRISPR) puede apoyarse en estas tecnologías

para transferir los vectores de las endonucleasas necesarias.(13)________________________________________________ 34

Figura 2: Fuentes de células pluripotentes. Las PSCs se derivan de diferentes tipos celulares in vivo. (a) ECC son células de

carcinoma derivadas de teratocarcinomas, es decir tumores germinales; (b) las ESC células derivadas del ICM de un embrión

preimplantatorio; (c) EpiSC y las rsPSC (células madre pluripotentes derivadas de una región selectiva) son células derivadas

de embriones posimplantatorios en ratón; (d) las EGC (células germinales embrionarias) son derivadas de células germinales

primordiales en humano y ratón (PGCs); por último (e) las GSC llamadas células madre germinales son las derivadas de las

células madre espermatogénicas de ratones recién nacidos y testículos adultos. (30) ________________________________ 36

Figura 3: Interconversión de los distintos tipos de células madre derivadas del blastocisto de ratón (29) ______________________ 38

Figura 4: El estado pluripotente es metaestable (31) _______________________________________________________________ 38

Figura 5: PSC en embriones en desarrollo y sus mecanismos de señalización. En naranja se presenta el estado naïve y en celeste el

primed. En rosado se definen las diferencias entre especies (32) ________________________________________________ 40

Figura 6: Línea del tiempo en el que se muestran los principales descubrimientos relacionados con las ESC (35). ______________ 43

Figura 7:Principales rutas metabólicas relacionadas a la pluripotencia en las m-ESC (35). _________________________________ 44

Figura 8: Mecanismos activados por LIF en células pluripotentes de ratón (37). _________________________________________ 45

Figura 9: Crosstalk entre mecanismos implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de h-ESC (38,39) __________________ 46

Figura 10: Señales extrínsecas que afectan la auto-replicación de las h-ESC (29). _______________________________________ 47

Figura 11: Número de publicaciones que describen el establecimiento de células pluripotentes en animales domésticos desde el año

2006 a la actualidad. El número de publicaciones de ESC se indica en naranja mientras que las correspondientes a iPSC se

encuentran en azul (26). _______________________________________________________________________________ 51

Figura 12: Métodos de generación de iPSC (48) __________________________________________________________________ 53

Figura 13: Fases de la reprogramación. Cinética de la aparición de marcas relacionadas a la pluripotencia (30) ________________ 54

Figura 14: División celular in vitro de un embrión de ratón. A: 2 células. B: 4 células. C: 8 células. D: 8 células compactas. E: mórula.

F: blastocisto. (fotografías de J. G. Mulnard.) ______________________________________________________________ 60

Figura 15: Diagrama esquemático del desarrollo temprano en ratones (55) _____________________________________________ 60

Figura 16: Implantación de blastocistos de mamíferos en el útero. A: Blastocistos de ratón ingresan al útero. B: implantación inicial

de blastocistos de mono. _______________________________________________________________________________ 61

Figura 17: Diagrama esquemático de la derivación de tejidos en embriones de humanos y monos (56). ______________________ 62

Figura 18: Desarrollo embrionario pre-implantatorio en ratón. E se refiere al número de días después de la fecundación que se toma

como E0.0 (58) ______________________________________________________________________________________ 63

Figura 19: Expresión Génica en el desarrollo embrionario temprano de ratón (60) _______________________________________ 65


17

Figura 20: Expresión de genes relacionados a diferentes mecanismos de señalización durante el desarrollo embrionario de ratón (60)

__________________________________________________________________________________________________ 66

Figura 21: Origen de la heterogeneidad celular del ICM. (58) _______________________________________________________ 67

Figura 22: Captura directa de colonias ESC de ratón en un estado transcripcional cercano al epiblasto E4.5 (60) _______________ 68

Figura 23: Análisis del nivel de expresión de genes relacionados a la pluripotencia y diferenciación en blastocistos de día 7

producidos in vitro en condiciones libre de suero. Se comparó diferentes medios utilizados para cultivar m-ESC y el medio

SOF con BSA, al cual se relativizaron los distintos tratamientos (2 réplicas, N=26 por grupo). Los resultados se muestran

como la media ± SEM de dos experimentos independientes. ___________________________________________________ 87

Figura 24: Embriones bovinos de día 7 cultivados en SOF sin suero (control) y N2B27 (tratamiento). Los macizos celulares de los

embriones producidos en N2B27 parecen de mayor tamaño, es decir que cuentan con mayor número de células que aquellos

obtenidos en medio SOF sin suero. Las imágenes de IF demuestran que los blastocistos cultivados en N2B27 tiene mayor

número de células Nanog y Sox17 positivas que los cultivados en SOF 0.8 % BSA. ________________________________ 88

Figura 25: Inmunofluorescencia de embriones bovinos de día 8 producidos por FIV y cultivados en BBH7. Localización en el ICM de

SOX2 (53 ± 9 células) y NANOG (41 ±7 células), análisis de 2 tandas de FIV, 10 embriones; los valores entre paréntesis

representan el valor medio y el error estándar. 75 ±5 % de las células SOX2 positivas co-expresan NANOG (A-C). Los

perfiles de intensidad de fluorescencia de células seleccionadas muestran la co-expresión de ambas proteínas marcadas con

anticuerpo fluorescente (SOX2 en rojo y NANOG en verde, D y E). El porcentaje de co-localización fue analizado utilizando

la herramienta ROI manager en imageJ (las imágenes fueron tomadas en microscopio de epifluorescencia con una

magnificación del objetivo de 40x). ______________________________________________________________________ 89

Figura 26: Expresión de SOX2 y NANOG en células del ICM versus TE de embriones de día 8 cultivados en BBH7 (medio libre de

suero). SOX2 y NANOG se expresan diferencialmente en el ICM (n=3, N=15 y n=4, N=19 respectivamente). n es el número

de manipulaciones independientes, N el número total de embriones analizados, U.A. son las unidades arbitrarias de

fluorescencia por unidad de área. ________________________________________________________________________ 89

Figura 27: Inmunofluorescencia de embriones bovinos de día 8 producidos por FIV y cultivados en BBH7 demuestran que NANOG y

SOX17son mejores marcadores de epiblasto e hipoblasto respectivamente. Localización de SOX2 (47 ± 4 células) y GATA6

(43 ± 5 células), 91 % de células SOX2 positivas son GATA6 positivas (1 réplica, 5 embriones) (A-E). Localización de

NANOG (48 % del ICM) y SOX17 (50 % del ICM). La co-localización entre ambos marcadores es despreciable, 3 de 9

embriones (2 réplicas, 9 embriones) (F-J). Localización de NANOG y GATA4 en embriones de día 8 (K-M) y día 10 (N-Q).

El porcentaje de co-localización fue analizado utilizando la herramienta ROI manager en imageJ (las imágenes fueron tomadas

en microscopio de epifluorescencia con una magnificación del objetivo de 40x). __________________________________ 91

Figura 28: Dinámica de expresión de NANOG (verde) y SOX2 (rojo) en el desarrollo in vitro de embriones bovinos. DAPI es la

marca nuclear azul. ___________________________________________________________________________________ 93

Figura 29: Dinámica de expresión de NANOG y SOX17 en el desarrollo in vitro de embriones bovinos. _____________________ 94

Figura 30: Inmunofluorescencia de embriones bovinos producidos por FIV-CIV en SOF 2.5 % SFB hasta el día 5 y cultivados en

N2B27 DMSO, N2B27 CHO LIF y N2B27 t2iGö CHO LIF hasta día 8. El porcentaje de co-localización fue analizado

utilizando la herramienta ROI manager en imageJ (las imágenes fueron tomadas en microscopio de epifluorescencia con una

magnificación del objetivo de 40x). ______________________________________________________________________ 97


18

Figura 31: Embriones producidos por FIV y tratados a partir del día 5 con N2B27 t2iGö h-LIF hasta el día 8 cuyo ICM fue aislado

manualmente con agujas de tungsteno y puesto en co-cultivo con m-MEF para el establecimiento de ESC bovinas. Imágenes

de campo claro obtenidas de microscopio invertido, magnificación del objetivo 5X (A y C) y 10X (B). ________________ 99

Figura 32: ICM de embriones protruidos de 8 días en co-cultivo sobre m-MEF en medio N2B27 t2iGö h-LIF sin y con FGF. Las

imágenes fueron obtenidas en microscopio invertido, campo claro con una magnificación del objetivo de 10x (N2B27 t2iGö h-

LIF) y 5x (N2B27 t2iGö h-LIF FGF) a los 3 y 6 días de haber sido inciado el co-cultivo. Las placas se incubaron en estufa a

38.5 °C 5 % de CO2 y 5 % de O2. _______________________________________________________________________ 100

Figura 33: IF de ICM sobre m-MEF a los 7 días de cultivo (2 días despúés del primer repique). Las imágenes mostradas fueron

tomadas en microscopio invertido de fluorescencia, con una magnificación del objetivo de 20x y 10x (N2B27 t2iGö h-LIF sin

FGF y con FGF respectivamente) _______________________________________________________________________ 101

Figura 34: Efecto durante el primer evento de diferenciación del embrión, impacto en el tamaño del ICM versus TE: t2iGö h-LIF y

t2iGö no ejercen un efecto en la segregación, mientras que el agregado de h-LIF por si solo aumenta el número de células del

ICM a expensas del TE (comparado con el control de DMSO). Los gráficos A y B muestran la relación ICM:Nt y TE:Nt

respectivamente. Los C-E el número de células totales (Nt), del macizo (ICM) y del trofoectodermo (TE). Los datos fueron

analizados por un MLGM con distribución de Poisson (cuando se analizó el número de células por embrión) y binomial (al

analizar proporciones ICM:Nt y TE:Nt). El software utilizado fue el infostat acoplado a R. Las letras diferentes marcan

medias significativamente diferentes (p value < 0.05). ______________________________________________________ 106

Figura 35: Segundo evento de diferenciación en el embrión bovino: formación del epiblasto versus hipoblasto. t2iGö h-LIF ejerce un

efecto parcial en la segregación (aumenta Nanog y disminuye Sox17); mientras que el agregado de h-LIF aumenta Nanog,

Sox17 y la co-expresión en el ICM sin variar las relaciones entre ellos comparado con el control. Los gráficos A, B y C

muestran la relación Nanog:ICM, Sox17:ICM y co epxresión:ICM respectivamente. Los D-F el número de células Nanog,

Sox17 y Co-expresión por embrión. Los datos fueron analizados por un MLGM con distribución de Poisson (cuando se

analizó el número de células por embrión) y binomial (al analizar proporciones). Análisis llevado a cabo en infostat acoplado a

R. Las letras diferentes marcan medias significativamente diferentes (p value < 0.05)._____________________________ 107

Figura 36: Inmunofluorescencia de embriones de día 8, producidos por FIV, cultivados en BBH7 hasta día 5 y tratados en medio

N2B27 del día 5 al 8. Células NANOG positivas (verdes) versus SOX17 (rojas). Las células que co-expresan ambos

marcadores se muestran en color naranja. N2B27 DMSO (control, N=15); N2B27 t2iGö (N=10); N2B27 CHO LIF (N=9);

N2B27 h-LIF 1x (N=10); N2B27 t2iGö h-LIF (N=9). _______________________________________________________ 109

Figura 37: Efecto de la modulación de MAPK/ERK y Wnt en la expresión de NANOG y SOX17 en embriones bovinos protruidos

entre día 8 y 8.5. Los embriones se cultivaron en medio SOF 2.5 % SFB desde el estadio de cigoto a mórula de día 5 y luego

se asignaron al azar a gotas con medio N2B27 con DMSO o bajo diferentes tratamientos: inhibición de MAPK/ERK con

PD0325901 (PD032+, 10 µM), inhibición de Wnt con IWP2 (2.5 µM) y la combinación de ambos. Las muestras se fijaron a

día 8. Inmunofluorescencia de NANOG (verde), SOX17 (rojo) y DAPI (azul) en blastocistos producidos por FIV. N: número

de embriones analizados. Barra: 10 µm. __________________________________________________________________ 112

Figura 38: Gráfico de dispersión del número total de células (DAPI), ICM, TE y células NANOG y SOX17 positivas del control y los

tratamientos. El análisis estadístico demuestra que la inhibición de Wnt no afecta la expresión de NANOG y SOX17

comparado con el control. La inhibición de MEK con 10 µM de PD0325901 es el único tratamiento que bloquea la expresión


19

de SOX17 y posiblemente la diferenciación a PE. La combinación de inhibidores también decrece en la mitad el número de

células de NANOG comparado con el control y el grupo de IWP2. ____________________________________________ 113

Figura 39: Inmunofluorescencia de embriones tratados con inhibidor de MEK a diferentes concentraciones y su efecto sobre la

expresión de NANOG y SOX17 en embriones bovinos protruidos entre día 8 y 8.5 producidos por FIV. Los embriones fueron

cultivados hasta día 5 en SOF 2.5 % BSA y luego hasta día 8 en N2B27 con DMSO o a diferentes concentraciones de

PD0325901: 2.5, 5 y 10 µM. (A) Detección por inmunofluorescencia de NANOG (verde), SOX17 (rojo) y DAPI (azul). N=

número de embriones analizados. Barra: 10 µm____________________________________________________________ 115

Figura 40: Curva dosis respuesta del número total de células por embrión (DAPI), ICM, TE, NANOG+ y SOX17+ del control y

tratamientos. El tratamiento con 5 µM tiene el mayor impacto no solo en la segregación embrionaria por el bloqueo de SOX17

sino también por el incremento de células NANOG+ comparado con 2.5 y 10 µM y a un nivel comparable con el control. 116

Figura 41: Aislamiento de explantos para cultivo primario de BEF. A: Feto separado de los anexos maternos (trabajo llevado a cabo

en condiciones de no esterilidad), B: feto libre de amnios en campana de flujo laminar para extraer explantos; C: visualización

de sexo, en este caso se trata de una hembra y D: explantos extraídos, en PBS P/S antes del corte en pedacitos. _________ 127

Figura 42: Fibroblastos fetales bovinos emergiendo de explantos de piel de feto. A: Explanto con células emergiendo, 10 días de

cultivo en 5 % CO2 a 38.5° C y medio BEF. B: pasaje 3. (imágenes tomadas en microscopio invertido, campo claro,

magnificación de objetivo 20x). ________________________________________________________________________ 128

Figura 43: Cultivo primario de MEF (3 días en incubadora) ________________________________________________________ 129

Figura 44: Vectores episomales utilizados para la reprogramación (A); vector EBNA-1 (B). ______________________________ 132

Tabla 44: Mezcla de transfección de células 293T para la producción de partículas lentivirales h-STEMCCA y EOS. __________ 135

Tabla 45: Esquema de transducción de fibroblastos porcinos (rojo) y bovinos (verde) ___________________________________ 136

Tabla 46: Mezcla de reacción para síntesis de c-DNA. ____________________________________________________________ 136

Tabla 47: Mezcla de reacción de PCR para detección de genes de pluripotencia y diferenciación __________________________ 137

Tabla 48: Secuencia de primers para RT-PCR utilizados en la caracterización de células porcinas. _________________________ 137

Tabla 49: Protocolo de PCR para genes porcinos ________________________________________________________________ 138

Figura 47: Proceso simplificado de reprogramación de PEF en geltrex y medio SB43 ___________________________________ 138

Tabla 50: Composición medio stem SB43 (112) _________________________________________________________________ 139

Figura 48:Cassette de expresión de los factores de reprogramación de Yamanaka y amplicones detectados __________________ 140

Tabla 51: Mezcla de reacción para PCR de detección STEMCCA en gDNA __________________________________________ 140

Tabla 52: Secuencia de primers para detección en gDNA del casete STEMCCA _______________________________________ 141

Tabla 53: Programa INTEGRA para detección de STEMCCA en gDNA _____________________________________________ 141

Tabla 54: Dilución de anticuerpos primarios y secundarios utilizados en IF de células. __________________________________ 142

Figura 49: Fibroblastos fetales bovinos como control de la reprogramación con episomas. A: BEF P5 campo claro; B: expresión de

GFP en BEF transfectados con el episoma p27082 48 h posteriormente a la primera transfección y C: expresión de GFP en

BEF durante la puesta a punto en las mismas condiciones de ensayo, 48 h post-transfección. ________________________ 143

Figura 50: Fibroblastos bovinos y porcinos en reprogramación, A: BEF P7 (izquierda) y PEF P5 (derecha) después de 30 días

cultivados en geltrex con RPM2; B: MEF inactivados con mitomicina (izquierda) y MEF con BEF 24 h pos pasaje (derecha);


20

C: fibroblastos bovinos (izquierda) y porcinos (derecha) en reprogramación después de 30 días de cultivo en medio

DMEM/F12, 20 % KSR, FGF (20 ng/ml), 1 µM PD32 y 3 µM de CHIR. _______________________________________ 144

Figura 51: Cambios morfológicos en colonias obtenidas con alto MOI a 18 días de cultivo. A: células porcinas con signos de

apoptosis: B: células con estructuras que se asemejan a gotas lipídicas. _________________________________________ 147

Figura 52: Fibroblastos en proceso de reprogramación. A: BEF P3 (izquierda) y PEF P2 (derecha) al 4to día post- transducción antes

de plaquear sobre MEF, la foto corresponde a la menor densidad plaqueada, para la cantidad alta de partículas lentivirales. B:

día 10, células procedentes de la transducción con baja cantidad de partículas lentivirales plaqueadas sobre MEF. _______ 147

Figura 53: Colonias porcinas semejantes a iPSC cultivadas en DMEM/F12 con 20 % KSR y 20 ng/ml de FGF. A: colonias

emergiendo a los 10 días posteriores a las transducción (objetivo 5x); B: Colonia a los 13 días (objetivo 10x) y C: 18 días

posterior a la transducción (objetivo 5x). Las colonias pertenecen a la condición sin butirato de sodio y con nivel bajo de

partículas lentivirales. ________________________________________________________________________________ 148

Figura 54: Colonias porcinas semejantes a iPSC y con sectores con estructuras de apariencia extraembrionaria (24 días en cultivo). Se

observan estructuras globulares (flecha). Imágenes tomadas con lupa. __________________________________________ 148

Figura 55: Análisis cualitativo por RT-PCR de la expresión génica de fibroblastos parentales y colonias en cultivo a día 24. Los

productos de RT-PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5 %. Se analizaron los genes marcadores

de pluripotencia Oct4, Sox2, Klf4, Nanog y de diferenciación Cdx2, Aromatasa, Eomes, Sox17, Gata4, Ple-1, AFP y Esrrb. Se

muestran también los controles negativo (sin RT), y los positivos (TE para genes Cdx2, Aromatasa, Ple-1 y Esrrb; PE para

Sox17, Gata4 y Eomes; Epiblasto porcino para Oct4, Sox2, Nanog y Klf4; Hígado para AFP). ______________________ 149

Figura 56: Análisis de expresión por inmunofluorescencia de anticuerpos anti SOX2 (A), NANOG (B) y DAPI (C) de fibroblastos

porcinos (arriba) y una colonia de porcino de 24 días con características extraembrionarias (abajo). __________________ 149

Figura 57: El agregado de NaB en el proceso de reprogramación no afecta la morfología de las colonias porcinas obtenidas. Colonias

semejantes a iPSC porcinas de día 18, cultivadas en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de NaB y obtenidas de

fibroblastos porcinos transducidos con bajo nivel de partículas lentivirales. ______________________________________ 150

Figura 58: Fosfatasa alcalina en colonias semejantes a iPSC porcinas obtenidas 24 días posteriores a la transducción de los

fibroblastos con partículas lentivirales. Se muestra la condición de transducción media, cultivada en presencia o ausencia de

butirato de sodio. ____________________________________________________________________________________ 150

Figura 59: Morfología de las colonias semejantes a iPSC antes y después del pasaje. A: Bajo MOI, con NAB colonia 5 pasada el día

18 (arriba) y 7 después de cultivo (abajo). B: Bajo MOI y con NAB, colonia 3 C: Bajo MOI y sin NAB, colonia 15. _____ 151

Figura 60: La red de señales que mantienen la pluripotencia naïve (A) y primed (B). Hawkins et al., (2014). _________________ 152

Figura 61: Colonias porcinas emergiendo en well de placa de 6 con geltrex a los 5 días después del seeding (20.000 células) y en

medio SB43. Imágenes tomadas con objetivo 5x de microscopio invertido. ______________________________________ 153

Figura 62: Colonias obtenidas en placa de 10.000 células PEF a los días 5, 6 y 7 cultivadas en geltrex con medio SB43 (objetivo 5x).

_________________________________________________________________________________________________ 154

Figura 63: Colonia emergente p-iPSC-like de día 6 objetivo 5X (izquierda) y 10x (derecha). _____________________________ 154

Figura 64: Colonias p-iPSC-like en pasaje 1 (método manual). Las imágenes de la colonia adherida a geltrex 2d después del pasaje

(A) y 11 días después (B) demuestran que no crecieron sobre este sustrato. Imágenes tomadas con objetivo de magnificación

5X. Colonia en crecimiento sobre m-MEF (C y D). Imágenes tomadas con objetivo de magnificación 10X. ____________ 155


21

Figura 65:p-IPSC like en pasaje 1, enzimático, sobre placa con geltrex (I-B) o m-MEF (II a IV- B). Fotos tomadas con objetivo de

magnificación 5x. ___________________________________________________________________________________ 156

Figura 66: Colonias semejantes a p-iPSC-C pasaje 4 sobre m-MEF. A: 2d P4 (aumento 10x); B: 4d P4 (aumento 10x); C: 4d P4

(aumento 20x) ______________________________________________________________________________________ 157

Figura 67: Colonias semejantes a p-iPSC-J 2d P12 sobre m-MEF ___________________________________________________ 157

Figura 68: Detección de la inserción de STEMCCA en gDNA. A: Los productos de PCR se visualizaron mediante la electroforesis en

gel de agarosa 1 %. De izquierda a derecha: Marcador de PM 1kb (M), control positivo (C+): productos de la PCR de vector h-

STEMCCA, control negativo (C-): de gDNA de PEF, muestra: de gDNA de colonia J semejantes a iPSC porcinas en pasaje 5.

B: Gel de agarosa 1% para detección de GAPDH, de izquierda a derecha se muestran: M 1kb (5µl), control positivo (productos

de la PCR de c-DNA de muestra conocida), control negativo: de agua, muestra: de gDNA de colonia semejante a p-iPSC J P5.

_________________________________________________________________________________________________ 158

Figura 69: Caracterización de colonias semejantes a iPSC de porcino. Inmunofluorescencia de NANOG (verde) y SOX2 (rojo). Los

núcleos fueron detectados por la unión del DAPI (azul) a la cromatina. Muestra: colonia J semejante a p-iPSC P2 (aumento

100x). ____________________________________________________________________________________________ 159

Figura 70: Caracterización de colonias semejantes a iPSC de porcino. Inmunofluorescencia de NANOG (verde). Los núcleos fueron

detectados por la unión del DAPI (azul) a la cromatina. Se muestra también la co-localización entre el anticuerpo de NANOG

y DAPI. Muestra: colonia de iPSC-C P2 (aumento 40x y 100x, panel superior e inferior respectivamente). _____________ 159

Figura 71: Caracterización de los fibroblastos porcinos parentales (PEF P2). Detección por inmunofluorescencia de NANOG y SOX2

(aumento 40x). _____________________________________________________________________________________ 160

Figura 72: Caracterización de colonias semejantes a iPSC de porcino. Localización en la membrana del anticuerpo de SSEA-1,

rodeando a la marca nuclear del DAPI. Imágenes tomadas en microscopio de epifluorescencia. Muestra: colonia p-iPSC-C P4

(aumento de objetivo 100x). ___________________________________________________________________________ 160

Figura 73: Caracterización de colonias pluripotentes inducidas de porcino. Localización en la membrana del anticuerpo de SSEA-4,

rodeando a la marca nuclear del DAPI. Imágenes tomadas en microscopio de epifluorescencia. Muestra: colonia p-iPSC-J P5

(aumento de objetivo 20 x y 100x, en panel superior e inferior respectivamente). _________________________________ 161

Figura 74: Caracterización de colonias pluripotentes inducidas de porcino. Localización en la membrana del anticuerpo anti TRA-1-

81. Imágenes tomadas del microscopio de fluorescencia. Muestra: colonia iPSC-J P2 (aumento 100x). ________________ 161

Figura 75: Caracterización de fibroblastos fetales porcinos. Localización en la membrana del anticuerpo anti TRA-1-81 (arriba) y

SSEA-4 (abajo). Imágenes tomadas del microscopio de fluorescencia. Muestra: PEF5 P2 (aumento 40x). ______________ 162

Figura 76: Fosfatasa Alcalina. Colonias semejantes a p-iPSC-J P4 y P5 en medio SB43 (izquierda y derecha respectivamente) __ 162

Figura 77: Detección de nodal en células PEF5 P2 y colonias semejantes a iPSC porcinas en P2 y P4; detección de genes relacionados

a la pluripotencia (Klf4, Nanog y Oct4) en colonias de iPSC porcinas en pasajes 3 y 5. El control positivo corresponde a un

pool de embriones y el negativo al agua. Gel de agarosa de 2%. _______________________________________________ 164

Figura 79: Colonias semejantes a iPSC bovinas emergiendo en placa MW6 con2500 BEF plaqueadas sobre geltrex ___________ 166

Figura 80: Colonia con morfología semejante a stem, iPSC-1 derivada de BEF5 P5 en placa de 5000 células sobre geltrex. (aumento

5x) _______________________________________________________________________________________________ 167


22

Figura 81: Colonia 8 semejante a iPSC bovina antes (panel superior) y después (panel inferior) del pasaje 1. La colonia se formó al

borde de la placa MW6 de 2500 BEF. ___________________________________________________________________ 167

Tabla 70: Mezcla de reacción enzimática del vector STEMCCA ____________________________________________________ 187


23

ÍNDICE DE ABREVIATURAS

• BAF: fibroblastos adultos bovinos

• BE: blastocisto expandido

• BEF: fibroblastos fetales bovinos

• bFGF: Factor de crecimiento de fibroblastos básico (por sus siglas en inglés: Basic Fibroblast growth factor)

• BGC: línea celular de granulosa bovina (por sus siglas en inglés: bovine granulose cells)

• BHed: blastocisto protruido

• BHing: blastocisto protruyendo

• BL: blastocisto

• b-LIF: variante de LIF, secuencia de aminoácidos de la proteína de origen bovino

• BO: Brackett y Oliphant

• BSA: seroalbúmina bovina (por sus siglas en inglés: bovine serum albumin)

• Bt: blastocisto temprano

• c-DNA: DNA complementario

• CHO LIF: variante de LIF cuya secuencia de aminoácidos es de origen murino pero es producida heterólogamente y

secretada en el sobrenadante del cultivo de células CHO.

• CO2: dióxido de carbono

• cSOF: SOF con citrato

• Ct: por sus siglas en inglés cycle thershold. Número de ciclos en una qPCR que toma alcanzar el nivel de fluorescencia

por encima del background.

• DAPI: por sus siglas en inglés 4',6-diamidino-2-phenylindole

• DGE: test de comparaciones múltiples de medias sin superposición de Di Rienzo, Guzmán y Casanoves.

• DMEM/F12: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12

• DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium

• DMSO: dimetilsulfóxido

• DNA: Ácido Desoxiribonucleico (por sus siglas en inglés)

• DNAsa: desoxiribonucleasa

• dNTP: nucléotido de DNA

• DO: densidad óptica

• DTT: ditriotreitol

• eMeA: Agencia Europea de Evaluación en Medicina

• EpiSC: epi stem cells

• ESC: embryonic stem cells

• ETOH: etanol

• FAUBA: Facultad de Agronomía, Universidad de Buenos Aires

• FDA: Food and Drug Administration


24

• FIV: fecundación in vitro

• Gapdh: gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa.

• g-DNA: DNA genómico (por sus siglas en inglés genomic DNA)

• HEK 293T: Línea celular Human Embryonic Kidney 293-T

• h-LIF: variante de LIF, secuencia de aminoácidos de la proteína de origen humano.

• HSOF: SOF con HEPES

• IF: inmunofluorescencia

• ICM: masa celular interna o macizo celular interno

• IHC: inmunohistoquímica

• iMEF: MEF irradiadas

• iPSC: induced pluripotent stem cells

• KSR: reemplazo de suero (por sus siglas en inglés: Knockout Serum Replacement)

• LIF: factor inhibidor de leucemia (por sus siglas en inglés: leukemya inhibitory factor)

• M: mórula

• MC-BGC: medio condicionado por granulosa bovina

• MEF: Mouse Embryonic Fibroblast

• MLGM: modelo lineal generalizado mixto

• m-LIF: variante de LIF, secuencia de aminoácidos de la proteína de origen murino.

• m-MEF: mitomicin inactivated Mouse Embryonic Fibroblast

• NaB: butirato de sodio

• N2B27: neurobasal medium

• O2: oxígeno molecular

• OGM: organismos genéticamente modificados

• OKSM: OCT4, KLF4, SOX2, C-MYC.

• OPS: por sus siglas en inglés Open Puller Straw

• Po, P1: pasaje cero y pasaje 1.

• P/S: solución de antibiótico compuesta de penicilina y estreptomicina

• PBS: buffer fosfato salino

• PE: endodermo primitivo

• PEF: fibroblastos fetales porcinos

• PFA: paraformaldehído

• PICT: Proyecto de Investigación de Ciencia y Técnica

• PI3K: fosfoinositol 3 quinasa

• PIPES: por sus siglas en inglés: piperazine-N,N’-bis (ethanesulfonic acid)

• PR: proteínas recombinantes

• PSC: células pluripotentes

• RNA: ácido ribonucleico (por sus siglas en inglés)


25

• RNAsa: ribomucleasa

• RPM1 y RPM2: medio de reprogramación 1 y 2.

• RT: temperatura ambiente (por sus siglas en el inglés: Room Temperature).

• RT-PCR: retrotranscripción seguida de PCR

• RT-qPCR: Reverse Transcriptase Quantitative Polimerase Chain Reaction

• SCNT: single cell nuclear transfer

• SDS: dodecil sulfato de sodio

• SEM: error estándar de la media (Standar Error of the Mean)

• SFB: suero fetal bovino

• SOF: fluido oviductal sintético (por sus siglas en inglés Synthetic Oviduct Fluid)

• STAT3: transductor de señal y activador de la transcripción 3

• t2iGö: inhibidores de MAPK, GSK3 y PCK.

• TE: trofoectodermo

• UFC: unidades formadoras de colonias

• UK: United Kingdom

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Resumen

26

RESUMEN

Las células madre embrionarias (ESC) se han utilizado exitosamente desde hace más de 30 años en la transgénesis de

ratón y más recientemente en rata para llevar a cabo investigaciones en genética, biología del desarrollo y posibles futuras

aplicaciones en medicina regenerativa. Estas células derivadas del macizo celular interno (ICM) del embrión de ratón tiene cuatro

propiedades fundamentales que han facilitado su utilización para la modificación genética: 1- pluripotencia, 2- clonogenicidad, 3-

capacidad de auto renovación a largo plazo y 4- capacidad de formar quimeras y contribuir a la línea germinal (“quimeras

germinales”). Esta última característica permite obtener quimeras de forma muy eficiente: 60 % de animales nacidos vivos en el caso

de inyección en blastocistos de ratón y 80 % mediante la agregación de ESC a embriones de 8 células. Las células con estas

propiedades se definen como células pluripotentes naïve y se diferencian de otro tipo de célula embrionaria pluripotente derivadas del

epiblasto, denominadas células primed (EpiSC).

En los últimos años, se han llevado a cabo numerosos estudios para establecer los mecanismos que determinan la

pluripotencia naïve durante el desarrollo embrionario temprano y durante la generación de células madre pluripotentes inducidas

(iPSC), aunque en su mayoría se han realizado en ratón y en menor medida en humano. La generación de células naïve bovinas y su

utilización para generar bovinos transgénicos requiere entonces trasladar este tipo de estudios. El objetivo general de esta tesis fue

estudiar los mecanismos involucrados en la emergencia de la pluripotencia durante el desarrollo embrionario temprano en bovinos y

aplicar estos conocimientos al desarrollo de una plataforma biotecnológica para la producción de bovinos transgénicos con fines

productivos (molecular pharming) basados en la derivación de células pluripotentes embrionarias y en la reprogramación de células

somáticas.

Para ello en el primer capítulo se estudió dos condiciones alternativas al medio clásico SOF/BSA para cultivo in vitro de

embriones sin suero. El medio N2B27 se estableció como la mejor opción libre de suero para obtener blastocistos bovinos de alta

calidad necesarios para estudiar el impacto de la modulación de las vías de señalización y su efecto en la segregación embrionaria.

Posteriormente se estudiaron los marcadores de epiblasto e hipoblasto (PE) bovino resultando NANOG y SOX17 los escogidos para

evaluar los efectos en la especificación de estos linajes. Adicionalmente se documentó la dinámica de expresión de estos genes

durante el desarrollo temprano en embriones de 4 células a blastocitos. La co-expresión comienza al estadio de 8 células, se

intensifica en el estadio de mórula y se restringe mutuamente en el de blastocisto. Mediante la detección por inmunofluorescencia se

determinó el número de células positivas de cada marcador y con ello se evaluó el efecto de diferentes medios de cultivo sobre la

evolución de embriones bovinos producidos in vitro. Se comparó el medio N2B27 t2iGo LIF, utilizado para establecer líneas de

células madre embrionarias naïve de ratón y humano, con el control (DMSO), y con el medio al que solo se le agregó h-LIF o t2iGö.

Este último es una combinación de PD0325901 y CHIR, inhibidores de MAPK7ERK y GSK3 respectivamente, con la adición de

PKC (Gö6983). Del análisis de los resultados se concluyó que el medio N2B27 h-LIF aumentó el número de células NANOG y

SOX17 positivas y por tanto del ICM en detrimento del trofoectodermo (TE), lo que indica un efecto en el primer evento de

diferenciación embrionaria. A su vez este medio aumentó el número de células que co-expresan NANOG y SOX17. Por otro lado, en

el medio N2B27 t2iGö h-LIF se detectaron diferencias en la segregación del epiblasto e hipoblasto de día 8 con un efecto parcial,

generando un mayor número de células NANOG positivas en el ICM en detrimento de las SOX17 positivas sin lograr bloquear

completamente la formación del hipoblasto. De acuerdo a estos resultados, se cree que existe algún otro mecanismo que junto a la vía

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Resumen

27

MAPK/ERK participa en el embrión bovino para el establecimiento del segundo evento de diferenciación. Para evaluar esta nueva

hipótesis, se estudió el efecto de N2B27 suplementado con PD0325901 en una concentración de 10 µM (PD032+), solo y en conjunto

con IWP2 el inhibidor de Wnt. Se compararon estos grupos con el control (DMSO) y el medio con solo IWP2. Se ha reportado

previamente que la inhibición conjunta de MARPK/ERK y Wnt inhiben el desarrollo del PE en embriones de monos.

Inesperadamente nuestros resultados demuestran que PD032+ bloquea la expresión de SOX17 y probablemente la formación del PE,

aunque sin el aumento del número de células que expresan NANOG. Este efecto también se observa en la combinación IWP2 +

PD032+. Posteriormente, con el fin de establecer si la disminución de las células NANOG positivas se debió a la alta concentración

del inhibidor, se llevó a cabo un análisis de la curva dosis respuesta en la que se varió la concentración de PD032 de 2.5, 5 y 10 µM.

En todas las concentraciones, se observó la ausencia de células SOX17, en cuanto que NANOG respondió de forma parabólica en la

que el número de células positivas es mayor a 5 µM que a 2.5 y 10 y semejante a la del control (DMSO). Al contrario de lo que se

esperaba, este resultado en el que no hay un aumento del marcador de un linaje en detrimento del otro nos lleva a pensar que el efecto

del bloqueo de SOX17 no se debe a un cambio en la decisión del destino celular. Se necesita profundizar el análisis para determinar

la causa de dicho efecto.

En el segundo capítulo se evaluaron diferentes metodologías para la generación de iPSC bovinas, tanto aquellas en la que

los factores de reprogramación OCT4, KLF4, SOX2 y C-MYC (OKSM) se introdujeron en la célula de forma transitoria mediante

episomas, como las que se insertaron en el genoma mediante la transducción de las células con partículas lentivirales. Se realizó en

paralelo la reprogramación de células de fibroblastos porcinos (PEF), utilizadas en primera instancia como control del protocolo de

reprogramación. Se establecieron las condiciones óptimas en los procesos de transfección de episomas y de generación de partículas

lentivirales, previo a la reprogramación. Se trabajó con diferentes medios de reprogramación, el convencional KSR + FGF, el medio

E8 de cultivo de células en medio feeder and serum free y el medio SB43 en el que se modulan las vías MAPK/ERK, Wnt y las

mediadas por TGF. Se caracterizaron las células obtenidas por inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia nucleares y de

membrana, por RT-PCR, actividad de fosfatasa alcalina (AP), detección de la inserción del vector (STEMCCA) en el genoma y

expresión de los factores exógenos mediante RT-PCR. Los resultados obtenidos en los experimentos con episomas ponen en

evidencia una vez más la dificultad de reprogramar células somáticas en las especies en estudio (bovino y porcino), en los que aún no

se han logrado establecer líneas de iPSC genuinas. Por otro lado, haciendo uso de partículas lentivirales en donde la expresión de los

genes es constitutiva y suficiente para iniciar la reprogramación, se obtuvieron con mayor facilidad a partir de células porcinas que

bovinas, colonias de morfología semejante a las iPSC. Reprogramar células bovinas requirió de la modificación de las condiciones de

reprogramación para ajustar los mismos a la cinética de crecimiento de fibroblastos bovinos y a la baja eficiencia con que estos se

transducen a una misma MOI con respecto a otras especies. Para ambas especies sigue siendo un desafío establecer el cultivo en

forma estable en el tiempo sin que las células varíen sus características. Determinar las condiciones de cultivo que favorezcan la

expresión de genes endógenos de la red de pluripotencia e inactiven los exógenos utilizados en los protocolos de partículas

lentivirales sigue siendo el cuello de botella en los procesos de establecimiento de iPSC bovinas y porcinas. Como aún no se lograron

las células totalmente reprogramadas en estas especies, es fundamental ganar más conocimiento de los mecanismos moleculares de

establecimiento de pluripotencia y diferenciación en animales de granja para superar este obstáculo.

Palabras clave: células madre, animales de granja, pluripotencia, desarrollo embrionario, modulación de las vías de señalización.

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Abstract

28

ABSTRACT

Embryonic stem cells (ESC) have been successfully employed in mouse transgenesis during more than 30 years, and more

recently in rats, to carry on research about genetics, developmental biology and future regenerative medicine applications. These cells

are derived from the inner cells mass (ICM) of mouse embryos and have two properties that make able their use as a vector in genetic

modified animals generation: 1) pluripotency, 2) clonogenicity, 3) self-renewal, 4) capacity for making chimeras and contributing to

the germ line. This last feature allows them to produce chimeras in an efficiently manner: 60% of lived born animals when blastocyst

injection is used and 80% by 8 cells aggregation of ESC. These kind of cells are defined as “naive” pluripotent stem cells and they

differ from that derived from the epiblast: the primed state of pluripotent stem cells (EpiSC).

Over the last few years many studies have been carried on to establish the molecular mechanism that define naive

pluripotency during early embryonic development and during the generation of induced pluripotent stem cells (iPSC). These studies

were mainly focused on mouse and then in human pluripotency. The generation of naive bovine cells and their use for generating

bovine transgenic animals require to study this as well. The main objective of this research was to study the mechanism of

pluripotency emergency during bovine embryonic development and the use of this new knowledge for developing a biotechnological

platform to produce transgenic bovines with productive purposes (molecular pharming) based on derivation of ESC and

reprogramming of somatic cells.

In the first chapter, two serum free conditions for culturing bovine embryos were studied. The N2B27 medium was the

best option for producing bovine blastocysts of high quality to study the impact of molecular pathways and their effect in lineage

segregation. Then, molecular markers for epiblast and hypoblast were chosen resulting NANOG and SOX17 as the better options for

studying the specification of these two lineages. Moreover, their dynamic expression was studied during early embryonic

development starting with 4 cell stage to blastocyst stage. Co expression of NANOG/SOX17 was detected at 8 cell stage, their

expression was intensified at morula stage and become mutually restricted at blastocyst stage. Then, the number of positive cells of

each marker was determined by immunofluorescence analysis and therefore the effect of different medium formulations was

evaluated in the in vitro bovine embryos. N2B27 t2iGö h-LIF used in the establishment of mouse and human naive ESC was

compared with control (N2B27 with DMSO) and N2B27 with h-LIF or t2iGö. t2iGö is a combination of PD0325901 and CHIR,

MAPK/ERK and GSK3 inhibitors respectively known as 2i, with PKC inhibitor (Gö6983). Results shows that N2B27 h-LIF

increased the number of NANOG and SOX17 positive cells and therefore the size of ICM in detriment of trophectoderm (TE).

Therefore, h-LIF influenced the first event of lineage segregation when ICM and TE are specified. At the same time, this medium

increased the number of NANOG and SOX17 co expressed cells. On the other hand, N2B27 t2iGö h-LIF was the only medium able

to impact on the second event of embryo lineage segregation, having more NANOG positive cells in day 8 embryos treated with it

and partially blocking PE specification. In conclusion, we expected that other pathway with MAPK/ERK specifies primitive

endoderm in bovine embryos. For elucidating this new hypothesis, we studied the effect of N2B27 with PD0325901 at 10 µM

(PD032+), alone and with IWP2, a Wnt inhibitor. This groups were compared with control (DMSO) and N2B27 with IWP2.

Previously was reported that dual inhibition of MARPK/ERK and Wnt blocks the development of PE in marmoset embryos.

Unexpectedly, our results show that PD032+ blocked SOX17 expression and probably the PE specification although without

NANOG positive cells increase (actually a decrease regard of the control). This effect was also seen in the combination IWP2 +

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Abstract

29

PD032+. Then, with the aim of establishing if NANOG positive cells decrease was due to a high concentration of PD032, we made

and analysis of dose response curve with 2.5, 5 and 10 µM of the inhibitor. In all the conditions, we saw the ablation of SOX17

expression, meanwhile the NANOG number of cells respond in a parabolic manner where the highest number was at a concentration

of 5 µM and at this concentration the positive cells number was like the control (DMSO). Contrary to we expected, this result in

which there is no an increase of one lineage in detriment of the other suggests us that the effect on the PE is not due to a change in the

decision fate of the cell. More studies are needed to understand what happened at high concentration of PD032 inhibitor.

In the second chapter, different strategies were evaluated for bovine iPSC generation. Episomes and lentivirus were used

for introducing reprogramming factors OCT4, KLF4, SOX2, C-MYC (OKSM). At the same time, porcine fibroblast (PEF) were

reprogramming as control of the method employed. Episomes transfection and generation of lentivirus were previously optimized.

Cells were cultured in different media: KSR + FGF, E8 medium for feeder and serum free conditions and finally SB43 medium in

which MAPK/ERK, Wnt and TGF pathways are modulated. Cells with changed morphology were characterized by

immunofluorescence of pluripotency markers, RT-PCR, alkaline phosphatase and detection of STEMCCA in the genome of

reprogramming cells. Finally, detection of exogenously factors were analysed during long term culture by RT-PCR. Results obtained

with episomes demonstrate once again that bovine and porcine cells are recalcitrant for reprogramming. Culturing of bonafide iPSC

cells in these species are still difficult and pluripotency is not maintained by endogenous factors but exogenous. On the other hand,

protocols based on lentiviruses produce porcine iPSC-like cells more easily then bovine. That means that protocols used in other

species are useful for obtaining porcine colonies but working with bovine cells need the adjustment of conditions. Despite of the fact

of getting colonies, long term culture of iPSC is still difficult for both species; they maintained the stem cells features only by the

expression of exogenous factors. Inactivation of the STEMCCA is still a bottleneck for establishing bonafide iPSC, since culture

medium did not maintain endogenous OKSM expression. Therefore, it is still crucial getting more knowledge regard on the molecular

mechanism for pluripotency and differentiation establishment in farm animals.

Key words: stem cells, farm animals, pluripotency, early development, modulation of pathways.

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Introducción General

30

INTRODUCCIÓN GENERAL

1. TRANSGÉNESIS ANIMAL

1.1. Qué es y para qué sirve.

La transgénesis animal es un procedimiento utilizado en biotecnología para modificar la expresión génica de una célula

animal. Esta puede ser llevada a cabo mediante la modificación transitoria o estable e incluye tanto la inserción de uno a varios genes

heterólogos (knock in) así como la deleción génica (knock out), silenciamiento (knock down) o modificación en los niveles de

expresión. Estos cambios pueden generar en su forma más sencilla células genéticamente modificadas y en su forma más compleja

animales transgénicos. Los animales transgénicos al igual que otros organismos genéticamente modificados (OGM) como bacterias,

levaduras y plantas pueden ser utilizados como plataformas biotecnológicas con diferentes fines. En un sentido más general estos

fines incluyen la expresión de proteínas heterólogas y el mejoramiento de especies (1). Particularmente, el uso de animales

transgénicos incluye un amplio rango de campos de aplicación entre los que se destacan el estudio in vivo de las funciones de un gen

(por ejemplo en biología del desarrollo y organogénesis) (2), la biomedicina (generación de modelos animales para el estudio de

enfermedades humanas, reconstrucción de órganos para xenotransplante, terapia génica), la agricultura (en el caso de animales de

granja, mejoramiento en las tasas de crecimiento y calidad de la carne, performance reproductiva) la medicina veterinaria (resistencia

a enfermedades), la biofarmacéutica (producción de anticuerpos monoclonales, proteínas para diagnóstico o terapia, producción de

vacunas virales) y la producción industrial de proteínas recombinantes (PR) en la que se utiliza a los animales como biorreactores (3).

La utilización de animales transgénicos como plataforma tecnológica para la expresión de genes heterólogos presenta

ventajas y desventajas respecto a otras plataformas ya existentes y maduras como bacterias, levaduras, hongos y células de

mamíferos. También presenta ciertas ventajas respecto a su análogo en el reino vegetal (molecular pharming). Las principales

características se resumen en la Tabla 1. La ventaja principal respecto a los procariotas y eucariotas menores es el correcto

procesamiento postranscripcional así como el adecuado plegamiento de proteínas complejas (4); respecto a las células de mamíferos

la relativa facilidad de manejo (“reactores vivientes”), la mayor capacidad de escalamiento así como menor costo (Tabla 2). Por otro

lado, a diferencia de las plantas, no presentan riesgos de migraciones de caracteres indeseados hacia otras especies (5). La principal

desventaja es la baja eficiencia de los métodos actualmente utilizados para su creación (3).


31

Tabla 1: Comparación de las características principales entre los sistemas de producción de proteínas recombinantes, PR (6)

Característica

Sistemas de producción

Bacteria Levadura Baculovirus Plataforma de transgénicos

Células CHO Plantas Animales

Rendimiento +++++ +++++ +++ ++ +++++ +++++

Inversión +++++ +++++ ++ + ++++ +++

Costo de producción +++++ +++++ ++ ++ +++++ ++++

Flexibilidad +++++ +++++ ++ + +++++ ++++

Conservación de la línea +++++ +++++ +++ +++ +++++ +++++

Estabilidad de la línea +++++ +++++ ++++ +++ +++++ +++++

Escalado +++++ +++++ ++ + +++++ ++++

Colección +++++ +++++ +++++ +++++ +++++ ++++

Modificaciones pos transcripcional + ++ +++ ++++ +++ ++++

Glicosilación + ++ +++ ++++ ++ ++++

Purificación +++ +++ +++ ++++ +++ +++

Patógenos contaminantes +++++ +++++ +++++ ++++ +++++ ++++

Propiedad intelectual ++++ +++ +++ ++ +++ +++

Productos en el mercado ++++ +++ +++ +++++ + +++


32

Tabla 2: Comparación de los costos de producción de PR producidas en cultivo de células animales (CHO) versus animales transgénicos (6)

Plataforma biotecnológica Escala de producción (kg/año) Costo (US$/año)

Células CHO 50 100

147 48

Animales transgénicos 50 100

20 6

Los primeros estudios realizados para lograr modificaciones genéticas en animales se realizaron en 1980 con embriones de

ratón (7). En 1985 se logró el primer ratón transgénico producido exitosamente por microinyección pronuclear de constructos

diseñados mediante el uso de ingeniería genética (8). De hecho, desde sus comienzos y hasta la actualidad la mayoría de los animales

transgénicos producidos son ratones. También se han desarrollado conejos, cerdos, ovejas y vacas transgénicas (9). Desde un punto

de vista más productivo el bovino transgénico representa una especie de gran interés por la posibilidad de generar productos

secretados por la glándula mamaria, siendo esta especie la de mayor producción de leche por período de lactancia dentro de las

especies de animales de granja (Tabla 3). El bovino también es de interés para generar nuevos genotipos para mejorar la calidad de

carne, crecimiento, adaptabilidad a nuevos ecosistemas y mejoramiento en la capacidad digestiva (10). La posibilidad de realizar de

forma extensiva o industrial modificaciones genéticas en ganado bovino presenta desafíos a nivel tecnológico, ya que los métodos de

producción de bovinos transgénicos utilizados actualmente son poco eficientes.

Tabla 3: Comparación de sistemas de producción de leche transgénica en diferentes especies (9)

Especie Producción de leche por

periodo de lactancia (litros) Conejo 1-1.5 Cerdo 200-400 Oveja 200-400 Cabra 600-800 Vaca 6000-8000

En los últimos años se han introducido al mercado de Estados Unidos 193 proteínas recombinantes obtenidas mediante

el cultivo de células de mamíferos y 42 de ellas se produjeron utilizando células CHO (4). La producción comercial se ha limitado a

células y no a animales debido a las regulaciones existentes. No fue sino hasta el 2006 que la Agencia Europea de Evaluación en

Medicina (eMeA) aprobó la antitrombina, primera proteína recombinante derivada de la leche de cabras transgénicas. Esta proteína se

aprobó posteriormente en Estados Unidos por la FDA. En el 2011, la eMeA aprobó la producción del inhibidor de c1-estereasa

producidos en conejos. El arribo al mercado de proteínas de uso terapéutico producidos por animales transgénicos sugiere que en un

futuro cercano se expanda el nicho de producción de PR (4).

Los estudios a nivel experimental sin embargo se han ido desarrollando y en la actualidad se encuentran publicados una

gran cantidad de trabajos con animales transgénicos (Tabla 4).


33

Tabla 4: Ejemplos de expresión de PRs humanas en la leche de animales transgénicos (4)

1.2. Metodologías y sus limitantes.

Para la generación de animales transgénicos existen diversas plataformas tecnológicas desarrolladas (Tabla 5) como la

microinyección pronuclear, la transgénesis mediada por espermatozoides, la clonación de células transfectadas o transducidas con

vectores virales: lentivirus, retrovirus, adenovirus (Figura 1) y por posterior transferencia nuclear (SCNT), y la transfección de células

madre pluripotentes y posterior desarrollo de embriones por formación de quimeras o por transferencia nuclear. La transgénesis

animal también puede ser llevada a cabo con células madre pluripotentes inducidas (iPSC), otro tipo celular con características

similares a las células madre embrionarias (ESC) generadas por el proceso de reprogramación. La tecnología de pluripotencia

inducida (iPS) requiere la expresión de múltiples genes para convertir el estado diferenciado a un estado semejante al “embrionario”.

Hay abundante evidencia que sugiere que este procedimiento ocasiona inestabilidad genómica que no es compatible con la

generación de un método seguro y eficiente para la producción de animales transgénicos. Un trabajo a gran escala llevado a cabo

recientemente demuestra que la utilización de iPSC de cerdo como células donantes para SCNT no favorece el desarrollo de animales

clonados (11).

Tabla 5: Evaluación de las metodologías de transferencia de genes (12)

Proteína Recombinante Animal Transgénico

Método de producción

Máximo nivel de producción de PR en leche (mg/ml)

Albúmina vaca NT 40 -fetoproteína cabra NT 1.1 Butirilcolinesterasa cabra NT 5 Factor Estimulante de colonias de granulocitos

cabra ratón

MI MI

0.05 0.04

Hormona del crecimiento cabra vaca

NT NT

0.07 5

Antitrombina cabra MI 2 Factor de coagulación IX ratón

cerdo MI MI

0.026 4

Activador del plasminógeno tisular cabra MI 3

Eritropoyetina ratón conejo

MI MI

0.3 0.5

Lisostafina vaca ratón

NT MI

0.014 1.3

Inhibidor de estereasa conejo MI 1.8 Factor de coagulación VIII conejo MI 0.1

*NT: transferencia nuclear; MI: microinyección pronuclear.


34

Figura 1: Los métodos de transferencia de ácidos nucleicos ex vivo requieren la manipulación in vitro de embriones o gametos y posterior transferencia a madres receptoras. (a) Inyección pronuclear, (b) transducción con vectores virales (c) electroporación de embriones, (d) transfección con liposomas, (e) inyección en la cavidad blastocélica o citoplasmática del cigoto, (f) transferencia mediada por espermatozoides co incubados con material genético e (g) ICSI de espermatozoides co incubados con material genético. La tecnología de edición del genoma (ZFN, TALENs y CRISPR) puede apoyarse en estas tecnologías para transferir los vectores de las endonucleasas necesarias.(13)

La utilización de ESC presenta ventajas frente a las otras alternativas mencionadas basadas en las propiedades que las

definen: auto-renovación y pluripotencia (14). Debido a su capacidad de diferenciarse a todos los tipos celulares fetales, así como a su

Método Uso Sitio de integración

Selección de integración

HR Múltiples genes

Tamaño del constructo

Mosaicismo Dificultad técnica

Microinyección Alto Azar No No Ineficiente Cromosomas artificiales

Si

SCNT Bajo Selección Si Posible Si Transfección limitada/

cromosomas artificiales

No

Implantación de espermatogonias

transgénicas

Bajo Azar Si No todavía

No todavía Transfección limitada

No

Transferencia mediada

por Espermatozoides

Bajo Azar No No Ineficiente No se sabe No se sabe

Inyección de lentivirus

Bajo Azar No No Si 5 Kb Si

d Transfección con liposomas

ICSI - MGT

c Electroporación in vitro

SMGT f b

Transducción

a

IP Inyección en blastocele

e


35

contribución a la línea germinal, pueden colonizar el ICM (macizo celular interno) de un blastocisto en desarrollo o agregarse a

embriones de ocho células y generar un animal genéticamente modificado (14). La eficiencia de generación de animales nacidos

vivos es del 60-80% en ratón (15,16) comparada con el 5 % por SCNT en la misma especie (17). En bovinos esta última técnica ha

sido utilizada desde sus comienzos y hasta la actualidad con una eficiencia del 1 % de animales nacidos vivos (18) debido a

problemas aún no resueltos de índole técnicos como síndrome de la cría grande, problemas placentarios relacionados a la ineficiencia

de reprogramación, etc. (19–21). Por lo tanto, aunque la eficiencia de fusión sea alta los problemas durante la concepción del feto

producen abortos prematuros o muertes después del nacimiento.

Por otro lado, debido a la capacidad de auto-renovación de las ESC, se pueden manejar grandes stocks de cultivos

celulares y trabajar en forma continua con estos mediante la transfección, selección de transfectadas, detección del gen de interés,

análisis de expresión génica antes de producir el organismo modificado, y por ende salvar el costo de manipular animales nacidos (3).

Por lo mismo es posible producir eficientemente organismos knock out y knock in por recombinación homóloga también llamado

gene targeting lo que es casi imposible de lograrse con ninguna de las otras técnicas de manipulación genética antes mencionadas

(22,23). La auto-renovación también abre un abanico amplio para realizar manipulaciones genéticas complejas de varios genes a la

vez, técnicamente inviable con otro tipo celular, de gran interés en aplicaciones biomédicas y agronómicas (24). Si se desea obtener, a

partir de esa célula transformada, un OGM no quimérico se puede hacer uso de la SCNT, esperando que por tratarse de una célula

indiferenciada mejore el proceso de obtención de embriones por NT. Por lo tanto, la obtención de ESC de bovinos permitirá la

manipulación genética específica para la mejora de eficiencias productivas y constituirá una herramienta poderosa para acelerar el

proceso de mejoramiento.

2. OTROS POTENCIALES USOS DE LAS CÉLULAS PLURIPOTENTES DE ANIMALES DE GRANJA

Dado el auge de las tecnologías de edición del genoma y en particular de los CRISPR, que en perspectiva se presentan como

herramientas de fácil uso y competitivas con la tecnología de ESC para generar knock in y knock out, no se puede dejar de mencionar

los usos alternativos de las PSC. Por sus características estas células son esencialmente células inmortalizadas y si se las mantiene en

forma adecuada son genéticamente estables, por lo que pueden ser utilizadas en la conservación de animales en peligro de extinción e

incluso en la producción de gametos de dichos animales. Además, su uso in vitro como fuente regular e inagotable de células las hace

una herramienta valiosa en aquellas fases experimentales en las que se quieran evaluar los efectos de fármacos, toxinas, teratógenos y

compuestos químicos en general. La habilidad de las PSC para diferenciarse sigue siendo una característica importante para estudiar

la biología detrás de los procesos de diferenciación. El uso de modelos animales para investigación preclínica de enfermedades

humanas es otro nicho a explotar una vez obtenido este tipo de células. Debido a la gran similitud del tamaño de sus órganos y

fisiología el desarrollo de PSC de animales de ganadería y primates no humanos como modelos humanos es esencial para acortar la

brecha y permitir la transferencia de procedimientos terapéuticos basados en tecnología iPSC de los roedores al campo de la medicina

humana. El desarrollo de tratamientos de la enfermedad de Parkinson y enfermedades cardíacas en modelos porcinos son algunos de

los ejemplos de las aplicaciones actuales (25,26).

3. CÉLULAS MADRE

3.1. Definición


36

Las células madre se definen como células que por un lado tienen la capacidad de auto replicarse indefinidamente y por

otro la habilidad de diferenciarse ya sea in vivo o in vitro a distintos tipos celulares funcionales. La primera característica permite la

propagación celular en cultivos prolongados, y la segunda les otorga un amplio rango de plasticidad celular (27,28). Las células

madre embrionarias son células provenientes de embriones que cuando son incluidas en un embrión huésped, tienen la capacidad de

producir quimeras y contribuir a la formación de todos los tejidos de estas, propiedad denominada pluripotencia, incluyendo las

células germinales. Esto último fue demostrado únicamente con ESC en ratones y primates no humanos (27).

La pluripotencia que define a las células madre embrionarias, es en realidad un estado transitorio en el desarrollo

embrionario de las células (Figura 2), es decir que existe durante un intervalo definido del desarrollo de un embrión (29). A medida

que este crece y se desarrolla se va diferenciando y perdiendo por ende su capacidad pluripotente.

Figura 2: Fuentes de células pluripotentes. Las PSCs se derivan de diferentes tipos celulares in vivo. (a) ECC son células de carcinoma derivadas de teratocarcinomas, es decir tumores germinales; (b) las ESC células derivadas del ICM de un embrión preimplantatorio; (c) EpiSC y las rsPSC (células madre pluripotentes derivadas de una región selectiva) son células derivadas de embriones posimplantatorios en ratón; (d) las EGC (células germinales embrionarias) son derivadas de células germinales primordiales en humano y ratón (PGCs); por último (e) las GSC llamadas células madre germinales son las derivadas de las células madre espermatogénicas de ratones recién nacidos y testículos adultos. (30)

Las células madre embrionarias poseen además de las dos propiedades que la definen, las siguientes características:

• cariotipo diploide estable.

• capacidad de formar colonias en cultivo in vitro.

• capacidad de generar in vitro todos los tipos celulares fetales (cuerpos embrioides), y tejidos de adultos (diferenciación a

tipos celulares definidos) y capacidad de producir in vivo diferentes tejidos cuando se lo inyecta en ratones

inmunodeprimidos (formación de teratomas).

• formación de quimeras y contribución a todos los tejidos, incluyendo los de la línea germinal. Colonización de la línea

germinal y trasmisión (14).

3.2. Tipos de células madre

Líneas PSC y su fuente de origen

Tumor germinal ICM Epiblasto Células Células madreprimordiales espermatogénicas

Teratocarcinoma embriones embriones fetos adultos y recién

pre-implantatorios pos-implantatorios m-E8.5-12,5/ nacidos

m- E3.5/h-E5.5 m- E5.5-7,5 h-semana 3-5


37

Según la de capacidad de diferenciación celular se reconocen varios grupos (28) que se muestran en la Tabla 6:

Tabla 6: Clasificación de células según su capacidad de diferenciación

Potencial Capacidad de desarrollo de la célula

Totipotente Habilidad de desarrollar todas las líneas celulares de un organismo. En los mamíferos solo el zigoto y los primeros

blastómeros son totipotentes.

Pluripotente Habilidad de desarrollar todas las líneas celulares del cuerpo de un organismo. Ejemplo ESC, EGC, iPSC.

Multipotente Habilidad de las células madre adultas de desarrollar múltiples tipos celulares de una línea. Ejemplo: células

hematopoyéticas.

Unipotente Células que forman un tipo celular. Ejemplo: las células madre espermatogénicas.

3.2.1. Según el origen

A lo mostrado en la Figura 2 se añaden los siguientes tipos celulares según la fuente a partir dela cual se obtienen:

Tabla 7: Fuente de células madre y tipos celulares obtenidos experimentalmente

Célula donante/tejido Sigla Nombre en inglés

Ovocitos ES partenogenética parthenogenetic embryonic stem cells

ICM ES Embryonic stem cells

Trofoectodermo TS Trophectoderm stem cells

Endodermo primitivo XEN Extraembryonic endoderm stem

Blastómero ES Embryonic stem cells

PGC (células germinales progenitoras) EG, EC Embryonic germ cells

Embryonic carcinome

Células madre de espermatogonias GMCS

maSSC

MASC Multipotent adult stem cells

Epiblasto EpiSC Epiblast stem cells

Médula ósea MAPC Multipotential adult progenitor cells

Células del cordón umbilical MAPC Multipotential adult progenitor cells

Células neuronales Neuroesferas -

Las células madre provenientes de las diferentes partes del blastocisto de ratón pueden interconvertirse de un estado al otro

según las condiciones de cultivo, por lo tanto, el estado de pluripotencia es un estado meta-estable intercambiable por señales

definidas (Figura 3 y Figura 4).


38

Figura 3: Interconversión de los distintos tipos de células madre derivadas del blastocisto de ratón (29)

Figura 4: El estado pluripotente es metaestable (31)

Nota: los diferentes factores mencionados en la figura 2 y 3 serán explicados en secciones posteriores.


39

3.2.2. Según el estado: naïve o primed

Las células madre pluripotentes pueden clasificarse según su potencial para formar quimeras germinales en naïve (ground

state) o primed. Cuando se las inyecta en un embrión en estadio de blastocisto las células naïve logran colonizar el ICM mientras que

las primed no. Además de esta diferencia funcional ambos tipos de células difieren en sus perfiles transcriptómicos y epigenéticos por

lo que se pueden distinguir fácilmente una de otras. También varían en la forma de obtención (origen y método de cultivo), el estado

naïve representa in vitro lo que en el desarrollo temprano de ratón está relacionado a las células del ICM E3.75 o epiblasto en estadio

E4.5 es decir un estadio pre-implantatorio. Las células primed en cambio están relacionadas con células provenientes de epiblastos

pos-implantatorios de embriones de ratón, o en el caso de humanos a células ESC cultivadas en FGF, activina y KSR (Figura 5).

Existen también diferencias entre los estadios naïve de diferentes especies, estas quizás están relacionadas con las diferencias

biológicas básicas presentes en el desarrollo embrionario temprano que se dan entre las mismas (Figura 5).

La Tabla 8 presenta algunas diferencias básicas de expresión génica en los epiblastos pre-implantatorios de ratón y humano.

Tabla 8: Expresión génica en embriones pre-implantatorios (32)

Gen Humano Ratón

Klf2 No Si

Klf17 Si No

ERAS No Si

Xist Baja No

DNMT3L Alto Bajo

Los mecanismos de señalización que mantienen en cultivo in vitro al estado naïve y primed en ratón son bastantes

conocidos (Figura 5). La suplementación continua de citoquinas e inhibidores mantienen este estado en forma estable durante los

pasajes de las células madre. Estos factores regulan los mecanismos de señalización que afectan tanto positiva como negativamente a

la estabilidad de la pluripotencia naïve y primed, que se establece mediante una red factores de transcripción. La interacción de

distintas vías de señalización en su conjunto mantienen este equilibrio dinámico, que tal como hemos visto en la sección anterior

puede modificarse fácilmente, ya que se trata de un estado metaestable. Estos mecanismos afectan de igual manera a la pluripotencia

primed de ratón y humano (Tabla 9 y Tabla 10) pero respecto a la pluripotenia naïve poco se conoce en humanos y otras especies de

mamíferos (incluido los bovinos), y en principio los estudios demuestran que existen diferencias entre especies, por ejemplo dosis

bajas de FGF2, activina A y BMP4 tienen efectos opuestos en la estabilidad de la pluripotencia en humanos y ratón (32,33).


40

Figura 5: PSC en embriones en desarrollo y sus mecanismos de señalización. En naranja se presenta el estado naïve y en celeste el primed. En rosado se definen las diferencias entre especies (32)


41

Tabla 9: Características de células de ratón naïve (N) y primed (P): medios de cultivos en los que se presentan (32).

Propiedad asociada a la pluripotencia

Características Medios de cultivo

Naïve (N)

Primed (P)

2i LIF

SFB, LIF

SRCi, GSK3bi

MEKi, LIF

BMP4, LIF

GSK3bi, AXINs

FGF2, activina A o

FGF2 TGF

Dependencia MEK-ERK No Si (N) (N) (N) (N) (N) (P) (P) Dependencia a largo plazo del mecanismo activado por FGF2

No Si (N) (N) (N) (N) (N) (N) (P)

Dependencia a largo plazo

del mecanismo TGF-activina A

No Si (N) (N) (N) (N) (N) (N) (P)

OCT4 enhancer activo Distal Proximal (N) (N) (N) (P) (P) H3K27me3 en reguladores de desarrollo

Bajo Alto (N) (P) (P)

Hipometilación global del DNA

Si No (N) (P) (P)

Cromosoma X inactivado No Si (N) (N) (N) (P) (P) Dependencia de DNMT1, DICER, METTL3, MBD3

No Si (N) (N) (P)

Marcadores primed (OTX2, ZIC2)

(N) (N) (N) (P) (P) (P)

NANOG, Klfs, Esrrb (N) (N) (N) (N) (N) (P) (P) Localización nuclear de TFE3

Alto Bajo (N) (N) (N) (P)

CD24, MHC clase 1 Bajo/Bajo Alto/mod (N) (N) (P) Molécula de adhesión expresada

E-caderina N-caderina

(N) (N) (N) (N) (N) (P) (P)

Promoción de la pluripotencia vía NANOG o Prdm14

Si No (N) (N) (N)solo NANOG

(N) (N) (P) solo NANOG

(P)

Metabolismo Fosforilación Oxidativa Glicolítico

Glicolítico (N) (N) (P)

Competencia de las células para inducir PGCLC

Alto Bajo (N) (P) (P)

Capacidad de colonización del ICM y contribución de quimeras

Alto Bajo (N) (N) (N) (N) (N) (P) (P)


42

Tabla 10: Características de células naïve (N) y primed (P) humanas: medios de cultivos y condiciones en los que se presentan.

Propiedad asociada a la pluripotencia OCT4 Klf4 Klf2 2i, LIF

2i, LIF p38i JNKi PKCi ROCKi FGF2

TGF

2i, LIF PKCi MEF (Klf2, NANOG)

2i, BRAFi ROCKi SRCi, LIF Activina A MEF (FGF2, JNKi)

2i, BMPi LIF MEF

FGF2, TGF o FGF2, Activina A o FGF2, MEF

Dependencia MEK-ERK (N) (N) (N) (N) (N) (P) Dependencia a largo plazo del mecanismo activado por FGF2

(P) (P) (P) (P)

Dependencia a largo plazo del mecanismo TGF-activina A

(P) (N) (P) (P)

OCT4 enhancer activo (N) (N) (N) (N) (P) H3K27me3 en reguladores de desarrollo (N) (N) (N) (P) Hipometilación global del DNA (N)Media (N)Fuerte (P) Cromosoma X inactivado (N) (N) (N) (P) (P) (P) Dependencia de DNMT1, DICER, METTL3, MBD3

(P)

Marcadores primed (OTX2, ZIC2) (N) (N) (N) (N) (N) (P) NANOG, Klfs, Esrrb (N) (N)Medio (N)Fuerte (N)Fuerte (N)Medio (P) Localización nuclear de TFE3 (N) (N) (P) (P)

CD24, MHC clase 1 (N) (N) (N) (P) Molécula de adhesión expresada (N) (N) (N) (N) (N)

Promoción de la pluripotencia vía NANOG o Prdm14

(N) (N) (N) (N) (N)

Metabolismo (N) (P) Competencia de las células para inducir PGCLC (N) (P) Capacidad de colonización del ICM y contribución de quimeras

(N) (N) (P) (P)

En ratón las ESC naïve se han cultivado en medio 2i + LIF (siendo 2i la combinación de la inhibición de MEK y GS3K), y las

células primed o EpiSC se han cultivado en FGF + activina (Figura 5). Las células mantenidas en otros medios son estadios intermedios

entre el estado naïve y primed que muestran características de ambos (Tabla 9). Las células ESC humanas se consideran primed pero

difieren de las EpiSC de ratón, ya que comparten también algunas de las características naïve de ratón (Tabla 10). Establecer células naïve

humanas con las características naïve de ratón sigue siendo un reto. Es importante aclarar que quizás tratar de lograrlo sea una paradoja de

la biología, ya que como se sabe existen diferencias en la biología del desarrollo entre especies. Colonizar el ICM y contribuir a la línea

germinal es a nuestro entender el punto de comparación para determinar si una línea ESC es del tipo naïve o no, independientemente de

que esta pueda tener diferencias en los perfiles transcriptómicos, epigenéticos, mecanismos de señalización etc. con la línea ESC de ratón.


43

La pregunta aún a responder es si existen diferentes tipos de estados naïve que se puedan definir de forma más apropiada para cada

especie, comparando las células pluripotentes inmortalizadas in vitro con las células del embrión en desarrollo de su especie. En humanos

por otro lado, las células primed se han podido establecer en presencia de FGF e inhibidores de WNT, además del conocido FGF +

activina.

4. CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS

4.1. Método de obtención en relación con los mecanismos que mantienen la pluripotencia

4.1.1. Ratón y humano

Las primeras células aisladas con características pluripotentes (EC: carcinoma embrionario) fueron de teratocarcinomas de

ratón (34), un tipo de cáncer común en las gónadas masculinas que está compuesto por una mezcla de células diferenciadas incluyendo

aquellas presentes en el desarrollo embrionario (endodermo, mesodermo, ectodermo), y de células indiferenciadas similares a las células

que componen un embrión (35).

Figura 6: Línea del tiempo en el que se muestran los principales descubrimientos relacionados con las ESC (35).

Las células EC de ratón se cultivaron sobre una capa de fibroblastos embrionarios inactivados de ratón (denominados feeder

layer debido a que inicialmente se creía que proveían nutrientes a las EC). Los estudios realizados con este tipo de células cancerígenas

derivaron posteriormente en el aislamiento de células pluripotentes de iguales características provenientes del ICM de los blastocistos de

ratón, los que se cultivaron intactos o disectados por inmunocirugía para aislar el ICM, es decir mediante la destrucción del trofoblasto

mediada por anticuerpos (36). En 1988 se descubrió que el factor LIF (factor inhibitorio de leucemia, miembro de la familia de citoquinas

IL-6) liberado por la capa de fibroblastos mantiene el estado pluripotente de las ESC de ratón (m-ESC), por lo que posteriormente estas

fueron aisladas del cultivo del ICM sobre un soporte de gelatina y en medio enriquecido con suero y LIF (Figura 6).

Derivación de EC de ratón

Obtención de un ratón quimera con

m-ESC

Descubrimiento de LIF

Primer cultivo feeder free

Establecimiento deESC de primates

Establecimiento deEC humanas

Establecimiento dem-ESC

Generación de ESCmodificadas

genéticamente

Aislamiento de EGC y ESC

humanas

Descubrimiento de Nanog. Uso de BMP en medios

serum free


44

La unión del factor LIF a su receptor (LIFr) en las m-ESC, activa dos mecanismos intracelulares opuestos: JAK-STAT y el

SHP2-ERK (Figura 7). En la ruta JAK-STAT esta unión activa las enzimas tirosina quinasas que fosforilan el factor de transcripción

STAT3, el cual una vez fosforilado dimeriza y transloca hacia el núcleo en donde se une a regiones del ADN promotoras de genes

relacionados con la pluripotencia (35).

Por otro lado, la unión de LIF con el receptor de membrana gp130 (glicoproteína 130), estimula el mecanismo RAS/MAPK

(mitogen activated protein kinase) iniciando la cascada de transfosforilación que resulta en la fosforilación de las enzimas quinasas ERK

(extracellular signal-regulated kinases). Las proteínas ERK translocan hasta el núcleo y promueven la diferenciación, por lo tanto la

adición de inhibidores de MEK a los medios de aislamiento de ESC, promueve la señalización vía STAT3 y por tanto la pluripotencia (35).

Figura 7:Principales rutas metabólicas relacionadas a la pluripotencia en las m-ESC (35).

LIF no regula directamente la expresión génica de OCT4 ni de NANOG en las m-ESC, sin embargo, cuando se añade LIF a

células que sobre-expresan NANOG estas aumentan su proliferación por lo tanto se cree que tienen efectos independientes pero aditivos

(es decir ambos mecanismos pueden solaparse en eventos de transcripción posteriores) (35). Otra evidencia de lo anterior es que en

ausencia de LIF, pero en medio con suero, las células que sobre-expresan el factor NANOG mantienen la pluripotencia (Figura 8).


45

Figura 8: Mecanismos activados por LIF en células pluripotentes de ratón (37).

En la Figura 7 se muestra en paralelo a los mecanismos mediados por LIF, aquellos mediados por BMP (bone morphogenic

protein) en las m-ESC. Cuando se quisieron aislar las m-ESC sin la utilización de suero en los medios de cultivos se observó que estas se

diferenciaban aún en presencia de LIF. Por lo tanto, se concluyó que existe en el suero un factor que promueve la auto-replicación

indefinida de las ESC. Las células embrionarias que crecen sin suero se diferencian espontáneamente hacia células neuronales, por lo que

la primera molécula estudiada para suplantar el suero fue el BMP4 que es un factor antineural en embriones. Cuando se cultivan células

embrionarias de ratón solo con BMP4, estas se diferencian a mesodermo y a células hematopoyéticas, pero cuando se cultiva acompañado

de LIF, se mantiene la pluripotencia. En este último caso, el factor BMP4 inhibe la diferenciación a neuroectodermo porque induce la

expresión de las proteínas inhibidoras de diferenciación (id genes), mientras que el dímero STAT3 bloquea la diferenciación a mesodermo

y endodermo mediada solo por BMP4 (35). Por tanto, se necesita en forma conjunta LIF y BMP4 para aislar m-ESC en medios sin suero.

Así mismo, en medios sin suero y en lo que se sobre-expresa en factor NANOG, se mantiene la pluripotencia by-paseando la inducción

mediada por BMP4 de los genes que mantienen la auto-replicación.

En las células madre embrionarias de humanos en cambio, existen otros mecanismos involucrados en la pluripotencia. Nodal es

un regulador del desarrollo temprano de embriones humanos, y al igual que la activina suprimen la diferenciación de las h-ESC. Estas

células tienen receptores de membrana para dichas moléculas (ACVR1B, ACVR2B) y un co- receptor (TDGF1), y también expresan

nodal. Asimismo, en aquellas células del ICM progenitoras de endodermo se expresan los antagonistas de nodal (Lefty1, Lefty2) que

regulan su señalización.


46

Muchos estudios han demostrado que nodal tiene acción sinérgica con otras moléculas extracelulares como los factores FGF2 y

WNTs para promover la pluripotencia en humanos (29). En concentraciones bajas de FGF el mecanismo mediado por PI3K/AKT no se

activa, lo contrario ocurre a concentraciones altas o por el agregado de heregulina o IGF-1. Se ha propuesto a PI3K/AKT como una llave

que activa la acción de SMAD2/3 promoviendo la pluripotencia (cuando está presente o activo) o la diferenciación cuando está ausente

(Figura 9).

Figura 9: Crosstalk entre mecanismos implicados en el mantenimiento de la pluripotencia de h-ESC (38,39)

Asimismo, en células h-ESC y m-EpiSC tanto nodal como activina activan a los factores SMAD2 y SMAD3 que se unen al

promotor de NANOG y aumentan su expresión (Figura 10). Sin embargo, este gen se ve inhibido por el agregado de BMP ya que este

activa los factores SMAD1, 5 y 6 que se unen al promotor de NANOG reprimiendo su transcripción.


47

La activación de los factores SMAD2 o 3 mediada por FGF2 suprime la expresión deBMP4 en las h-ESC, previniendo la

diferenciación. En cambio, GDF3 suprime la acción de BMP4 antagonizando su acción por la inducción de los mecanismos de

pluripotencia de nodal sobre las h-ESC. Otros antagonistas de BMP4 en humanos son GREM1, GDF11 y MSTN que activan la señal de

nodal vía ACVR2B (29).

A diferencia de las m-ESC, las h-ESC pueden crecer sin feeder layer solo si se le agrega al medio FGF2. En ausencia de suero,

las h-ESC pueden mantenerse en estado pluripotente mediante el agregado de PDGF y S1P.

Figura 10: Señales extrínsecas que afectan la auto-replicación de las h-ESC (29).

Los mecanismos que regulan la pluripotencia en m-ESC (vía JAK-STAT3 por la regulación del gen Tbx3 previo NANOG), no

mantienen la pluripotencia en las h-ESC. El agregado de LIF a los medios de cultivo de h-ESC activa la cascada JAK-STAT pero esta no

impacta sobre los genes relacionados con la pluripotencia (29).


48

4.1.2. Animales de granja: el modelo bovino.

Debido al éxito en el aislamiento y mantenimiento de las ESC de ratón y a sus aplicaciones, se han realizado diversos intentos

de obtener células madre en animales de granja, pero con un éxito limitado. En los últimos 15 años, se han publicado varios estudios en

porcinos, bovinos, caprinos, ovinos y equinos, en los que se ha obtenido células semejantes a las células madre pero que finalmente

pierden la capacidad de auto-replicarse o de diferenciarse (Figura 11) (27). Ninguna de estas células ha probado tener capacidad definitiva

de ser ESC, y ninguna ha sido utilizada exitosamente de forma similar que las mESC, h-ESC y ESC de primates (formación de quimeras, o

diferenciación in vitro) (27).

Las primeras líneas generadas en bovinos tuvieron capacidad limitada de proliferación, y ninguna fue capaz de generar

teratomas cuando se inyectó en ratones inmunodeprimidos y por lo tanto estos estudios fallan en demostrar una de las características

principales relacionada a la prueba de pluripotencia in vitro (26). El agregado de LIF al medio de cultivo, junto con FGF2 y también en

combinación con 2i, ha resultado en líneas b-ESC-like con mejores características fenotípicas, aunque aún no se tiene evidencia de la

incorporación estable de estas b-ESC-like en fetos bovinos a término (26). La contribución al ICM cuando se inyecta en blastocistos ha

sido evaluada mediante la expresión de proteínas fluorescentes y su contribución en fetos de 60 días ha sido solo confirmada por análisis

de PCR (40). Hasta el momento, la adición de 2i en los protocolos de obtención de blastocistos bovinos obtenidos in vitro no han mostrado

mejoras en el aislamiento de ESC a partir de ellos (41), lo que indica que se necesita de alguna otra señal o interacción entre mecanismos

para mantener la pluripotencia bovina durante el establecimiento y cultivo de ESC bovinas.

4.2. Limitaciones en los protocolos de derivación

Los problemas experimentales al momento de aislar y cultivar ESC de bovinos son diversos y se enumeran a continuación:

• Tiempo de aislamiento e iniciación de los cultivos primarios (estadio embrionario óptimo): se desconoce en la actualidad cuál es el

momento óptimo para aislar células con características de células madre en bovinos. También se desconocen los factores que determinan

con exactitud ese estadio óptimo. La producción in vitro de embriones es una práctica eficiente y relativamente económica utilizada en

bovinos y por lo tanto los blastocistos obtenidos con esta técnica son el material de partida más frecuentemente usado en los intentos de

aislar ESC (27). Se debe tener en cuenta que el patrón de expresión de algunos genes difiere según la fuente de blastocisto empleada

(embriones recolectados in vivo o producidos in vitro). Esta variación debe estudiarse en aquellos genes relacionados con la pluripotencia.

Al respecto, lo estudiado en otras especies indica que el estado naïve se puede capturar in vitro en el rango temporal en que epiblasto e

hipoblasto ha empezado a diferenciarse (expresión en forma de mosaico o llamada también salt and pepper) hasta que se ha establecido

definitivamente como dos estratos bien diferenciados siempre y cuando sea pre implantatorio.

• Disociación y capacidad de propagación: las enzimas utilizadas en la propagación de las posibles colonias de células madre tales como la

tripsina, colagenasa y pronasa utilizadas en los protocolos de aislamiento de m-ESC, cuando se emplean de igual manera para aislar y

propagar células de los blastocistos de humanos y primates disminuyen la eficiencia de replicación en placa hasta menos de 1% (la

eficiencia en el proceso de m-ESC es del 20%). En el caso de bovinos, la eficiencia es similar a la conseguida en humanos, por lo tanto, el

uso de enzimas para la disgregación celular debe ser evitada. Actualmente el agregado de inhibidor de ROCK permite la utilización de


49

TRYPLE (enzima recombinante que puede ser usada como sustituto de la tripsina de origen porcino) para expandir de manera clonal

colonias de h-ESC y aquellas ESC de especies en el que el uso de la tripsina no ha podido utilizarse.

• Marcadores de pluripotencia inespecíficos: en ratones y primates los genes utilizados para identificar una línea con características de

células madre limitan su expresión a las células de la masa celular interna. En bovinos se ha detectado la presencia proteína (NANOG,

SSEA4, TRA-1-81 y TRA-1-60) por inmunofluorescencia tanto en la masa celular interna como el trofoectodermo derivados de

blastocistos producidos in vitro de ocho días de cultivo (42). Kirchoff et al., (2000) detectaron por inmunofluorescencia la presencia

inespecífica de la proteína OCT4 tanto en la masa celular interna como en las células del trofoectodermo de blastocistos de ocho días

producidos in vivo e in vitro (localizados tanto en el núcleo como en el citoplasma) (43). Eijk et al., (1999) también detectaron la presencia

de la proteína OCT4 por la misma técnica tanto en ovocitos como en embriones producidos in vitro, la ubicación de la fluorescencia fue

nuclear en el caso de los estadios embrionarios pre-implantación y difuso después de la formación del blastocele (tanto en la ICM como en

el trofoectodermo) (44). En un estudio más reciente, Kurosaka et al., (2004) estudiaron la presencia del transcripto OCT4 durante el

desarrollo embrionario bovino (ovocitos y embriones producidos in vitro). En dicho estudio se detectó la presencia del mRNA por

hibridación in situ haciendo uso de los transcriptos anti-sentidos marcados con digoxigenina y confirmando mediante RT-PCR. Los

resultados demuestran la presencia de m-RNA de OCT4 materno en los ovocitos bovinos, pero a niveles inferiores comparados con los

detectados en embriones pos-compactación. En bovinos se detecta presencia de m-RNA de OCT4 a partir de embriones de 16 células y su

expresión disminuye en el trofoectodermo de blastocistos. Por tanto, la presencia de m-RNA de OCT4 es específico de la masa celular

interna en embriones bovinos. La discrepancia entre la detección de transcriptos y proteínas en el trofoectodermo puede deberse a que la

proteína (producida quizás en estadios anteriores) es más estable o no es eliminada en forma activa. Su presencia puede tener una función

fisiológica diferencial en embriones de bovinos. Como OCT4 es represor de genes específicos de las células de trofoectodermo (como el

gen del interferón ), su presencia por tanto puede estar implicada en regular la diferenciación del trofoectodermo hacia tejidos

extraembrionarios permitiendo una proliferación extensiva de las células de trofoectodermo durante el período de pre implantación (el cual

es mayor en bovinos que ratones, y en el que se produce la expansión y elongación del blastocisto). Otros genes relacionados a la

pluripotencia ZFP42 (Rex1), TDGF1 (Cripto) y Esg1 (Dppa5) no han sido estudiados aún en bovinos (27).

• Contaminación celular: las células con características pluripotentes se aíslan generalmente del ICM o el epiblasto derivados de los

blastocistos. Este procedimiento se realiza en forma mecánica o por inmunocirugía que consiste en el uso de anticuerpos que atacan

específicamente a las células del trofoectodermo. Se debe realizar una manipulación cuidadosa para evitar la contaminación, y con ello

asegurarse que la expresión génica estudiada se deba específicamente a las células en de interés. Cuando se realizan ensayos de RT-PCR se

debe considerar como control también las células feeder para detectar cualquier interferencia en la expresión génica.

• Diferenciación espontánea: quizás uno de los problemas más ocurrentes a la hora de aislar células madre de epiblasto bovino es la

incapacidad de poder controlar la diferenciación no dirigida. Se puede observar al microscopio después de las 48-96 h de cultivar el

epiblasto sobre feeder layer que las células adquieren formas epiteliales y de características no concordantes con el estado pluripotente.

Las citoquinas y factores de crecimientos utilizados en protocolos de ratón y humano para inhibir la diferenciación espontánea (LIF y

BMP4 o b-FGF y activina respectivamente) no previenen el proceso de especialización celular en los cultivos obtenidos de la ICM o

epiblasto de ungulados. Estudios previos realizados en bovinos demuestran que el problema de diferenciación espontánea durante el


50

cultivo de células provenientes de la masa celular interna sobre fibroblastos se relaciona con una disminución en la expresión génica de dos

de los genes relacionados a la pluripotencia, OCT4 y NANOG (28).

Los problemas señalados en bovinos son en su mayoría comunes y extensibles a las diferentes especies de ungulados. No existen

células pluripotentes bien caracterizadas ni en ungulados ni en animales domésticos, como felinos y caninos. Como se verá más adelante,

los avances tampoco son muy prometedores en la tecnología de generación de iPSC en estas especies. El problema general y persistente de

poder aislar células madre embrionarias y de obtener iPSC sin la expresión exógena de los factores de reprogramación o el establecimiento

de los genes endógenos de pluripotencia señalan un reto común: la inestabilidad de la red de pluripotencia necesaria para mantener el

estado bajo las condiciones de cultivo empleadas hasta el momento.

5. IPSC

5.1. Qué son y cómo se obtienen

Por largo tiempo se creyó que la diferenciación es un proceso de una sola dirección y que por tanto el destino de las células

somáticas es irreversible. El descubrimiento de que las células somáticas especializadas pudiesen volver a un estado no diferenciado fue

propuesto por primera vez décadas atrás cuando Gurdon inyectó el núcleo de células epiteliales de intestino de rana dentro de ovocitos de

rana enucleados y demostró que pueden desarrollarse renacuajos normales a partir del núcleo inyectado (45). Más tarde, la prueba de que

la reprogramación de células de mamíferos es posible se obtuvo con los primeros experimentos de clonación de varias especies (oveja,

vaca, cabra, cerdo) vía transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) (46).

El uso de embriones (principalmente de humanos) para el aislamiento de ESC se enfrenta a problemas éticos y está sujeto a

rigurosas restricciones legales. Reprogramar células somáticas por SCNT es un desafío desde el punto de vista técnico, de procedimiento

laborioso, ineficiente y que requiere en el mejor de los casos de los ovocitos de la especie. A pesar de estos inconvenientes, la tecnología

SCNT sugirió que el ovocito contiene factores que son los capaces de reprogramar las células. Takahashi y Yamanaka identificaron esos

factores y desarrollaron un método definido de reprogramación que fue en principio simple y que deja de lado la manipulación de

embriones u ovocitos para obtener células pluripotentes (47). Las llamadas células madre pluripotentes inducidas (iPSC) fueron generadas

en sus orígenes a partir de fibroblastos embrionarios de ratón por la adición de los factores Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc (OKSM) mediada

por retrovirus y publicadas en el año 2006. Las iPSC humanas se generaron poco tiempo después utilizando un set de factores levemente

modificado OSNL: OCT4, SOX2, NANOG y Lin28 (48). Después del establecimiento de la tecnología en ratón y humano se generaron

líneas iPSC en diferentes especies utilizando el mismo principio (Figura 11). Se han utilizado diferentes combinaciones de factores de

transcripción y condiciones de cultivo, dependiendo de la célula a reprogramar y de la especie. Los avances en la reprogramación de

células en animales domésticos puede a su vez generar información biológica acerca de la pluripotencia en diferentes especies como

condiciones óptimas de propagación por ejemplo, las cuales eventualmente podrán permitir la derivación y propagación de células ESC

derivadas de ICM en animales de granja (25).


51

Figura 11: Número de publicaciones que describen el establecimiento de células pluripotentes en animales domésticos desde el año 2006 a la actualidad. El número de publicaciones de ESC se indica en naranja mientras que las correspondientes a iPSC se encuentran en azul (26).

A su vez, la generación de iPSC se presenta como una alternativa de células pluripotentes en aquellos casos en los que no se

cuenta con ESC. Aunque esto es cierto en forma acotada, ya que como discutiremos más adelante la dificultad de obtener ESC y de

mantener iPSC de animales de granja probablemente tengan en común la misma raíz del problema técnico que aún queda por resolver.

Se ha demostrado que los factores de transcripción humanos y de ratón pueden reprogramar células de diferentes especies de

mamíferos, así como también de vertebrados no mamíferos e invertebrados. Este hecho demuestra que hay una alta conservación de los

genes relacionados a la pluripotencia a través de un amplio rango filogenético (Tabla 11).


52

Tabla 11: Similitud (%) de las secuencias de aminoácidos de OKSM y NANOG de diferentes especies comparadas con humano/ratón (25)

Especies OCT4 SOX2 Klf4 c-Myc NANOG

Cerdo 93/86 (NP_001106531)

99/97 (NP_001116669)

96/92 (NP_001026952)

93/91 (NP_001005154)

75/58 (ABS83566.1)

Caballo 94a/86a

(XP_001490158) 98a/96a

(ACJ12602) 94a/91a

(XP_005605741) 92a/91

(XP_001498041) 76a/55a

(XP_001498858.1) Conejo 90/85

(NP_001093427) 98a/99a

(ACJ97786) 96a/92a

(ACJ97787) 94a/92a

(XP_008254124) 56a/47a

(AJC97783.1) Oveja 91/84

(XP_004019017) 100a/98a

(CAA65725) 96/93

(NP_001157691) 93/92

(NP_001009426) 71a/55

(XP_012017724.2) Vaca 91a/84a

(NP_777005) 100/98

(NP_001098933) 96/93

(NP_001098855) 92/91

(NP_001039539) 69/56

(NP_001020515.1) Cabra 91/84

(NP_001272498) 97/96

(NP_001272601) 96a/92a

(XP_005684447) 92a/92a

(XP_005689000) 70/55

(AAW50709.2) Humano 100/86

(NP_002692) 100/98

(NP_003097) 100/92

(NP_004226) 100/90

(NP_002458) 100/56

(AAP49529) Ratón 86/100

(NP_038661) 98/100

(NP_035573) 92/100

(NP_034767) 90/100

(NP_034979) 56/100

(AAP92157.1) El número de acceso de Genbank se marca entre paréntesis.

a: la similitud se basa en secuencias predichas o no curadas.

OCT4 es la proteína de reprogramación menos conservada de los factores de Yamanaka entre las especies, aunque aún exhibe

un alto porcentaje de similitud, del 89% entre los animales de granja y humanos y 84% comparado con ratón. SOX2 es la proteína más

conservada (por arriba del 95 % en todas las especies comparadas), mientras que Klf4 y c-Myc exhiben por arriba del 90% entre todas las

especies. La identidad de las secuencias entre los animales de granja ronda los 95 % para todos los factores de transcripción y alcanza un

98-100 % entre especies relacionadas (por ejemplo, los rumiantes). Los factores de humano y ratón se usan para reprogramar células de

animales ya que en algunas especies las secuencias no se conocen o porque los vectores con secuencias de humano y ratón están

comercialmente disponibles. Basado en las secuencias se aconseja utilizar los factores de humanos en vez de los de ratón para reprogramar

células de animales de granja (Tabla 11). Sin embargo, la evidencia empírica demuestra que los factores de ratón también pueden ser

utilizados exitosamente para reprogramar células de animales de granja (por ejemplo, en porcino, ovino y equino). Finalmente hay que

destacar que la secuencia de aminoácidos de NANOG difiere en mayor grado comparadas con ratón y humano, por lo que es probable que,

de agregarse en los protocolos de reprogramación de especies rumiantes, esta debe ser en la versión especie específica, si lo que se espera

es obtener mejores resultados.

Las metodologías de reprogramación se dividen en dos grandes grupos: los que ingresan los factores de reprogramación

exógenos al interior de la célula y posteriormente modifican la expresión de los endógenos y los que directamente modifican la expresión

de los factores endógenos (Figura 12).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/154622684?report=genbank&log$=prottop&blast_rank=79&RID=SUBXVKKV01R






53

Figura 12: Métodos de generación de iPSC (49)

Sin entrar en grandes detalles de cada uno de los diferentes métodos mencionados en la Figura 12, debemos señalar aquí que al

momento de reprogramar el núcleo de una célula somática hasta el estadio de una célula madre lo más importante al principio, desde el

punto de vista tecnológico, es la eficiencia en la generación de las iPSC (Tabla 12) pero lo más desafiante en la tecnología iPSC es el

mantenimiento y activación de los genes endógenos durante el cultivo a largo plazo.

Tabla 12: Eficiencia de generación de h-iPSC a partir de fibroblastos de piel en humanos, revisado en (50)

Métodos Lentivirus Lentivirus policistrónico STEMCCA

Retrovirus Episomas Minicírculos

miRNAs Proteínas Sendai virus

mRNA

Eficiencia (%)

0.022 0.01 a 1.5 <0.01 a 0.02

0.003 a 0.006

0.002 0.001 0.01 a 1 >1

Integración Sí Sí Sí No No No No No

5.2. Mecanismos y etapas de la reprogramación

Una reprogramación exitosa requiere del restablecimiento de las características de las PSC a nivel transcriptómico y

epigenómico partiendo de la base de una célula diferenciada. Por tanto, las características transcripcionales y epigenéticas de la célula

donante que la definen deben ser “borradas” y “reescritas” a un estadio similar al que la célula poseía en estado embrionario, en donde la

capacidad pluripotente, es decir su potencial de convertirse en cualquier célula es la principal característica reestablecida.

Células somáticas:(1) uni a multipotentes(2) Limitada diferenciación(3) No forman teratomas

Factores de ReprogramaciónOCT4, SOX2, NANOG, KLF4,

C-MYC, LIN28, GLIS1

Métodos de ingreso de factores Métodos auxiliares

Viral No Viral

Retrovirus

Lentivirus

Adenovirus

Sendai virus

Episomas

DNA minicírculos

RNAs

PRs

PiggyBac(transposón)

Sleeping Beauty

(transposón)

Moléculas pequeñas Células madre somáticas

Expresión endógena de los

factores de reprogramación

Inhibidor de ERK

Inhibidor de MEK

Modificadores epigenéticos

iPSC: (1) Pluripotentes(2) Diferencian in vitro(3) Forman teratomas(4) Forman quimeras(5) Trasmiten por la línea

germinal


54

En la actualidad el proceso de reprogramación ha sido descrito como una serie de fases que la célula transita y que se definen

por cambios específicos (Figura 13 y Tabla 13).

Figura 13: Fases de la reprogramación. Cinética de la aparición de marcas relacionadas a la pluripotencia (30)

Las mismas se componen por la fase de iniciación, la de maduración y la de estabilización. Conocer las diferentes etapas de la

reprogramación, así como los eventos que la caracterizan ayuda a establecer condiciones de cultivo apropiados para favorecer a alguna de

ellas. También es importante para establecer metodologías de análisis o evaluación basadas en lo que se espera encontrar en cada fase, de

manera que con ello logremos identificar si se ha alcanzado la misma o no con nuestras células y nuestros protocolos.

Tabla 13: Cambios de expresión génica y epigenética ocurridos durante el proceso de reprogramación. Los genes en verde incrementan su expresión y los de color rojo la disminuyen. Las marcas epigenéticas en verde están asociadas a loci activos mientras que los de rojo están relacionados a reprimidos. Las flechas arriba y abajo indican incremento o disminución. (30)

Cambios en la expresión ocurridos durante la reprogramación

Iniciación Maduración Estabilización Genes mesenquimales: Snai1/2, Zeb1/2, Slug

Genes de pluripotencia: Oct4, Sall4, Nanog, Sox2, Esrrb, Lin28, Dppa2, Tcl1, Nr5a2, Sox2 (tarde)

Genes de pluripotencia tardía

Genes epiteliales: Cdh1, Epcam, Cldn3,4,7,11, Ocln, Crb3

Genes de la línea germinal: Mnd1, Mutyh, Rad54b

Metilación de DNA: AID, Tet y la familia Dnmt

Genes de pluripotencia tempranos: Alpl, Genes del citoesqueleto: Tuba3a, Pdzk1, Genes de la célula diferenciada: Borrado


55

Cambios en la expresión ocurridos durante la reprogramación

Iniciación Maduración Estabilización Fbxo15 Itgb7, Kirrel2 progresivo de la memoria epigenética de la

célula de origen, parcial o completa. Circuito de regulación: Jarid2, Rif1, Tcf3, Eed

Genes de señalización RET: Nrtn, Kif26a

Regulación de la transcripción: mediator, TAF, RNA Pol II, Nurd

Genes respuesta de la hipoxia: ALDOC, ENO3, PKM2, Pfkl, GPi, Pgk1

Genes de replicación del DNA: Poli, Rfc4, Mcm5, y de la progresión del ciclo celular: Ccnd1, Ccnd2.

Genes epidermales: Ehf, Elf5, Krt17, Krt6a

Genes de estrés: Cdkn1a, Cdkn2a Genes reporteros: Oc4-GFP o Nanog-GFP Marcadores de superficie: SSEA1, CD73, CD49d, CD200. THY1 Cambios epigenéticos ocurridos en la reprogramación

Iniciación Maduración Estabilización

H3K4me1proliferación y genes del metabolismo

H3K9me3genes de pluripotencia tardía H3K9me3 genes de pluripotencia tardía

H3K4me2 proliferación, metabolismo, pluripotencia, MET genes de MEF y EMT

H3K36m3 genes de pluripotencia tardía H3K36m3 genes de pluripotencia tardía

H3K4me3proliferación y metabolismo H3K79me2 genes MEFs y EMT DNA-5mC genes de pluripotencia X cromosoma en XX Genes OKSM de lentivirus

H3K27me3 genes de MEF y EMT H3K27me3 incremento gradual (binomios)

DNA-5mC genes mesenquimales

H3K27me3reducción global H3K36me2genes de pluripotencia temprana H3K36me3genes de pluripotencia temprana H3K79me2genes MEF y EMT

En la fase de iniciación los fibroblastos de ratón transitan por una transformación mesenquimal a epitelial, cambian su tasa de

proliferación y aumentan la expresión de los marcadores de PSC. Alrededor del día 3 después del comienzo de la expresión de OKSM, se

produce un pico en la onda de cambios globales en la transcripción que involucra mRNAs, miRNAs y lncRNAs. Progresivamente las

células se convierten a THY-/SEEA1+ (estadio intermediario en la reprogramación), aunque no todas las células SSEA1+ generan células


56

totalmente reprogramadas. Se ha demostrado que las MEFs con expresión de CD73, CD49d y CD200; Nr0b1 y Etv5 tienen mayor

predisposición a la reprogramación y generación de iPSC.

Al principio de la fase de maduración existe un período de estado estacionario en la transcripción seguido de una segunda ola de

cambios transcripcionales y proteómicos en los días 9-12. Los genes que afectan el desarrollo, la pluripotencia y la respuesta a la hipoxia

son sobre-expresados en esta etapa. También se vuelven a expresar los genes silenciados en la iniciación, relacionados al transporte

vesicular, matriz extracelular, adhesión celular y EMT. La fase de maduración termina con un marcado incremento en la expresión de

Sox2, Pecam y otros genes de pluripotencia que ayudan a establecer la red endógena que sostiene a la pluripotencia de manera

independiente de los genes exógenos. El silenciamiento de los genes OSKM exógenos es la marca más contundente de la finalización de la

fase de maduración. Los genes de pluripotencia (Esrrb, Utf1, Lin28, Dnmt3l, Pecam y Dppa2), de la línea germinal y de citoesqueleto

toman importancia en la transición de esta fase a la siguiente.

La fase de estabilización comienza cuando las iPSC se vuelven independientes de la expresión exógena de OSKM. En este punto

los telómeros se alargan en forma activa alcanzando los niveles embrionarios, el DNA sufre transformaciones radicales como la

reactivación de las dos copias del cromosoma X en las iPSC provenientes de fibroblastos de hembra y las marcas de 5mC se remodelan en

correlación con la sobreexpresión de los genes relacionados a la metilación del DNA.

5.3. Limitantes en animales de granja

Los estudios llevados a cabo en animales de granja demuestran que la utilización de factores de transcripción especie

específicos, humanos y de ratón son capaces de generar células reprogramadas. En la mayoría de los casos el set OSKM es suficiente para

reprogramar las células de interés. En muchos casos, NANOG y Lin28 se añaden a la mezcla de factores y/o la expresión de los factores de

transcripción se acompaña de la adición de compuestos químicos pequeños o la expresión del antígeno SV40T, la subunidad catalítica de

la transcriptasa reversa de la telomerasa humana (hTERT) o los micro RNA 302/367 para aumentar la eficiencia de reprogramación y la

estabilidad de las iPSC. Por lo publicado hasta el momento, al parecer las especies rumiantes requieren la expresión de NANOG, Lin28 y/o

SV40T y TERT. En la mayoría de los casos se ha utilizado métodos de integración (vectores virales y transposones) para reprogramar

células de animales de granja. Únicamente se ha publicado el uso de vectores no integrativos episomales, en porcinos. No hay reportes de

reprogramación con métodos no integrativos como los virus no integrativos y los mRNA). La expresión de los factores exógenos en su

mayoría es controlada por promotores constitutivos (CMV, EF1) y en algunos casos por el promotor inducible controlado por

tetraciclina. Los fibroblastos se usan en general como fuente de células diferenciadas.

En la mayoría de los estudios la pluripotencia ha sido demostrada por el uso de marcadores moleculares, diferenciación in vitro

y formación de teratomas. La contribución a la línea germinal no se ha analizado, y en los estudios en lo que se ha llevado a cabo las

células no son competentes para la trasmisión del transgen por la línea germinal, por tanto, la mayoría de las iPSC publicadas no cumplen

con el criterio de pluripotencia en su sentido más estricto y deben considerarse células iPSC-like. En un solo estudio en porcinos se ha

demostrado la trasmisión por línea germinal (51) sin embargo, la prueba se basa en la detección por PCR de los factores de transcripción

provenientes del vector viral, en la que demuestran un alto porcentaje de complementación de iPSC en blastocistos y la que puede estar


57

sujeta a artefactos en la técnica de detección por la contaminación con DNA genómico. La trasmisión por la línea germinal de estas

quimeras es baja (2 de 43 fueron transgénicos). También se ha utilizado la expresión de proteínas fluorescentes fusionadas a los factores de

reprogramación, pero las evidencias se limitan a demostrar su presencia en embriones y fetos en desarrollo, más que en animales nacidos.

Por lo tanto, hasta el momento no existen reportes de iPSC de animales de granja que produzcan fehacientemente y en forma sistemática

descendencia fértil de animales transgénicos (Tabla 14).

Tabla 14: Ejemplos de estudios recientes publicados en la generación de iPSC de animales domésticos (26)

iPSC Felinos Caninos Ovinos Porcinos Bovinos Equinos

Autores, feeders y medio Verma et al., MEF 1000 U/ml mLIF 20 % SFB

Koh et al., MEF 2i, 10 ng/ml hFGF2 1000 ng/ml hLIF 20 % KSR

Sartori et al., SNL LIF, 8 ng/ml hFGF2 20 % KSR

Gao et al., MEF 10 ng/ml FGF2 1000 U/ml LIF 10 % SFB, 10 % KSR

Talluri et al., MEF 8 ng/ml FGF2 1000 U/ml LIF 20 % KSR

Nagy et al., MEF+EFF 10 ng/ml hFGF2 1000 U/ml LIF 15 % SFB

Marcadores de pluripotencia + + + + + + Diferenciación a EBs No evaluado + + + + + Cultivo a largo plazo + + + + + + Teratomas + + + + + + Trasmisión por la línea germinal

- - - - - -

Esto se puede deber a que en general los animales de granja siguen expresando los factores exógenos y no estabilizan la red de

pluripotencia endógena.

Particularmente el grupo de Ezashi et al.,(2016) señala que las condiciones que permiten la derivación de iPSC porcinas a partir

de fibroblastos y con el uso de vectores lentivirales en medio con FGF2 fallan en el caso de la obtención de iPSC de bovinos (26). No es

sorprendente entonces que la mayoría de los estudios en bovinos utilicen además LIF en sus protocolos de derivación. En seis de los

reportes de iPSC bovinas se utiliza LIF y FGF2 en ausencia de 2i, la mitad de estos generan células con características primed. Se han

reportado células con algunas características naïve cuando se utiliza solo LIF acompañado de 2i o BMP4. Un solo estudio reporta el uso de

transposones para generar b-iPSC a partir de fibroblastos, aunque en este los factores exógenos siguen activos (52).


58

6. HIPÓTESIS DE TRABAJO

Tras la revisión del estado del arte podemos afirmar que la especie bovina tiene características deseables para la producción de

proteínas recombinantes y el desarrollo de células pluripotentes de esta especie constituirá un avance tecnológico que representará un gran

salto en la forma de llevar a cabo la producción de las mismas. Asimismo, es probable que, de lograrse avances en el entendimiento de la

biología del desarrollo bovino y su relación con el mantenimiento de la pluripotencia, estos constituyan un punto de partida para otras

especies en pos de resolver los problemas que se presentan como comunes a todos los animales de granja durante el aislamiento de ESC o

generación de iPSC.

La hipótesis que se plantea entonces es que la modulación de vías de señalización de mecanismos relacionados con la diferenciación

y pluripotencia permitirá establecer un protocolo de cultivo de células madre acorde a esta especie.

7. OBJETIVO GENERAL

Estudiar los mecanismos involucrados en la pluripotencia durante el desarrollo embrionario temprano en bovinos y aplicar estos

conocimientos en el establecimiento de una plataforma tecnológica para producción de bovinos transgénicos con fines productivos

(molecular pharming).

8. OBJETIVOS PARTICULARES

Esta tesis se centra en dos ejes fundamentales, desarrollados en forma de dos capítulos independientes cuyos objetivos son:

1. Modulación de vías de señalización en el embrión bovino producido in vitro y estudio de su efecto en el segundo evento de

diferenciación y en el establecimiento de líneas de células madre embrionarias bovinas.

2. Reprogramación de células bovinas diferenciadas mediante el empleo de diferentes estrategias y modulando diferentes vías de

señalización.

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre CAPÍTULO

1

59

PRODUCCIÓN IN VITRO DE EMBRIONES: MODULACIÓN DE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN EN EL ESTABLECIMIENTO

DE LA PLURIPOTENCIA BOVINA.

1. MARCO TEÓRICO

1.1. Desarrollo embrionario temprano en mamíferos

Conocer las diferentes etapas del desarrollo embrionario y la biología comparada entre especies brinda las bases necesarias para

establecer lo que sucede durante dicho proceso y determinar con ello tanto los mecanismos conservados así también como las

diferencias en el proceso de especificación de la pluripotencia durante el desarrollo temprano de mamíferos.

1.1.1. División celular en mamíferos

Durante el proceso de ovulación de los mamíferos el ovocito es liberado por el ovario y atrapado por las fimbrias del

oviducto en donde puede ocurrir, previo coito, la fecundación del mismo. En este momento se completa la meiosis, y la primera

división celular tras la fecundación ocurre al día siguiente (entre las 12-24 horas). Mientras ocurre la división, las cilias del oviducto

desplazan al embrión hacia el útero.

La mitosis celular continúa en forma asincrónica, por lo que los blastómeros no se dividen todos al mismo tiempo, y no

crecen en forma exponencial de 2-4-8 células. Es esta la razón por la cual se pueden encontrar embriones de mamíferos con un

número impar de células (53). El genoma del embrión se activa durante la división celular para producir las proteínas necesarias para

que esta ocurra (en ratones y ovejas ocurre en el estadio de 2 células, en bovino en el estadio de 8 células) (54). Los blastómeros de

ratón, en la etapa de 8 células se compactan maximizando el contacto entre ellos. Este arreglo empaquetado es estabilizado por

uniones que se forman entre las células exteriores del embrión, mientras que las células internas utilizan las uniones para transportar

iones y pequeñas moléculas entre ellas.

Las células compactas del embrión al estado de 8 células se dividen para formar la mórula (Figura 14E). La mórula

consiste en un grupo pequeño de células internas, rodeadas de un grupo grande de células externas. La mayoría de las células externas

se convierten en el trofoblasto (trofoectodermo, TE). Este grupo de células se diferencia luego en el corión, parte de la placenta que

proviene del lado del embrión y que este utiliza para tomar el oxígeno y nutrientes de la madre. El corión secreta hormonas que son

responsables de que el feto sea retenido en el útero materno y produce reguladores de la respuesta inmune responsables de que la

madre no rechace el embrión, como lo haría en un trasplante de órganos.


1

60

Figura 14: División celular in vitro de un embrión de ratón. A: 2 células. B: 4 células. C: 8 células. D: 8 células compactas. E: mórula. F: blastocisto. (fotografías de J. G. Mulnard.)

El embrión de ratón propiamente dicho deriva de las células internas del estadio de 16 células, junto con algunas células

del trofoblasto durante la transición al estadio de 32 células. Este conjunto de células genera la masa celular interna o macizo celular

interno (ICM), que se diferencia posteriormente al cuerpo del embrión, al saco vitelino, amnios y alantoides. En el estadio de 64

células, el ICM (aproximadamente 13 células) y el trofoblasto se separan en dos capas de células bien definidas dando lugar a la

formación del blastocisto. Las células del trofoblasto poseen bombas Na+/K+ cuya actividad conlleva al establecimiento de gradientes

iónicos a través de las células de trofoectodermo, y por ende a la acumulación de líquido en la cavidad denominada blastocele (55).

En ratones, Oct4 (56) y Cdx2 (55) se han identificado como factores requeridos en la primera especificación celular del

embrión (en células de trofoectodermo e ICM) (Figura 15). Oct4 es expresado en todas las células del embrión (blastómeros) en las

etapas tempranas de desarrollo, pero se vuelve específico de las células de la masa celular interna durante la formación del

blastocisto. La diferenciación de las células externas de la mórula en células de trofoectodermo comienza con anterioridad a la

disminución de Oct4 en dichas células, y es promovida por la expresión de Cdx2 (55). La expresión del mRNA de Cdx2 es detectado

por primera vez en el estadio de 8 células, mientras que la proteína se ha detectado en el núcleo y el citoplasma de las células externas

de la mórula y la mórula tardía. Se ha detectado pequeños niveles de proteína en el citoplasma de las demás células en dichos

estadios; sin embargo la expresión, y por tanto la detección de la proteína, se vuelve más específica de las células externas en el

blastocisto temprano y del núcleo de las células del trofoectodermo en el blastocisto expandido.

Figura 15: Diagrama esquemático del desarrollo temprano en ratones (57)

Blastocisto

temprano

Morula Blastocisto

tardío

Estadio pos

implantatorio

TE

ICM

Ectodermo

extraembrionario

Endodermo

parietal

Endodermo

visceral

Blastocele

Endodermo

primitivo

Ectodermo

primitivo

Células

somáticas:

Ectodermo

Mesodermo

endodermo

Células

germinales

Epiblasto

Cavidad

proamniótica


1

61

Mientras el embrión se mueve a través del oviducto yendo hacia el útero, el blastocisto se expande saliendo de la zona

pelúcida (ZP, matriz extracelular esencial para la unión del espermatozoide durante la fecundación). Las membranas plasmáticas de

las células de trofoblastos contienen bombas de sodio (Na+/K+-ATPasa) del lado del blastocele, que transportan los iones Na+ hacia

la cavidad central. La acumulación de sodio promueve la entrada de agua por ósmosis de manera que el blastocele aumenta de

tamaño. Durante este proceso, la zona pelúcida evita que el blastocisto se adhiera a las paredes del oviducto evitando los eventos de

preñez ectópica. Cuando el blastocisto llega al útero debe entonces salir de su envoltura proteica para poder adherirse a la pared

uterina. Esto ocurre simultáneamente a haber completado la primera diferenciación (Figura 16), y el desarrollo del embrión en este

momento se retrasa hasta haber completado la implantación. Mientras esto ocurre, la masa celular interna le provee activamente al

trofoblasto proteínas que ella misma secreta (tales como FGF4) y que promueven la división de este último.

Figura 16: Implantación de blastocistos de mamíferos en el útero. A: Blastocistos de ratón ingresan al útero. B: implantación inicial de blastocistos de mono.

El blastocisto de ratón protruye de la ZP a través de un hoyo realizado mediante lisis enzimática con estripsina, que es una

proteasa parecida a la tripsina, que se encuentra en las membranas de las células de trofoblastos. Una vez afuera, la pared del útero

(endometrio) atrapa al blastocisto en una matriz extracelular de colágeno, laminina, fibronectina ácido hialurónico, y receptores de

heparina. Las células de trofoblastos poseen integrinas por las que se adhieren a dicha matriz y sintetizan heparina previamente al

proceso de implantación. Una vez en contacto con el endometrio, las células de trofoblasto secretan otra serie de proteasas,

incluyendo colagenasa, estromelisina y activador de plasminógeno que digieren la matriz extracelular del tejido uterino quedando

entonces adherido por sí mismo a la pared del útero.

La segregación posterior de tejidos está representada en la Figura 17. La primera diferenciación de la masa celular interna

resulta en la formación del hipoblasto (a veces también llamado endodermo primitivo, PE). El hipoblasto delimita a la masa celular

interna, separándola de la cavidad denominada blastocele, donde origina posteriormente al endodermo extraembrionario que forma el

saco vitelino. Como en las aves, estas células no forman ninguna parte del nuevo organismo. Las células remanentes de la masa

celular interna encima del hipoblasto se denominan epiblasto. El epiblasto es una capa celular que se divide y forma el epiblasto

embrionario y la cavidad amniótica. Una vez que se completa la formación del amnio este se llena de líquido amniótico que sirve de

protector del embrión, así como también previene la desecación del mismo. El epiblasto embrionario es el que dará origen al cuerpo

embrionario durante el posterior desarrollo en un proceso llamado gastrulación.

Los marcadores moleculares identificados en la segunda diferenciación celular del embrión de ratón, es decir aquella que

se lleva a cabo en la masa celular interna para generar las células del endodermo primitivo y el epiblasto, se muestran en la Figura 15.

Nanog es un factor de transcripción que se expresa en la masa celular interna del embrión de ratón, y se vuelve específico de las

células del epiblasto durante la segunda diferenciación. Este factor es el encargado de reprimir la diferenciación a endodermo

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK10052/figure/A2617/?report=objectonly


1

62

primitivo de las células del epiblasto, así como Oct4 se encarga de inhibir la diferenciación de la masa celular interna a

trofoectodermo en la primera etapa. En las células externas del embrión, Cdx2 se encarga de reprimir la expresión de Oct4 y Nanog

en las células de trofoectodermo, mientras que Gata6 inicia y promueve la diferenciación a endodermo primitivo, y este a endodermo

parietal y visceral que forman el saco vitelino (57).

Figura 17: Diagrama esquemático de la derivación de tejidos en embriones de humanos y monos (58).

1.1.2. Diferencias en el desarrollo temprano de mamíferos

El desarrollo embrionario temprano previo a la formación del epiblasto no sigue temporalmente el mismo programa en

ratón y ungulados (59). En ratón, el primer evento de diferenciación, caracterizado por la formación de la masa celular interna y el

trofoblasto ocurre en el día 3.5 dentro del lumen uterino. Entre los días 3.5 y 4.5, se forma una capa adicional de células (endodermo

primitivo o extraembrionario) en la base de la masa celular interna que eventualmente delimita la cavidad blastocélica (Figura 18).

Los eventos previos a la formación de estas tres capas se realizan en períodos cortos de tiempo en el ratón, pero en muchas especies

este período es bastante extendido. Por ejemplo, en humanos, cerdos y vacas la formación del blastocisto y su extrusión ocurre varios

días después que en ratón. En el ratón las células de la masa celular interna proliferan rápidamente entre los días 5.5 y 6.5 y forman el

epiblasto, el precursor de las líneas germinales embrionarias. El epiblasto formado persiste durante un corto tiempo hasta que se inicia

la gastrulación en el día 6.5. En ungulados, la masa celular interna es pequeña comparada con el trofoectodermo antes de la extrusión,

pero comienza a emerger en el día 6 y persiste por un período de tiempo mayor que en los ratones. Alrededor del día 10 en cerdos y

12 en vacas una fina capa de células de trofoectodermo que rodean el epiblasto (llamada la capa Rauber) se degenera exponiendo al

epiblasto al contenido del lumen uterino, y por tanto en contacto directo con el epitelio del útero. Esta exposición del epiblasto

Blastocisto

ICM

Epiblasto

Hipoblasto

TE Citotrofoblasto Sincitiotrofoblasto

Endodermo

extra

embrionario

Saco

vitelino

TEJIDOS

EXTRA-

EMBRIONARIOS

Mesodermo extra-

embrionario

TEJIDOS

EMBRIONARIOS

Ectodermo

Extra-

embrionario

Epiblasto

embrionario

línea

primitiva

Ectodermo

embrionario

Endodermo

embrionario

Mesodermo

embrionario


1

63

Frum et al.,

coincide con la iniciación de un período de rápido crecimiento del embrión. En el cerdo, por ejemplo, el blastocisto expandido, que

existe como una vesícula esférica de 8 a 10 mm de diámetro en el día 10, elonga adoptando una forma filiforme de hasta un metro de

largo en unos pocos días. Este crecimiento y reorganización afecta principalmente al trofoblasto y el endodermo primitivo, pero no al

epiblasto, y probablemente refleja la necesidad creciente de nutrientes por parte del embrión, por lo que aumenta el área de contacto

con la madre y con ello adquiere grandes cantidades de nutrimentos provenientes de la secreción uterina.

Figura 18: Desarrollo embrionario pre-implantatorio en ratón. E se refiere al número de días después de la fecundación que se toma como E0.0 (60)

Finalmente, mientras que las células del trofoectodermo de ratón se adhieren e invaden el endometrio en el día 4.5 después

de la fecundación, el período de implantación es retrasado hasta el día 12-14 en los ungulados, y termina entre los días 17-19 en cerdo

y 19-20 en vacas. Resumiendo, en cerdos y vacas el período pre-implantación es mayor que en humanos y ratones, y corresponde a

una expansión de las células de trofoblastos y un retraso del crecimiento del embrión. Por lo tanto, el estadio embrionario en el cual

se establecen los cultivos celulares de ESC en vacas y cerdos podría no corresponderse con el de otras las especies más estudiadas

(ratón y humano) (59).

Maddox-Hyttel et al. 2003, realizaron un estudio de microscopia para seguir los cambios producidos durante el desarrollo

temprano de embriones bovinos obtenidos in vivo (61). En la Tabla 15 se muestran las imágenes obtenidas por microscopio

electrónico de trasmisión (TEM):


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64

Tabla 15: Estructura general de embriones bovinos protruidos (61)

Desarrollo embrionario en bovinos Descripción Día 9

Células de trofoectodermo (T) de forma cuboidal, a excepción de la parte por encima de la ICM donde se alargan para formar una fina capa denominada capa Rauber (RL). Células del hipoblasto (H) sobre la cara interna de la ICM y el trofoectodermo (la diferenciación inicia en el día 8 y termina en el día 10). El embrión va transformando su forma esférica a ovoidal.

Día 11

Células de trofoectodermo (T) cuboidales. Desintegración focalizada de la capa Rauber (marcado en cuadrado). Hipoblasto como capa delgada y continua rodeando el epiblasto y el trofoectodermo. ICM diferenciado a epiblasto (E). Existen uniones intercelulares entre las células de trofoectodermo entre sí, las del epiblasto y las del hipoblasto.

Día 14

Embrión de forma tubular (le elongación se lleva a cabo entre los días 12-14). El largo aproximado es de 0.5 mm a 19 mm. El epiblasto ha desplazado la capa Rauber y establecido el disco embrionario (ED) de 0.10 - 0.44 mm. Epiblasto y trofoectodermo forman un epitelio continuo delimitado internamente por el hipoblasto (escamoso debajo del trofoectodermo y cuboidal debajo del epiblasto). En algunos embriones se inicia la formación del amnio. Se forman los pliegues amnióticos (AF) en la capa de trofoectodermo adyacente al epiblasto.

Día 21

El tamaño aproximado del embrión y sus anexos es de 30 cm. El embrión propiamente dicho mide entre 0.78-5.79mm. Formación gradual del tubo neural (NT) y el notocorda (N) en el extremo del endodermo (E). El mesodermo se divide en mesodermo somático (SM) que delimita la cavidad amniótica (A), y el mesodermo esplánchico (SpM) que delimita el hipoblasto.

1.2. Mecanismos y factores de transcripción involucrados en el establecimiento de la pluripotencia


1

65

En el embrión pre-implantatorio de ratón, el epiblasto expresa genes de pluripotencia Oct4, Sox2 y Nanog, mientras que la

identidad de las células del PE se va adquiriendo por la activación secuencial de Gata6, Pdgfra, Sox17, Gata4 y Sox7 (62). La

habilidad de las células del macizo celular interno para auto-replicarse como ESC se adquiere durante el desarrollo embrionario en la

especificación del epiblasto, lo que define a este tipo celular como el origen de la pluripotencia naïve in vivo.

Figura 19: Expresión Génica en el desarrollo embrionario temprano de ratón (62)

La Figura 19 muestra que los genes característicos del estadio de mórula (Dppa3 y Oct4) son activamente transcriptos en el

estadio E.2.5. En E3.5 y E4.0 el ICM expresa Nanog, Sox2, Klf2, Klf4, Bmp4 y Fgf4(62). En este mismo estudio se demuestra además

que los marcadores de PE Gata6, Sox17, Gata4 y Pdgfra son sobre-expresados en las células Pdgfra:GFP positivas del embrión

separadas por cell sorting para su análisis y caracterización con el fin de identificar marcadores del hipoblasto. Nanog se expresa en

altos niveles en el ICM de blastocistos tempranos y medios, pero disminuye en el epiblasto pos-implantatorio. Klf4 es expresado en el

epiblasto y PE mientras que Klf2 es específico del epiblasto de ratón. En el estadio E5.5 la expresión de Fgf5, Nodal y Lef1 se

incrementa en el epiblasto. Los marcadores de pluripotencia naïve de las ESCs Tbx3, Klf2, Klf4, Klf5, Dppa3, Fbxo15, Zfp42 y

Tfcp2l1 son específicos del desarrollo pre-implantatorio. En el mismo estudio se demuestra por el análisis de componentes principales

que la mayoría de las muestras de m-ESC cultivadas en 2i tienen una alta similitud con el epiblasto pre-implantatorio E4.5, una

tendencia que se incrementa en presencia de LIF.

Respecto a los mecanismos activos durante el desarrollo embrionario, la Figura 20 muestra que Socs3, un blanco directo y

regulador negativo de JAK/STAT tiene un pico de expresión al estadio de 8 células y va disminuyendo progresivamente en el


1

66

tiempo. En el ICM de blastocistos tempranos, se expresa Bmp4, el cual alcanza su pico en el epiblasto de E4.5 y luego disminuye. La

expresión de los efectores ríos debajo de Bmp4, Id1 e Id3, sugieren que la vía BMP es activa en el epiblasto. A partir del estadio E4.5

en adelante los genes asociados al mecanismo de activina/nodal tales como Nodal y Acvr2b y sus blancos directos Lefty1 y Lefty2

también son sobre-expresados. Los genes asociados al mecanismo de señalización FGF/MAPK son expresados en forma dinámica

durante todo el desarrollo embrionario, mientras que DKK1 un inhibidor de Wnt es sobre-expresado específicamente en células del

PE del estadio E4.5. Estos resultados demuestran que los genes específicos relacionados a la pluripotencia naïve se expresan en la

etapa pre- pero no pos-implantatoria y sugieren que existen diferentes ondas relacionadas a los mecanismos de señalización en el

desarrollo temprano de ratón.

Figura 20: Expresión de genes relacionados a diferentes mecanismos de señalización durante el desarrollo embrionario de ratón (62)

Especial interés toma la vía FGF/MAPK en el ratón durante la especificación del endodermo primitivo, en el segundo evento

de diferenciación del embrión (E3.5-E3.75). La inhibición farmacológica de MAP2K con PD325901 protege a las células del ICM de


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67

las señales inductivas de FGF y bloquea efectivamente su diferenciación. In vivo, previene la diferenciación de las células

pluripotentes hacia el endodermo primitivo, lo que da por resultado embriones en los que el ICM se convierte completamente en

epiblasto (63). El análisis transcriptómico a nivel de célula única demuestra que en el estadio 3.75 existe una cierta heterogeneidad

celular en el ICM. Aquellas células con expresión de marcadores pluripotentes Oct4, Sox2 y Nanog producen Fgf4 al mismo tiempo

que bloquean la expresión de Gata6 (marcador de endodermo primitivo). Este factor de crecimiento tiene un efecto paracrino en las

células adyacentes en los que se expresan los receptores específicos denominados FGFR (Figura 21) y estimulan vía MAPK la

expresión de Gata6. Gata6 actúa a su vez inhibiendo los factores de transcripción relacionados a la pluripotencia y promoviendo la

expresión de Sox17y Gata4. Tanto en las células del epiblasto como del PE se expresa Oct4, y su función en promover los genes de

pluripotencia o diferenciación dependerá del contexto transcriptómico celular. Se ha postulado que Oct4 en presencia de Sox2

promueve la expresión de genes de pluripotencia, mientras que Oct4 en presencia de Sox17 promueve la transcripción de genes

relacionados a la diferenciación (60).

Figura 21: Origen de la heterogeneidad celular del ICM. (60)

Las proteínas de la vía WNT también antagonizan con el mecanismo mediado por FGF/MAPK y pueden ser indirectamente

estimuladas mediante la inhibición parcial de GSK3 (64). La doble inhibición de MAP2K y GSK3 conocida como 2i y

suplementada con LIF provee una forma de cultivo celular definido que bloquea efectivamente la salida de la pluripotencia. Por lo

tanto, el cocktail 2i ha sido utilizado en ratón para propagar in vitro diferentes tipos de células pluripotentes y permitir la derivación

de ESC en estado naïve inclusive de embriones en especies como la rata, en que las condiciones convencionales de LIF y suero no

permitían el establecimiento de ESC (65).

Desde el punto de vista tecnológico, los avances en el conocimiento básico referidos a los genes relacionados a la pluripotencia

y sus vías y mecanismos de promoción y en contraposición, los genes relacionados a la diferenciación y los procesos antagónicos de

especificación celular, han permitido desarrollar sistemas productivos de aislamiento de células madre naïve en ratón y muy


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68

recientemente en humano. La Figura 22 muestra que la captura in vitro del estado pluripotente, que es transitorio durante el desarrollo

embrionario, se logra mediante la combinación correcta de estadio celular y las condiciones de cultivo.

Figura 22: Captura directa de colonias ESC de ratón en un estado transcripcional cercano al epiblasto E4.5 (62)

El cultivo de las células individuales del epiblasto en 2i LIF y sustrato de fibronectina/laminina ha sido utilizado como

plataforma para estudiar el proceso de derivación de m-ESC. Las células del PE se marcaron con un vector dirigido por el promotor

de Pdgfra que expresa GFP y los resultados después de disociar los macizos de estadio E4.5 y cultivar en forma individual cada célula

demuestran que las células GFP negativas generan colonias (3/3) mientras que las GFP positivas son más difíciles de disociar con

enzima y mueren en cultivo a los pocos días de haberse adherido al sustrato. La ventana de tiempo durante el desarrollo embrionario

en que se pudieron establecer ESC de células individuales en condiciones 2i LIF (E3.75-E4.5) se correlaciona con el surgimiento de

epiblasto en el ICM, estadio que también facilita la derivación en condiciones indefinidas (suero-LIF y feeders). Un aspecto técnico

importante señalado en este estudio es que el número de colonias ESC establecidas por este protocolo de derivación a partir de células

únicas es proporcional al tamaño del epiblasto, por tanto, en principio un epiblasto con mayor número de células NANOG positivas

aumentaría la eficiencia de establecimiento de ESC. Los epiblastos de ratón de embriones medios a tardíos suelen tener entre 10 a 20

células, de los cuales se mencionan en el trabajo un promedio en la derivación de 9 colonias por epiblasto E4.5, lo que indica que la

mayoría, si no todas las células del epiblasto, pueden generar naïve ESC. Finalmente, hay que remarcar que las células provenientes

de ICM de embriones E3.25 a E3.5 raramente establecieron colonias por este método en gelatina, sin embargo, si se cultiva en

ausencia del inhibidor PD325901 los primeros días de la derivación, o bien se cultiva en sustrato de laminina/fibronectina que imita el

nicho de células en el embrión, le permite al ICM convertirse en cultivo a un estado similar al epiblasto y por ende adquirir la

competencia para establecer líneas de ESC. Se relaciona a la laminina e integrina con la activación del mecanismo mediado por PI3K,

aunque se requieren de mayores estudios que relacionen a este mecanismo con el paso del ICM a epiblasto en el embrión temprano.

1.3. Planteamiento del problema y justificación

En embriones bovinos y humanos la inhibición de ERK tiene un efecto moderado (bovino) o nulo (humano) en el número de

células GATA6 y NANOG positivas (66), lo que sugiere que otros mecanismos están implicados en la diferenciación del ICM a


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69

epiblasto e hipoblasto. Harris et al., (2013) demostraron por qRT-PCR de embrión entero que NANOG y SOX2 aumentan mientras

que GATA4 disminuye significativamente cuando los embriones de bovino son cultivados in vitro con 2i, sin embargo, esta

inhibición del endodermo primitivo en favor del epiblasto es parcial (41). Otro estudio del mismo grupo muestra, por la misma

técnica de qRT-PCR, que el efecto de 2i en NANOG y SOX17 no es significativo pero que al aumentar la concentración de

PD325901 de 0.4 µM usado en 2i a 10 µM (llamado 2i+) el efecto es similar al obtenido a solo inhibir MAP2K con PD325901, es

decir que aumenta NANOG y FGF4 (utilizados como marcadores del epiblasto) mientras que disminuye SOX17 y Pdfgra

(marcadores de endodermo primitivo) (67). Nuevamente, este efecto en la segregación es parcial, pero determina la importancia de la

vía MAPK como uno de los mecanismos conservados en la diferenciación embrionaria.

2. HIPÓTESIS

Dado que en embriones bovinos ha sido demostrado que el tratamiento con 2i tiene un efecto parcial en prevenir la segregación

del hipoblasto y que en células humanas el medio t2iGö + LIF mantiene la pluripotencia naïve de ESC modificadas genéticamente

con NANOG y KLF2, se plantea que:

• La vía de MAPK es necesaria, pero no suficiente para establecer el endodermo primitivo durante el desarrollo

temprano bovino. Por lo tanto, además de esta vía, otro mecanismo es necesario para el establecimiento del

segundo evento de diferenciación que especifica el epiblasto e hipoblasto bovino.

• La inhibición de PKC junto con el agregado de LIF promueven la inhibición de la segregación de la ICM en

embriones bovinos cultivados in vitro.

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo General

El objetivo general del proyecto es investigar el rol de vías de señalización intracelular en el establecimiento de células

pluripotentes durante el desarrollo embrionario bovino y determinar si su modulación puede ser utilizada para establecer protocolos

de derivación de células madre.

Esta información contribuirá a establecer el estadio embrionario óptimo y las condiciones de cultivo requeridas para aislar

y mantener células madre embrionarias bovinas. Los resultados derivados de este proyecto permitirán a) establecer un paradigma

sobre los mecanismos de señalización que mantienen la pluripotencia en mamíferos b) diseñar estrategias alternativas para hacer más

eficiente el proceso de transgénesis en el bovino a través del uso de las células madre como vector de los genes de interés.

Este proyecto se encuentra en el marco institucional de la mejora genética de animales de granja implementada por INTA

EEA Balcarce, en el cual se enmarca esta tesis doctoral.

3.2. Objetivos Particulares

• Optimizar las condiciones de cultivo in vitro de embriones bovinos libre de suero para reducir los efectos del mismo

en la segregación embrionaria. El objetivo es encontrar condiciones que no afecten la producción pero que produzcan


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70

embriones de alta calidad en los que se pueda luego modular las vías de señalización y evaluar su efecto en el número

de células de diferentes linajes embrionarios.

• Establecer los marcadores de epiblasto e hipoblasto bovino como herramienta en el estudio de la modulación de las

vías de señalización intracelular y el efecto en el segundo evento de diferenciación embrionaria.

• Estudiar el efecto de t2iGöLIF en la segregación del epiblasto e hipoblasto y establecer si hay una interacción entre

los efectos de los inhibidores y la citoquina que como se conoce, activa varias vías de señalización. Asimismo, se

evaluará la producción embrionaria para establecer si los tratamientos afectan la viabilidad además de la segregación.


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71

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Producción in vitro de embriones: FIV corta

En el marco de esta tesis se trabajó con producción in vitro de embriones bovinos, los mismos se produjeron en el

Laboratorio de Biotecnología de la Reproducción de INTA EEA Balcarce durante la puesta a punto de las técnicas analíticas

(Inmunofluorescencia y qRT-PCR). Los embriones utilizados para evaluar el efecto de t2iGöLIF se produjeron en una segunda

instancia en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la FAUBA, en colaboración con el grupo del Dr. Daniel Salamone (FIV

corta) y en el Laboratorio de embriones del Dr. Kevin Sinclair en la Universidad de Nottingham (FIV larga). La producción in vitro

de embriones consiste en tres pasos: maduración ovocitaria, fecundación in vitro y cultivo embrionario. Los protocolos que se

describen a continuación varían ligeramente de un laboratorio a otro según la rutina de trabajo establecida en cada lugar.

4.1.1. Maduración ovocitaria

Se arman placas de cultivo en gota con 100 µl de medio de maduración fresco y cubierto de aceite mineral (Marca Sigma.

Catálogo Número M8410-1L. Embryo cultured tested) para evitar la evaporación de las mismas. En estas gotas se

colocarán 20 ovocitos por gota. La placa utilizada es de 35 cm Corning, cell culture dish 35 mm x 10 mm de poliestireno.

Catálogo 430165.

Se pre-equilibra la placa de maduración al menos 1 hora antes de empezar la colecta. (Nota: este aceite mineral se puede

reutilizar).

El medio de maduración se prepara fresco: TCM199 con 10 % de suero, FSH y cisteamina.

Los ovocitos se colectan en 5-10 ml de TALPH, en un tubo falcon de 50 ml. Ese TALPH se coloca en la estufa para

calibrar la temperatura y se lleva pegado al cuerpo mientras se hace la punción. La aspiración folicular se realiza con

agujas de 21 G en forma manual.

En el momento de la búsqueda se arma la placa de búsqueda con TALPH y se coloca el pellet que se forma en el tubo de

colecta.

Se lavan una vez los ovocitos en una placa de 60 cm con 2 ml de TALPH, allí es donde se colocan los ovocitos que se

encuentran de la placa de búsqueda.

En otra placa similar, se pasa de a grupitos de 20 ovocitos, y se van colocando separadamente para que luego sea más fácil

tomar los grupos que se pasan a la gota.

La maduración se hace en estufa de cultivo con CO2: 6.5 % CO2 y 38.5 °C por 20-22 h.

4.1.2. Fecundación in vitro

Se descongelan pajuelas de toro crio-preservadas en nitrógeno líquido, por lo general se utilizan dos toros: en las

manipulaciones realizadas fueron Pegual y Juan. La cantidad de pajuelas a descongelar depende de la cantidad de gotas a

madurar. Por lo general se descongelan 8 pajuelas en dos tandas de 4 (se busca tener 16 millones/ml de espermatozoides

en 100 µl de gota de medio BO). Se colocan las pajuelas sacadas directamente del nitrógeno líquido (con pinzas,

cuidadosamente) en un baño a 37 °C durante 30 s. Se secan luego con papel previamente mojado con etanol al 70 %.


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72

Se arman dos tubos falcon de 15 ml con 5 ml de medio de lavado SWS. Se centrifuga a 490 g durante 5min. Se retira el

líquido sobrenadante con pipeta y se colocan 4 ml de líquido de lavado por la pared del tubo, de manera lenta y cuidadosa.

Se centrifuga nuevamente a 490 g durante 5 min.

Se saca el sobrenadante de lavado y se colocan 650 µl de cada solución SWS y SDS (o se calcula la cantidad de medio a

colocar para obtener una concentración final de 16 millones por ml). Se arma la placa de fecundación con gotas de 100 µl

con espermatozoides, en una placa de 60 cm y se cubre de aceite mineral.

Paralelamente se lavan los ovocitos maduros en placa de 60 cm con TALPH y luego se traspasan con pipeta p10 a las

gotas con los espermatozoides.

La placa de FIV se coloca en estufa durante 5 h a 6.5 % CO2 y 38.5 °C. Mientras se arma la placa de embriones 35 mm

con medio SOF citrato y 2.5 % de suero, 50 µl por gota, y se cubre con aceite mineral.

Pasadas las 5 h de la FIV corta, se denudan los ovocitos con el fin de quitar la granulosa. Para ello se colocan los ovocitos

en tubo eppendorf de 1.5 ml con solución de hialuronidasa. Se agitan con vortex durante 2 min, y se pasan a placa de 60

mm de TALPH. Se lavan dos veces y se colocan de a 20 en gotas de cSOF (2.5 % suero). Las placas finalmente se

colocan en incubadoras trigaseadas con mezcla de 5 % CO2, 5 % O2 y el resto de Nitrógeno a 38.5 °C.

4.1.3. Cultivo embrionario

A las 48 h pos FIV (se considera como día 0) se retiran las placas de cultivo y se cuentan el número de cigotos que ha

presentado división celular, generalmente entre 2 a 4 células. Se gasea de nuevo la incubadora y se coloca en estufa hasta

el día 5.

Al quinto día se realiza el cambio de medio por medio fresco sin suero, con 0.8 % de BSA o medio N2B27 (control:

DMSO, y tratamientos: LIF y t2iGöLIF). Se inyecta nuevamente la mezcla de tres gases a la incubadora y se coloca en

estufa hasta el día 7, en el cual se evalúa la producción embrionaria. Las muestras se toman a día 8 luego de la protrusión

de los embriones.

Nota: en la puesta a punto del sistema de cultivo embrionario libre de suero se probaron 3 medios diferentes: SOF sin

suero y suplementado con BSA, MC-BGC (medio condicionado por granulosa bovina) y N2B27. Finalmente, el ensayo de

modulación se realizó con medio base N2B27 (desde el quinto día de cultivo, puesto que en ensayos preliminares se

observó una disminución en la tasa global de producción de blastocistos de día 7 si se cultiva en otro medio distinto de

SOF a partir del cigoto hacia adelante).


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4.1.4. Composición de medios utilizados en producción embrionaria (FAUBA)

MC-BGC (utilizado en la puesta a punto, ver anexo)

El medio condicionado MC de granulosa se obtiene al crecer células de granulosa bovina inmortalizada BGC-1 en un

medio base (68). La liberación de proteínas, citoquinas y productos del metabolito de las células secretadas al medio “condiciona” la

composición del mismo. Este medio MC-BGC ha sido utilizado anteriormente para sostener el crecimiento y propagación de las

células madre embrionarias y las pluripotentes inducidas de ratón (69,70), aún sin el suplemento de LIF. La velocidad de propagación

es mayor en este medio que en el medio típicamente utilizado para aislar ESC (69).

Para acondicionar medio, primero se prepara el medio base de acuerdo a la siguiente composición:

Tabla 16: Medio base para acondicionar por cultivo de BGC

Componentes Cantidad Composición final en el medio

DMEM/F12 5x (Gibco. 12100-046 en polvo, se prepara una solución 5X con agua ultrapura)

60 ml 1X

Glutamax (Gibco. A12860-01 100 ml) 3 ml 1 % P/S 100 x (Gibco) 3 ml 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml de

estreptomicina Agua ultrapura c.s.p. Se tiene en cuenta la composición final del

medio Volumen final 300 ml

Por cada 10 ml a acondicionar se agrega 500 µl de solución de bicarbonato de sodio 7.5 %.

Tabla 17: Medio de crecimiento de células BGC-1 (medio BGC)

Componentes Cantidad Composición final

DMEM 5X 10 ml 1X SFB 5 ml 10 % NaHCO3 7.5 % 2.5 ml 375 mg en 100 ml P/S 100x 500 µl 100 U/ml penicilina y 100 µg/ml de estreptomicina Agua ultrapura 32 ml Cantidad necesaria para llevar a volumen Volumen final 50 ml

Se cultivan las células BGC-1 de acuerdo al siguiente protocolo:

• Se colocan 5 ml de medio BGC en un tubo de centrífuga de 15 ml.

• Se transporta el criotubo con las células en frosty hasta la sala de cultivo.

• Se descongela parcialmente el contenido colocando en baño maría a 37 °C.

• Se agrega 1ml de medio BGC al criotubo y se mezcla con pipeta. Se pasa el contenido al tubo de centrífuga

previamente preparado con medio.


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• Se centrifuga a 200 – 400 g durante 5 minutos para sacar el DMSO.

• Se preparan durante la centrifugación placas de cultivo celular p100 con 8 ml de medio BGC y se etiquetan

adecuadamente indicando fecha, tipo celular, pasaje.

• Sobre cubreobjetos se colocan 6 µl de tripan blue en cámara de Neubauer para ver las células.

• Después de la centrifugación se vuelca el sobrenadante, y con el medio que queda en el tubo se resuspenden las

células.

• Se coloca 1 ml de medio BGC al pellet de células y se toma una alícuota para contar en cámara de Neubauer. A

su vez se determina el porcentaje de viabilidad colocando 6 µl de suspensión celular en la cámara previamente

montada (las células teñidas de azul en tripan blue representan las células muertas, en el cual el tinte ha

ingresado al interior celular debido al daño de la membrana).

• Se siembra cada placa con suspensión de BGC.

• Se cultiva durante 24 h en medio BGC a 37.5 °C y 5 % CO2.

• Al día siguiente se lava cada placa con 1ml de PBS estéril (hasta 3 lavados) y se coloca 10-14 ml de medio a

acondicionar de acuerdo a la confluencia celular.

• Se cultiva durante 24 h para su acondicionamiento, y se colecta el MC-BGC. Se filtra por membrana de 0.22

µm y se guarda a 4 °C mientras se recoge el volumen necesario.

Nota: si las células BGC se vuelven muy confluentes, se realiza el split en nuevas placas para acondicionar.

Una vez finalizada la colecta se vuelven a crio-preservar.

Medio N2B27 (para cultivo embrionario sin suero)

Tabla 18: Composición de medio N2B27 (para embriones)

Componente N2B27 (5ml finales)

DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific. Catálogo 12500-062 polvo. Se diluye en agua a una concentración 5X).

2.5 ml (Se prepara 2.5 ml a partir del stock de 5X: 500 µl del stock, 50 µl de P/S 100x, y el resto agua)

Neurobasal (Gibco. Thermo Fisher Scientific. Catálogo 21103-049)

2.5 ml

Suplemento N2 100x (Thermo Fisher Scientific. Catálogo 17502048).

25 µl

Suplemento B27 50x (Thermo Fisher Scientific. Catálogo 175004044).

50 µl

Insulina 14 µl de stock 3.5 mg/ml O 5 µl de I9278 de Sigma Aldrich. (10 mg/ml)

BSA (Sigma Aldrich). 0.8 %

Se mezclan los componentes y se filtra por membrana 0.22 µm. Se agrega además:


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• DMSO: es el solvente de los inhibidores, por tanto, se agrega en la cantidad en que se agregan los inhibidores

en los tratamientos.

• CHO LIF: 125 x

• t2iGö: 1 µM de PD329501 (inhibidor de MEK1 y MEK2), 1 µM de CHIR (inhibidor de GSK3) y 2 µM de

Gö6983 (inhibidor de PKC de amplio espectro).

• t2iGöLIF: la combinación de los antes mencionados.

Stocks:

• CHO LIF: obtenido de cultivo de células CHO en el Laboratorio de Regulación de la Expresión Génica en Células Madre,

FCEN-UBA. El sobrenadante se filtra por membrana de 0.2 µm, se alícuota y se conserva a -20 °C.

• PD325901: inhibidor de MEK1 y MEK2. Catálogo: 4192 (5 mg). Marca: Tocris

Stock: 10 mM, se prepara agregando 1.037 ml de DMSO a 5 mg de inhibidor. Se alícuota y guarda a -80 °C.

• CHIR: inhibidor de GSK3Catálogo: 4423 (5 mg). Marca: Tocris

Stock: 3 mM, se prepara agregando 1.075 ml de DMSO a 5 mg de inhibidor. Se alícuota y guarda a -80 °C.

• Gö6983: inhibidor de PKC. Catálogo: 2466 (10 mg). Marca: Axon Medchem.

Stock: 50 mM, se prepara agregando 447.4 µl de DMSO a 10 mg de inhibidor. Se alícuota y guarda a -80 °C. Se hace una

solución stock intermedia de 5 mM: A 10 µl de 50 mM se agregó 90 µl de DMSO.

4.2. Aislamiento de ESC a partir de embriones tratados en N2B27 t2iGö h-LIF

4.2.1. Protocolo

Se produjeron embriones por FIV de acuerdo a lo detallado en la sección . Producción in vitro de embriones: FIV larga, en

el laboratorio del Dr. Kevin Sinclair de la Universidad de Nottingham durante mi estadía de 7 meses en UK en el año 2015. Los

embriones producidos por FIV, cultivados en BBH7 hasta el día 5 y tratados con N2B27 t2iGö h-LIF hasta el día 8 se disectaron

manualmente con agujas de tungsteno. Los ICM de los embriones protruidos en forma natural durante el cultivo fueron puestos en

pocillos de placas 4 well con m-MEF preparadas previamente de acuerdo al protocolo descrito en la sección 4.2 página 132 del

Capítulo 2. Se incubaron en estufa a 38.5 °C y 5 % CO2 con 5 % O2 durante 7 días, monitoreando cada día, documentando el progreso

mediante imágenes de microscopía y por último analizando por IF.

4.2.2. Reactivos:

Medio N2B27 utilizado para el aislamiento de ESC

El medio N2B27 para células se preparó con leves modificaciones de acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla 19: Medio N2B27 para cultivo de ESC (adaptado de Boroviak et al., 2015)

Componentes medio A Cantidad Componentes medio B Cantidad

DMEM F12 con glutamina 245 ml Neurobasal medium (sin glutamina) 250 ml N2 suplemento (100x) 2.5 ml B27 suplemento (50x) 5 ml BSA 12.5 mg Glutamina (200 mM) 1.25 ml P/S 100x 5 ml Insulina (10 mg/ml). I9278 de Sigma Aldrich. 125 µl


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Se mezclan en un radio de 1:1 el medio A y B. Se agrega mercaptoetanol hasta una concentración final de 0.1 mM. Se

filtró por membrana de 0.2 µm.

Para preparar N2B27 t2iGö LIF se empleó h-LIF: 20 ng/ml (Factor inhibidor de leucemia humano), catálogo: 300-05 (1

mg) de la marca: Peprotech y la mezcla de inhibidores t2iGö: 1 µM de PD329501 (inhibidor de MEK1 y MEK2), 1 µM de CHIR

(inhibidor de GSK3) y 2 µM de Gö6983 (inhibidor de PKC de amplio espectro).

4.3. . Producción in vitro de embriones: FIV larga

En el laboratorio del Dr. Kevin Sinclair en la Universidad de Nottingham, se llevó a cabo el siguiente protocolo de

producción in vitro de embriones:

4.3.1. Maduración ovocitaria

• Previo a la manipulación se preparan fresco el medio de lavado y el de maduración. Ambos se ponen a calibrar en estufa a

38.5 °C armando una placa de 4 wells (Marca Thermo Scientific: Multidish 4 well Nunclon. Catálogo Número 144444)

cada 160 COCs previsto en cultivo.

• Se colectan los ovarios provenientes de matadero y se colocan en termo con PBS para su transporte.

• Una vez en el laboratorio, se lavan con PBS previamente equilibrado a 39 °C. Se colecta el líquido folicular con los

ovocitos aspirando los folículos de 2-10 mm de diámetro; para ello se utiliza una aguja estéril descartable de 21G

insertada en una jeringa de 10 ml. El contenido aspirado se coloca en tubos de 50 ml en incubadora a 38.5 °C, mientras se

finaliza con la tanda a procesar y dejando que decanten los complejos de ovocito-células del cúmulus, también llamadas

células de la granulosa (COCs). El material biológico utilizado finalmente se descarta en bolsas amarrillas para su

disposición como residuo biológico a incinerar.

• Del fondo del tubo de 50 ml se toma con pipeta pasteur el material decantado y se coloca en placa de bacterias de 100 mm

de diámetro estériles, en cuyo fondo se realizó previamente una cuadrícula marcada con aguja u otro objeto punzante; se

le agrega algo de medio de lavado para diluir los restos de tejidos y células indeseables y observar mejor los COCs. Se

busca bajo lupa levantando los COCs de buena calidad (más de dos capas de granulosa y citoplasma homogéneo) con

pipeta p10. Se colocan los COCs en una placa p35 con medio de lavado.

• Se seleccionan nuevamente los COCS a través de un segundo lavado, pasando los mismos a una nueva placa p35 con

medio de lavado pre-equilibrado a 38.5 °C. La búsqueda y los lavados se realiza en platina térmica a 38. 5°C. Finalmente

se colocan de a 40-50 COCS por well con 500 µl de medio de maduración. La placa de 4 wells se lleva a estufa por 22 h a

5 % CO2 y 39 °C.

4.3.2. Fecundación in vitro

Previo a la manipulación, se ponen a equilibrar en estufa el medio de lavado de ovocitos y el medio de fecundación; y a

RT el diluyente bovidilute (Catálogo BD-100 de Nadicon) y el reactivo de sílica para preparar el gradiente: bovipure (Catálogo BP-

100 de Nadicon), por lo menos 2 h antes. Se arma una placa de 4 well con 400 µl de medio de fecundación, en una relación de 1:1

(well de maduración a well de fecundación); se pre-equilibra en estufa a 38.5 °C.


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• Se prepara las fases del gradiente de bovipure de acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla 20: Gradiente de Bovipure para lavado de semen

Concentración Bovipure Bovidilute

90 % 270 µl 30 µl 45 % 135 µl 165 µl

• En un tubo de 1.5 ml se colocan primero 150 µl de 45 % de bovipure y luego por soto posición 150 µl de 90 %

de bovipure. Otra forma de hacerlo es agregar la fracción 90% primero en el fondo y la 45 % por encima con

mucho cuidado, evitando que se mezclen las dos fracciones.

• Se descongela una pajuela de semen almacenada en tanque de nitrógeno líquido, en una probeta con agua

atemperada a 38 °C durante 1 minuto como máximo. Se limpia la pajuela con papel tissue previamente rociado

con etanol al 70 %. Se coloca el contenido de la pajuela en un tubo de centrífuga de 1.5 ml.

• Se toma el contenido de la pajuela y se coloca por encima del gradiente antes preparado, con mucho cuidado

arrojando el semen por las paredes del tubo con pipeta p200.

• Se centrifuga a 900 g por 10 min a RT. Del pellet formado se toman 30 µl y se transfieren a un nuevo tubo de

centrífuga con 400 µl de medio de fecundación pre-equilibrado.

• Mientras se realiza la primera centrifugación se lavan los ovocitos 2 veces en medio de lavado, pasando los

mismos de la placa de maduración a una p35 pre equilibrada con medio de lavado de ovocitos (1.5 ml). Se

colocan en placa de 4 wells con medio de fecundación previamente equilibrado. Si la maduración ha sido

exitosa se observa como el cúmulus ha expandido su tamaño.

• Se centrifuga por segunda vez a 900g por 10 minutos a RT. Se transfieren 30 µl del fondo del tubo a un nuevo

tubo con 170 µl de medio de fecundación. Se mezcla suavemente con pipeta.

• Si no se han lavado todos los ovocitos, se continua con el lavado de los mismos.

• Se toma 5 µl del semen diluido y se coloca en 95 µl de agua para realizar el conteo. Se prepara la cámara de

Neubauer y se cuentan los espermatozoides de los cuatro cuadrantes de los extremos de la cámara. Se saca una

media y se multiplica por 10.000 y por 20 (factor de dilución de conteo) para obtener la concentración de

espermatozoides del semen diluido.

• De acuerdo a la concentración obtenida se diluye el semen de manera de obtener 5 x 106espermatozoides por

ml.

• Se coloca 100 µl de la dilución final a cada well con los ovocitos. La concentración final por well queda de 1

x106 espermatozoides por ml.

• Se incuba por 24 h a 38.5 °C y 5 % CO2.


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4.3.3. Cultivo embrionario

• Al día siguiente de la fecundación (E0.0), se procede al denudado de los COCs fertilizados y el cultivo embrionario. Para

ello, se pre-equilibran 2 p35, una de ellas con medio H-SOF y la otra con medio C-SOF a 38.5 °C. Dos horas antes, se

prepara la placa de cultivo embrionario, p35 con gotas de 20 µl de BBH7 (Marca MOFA, Número de Catálogo

19982/1260) cubierto por aceite mineral. Se toma en cuenta 1 gota por cada 20 cigotos. Se pre-equilibra la placa en estufa

de embriones (5 % CO2, 5 % O2 y 90 % N2).

• Para denudar los cigotos se pipetea con p200 varias veces el contenido del well de fecundación, hasta lograr que la

granulosa se despegue. Este proceso se realiza mirando por lupa, para evitar un excesivo esfuerzo de corte que dañe al

cigoto. Generalmente cuando la fecundación ha sido exitosa, este denudado se logra fácilmente dado que los

espermatozoides ya han realizado su trabajo y removido también parte de la misma.

• Se colectan los cigotos con p10 y se pasan a la placa de lavado H-SOF, todo mediante el uso de lupa y en platina térmica.

• Se pasan al segundo lavado, con C-SOF y de ahí a las gotas de BBH7, colocando 20 cigotos por cada gota. La placa de

cultivo embrionario vuelve a la estufa, mientras se procede al denudado de otro well de fecundación.

• Una vez finalizado, se incuba la placa a 38.5 °C con 5 % CO2, 5 % O2 y 90 % N2. A las 48 h pos fecundación, es decir al

día siguiente, se cuenta el número de cigotos divididos.

• Al quinto día pos fecundación, se asignan al azar las gotas a los tratamientos (N2B27 con DMSO para el control, N2B27

t2iGö, N2B27 h-LIF y N2B27 t2iGö h-LIF para los tratamientos), y se cultivan 2 días más en placa con gotas de medio

cubiertas de aceite mineral.

• Al séptimo día se renueva el medio, pasando los embriones a nuevas gotas de medio (control y tratamientos) previamente

pre-equilibrados. Se aprovecha esta instancia para contar los blastocistos desarrollados.

• Al 8vo día se cuentan los embriones y se fijan los blastocistos protruidos para su análisis por IF, utilizando para ello PFA

4%. Se pueden o bien mantenerlos en PFA 1% en la heladera o bien ser utilizados inmediatamente para IF.

• El resto de los embriones que aún no protruyen, se mantienen en cultivo durante un día más hasta su conteo final y toma

de muestra.

4.4. Extracción de RNA, síntesis de c-DNA y qPCR de pooles de embriones

4.4.1. Extracción con trizol

La toma de muestra se puede realizar de varias maneras:

1) Se coloca la muestra en un mínimo volumen de PBS 0.1% PVP y se agrega 5 a 10 veces el volumen de RNA later

(Qiagen. Catálogo Número 76106, 250 ml). Se deja actuar 5 min en caso de un pool de embriones, u O.N. en caso de

células a 4 ºC, y luego se congela a -20 ºC. En caso de extraer con trizol (Thermo Fisher Scientific. Catálogo Número

15599-026), se debe sacar el RNA later, o sacar los embriones del RNA later y colocarlos en 100 µl de trizol).

2) Se agregar directamente sobre la muestra 100 µl de trizol, se guarda a -80 °C hasta su extracción.


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Protocolo modificado para muestras con poco RNA

Al momento de extraer el RNA:

• Se enfría la centrífuga a 4 ºC y se descongela el glucógeno.

• Se agrega al tubo con trizol 1 µl de glucógeno (10 µg/µl).

• Se prepara la solución de etanol 75 % en agua depc.

• Se coloca el isopropanol y etanol en hielo.

• Se descongelan las muestras en hielo.

• Se centrifuga si es necesario.

• Se deja reposar 5 min a RT.

• Se adiciona 20 µl de cloroformo y se mezcla bien por inversión. Se incuba 3 min a temperatura ambiente.

• Se centrifuga 12.000 g durante 15 min a 4 ºC.

• Se preparan los tubos de 0.2 ml.

• Se transfieren 50 µl de la fase acuosa a los tubos nuevos.

• Se adiciona 50 µl de alcohol isopropílico por muestra de RNA. Se mezcla con la pipeta y se incuba 10

min a RT u ON a -20 ºC (mejora el rendimiento).

• Se centrifuga el RNA a 12.000 g 10 min a 4 ºC.

• Se remueve el sobrenadante de RNA y se adiciona 100 µl de etanol 75 %. Se mezcla bien y se centrifuga

a 7500 g por 5 min a 4ºC.

• Se remueve el sobrenadante (casi por completo, es posible ver el glucógeno) y se deja secar 5 min

aproximadamente hasta que transparente el pellet.

• Se agrega 11 µl de agua depc.

• Se incuba 10 min a 55-60 ºC.

• Se guarda a -80 ºC.

• Se hace la retro transcripción o el chequeo de PCR sin RT para detectar contaminación con el DNA

genómico.

4.4.2. Tratamiento de DNAsas

El protocolo se lleva a cabo de acuerdo a las indicaciones del proveedor (RQ1 RNase free DNase. Promega. Catálogo Número M6101). Brevemente, para el tratamiento de DNAsas, se debe pipetear 10 µl (máximo) de RNA o una base en µg: generalmente 1µg en caso de trabajar con células; en caso de embriones como no se logran estas cantidades se normaliza a una cantidad constante, la de menor contenido en las muestras. Se agrega luego 1 µl de DNAsa y 1 µl de Buffer, se completa con agua depc hasta los 10 µl finales. Se incuba a 37 ºC durante 30 min y luego se agrega 1 µl por muestra de buffer stop, se incuba a 65 ºC durnte 5 min.

Nota: Previo tratamiento se puede verificar la presencia de DNA genómico corriendo una PCR sin RT con algún primer que amplifique solo en genómico.


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4.4.3. Síntesis de c-DNA

Para la síntesis de c-DNA se debe poner por cada tubo de síntesis:

Tabla 21: Mezcla inicial para síntesis de c-DNA

RNA muestra (1µg o menos) X µl (hasta 10) DNTPs (Thermo Fisher Scientific. Catálogo Número 10297-018): (10mM o 25uM) 1 o 0.8 µl Primers (oligodT o Random). Thermo Fisher Scientific. Catálogo Número 48190-011) 1 o 0.2 µl H2O Hasta completar 13 µl finales

Se utilizó la Superscript III de Invitrogen (Reverse transcriptase 10000 U, 200U/µl), catálogo 18080-044:

Ciclo:

• 65 ºC durante 5 min. Luego se para y se agrega por cada tubo 7 µl de la master mix a cada reacción de

síntesis. La master mix se prepara de acuerdo a la siguiente tabla:

Tabla 22: Master mix para síntesis de c-DNA

Buffer 5X 4*N*1.1 RNAse out 1*N*1.1 DTT 1*N*1.1 Superscript III 1*N*1.1

• El ciclo continua:

- 25 ºC 5 min (sólo random primers).

- 50 ºC 60 min

- 70 °C 15 min

- Mantener a 4 ºC.

Nota: Se amplifica mediante PCR GAPDH o cualquier otro gen utilizado como house keeping gene para verificar que el c-DNA está

bien preparado.

4.4.4. PCR tiempo final

Para chequear c-DNA o hacer RT-PCR. Por cada muestra se pipetea:

Tabla 23: Master mix para muestras de PCR tiempo final Buffer 5X Go taq polimerasa de Promega: catálogo M3005 4 * N * 1.1 dNTPs (25 µM) 0.2* N * 1.1 Primers F/R (10 µM) 1 * N * 1.1 Taq (5U/µl) 0.55 * N * 1.1 Agua 12.25* N * 1.1 c-DNA 2 µl Vtotal 20µl

Nota: los reactivos se descongelan en hielo. Generalmente se guardan a -20 °C.


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Se prepara la master mix en tubos eppendorf de 1.5 ml y se divide para cada muestra 18 µl en tubo de PCR, a la que se le

agrega 2 µl de muestra de c-DNA o su dilución. Una vez preparada la mezcla se corre en termociclador de acuerdo al siguiente ciclo:

Tabla 24: Ciclo de PCR tiempo final (programa para el termociclador)

Etapa Condiciones Desnaturalización 94 °C 4 min

40 x (ciclos de amplificación)

94 °C 30 s 60 °C 30 s 72 °C 30 s

Elongación 72 °C 4 min Mantener a 10 °C

Finalmente, las muestras se corren en un gel de 1-2 % de agarosa para amplicones de Real time PCR (tamaños de 90-250

bp), para ello dependiendo del número de muestras se puede preparar un gel chico (de 50 ml para 14 muestras) o uno grande (120 ml

para más de 15 muestras). Como la mix ya viene con el loading buffer se carga en cada calle la muestra junto con un marcador de

peso molecular (generalmente 5 µl). Si no, hay que cargar la muestra como sigue: 20 µl de muestra más 4 µl de loading buffer (LB

6X).

4.4.5. qRT-PCR

Por cada reacción de real time PCR se debe mezclar:

H2O (hasta completar 10.5 µl) 3.75 * N * 1.1 P F/R (25 µM) 0.5 µl* N * 1.1 Master mix Roche 2x (Catálogo) 6.25 µl* N * 1.1 c-DNA (generalmente diluido ½ a 1/5) 2 µl Vtotal por reacción 12.5 µl

Los primers utilizados de los marcadores de pluripotencia (OCT4, SOX2, NANOG) y de trofoectodermo (Cdx2). La

secuencia se muestra en la siguiente tabla:

Tabla 25: Secuencia de primers utilizados en bovinos (5’ a 3’)

Primer Secuencia 5´-3’ Tamaño de amplicón Características

OCT4-Forward CTT GCT GCA GAA GTG GGT GGA 169 bp (mRNA)

497 bp (gDNA)

Marcador de macizo celular

y epiblasto OCT4- Reverse CTG CAG TGT GGG TTT CGG GCA

SOX2-Forward AGC GCA TGG ACA GCT ACG CG 127 bp (mRNA)

127 (gDNA)

Marcador de macizo celular

y epiblasto SOX2- Reverse ATG GGC TGC ATC TGA GCG GC

NANOG- Forward AAA GAA TCT TCA CCT ATG CC 95 bp (mRNA) Marcador de macizo celular

y epiblasto NANOG Reverse GAA GGA AGA GGA GAG ACA GT


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Primer Secuencia 5´-3’ Tamaño de amplicón Características

Cdx2-Forward GCC ACC ATG TAC GTG AGC TAC 140 bp (mRNA) Marcador de trofoectodermo

Cdx2-Reverse ACA TGG TAT CCG CCG TAG TC

GAPDH-Forward AGCTCATTTCCTGGTACGACAA 95 bp (mRNA)

95 bp (gDNA)

Housekeeping gene

GAPDH-Reverse GGT CCA GGG ACC TTA CTC CT

Se realizó la detección en el equipo OPTICON Real time DNA Engine (Biorad) de acuerdo al siguiente esquema:

Tabla 26: Ciclo de PCR cuantitativa (qRT-PCR)

95 °C 10 minutos Desnaturalización 95 °C 30 segundos Ciclo de amplificación y detección

40 ciclos 60 °C 30 segundos 72 °C 2 minutos Curva de melting Control de especificidad de primers

Como se indica en la tabla, el esquema de reacción contiene una curva de melting inmediatamente finalizada la

amplificación, utilizando una tasa de transición de temperatura lineal de 0,3 °C/s de 60 °C a 90 °C con adquisición continua de

fluorescencia. Estas curvas presentaron un único pico para todos los primers utilizados, indicando la presencia de un único producto

de PCR. Más aun, se confirmó el correcto tamaño del producto de amplificación y la presencia de una única banda mediante

electroforesis en gel de agarosa 2 %.

Los datos crudos se extrajeron utilizando el programa MJ Opticon Monitor Software 3.1.32 (Bio-Rad) y se analizaron con

el software de LinReg PCR (71,72). Se obtuvieron los valores de N0 (Número inicial de moléculas) utilizando el mismo programa, el

cual los calcula teniendo en cuenta la intensidad de fluorescencia en el Ct de corte (threshold) y la eficiencia específica de cada par de

primers. Se normalizó la expresión génica a la del gen gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (Gapdh). Para cada experimento se

analizaron duplicados de por lo menos dos muestras independientes. En todos los casos, se relativizaron los resultados a la condición

del control, como se indica en cada ensayo.

4.5. Inmunofluorescencia de embriones

4.5.1. Protocolo

Se recolectan los embriones a analizar. Se utilizan aproximadamente entre 8-12 embriones por cada anticuerpo en cada

uno de los estadios a analizar. Se fijan embriones protruidos o se remueve la zona pelúcida, para esto puede utilizarse

pronasa o ácido tirodes, se manipula el pool de embriones en placa de 4-5 well en PBS con suero o BSA.

Se lava brevemente con 0.5 ml por well de PBS con 3 mg/ml de polivinilpirrolidona o PBS 1% BSA.

Se fija con 0.2 ml de 4 % de PFA en PBS por 15 minutos (es crítico) a RT. *

Se enjuaga con 0.2 ml de PBS/PVP o PBS 1 % BSA, 3 lavados (se deja 5 minutos a RT). Los embriones fijados se pueden

almacenar hasta por 3-4 semanas, en PBS/PVP o de 2-3 meses en PBS 1% PFA en refrigeración.


1

83

Se permeabilizan los embriones en 0.2 ml de 0.1 % Tritonx-100 en buffer PBS por 15 minutos usualmente en un well de

una placa de 4 wells. Se lava con 0.2 ml de PBS 1 % BSA, 3 veces (5 minutos a RT).

Se colocan 0.2 ml de solución de bloqueo: 0.1 % de BSA, 0.2 % Tween 20, 10 % Donkey serum (ninguno de los

anticuerpos primarios debiera ser obtenidos en este hospedero) en PBS, 1hora a RT. No es necesario lavar. Solo sacarlo.

Se diluyen los anticuerpos primarios en solución de bloqueo (usualmente a 1:200). *

Se incuban los embriones en 0.2 ml de solución de anticuerpo primario en well o en microgotas de 25 µl por grupo a

analizar en placa nunc de multiwell, por una hora a RT o hasta 3 días a 4 °C (usualmente se deja una noche entera en

refrigeración).

Se lava 4 veces por 10 minutos (como mínimo) con 1 ml de solución PBS 1 % BSA.

Se diluye apropiadamente el anticuerpo secundario en solución de bloqueo (Alexa Fluor se diluyen usualmente 1:500).

Se incuban los embriones por grupo en 0.2-0.3 ml de la solución de anticuerpo secundario o 25 µl en microwell, por 45

min en la oscuridad y a RT.

Se lava 4 veces por 10 minutos con 1 ml de solución PBS 1 % BSA.

Se colocan los embriones en pequeñas gotas de reactivo de montaje 5µl por embrión en portaobjetos rodeados de vaselina.

Se colocan el cubreobjeto sobre las gotas de vaselina, y se presionan suavemente para inmovilizar los embriones. Se deja

secar a oscuridad ON. Se cubre por la periferia del cubreobjeto con barniz de uñas.

Se dejan los portaobjetos en campana de extracción para que se sequen.

Se examina la fluorescencia en microscopio confocal o de epifluorescencia.

Se guardan a -20 °C cubiertos de la luz con papel aluminio.

4.5.2. Análisis de imágenes de microscopía por Fiji (ImageJ)

Las imágenes de fluorescencia se analizaron utilizando el software Fiji (Image J). De acuerdo a cada caso en particular se

sustrajo el background, se aplicaron filtros (generalmente filtro gaussiano) y se generaron los gráficos de perfil de fluorescencia para

cada señal de manera de detectar co-expresión de los marcadores y por ende la co-localización. Para generar los gráficos se usó la

herramienta multichannel plot profile de BAR. Para cuantificar el número de células con cada anticuerpo se crearon máscaras en cada

canal y se contabilizaron las mismas utilizando la herramienta Analyze particles.

4.5.3. Soluciones

Solución de lavado: 1 % BSA en PBS (se prepara suficiente cantidad para lavar cada grupo de embriones a analizar considerando 1ml por lavado por grupo). Guardar a 4 °C, y pre-equilibrar a RT antes del uso, la difusión de los

componentes depende de la temperatura.

Permeabilización: 0.1 % tritonX-100 en PBS (siempre preparar fresco, calcular 200 µl por grupo).

Solución de bloqueo: 0.1 % BSA, 0.2 Tween-20 y 10% Donkey serum (los anticuerpos secundarios están hechos en Donkey). Usualmente se prepara fresco en cada tanda de IF, dependiendo de la cantidad de muestras a analizar. Se

considera 200 µl por grupo para el bloqueo, 20-30 µl para el anticuerpo primario y otros 20-30 µl para el anticuerpo

secundario).


1

84

4.5.4. Reactivos

Anticuerpos:

- NANOG (rabbit anti human NANOG, policlonal). PEPROTECH. Número de Catálogo 500-P236. Diluir 50 µg en 500 µl de agua ultrapura estéril. Alicuotar y guardar a -20 °C. Usar 1/200 para embriones.

- SOX17 (goat anti human SOX17). R&D company. Número de Catálogo AF1924. Diluir 100 µg en 500 µl de PBS.

Alicuotar y guardar a -20 °C. Usar 1/200 en embriones.

- GATA6 (rabbit anti human GATA6, policlonal). ABCAM. Número de Catálogo 22600. Líquido, alicuotar y

conservar a -20 °C o -80 °C.

- GATA4 (goat anti mouse C- terminus GATA4, policlonal). Santa Cruz. Número de Catálogo sc-1237. Líquido, alicuotar y conservar a -20 °C o -80 °C.

- SOX2 (goat anti human SOX2, polyclonal 100 µg/ml). Santa Cruz. Número de catálogo sc-17320. Líquido,

Alicuotar y conservar a 4 °C.

- Anticuerpos secundarios: Donkey anti rabbit Alexa fluor 488 (para NANOG y GATA6) y Donkey anti goat Cy3

(para SOX17, GATA4 y SOX2). Dilución: 1/500. Se conservan de acuerdo a las instrucciones del proveedor.

Reactivo de Montaje: Fluoroshield con DAPI (agente fluorescente que se intercala entre las hebras de DNA) de Sigma Aldrich. Número de Catálogo F6057 20 ml.

4.6. Inmunofluorescencia de células

En este capítulo se menciona el uso de la técnica de inmunofluorescencia para detección de NANOG y SOX17 en células

adherentes en cultivo. Si bien los pasos a seguir son esencialmente los mismos que los detallados en el protocolo de embriones, hay

leves modificaciones que se detallan en el Capítulo 2, en la sección de materiales y métodos.

4.7. Análisis estadístico

Se llevó a cabo el análisis de los datos para establecer las diferencias significativas entre los diferentes tratamientos haciendo

uso del software Infostat. De acuerdo a cada tipo de respuesta se utilizaron diferentes distribuciones, por lo general y a menos que se

indique lo contrario, la producción embrionaria se analizó por MLGM (modelos lineales generalizados mixtos), tomando en cuenta

cada manipulación como efecto aleatorio y cada tratamiento como efecto fijo (los tratamientos por lo general hacen referencia a

diferentes medios a día 5 de cultivo). Los porcentajes de producción se analizaron siguiendo la distribución binomial, con función de

enlace logit, por el contrario los números de células por embrión se analizaron mediante el uso de la distribución Poisson, con función

de enlace logic, al menos que se indique lo contrario. La elección de la función de enlace, se realizó de manera tal que los valores de

AIC y BIC sean los menores para cada modelo a ajustar. Se utilizaron los valores predichos de la media de los tratamientos y el SEM

para graficar las variables de respuesta, sobre todo en aquellos conjuntos de datos en los que la variabilidad entre manipulaciones dio

significativa. Por último, se consideró que hay diferencias significativas cuando el p valor fue menor a 0.05. Las comparaciones

múltiples entre medias se realizaron todas contra todas sin superposición mediante el test de DGE (Di Rienzo, Guzmán y Casanoves)

del software Infostat.


1

85

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Producción in vitro de embriones bovinos, sin suero

Los protocolos de producción in vitro de embriones bovinos utilizan de rutina el medio SOF durante el cultivo

embrionario. Este medio, ya sea suplementado con suero o su sustituto (BSA y aminoácidos), fue desarrollado en base a la

composición del fluido oviductal tomando en promedio la composición de varias especies. Debido a que el SFB y la BSA varían

considerablemente de batch a batch y que además el agregado de SFB convierte al medio de cultivo embrionario en uno del tipo de

formulación indefinida se planteó como primera necesidad contar con un medio de cultivo libre de SFB, ya que un medio indefinido

no es conveniente en este tipo de estudios en los que se requiere contar con condiciones controladas para evaluar el efecto de la

modulación de las vías de señalización. Si bien las manipulaciones en las que se emplea SOF con SFB presentan en general una

mayor producción de blastocistos, lo cual es beneficioso desde el punto de vista productivo, el empleo del mismo ha sido asociado a

problemas de crio preservación y sanitarios debido a que aumenta el riesgo de trasmitir virus, priones y micoplasma; también se le

atribuye el origen del síndrome de la cría grande descrito en rumiantes producidos in vitro (73). Además, es responsable de varias

alteraciones morfológicas, de ultra estructura y de cinética de desarrollo.

En el presente trabajo se evaluaron dos medios utilizados en células madre embrionarias de ratón en el que se sustituye el

SFB por BSA al 0.8 %. El MC-BGC se obtiene del acondicionamiento de medio base DMEM/F12 por una línea inmortalizada de

células de la granulosa (74,75). Estas células (en su versión de cultivo primario) han sido utilizadas en sistemas de co-cultivo de

embriones y se conoce su efecto beneficioso en la producción embrionaria. De igual manera, el MC-BGC ha sido utilizado en el

cultivo de m-ESC sin la necesidad de agregar LIF; por lo que este medio mantiene las características pluripotentes de las células m-

ESC y a su vez incrementa la tasa de proliferación celular (76). Por otro lado, el medio N2B27 se utiliza en sistemas de cultivo de

ESC libre de suero y MEF y proporciona una base de nutrientes entre los que se destacan el agregado de insulina, transferrina y

selenio entre otros componentes distintivos del medio. La insulina tiene efecto anti apoptótico en embriones bovinos, a la vez que

aumenta la actividad mitogénica de las células (77). La transferrina actúa como una proteína de transporte de hierro en la célula y

también como mecanismo de detoxificación removiendo metales del medio. El selenio por su parte previene el daño oxidativo

regulando la actividad del glutatión peroxidasa (73).

Se comparó la producción embrionaria a día 7, parámetro utilizado para evaluar la eficiencia en la producción de una

manipulación in vitro, mediante el análisis a través de modelos lineales generalizados con el uso de la herramienta estadística Infostat

(datos obtenidos de dos réplicas biológicas). Como se señaló en materiales y métodos los embriones fueron producidos por FIV corta,

cultivados hasta día 5 en SOF con 2.5 % de SFB y luego tratados en los medios MC-BGC, N2B27 y comparados con SOF (0.8 %

BSA).


1

86

Tabla 27: Producción in vitro de embriones bovinos en condiciones libre de suero.

Medio n N Clivado BL totales día 7

Media ± SEM %

BL Media ± SEM %

SOF 2 103 90 62 69 ± 6 ª 53 61 ± 7ª

MC BGC 2 94 80 39 49 ± 6b 35 45 ± 7b

N2B27 2 114 100 65 65 ± 6a 56 58 ± 6a

Nota: Los cigotos producidos por FIV se cultivaron del día 1-5 en medio SOF con 2.5 % de SFB, y se asignaron al azar a gotas de

SOF con 0.8 % de BSA (control), MC-BGC y N2B27 (tratamientos) en los que se cultivaron del día 5-8. En la tabla n es el número

de manipulaciones independientes, N el número total de ovocitos en cada grupo, Clivado es el número total de embriones de 2 o más

células por cada grupo 2 días después de la FIV, BL día 7 el número de blastocistos en el día 7, también se presentan el porcentaje y

error estándar (analizado por MLGM con distribución binomial y función de enlace logit, igual letra indica que no hay diferencia

significativa entre las medias).

Los resultados de producción embrionaria indican que existe diferencia significativa en el número total de blastocistos de

día 7, siendo en promedio mayor el porcentaje obtenido en SOF (69 ± 6%) y N2B27 (65 ± 6%) respecto a MC-BGC (49 ± 6%).

Cuando se analiza el tipo de blastocisto de día 7 y se clasifica de acuerdo a la morfología en blastocisto, blastocisto protruyendo y

blastocisto protruido no se observan diferencias entre los medios (no se muestra en la tabla). Se tomó muestra al día 7 para su análisis

de expresión de genes y los blastocistos sobrantes se cultivaron hasta día 8. En la Tabla 28 se muestra la producción embrionaria a día

8, en la que se contabiliza el número de embriones totales (los que no fueron tomados como muestra y los que aparecieron entre día 7

y 8) respecto al número total que quedó en cultivo y su clasificación de acuerdo a la morfología.

Tabla 28: Producción in vitro de embriones bovinos de día 8 en condiciones libre de suero.

Medio n N BL totales

día 8

Media ± SEM (%)

BE Media ± SEM (%)

SOF 2 47 26 51 ± 14 ª 19 40 ± 7ª

MC BGC 2 54 28 51 ± 13a 21 39 ± 7a

N2B27 2 63 36 54 ± 13a 19 30 ± 6a

Nota: En la tabla n es el número de manipulaciones independientes, N el número total que siguió en cultivo, BL día 8 el

número de blastocistos totales en el día 8, BE hace referencia a los blastocistos expandidos. También se presentan el porcentaje y

error estándar de cada grupo (analizado por MLGM con distribución binomial y función de enlace logit, igual letra indica que no hay

diferencia significativa entre las medias).

Los embriones de día 8 no presentan diferencia significativa en cuanto a la cantidad de blastocistos producidos entre día 7

y 8 y el tipo de blastocistos; pero si se toma entonces la suma de producción embrionaria de ambos días (Tabla 27 y Tabla 28) se

puede concluir que SOF y N2B27 tienen niveles de eficiencia comparables desde el punto de vista productivo. El análisis de

expresión génica se realizó entonces para determinar si estos dos medios impactan en la calidad embrionaria (tomando como tal el


1

87

nivel de expresión de genes de pluripotencia). En definitiva, lo que se pretende establecer es un sistema de cultivo in vitro en el que

se pueda luego modular las vías de señalización y detectar cambios en la cantidad y calidad de embriones. Contar con una alta tasa de

desarrollo en el medio control es un requisito para poder establecer sobre ella las modulaciones que se pretenden estudiar.

En la Figura 23 se observan los niveles de expresión relativos a GAPDH para cada muestra, tomando al SOF como medio

control (valor de expresión 1, promedio de dos réplicas independientes). El medio N2B27 aumenta los niveles de OCT4 y SOX2 más

marcadamente que NANOG, también aumenta CDX2 que es un marcador de trofoectodermo. En principio un análisis cuantitativo de

este tipo en el que la muestra se constituye de un pool de embriones, los que a su vez están conformados por un pool de distintas

células (al día 7: ICM y TE), nos permite establecer un punto de comparación entre los medios, pero no nos permite discernir la causa

de dicha diferencia en la expresión. Dicho de otra manera, el aumento de los genes de pluripotencia y diferenciación pueden deberse

al aumento en el nivel de expresión de cada célula, al número total de cada tipo celular o a ambas. El análisis morfológico de los

embriones por inspección visual sugiere que el aumento en la expresión está relacionado a un número mayor de células del ICM y TE

en el medio N2B27 comparado con SOF (Figura 24).

Oct4 Sox2 Nanog Cdx20

2

4

6SOF

MC-BGC

N2B27

Exp

resió

n R

ela

tiva

Figura 23: Análisis del nivel de expresión de genes relacionados a la pluripotencia y diferenciación en blastocistos de día 7

producidos in vitro en condiciones libre de suero. Se comparó diferentes medios utilizados para cultivar m-ESC y el medio SOF con BSA, al cual se relativizaron los distintos tratamientos (2 réplicas, N=26 por grupo). Los resultados se muestran como la media ± SEM de dos experimentos independientes, sin análisis estadístico.


1

88

Figura 24: Embriones bovinos de día 7 cultivados en SOF sin suero (control) y N2B27 (tratamiento). Los macizos celulares de los embriones producidos en N2B27 parecen de mayor tamaño, es decir que cuentan con mayor número de células que aquellos obtenidos en medio SOF sin suero. Las imágenes de IF demuestran que los blastocistos cultivados en N2B27 tiene mayor número de células NANOG y SOX17 positivas que los cultivados en SOF 0.8 % BSA.

5.2. Marcadores de epiblasto e hipoblasto

Durante el desarrollo temprano de mamíferos el primer evento de diferenciación de las células en división da lugar al

desarrollo del trofoectodermo (que forma una capa de células externas del embrión) y el segundo al endodermo primitivo o

hipoblasto, células que rodean el ICM y lo separan de la cavidad blastocélica. Las células internas restantes forman el epiblasto del

cual surge el embrión propiamente dicho durante la gastrulación (63). Se utilizan marcadores moleculares de los diferentes linajes

para identificar los tipos celulares descritos en el embrión. En ratón y humano OCT4, SOX2 y NANOG son genes relacionados a la

pluripotencia del ICM mientras que CDX2 se lo utiliza para identificar el TE (41,78). La expresión de OCT4 en bovinos difiere de la

de ratón y humano ya que está presente en el ICM y a su vez persiste por más tiempo en el TE; la caracterización de la expresión de

SOX2 y NANOG no es completa en embriones bovinos y sus diferencias con otras especies no está del todo establecida.

Específicamente, en embriones bovinos de día 8 en donde el ICM comienza a diferenciarse en epiblasto e hipoblasto (61) no se ha

establecido los mejores marcadores para ambos linajes embrionarios. Estudios previos demuestran que el RNA mensajero de SOX2

parece restringirse al ICM en los días 8 y 9 de cultivo mientras que su proteína aparece localizada solo en el ICM desde el día 7 (79).

En este estudio, encontramos la proteína expresada principalmente en el ICM de embriones de día 8 producidos en medio BBH7 libre

de suero (Figura 25 A y Figura 27 A). En algunos embriones se observa también la presencia de SOX2 en las células del TE pero a un

nivel de expresión menor al hallado en las células del ICM (Figura 26 y Figura 27 A). Probablemente este remanente de SOX2 en el

TE esté relacionado a que aún no ha sido completamente silenciado en este estadio. Asimismo, reportamos por primera vez la co-

localización de las proteínas SOX2 y NANOG en las células del ICM de embriones de día 8 (Figura 25C-E). Del análisis de los

perfiles de fluorescencia de ambos marcadores se puede observar que existen células de SOX2 con y sin expresión de NANOG o al

nivel del background (Figura 25 E). En la gráfica se muestra la intensidad de fluorescencia para una sección del embrión seleccionada

con la herramienta de trazo libre en la que las células con solo SOX2 se encuentran al principio y al final de la selección (Figura 25

D). Los resultados sugieren que NANOG se restringe más rápidamente al epiblasto que SOX2, ya que por lo general se presentan

como un subgrupo dentro de las células marcadas con SOX2. La proporción de células que co-expresan NANOG y SOX2 en medio

BBH7 es 75 ± 5 %. NANOG por su parte se ve presente en células del ICM en embriones de día 8, con poca o ninguna expresión en

las células del TE (Figura 25B y Figura 26).

SO

F

N2

B2

7

NANOG/SOX17/DAPIBrightfield


1

89

SOX2

NANOG

Merge con DAPI

Figura 25: Inmunofluorescencia de embriones bovinos de día 8 producidos por FIV y cultivados en BBH7. Localización en el ICM de SOX2 (53 ± 9 células) y NANOG (41 ±7 células), análisis de 2 tandas de FIV, 10 embriones; los valores entre paréntesis representan el valor medio y el error estándar. 75 ±5 % de las células SOX2 positivas co-expresan NANOG (A-C). Los perfiles de intensidad de fluorescencia de células seleccionadas muestran la co-expresión de ambas proteínas marcadas con anticuerpo fluorescente (SOX2 en rojo y NANOG en verde, D y E). El porcentaje de co-localización fue analizado utilizando la herramienta ROI manager en imageJ (las imágenes fueron tomadas en microscopio de epifluorescencia con una magnificación del objetivo de 40x).

ICM TE

0

5

10

15

Sox2

U.A

. d

e

Flu

ore

scen

cia

/Are

a

ICM TE

0

2

4

6

8

10

Nanog

U.A

. d

e F

luo

rescen

cia

/Are

a

Figura 26: Expresión de SOX2 y NANOG en células del ICM versus TE de embriones de día 8 cultivados en BBH7 (medio libre de suero). SOX2 y NANOG se expresan diferencialmente en el ICM (n=3, N=15 y n=4, N=19 respectivamente). n es el número de manipulaciones independientes, N el número total de embriones analizados, U.A. son las unidades arbitrarias de fluorescencia por unidad de área.

A B C

E D


1

90

GATA6, GATA4 y SOX17 son empleados como marcadores del hipoblasto en embriones de ratón y humano. Su

expresión se opone al de NANOG y eventualmente compartimentalizan el ICM en epiblasto e hipoblasto (80,81). Como uno de los

objetivos principales fue establecer el efecto de la modulación en la segregación de estos dos compartimentos y establecer la

condición de cultivo embrionario que favorezca uno en detrimento de otro, durante la determinación de las proteínas por IF co-

incubamos embriones de día 8 con anticuerpos que reconocen NANOG y GATA4 o NANOG y SOX17. Asimismo, se evaluó la co-

localización de SOX2 y GATA6.

SOX2

GATA6

Merge con DAPI

NANOG

SOX17

Merge con DAPI

A B C

F G H

D E

I J


1

91

NANOG

GATA4

Merge con DAPI

Figura 27: Inmunofluorescencia de embriones bovinos de día 8 producidos por FIV y cultivados en BBH7 demuestran que NANOG y SOX17son mejores marcadores de epiblasto e hipoblasto respectivamente. Localización de SOX2 (47 ± 4 células) y GATA6 (43 ± 5 células), 91 % de células SOX2 positivas son GATA6 positivas (1 réplica, 5 embriones) (A-E). Localización de NANOG (48 % del ICM) y SOX17 (50 % del ICM). La co-localización entre ambos marcadores es despreciable, 3 de 9 embriones (2 réplicas, 9 embriones) (F-J). Localización de NANOG y GATA4 en embriones de día 8 (K-M) y día 10 (N-Q). El porcentaje de co-localización fue analizado utilizando la herramienta ROI manager en imageJ (las imágenes fueron tomadas en microscopio de epifluorescencia con una magnificación del objetivo de 40x).

Los resultados demuestran que hay un porcentaje alto de co-localización entre los marcadores SOX2 y GATA6 en los

embriones producidos por FIV y cultivados en BBH7 hasta día 8 (Figura 27 A-E), lo que refuerza la idea de que SOX2 está presente

en células que han comenzado a diferenciarse a PE y que su restricción a las células del epiblasto es más tardía que NANOG. Cuando

se comparó NANOG con SOX17 y NANOG con GATA4 (Figura 27 H y J versus M, O y Q) se encontró que pocos embriones o

ninguno, en el caso de algunas tandas de manipulación presentan células GATA4 positivas a día 8, mientras que SOX17 está presente

en todos los embriones analizados y sigue un patrón de “sal y pimienta” similar al descrito para GATA6 y NANOG en embriones de

ratón de día E3.75 (Figura 18). Con este estudio se muestra por primera vez que SOX17 se restringe a un subgrupo de células del

ICM que no expresa NANOG y que por tanto probablemente se confine a células del PE, las que comienzan a especificarse en este

estadio embrionario (Figura 27H y J). El hecho de que la expresión de NANOG y SOX17 aparece mutuamente excluyente en el ICM

K L M

N Ñ O

P Q


1

92

tardío de los embriones analizados sugiere que estos marcadores pueden ser utilizados para evaluar la segregación del epiblasto e

hipoblasto en los embriones tratados con diferentes moduladores de las vías de señalización. Asimismo, tal como lo muestra Hyttel et

al. (61), por microscopía electrónica, el análisis por IF demuestra que el ICM ha comenzado su proceso de especificación a día 8.

Finalmente, se evaluó si GATA4 es un marcador específico del PE en embriones bovinos, ya que Kuijk et al., (2012) demostraron

que no solo está presente en el ICM sino también en el TE (66). Los resultados de esta tesis sugieren que, si bien la frecuencia de

embriones con expresión de GATA4 a día 8 es baja, este se restringe al PE, así como en embriones de día 10 (Figura 27L-Q). Debido

a su activación tardía, GATA4 no es un marcador temprano de hipoblasto para analizar los efectos de la modulación sobre la

especificación del mismo en el estadio embrionario de día 8.

Resumiendo, la tabla 37 muestra los marcadores de epiblasto e hipoblasto y su porcentaje de co-localización expresado

como número de células positivas en embriones bovinos obtenidos por FIV y cultivados en BBH7 hasta día 8.

Tabla 29: Cuantificación de células marcadas con genes relacionados a la pluripotencia (SOX2 y NANOG) y a la diferenciación a PE (GATA6, SOX17 y GATA4); y su porcentaje de co-localización celular en embriones bovinos de día 8

producidos por FIV y cultivados en BBH7.

Marcadores analizados n N SOX2* NANOG* SOX17* GATA6* GATA4* Co-expresión (%)

SOX2/NANOG 2 10 53 ± 9 41 ± 7 - - - 75 ± 5

SOX2/GATA6 1 5 47 ± 4 - - 43 ± 5 - 91 ± 5

NANOG/SOX17 2 9 - 23 ± 7 26 ± 5 - - <2% **

NANOG/GATA4 2 8*** - - - * Número de células positivas. n= FIV independientes N= número total de embriones analizados. Valores expresados como media ± SEM.

** Algunos embriones tienen co-expresión y otros no, el promedio es de 0.5 ± 0.29 células co-expresadas por embrión.

*** Marca en 1 embrión de 8 analizados.

5.3. Dinámica de expresión de NANOG, SOX2 y SOX17 durante el desarrollo embrionario temprano de bovinos

Estudios previos sugieren que la proteína NANOG aparece por primera vez en el día 7 (E7) localizada en el ICM de

embriones bovinos, aunque el transcripto de Nanog se ha detectado desde el estadio de 8 células en adelante (66,79,82). Haciendo uso

de la producción in vitro de embriones y la detección de proteínas por inmunofluorescencia se analizó la co localización de

NANOG/SOX2 y NANOG/SOX17 en embriones bovinos de día 2-8. La co-expresión de NANOG y SOX2 es detectada por primera

vez en embriones de 8 células en el día 4 de desarrollo in vitro hasta el día 8 (Figura 28, N=4). SOX2 también aparece en embriones

de 4 células, probablemente por la presencia de SOX2 materno (imagen faltante, los embriones se disgregaron fácilmente en sus

células). A día 7 y 8 se observa una fuerte expresión de NANOG y SOX2 en un grupo de células del ICM (Figura 25D), sin embargo

en algunas ocasiones, una leve marca se observa en células del TE.


1

93

Figura 28: Dinámica de expresión de NANOG (verde) y SOX2 (rojo) en el desarrollo in vitro de embriones bovinos. DAPI es la marca nuclear azul.

SOX17 ha sido utilizado en embriones de ratón y humano para identificar el PE (80,81). En embriones bovinos, estudios

previos detectan su transcripto en blastocistos de día 8, sin embargo, su función y localización no ha sido reportada, tampoco el perfil

de expresión en estadios más tempranos. Por lo tanto, en este estudio analizamos la especificación de las células del PE mediante la

detección de SOX17 por inmunofluorescencia en estadios de células a blastocistos (Figura 29).

En este estudio se detectó SOX17 en el estadio de 8 células, pero no en estadios previos. Se localizó principalmente en el

citoplasma y también en algún núcleo de la célula pero a niveles de expresión comparativamente menores que su expresión en

blastocistos de día 8. A día 8, SOX17 es altamente expresado en el núcleo de un sub-grupo de células del ICM, tanto en aquellas que

rodean el blastocele como en el interior del ICM consistente con el patrón heterogéneo de expresión de los genes relacionados al PE

en el desarrollo embrionario de ratón (63,80,83). Este patrón es conocido como “sal y pimienta” ya que junto con NANOG

conforman la totalidad del ICM una vez diferenciado en epiblasto e hipoblasto (Figura 27 I). La expresión de SOX17 en estadios

tempranos se solapa con la de NANOG, pero en los blastocistos protruidos de día 8 SOX17 se restringe a un grupo de células que no

expresa NANOG. Los resultados sugieren que estas células han empezado a diferenciarse a PE al igual que los embriones pre

implantatorios de ratón. En ellos, Sox17 aparece por primera vez en el estadio de 32 células y precede a la expresión de GATA4. Una

vez que GATA4 aparece, alrededor del estadio de 64 células, siempre coincide con la expresión de SOX17 (80). En humanos, SOX17

se ha detectado inicialmente en blastocistos tempranos y también precede a GATA4 (81).

32-64 células

N=4

8-16 células

N=5

DAPI

SOX2

NANOG


1

94

Figura 29: Dinámica de expresión de NANOG y SOX17 en el desarrollo in vitro de embriones bovinos.

5.4. Modulación de las vías de señalización durante el desarrollo embrionario temprano

5.4.1. Resultados en colaboración con el Grupo de Biotecnología de la Reproducción (FAUBA)

En esta primera instancia se presentan los resultados de la colaboración con el Grupo del Dr. Daniel Salamone. Los

blastocistos protruidos fueron fijados y mantenidos en PFA 1 % a 4 °C hasta su análisis en La Universidad de Nottingham (Reino

Unido).

Producción embrionaria

Se realizaron 7 manipulaciones independientes (tomadas como 7 bloques, ya que por lo general cada tanda de ovarios a

procesar es diferente) en las que se evaluaron simultáneamente tanto el control como los tratamientos. Las tres primeras

manipulaciones se utilizaron para tomar muestras de embriones para RNA y las 4 restantes para IF. Los datos de producción de día 7

se evaluaron para las 7 manipulaciones, mientras que los de día 8 solo se registraron para las 4 últimas.

En primera instancia se analizaron los datos de producción embrionaria para el control y los tratamientos tomando como

variable de respuesta el número de blastocistos de día 7, parámetro generalizado para evaluar producción embrionaria. Se realizó un

análisis de MLGM tomando como efecto fijo el factor medio y como variable las manipulaciones. El número de embriones clivados

Blastocisto día 8

N = 2 8-16 células

N= 332-64 células

N = 4

4 células

N = 4

NANOG

SOX17

DAPI


1

95

se tomó en cuenta para el cálculo de la proporción de blastocistos de día 7. En la Tabla 30 se muestran los valores finales de las 7

réplicas, el porcentaje y error estándar. Como puede observarse mediante el análisis estadístico, no existe diferencia significativa

entre los tratamientos y el control en el número de blastocistos totales de día 7.

Tabla 30: Producción in vitro de embriones bovinos en medio N2B27 t2iGö CHO LIF.

Medio n N Clivado BL día 7 Media (%) SEM

N2B27 DMSO 7 293 241 74 30 a 5

N2B27 CHO LIF 7 325 267 74 28 a 5

N2B27 t2iGö CHO LIF 7 350 317 105 34 a 5

Nota: Los cigotos producidos por FIV se cultivaron del día 1-5 en medio SOF 2.5 % SFB, y se asignaron al azar a gotas de N2B27

(DMSO: control, CHO LIF y t2iGö CHO LIF: tratamientos) en los que se cultivaron del día 5-7 u 8. En la tabla n es el número de

manipulaciones independientes, N el número total de ovocitos en cada grupo, Clivado el número total de embriones de 2 o más

células por cada grupo y BL día 7 el número de blastocistos totales en el día 7; también se presentan la media del porcentaje y SEM

(analizado por MLGM con distribución binomial y función de enlace logit, igual letra indica que no hay diferencia significativa entre

las medias).

También se analizó la producción embrionaria a día 8 tanto para el número de blastocistos totales, así como para su

clasificación en BL: blastocistos, BE: blastocistos expandidos, BHing: blastocistos protruyendo y BHed: blastocistos protruidos. La

Tabla 31 muestra los valores medios de la proporción respecto al número de embriones clivados y su SEM.

Tabla 31: Producción de embriones bovinos de día 8 en medio N2B27 t2iGö CHO LIF.

Medio n N Clivado BL totales (%) BL (%) BE (%) BHing (%) BHed (%)

N2B27 DMSO 4 171 139 31 ± 6ª 6 ± 2a 16 ± 2a 3 ± 2a 6 ± 2a

N2B27 CHO LIF 4 196 160 29 ± 6a 8 ± 3a 15 ± 2a 1 ± 1b 6 ± 2a

N2B27 t2iGö CHO LIF 4 198 163 32 ± 6a 5 ± 2b 15 ± 2a 3 ± 1a 12 ± 3b

Nota: Análisis estadístico llevado a cabo mediante MLGM con distribución binomial y función de enlace logit para el número total de

blastocistos de día 8, igual letra indica que no hay diferencia significativa entre las medias.

Del análisis estadístico surge que no hay diferencias significativas en el número total de embriones producidos en día 8.

Cuando se evalúa el tipo de embrión de acuerdo a su grado de desarrollo existen diferencias entre los tratamientos. En particular se

debe mencionar que para el tratamiento de CHO LIF con los tres inhibidores hay una diminución de la proporción de blastocistos en

favor de un incremento en el número de blastocistos protruyendo y protruidos. Este resultado implica que hay un efecto en la cinética

de producción embrionaria más que un aumento en la eficiencia de producción.

Efecto en el primer evento de segregación (formación de ICM y TE)

Los embriones obtenidos a día 8 fueron analizados por IF utilizando anticuerpos para NANOG y SOX17, marcadores de

epiblasto e hipoblasto respectivamente. Los núcleos totales se visualizaron con DAPI. El conteo se realizó haciendo uso de la

herramienta ROI manager de ImageJ, para localizar los núcleos que presentasen doble tinción (NANOG y SOX17). A su vez se


1

96

controló que la marca de anticuerpo fuera específica, es decir nuclear, contrastando las áreas marcadas con los anticuerpos y el DAPI.

El número de células se analizó usando la herramienta Genstat, software estadístico disponible en la Universidad de Nottingham. Se

sometió a un modelo lineal generalizado mixto con distribución Poisson para la variable número de células por embrión. La función

de enlace escogida fue la del logaritmo (log). A través de la prueba de Tukey se obtuvieron las medias que son significativamente

diferentes.

Los resultados presentados en la Tabla 40 sugieren que no hay diferencia significativa entre el control y los tratamientos

en el número total de células y el número de células del trofoectodermo. En cambio, cuando se compara el número de células del

macizo celular interno se observa una disminución de casi la mitad del valor del control (44 ± 7 versus 24 ± 4 para el control y

N2B27 t2iGö CHO LIF respectivamente). Al no existir una variación en el N ni el TE, el impacto sobre el número de células del ICM

pareciera no estar relacionado con el primer evento de diferenciación (formación de TE y ICM).

Tabla 32: Efecto en el número de células totales (N), del trofoectodermo (TE) y macizo celular interno (ICM) de embriones bovinos de día 8 producidos por FIV en SOF con 2.5 % de SFB y cultivados desde el día 5 en medio N2B27 (control y tratamientos).

Medio N2B27 DMSO (control) N2B27 CHO LIF N2B27 t2iGö CHO LIF

N (media ± S.E.M.) 226 ± 15a 235 ± 15a 224.± 11a

TE (media ± S.E.M.) 182 ± 15a 198 ± 16a 199 ± 12a

ICM (media ± S.E.M.) 44 ± 7a 37 ± 6a 24 ± 4b

Nota: La cuantificación de N se realizó por conteo de los núcleos marcados con DAPI, la de ICM como la suma de las células

NANOG y SOX17 positivas y TE como resta: N-ICM. Nota: igual letra indica que no hay diferencia significativa entre las medias.

Efecto en el segundo evento de segregación (formación del epiblasto y PE)

Los efectos obtenidos en el número de células NANOG positivas y SOX17 positivas determinan si existe un impacto o no

en el segundo evento de segregación embrionaria donde el ICM se convierte en células del epiblasto e hipoblasto. El aumento de un

tipo en particular en detrimento del otro es lo que se observa cuando ese impacto es causado por un cambio en la decisión de la

identidad celular, es decir en la modulación de las vías de señalización que especifican una u otra población. Cuando se trata de

embriones control, independientemente del medio base utilizado (es decir BBH7 o N2B27 DMSO) la proporción de ambos

marcadores ronda en un 50 % (Figura 27 F-H y Tabla 34). En ratón han sido descrito como embriones normales aquellos que poseen

un porcentaje de células del epiblasto e hipoblasto (marcadas con NANOG y GATA6 respectivamente) iguales, es decir alrededor del

50 % para cada población (84). Los embriones de ratón obtenidos por superovulación y lavado del tracto uterino a E2.5 (estadio de 8

células) se cultivan en medio control durante tres días y se analizan por IF, los resultados arrojan que aproximadamente un 80 % de

los mismos posee esta característica, alrededor del 10 % tiene una proporción de NANOG más alta que lo normal y el otro 10% de

GATA6 más alta de lo normal (84). En embriones bovinos obtenidos por FIV y cultivados en N2B27 DMSO a partir del día 5

(estadio de mórula) se obtienen en promedio 21 ± 3 células NANOG positivas y 24 ± 5 SOX17 positivas (Tabla 33), lo que

representa el 47 ± 6 % de NANOG versus 53 ± 6 % de SOX17 en el ICM (Figura 30). Estos embriones podrían considerarse como


1

97

normales de acuerdo a la clasificación realizada en ratón. Sin embargo, la capacidad de estos embriones de dar lugar a un nacimiento

no ha sido evaluada y por tanto la correlación entre la calidad embrionaria (basada en el número de células de cada linaje) y su

eficiencia en la producción de animales nacidos por la tecnología de producción in vitro y transferencia embrionaria debe ser

analizada antes de poder considerarse una característica normal en esta especie.

Tabla 33: Efecto en el número de células NANOG positivas (NANOG) y SOX17 positivas (SOX17) en embriones bovinos de día 8 producidos por FIV en SOF con 2.5 % de SFB y cultivados a partir del día 5 en medio N2B27 (control y tratamientos).

Medio N2B27 DMSO(control)

N2B27 CHO LIF N2B27 t2iGö CHO LIF

NANOG (verde)

21 ± 3a 33 ± 4b 24 ± 4a

SOX17 (roja)

24 ± 5a 5 ± 3b 0.2 ± 0.3b,c

Nota: La cuantificación se realizó por conteo de los núcleos marcados con cada anticuerpo, con el software Image J (ROI manager).

Igual letra indica que no hay diferencia significativa entre las medias, p>0.05.

NANOG SOX17 MERGE CON DAPI

N2B27 DMSO

N2B27 CHO LIF

N2B27 t2iGö CHO LIF

Figura 30: Inmunofluorescencia de embriones bovinos producidos por FIV-CIV en SOF 2.5 % SFB hasta el día 5 y cultivados en N2B27 DMSO, N2B27 CHO LIF y N2B27 t2iGö CHO LIF hasta día 8. El porcentaje de co-localización fue analizado utilizando la herramienta ROI manager en imageJ (las imágenes fueron tomadas en microscopio de epifluorescencia con una magnificación del objetivo de 40x).


1

98

Cuando se analiza el efecto de los tratamientos comparados con el control en el número total de células NANOG positivas y SOX17 positivas se puede apreciar que CHO LIF incrementa el número de células de epiblasto y disminuye las del hipoblasto (aunque no en su totalidad) lo que resulta en un incremento en la proporción de células NANOG con respecto al ICM en detrimento de la proporción de células SOX17 en el ICM (Tabla 33 y Tabla 34). Sin embargo, cuando los embriones se cultivan en presencia de CHO LIF y los inhibidores conjuntamente, el número de células de NANOG no se altera, aunque disminuye en su totalidad el número de células SOX17, por lo que la proporción se incrementa a un 99 % versus un 1% de células NANOG/ICM y SOX17/ICM respectivamente. De los resultados obtenidos se desprende que para establecer un cultivo de ESC a partir de estos embriones tratados aquellos con CHO LIF y los tres inhibidores podrían ser desde el punto de vista tecnológico más eficientes ya que poseen un ICM compuesto en su mayoría solo por células NANOG positivas. En la sección siguiente se muestran los resultados del primer intento de establecer un cultivo de ESC a partir de esta condición. Hay que mencionar aquí que los resultados de esta sección en particular se obtuvieron con embriones cultivados en Argentina con CHO LIF y los inhibidores y analizados en UK. Se repitió entonces la experiencia en UK produciendo embriones con LIF y los 3 inhibidores, solo que en esta ocasión se utilizó h-LIF.

Tabla 34: Análisis de proporciones, NANOG/ICM y SOX17/ICM (expresado en %).

(%) N2B27 DMSO (control) N2B27 CHO LIF N2B27 t2iGö CHO LIF

NANOG/ICM 47 ± 6a 89 ± 4b 99 ± 1b

SOX17/ICM 53 ± 6a 11 ± 5b 1 ± 1b

Nota: igual letra indica que no hay diferencia significativa entre las medias, p > 0.05. p valor 0.088 entre CHO LIF y t2iGö CHO LIF

en la proporción NANOG/ICM y p valor 0.058 entre CHO LIF y t2iGö CHO LIF en la proporción SOX17/ICM.

Aislamiento de ESC a partir de embriones tratados

Se realizó una tanda de FIV a partir de ovarios obtenidos de matadero de una localidad cercana a la ciudad de Nottingham

en UK. Los embriones se produjeron de acuerdo al protocolo detallado en la sección. Producción in vitro de embriones: FIV larga. Se

debe mencionar aquí que existen diferencias entre los protocolos utilizados en los laboratorios de Biotecnología Animal de la

FAUBA en el que se sigue un protocolo de FIV corta y se cultivan los embriones en SOF con SFB los primeros 5 días antes del

tratamiento; y los utilizados en el Laboratorio de Embriones del Dr. Kevin Sinclair en la Universidad de Nottingham, con quienes se

trabajó en colaboración en la segunda etapa, después de haber analizado los embriones por IF. En este laboratorio los embriones se

producen por FIV larga y se cultivan los primeros 5 días en BBH7 un medio comercial que permite el desarrollo de embriones

bovinos en condiciones libre de suero (85). En ambos casos, los embriones se cultivaron en medio N2B27 con DMSO, LIF y t2iGö

LIF a partir del estadio de mórula (quinto día). Se debe mencionar también que el tipo de citoquina utilizada no fue la misma, el LIF

proveniente de las células CHO es una proteína recombinante que tiene la secuencia de aminoácidos de LIF de ratón, mientras que el

LIF comercial utilizado en UK es la proteína recombinante humana. Las diferencias en las secuencias se muestran en el Anexo. El

porcentaje de homología con el b-LIF (proteína LIF de origen bovina) es de 75.6 % para el m-LIF y de 89.6 % para el h-LIF.


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99

Embriones de día 8 cultivados en N2B27 t2iGö h-LIF

(A)

ICM aislado Manualmente

(B)

ICM en co-cultivo con MEF

(C)

Figura 31: Embriones producidos por FIV y tratados a partir del día 5 con N2B27 t2iGö h-LIF hasta el día 8 cuyo ICM fue aislado manualmente con agujas de tungsteno y puesto en co-cultivo con m-MEF para el establecimiento de ESC bovinas. Imágenes de campo claro obtenidas de microscopio invertido, magnificación del objetivo 5X (A y C) y 10X (B).

Los embriones en t2iGö h-LIF fueron utilizados para el aislamiento de ESC, a los que previamente se le aisló el ICM

manualmente con agujas de tungsteno; de un total de 15 embriones protruidos en día 8 se pudieron aislar 12 ICM, de los cuales 7 se

cultivaron en medio N2B27 t2iGö h-LIF sobre m-MEF y los 5 restantes en el mismo medio, pero con el agregado de FGF (20 ng/ml).

Otros 11 embriones protruyeron en día 9, a los cuales a 9 se les pudo aislar el ICM. De estos ICM de día 9 se cultivaron 5 en el medio

N2B27 t2iGö h-LIF y 4 en el mismo medio, pero con el agregado de FGF. En la Tabla 35 se muestra en número de ICM adheridos a

las mMEFs.

Tabla 35: Número de ICM adheridos en well de placa 4 well con m-MEF.

Condiciones de cultivo N2B27 t2iGö h-LIF N2B27 t2iGö h-LIF + FGF

Embriones de día 8

N2B27 + h-LIF + t2iGö MEF

5/7 5/5

Embriones de día 9

5/5 4/4

Nota: Los embriones fueron obtenidos por FIV y cultivados de día 5 a 8-9 en medio N2B27 con t2iGö h-LIF. Los

blastocistos protruidos fueron manualmente disectados con agujas de tungsteno y cultivados a 38.5 °C y 5 % CO2 y 5 % O2 durante 7

días.

Los macizos se adhirieron en su mayoría en el transcurso de 1 día de haberlos puesto en cultivo sobre m-MEF. A los 4

días en cultivo se evidenció signos de diferenciación. Las células diferenciadas crecieron a mayor velocidad que las células

pluripotentes lo que no permitió la expansión de estas últimas. Como se observa en la Figura 32, el macizo en cultivo sobre m-MEF y

medio N2B27 t2iGö h-LIF presenta, a los 3 días, pocas células diferenciadas rodeándolo, tiene buen aspecto, bordes definidos como

colonia de células pluripotentes y es refringente. Sin embargo, en el sexto día esta misma colonia ya está rodeada de células de

morfología distinta, tipo mesenquimales, y el macizo ha comenzado a perder las características iniciales y a ponerse oscuro.


1

100

Sobre

MEF

3 días de cultivo 6 días de cultivo

N2B27

t2iGö

h-LIF

N2B27

t2iGö h-LIF FGF

Figura 32: ICM de embriones protruidos de 8 días en co-cultivo sobre m-MEF en medio N2B27 t2iGö h-LIF sin y con FGF. Las imágenes fueron obtenidas en microscopio invertido, campo claro con una magnificación del objetivo de 10x (N2B27 t2iGö h-LIF) y 5x (N2B27 t2iGö h-LIF FGF) a los 3 y 6 días de haber sido inciado el co-cultivo. Las placas se incubaron en estufa a 38.5 °C 5 % de CO2 y 5 % de O2.

Al día 5, los macizos que aun teniendo células diferenciadas a su alrededor se veían saludables (refringentes y bordes

definidos) se picaron y pasaron a nuevos wells con m-MEF tratando de separarlos de las células que compiten con las células

potencialmente pluripotentes. Dos días después del repique las células diferenciadas volvieron a aparecer alrededor del ICM y este no

creció sensiblemente de tamaño, por lo que se decidió fijar con 4 % PFA y proceder a la IF de NANOG y SOX17.


1

101

Campo claro NANOG SOX17

N2B27 t2iGö h-LIF

N2B27 t2iGö h-LIF FGF

(20 ng/ml)

Figura 33: IF de ICM sobre m-MEF a los 7 días de cultivo (2 días despúés del primer repique). Las imágenes mostradas fueron tomadas en microscopio invertido de fluorescencia, con una magnificación del objetivo de 20x y 10x (N2B27 t2iGö h-LIF sin FGF y con FGF respectivamente)

Los resultados de la inmunofluorescencia de los macizos sobre m-MEF indican que a los 7 días de haber sido aislados y

puestos a cultivar para el establecimiento de ESC, las células que en principio se creían en su totalidad pluripotentes (por los

resultados obtenidos previamente con los embriones tratados en medio N2B27 t2iGö CHO LIF) se diferenciaron en cultivo. Las

imágenes de campo claro muestran el cambio de morfología evidente, que es el primer indicio de la pérdida de la pluripotencia.

SOX17 aparece presente en ambos casos (medio con y sin FGF), lo que marca con claridad una evidencia de diferenciación hacia

endodermo. NANOGno se detecta en cultivo con N2B27 t2iGö h-LIF o se expresa a niveles basales; cuando además se le agrega

FGF (Figura 33) se observa fluorescencia solo un poco por arriba del nivel del fondo. Hay que mencionar aquí que los ICM crecieron

en mayor tamaño en presencia de FGF que en su ausencia, por lo cual, para tomar la imagen de toda la estructura adherida a m-MEF

se debieron utilizar dos magnificaciones del objetivo diferentes, de allí la razón por la cual se mencionan estas diferencias en la

adquisión de la imagen.

Los resultados en el procedimiento de establecer un cultivo de ESC a partir de embriones tratados fueron inesperados. Si

bien se realizó una sola tanda de embriones, el núnero de ICM aislados y plaqueados sobre m-MEF es lo suficientemente grande para

inferir que el comportamiento no es azaroso. Por tanto, se decidió profundizar en las posibles causas. Se produjeron más embriones

por FIV de acuerdo a la metodología empleada en el laboratorio de embriones de la Universidad de Nottingham, los que se

caratcerizaron con el fin de verificar si los resultados obtenidos en las réplicas realizadas en Argentina eran reproducibles en UK.


1

102

5.4.2. Resultados en colaboración con el Grupo de la Universidad de Nottingham (Reino Unido)

Como parte del programa de intercambio PICT Raíces 1727-2013 se realizó una estancia en Reino Unido, en la

Universidad de Nottingham de 7 meses de duración. Tal como se menciona en las secciones anteriores, durante dicho período se

analizaron los embriones producidos en Argentina por IF (resultados presentados en la sección anterior) y se llevó a cabo una primera

manipulación para establecer ESC de ICM aislados de embriones tratados con N2B27 t2iGö h-LIF. Los resultados preliminares

sugerían que este tratamiento permitía tener un ICM compuesto enteramente de células NANOG positivas. En la experiencia de

establecer ESC, si bien los ICM se adhirieron a las m-MEF al día siguiente de haberlos puesto en co-cultivo (lo cual es indicativo de

la viabilidad de las células del macizo) las células pluripotentes no mostraron ser capaces de establecer un cultivo en crecimiento y

por el contrario se diferenciaron entre el día 4 y 7. No se supo con exactitud en ese momento si tenía que ver con los tratamientos, o

con el protocolo utilizado para aislar ESC. Se decidió por ende caracterizar los embriones generados en UK que como se mencionó

antes, desde el punto de vista de su producción tiene diferencias importantes con los obtenidos en Argentina. Los resultados se

presentan en esta sección. Cabe señalar que el hecho de haber utilizado CHO LIF en lugar de un LIF comercial, como se hizo luego

en Inglaterra puede ser uno de los factores de impacto fundamentales, el protocolo descrito para generar los embriones caracterizados

en esta sección es más robusto puesto que se quita dos fuentes importantes de variabilidad no controlable: el CHO LIF y el uso de

SFB.

Producción embrionaria

A diferencia de lo realizado en colaboración con el Grupo de la FAUBA, en el sistema de producción de embriones

bovinos de la Universidad de Nottingham se trabajó con embriones producidos por FIV y cultivados en su totalidad en medio sin

suero (los primeros 4 días en BBH7 y luego en N2B27 con inhibidores y LIF). Se utilizó LIF de origen humano (LIF comercial, de la

marca Peprotech), a diferencia del CHO LIF utilizado en Argentina que es la proteína de ratón secretada por las células CHO en

cultivo. El diseño de experimentos se modificó levemente por lo que se añadieron los grupos t2iGö, h-LIF para distinguir entre el

efecto de los inhibidores, el del LIF y el de la combinación de ambos. Asimismo, se utilizó CHO LIF tratando de dilucidar si los

resultados conseguidos en Argentina y que no se pudieron reproducir en Nottingham tenían que ver con el uso de esta citoquina en su

formato indefinido y de origen murino o con el sistema productivo utilizado. Se ha reportado en otros estudios que el efecto de LIF

durante el desarrollo embrionario bovino temprano depende de la fuente utilizada (proteína de ratón o humana) (86–89). En

Argentina el sobrenadante de las CHO se utilizó como una solución 125x.De igual manera, se usó el CHO LIF en Nottingham,

concentración 8 veces por encima de la utilizada para cultivar m-ESC.

Durante el registro de datos de producción embrionaria hemos notado que la eficiencia de producción en condiciones

definidas (sin suero) son menores a los comúnmente obtenidos en SOF con suero (datos no mostrados). A día 7, el número de

blastocistos es menor en estos medios (base N2B27) que los usualmente obtenidos con SOF con SFB, y se incrementa

progresivamente entre los días 8 y 9, como si existiese un pico en la producción un poco más tardío que el que se logra con SOF 2.5

% SFB sugiriendo que el SFB tiene un impacto en la cinética de producción embrionaria. En la Tabla 36 se muestra el número total y

la clasificación de los blastocistos obtenidos entre día 8 y 9. Cuando se realizan las pruebas de comparaciones múltiples entre las

condiciones definidas de cultivo embrionario los resultados demuestran que no hay diferencia significativa entre el medio control

N2B27 con DMSO y los tratamientos h-LIF, CHO LIF y t2iGö h-LIF (p valor > 0.05). Independientemente del tipo y fuente de LIF


1

103

utilizado, los tratamientos con LIF no tienen efecto en el nivel de producción embrionaria. Por el contrario, cuando solo se añade la

mezcla de inhibidores t2iGö al medio N2B27, se registra una disminución en la tasa de blastocistos totales, al parecer restaurada al

nivel del control cuando en forma concomitante se añade h-LIF (Tabla 36). Harris et al., (2013) demostraron que la adición de 2i

(inhibidores de MAPK y GSK3b) mejora la producción de blastocistos, presentándose un incremento en la proporción de blastocistos

protruidos o en protrusión a expensas de los blastocistos tempranos (41). En nuestro estudio, la adición del inhibidor de PKC

probablemente antagonice el efecto de la mezcla 2i observado por los otros autores. Se conoce que la vía de PKC está implicada en la

regulación de la proliferación y muerte celular. Un estudio en embriones de ratón demuestra que el inhibidor de PKC retrasa la tasa

de cavitación, lo que sugiere un rol de PKC en la homeostasis de los embriones en desarrollo (90). Adicionalmente, nuestros

resultados sugieren que la adición de h-LIF a la mezcla t2iGö restaura la eficiencia embrionaria al nivel del control probablemente

por la acción de esta citoquina en la activación de señales de transducción relacionadas con el incremento en la supervivencia

(mecanismo mediado por PI3K/AKT) y un efecto anti-apoptótico (mediado por la activación de la vía JAK/STAT).

Tabla 36: Efecto del medio t2iGö h-LIF en la producción embrionaria. * día 8 y 9.

Tratamiento n N Clivado BL BE BHing BHed Total* % (media ± SEM)

N2B27 DMSO 3 111 78 1 0 0 18 19 24 ± 5 a

N2B27 h-LIF 4 131 100 1 3 0 18 22 22 ± 4 a

N2B27 CHO LIF 2 80 53 0 1 0 12 13 25 ± 6 a

N2B27 t2iGö 4 244 155 4 0 2 17 23 15 ± 3 b

N2B27 t2iGö h-LIF 3 250 185 5 8 1 45 59 32 ± 3 a

Nota: El porcentaje de blastocistos se basa en el número de embriones clivados. n es el número de manipulaciones de FIV

independientes, N es el número total de ovocitos. Las letras diferentes representan diferencias significativas (p<0.05).

Efecto en el primer evento de segregación (formación de ICM y TE)

Takashima et al., (2014) previamente demostaron que las células h-ESC modificadas genéticamente (con Klf2 y NANOG)

pueden ser mantenidas en estado naïve en presencia del inhibidor PD325901 y una concentración ajustada de inhibidor de GSK3,

CHIR99021, solo si se suplementa esta mezcla conocida como t2i con el inhibidor de PKC, Gö6983 y LIF (91). Adicionalmente, un

trabajo reciente del mismo grupo demuestra que se pueden aislar h-ESC con caraterísticas naïve directamente de embriones

humanos,si se cultivan las células del ICM en medio t2iGö LIF y MEF (92). Este último trabajo pone en evidencia que las

condiciones estándar de cultivo de h-ESC favorecen la transición del epiblasto embrionario al epiblasto posimplantatorio (estado de

características primed) in vitro, y que en principio el estado naïve está presente también en el embrión humano y puede ser capturado

y mantenido en cultivo si las condiciones son adecuadas.

En el presente trabajo se utilizaron las condiciones de cultivo naïve para producir embriones bovinos in vitro y determinar

si estas condiciones favorecen características relacionadas al estado naïve en el embrión. Por lo tanto, se colocaron embriones de 64

células (mórula de día 5) en medio libre de suero y con PD325901, CHIR99021, Gö6983 y h-LIF. En todas las condiciones se

formaron los blastocistos, se expadieron y la mayoría protruyeron en cultivo lo que indica que el agregado de los inhibidores no

interfiere con la viabilidad de los embriones, la formación del trofoblasto y la diferenciación. Posteriormente se analizaron los

embriones por IF, se utilizó para ello anticuerpos contra NANOG y SOX17. Las células totales se cuantificaron (Nt) mediante el


1

104

conteo de los núcleos con DAPI, las del ICM se obtuvieron mediante la suma de NANOG y SOX17 y las del TE como la resta de los

anteriores. Manteniendo al margen de los resultados obtenidos con CHO LIF (en los que en general no se observa ningún efecto), los

resultados indican que comparado con el control (ICM:Nt de 0.20 ± 0.03), la proporción ICM:Nt se incrementa en todos los

tratamientos (Figura 34 A). Comparando entre los tratamientos, se observa que la proporción ICM:Nt no presenta diferencias

significativas entre t2iGö (0.28 ± 0.04) y t2iGö h-LIF (0.27 ± 0.04), y que para estos dos tratamientos esa relación es

significativamente menor que la lograda por h-LIF (0.33 ± 0.03). Al mismo tiempo, la proporción TE:Nt es significativamente mayor

para el control (0.79 ± 0.03) que para los tratamientos t2iGö (0.72 ±0.04), h-LIF (0.66 ±0.04) y t2iGö h-LIF (0.71 ± 0.04) (Figura 34

B). Si se combina ambas variables el radio ICM/TE es de 0.25 ± 0.05 versus 0.39 ± 0.08, 0.50 ± 0.08 y 0.38 ± 0.08 (control versus

t2iGö, h-LIF y t2iGöLIF, respectivamente). El número total de células es constante entre el control (261 ± 15) y los tratamientos h-

LIF (281 ± 17) y t2iGö (282 ± 17), pero menor para t2iGö h-LIF (209 ± 13) (Figura 34 C). El número de células del TE también es

menor en t2iGö h-LIF (142 ± 14) que para el resto de los tratamientos (198 ± 19 en t2iGö y 180 ± 18 en h-LIF) y control (210 ± 20)

(Figura 34 E), lo que sugiere que en esta condición el embrión es de menor tamaño debido a que el TE es menor. Al estudiar por

separado los efectos de los inhibidores y h-LIF se observa que el responsable de esta disminución es en parte el agregado de h-LIF

(ya que también disminuye en número de células del TE) pero que además la combinación de este con los inhibidores ejerce una

interacción que disminuye aún más el número de TE comparado con el control. Por lo tanto, es probable que la combinación afecte el

crecimiento de las células del TE ya sea debido a diferencias en la tasa de proliferación o muerte del TE. Se necesitan más estudios

para determinar cuál de los dos efectos es el responsable de dicha disminución.

Finalmente, el número de células del ICM se incrementa en los tratamientos t2iGö (75 ± 10) y h-LIF (91 ± 12)

comparados con el control (53 ± 7), pero no en t2iGö h-LIF (55 ± 8). Esto sugiere que si bien todos los tratamientos ejercen un efecto

significativo en la proporción ICM:TE las causas son distintas dependiendo del tratamiento en cuestión. En el caso de h-LIF,

observamos un incremento en el ICM a expensas del TE, lo cual se había definido en la sección anterior como un impacto real sobre

la segregación, es decir sobre la decisión celular de convertirse en una especie en contraposición de otra en la especificación. En el

caso de t2iGö el embrión experimenta un aumento del número de células del ICM, pero sin experimentar cambios en el TE (respecto

al control), mientras que en el tratamiento t2iGö h-LIF el ICM se mantiene de igual tamaño que el control y el TE disminuye. Al

contrario de lo esperado, el tratamiento t2iGö h-LIF no ejerce un efecto conjugado entre h-LIF y t2iGö, es decir que los efectos de

cada tratamiento por separado no son aditivos al combinarlos. Este tipo de comportamiento sugiere una interacción entre ambos,

probablemente debido a la activación de diferentes mecanismos por h-LIF y la inhibición de alguno de ellos al agregar los

inhibidores. Cuando los inhibidores se agregan sin h-LIF están actuando sobre los mecanismos activos endógenamente durante el

desarrollo embrionario.

Se ha demostrado en estudios previos que el efecto del LIF durante el desarrollo embrionario bovino difiere dependiendo

de la fuente que se utilice (b-LIF, m-LIF y h-LIF). Yamanaka et al., (2001) demuestran que el agregado de b-LIF aumenta el número

de células del TE en blastocistos protruidos y por ende el número total de células Nt, sin afectar en número de células del ICM (86).

Por otro lado, Sirisathien et al., (2003) demuestran que el agregado de 100 ng/ml de h-LIF aumenta en número de células del ICM

comparado con el control, y con ello en Nt sin afectar el TE cuando evalúa embriones de FIV de día 8 que han sido tratados in vitro

desde el día 6 con la citoquina (87). Un estudio más reciente que compara las dos variantes de LIF (m-LIF y h-LIF) demuestra que en


1

105

blastocistos de día 8 tratados con 100 ng/ml de LIF desde la mórula el agregado de m-LIF disminuye el número de células del ICM y

no afecta el TE, mientras que el agregado de h-LIF no afecta ninguno de los tipos celulares y por ende tampoco el número total de

células (89). En este estudio el agregado de 20 ng/ml de h-LIF se decidió en base a lo utilizado en iPSC y ESC de humano, y a los

estudios hecho en paralelo de iPSC de porcino y bovino mostrados en el capítulo 2 de la presente tesis. En concordancia con lo

publicado por Sirisathien et al., (2003) en esta investigación el agregado de h-LIF aumenta el número de células del ICM, sin

embargo también se encontró una disminución de las células del TE para este tratamiento. En ratón se ha demostrado que las células

del TE producen LIF y que este LIF tiene un efecto paracrino en la expansión de las células del ICM donde la expresión de los

receptores de LIF y proteínas ancladas a los receptores también se demuestra que es mayor (84).

En el caso de los tratamientos basados en los inhibidores de MEK y GSK3 estudios anteriores llevados a cabo con

embriones bovinos demuestran que tanto 2i, 2i+ como CHIR aumentan el número de células del macizo respecto al control de DMSO

(41,67). 2i y CHIR aumentan además el número de células del TE al menos así lo demuestra el estudio de Harris et al., (2013),

aunque en el estudio de Mc Lean et al., (2014) el efecto de 2i sobre el TE no es significativo. En este estudio el agregado del

inhibidor de PKC no altera el efecto de 2i, lo que en concordancia con lo previamente publicado para 2i, t2iGö aumenta el número de

células del ICM. El número de células del TE no se ve afectado significativamente en este estudio.

Finalmente, hay que destacar que el efecto del tratamiento t2iGö h-LIF ha sido evaluado por primera vez en el desarrollo

embrionario temprano de bovinos con el presente estudio.


1

106

N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

iGö

N2B

27 C

HO L

IF

N2B

27 h

-LIF

1X

N2B

27 t2

iGö h

-LIF

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

c

b

c

ab

A

ICM

:Nt

N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

iGö

N2B

27 C

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N2B

27 h

-LIF

1X

N2B

27 t2

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0.2

0.4

0.6

0.8

1.0a

ba

cb

B

TE

:Nt

Nt

N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

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N2B

27 C

HO

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N2B

27 h

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1X

N2B

27 t2

iGö h

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0

50

100

150

200

250

300

350

400

aa a a

b

C

Nú

mero

de c

élu

las p

or

em

bri

ón

ICM

N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

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N2B

27 C

HO

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N2B

27 h

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27 t2

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50

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Nú

mero

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TE

N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

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N2B

27 C

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N2B

27 h

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N2B

27 t2

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50

100

150

200

250

300

b b

a

c

d

E

Nú

mero

de c

élu

las p

or

em

bri

ón

Figura 34: Efecto durante el primer evento de diferenciación del embrión, impacto en el tamaño del ICM versus TE: t2iGö h-LIF y t2iGö no ejercen un efecto en la segregación, mientras que el agregado de h-LIF por si solo aumenta el número de células del ICM a expensas del TE (comparado con el control de DMSO). Los gráficos A y B muestran la relación ICM:Nt y TE:Nt respectivamente. Los C-E el número de células totales (Nt), del

macizo (ICM) y del trofoectodermo (TE). Los datos fueron analizados por un MLGM con distribución de Poisson (cuando se analizó el número de células por embrión) y binomial (al analizar proporciones ICM:Nt y TE:Nt). El softwa re utilizado fue el infostat acoplado a R. Las letras diferentes marcan medias significativamente diferentes (p value < 0.05).


1

107

N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

iGö

N2B

27 C

HO

LIF

N2B

27 L

IF 1

X

N2B

27 L

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iGö

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

b b b b

a

A

Nan

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:IC

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N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

iGö

N2B

27 C

HO

LIF

N2B

27 L

IF 1

X

N2B

27 L

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iGö

0.0

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0.4

0.6

0.8 a

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B

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N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

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N2B

27 C

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N2B

27 h

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1X

N2B

27 t2

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0.00

0.05

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b

C

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N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

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N2B

27 C

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N2B

27 h

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N2B

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b

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D

Nú

mero

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ón

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N2B

27 D

MSO

N2B

27 t2

iGö

N2B

27 C

HO

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N2B

27 h

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N2B

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E

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mero

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bri

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Células co expresadas

N2B

27 D

MSO

N2B

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N2B

27 C

HO L

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N2B

27 h

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N2B

27 t2

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0

5

10

15

20

F

cc c

b

a

Nú

mero

de c

élu

las p

or

em

bri

ón

Figura 35: Segundo evento de diferenciación en el embrión bovino: formación del epiblasto versus hipoblasto. t2iGö h-LIF ejerce un efecto parcial en la segregación (aumenta Nanog y disminuye Sox17); mientras que el agregado de h-LIF aumenta Nanog, Sox17 y la co-expresión en el ICM sin variar las relaciones entre ellos comparado con el control. Los gráficos A, B y C muestran la

relación Nanog:ICM, Sox17:ICM y co epxresión:ICM respectivamente. Los D-F el número de células Nanog, Sox17 y Co-expresión por embrión. Los datos fueron analizados por un MLGM con distribución de Poisson (cuando se analizó el número de células por embrión) y binomial (al analizar proporciones). Análisis llevado a cabo en infostat acoplado a R. Las letras diferentes marcan medias significativamente diferentes (p value < 0.05).


1

108

Efecto en el segundo evento de segregación (formación del epiblasto y PE)

Con el objetivo de correlacionar los cambios en el número de células del ICM entre los tratamientos con el segundo evento

de diferenciación embrionaria en el que se lleva a cabo la especificación del epiblasto e hipoblasto, se analizaron los embriones de día

8 mediante IF con anticuerpos específicos para NANOG y SOX17. De acuerdo a la Figura 35 A la proporción de células NANOG en

el ICM es significativamente mayor en el tratamiento t2iGö h-LIF comparado con el resto de los tratamientos y el control (p valor <

0.05). Al mismo tiempo, la proporción de células SOX17 positivas en el ICM en este tratamiento es el menor alcanzado (Figura 35 B

y Figura 36), también hay una disminución significativa en t2iGö (Figura 35 B y Figura 36) comparado con el control aunque el

análisis sugiere que es debido a distintas razones. Cuando se cuantifica el número de células por embrión podemos detectar que para

todos los tratamientos (excepto CHO LIF) el número de células NANOG positivas es mayor que el control (25 ± 4) (Figura 35 D), en

t2iGö (40 ± 7), h-LIF (44 ± 7) y t2iGö h-LIF (45 ± 8). El número de células SOX17 positivas (Figura 35 E) solo decrece en t2iGö h-

LIF (19 ± 3) y permanece sin cambios en t2iGö (38 ± 5) comparado con el control (34 ± 5). Sorprendentemente, la cantidad de

células SOX17 positivas es mucho mayor en el tratamiento con h-LIF (61 ± 8), lo que indica que no solo NANOG sino también

SOX17 aumenta con el agregado de LIF y más interesante aún, el número de células que co-expresa ambos marcadores. Por lo tanto,

los resultados indican que la proporción de NANOG y SOX17 en el ICM no varían respecto al control porque hay un incremento

tanto del número de células NANOG como SOX17 positivas, así como NANOG/SOX17 co-expresados. Se podría pensar entonces

que h-LIF promueve un estado intermedio de las células del ICM antes de especificarse. Este efecto de LIF sobre el desarrollo

embrionario es por un lado beneficioso, ya que incrementa el número de células NANOG positivas, pero por otro lado puede resultar

crítico durante el aislamiento de células ESC ya que también incrementa las células SOX17 positivas. Las células SOX17 positivas

pueden ejercer un efecto paracrino sobre las células del epiblasto que se pretenden inmortalizar por lo que debe tenerse en cuenta este

efecto cuando se agrega LIF en los medios de cultivo de ESC bovinas. Adicionalmente la existencia de células que al parecer tienen

un repertorio de factores de transcripción de ambos linajes, que son a su vez antagonistas en el embrión, es otro punto a considerar

para establecer ESC a partir de células del macizo bovino en cultivo con LIF. Afortunadamente el efecto de LIF en la población

pluripotente del embrión se mantiene en el tratamiento t2iGö h-LIF a la vez que se reduce el número de células SOX17 positivas.

Esto desde el punto de vista tecnológico es una característica deseable. Como h-LIF por sí solo incrementa el número de células

SOX17, y t2iGö solo no tiene efecto en esta población celular, los resultados sugieren que en el tratamiento conjugado h-LIF y los

inhibidores tienen una interacción cuando se añaden conjuntamente que no es el resultado aditivo de los efectos por separado y que

impacta en el segundo evento de diferenciación embrionaria. Para finalizar hay que mencionar que la proporción de células SOX17

positivas en el macizo (SOX17:ICM) decrece en t2iGö y en t2iGö h-LIF, pero aparentemente por distintas razones, en el primer caso

se debe a que el incremento del número de células NANOG positivas aumenta como resultado el número de células del ICM, pero

SOX17 se mantiene constante, por lo tanto, hay una relación entre ambos que disminuye SOX17:ICM pero a NANOG:ICM

constante. En el segundo caso, t2iGö h-LIF, hay una disminución de SOX17 así como un aumento de NANOG debido al efecto en el

segundo evento de diferenciación. Por tanto, se incrementa la proporción de células NANOG positivas en el macizo (NANOG:ICM)

mientras disminuye SOX17:ICM.


1

109

N2B27

DMSO

N=15

SOX17

NANOG

Merge

N2B27

t2iGö

N=10

N2B27

CHO

LF

N=9

N2B27

h-LIF

N=10

N2B27

t2iGö

h-LIF

N=9

Figura 36: Inmunofluorescencia de embriones de día 8, producidos por FIV, cultivados en BBH7 hasta día 5 y tratados en medio N2B27 del día 5 al 8. Células NANOG positivas (verdes) versus SOX17 (rojas). Las células que co-expresan ambos marcadores se muestran en color naranja. N2B27 DMSO (control, N=15); N2B27 t2iGö (N=10); N2B27 CHO LIF (N=9); N2B27 h-LIF 1x (N=10); N2B27 t2iGö h-LIF (N=9).


1

110

5.4.3. Modulación in vitro de las vías de señalización: MAPK/ERK y Wnt, en el embrión bovino

La activación de la vía MAPK/ERK es uno de los mecanismos conservados entre las especies que impacta en la segregación

del PE, pero en bovinos se requiere seguir profundizando para establecer alguna otra vía, tal que al inhibirla en forma conjunta se

lleve a cabo el bloqueo total del establecimiento del endodermo primitivo. En estudios recientes desarrollados con embriones de

mono tití, se determinó que MAPK/ERK junto con Wnt son necesarios para establecer el epiblasto e hipoblasto de dicha especie (93).

De acuerdo a los resultados previos presentados en esta tesis, en esta sección se evaluó una nueva hipótesis:

MAPK/ERK y Wnt participan en forma conjunta en el establecimiento del endodermo primitivo bovino durante el

desarrollo embrionario temprano.

El diseño de experimento propuesto fue el siguiente:

• N2B27 + DMSO (control).

• N2B27+ inhibidor de MAPK/ERK (PD0325901, 10 µM).

• N2B27 + inhibidor de Wnt (IWP2, 2.5 µM).

• N2B27 + inhibidor de MAPK/ERK y Wnt.

Resultados análisis de la producción embrionaria

Se llevó a cabo la producción in vitro de embriones bovinos de acuerdo a lo detallado en la Sección 4.1. de Materiales y

Métodos. Brevemente, se cultivaron los cigotos hasta el día 5 en SOF 2.5 % de SFB y luego se asignaron al azar las gotas al medio

N2B27 con DMSO o bajo diferentes tratamientos (ver diseño de experimentos). El objetivo de este experimento fue analizar el efecto

de inhibir MAPK/ERK y Wnt en forma conjunta utilizando una concentración de 10µM de PD0325901 (PD032+) y 2.5 µM de

IWP2. En términos de producción, ninguna de las condiciones analizadas interfirió con la formación de blastocistos con morfología

normal (Figura 37), aunque se tuvo mayor dificultad para obtener blastocistos protruidos de día 8 en el tratamiento con IWP2 (este

estadio fue tomado como muestra y analizado por inmunofluorescencia). El tratamiento con PD032+ tuvo el mejor rendimiento en la

producción embrionaria de día 8, y su eficiencia fue del 81 ± 10 % comparado con el resto de los grupos. En el control tuvimos una

eficiencia de producción del 38 ± 8 %, 28 ± 7 % para el grupo con IWP2 y 59 ± 12 % para la combinación de inhibidores (Tabla 37).

Tabla 37: Efecto del medio IWP2 + PD032+ en la producción embrionaria. * día 8.

Grupos n Clivados BL BE BHing BHed Total*

N2B27 DMSO 4 63 12 (19 ± 2) a 7 (11 ± 4) b 3 (5 ± 3) b 2 (3 ± 2) b 24 (38 ± 8) b

N2B27 IWP2 4 83 7 (8 ± 3) b 17 (20 ± 4) a 0 2 (2 ± 2) b 26 (28 ± 7) b

N2B27 PD032+ 2 18 4 (22 ± 10) a 5 (28 ± 11) a 3 (17 ± 9) a 2 (11 ± 8) a 14 (81 ± 10) a

N2B27 IWP2 + PD032+ 2 24 2 (8 ± 6) b 8 (33 ± 10) a 0 3 (12 ± 7) a 13 (59 ± 12) b

Nota: Los datos se presentan como número de embriones y entre paréntesis el porcentaje de blastocistos en base al número de

embriones clivados (media ± SEM). n es el número de manipulaciones de FIV independientes. Las letras diferentes representan

diferencias significativas (p<0.05, analizados por MLGM con distribución binomial y función de enlace logit en INFOSTAT).


1

111

Resultados análisis de segregación de linajes embrionarios

Los resultados de la cuantificación de células con marca positiva de NANOG y SOX17, así como del número total de

células del embrión y del TE se resumen en la Tabla 38.

Tabla 38: Análisis estadístico del efecto de la modulación de MAPK/ERK y Wnt en el primer y segundo evento de diferenciación.

Grupos n N DAPI ICM TE NANOG SOX17

DMSO 4 7 258 ± 11b 97 ± 4a 161 ± 9b 42 ± 3b 57 ± 5a

IWP2 (2.5 µM)

3 6 306 ± 14a 108 ± 5a 196 ± 12a 52 ± 4a 59 ± 6a

PD032+ (10 µM)

2 6 216 ± 10c 34 ± 3b 181 ± 11a 33 ± 3c 1 ± 0.43b

IWP2 + PD032+ 2 6 212 ± 10c 22 ± 2c 190 ± 12a 23 ± 2d 0 ± 0b

Nota: Número de células (media ± SEM) analizadas por MLGM en infostat con distribución Poisson y función de enlace logic.

Se llevó a cabo el análisis estadístico haciendo uso del software INFOSTAT. Mediante el análisis de modelos lineales

generalizados mixtos se evaluó el número de células; teniendo en cuenta que diferentes tandas de ovarios pueden ser fuente no

controlable de la variabilidad entre réplicas. Se usó un modelo mixto en el que la variable “número de réplica” se tomó como efecto

aleatorio, y la variable “medio” como efecto fijo. Como puede observarse en las predicciones del modelo resumido en la Tabla 38 y

en la dispersión de los datos de la Figura 38, el cultivo con IWP2 aumentó el número de células totales a raíz de un leve aumento de

las células del TE, aunque el tamaño del ICM se mantuvo constante comparado con el control. Este aumento de las células del TE sin

alterar las del ICM sugiere un efecto sobre la tasa de multiplicación y muerte celular de las células del TE más que un cambio en la

decisión de los blastómeros en formar parte del ICM o TE. Por su parte el tratamiento con PD032+ afecta al número total de células

comparado con el control, debido a una disminución del tamaño del ICM y el leve aumento de las células del TE no compensa este

efecto. Al contabilizar las células con marca NANOG y SOX17 positivas se observa que el mayor de los cambios entre los grupos

analizados es el bloqueo de expresión de SOX17 a una concentración de 10 µM de inhibidor. El número de células con NANOG

también disminuye levemente comparado con el control.


1

112

Figura 37: Efecto de la modulación de MAPK/ERK y Wnt en la expresión de NANOG y SOX17 en embriones bovinos protruidos entre día 8 y 8.5. Los embriones se cultivaron en medio SOF 2.5 % SFB desde el estadio de cigoto a mórula de día 5 y luego se asignaron al azar a gotas con medio N2B27 con DMSO o bajo diferentes tratamientos: inhibición de MAPK/ERK con PD0325901 (PD032+, 10 µM), inhibición de Wnt con IWP2 (2.5 µM) y la combinación de ambos. Las muestras se fijaron a día 8. Inmunofluorescencia de NANOG (verde), SOX17 (rojo) y DAPI (azul) en blastocistos producidos por FIV. N: número de embriones analizados. Barra: 10 µm.

NANOG SOX17 MERGE+DAPI

PD032+

(10 uM)

IWP2

IWP2 +

PD032+

N=6

N=7

N=6

N=6

DMSO


1

113

DAPI

DM

SO

IWP2

PD03

2+ (1

0 uM

)

IWP2

+ PD03

2+ (1

0 uM

)

0

100

200

300

400

500N

um

ber

of

cell

s p

er

em

bry

o

ICM

DM

SO

IWP2

PD03

2+ (1

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IWP2

+ PD03

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50

100

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Nu

mb

er

of

cell

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TE

DM

SO

IWP2

PD03

2+ (1

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)

IWP2

+ PD03

2+ (1

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200

300

400

500

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

NANOG

DM

SO

IWP2

PD03

2+ (1

0 uM

)

IWP2

+ PD03

2+ (1

0 uM

)

0

20

40

60

80

100

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

SOX17

DM

SO

IWP2

PD03

2+ (1

0 uM

)

IWP2

+ PD03

2+ (1

0 uM

)

0

20

40

60

80

100

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

Figura 38: Gráfico de dispersión del número total de células (DAPI), ICM, TE y células NANOG y SOX17 positivas del control y los tratamientos. El análisis estadístico demuestra que la inhibición de Wnt no afecta la expresión de NANOG y SOX17 comparado con el control. La inhibición de MEK con 10 µM de PD0325901 es el único tratamiento que bloquea la expresión de SOX17 y posiblemente la diferenciación a PE. La combinación de inhibidores también decrece en la mitad el número de células de NANOG comparado con el control y el grupo de IWP2.

A diferencia de lo estudiado en el primer bloque de experimentos en los que PD032 se utilizó a una concentración de 1

µM, se decidió en esta tanda elevar a 10 µM ya que un estudio previo a nuestra nueva serie de experimentos demostró que el efecto

sobre NANOG y SOX17 se detecta a esta concentración y no a 0.4 y 1 µM cuando se utiliza en la combinación con CHIR (2i+). Este

efecto del medio 2i+ se debió a exclusivamente al aumento de PD032.

Finalmente, el grupo con los dos inhibidores produjo embriones con menor cantidad de células totales comparado con el

control, y un macizo de tamaño menor. El aumento del número de células del TE fue leve mientras que la disminución de SOX17 fue

total y la de NANOG significativamente menor (alrededor del 50% menos que el control). Al comparar los grupos IWP2 + PD032+

con aquel de única inhibición por PD032+ se observa que el número de células NANOG+ es menor de lo que se esperaba y por ende

sugiere que hay una interacción entre los mecanismos que refuerza el efecto antagónico sobre el número de células NANOG+.


1

114

5.4.4. Curva dosis respuesta de PD0325901 y su efecto en la producción y segregación de embriones bovinos

Con el fin de establecer si el efecto sobre las células NANOG y SOX17 está asociado a la concentración del inhibidor, se

estudió adicionalmente 2 concentraciones menores que PD032+ y se lo comparó con los embriones control (Figura 39). También se

analizó la producción embrionaria a día 8 (Tabla 39)

Tabla 39: Efecto de la concentración de PD032 en la producción embrionaria. * día 8.

Grupos n Clivado BL BE BHing BHed Total*

N2B27 DMSO 4 63 12 (19 ± 2) a 7 (11 ± 4) b 3 (5 ± 3) b 2 (3 ± 2) b 24 (38 ± 8) b

N2B27 PD032 2,5 2 49 4 (8 ± 4) b 7 (14 ± 5) b 1 (2 ± 2) b 1 (2 ± 2) b 13 (26 ± 8) b

N2B27 PD032 5 2 46 5 (11 ± 5) b 11 (24 ± 6) a 4 (9 ± 4) b 2 (4 ± 3) b 22 (46 ± 10) b

N2B27 PD032+ 2 18 4 (22 ± 10) a 5 (28 ± 11) a 3 (17 ± 9) a 2 (11 ± 8) a 14 (81 ± 10) a

Nota: Los datos se presentan como número de embriones y entre paréntesis el porcentaje de blastocistos en base al número de

embriones clivados (media ± SEM). n es el número de manipulaciones de FIV independientes.

Los datos de producción embrionaria indican que existen diferencias significativas entre el control y el grupo PD032+,

mejorando tanto el rendimiento total como el porcentaje de blastocisto expandidos en adelante (Tabla 39). Mc Lean et al., (2014)

también detectan un aumento en el porcentaje de blastocistos de grado 1-2 respecto al control, y un rendimiento total del 96% de

embriones producidos in vitro a concentración de 10 µM de este inhibidor (67).

Tabla 40: Análisis estadístico del número de células totales (DAPI), ICM, TE, NANOG+ y SOX17+ de embriones tratados con diferentes concentraciones de PD0325901.

Grupos n N DAPI ICM TE ICM:TE NANOG SOX17

DMSO 4 7 258 ± 11a 97 ± 4a 161 ± 9b 0.60 ± 0.06a 42 ± 3a 57 ± 5a

PD032 (2.5 µM) 2 5 226 ± 11b 30 ± 3c 196 ± 12a 0.15 ± 0.02b 29 ± 3b 0.43 ± 0.31b

PD032 (5 µM) 2 9 257 ± 11a 44 ± 3b 211 ± 12a 0.21 ± 0.03b 43 ± 3a 0 ± 0b

PD032+ (10 µM) 2 6 216 ± 10b 34 ± 3c 181 ± 11a 0.19 ± 0.03b 33 ± 3b 1 ± 0.43b

Nota: La inhibición de MEK bloquea la expresión de SOX17 en todas las concentraciones. Los datos fueron analizados por MLGM

con distribución Poisson y función de distribución logic utilizando el software INFOSTAT. n es el número de FIV independientes, N:

el número de embriones analizados. Los datos se representan como la media ± SEM. Diferentes superscripts indican una diferencia

estadísticamente significativa entre los grupos (p<0.05)


1

115

Figura 39: Inmunofluorescencia de embriones tratados con inhibidor de MEK a diferentes concentraciones y su efecto sobre la expresión de NANOG y SOX17 en embriones bovinos protruidos entre día 8 y 8.5 producidos por FIV. Los embriones fueron cultivados hasta día 5 en SOF 2.5 % BSA y luego hasta día 8 en N2B27 con DMSO o a diferentes concentraciones de PD0325901: 2.5, 5 y 10 µM. (A) Detección por inmunofluorescencia de NANOG (verde), SOX17 (rojo) y DAPI (azul). N= número de embriones analizados. Barra: 10 µm

NANOG SOX17 MERGE+DAPI

N=5

N=7

N=9

N=6

DMSO

PD032 (2,5 uM)

PD032 (5 uM)

PD032+ (10 uM)


1

116

DAPI

DM

SO

PD03

2 2.

5 uM

PD03

2 5

uM

PD03

2+ 1

0 uM

0

100

200

300

400

500

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

ICM

DM

SO

PD03

2 2.

5 uM

PD03

2 5

uM

PD03

2+ 1

0 uM

0

50

100

150

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

TE

DM

SO

PD03

2 2.

5 uM

PD03

2 5

uM

PD03

2+ 1

0 uM

0

100

200

300

400

500

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

NANOG

DM

SO

PD03

2 2.

5 uM

PD03

2 5

uM

PD03

2+ 1

0 uM

0

50

100

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

SOX17

DM

SO

PD03

2 2.

5 uM

PD03

2 5

uM

PD03

2+ 1

0 uM

0

20

40

60

80

100

Nu

mb

er

of

cell

s p

er

em

bry

o

Figura 40: Curva dosis respuesta del número total de células por embrión (DAPI), ICM, TE, NANOG+ y SOX17+ del control y tratamientos. El tratamiento con 5 µM tiene el mayor impacto no solo en la segregación embrionaria por el bloqueo de SOX17 sino también por el incremento de células NANOG+ comparado con 2.5 y 10 µM y a un nivel comparable con el control.

Adicionalmente, en este estudio se muestra que la inhibición de la vía MAP2K bloquea la expresión de SOX17 no solo a

altas concentraciones, sino también a bajas, aunque no se logra con este desbalance un aumento de células NANOG+. Los

tratamientos con diferentes dosis de PD032 incrementan la población perteneciente al TE y disminuyen la del ICM.

6. DISCUSIÓN

6.1. Efecto del medio t2iGöLIF en el desarrollo embrionario bovino

En embriones de ratón, GATA6 es responsable de reprimir NANOG en aquellas células en donde la especificación del

endodermo primitivo se lleva a cabo (83,94). Los blastocistos con deleción en el gen Fgf4 no mantienen los factores específicos de

hipoblasto GATA6, PDGFRA y SOX17 y por tanto carecen de endodermo primitivo. Por otro lado, la administración de FGF4

exógeno mantiene la expresión de estos genes y activa así mismo genes marcadores de hipoblasto tardío o definitivo como Gata4

mientras que inhibe marcadores específicos de epiblasto como Nanog (67). Estos resultados condujeron a la hipótesis de que la

secreción de FGF4 induce la especificación del endodermo primitivo por la activación de la vía MAPK (95). Por lo tanto, luego se

demostró que la inhibición química de MAP2K protege al epiblasto de las señales inductivas del FGF y bloquea efectivamente la

diferenciación. In vivo, esta inhibición previene que las células del epiblasto se diferencien a linajes extraembrionarios, lo que resulta

en embriones cuyo ICM se convierte enteramente en epiblasto (33). Las proteínas WNT también antagonizan con la vía FGF/

MAP2K y se pueden estimular en forma indirecta por la inhibición parcial de GSK3 (64). En ratón, la doble inhibición (2i) de

MAP2K y GSK3 provee condiciones de cultivo definidas que efectivamente bloquean la salida de la pluripotencia (33,63). Como se

había señalado en el estado del arte, en embriones bovinos y humanos, sin embargo, la inhibición de MAPK tiene un efecto moderado

(bovino) o nulo (humano) en el número de células que expresan NANOG y GATA6, lo que sugiere que en estas especies existen

otros mecanismos involucrados en la formación del hipoblasto. Adicionalmente, debido a que la expresión de GATA6 no se bloquea


1

117

completamente tras la inhibición de MAPK ni de 2i en embriones bovinos (41) pero si hay un efecto parcial de la acción del mismo,

se hipotetizó en este estudio que MAPK podría ser un mecanismo conservado en la especificación el PE bovino pero que no es

suficiente por si solo para establecer la segregación de linajes en el segundo evento de diferenciación embrionaria y que

probablemente la interacción con otro mecanismo es necesaria para la completa inhibición del PE. En concordancia con esta

hipótesis es que se estudió si la inhibición de PKC solo o con h-LIF ayuda a 2i a evitar la formación del PE y favorece el bloqueo de

la salida de la pluripotencia del epiblasto. Se decidió agregar h-LIF ya que se conoce que esta citoquina activa diferentes vías tales

como la de JAK/STAT, MAPK/ERK and PI3K/AKT, algunas de las cuales están directamente relacionadas con la promoción de la

pluripotencia y diferenciación en otras especies. El balance en favor de la pluripotencia o la diferenciación dentro del embrión

depende del contexto. Por lo tanto, se cultivaron embriones en LIF, t2iGö y t2iGö h-LIF para intentar establecer el efecto de esta

citoquina sola y en un contexto de inhibición, y por otro lado para combinar 2i con el inhibidor de PKC o el inhibidor de PKC y LIF.

El tratamiento t2iGö no afectó el número de células SOX17 positivas, aun cuando aumentó NANOG y disminuyó el número de

células que expresan ambos marcadores. En este estudio se utilizó el inhibidor de MAPK, PD325901, a una concentración de 1 µM,

CHIR a 1 µM y Gö6983 a 2 µM. Mc Lean et al., (2014) demostraron que cuando se utiliza PD325901 a 0.4µM en la mezcla 2i no

hay efecto en la expresión de NANOG y SOX17 comparado con el control pero cuando se incrementa la concentración a 10 µM no

solo incrementa la expresión de NANOG sino también disminuye la de SOX17, aunque con un efecto parcial (67). Probablemente a

la concentración y combinación que se usa en esta tesis PD325901 en t2iGö el efecto parcial en la inhibición de GATA6 es el

responsable del aumento de NANOG, pero no es suficiente para inhibir SOX17 vía NANOG, pero cuando se añade LIF a t2iGö se

tiene un incremento de NANOG por la inhibición de GATA6 y un incremento extra por la activación de NANOG por otra ruta, es

decir debido a una estimulación directa, por ejemplo, por la vía JAK/STAT que en forma conjunta disminuyen SOX17. Este análisis

sugiere que, si bien hay un efecto en la disminución de SOX17, existe en forma paralela alguna otra ruta que compensa dicho efecto,

y por lo tanto mantiene el PE. Para evaluar esta hipótesis, se requieren más estudios. Más allá de los análisis realizados hasta el

momento con 2i o t2i, el próximo paso es evaluar el efecto de los inhibidores ya estudiados por si solos, pero en un contexto de doble

inhibición que tenga en cuenta una posible interacción de mecanismos de señalización, ya sea entre dos rutas diferentes a MAPK o de

este último con alguna otra.

Cuando se estudió el efecto de h-LIF durante el desarrollo embrionario bovino como una forma de determinar si el efecto de

t2iGö h-LIF se debe al LIF, al t2iGö o a una interacción entre ambos se encontró que LIF promueve tanto SOX17 como NANOG en

el embrión bovino temprano. El efecto de LIF relacionado a promover la expansión de las células del endodermo primitivo fue

reportado anteriormente en embriones de ratón (84). Morgani et al., (2015) demostraron que la adición de LIF durante el cultivo

embrionario in vitro incrementa las células Gata6 positivas pertenecientes al PE pero que tiene poco efecto sobre NANOG, mientras

que la inhibición de la vía JAK/STAT reduce ambos, es decir las células NANOG y GATA6 positivas. Además, el tratamiento con

LIF también parece reducir el número de células que todavía no se han especificado ya que el número de células que co-expresan

GATA6 y NANOG se ve reducido. Nuestros resultados sugieren que existen algunas diferencias entre especies, ya que h-LIF no solo

estimula la expansión del PE sino también del epiblasto, y en embriones bovinos, el porcentaje de células que co-expresan ambos

marcadores es mayor. Morgani et al., (2015) argumentan que LIF evita la diferenciación de las células NANOG positivas pero que no

incrementan su número (84). En embriones bovinos se ha demostrado que la inhibición de la vía JAK/STAT por AZD1480 que

inhibe JAK 1/2 interfiere con la formación del ICM pero no con el de TE ya que el número de células del TE y sus marcadores


1

118

(CDX2 y KRT8) no resultan alterados (96). En línea con nuestros resultados, la inhibición de JAK reprime tanto marcadores de

epiblasto (NANOG y FGF4) como de hipoblasto (SOX17 y PDGFRA), así como genes relacionados a la pluripotencia naïve (KLF4 y

TFCP2L1) y STAT3 (96).

6.2. Efecto de la inhibición de Wnt y ERK/MAPK en el desarrollo embrionario bovino

Un estudio previo ha reportado que el mecanismo de señalización mediado por Wnt está activo en embriones bovinos de

día 6 (97). Adicionalmente, se ha reportado que 22 genes del mecanismo WNT y 47 genes importantes para la vía MAPK se expresan

en ovocitos y blastocistos bovinos (98). Las proteínas WNT regulan la función celular a través de dos mecanismos: el canónico y no

canónico. LA vía canónica ha sido asociada con la regulación del destino celular mientras que la no canónica ha sido implicada en la

regulación de la polaridad, división asimétrica y movimientos celulares durante la gastrulación (97). El mecanismo canónico se activa

cuando las proteínas WNT se unen al receptor de membrana FZD y a su co receptor LRP5 y 6. Esta señal se transmite río abajo por el

transductor Dishevelled que bloquea la acción del complejo de destrucción de β catenina (entre los que se encuentra GSK3, Axina,

APC y CK1) lo que resulta en su acumulación en el citoplasma y translocación al núcleo donde se une a factores de transcripción

como el factor T-cell y LEF (lymphocyte enhancer factor). El mecanismo no canónico se activa con la unión de proteínas WNTs a

varios receptores incluyendo el FZD, ROR2 y RYK (99). En bovinos, ambas isoformas de GSK3 (GSK3A y GSK3B) fueron

detectadas desde el estadio de 2 células hasta blastocisto (97). La fosforilación de ambas isoformas se incrementa a medida que

progresa el desarrollo embrionario lo que sugiere que la inhibición de GSK3, y por ende la activación de WNT, está asociado al

normal desarrollo embrionario (98). La inhibición de GSK3B con CT99021 aumenta la formación de blastocistos de buena calidad,

mientras que la inhibición con LiCl disminuye la formación de los mismos (98). Nuestros resultados muestran que con la inhibición

de Wnt si bien el número total de blastocistos no varía respecto al control, el número de blastocistos expandidos aumenta a expensas

de los blastocistos sin expander, comparado con el control a los 8 días de cultivo in vitro. Denicol et al., (2013) también demuestra

que la activación de Wnt con AMBMP a partir del día 5 y hasta el día 8 disminuye el desarrollo de blastocistos, lo que estaría en

concordancia con nuestros resultados (97). Asimismo, se ha demostrado que la inhibición de Wnt con DKK1 de día 5 a 8 aumenta la

producción de blastocistos de día 7 y no tiene efecto en la producción de día 8 comparado con el control en un estudio llevado a cabo

un año más tarde por el mismo grupo de investigación (100). El aumento del número total de células es la responsable de la

expansión de los blastocistos, y en nuestro estudio el grupo con IWP2 tiene significativamente mayor número comparado con el

control (Tabla 38).

En cuanto a la segregación embrionaria, en los estudios antes mencionados se ha demostrado que la activación de Wnt

inhibe la formación de TE (97), y que DKK1 (inhibidor de Wnt) promueve la segregación hacia TE e hipoblasto, lo que implica un

aumento del porcentaje de células consideradas del TE (CDX2+) y del hipoblasto (GATA6+ en ICM), una reducción de células del

epiblasto (NANOG+ en ICM), y una reducción en el porcentaje de células que expresan NANOG y GATA6 a día 8 (100). Nuestros

resultados demuestran que al inhibir Wnt con IWP2 también aumenta significativamente las células del TE, pero a diferencia de lo

marcado con GATA6, las células con marca SOX17 no modifican su proporción comparado con el control. Queda pendiente

establecer si esta diferencia entre los marcadores del PE se debe a que el efecto sobre SOX17 es posterior al día 8 y se evidencia

primero en la expresión de GATA6, o si bien el efecto de IWP2 a la concentración utilizada no es comparable a la de DKK1 en la

concentración utilizada en dicho estudio. Tampoco se observa un efecto en el número de células con NANOG. Por otro lado, los


1

119

estudios que promueven la vía Wnt mediante la inhibición de GSK3B han demostrado que la expresión de NANOG aumenta en el

ICM (66,101) y en el TE al igual que la expresión de GATA6 en el ICM y TE (101). Los resultados contradictorios entre los

experimentos de activación e inhibición de mecanismos de señalización demuestran que existen efectos directos e indirectos que

deben ser estudiados con más detalles, sobre todo cuando se analizan genes que son funcionalmente opuestos, como los marcadores

de epiblasto e hipoblasto.

El grupo en el que se lleva a cabo la doble inhibición de Wnt y MAPK/ERK la expresión de SOX17 es nula, y al parecer

su efecto se debe a la acción de PD032+, ya que en los embriones en los que solo se inhibe esta vía se consigue el mismo efecto sobre

este gen. Sin embargo, la inhibición de SOX17 no está acompañada del aumento de células que expresan NANOG y, por el contrario,

este disminuye al 55 % en la inhibición dual y al 79% en la de MAPK/ERK. Aunque falta profundizar si el efecto de la disminución

de las células NANOG positivas se debe a la alta concentración del inhibidor de MAPK/ERK, lo que si sugieren estos resultados es

que existe una interacción entre ambos mecanismos. Queda estudiar a qué nivel ambos mecanismos confluyen para inhibir NANOG.

6.3. Efecto de la concentración de PD0325901 en el desarrollo embrionario bovino

Se ha demostrado que la fosforilación de MAP2K (y por tanto la activación del mecanismo) se inhibe a concentraciones

estándar de PD032 (0.4 y 1 µM), por lo que Mc Lean et al., (2014) sugieren que a altas concentraciones PD032 ejerce un efecto

secundario sobre otros mecanismos en forma no selectiva. Para descartar este efecto, se decidió bajar la concentración de PD032,

esperando que a dichas concentraciones el efecto secundario sobre otros mecanismos diferentes a los de la vía MAPK/ERK no se

produjeran. En dichos tratamientos se produjo un incremento del número de células del TE. Este incremento puede estar relacionado a

una estimulación de la proliferación o inhibición de la muerte celular de dichas células, en cambio el efecto sobre el ICM se debe exclusivamente

a la abolición de células SOX17+. En ratón, la proliferación del trofoblasto se reduce por la inhibición con 2i o MAPK. En embriones tardíos

además la inhibición farmacológica de Fgf/Mapk ya sea por PD032 o PD173 solo o en 2i/3i elimina la expresión de Gata4 y expande Nanog (63).

Esto ocurre sin cambios o incluso con un pequeño aumento del tamaño del ICM lo que sugiere que las células del hipoblasto se han

redireccionado hacia el epiblasto como destino en el segundo evento de diferenciación. En bovinos, Mc Lean et al., (2014) también muestran

entre sus resultados que la inhibición con PD032+ altera la expresión de genes relacionados al epiblasto (FGF4/NANOG) e hipoblasto

(PDGFRα/SOX17), pero a pesar de la disminución en su expresión, sigue detectando los marcadores del hipoblasto por qRT-PCR comparado

con el control. Si se toma en cuenta los resultados de Mc Lean en comparación con los obtenidos en esta tesis, hay que señalar que la discrepancia

entre la presencia de mRNA de SOX17 y la ausencia de su proteína podrían indicar que aún cuando hay transcripción o un remanente de la

misma, la traducción se ve bloqueada. Se requiere profundizar el estudio para detectar si en estadios posteriores se logra el cese completo de la

transcripción en el modelo de estudio utilizado por el grupo de Mc Lean. En cuanto al aumento de la expresión de NANOG detectado por qRT-

PCR y los resultados obtenidos a diferentes concentraciones en este estudio cabe señalar que la técnica de detección de transcriptos de un pool de

células no ayuda a detectar si el cambio se produce por una variación en el número de células con dicho transcripto o en la cantidad intrínseca de

cada célula. Por lo tanto, es difícil comparar ambos resultados. Lo que si sugiere la curva dosis respuesta es que la cantidad de células NANOG+

depende de la concentración del inhibidor por mecanismos que se desconocen y que requieren de un estudio más complejo.

Inesperadamente se logró bloquear la expresión proteica del marcador de PE también a 2.5 y 5 µM sin aumento de células

NANOG+ por lo que se esperaría que este efecto esté asociado a un aumento de la tasa de muerte celular. Habría que investigar los


1

120

mecanismos de apoptosis en estadios anteriores al día 8 para saber si se activan de forma exacerbada respecto al control en células

que ya ha iniciado la diferenciación a PE; la respuesta sobre el número de células con NANOG es más difícil de interpretar.

NANOG es una proteína plausible de ser fosforilada en los sitios serina/treonina. En ES de ratón esta modificación previene su

degradación mediada por proteosomas (102). Por lo tanto, las modificaciones pos transduccionales son importantes también en la

regulación de la pluripotencia y la auto replicación celular. Se conoce que la proteína NANOG en humanos es fosforilada por

MAP2K lo que constituye un posible link entre esta vía y la pluripotencia (103). Se desconoce si la inhibición de MAP2K reduce esta

modificación, cómo afecta esto a la estabilidad de NANOG en bovinos y cómo esto contribuye a la especificación de los linajes en

blastocitos en la producción in vitro. Lo que si sugiere la curva dosis respuesta es que hay diferentes mecanismos puestos en juego

por la inhibición de MAPK que dependen de su concentración y que requieren mayor estudio.


1

121

7. CONCLUSIONES

En el primer capítulo se estudiaron dos condiciones alternativas al medio de cultivo clásico, SOF citrato/BSA, utilizado para

producir embriones bovinos in vitro en cultivo libre de suero. Los medios MC-BGC y N2B27 han sido previamente utilizados para

cultivar células con características pluripotentes y en este estudio se emplearon como medio base en la producción embrionaria a

partir del día 5 pos-fecundación. Los embriones obtenidos se analizaron desde dos enfoques, el rendimiento (porcentaje total de

blastocistos de día 7 y 8) y la calidad (tipo de blastocisto y expresión génica de marcadores de pluripotencia y diferenciación). El

medio N2B27 se estableció como la mejor opción libre de suero para producir blastocistos bovinos de alta calidad necesarios para

estudiar el impacto de la modulación de las vías de señalización y su efecto en la segregación embrionaria.

En segunda instancia se establecieron los marcadores de epiblasto e hipoblasto bovinos. SOX2 y NANOG resultaron buenos

marcadores del ICM, pero NANOG resultó mejor marcador del epiblasto que SOX2 al día 8, ya que este último co-localiza

fuertemente con GATA6 (marcador de hipoblasto). Se demostró por primera vez la co-localización de SOX2 y NANOG, así como la

exclusión de NANOG Y SOX17 en el embrión bovino de día 8 producido in vitro. GATA6 Y GATA4 son marcadores de hipoblasto

utilizados en otras especies, sin embargo, en nuestras condiciones de cultivo GATA6 co-localizó completamente con SOX2 y

GATA4 se encontró raramente presente a día 8, apareciendo a día 10 como marcador específico del hipoblasto. Concluimos entonces

que NANOG y SOX17 resultaron ser los mejores marcadores de epiblasto e hipoblasto respectivamente en el día 8 requeridos para

estudiar los efectos en la segregación embrionaria de estos dos linajes. Se analizó entonces la dinámica de expresión de los mismos

durante el desarrollo embrionario; adicionalmente dada la actual importancia de SOX2 en el establecimiento de linajes demostrado

recientemente por estudios de microscopía de correlación de fluorescencia se estudió también la co expresión de NANOG/SOX2. En

bovinos, encontramos SOX2 desde embriones de 4 células en adelante, en todas las células del mismo en estadios tempranos y co

expresado con NANOG en un 75 ± 5 % de las células SOX2+ en blastocistos de día 8. Por su parte SOX17 y NANOG también se

encuentran en estadios tempranos desde embriones de 8 células en adelante, fuertemente co-expresado en la mórula y mutuamente

excluyente en blastocistos de día 8.

Posteriormente, se evaluó el medio N2B27 t2iGö LIF utilizado para establecer líneas de células madre embrionarias naïve en

ratón y humano en la producción in vitro de embriones bovinos. El objetivo fue estudiar el efecto en el primer y segundo evento de

diferenciación embrionaria, es decir la formación del blastocisto primero y del epiblasto e hipoblasto después. Este objetivo se realizó

en dos momentos diferentes de la ejecución de esta tesis, el primero fue llevado a cabo en Argentina y el segundo en Inglaterra. Los

resultados obtenidos en la primera instancia resultaron muy alentadores (bloqueo total del hipoblasto), pero poco reproducibles. Al

momento de repetir los ensayos en Inglaterra para establecer líneas de ESC bovinas se detectaron diferencias en el efecto de N2B27

t2iGö LIF sobre el número de células NANOG y SOX17 positivas (efecto parcial en la segregación de linajes). Esencialmente los

embriones analizados difieren en dos puntos, el medio de desarrollo de día 0 a 5 en cultivo y la fuente de LIF utilizada. Se cree que la

razón principal de las diferencias no se debe a que en los primeros cinco días los embriones fueron cultivados en medios diferentes

(SOF versus BHH7) ya que el control (N2B27 DMSO) resultó comparativamente similar en ambas experiencias. Por lo tanto, es

probable que la diferencia esté en la citoquina empleada (CHO LIF en Argentina versus h-LIF en Inglaterra). No es la primera vez

que se reporta diferencias en los resultados obtenidos con LIF dependiendo de la fuente que se utilice.


1

122

Finalmente, se amplió el diseño de experimentos para estudiar no solo el efecto combinado de t2iGö h-LIF en la producción

embrionaria, sino también para establecer si los resultados obtenidos en este medio se deben al efecto de la citoquina h-LIF, al de los

inhibidores t2iGö o a la interacción de ambos. Se concluye finalmente que el medio N2B27 h-LIF aumenta el número de células

NANOG y SOX17 positivas y por tanto el del ICM en detrimento del TE, indicando un efecto en el primer evento de diferenciación

embrionaria. A su vez este medio aumenta el número de células que co-expresan NANOG y SOX17. Por otro lado, el medio N2B27

t2iGö h-LIF es el único capaz de establecer diferencias en la segregación del epiblasto e hipoblasto de día 8, pero este efecto es

parcial. Dicho de otra forma, se encontró un mayor número de células NANOG positivas en el ICM en detrimento de las SOX17

positivas sin lograr bloquear completamente la formación del hipoblasto. Por tanto, creemos que existe algún otro mecanismo que

junto a la vía MAPK/ERK participa en el embrión bovino para el establecimiento del segundo evento de diferenciación.

Con el objetivo de responder a esta nueva hipótesis se analizaron los efectos en la segregación de la inhibición de

MAPK/ERK, Wnt y la combinación de las mismas ya que esta última ha sido utilizada en embriones de mono tití para bloquear la

diferenciación a PE y favorecer la formación del epiblasto. En nuestras condiciones de estudio, la nueva combinación de inhibidores

afecta a la población con marca SOX17 aboliendo completamente su expresión, pero esta no aumenta el número de células del

epiblasto. Por otro lado, los grupos con una única inhibición ponen en evidencia que este efecto se debe más bien a la inhibición de

MAPK/ERK a altas concentraciones que a la combinación de las mismas. Queda pendiente establecer si la concentración utilizada del

inhibidor de Wnt es el responsable de no producir efectos en la segregación embrionaria cuando se modula esta vía.

Para finalizar, se estudió el efecto de la concentración de PD032 variando de 2.5 a 10 µM. En todas las condiciones se

observó el bloqueo de SOX17 pero el cambio en el número de células NANOG positivas fue inesperado, disminuyendo o quedando

constante dependiendo de la concentración. Se debe estudiar en profundidad este fenómeno, abordando otros enfoques como la

activación o inhibición de la expresión por modificaciones pos transduccionales.


1

123

8. PERSPECTIVAS

Se necesita conocer los mecanismos endógenos del embrión involucrados en la determinación de los dos linajes, epiblasto e

hipoblasto, a fin de establecer las condiciones de cultivo apropiadas para el establecimiento de células madre embrionarias. La

activación de la vía ERK/MAPK es uno de los mecanismos conservados entre las especies que impacta en dicha segregación, pero en

bovinos se requiere seguir profundizando para establecer alguna otra vía, tal que al inhibirla en forma conjunta se lleve a cabo el

bloqueo total del establecimiento del endodermo primitivo y el aumento de la población del epiblasto.

Se propone extender el estudio del efecto dual de los inhibidores WNT y MAPK/ERK ajustando previamente la

concentración del inhibidor IWP2 mediante el desarrollo de un análisis de dosis/ respuesta y analizando también otros inhibidores de

WNT. Se planea llevar a cabo más experimentos, pero con la concentración de PD032 ajustada a 5 µM. De no obtener los resultados

esperados, se planifica ampliar al estudio analizando otro par de vías y su interacción. Se utilizará la misma estrategia de análisis,

producción embrionaria e inmunofluorescencia de NANOG y SOX17. De existir un bloqueo total de la formación del PE evidenciada

por la ausencia de células SOX17 positivas, el estudio se hará extensivo a otros marcadores de PE y a otros genes relacionados a la

replicación y proliferación celular y a la pluripotencia para completar la caracterización de los embriones obtenidos.

Paralelamente se propone estudiar en estadios tempranos (día 6 y 7) los mecanismos de apoptosis celular en los grupos

previamente analizados de la curva de dosis respuesta de PD032 para establecer si la abolición de las células SOX17 está asociado a

la muerte celular.

En última instancia se planea producir embriones bajo tales condiciones de abolición de SOX17 y aislar el ICM. Estas

células se cultivarán en condiciones stem para llevar a cabo el aislamiento de células madre embrionarias bovinas.


2

124

GENERACIÓN DE CÉLULAS IPSC BOVINAS

1. MARCO TEÓRICO

iPSC en bovinos: logros y limitaciones

Después de 10 años desde los primeros trabajos de reprogramación publicados en ratón y humano mediante la

sobreexpresión de los factores OKSM, se han realizado numerosos intentos de reprogramación en bovinos (Tabla 41). Todos los

estudios han utilizado fibroblastos para reprogramar, ya sea fetales (BEF) como así también adultos (BAF), obtenidos de la piel de

una biopsia de oreja. Los métodos de introducción de los factores de reprogramación empleados en su mayoría incluyen la utilización

de partículas virales (retrovirus y lentivirus principalmente), solo un trabajo emplea vectores no integrativos y uno reciente, el uso de

sistemas basados en transposones. A diferencia de otras especies, no se ha publicado aún la utilización de proteínas recombinantes,

RNA, microRNA, DNA (minicírculos) como métodos de introducción de los factores de transcripción (ver Figura 12).

Tabla 41: Resumen de iPSC generadas en bovinos (104)

Fuente de células

Medio basal Suplementos Feeder layers

EB Diferenciación in vivo

Método de Reprogramación

Cariotipo Ref.

BEF DMEM 20 % KSR

b-FGF MEFs Si Teratoma Retrovirus (b-OKSM, b-OKSMLN*, h-OKSM) *silenciado en SCNT embriones

Normal Hang et al., 2011 (105)

BAF MEMa 20 % FBS, ITS

FGF de bovino y h-LIF

MEFs Si Teratoma Retrovirus (h-OKSMN) no silenciado

Normal Sumer et al., 2011 (106)

BEF N2B27 VPA (3 días) a BEF, h-LIF, PD0325901 y CHIR99021

MEFs Si Teratoma Vector (virus free) (b-OKSM) no silenciado

Normal Huang et al., 2011 (107)

BEF DMEM 15 % SFB

LIF y bFGF MEFs Si Teratoma Lentivirus (h-O y p-KSM) no silenciado

Normal Cao et al., 2012 (108)

BEF KO DMEM, 15 % SFB

PD0325901 y CHIR99021

No Gelatina 0.1 %

No No Retrovirus (h-OKSM) no silenciado

Normal Lei et al., 2013 (10)

BEF DMEM/F12, 20 % KSR

b-FGF (8 ng/mL) h-LIF

MEFs No Teratoma PiggyBac (Transposones) (h-OKSMLN)

No informa Talluri et al, 2015


2

125

Fuente de células

Medio basal Suplementos Feeder layers

EB Diferenciación in vivo

Método de Reprogramación

Cariotipo

Ref.

(1000 U/mlL) * prueban 2i

no silenciado (52)

BAF DMEM 15 % FBS

LIF PD0325901 y CHIR99021 o VPA (2mM) Vitamina C (30 µg/mL)

MEFs No Teratoma Lentivirus (h-OKSM) SILENCIADO

Normal Heo et al., 2015 (109)

Aunque un sólo trabajo fue reportado en el 2012 (110) en donde se construyen PRs (OKSM) para utilizarlas en

reprogramación de bovinos, hasta el momento no ha sido publicado por este mismo grupo o algún otro, ningún estudio donde esta

metodología haya sido fehacientemente útil. Entre los distintos métodos utilizados para reprogramación reportados en humanos, la

eficiencia más alta se da en el caso de los lentivirus (Tabla 12). El desafío actual, en especies donde se ha logrado generar y mantener

iPSC, es el de aumentar la eficiencia de este proceso complejo que transforma las células diferenciadas y especializadas en células

semejantes al estadio embrionario pluripotente (indiferenciado).

Se han utilizado en reprogramación de bovinos diferentes versiones de los factores de transcripción OKSM. Algunos

autores postulan que las versiones humana y bovina de los mismos no estabilizan el estado pluripotente y que las células sólo pueden

mantenerse viables unos pocos pasajes (104). Solo en tres trabajos se logra pasajes mayores cuando se utiliza b-OKSMLN (105), h-

OSKMN (106) y h-OSKMNL (52). Es evidente en estos trabajos que la incorporación exógena de NANOG es necesaria para lograr

pasajes a tiempos prolongados. Han et al., (2011) demuestra por RT-qPCR que la expresión endógena de NANOG no aumenta

significativamente. Por tanto, estos estudios sugieren que la reprogramación no ha sido completa y que las células se mantienen

indiferenciadas por la expresión exógena de los factores de transcripción que no es silenciada en los pasajes sucesivos. Recientemente

Heo et al., (2015) demuestra que la expresión de h-OSKM en BAF cultivadas en medio con 2i produce un incremento significativo

de NANOG endógeno. Esto coincide con lo publicado anteriormente por Huang et al., (2011). Sin embargo, en el trabajo de Huang

los genes exógenos no se silencian, mientras que en el de Heo si reportan el silenciamiento. En este último trabajo además se utiliza la

línea b-iPSC para modificar genéticamente el genoma bovino utilizando la herramienta CRISPR.

En general en todos los trabajos publicados hasta el momento se demuestra la capacidad pluripotente de las b-iPSC

mediante los test de diferenciación in vitro o in vivo. Aunque la formación de quimeras y la transmisión genética por la línea germinal

no ha sido demostrada aún en ninguno de los reportes hasta el momento. Esta capacidad es específica de las líneas ESC de tipo naïve

y ha sido demostrada experimentalmente en ratón. Por cuestiones éticas este ensayo no es realizado con líneas naïve humanas

obtenidas en diferentes medios.


2

126

2. HIPÓTESIS

La expresión exógena de los factores de reprogramación de las células b-iPSC obtenidas hasta el momento sugieren que aún

no se ha logrado obtener células completamente reprogramadas en esta especie, por lo tanto, se requiere seguir investigando en los

mecanismos y fases de la reprogramación bovina.

3. OBJETIVOS

El objetivo general de este capítulo es estudiar los mecanismos moleculares involucrados en la des-diferenciación para la

obtención de iPSC bovinas y en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células madre pluripotentes.

En base a la hipótesis planteada y al objetivo general, se establecieron los siguientes objetivos específicos:

1. Desarrollar y caracterizar iPSC de origen bovino y porcino (modelo tomado como control del proceso de reprogramación),

explorando diferentes condiciones para su obtención mediante vectores episomales y partículas lentivirales.

2. Evaluar la idoneidad de diferentes medios de cultivo para el establecimiento y mantenimiento de la pluripotencia en ambas

especies.


2

127

4. MATERIALES Y MÉTODOS

4.1. Preparación de BEF y cultivo primario

4.1.1. Protocolo

Para la preparación de BEF se solicitan 1 o 2 fetos (para reprogramar, si es hembra mejor) provenientes de vacas preñadas

que van a matadero, los mismos se transportan en termo para mantener la temperatura durante el traslado. Los fetos suelen venir del

matadero dentro del cuerno uterino, por lo que para trabajar con ellos se los debe separar primero de los tejidos de la madre. Esta

disección se realiza en una zona no estéril, manipulando con tijeras y pinzas, cuidando que no se rompa la bolsa que contiene el

líquido amniótico (Figura 41 A).

Figura 41: Aislamiento de explantos para cultivo primario de BEF. A: Feto separado de los anexos maternos (trabajo llevado a cabo en condiciones de no esterilidad), B: feto libre de amnios en campana de flujo laminar para extraer explantos; C:

visualización de sexo, en este caso se trata de una hembra y D: explantos extraídos, en PBS P/S antes del corte en pedacitos.

Una vez separado, el amnios con el feto en su interior se coloca en una placa y se procede a abrir con pinzas estériles en

campana de flujo laminar (Figura 41 B). Se separa el feto y se coloca en otra placa, a la que se le agrega PBS P/S. Se observa y toma

nota del sexo del feto, dependiendo del tamaño podrá verse a simple vista o se necesitará la ayuda de una lupa (Figura 41 C). Con la

ayuda de pinzas y hojas de bisturí estériles se procede a extraer explantos de piel: se realiza una breve incisión debajo de los

miembros y con ayuda de la pinza se despega la misma del músculo tratando de separar los explantos. Estos se van juntando en una

placa con PBS P/S hasta proceder con todo el feto (Figura 41 D). Finalmente se lava entre 1 y 2 veces en gotas de PBS P/S, y se

procede a cortarlos en cuadrados y a colocarlos en placa adherente con una gota de medio para BEF para evitar que se deshidraten. Se

A B

C D


2

128

dejan entre 15-30 min en campana para que se adhieran a la superficie de la placa de cultivo antes de colocarles el medio fresco (la

cantidad depende de la superficie empleada) y llevarlos a incubar en estufa de 5 % CO2 y 38.5 °C. Se cultivan 7-14 días hasta el 100

% de confluencia, momento en el cual se procede a su amplificación o crio preservación.

Figura 42: Fibroblastos fetales bovinos emergiendo de explantos de piel de feto. A: Explanto con células emergiendo, 10 días de cultivo en 5 % CO2 a 38.5° C y medio BEF. B: pasaje 3. (imágenes tomadas en microscopio invertido, campo claro, magnificación de objetivo 20x).

4.1.2. Medios y reactivos utilizados

Medio BEF

Se prepara una tanda de medio fresco, el que se puede alicuotar en tubos de 50 ml y almacenar en -80 °C si no se prevé un

uso inmediato de la totalidad preparada. Por el contrario, si se piensa que dicha cantidad puede ser utilizada en el plazo de un mes, se

guarda a 4 °C.

Tabla 42: Composición de medio para fibroblastos (BEF, MEF, PEF)

Componente Cantidad

DMEM high glucose (Sigma D5796) 440 ml SFB (PAA) 50 ml Glutamina (Invitrogen. 25030-032) 5 ml MEM: Non essential aminoacids (Invitrogen 11140-035) 5 ml Volumen final 500 ml


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129

4.2. Preparación de MEF y stock de MEF inactivadas mitóticamente

4.2.1. Preparación de MEF

Como se ha mencionado anteriormente en la sección 4 de la introducción general, las células PSC se cultivan sobre placas

recubiertas con gelatina bovina y sobre ella una capa de MEF inactivadas mitóticamente, que actúan como feeder layer, aportándoles

los nutrientes necesarios que favorecen el mantenimiento del estado indiferenciado.

Para obtener un cultivo primario de MEF, se solicitan 1 ó 2 ratones hembra de la cepa CF1 con 13,5 días de preñez al

Bioterio. Cuando llegan a esa condición, se sacrifican en cámara de CO2 gaseoso, por el personal del bioterio, y en condiciones de

esterilidad (flujo laminar tipo 1), se procede a la extracción del útero. Luego, se extraen los embriones, se lava una vez con PBS con

P/S y se extirpa las extremidades y cabezas. Posteriormente, se disgrega mecánicamente con bisturíes y/o tijeras y mediante pasaje

por pipetas Pasteur de vidrio, en medio de cultivo correspondiente (DMEM 10% suero fetal bovino, 100 UI/ml penicilina - 100

μg/ml estreptomicina). De esta manera se obtienen explantos de diversos tamaños, sembrando los de menor tamaño a razón de 3

embriones por placa p100 con 10 ml de medio MEF. Las placas se incuban a 37 °C con 5 % CO2 para el establecimiento del cultivo

primario. Alternativamente, después de la disgregación con pipetas, se puede agregar 10 ml de tripsina y 10 ml de TRYLE (2 ml por

feto procesado, 50:50 tripsina:tryple) y mezclar en vortex por 20 segundos. Se incuba luego a 38.5 °C por 5 minutos y se vuelve a

mezclar con vortex hasta lograr disgregar grandes pedazos de tejido y con ello lograr la apariencia de una sopa espesa. Se deja

decantar unos minutos, y se agrega por placa p100 3 ml del sobrenadante, sumado a 3 ml de medio fresco y 2 ml de suero

(concentración final del SFB en la placa del 15 %, para evitar problemas con la inactivación de la tripsina y el tryple). Al otro día, se

observan las células pegadas y se cambia por medio fresco, se cultiva hasta la confluencia (Figura 43).

Figura 43: Cultivo primario de MEF (3 días en incubadora)

Cuando la confluencia de las MEF es del 100 %, se realiza el pasaje de las células para amplificar el cultivo. Para esto, se

descarta el medio de cultivo, se lavan las placas con 5 ml de PBS para eliminar los remanentes de suero, y se incuba con 1 ml de

Tripsina/EDTA durante 5 minutos a 37 °C. La disgregación de las células se completa mecánicamente con pipeta y agregando 2 ml

medio de cultivo que aporta el suero necesario para detener la digestión enzimática. Se distribuye la suspensión celular en 3 placas

p100 (1 ml por placa), se completa con 7 ml de medio de cultivo y se incuban las placas a 37 °C con 5 % de CO2. Una vez que la

confluencia vuelve a ser del 100 %, se procede de la misma manera para realizar un nuevo pasaje. Por tratarse de un cultivo primario,

se realizan hasta 2-3 pasajes, dado que si las células acumulan más pasajes se induce el proceso de senescencia replicativa. Los


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130

procedimientos que se realizan con los ratones se ajustan a las normas éticas locales y el protocolo de obtención de MEF debe ser

aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación (CICUAE).

4.2.2. Inactivación de MEFs

Siguiendo el protocolo del laboratorio de la Universidad de Nottingham:

- Se expanden los fibroblastos embrionarios de ratón obtenidos por cultivo primario (MEFs) de Po hasta P2 (se puede congelar en P1

para mantener un stock). Se plaquea 6 millones de células en una T225.

- Cuando se alcanza el 90 % de confluencia en P2:

• Se prepara la solución de Mitomicina C (MMC) de 10μ g/ml (manejar con cuidado, ya que es muy peligrosa). Por ejemplo, se pesa 2 mg y se disuelve en 200 ml de DMEM complete, se puede conservar a -20 °C para su almacenamiento.

• Se remueve el medio de las células en T225. • Se reemplaza por 25 ml de la solución de 10μ g/ml solución de MMC. • Se incuba por 2.5 horas. • Se remueve la MMC, y se lava 2x con PBS. • Se trypsiniza (5 ml de 2.5 % Trypsina por T225) 5 minutos en incubación, se inactiva (con 15 ml DMEM complete), se

cuenta y se centrifuga a 200 – 400 g por 5 minutos. (Normalmente se obtiene 18 millones de células por T225). • Se congela a -80 °C en 10 % DMSO a una densidad apropiada (depende de la superficie a la que se va a plaquear para su

uso, generalmente 2 millones de células por vial en 1 ml) • Se conserva en N2 líquido hasta su uso como feeder layer.

4.2.3. Congelamiento de células somáticas (MEF, PEF, BEF, 293T)

Protocolo

• Se descarta el medio de cultivo de la placa que contiene las células a ser congeladas.

• Se lava la placa con PBS pH 7,4 estéril.

• Se tripsinisa la placa con Tripsina/ EDTA 1x en PBS estéril. Se incuba durante 5 minutos (tiempo máximo) a 37 °C 5 %

CO2.

• Se neutraliza la Tripsina con medio de cultivo suplementado con suero.

El volumen de medio con suero agregado debe ser por lo menos el mismo que de tripsina. Lo ideal es que la enzima

quede diluida 1/10 en el volumen final para asegurar su inactivación.

• Se disgregan las células y se colocan las mismas en un tubo falcon de 15 ml. Se agrega más medio si fuera necesario.

• Se centrifuga a 200 – 400 g durante 5 minutos.

• Se descarta el sobrenadante y se resuspenden las células en el medio de congelamiento frío.

• Se colocan los criotubos en hielo.

• Se pasan los criotubos a un recipiente con algodón o en frosty y se coloca a -80 °C ON.

El algodón permite que el congelamiento sea progresivo y no abrupto, lo que mataría a las células.

• Se conservan los criotubos en N2 y se anota la posición donde fueron guardados.


2

131

Reactivos: medio de congelamiento

Se prepara la cantidad según la cantidad de criotubos a utilizar. En general, se congela 1 ml por criotubo. Mantener en hielo

hasta la resuspención de las células.

Medio de cultivo correspondiente a las células a congelar ____ csp Suero ____ 20% DMSO ____ 10%

Nota: En el caso de stem cells, el suero utilizado para congelar no debe ser el SFB Gibco, no debe contener LIF. Generalmente se agrega 600 µl de medio fresco a las células centrifugadas previo descarte del sobrenadante, de manera que en total sean 700µl, luego se agrega 200 µl extra de suero y 100 µl de DMSO. 4.2.4. Plaqueo de MEF inactivadas mitóticamente

• Se coatea cada superficie con gelatina 0.1%, 10 min en estufa.

• Se descongela criotubo con m-MEF.

• Se plaquea: 2.000.000 de células en placa p100 en medio DMEM o el equivalente de acuerdo al área del well si se

trabajan con menor tamaño (típicamente se prepara una placa entera de 6 wells que es el equivalente a una p100).

4.3. Reprogramación con vectores episomales

Con el objetivo de obtener células pluripotentes en animales de granja (bovino y porcino) se procedió a la reprogramación

de fibroblastos fetales de acuerdo a los protocolos publicados por Okita et al., 2011y Beers et al., 2012(111). Se utilizaron vectores

episomales adquiridos comercialmente (addgene 27077, 27080, 27078, 37624) que expresan los factores de reprogramación OCT4,

SOX2, KLF4, L-MYC, LIN28, una proteína viral EBNA-1 que aumenta la expresión de los factores anteriormente mencionados y un

shp53 que silencia al gen p53 favoreciendo la reprogramación mediante el bloqueo de la cascada de señalización relacionada a la

senescencia (Figura 44).


2

132

Figura 44: Vectores episomales utilizados para la reprogramación (A); vector EBNA-1 (B).

4.3.1. Protocolo de una transfección

Se plaquearon las células EOS-BEF y EOS-PEF en 3 wells por línea celular con 300.000 células cada uno para proceder al día

siguiente a la transfección de los vectores de reprogramación. Se transfectaron 2 wells con los vectores episomales de Okita en una

relación de 1:1:1:1, sumando un total de 4 µg de DNA y 8 µl de Fugene 6 por well. El tercer well se utilizó para transfectar con un

reportero, vector episomal GFP (addgene 27802) como control de la transfección. A las 24 h se cambió el medio por Complete

DMEM fresco y a las 48 h se pasó un well de cada tipo celular a dos placas de well de 6 cubiertas con geltrex y con medio para

reprogramación 1 (RPM1) según el protocolo de Beer et al (2012). El otro well transfectado se dejó con medio DMEM para pasarlo a

MEF y a medio stem seis días después. A partir de este momento, el protocolo de reprogramación se dividió en dos: en una condición

se testeó el medio base E8 utilizado por Cheng et al. (2011) y Beers et al., (2012), para reprogramar fibroblastos humanos en los que

se le agrega FGF e hidrocortisona los primeros 3-5 días (o hasta lograr el 20% de confluencia de la placa) y luego se cambia al medio

base E8 con FGF y butirato de sodio hasta el momento del picado de colonias, que se realiza manualmente y en medio E8 completo

(con FGF y TGFb) Tabla 43 . Las colonias en humanos aparecen aproximadamente 2 semanas después de realizada la transfección

(Okita et al, 2011).

Tabla 43: Composición del medio de reprogramación, basado en Beers et al., 2012 (111).

Componente Medio Full E8 RPM1 RPM2 Concentración final

E8 medio base 500 ml 500 ml 500 ml

Holo transferrina 500 µl 500 µl 500 µl 10 µg/ml

bFGF 500 µl 500 µl 500 µl 100 ng/ml

TGFβ1 500 µl - - 1.74 ng/ml

Insulina 1 ml 1 ml 1 ml 20 µg/ml

hidrocortisona - 50 µl - 1 µM

Butirato de sodio - - 500 µl 100 µM

A

B


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133

Por otro lado, tal como se mencionó antes, se cultivó un well de fibroblastos transfectados con los factores de

reprogramación durante cinco días en medio complete DMEM y al sexto día se plaquearon a razón de 100.000 células por p100

previamente preparadas con MEF inactivadas (2 x 106 de MEF/P100). Por cada tipo celular se prepararon dos placas, una con butirato

de sodio y otra sin butirato. En ese momento se tomaron también muestras para ARN como control del punto cero, es decir después

de la transfección y antes de inducir el proceso de reprogramación. Los fibroblastos en MEF se incubaron en estufa a 37.5 °C y 5 %

CO2 por 30 días. El medio utilizado para favorecer las condiciones de pluripotencia fue el DMEM/F12 con 20 % KSR, 100x P/S,

100x NEAA, 1000x Beta-mercaptoetanol y suplementado con 20 ng/ml de FGF, 1 µM de inhibidor de MEK y 3 µM de CHIR.

Se procedió a una segunda transfección 11 días después de la primera con los fibroblastos que sobraron repitiéndose el

protocolo de cultivo antes mencionado (ambas condiciones, feeder free/E8 y MEF/DMEMF12) tanto para fibroblastos porcinos como

bovinos.

4.3.2. Protocolo de transfecciones seriadas

Se procedió en una tercera instancia a transfectar en forma seriada, día por medio, 300.000 BEF5P3 y 500.000 PEF5 P1

plaqueadas el día anterior en dicha densidad, por duplicado para cada tipo de células y en dos formatos: 1well de 6 y una p100. Las

células del well de 6 se transfectaron cuatro veces con 1 µg de cada vector y 8 µl de fugene tal como se había puesto a punto antes. A

las células en placa de p100 se transfectaron cada vez con 1.25 µg de cada vector y 15 µl de x-treme, un reactivo de transfección de

Roche siguiendo las recomendaciones de un grupo de investigación de la Universidad de Nottingham dirigido por la Dra. Cinzia

Allegrucci que utiliza dicho reactivo para reprogramar fibroblastos. Al siguiente día de la última transfección las células en la placa

p100 se pasaron a nuevas p100 con MEF y medio stem (100.000 células por placa en el caso de las PEF5 y 40.000 células en el caso

de las BEF5 por duplicado); a las células del well de 6 solo se le cambió el medio. Al día siguiente (9 día del protocolo, tomando el 1

como el de la primera transfección) se pasaron las células del well de 6 a placas p100 con MEF (dos por cada condición de cultivo) a

razón de 100.000 células para las PEF5 y 25.000 para las BEF5. Por tanto, finalmente lo que se hizo fue testear dos condiciones de

transfección, 3 medios de cultivo stem, y dos densidades de reprogramación para las BEF que crecen a mayor velocidad y se vuelven

confluentes rápidamente durante la reprogramación.

Los medios de cultivo testeados fueron el medio convencional de KSR y FGF detallado en la sección 4.4.4 (página 134), el

medio SB43 detallado más adelante en la sección 4.4.5 (página 138), y un medio con base N2B27,20 ng/ml de FGF y 2.5 µM de

IWR1 (inhibidor de Wnt). Las placas se cultivaron en 5 % CO2 y con cambio de medio día por medio durante 30 días.

El medio N2B27 para células y el stock de FGF se detallan en la sección 4.2.2 del capítulo 1 (página 74); el stock de IWR1

se prepara a 100 mM en DMSO.


2

134

4.4. Protocolo de reprogramación con lentivirus

4.4.1. Protocolo de preparación del plásmido STEMCCA

Se trabajó con el vector policistrónico STEMCCA (Figura 45), que contiene el casete de reprogramación con los cuatro

factores de Yamanaka, OSKM unidos por secuencias 2A e IRES. El mismo fue cedido gentilmente por el Dr. Gustavo Mostovlasky,

de la Universidad de Boston.

La dilución, amplificación del vector, purificación y verificación de la identidad del mismo se describen en la sección de

Anexos, protocolos comunes de biología molecular página 181.

Figura 45: Mapa del vector de reprogramación STEMCCA (versión con c-Myc)

4.4.2. Cultivo de 293T (HEK)

Las células HEK 293-T se cultivan en placas p100 con 10 ml high-glucose DMEM suplementado con SFB al 10 % (PAA), y

antibióticos (100 U/ml penicilina y 100 mg/ml estreptomicina, Gibco), a 37 °C con 5 % de CO2. Cuando se alcanza una confluencia

del 80 % aproximadamente, se cosechan y siembran 1/8 de la cantidad de partida en la nueva placa p100.


2

135

Figura 46: Cultivo de HEK productoras de partículas lentivirales (60 h en cultivo)

4.4.3. Protocolo de preparación de partículas lentivirales

Se prepararon las partículas lentivirales con el vector STEMCCA y el reportero EOS en base a la siguiente tabla:

Tabla 44: Mezcla de transfección de células 293T para la producción de partículas lentivirales h-STEMCCA y EOS.

Vector Para una reacción (p100) Para dos (2 x p100)* STEMCCA o EOS 10 µg 22 µg PPAX2 4 µg 8.8 µg PMD2G 2.5 µg 5.5 µg Fugene 6 49.5 µl 108.9 µl OPTIMEM 500 1100 µl

*Se considera un exceso del 10 %

Se plaquearon 3 x 106 células 293T/p100, en 4 p100 con 10 ml de medio complete DMEM. Se realizaron un total de 2

reacciones por gen. Luego de 16 h se cambió la mezcla de reacción por 9 ml de medio DMEM fresco por placa y a las 24 h siguientes

se procedió a la colecta del sobrenadante cada 12 h por dos días consecutivos (4 colectas en total de 9 ml cada una). Los

sobrenadantes colectados fueron filtrados por membranas de 0.45 µm y guardados a 4 °C hasta completar el número total de colectas

previstas. Posteriormente se realizó la concentración por ultra centrifugación con un rotor Beckman WS28 a 10°C, 16.500 rpm y por

90 minutos. Se descartó el sobrenadante y se dejó incubando 2 h en hielo antes de la resuspención final y alicuotado del stock viral (lo

que no se usa en el momento se guarda a -80 °C).

4.4.4. Reprogramación medio FGF+ MEF + KSR

Protocolo de reprogramación de BEF y PEF

El mismo día en que se concentraron las partículas lentivirales, se infectaron dos densidades diferentes de fibroblastos

fetales (40.000 y 80.000 células para bovinos; y 50.000 y 100.000 células para porcinos). El objetivo fue transducir un número tal de

manera que a los 6 días de cultivo se obtengan entre 90-95 % de confluencia en un well de 6. Se utilizaron 3 cantidades diferentes de

sobrenadante concentrado (Tabla 45): bajo: 0.3, medio: 1.5 y alto: 7.5 µl para STEMCCA y 0.4, 2 y 10 µl para EOS (dependiendo de

la cantidad de volumen final que haya quedado después de descartar el líquido sobrenadante, se busca que de 300 µl de concentrado,

es decir 150 µl por cada p100, se utilicen 0.2, 1 y 5 µl de partículas virales concentradas, en estos experimentos se realizaron los

ajustes puesto que se obtuvo el sobrenadante levemente más diluido). Al quinto día se alcanzó la confluencia de entre 90-95 % por lo


2

136

que se adelantó el pasaje a MEF por un día a lo previsto en el protocolo. Se cultivaron 100.000 células por p100 de MEF irradiadas,

se plaquearon 2 condiciones (con y sin butirato de sodio) por cada nivel de partículas lentivirales (bajo, medio alto) para cada especie.

Cabe señalar que entre séptimo y décimo día de haber sido plaqueadas en MEF las células bovinas superconfluentes se despegaron de

la placa, por lo que se repitió el proceso de reprogramación desde el plaqueo en MEF con una cantidad menor (40.000 células en

lugar de 100.000). El medio se cambió cada dos días.

Tabla 45: Esquema de transducción de fibroblastos porcinos (rojo) y bovinos (verde)

0.3 µl STEMCCA 0.4 µl EOS

1.5 µl STEMCCA 2 µl EOS


0.3 µl STEMCCA 0.4 µl EOS


7.5 µl STEMCCA 10 l EOS

Caracterización de colonias: Extracción de RNA y RT-PCR

Se tomaron muestras para análisis de expresión en 350 µl del buffer de lisis del kit de extracción de RNA, las muestras

fueron almacenadas a -80 °C en este buffer hasta la extracción. Se realizó la extracción con columna de acuerdo a lo sugerido por el

fabricante (incluye entre sus pasos la digestión de DNA en columna). Las muestras extraídas se resuspendieron en 30 µl de agua libre

de nucleasas y se utilizaron inmediatamente para síntesis de c-DNA, el resto del RNA se almacenó en -80 °C. La síntesis de cDNA se

realizó con el kit Omniscript de Qiagen en un solo paso mezclando los siguientes reactivos:

Tabla 46: Mezcla de reacción para síntesis de c-DNA.

Componentes Cantidad por reacción de síntesis de cDNA

Master mix 10X Buffer RT 2 µl

dNTP Mix (5 mM cada dNTP) 2 µl Random Primer 1 µl

RNase inhibitor (10 unidades/µl) 1 µl

(diluir el stock de 40unidades/µl con buffer RT 1X)

Omniscrpt Transcriptasa Reversa 1 µl

(4 unidades por reacción de 20 µl) Agua libre de RNAsa Variable

Templado de RNA Hasta 13 µl

(hasta 2 µg finales)* Volumen total 20 µl

*En los casos en que la cantidad de RNA fue suficiente se tomó 1µg de RNA para la síntesis de c-DNA, en aquellos

otros en los que no se preparó el máximo permitido por reacción es decir 13 µl de RNA.

Se incubó 1h a 37 °C, y el c-DNA listo se utilizó inmediatamente para análisis de expresión por RT-PCR. Para ello se

setearon las reacciones de PCR de acuerdo a la siguiente tabla:


2

137

Tabla 47: Mezcla de reacción de PCR para detección de genes de pluripotencia y diferenciación

Agua libre de nucleasas 2.8 µl Primer F/R (10 µM):

se prepara diluyendo 5 µl de cada primer stock 100 µM en 40 µl de agua

0.2 µl

Ready mix (Sigma Aldrich) 5 µl c-DNA (20 ng) 2 µl

Volumen final de reacción 10 µl

Se realizó una master mix por par de primers (Tabla 48), calculando la cantidad de cada reactivo para el número total de

muestras, un control positivo, un control negativo y un exceso de 1 reacción o 10 % dependiendo del volumen final total. Esta master

mix se dividió en 8 ul por reacción y se le agregaron 2 µl de c-DNA diluido de manera de contar con 20 ng de c-DNA totales por

reacción (dependiendo de la muestra se diluyó en un rango de 1/2.5 a 1/5). Se trabajó todo el tiempo en hielo.

Tabla 48: Secuencia de primers para RT-PCR utilizados en la caracterización de células porcinas.

Gapdh Forward Gapdh Reverse

GGGCGTGAACCATGAGAAGT GTCTTCTGGGTGGCAGTGAT

Gen normalizador (mRNA amplicón: 162 bp)

OCT4 Forward OCT4 Reverse

GCAAACGATCAAGCAGTGA GGTGACAGACACCGAGGGAA

Marcador de pluripotencia mRNA: 201 bp

SOX2 Forward SOX2 Reverse

AAGAGAACCCCAAGATGCACAACT GCTTGGCCTCGTCGATGAAC

Marcador de pluripotencia mRNA amplicón: 105 bp

Klf4 Forward Klf4 Reverse

CCATGGGCCAAACTACCCAC TGGGGTCAACACCATTCCGT


NANOG Forward NANOG Reverse

AAGTACCTCAGCCTCCAGCA GGCATCCTTGGTGATAGGAA


Cdx2 Forward Cdx2 Reverse

AGAACCCCCAGGTCTCTGTCTT CAGTCCGAAACACTCCCTCACA

Marcador de trofoectodermo mRNA amplicón: 101 bp

Eomes Forward Eomes Reverse

TACCAACCACGTCTGCACAT GGAAGCGGTGTACATGGAGT

Marcador de trofoectodermo amplicón: 210 bp

Gata4 Forward Gata4 Reverse

AATCGAAGACGTCAGCAGGT GGCCAGACATGGCACTAACT

Marcador de endodermo definitivo amplicón: 195 bp

SOX17 Forward SOX17 Reverse

CTTCATGGTGTGGGCTAAGG TTGTAGTTGGGGTGGTCCTG


Ple-1 Forward Ple-1 Reverse

CTGGCAAAAAGCAGACATGA AGCTGTAGCCTCCTTGTGGA


AFP Forward AFP reverse

AGATGCCCATAAACCCTGGT CCAGTAGACCAGAGAAATCTGCA


Esrrb forward Esrrb Reverse

AGCCCGTACCTGAGCTTACA CAACCA ATGATGACCACGAG



2

138

El c-DNA se amplificó mediante PCR de acuerdo al siguiente protocolo:

Tabla 49: Protocolo de PCR para genes porcinos

Desnaturalización 94 °C 4 minutos 40x (amplificación)

94 °C 30 segundos 60 °C 30 segundos 72 °C 30 segundos

Extensión final 72 °C 4 minutos 10 °C

Las muestras se analizaron en una corrida de gel de agarosa al 1.5 %, para determinar la presencia o ausencia de expresión

del gen. Se sembraron 10 µl del producto de PCR más 2 µl de buffer de carga 6X y en paralelo se sembró un marcador de peso

molecular de 100 bp.

Caracterización de colonias: Fosfatasa Alcalina

Se evaluó la actividad fosfatasa alcalina mediante la utilización del kit de Sigma Aldrich Catálogo 86R-1KT siguiendo las

especificaciones del protocolo, pero reduciendo la preparación de reactivos a un décimo de lo recomendado.

4.4.5. Reprogramación en medio SB43

Se transdujeron fibroblastos porcinos y bovinos provenientes de cultivo primario y criopreservados en pasaje 0 y 3

respectivamente (PEF5 Po y BEF5 P3). Se plaquearon 100.000 células por cada well de 6 (por duplicado) y se agregaron en forma

consecutiva partículas lentivirales, 1.5 µl de STEMCCA y 2µl de EOS, producidas y almacenadas en alícuotas a -80 °C (ver página

130); junto con 7 µg/ml de polibreno. Las células transducidas se cultivaron a 37.5 °C y 5 % CO2. Posteriormente se cultivaron en

medio DMEM completo (medio para fibroblastos) y al cuarto día se dividieron en nuevos wells de 6 cubiertos previamente con

geltrex. Se sembraron dos densidades distintas: 10.000 y 20.000 células por well de 6. Las células en cultivo crecieron en medio

SB43 durante varios días hasta la aparición de colonias. Las colonias seleccionadas se pasaron en forma manual, con tryple en forma

de agregados y con tryple disgregadas completamente. Se testeó la habilidad del pasaje clonal a matriz extracelular y a MEF

previamente inactivadas con mitomicina C.

Figura 47: Proceso simplificado de reprogramación de PEF en geltrex y medio SB43

DÍA -1

Plaequear 100.000 células por well de 6

DÍA 0

Transducción con STEMCCA y EOS

DÍA 1

Transducción con STEMCCA y EOS

DÍA 2

Cambiar medio a DMEM completo

DÍA 6

Dividir las células y sembrar 10.00 y 20.000 células en well de 6 con

geltrex

Día 6

Cultivar en medio SB43

Día 9

Aparecen colonias

Día 16-21

picar colonias con aguja y disgregar con tryple. Pasar a placas con m-MEF


2

139

Se realizaron modificaciones al protocolo de reprogramación debido a que las BEF5 P4 no sufrieron cambio en la

morfología. Por lo tanto, se utilizaron las células dos veces transducidas, criopreservadas y se transdujeron, 25.000 células en pasaje

5, 3 veces consecutivas como se describió anteriormente. Al tercer día se dividieron en dos densidades: 2500 y 5000 células en well

de 6 con geltrex y se cultivaron por duplicado en medio DMEM completo hasta el 20-30% de confluencia (2-3 días). Alcanzada esa

confluencia se cambió el medio por medio stem SB43 y se cultivaron las placas a 37.5 °C, 5 % de CO2, cambiando por medio fresco

día por medio.

Composición de medio SB43

Tabla 50: Composición medio stem SB43 (112)

Componente Concentración stock Concentración en el medio Cantidad para 400 mL

KSR (Invitrogen, 10828028) - 20% 80 mL MEM (GIBCO, 11095) 100X 1X 4 mL

mercaptoetanol (GIBCO, 50 mM 0.1 mM 800 µl

bFGF (Peprotech, 80 µg/mL 20 ng/mL 100 µl hLIF (Peprotech) 200 µg/mL 20 ng/mL 40 µl SB431542 (Calbiochem). 100 mM 2.5 µM 10 µl PD32 (Tocris) 10 mM 0.5 µM 20 µl Rock inhibitor. 10 mM 0.5 µM 20 µl P/S 100X 1X 4 mL DMEM/F12 (Thermofisher 11320-074)

1X 1X 311 mL

Pasaje de células semejantes a células pluripotentes inducidas

Luego de aproximadamente 9 días post-transducción, observamos colonias con una morfología similar a la presentada por

las ESC. Seguimos en el tiempo estas colonias por su morfología y para observar el aumento del tamaño que indique el crecimiento

celular. Se testearon diferentes formas de pasaje. Primero, dada la alta confluencia del well sembrada con 20.000 células al día 11 se

pasó este well entero a una razón de 1 a 4 a un nuevo well con geltrex. Al día 16 post-transducción, recortamos las colonias con una

aguja estéril, y sembramos una colonia a una placa con geltrex o con m-MEF para testear el sustrato que sea más satisfactorio para la

expansión. Finalmente, se picaron colonias con aguja estéril y se disgregaron con tryple ya sea hasta nivel unicelular o como

agregados para pasarla a wells con m-MEF. Continuamos con la amplificación de las colonias de la misma manera que para iPSC

humanas detallado en el protocolo de Beer et al., (2012), es decir, tratándolas con tryple, y sembrándolas sobre m-MEF en wells de

placa MW24 y luego MW6.

Congelamiento de colonias semejantes a iPSC

Para criopreservar células iPSC se levantan las células con tryple (tanto colonias como m-MEF). Se neutraliza con medio

con suero o BSA y se centrifuga a 200 – 400 g durante 5 minutos. Se descarta el sobrenadante y finalmente se resuspende en 900 µl

de SFB y 100 µl de DMSO. Se almacena en N2 líquido en criotubos previamente etiquetados.


2

140

Caracterización de colonias: detección del casete h-STEMMCA en células reprogramadas

Extracción de DNA genómico

El protocolo se detalla en la sección de Anexo, protocolos comunes de biología molecular, página 186.

PCR tiempo final

La inserción viral se evidencia mediante una PCR que detecta únicamente al constructo recombinante STEMCCA.

Existen dos PCRs independientes puestas a punto en el Laboratorio PLACEMA del Instituto Leloir (Figura 48), se realizó en base a

su protocolo solo una PCR para detectar el puente OCT4_bridge/Klf4_bridge (OK_bridge). Asimismo, se realizó una PCR que indica

la presencia de gDNA en la muestra mediante la detección de un gen Housekeeping (HKG) para gDNA. En este caso se utilizó como

HKG al gen de GAPDH.

Figura 48: Cassette de expresión de los factores de reprogramación de Yamanaka y amplicones detectados

Se tomaron muestras a diferentes colonias iPSC para extraer el gDNA, para ello se despegaron las células adheridas a m-

MEF con triple (600 µl por cada well de 6) se incubó 5 min en estufa de cultivo y se neutralizó con igual cantidad de medio con

suero. Las células se centrifugaron a 200 – 400 g por 5 minutos en eppendorf y se descartó el sobrenadante. El pellet formado se

almacenó a -80 °C hasta su uso. Se analizaron por PCR las muestras iPSC más 3 controles, sobre el puente OK_bridge y sobre

GAPDH.

50 ng de gDNA de IPSC

50 ng de gDNA PEF parentales.

Control positivo OK_bridge: plásmido de STEMCCA

Control positivo HKG: Línea parental conocida

Control negativo: Agua

Mix PCR

Tabla 51: Mezcla de reacción para PCR de detección STEMCCA en gDNA

Reactivo 1x (µl) 5x OK_bridge 5x GAPDH 2X PCR buffer Ready mix (Sigma) 5 27.5* 27.5 OCT4_bridge 10 µM 0.5 2.75 - Klf4_bridge 10 µM 0.5 2.75 - GAPDH_F/R 10 µM 0.3 - 1.65 Agua 2.7 (HKG)

2 (puente) 11 14.85

Muestra 5 - -


2

141

* Se calcula con un exceso de 10 %. El volumen final de la reacción de PCR es de 10 µl cada una: 8 µl de mezcla PCR + 2 µl de

gDNA diluido.

Gel control de agarosa

- Se agregó 2 µl de Blue Loading Buffer 6X a cada tubo de PCR, y se sembró 10 µl de cada muestra en un gel 1 % de agarosa, con

Bromuro de Etidio.

- Se dejó correr por una hora a 100 V (aproximadamente).

- Se documentó con un transiluminador UV.

Juego de Primers

Tabla 52: Secuencia de primers para detección en gDNA del casete STEMCCA

Nombre bp Secuencia Programa PCR OCT4_bridge 560 CAACGAGAGGATTTTGAGGCTGC INTEGRA klf4_bridge ATCGTTGAACTCCTCGGTCTCTCT

Programa de PCR

Tabla 53: Programa INTEGRA para detección de STEMCCA en gDNA

INTEGRA 1. 94 °C 3´ 2. 94 °C 45´´ 3. 61 °C 30´´ 4. 72 °C 1:30´ 5. GOTO 2 35 veces 6. 72 °C 10´ 7. 8 °C for ever

Caracterización de colonias semejantes a iPSC: Inmunofluorescencia de células

1. Se crecieron las células adheridas a cubreobjetos de manera de facilitar su manipulación posterior en el proceso de

detección de proteínas por Inmunofluorescencia.

2. Para proteínas que no son de membrana se fijó con metanol, 10 min a -20 ºC; si no fijar con PFA 4 %, y se lavó con PBS.

Se pueden guardar los cubres hasta 2 semanas a 4 ºC en PBS cubiertos de la luz o por meses a 4 °C con PBS 1 % PFA.

3. Se permeabilizó con solución de tritón x-100 al 1 % en PBS preparada en el día, 15 min RT. Se lavó 3x con PBS. 5 min a

RT.

4. Se bloqueó con BSA 5 % en PBS (para proteínas de membrana) o 10 % donkey serum 5 % BSA en PBST (0.2 % tween-

20) para el resto de los marcadores nucleares, 45 min RT.

5. Se incubó con AB primario (dilución en bloqueo o PBST) ON a 4 ºC.


2

142

6. Se lavó 3x 15 min RT con PBST.

7. Se incubó con AB 2rio 1h RT con (dilución del AB en bloqueo o PBST). Se lavó 3x 5 min RT.

8. Se montaron en forma invertida sobre una gota de 7-10 µl de Fluoroshield de Sigma Aldrich (catálogo F6057-20 ml)

sobre un porta.

9. Se dejaron secar en la oscuridad 4 h a ON, y se sellaron con esmalte de uñas.

10. Se conservaron a 4 ºC o -20 ºC (períodos prolongados). Se documentaron los resultados en fotos.

Tabla 54: Dilución de anticuerpos primarios y secundarios utilizados en IF de células.

Proteína Anticuerpo primario Anticuerpo secundario Inmunógeno (1rio)

NANOG Peprotech. 500-P236. Dilución 1/100.

Alexa fluor 488. Donkey anti rabbit. Dilución 1/400.

Policlonal rabbit anti h-NANOG

SOX2 Santa Cruz. sc-17320. Dilución 1/200

Cy3 donkey anti goat. 1/500 Policlonal goat anti h-NANOG

TRA-1-81 DSHB: Developmental studies hybridoma bank. Dilución 1/10

Alexa fluor 488. Donkey anti mouse. Dilución 1/400

SSEA4 DSHB: Developmental studies hybridoma bank. 1/10

Alexa fluor 488. Donkey anti mouse. Dilución 1/400

SSEA1 DSHB: Developmental studies hybridoma bank. 1/10

1/400

Caracterización de colonias: RT-PCR

Con el objeto de caracterizar las células iPSC se extrajo RNA tal como se mencionó en la sección Caracterización de

colonias: Extracción de RNA y RT-PCR descrita en la página 135. Se analizaron muestras de PEF parentales y de colonias

semejantes a iPSC porcinas en diferentes pasajes (P2 y P4). Para la detección de nodal (proteína perteneciente al pathway de TGFb)

se utilizaron los siguientes primers:

Nodal_Fordward: CGT CTC CAG ATG GAC CTG TT

Nodal_Reverse: CTG CTC TGG AGA GAG GTT GG

Se utilizó como control positivo el c-DNA proveniente de muestras de embriones porcinos. El amplicón correspondiente a

nodal se visualiza como una banda a 222 bp.


2

143

5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1. Reprogramación con vectores episomales

La transfección con los episomas de reprogramación se realizó con fugene, previa puesta a punto de la densidad inicial de

transfección, la relación de ADN:Fugene y la cantidad de ADN total por mezcla de transfección. Se realizó en paralelo una

transfección control con GFP con la cantidad equivalente de un vector, es decir 1 µg total, para estimar en forma indirecta la

eficiencia de transfección de los factores de Yamanaka (Figura 49). Hay que señalar aquí que por eventos estocásticos la eficiencia

parece ser visiblemente menor en el momento del ensayo a la obtenida durante la puesta a punto con las mismas condiciones (Figura

49 B y C). En la puesta a punto se logró un 23 % de células GFP positivas con un solo evento de transfección (analizado por FACS).

Figura 49: Fibroblastos fetales bovinos como control de la reprogramación con episomas. A: BEF P5 campo claro; B: expresión de GFP en BEF transfectados con el episoma p27082 48 h posteriormente a la primera transfección y C: expresión de GFP en BEF durante la puesta a punto en las mismas condiciones de ensayo, 48 h post-transfección.

Aún con la eficiencia de transfección obtenida en el control se decidió proseguir con la reprogramación dado que para

fibroblastos se consideró que la misma está dentro de un valor esperado. Durante la puesta a punto se probó también la nucleofección

de fibroblastos con el kit de Lonza y el dispositivo Amaxa. El nivel de células GFP positivas a las 48 h fue de aproximadamente 19 %

analizado por FACS.

Las células fetales bovinas y porcinas se comportan de manera muy distinta, a pesar de haber utilizado el mismo tipo

celular (fibroblastos). Esto es esperable cuando se trabaja con cultivos primarios aún de la misma especie y tiene que ver por un lado

con la edad del donante y por el otro con características intrínsecas del mismo, que son desconocidas. Detectamos que las células

bovinas crecen con mayor velocidad que las porcinas, y que además las células porcinas son de mayor tamaño puesto que al

cultivarse con una misma densidad inicial y a un mismo tiempo el número de células porcinas siempre fue menor (a igual porcentaje

de confluencia) que el de bovinas. Después de la primera transfección para reprogramar, el protocolo se dividió en dos: con un well

de 6 de cada especie se siguió el protocolo de Beers (sin MEF y medio E8 para reprogramación, llamado RPM1 y RPM2); y con el

otro, el método convencional (en MEF y medio stem base DMEM/F12, KSR y FGF) solo que en esta ocasión le agregamos

adicionalmente los inhibidores comúnmente utilizados para obtener células naïve en ratón.

Al momento del pasaje a condiciones stem (24 h pos transfección) y siguiendo el protocolo de Beers, los fibroblastos

transfectados en un well de 6 se pasaron a dos placas de well de 6 pre-tratadas con geltrex. En total alrededor de 500.000 células

bovinas se dividieron en 12 wells por lo que al inicio de la reprogramación cada well tuvo aproximadamente 45.000 células. Como

los fibroblastos porcinos crecen más lento, a igual cantidad transfectada, se obtuvieron aproximadamente 200.000 células totales que

A B C


2

144

se dividieron en 12 wells a razón de 18.000 células por well. En los primeros 3-5 días se cultivó con medio que favorece la división

celular debido al agregado de hidrocortisona (medio RPM1). Este medio se mantuvo hasta lograr el 20 % de confluencia, momento

en el que se pasó a medio RPM2 con butirato de sodio (NaB). Las células bovinas lograron el 20 % de confluencia de acuerdo a lo

esperado en el protocolo, pero las porcinas no lograron el objetivo, ni siquiera después de una semana en cultivo por lo que se cree

que fueron afectadas o bien por la baja densidad inicial o por el método de transfección, es decir la toxicidad del agente de

transfección (optimizado para bovinos, pero no para porcinos). De hecho, el número de células pos transfección fue la mitad para los

fibroblastos porcinos a pesar de que se comenzó inicialmente con la misma cantidad, es decir 300.000 células por well. Después de 30

días de cultivo en medio RPM2, las células bovinas y porcinas no mostraron cambios detectables en la morfología, tampoco se

apreció un aumento significativo en el número de células, sino que al contrario, éstas parecieron haberse arrestado en algún momento

del proceso de reprogramación (Figura 50 A).

Al creer que quizás tanto la densidad celular como el nivel de transfección no fue el adecuado en este primer ensayo de

reprogramación se procedió a una segunda tanda de transfección y al momento de pasar a condiciones stem se decidió plaquear sobre

una placa de well de 6 en vez de dos como sugería el protocolo. Estas modificaciones tampoco lograron hacer diferencia en los

resultados obtenidos, es decir que después de 30 días en medio RPM2 tampoco hubo cambios morfológicos detectables en ninguna de

las dos especies.

Figura 50: Fibroblastos bovinos y porcinos en reprogramación, A: BEF P7 (izquierda) y PEF P5 (derecha) después de 30 días cultivados en geltrex con RPM2; B: MEF inactivados con mitomicina (izquierda) y MEF con BEF 24 h pos pasaje (derecha); C: fibroblastos bovinos (izquierda) y porcinos (derecha) en reprogramación después de 30 días de cultivo en medio DMEM/F12, 20 % KSR, FGF (20 ng/ml), 1 µM PD32 y 3 µM de CHIR.

A

B

C


2

145

Como se mencionó antes, también se probaron las condiciones convencionales de producción de iPSC en MEF y medio

DMEM/F12 con KSR y FGF. A las 48 h postransfección se realizó el primer pasaje de células, contándose un total de alrededor de

600.000 células totales para bovinos y 300.000 para porcinos. Nuevamente se notó la diferencia antes marcada de que los fibroblastos

porcinos probablemente fueron más afectados durante la transfección y crecen con mayor lentitud. Estas células se dejaron creciendo

hasta el día 6, momento en el que fueron pasadas a razón de 100.000 células por cada p100, en dos placas con MEF por especie con y

sin butirato de sodio (Figura 50B). Después de 30 días se observa que si bien las células crecieron, no hubo cambios morfológicos

apreciables, por lo que una vez más se cree que independientemente de las condiciones de reprogramación testeadas, el nivel logrado

de expresión de los factores de transcripción no parece ser suficiente para la reprogramación de fibroblastos bovinos y porcinos con

un solo evento de transfección de episomas (Figura 50C). Al revisar la bibliografía publicada sobre el tema se encontró que Okita et

al (2011) logran colonias de fibroblastos humanos con niveles de transfección del control GFP de 67.6 % a la semana de transfección

y que el mismo desciende a 28 % a las dos semanas de cultivo (113). En nuestro control se logró entre el 10-15 % a las 48 h pos

transfección y 1.1 % 2 semanas después de haber sido transfectado y cultivado (analizado por FACS). La ventaja de los episomas es

que no se integran al genoma, por lo que se puede lograr una reprogramación en las primeras dos semanas debido a la activación

endógena de los factores de pluripotencia; la desventaja es que se pierden durante el cultivo y si no se logra la reprogramación en las

primeras dos semanas con los niveles probablemente esto sea signo de que el nivel inicial de transfección no es el adecuado, sumado

a que el medio de cultivo podría estar ejerciendo un desbalance en contra de la pluripotencia. La eficiencia de reprogramación

obtenida en humanos con episomas es mucho menor que la lograda con partículas lentivirales (3.9 x 10-4 versus 0.01 a 1.5) (50,113).

Okita logra los niveles anteriores con nucleofección en un solo evento de transfección y con un porcentaje de viabilidad alto mediante

el uso de un kit optimizado para fibroblastos humanos. Lamentablemente en este estudio no se contó con el mismo tipo de

herramienta para fibroblastos bovinos y porcinos, y de hecho el nivel alcanzado por nucleofección no fue significativamente distinto

al alcanzado mediante el uso del agente de transfección fugene 6 en nuestra puesta a punto.

Hubbard et al., (2014) logran reprogramar células derivadas de sangre periférica humana con el uso de estos mismos

vectores episomales hasta de un paciente de 87 años, las colonias aparecen a los 12 días post-nucleofección (114). A pesar de que el

nivel logrado de expresión del control de GFP es del orden del 10 % (similar al obtenido en nuestros ensayos), este nivel de expresión

parece ser suficiente para células eritoblásticas cultivadas para la reprogramación. De hecho, Chou et al., (2011) demuestra que las

células CD34+ derivadas de sangre periférica se encuentran a una menor distancia de las células pluripotentes humanas (ESC, iPSC)

en el dendograma cuando se analiza la metilación del ADN en forma genome wide (115).

Por los resultados obtenidos con un solo evento de transfección, se concluye que el nivel bajo de transfección logrado con

los fibroblastos bovinos y porcinos podría llegar a ser una de las causas principales de no haber obtenido células reprogramadas.

Aunque también se cree que durante la reprogramación en medio RPM2 las células por alguna razón que se desconoce no logran

dividirse de forma suficiente para lograrlo. Si bien al principio se creyó que el nivel de células plaqueadas en condiciones stem fue

insuficiente para lograr obtener un cultivo saludable y activo, en nuestro segundo intento en el que se plaqueó a una mayor densidad

(el doble) no se obtuvo resultados diferentes. Las células parecen arrestarse y esto es sin lugar a duda en detrimento del proceso de

reprogramación que requiere una división celular activa. Por otro lado, habiendo realizado en paralelo la reprogramación en medio

convencional y sobre una feeder layer de MEF se testeó que, si bien en esta ocasión la división celular no pareció ser un


2

146

inconveniente, los fibroblastos de ambas especies no lograron cambios morfológicos detectables, por lo que este experimento sugiere

que la eficiencia de transfección podría impactar fuertemente en la eficiencia de reprogramación. Por lo publicado en la literatura se

puede inferir que los fibroblastos aun siendo fetales, son en general más refractarios a la reprogramación que otros tipos celulares

como las células de sangre de cordón umbilical, o las células de sangre periférica. Por tanto, si bien una opción es mejorar la

eficiencia de transfección de los episomas en nuestros fibroblastos fetales (por múltiples transfecciones seriadas), la otra alternativa

también podría ser la de emplear otro tipo celular para comenzar el proceso. Adicionalmente se pueden probar métodos más

eficientes de reprogramación, entendido como un proceso global, utilizando partículas lentivirales con los factores de Yamanaka en

un vector policistrónico (STEMCCA) que asegura que la célula que es transducida cuente al mismo tiempo con los cuatro factores de

reprogramación, aumentando de esta manera la probabilidad de que sea reprogramada.

Finalmente hay que señalar que los resultados obtenidos realizando cuatro transfecciones seriadas y en diferentes medios

con inhibidores demuestran que no se favoreció la reprogramación ni de fibroblastos porcinos, ni bovinos. No hubo cambios en la

morfología después de cultivar sobre MEF y medio stem por 30 días.

5.2. Reprogramación con STEMCCA en medio FGF+ MEF + KSR

De acuerdo a los intentos fallidos descriptos en la sección anterior se decidió inducir el proceso de reprogramación

utilizando el vector lentiviral STEMCCA para insertar los genes de Yamanaka (OKSM) y lograr una expresión estable de los factores

durante el cultivo. Se requiere al inicio una expresión sostenida de los factores exógenos hasta lograr la reactivación de los genes

endógenos. Se utilizaron tres cantidades diferentes de partículas lentivirales para transducir dos densidades celulares. La idea del

protocolo es trabajar con diferentes cantidades de partículas lentivirales para generar iPSC con diferentes MOI y a su vez testear

aquella densidad celular que a los 6 días de cultivo logren entre el 90-95 % de confluencia en un well de 6. Con BEF y PEF se logró

esta condición con la menor densidad al cuarto día, por lo que se decidió adelantar el pasaje a MEF (Figura 52 A). Se pasaron

100.000 células por cada placa p100 con MEF. Esta cantidad y condiciones fueron suficientes para lograr a los 9 días los primeros

cambios detectables de morfología. En los porcinos este cambio fue seguido del aumento en el número de células y aparición de

colonias con morfología parecida a las células madre, mientras que en el caso del bovino si bien al principio parecía haber cambios

(Figura 52 B), no se lograron obtener colonias en el medio utilizado. En porcinos las primeras colonias detectables aparecieron en

mayor número en las condiciones de mayor cantidad de partículas lentivirales al momento de la transducción, aunque estas colonias

se fueron poniendo más oscuras y apoptóticas (Figura 51 A). También aparecieron cambios en la morfología similares a “gotas

lipídicas” primero en los fibroblastos transducidos con mayor MOI y luego se extendieron a todas las condiciones testeadas (Figura

51 B). Con el transcurso del tiempo se pudo detectar que a menor MOI las colonias que fueron emergiendo en cultivo fueron de

mejor calidad desde el punto de vista de la morfología que las colonias obtenidas a mayor MOI (Figura 53).


2

147

Figura 51: Cambios morfológicos en colonias obtenidas con alto MOI a 18 días de cultivo. A: células porcinas con signos de apoptosis: B: células con estructuras que se asemejan a gotas lipídicas.

Figura 52: Fibroblastos en proceso de reprogramación. A: BEF P3 (izquierda) y PEF P2 (derecha) al 4to día post- transducción antes de plaquear sobre MEF, la foto corresponde a la menor densidad plaqueada, para la cantidad alta de partículas lentivirales. B: día 10, células procedentes de la transducción con baja cantidad de partículas lentivirales plaqueadas sobre MEF.

Si bien esta diferencia de calidad en las colonias, según la MOI empleada para transducir los fibroblastos, fue evidente las

primeras tres semanas, a partir de la cuarta se generalizó para todas las condiciones testeadas, en las que aparecieron en mayor o

menor medida colonias con características similares a tejidos extraembrionarios (Figura 54).

A

B

A B


2

148

Figura 53: Colonias porcinas semejantes a iPSC cultivadas en DMEM/F12 con 20 % KSR y 20 ng/ml de FGF. A: colonias emergiendo a los 10 días posteriores a las transducción (objetivo 5x); B: Colonia a los 13 días (objetivo 10x) y C: 18 días posterior a la transducción (objetivo 5x). Las colonias pertenecen a la condición sin butirato de sodio y con nivel bajo de partículas lentivirales.

Figura 54: Colonias porcinas semejantes a iPSC y con sectores con estructuras de apariencia extraembrionaria (24 días en cultivo). Se observan estructuras globulares (flecha). Imágenes tomadas con lupa.

Se procedió entonces a caracterizar las colonias en cultivo después de 24 días. Para ello se extrajo RNA de colonias en

reprogramación y de fibroblastos parentales, y se analizó por RT-PCR la expresión de genes de pluripotencia y de diferenciación

(Figura 55 y Figura 56). Como puede observarse, los fibroblastos porcinos expresan niveles bajos de Eomes, Gata4, Esrrb y Klf4;

pero no expresan los genes relacionados al core de pluripotencia En cambio, las colonias en proceso de reprogramación expresaron

genes de diferenciación a trofoectodermo (Cdx2, Eomes, Ple-1 y Esrrb) así como de endodermo primitivo (Gata4, Sox17, AFP). Esto

refuerza la observación referente a su morfología descrita en párrafos anteriores. La expresión de los genes endógenos de

pluripotencia que son a su vez expresados a partir del vector STEMCCA es escasa o nula en las dos muestras analizadas, por lo que

sugiere que la reprogramación no ha sido exitosa. Nanog es un gen relacionado a la pluripotencia que no se agrega exógenamente con

el vector STEMCCA, por lo que su expresión indicaría la activación endógena por parte de los factores OKSM (exógenos y

endógenos).

B C A


2

149

Figura 55: Análisis cualitativo por RT-PCR de la expresión génica de fibroblastos parentales y colonias en cultivo a día 24. Los productos de RT-PCR fueron analizados mediante electroforesis en gel de agarosa 1.5 %. Se analizaron los genes marcadores de pluripotencia Oct4, Sox2, Klf4, Nanog y de diferenciación Cdx2, Aromatasa, Eomes, Sox17, Gata4, Ple-1, AFP y Esrrb. Se muestran también los controles negativo (sin RT), y los positivos (TE para genes Cdx2, Aromatasa, Ple-1 y Esrrb; PE para Sox17, Gata4 y Eomes; Epiblasto porcino para Oct4, Sox2, Nanog y Klf4; Hígado para AFP).

SOX2 NANOG DAPI

Figura 56: Análisis de expresión por inmunofluorescencia de anticuerpos anti SOX2 (A), NANOG (B) y DAPI (C) de fibroblastos porcinos (arriba) y una colonia de porcino de 24 días con características extraembrionarias (abajo).

A B C


2

150

De acuerdo a lo observado durante el cultivo la presencia o ausencia de butirato de sodio no afecta visiblemente las

primeras fases de reprogramación. Las colonias en ambos casos fueron de morfología similar (Figura 57). El número de colonias

fosfatasa alcalina positiva en presencia de butirato de sodio parece ser levemente menor que en su ausencia: 117 versus 138 (Figura

58), aunque se analizó una sola condición de transducción, se pudo observar en todos los casos (es decir para todas las condiciones

MOI ensayadas).

Figura 57: El agregado de NaB en el proceso de reprogramación no afecta la morfología de las colonias porcinas obtenidas. Colonias semejantes a iPSC porcinas de día 18, cultivadas en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de NaB y obtenidas de

fibroblastos porcinos transducidos con bajo nivel de partículas lentivirales.

Figura 58: Fosfatasa alcalina en colonias semejantes a iPSC porcinas obtenidas 24 días posteriores a la transducción de los fibroblastos con partículas lentivirales. Se muestra la condición de transducción media, cultivada en presencia o ausencia de butirato de sodio.

Se picaron colonias a los días 18, 19 y 21 de cultivo en MEF. Se seleccionaron colonias con morfología stem obtenidas en

condiciones de bajo y mediano MOI, así como con y sin butirato de sodio (Figura 59). Las colonias se dividieron entre 3-10

fragmentos dependiendo del tamaño de la colonia y se pasaron manualmente a medio FGF+KSR y LIF/FGF+3i.


2

151

Figura 59: Morfología de las colonias semejantes a iPSC antes y después del pasaje. A: Bajo MOI, con NAB colonia 5 pasada el día 18 (arriba) y 7 después de cultivo (abajo). B: Bajo MOI y con NAB, colonia 3 C: Bajo MOI y sin NAB, colonia 15.

Se decidió pasar en forma clonal cada colonia a un well de p24, aquellas en medio LIF/FGF/3i rápidamente se tornaron de

aspecto apoptótico y no crecieron. Las colonias en FGF/KSR si bien al principio parecían tener mayores posibilidades de

supervivencia también se volvieron apoptóticas o con signos de diferenciación en cultivo durante 7 días. No se pudieron establecer

entonces colonias p-iPSC en las condiciones testeadas.

Se desconoce las razones por las cuales existe una activación de la expresión de marcadores extraembrionarios en las

colonias en reprogramación con STEMCCA. Se han obtenido en este mismo laboratorio (Universidad de Nottingham, Laboratorio

dirigido por el Dr. Ramiro Alberio) y con fibroblastos porcinos, colonias parcialmente reprogramadas con vectores lentivirales que

expresan cada uno de los factores por separado en medio DMEM/F12 con KSR y FGF, así como en medio 2iLIF y la morfología de

las mismas es similar a las células madre durante todo el proceso de establecimiento de las p-iPSC. Es decir que a diferencia de las

células transducidas con el vector STEMCCA, no se expresan marcadores del linaje extraembrionario en esas colonias. En esas

condiciones si bien los genes endógenos se activan, no son expresados en niveles tales que se mantenga su expresión estable sin la

inducción de doxiciclina, es decir que la red endógena de pluripotencia no se auto-sustenta. Los resultados obtenidos con los vectores

lentivirales monocistrónicos sugieren que se logra la primera fase de la reprogramación descrita por Hawkings et al., (2014) pero no

se pasa a la segunda fase (116). La primera fase o de “iniciación” está caracterizada por un cambio del metabolismo de fosforilación

oxidativa a glicólisis, reactivación de la actividad telomerasa y la transición mesenquimal/epitelial con la adquisición de polaridad en

la célula, y expresión de la molécula de adhesión E-caderina entre otras. En porcino el cambio en la morfología a colonias “stem like”

antes mencionado se logra, pero la maduración de las colonias no. La fase de maduración ha sido descripta como el cuello de botella

de los procesos de reprogramación y la responsable de la baja eficiencia general del establecimiento de colonias totalmente

reprogramadas. Durante la maduración ocurren los cambios epigenéticos que inducen la activación de los genes endógenos de

A B C


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152

pluripotencia. También es la fase en la que los efectos del medio de cultivo son más pronunciados, siendo necesaria la estimulación

adecuada de los genes activados. Si bien en trabajos anteriores en este laboratorio se demostró la activación endógena de OCT4,

SOX2 y NANOG, no se ha podido establecer si sus niveles de expresión son los adecuados para pasar de esta fase a la fase de

estabilización. La dependencia de los factores exógenos da a suponer que no lo es y por tanto se deben buscar alternativas que

incrementen esta expresión.

En este punto cabe remarcar que las diferencias entre las especies son notables, mientras que en ratón y humano es

suficiente la expresión exógena de los factores OKSM para inducir la expresión endógena y mantener la red de pluripotencia

estabilizada en condiciones de cultivo naïve o primed respectivamente, para los animales de granja estas mismas condiciones no

alcanzan. La utilización de LIF/BMP4 o FGF/Activina no tienen el mismo efecto resultante en estas especies. Esto establece un

interrogante fundamental: ¿existen otros factores/citoquinas que favorezcan a la pluripotencia en animales ungulados y por ende otros

mecanismos de señalización o es que estos mecanismos ya conocidos no tienen el mismo efecto porque de alguna manera un efecto

antagónico también existente en estas condiciones contrarresta el estado metasetable de la célula hacia la pluripotencia? ¿Este efecto

antagónico está relacionado con la falta de estimulación de los genes de pluripotencia en el mismo nivel de expresión que en ratón o

el humano, o se relaciona con la estimulación de genes de diferenciación? Revisando los mecanismos que mantienen el estado

pluripotente (Figura 60) en ratón y humano se pueden estudiar los niveles de expresión de los mecanismos que se activan para tratar

de establecer el cuello de botella en la fase de maduración.

Figura 60: La red de señales que mantienen la pluripotencia naïve (A) y primed (B). Hawkins et al., (2014).

Probablemente alguno de los mecanismos señalados en la Figura 60 o bien no es activado en porcinos como lo es en ratón

y humano o siendo activado, los niveles logrados no son suficientes para estabilizar la red de pluripotencia OCT4/SOX2/NANOG y

por lo tanto se requiere estimular de alguna otra manera (funciones de ganancia).

En ESC de humanos, se ha demostrado que la actividad de PI3K/AKT mantiene la auto-replicación restringiendo los

mecanismos de diferenciación a través de la inhibición de RAF/MEK/ERK y Wnt. Es decir, que cuando la vía PI3K/AKT está

activada en niveles bajos, los efectores del mecanismo Wnt actúan en conjunto con Smad2,3 para promover la diferenciación (117).

Por lo tanto, PI3K/AKT sería como una especie de llave que regularía el efecto de Smad2,3 hacia la pluripotencia o diferenciación de


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153

acuerdo a su nivel de activación. Adicionalmente, se ha demostrado que cuando se utilizan 10 ng/ml de FGF en el medio stem, éste

no tiene efecto en MEK ni GSK3b por lo que el nivel de este factor de crecimiento no activaría la vía PI3K. En cambio, cuando se

utilizan 100 ng/ml activa PI3K/AKT y el efecto de FGF a esta concentración es similar a agregar IGF-1 o heregulina (activadores

directos de PI3K) (117). Queda claro con esto que las interacciones entre vías de señalización y más aún los niveles de activación de

los diferentes mecanismos juegan un rol importante que mueve la balanza de un estado a otro. En animales de granja no se conocen

las interacciones entre los mecanismos, tampoco se conoce el impacto en el mantenimiento de la pluripotencia de los mecanismos

Wnt y PI3K.

A diferencia del porcino, los intentos de reprogramación en bovinos no han logrado pasar la primera fase de la

reprogramación, es decir la iniciación. Los experimentos fueron llevados a cabo en paralelo cada vez entre ambas especies, por lo que

se descarta que sea un problema relacionado al protocolo de producción de partículas virales. La dificultad de no lograr la transición

mesenquimal/epitelial (MET) sugiere que hay factores en el medio de cultivo que desfavorecen a la misma. La hipoxia, el aumento de

KLF4 y SOX2 favorecen la producción de E caderina y con ello la transición MET. La MET también se ve favorecida por la

inhibición de TGFb en la fase de iniciación tanto en ratón como en humano. La combinación de inhibidores de TGFβ y MEK

también promueven la MET en la fase de iniciación. Algunos autores sostienen que FGF es fundamental al inicio de la

reprogramación, pero ejerce efectos adversos en etapas tardías. Por todo lo mencionado anteriormente se procedió a testear el efecto

de algunos de estos compuestos para ver si los fibroblastos bovinos logran la primera etapa de reprogramación utilizando el vector

STEMCCA.

5.3. Reprogramación con STEMCCA y medio SB43

5.3.1. Reprogramación de PEF

Establecimiento de colonias y pasajes

Los fibroblastos porcinos presentaron cambios en la morfología correspondiente a la transición mesenquimal epitelial a los

9 días a partir de la primera transducción (día 5 en geltrex) tanto a 10.000 como 20.000 células (Figura 61 y Figura 62).

Figura 61: Colonias porcinas emergiendo en well de placa de 6 con geltrex a los 5 días después del seeding (20.000 células) y en medio SB43. Imágenes tomadas con objetivo 5x de microscopio invertido.


2

154

Figura 62: Colonias obtenidas en placa de 10.000 células PEF a los días 5, 6 y 7 cultivadas en geltrex con medio SB43 (objetivo 5x).

Figura 63: Colonia emergente p-iPSC-like de día 6 objetivo 5X (izquierda) y 10x (derecha).

Las colonias emergentes en este medio se caracterizan por ser homogéneas, presentando bordes definidos y relación

núcleo:citoplasma elevada, típica de la morfología de células madre. A su costado en las imágenes se puede observar los fibroblastos

porcinos no reprogramados que siguen creciendo, pero a menor tasa de proliferación que las colonias (Figura 63). Es importante

mencionar aquí que la homogeneidad que confiere este medio en particular es favorable al momento de seleccionar las colonias para

su expansión. En intentos anteriores de reprogramación en los que se ha usado el mismo vector policistrónico STEMCCA, pero en

medio convencional (FGF+ KSR+ MEF) el entrenamiento para seleccionar colonias viables para su expansión es un paso crucial, ya

que muchas de ellas presentan signos de diferenciación en los bordes de la colonia o inclusive con el paso del tiempo en el interior de

la misma (Figura 54).

Las colonias en crecimiento se empezaron a expandir a partir del día 11 (tomando el día cero como el momento de la

primera transducción). Se utilizó el método manual (con aguja) y enzimático (con tryple). Las colonias se plaquearon tanto en geltrex

como en placa con gelatina al 0.1% y MEF inactivadas mitóticamente con mitomicina (m-MEF). Las células pasadas en forma

manual (método generalizado en todas las especies distintas al ratón) se adhirieron al sustrato geltrex, pero no crecieron, mientras que

las células pasadas a m-MEF sí pudieron crecer y expandirse en forma indiferenciada, aunque más aplanadas y con colonias con

bordes menos definidos (Figura 64).


2

155

Figura 64: Colonias p-iPSC-like en pasaje 1 (método manual). Las imágenes de la colonia adherida a geltrex 2d después del pasaje (A) y 11 días después (B) demuestran que no crecieron sobre este sustrato. Imágenes tomadas con objetivo de magnificación 5X. Colonia en crecimiento sobre m-MEF (C y D). Imágenes tomadas con objetivo de magnificación 10X.

El primer pasaje de las colonias que se expandieron en forma enzimática se realizó de diferentes maneras:

I: Se pasó un well entero a una razón de 1 a 4 a un nuevo well con geltrex.

II: Se pasaron 2-3 colonias disgregadas completamente a una placa de 4 wells con mMEF (todas al mismo well).

III: Se pasaron varias colonias disgregadas en forma parcial a una placa de 4 wells con mMEF (una colonia por cada

well).

IV: Se pasaron varias colonias disgregadas completamente a una placa de 4 wells con mMEF (una colonia por cada

well).

Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 65. En la imagen I-A se observan las colonias del well de 20.000 células

PEF en reprogramación a los 11 días en cultivo, este well se trató con tryple y las células se pasaron a razón de ¼ a un nuevo well con

geltrex. Las células pasadas (imagen I-B) se adhirieron y crecieron, pero no se volvió a detectar la morfología de células madre, es

decir la forma de colonias, probablemente porque los fibroblastos no reprogramados crecieron a mayor velocidad que las células de

las colonias. Beer et al., (2012) señala que la sobrepoblación de un well con fibroblastos generalmente inhibe el surgimiento de

células con morfología stem y más aún, de las colonias totalmente reprogramadas.

C

B

A

D


2

156

Figura 65:p-IPSC like en pasaje 1, enzimático, sobre placa con geltrex (I-B) o m-MEF (II a IV- B). Fotos tomadas con objetivo de magnificación 5x.

Las colonias que se seleccionaron para pasar en grupo (Figura 65 II-A) se levantaron con aguja y se pasaron con pipeta a

un well de placa de 4 wells con tryple, tratando de pasar el mínimo volumen de medio (ya que la BSA inhibe la enzima) y pipeteando

antes y después de la incubación en estufa hasta disgregar casi completamente las colonias. Luego de 3 días en cultivo en medio con

inhibidor de Rock las células crecieron con morfología de colonias (Figura 65 II-B), a diferencia del pasaje del well completo en

reprogramación en donde PEF no reprogramadas y en reprogramación se pasaron simultáneamente para su expansión (Figura 65 I-B).

Las células se criopreservaron como pool de colonias en pasaje 1 ya que no fueron expandidas de forma clonal. El pasaje de colonias

individuales se realizó disgregando en forma parcial (Figura 65 III-A) o completa (Figura 65 IV-A) cada colonia y cultivando las

células en 4 wells con m-MEF. Las colonias disgregadas parcialmente llegaron a confluencia de pasaje más temprano que las

disgregadas completamente (2 días versus 5 días, Figura 65 III-B). Las colonias disgregadas hasta nivel unicelular crecieron y se

expandieron con mayor eficiencia (más colonias por cada colonia disgregada, Figura 65 IV-B). Se aislaron y expandieron nueve

colonias (denominadas por letras de la “A” a la “I”) que se criopreservaron en diferentes pasajes. Los pasajes siguientes se realizaron

todos con tryple disgregando el well completo con iPSC y m-MEF, comenzando con un radio de expansión de 1/3 (pasaje 2) y

extendiendo a ¼ en el pasaje 5. Como las m-MEF están inhibidas mitóticamente se van perdiendo con cada pasaje y no interfieren en

el crecimiento de las p-iPSC como los hacen las PEF sin reprogramar en el pasaje 1. Se tomaron muestras para RNA, para detección

del casete STEMCCA insertado en el ADN genómico y muestras para análisis por inmufluorescencia.

Finalmente se monitoreó la conservación de la morfología stem durante los sucesivos pasajes. En la Figura 66 se observa

el crecimiento de las colonias provenientes del pasaje clonal de iPSC-C en día 2 y 4 en cultivo con medio SB43, pasaje 4. Asimismo,

se muestra una imagen de la colonia J en pasaje 12 (Figura 67).

I-A

I-B

II-A

II-B III-B

III-A IV-A

IV-B


2

157

Figura 66: Colonias semejantes a p-iPSC-C pasaje 4 sobre m-MEF. A: 2d P4 (aumento 10x); B: 4d P4 (aumento 10x); C: 4d P4 (aumento 20x)

Figura 67: Colonias semejantes a p-iPSC-J 2d P12 sobre m-MEF

Caracterización de colonias

Detección del casete h-STEMCCA en colonias p-IPSC like

Existen diferentes métodos de reprogramación celular. En nuestro laboratorio se utiliza de rutina partículas lentivirales,

que contienen un casete de expresión denominado h-STEMCCA. Este casete se inserta en el genoma de la célula huésped de manera

aleatoria y codifica los 4 genes de reprogramación de Yamanaka en un solo transcripto, lo que permite una alta eficiencia de

reprogramación, y disminuye la frecuencia de eventos de reprogramación parciales. Para detectar la inserción genómica de este casete

de expresión se utilizó un juego de primers que detecta la zona intergénica de este constructo. Esta secuencia no se encuentra en los

genomas de los fibroblastos parentales transducidos. En la Figura 68 se muestra el fragmento de 560 pb amplificado por PCR que

demuestra la inserción viral en el genoma huésped y la ausencia del mismo en los fibroblastos parentales no transducidos. Asimismo,

se realizó la detección de GAPDH para comprobar la presencia de gDNA en las muestras extraídas.


2

158

Figura 68: Detección de la inserción de STEMCCA en gDNA. A: Los productos de PCR se visualizaron mediante la electroforesis en gel de agarosa 1 %. De izquierda a derecha: Marcador de PM 1kb (M), control positivo (C+): productos de la PCR de vector h-STEMCCA, control negativo (C-): de gDNA de PEF, muestra: de gDNA de colonia J semejantes a iPSC porcinas en pasaje 5. B: Gel de agarosa 1% para detección de GAPDH, de izquierda a derecha se muestran: M 1kb (5µl), control positivo (productos de la PCR de c-DNA de muestra conocida), control negativo: de agua, muestra: de gDNA de colonia semejante a p-iPSC J P5.

Inmunofluorescencia de genes de pluripotencia

Para caracterizar las colonias generadas y estudiar si son iPSC genuinas, se debe evaluar las dos propiedades

fundamentales de las células madre pluripotentes: auto-renovación y pluripotencia. La primera implica que las células puedan

mantenerse en cultivo a lo largo de sucesivos pasajes conservando su morfología típica y expresando marcadores específicos del

estado indiferenciado. Por otra parte, la pluripotencia se analiza estudiando su capacidad de diferenciación por la que son capaces de

generar células derivadas de las tres capas germinales (mesodermo, ectodermo y endodermo). Esta propiedad se evalúa tanto in vitro,

mediante protocolos de diferenciación no dirigidos, como in vivo, mediante la formación de teratomas en ratones inmunosuprimidos.

Luego de amplificar las colonias, se comenzó su caracterización analizando la expresión de marcadores específicos del

estado indiferenciado utilizando distintas técnicas. Se observó por inmunofluorescencia la presencia de SOX2 y NANOG. SOX2 está

presente en el casete de reprogramación STEMCCA mientras que NANOG es de importancia para detectar la activación endógena de

la red de pluripotencia. En la Figura 69 se muestran dos colonias derivadas del clon iPSC-J en pasaje 2, tanto la marca nuclear

(DAPI) como la expresión de NANOG (verde) y SOX2 (rojo). Asimismo, se visualiza la co-localización nuclear de las proteínas

marcadoras del estado pluripotente. Las células de m-MEF tienen núcleos más grandes que las iPSC y como se espera para células

diferenciadas, no se observa expresión de los genes de pluripotencia SOX2 y NANOG. La Figura 70 muestra la presencia de

NANOG de otro clon (iPSC-C) de los nueve aislados y expandidos lo que demuestra la robustez del método de reprogramación.

Escalera C+ C- IPSC-JP5

A

B

500 bp

M C+ C- IPSC-J P5


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159

DAPI NANOG SOX2

Figura 69: Caracterización de colonias semejantes a iPSC de porcino. Inmunofluorescencia de NANOG (verde) y SOX2 (rojo). Los núcleos fueron detectados por la unión del DAPI (azul) a la cromatina. Muestra: colonia J semejante a p-iPSC P2 (aumento 100x).

DAPI NANOG CO-LOCALIZACIÓN

Figura 70: Caracterización de colonias semejantes a iPSC de porcino. Inmunofluorescencia de NANOG (verde). Los núcleos fueron detectados por la unión del DAPI (azul) a la cromatina. Se muestra también la co-localización entre el anticuerpo de NANOG y DAPI. Muestra: colonia de iPSC-C P2 (aumento 40x y 100x, panel superior e inferior respectivamente).


2

160

Es importante destacar que en las células adultas de las que se partió para efectuar la reprogramación, no se detectó

expresión de estos genes (Figura 71), por lo que se confirma que la expresión de estos marcadores surgió como consecuencia del

proceso de reprogramación.

DAPI NANOG SOX2

Figura 71: Caracterización de los fibroblastos porcinos parentales (PEF P2). Detección por inmunofluorescencia de NANOG y SOX2 (aumento 40x).

Inmunofluorescencia de marcadores de membrana

Las proteínas de membrana que se utilizan para marcar el estado indiferenciado son diferentes según la especie utilizada

en la reprogramación. SSEA-1 es un antígeno de superficie específico del estado indiferenciado en células de ratón, mientras que

SSEA-4 lo es en células humanas. TRA-1-81 también es utilizado en h-ESC, células de carcinoma embrionario (h-EC) y células

germinales (h-EG) humanas.

DAPI SSEA-1 MERGE

Figura 72: Caracterización de colonias semejantes a iPSC de porcino. Localización en la membrana del anticuerpo de SSEA-1, rodeando a la marca nuclear del DAPI. Imágenes tomadas en microscopio de epifluorescencia. Muestra: colonia p-iPSC-C P4 (aumento de objetivo 100x).


2

161

DAPI SSEA-4

Figura 73: Caracterización de colonias pluripotentes inducidas de porcino. Localización en la membrana del anticuerpo de SSEA-4, rodeando a la marca nuclear del DAPI. Imágenes tomadas en microscopio de epifluorescencia. Muestra: colonia p-iPSC-J P5 (aumento de objetivo 20 x y 100x, en panel superior e inferior respectivamente).

Las células de porcino reprogramadas analizadas por inmunofluorescencia demuestran la expresión de marcadores de

ratón y humano, es decir SSEA-1; SSEA-4 y TRA-1-81. En la Figura 72, se muestra la expresión de SSEA1. En la Figura 73 y Figura

74 se observa claramente la presencia de SSEA4 y TRA-1-81 en células pertenecientes a la colonia iPSC-J en pasaje 5 y 2

respectivamente, mientras que la célula de m-MEF la marca es inexistente.

DAPI TRA-1-81 MERGE

Figura 74: Caracterización de colonias pluripotentes inducidas de porcino. Localización en la membrana del anticuerpo anti TRA-1-81. Imágenes tomadas del microscopio de fluorescencia. Muestra: colonia iPSC-J P2 (aumento 100x).


2

162

En la Figura 75 se muestra la ausencia de las proteínas de membrana en los fibroblastos parentales usados para la

reprogramación. Esto indica que las proteínas expresadas en las iPSC han sido activadas durante el proceso de reconversión de

células adultas diferenciadas a células madre indiferenciadas.

DAPI TRA-1-81

DAPI SSEA-4

Figura 75: Caracterización de fibroblastos fetales porcinos. Localización en la membrana del anticuerpo anti TRA-1-81 (arriba) y SSEA-4 (abajo). Imágenes tomadas del microscopio de fluorescencia. Muestra: PEF5 P2 (aumento 40x).

Fosfatasa alcalina

La fosfatasa alcalina es una enzima cuya actividad se encuentra presente en células del tipo pluripotente y es comúnmente

utilizada como marcador de pluripotencia. Los resultados presentados en la Figura 76 muestran la variabilidad en la expresión de esta

enzima en las diferentes células cultivadas en medio SB43 y sobre m-MEF. Se pueden observar colonias con una alta actividad y

otros con escasa o nula, las m-MEF se observan claramente negativas. Las células iPSC porcinas obtenidas anteriormente en medio

FGF + KSR + m-MEF fueron positivas, pero llamativamente de una coloración más intensa (Figura 58). Por otro lado Lin et al.,

(2009) que utilizan el medio SB43 para optimizar el proceso de expansión de células iPSC humanas, demostraron que las células

reprogramadas humanas tienen una alta actividad de AP (112).

Figura 76: Fosfatasa Alcalina. Colonias semejantes a p-iPSC-J P4 y P5 en medio SB43 (izquierda y derecha respectivamente)


2

163

Expresión de genes de pluripotencia y control de inhibición del mecanismo TGFβ

SB431542 es un inhibidor del receptor de TGFβ tipo I llamado ALK5 y también de ALK4 y 7. Su empleo en el protocolo

de reprogramación se basa en su capacidad de reprimir la transición epitelial a mesenquimal, una de las características principales en

los procesos de diferenciación, desde el punto de vista morfológico. Con ello se consigue facilitar la primera etapa de la

reprogramación denominada iniciación (ver Sección 5.2 Capítulo de Introducción General, página 52). Un estudio en reprogramación

humana demuestra que el uso de SB431542 junto con PD0325901 aumenta en 100x la eficiencia de generación de h-iPSC (112). En

nuestra experiencia con PEF y BEF se lograron colonias con morfología más homogénea, y finalmente se consiguieron colonias con

morfología de células pluripotentes inducidas en bovinos, después de muchos intentos en los que ni si quiera se había podido ver los

primeros cambios de morfología. Nodal es un ligando de la super familia de TGFβ que se une a los receptores ALK4 y ALK7

desencadenando los procesos de activación de la vía TGF. En el desarrollo embrionario nodal es el responsable de los procesos de

diferenciación meso-endodermal, la determinación del eje dorso-ventral y el establecimiento de los patrones del sistema nervioso

central. Su unión con los receptores TGFβ produce la fosforilación de Smad2 que se une con Smad4 y transloca al núcleo para

interactuar con los factores de transcripción FoxH1, p53 y Mixer. Esto conlleva a la inducción de genes tales como Nodal (en un

feedback loop positivo), Lefty y el antagonista de nodal Cerberus entre otros (118). Mediante el análisis de expresión por RT-PCR se

verificó la acción del inhibidor SB43. En la Figura 77 se muestra la presencia de nodal en PEF de pasaje 2 y la inhibición progresiva

de nodal en las iPSC de porcinos en pasaje 2 y 4.

Nodal

100 bpladder

PEFpiPSP2 SB43

piPSP4SB43

C- C+


2

164

Figura 77: Detección de nodal en células PEF5 P2 y colonias semejantes a iPSC porcinas en P2 y P4; detección de genes relacionados a la pluripotencia (Klf4, Nanog y Oct4) en colonias de iPSC porcinas en pasajes 3 y 5. El control positivo corresponde a un pool de embriones y el negativo al agua. Gel de agarosa de 2%.

Asimismo, para verificar la activación de la expresión de los genes de pluripotencia, detectamos los transcriptos por RT-

PCR de Nanog, Oct4 (Oct3/4) y Klf4. Se analizó el transcripto de Gapdh como control (housekeeping gene).

Hasta aquí se demostró que las líneas obtenidas son capaces de proliferar preservando un estado en el que expresan

marcadores propios de células pluripotentes indiferenciadas. Sin embargo, para concluir que se trata de iPSC, se debe evaluar su

capacidad de originar células de los tres linajes, es decir, se debe evaluar si son pluripotentes. Para esto es necesario llevar a cabo

protocolos de diferenciación in vitro mediante la formación de cuerpos embrioides (CE) que al adherirlos se diferencien a tipos

celulares derivados de las tres capas germinales por tratarse de un protocolo no dirigido. Finalmente, la formación de teratomas al

inyectar estas células en un ratón inmunosuprimido se utiliza para verificar su capacidad de diferenciación in vivo.

Gapdh

100 bpladder

C+ piPSP5 SB43

piPSP3SB43

C-

Klf4

Nanog Oct3/4

100 bpladder

C+ piPSP5 SB43

piPSP3SB43

100 bpladder

C+ piPSP5 SB43

piPSP3SB43

C+ piPSP5 SB43

piPSP3SB43

C-

C- C-


2

165

Detección de la expresión del casete STEMCCA en pasajes tardíos

Se llevó a cabo la detección de la expresión de los genes introducidos con el vector STEMCCA en células iPSC porcinas

de pasaje 3, 5 y 12. En la Figura 78 se muestra el gel de agarosa de 1 % con los amplicones correspondientes al gen Sox2, diseñado de

manera tal de amplificar una región no conservada del gen que diferencie el Sox2 humano (del STEMCCA) con el Sox2 endógeno.

El amplicón de 500 bp se observa en las muestras de cDNA de piPSC P3 y P5 y no en la muestra de sus fibroblastos parentales

(control negativo de la presencia del vector), a su vez se muestra el control negativo de la reacción de PCR. Luego de sucesivos

pasajes se volvió a estudiar la expresión de Exo-Sox2 y se halló la presencia del mismo amplicón en células de pasaje 12, lo cual es

indicativo de que el silenciamiento del vector aún no se ha producido.

Figura 78: Detección de expresión de STEMCCA en c-DNA de p-iPSC P3 y P5. Las muestras se retro transcribieron y amplificaron por RT-PCR y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 %. La banda que indica la expresión de los factores exógenos corresponde a una región del gen h-SOX2 (500 bp), también se muestran los amplicones de GAPDH que demuestran la presencia de c-DNA en las muestras.

Los estudios que utilizan como herramienta vectores de reprogramación con promotores inducibles por doxiciclina para

estudiar las diferentes fases de la misma en células MEF, han demostrado que la expresión continua de los factores exógenos impide

la sobre-expresión endógena de los genes relacionados a la pluripotencia de la fase de estabilización (ver sección 5.2 en la

Introducción general) en la parte final de la fase de maduración. Lo que indica que el silenciamiento de los genes OKSM es un

requisito para pasar de la fase de maduración a la de estabilización y convertir a las iPSC-like en células totalmente reprogramadas

(119). En la actualidad se desconocen las razones por las que los genes OSKM no se silencian en la mayoría de las células iPSC-like

de animales de granja. Algunos estudios postulan que no se establece la red de pluripotencia debido a que las condiciones de cultivo,

y más específicamente los medios de cultivo utilizados en la reprogramación no sostienen los niveles endógenos de los genes de

pluripotencia. En nuestro estudio, Nanog es un gen que no se expresa en las PEF, pero cuya expresión comienza y se detecta luego de

la generación de iPSC. Aunque esta expresión indicaría que se ha iniciado con la fase de maduración la detección de mRNA del

casete STEMCCA indica que no se ha completado, y por tanto las células obtenidas hasta el momento no pueden considerarse

totalmente reprogramadas. En el futuro, se propone analizar otros marcadores de la fase de estabilización cuya expresión debe

aumentar al final de la fase de maduración para producir la transición final. Modularemos diferentes vías para lograr detectar cambios

en los perfiles de expresión de dichos genes (Lin28, Pecam, Sox2, etc).

GAPDH

100 bpladder

PEF7 piPSP5 SB43

piPSP3SB43

C-

Exo-Sox2

PEF7 piPSP5 SB43

piPSP3SB43

C-


2

166

Debido a que las células conseguidas no silencian los genes OKSM del vector STEMCCA se decidió no terminar su

caracterización, la cual comprendía analizar la capacidad pluripotente en ensayos de diferenciación in vitro e in vivo. Muchos autores

han publicado células parcialmente reprogramadas con capacidad de diferenciarse a cuerpos embrioides o teratomas, tanto en porcino

como en bovino (ver Sección 5.1 del Capítulo de Introducción General, página 49), generalmente utilizan pasajes tempranos para

dichos análisis en los que se ha activado la red de pluripotencia y por ende su capacidad de diferenciarse y en donde en ocasiones aún

con la expresión de los genes exógenos se consigue obtener células de los distintos linajes o al menos la presencia de sus marcadores.

Lo que no se analiza en esos estudios es si realmente esas células diferenciadas son funcionales, es decir que no se ha publicado hasta

el momento evidencias de que dichas células aún con niveles de expresión de OKSM puedan contribuir a la formación de embriones

viables.

5.3.2. Reprogramación de BEF

Establecimiento y pasajes

Las células BEF que fueron transducidas dos veces con partículas lentivirales no fueron capaces de desarrollar colonias

iPSC como lo hicieron los PEF en medio SB43. En varios intentos, las células llegaron a confluencia del 100 % antes de que se

desarrollasen las colonias. No queda claro si la incapacidad de reprogramarse se debe a la insuficiente expresión de las proteínas del

vector STEMCCA (quizás por una diferencia en la tasa de transducción entre fibroblastos porcinos y bovinos, a igualdad de MOI) o

al sobre crecimiento de los fibroblastos que, como se mencionó antes, no favorecen al surgimiento de las colonias. En un último

experimento de reprogramación, se testeó la capacidad de las BEF de reprogramarse después de haber sido transducidas 5 veces con

STEMCCA y EOS y plaqueando a densidades de 2500 células y 5000 células sobre MW6 con geltrex (Figura 79 y Figura 80).

Figura 79: Colonias semejantes a iPSC bovinas emergiendo en placa MW6 con2500 BEF plaqueadas sobre geltrex


2

167

Figura 80: Colonia con morfología semejante a stem, iPSC-1 derivada de BEF5 P5 en placa de 5000 células sobre geltrex. (aumento 5x)

Las Figura 79 y Figura 80 muestran algunas colonias que se formaron en las placas de 2500 y 5000 BEF entre los 18-20

días desde la infección 1 (14-16 días desde la tercera infección). Es notorio que a diferencia de las PEF en donde el número de

colonias alcanzó entre los 50-240 por MW6, las BEF dieron lugar a un número mucho menor de colonias (aun teniendo en cuenta la

diferencia en la densidad inicial: 10.000 versus 2500/5000). Lo claro es que en el caso de las BEF en reprogramación hubo más

colonias a 2500 células iniciales que a 5000.

Figura 81: Colonia 8 semejante a iPSC bovina antes (panel superior) y después (panel inferior) del pasaje 1. La colonia se formó al borde de la placa MW6 de 2500 BEF.


2

168

En la Figura 81 se muestra la colonia semejante a iPSC-8 que por su gran tamaño usualmente no clasificaría como apta

para expandir (se muestra en comparación con la colonia iPSC-3). Al observarla en aumento 5x y 10x del objetivo se puede apreciar

que se trata de una colonia homogénea, de borde definido y claramente diferente a los BEF no reprogramados. Por su inusual tamaño

se dividió en 4 partes, se disgregó parcialmente con tryple y se centrifugó a 200 – 400 g por 5 minutos. El pellet formado se

resuspendió con 500 µl de medio SB43 y se plaqueó sobre m-MEF en MW6. Al día siguiente se visualizaron pequeños cúmulos de

células en crecimiento y dos días después se observó el crecimiento de las mismas. Esta y otras colonias de b-iPSC se criopreservaron

para su posterior caracterización.

Se debe señalar aquí que debido a la incapacidad de poder trasladar las colonias obtenidas en último momento en UK se

decidió, repetir el protocolo de generación de iPSC en la Universidad de Buenos Aires para completar el análisis. En la actualidad y

después de haber llevado a cabo 3 intentos fallidos de reprogramación, nos enfocamos en detectar las causas de la dificultad para

emular los resultados. Los experimentos se realizaron en el Laboratorio de Regulación de la expresión Génica de Células Madre con

el apoyo de Camila Vazquez Echegaray. Con Camila no hemos logrado obtener el mismo título de partículas lentivirales necesario

para los procesos de reprogramación. Actualmente estamos evaluando las alternativas para producir estas partículas con alta

eficiencia.


2

169

6. CONCLUSIONES

En el segundo capítulo se evaluaron diferentes metodologías para la generación de iPSC bovinas, tanto aquellas en la que

los factores de reprogramación OKSM se introducen en la célula en forma transitoria (episomas) como las que se insertan al azar en

el genoma (partículas lentivirales). Se realizó en paralelo la reprogramación de PEF, células de fibroblastos porcinos, utilizadas en

primera instancia como control del protocolo de reprogramación. Se establecieron previo al cultivo a reprogramar, las condiciones

óptimas en los procesos de transfección de episomas y de generación de partículas lentivirales (testeando diferentes densidades

celulares, relación de agente de transfección:DNA, DNA total, etc). Se puso a punto por primera vez el protocolo de concentración de

partículas lentivirales en ambos laboratorios en los que se trabajó en reprogramación (Laboratorio de la Regulación de la Expresión

Génica en células madre de la FCEN-UBA y Laboratorio de Epigenética del desarrollo de la Universidad de Nottingham). Se trabajó

con diferentes medios de reprogramación, el convencional FGF+KSR, el medio E8 para cultivo de células en condiciones feeder and

serum free y el medio SB43. Se caracterizaron las células obtenidas por inmunofluorescencia de marcadores de pluripotencia

nucleares y de membrana, por RT-PCR, análisis de actividad AP, detección de la inserción de STEMCCA en el genoma por PCR y

análisis de expresión de los factores exógenos por RT-PCR.

Los resultados obtenidos en los experimentos con episomas ponen en evidencia una vez más la complejidad de los

procesos de reprogramación en la especie porcina y bovina. Los protocolos de transfección de episomas publicados hasta el momento

son aquellos optimizados para especies como ratón y humano, faltando estudios previos de optimización en otras especies. La

eficiencia obtenida aún con fibroblastos fetales en estas especies está muy por debajo de la deseada para alcanzar niveles de expresión

suficientes de los factores OKSM en los procesos de reprogramación. Esto se evidencia porque para una misma especie como el

porcino, lograr iPSC con episomas utilizando los mismos medios de cultivo fue infructuoso, no así con las partículas lentivirales, aún

haciendo uso del medio convencional.

Entre las dos especies con las que se trabajó, la porcina tiene mayor facilidad para formar colonias reprogramadas que la

bovina. Los protocolos usados en otras especies son de traslación directa en porcinos y con buenos resultados a corto plazo,

requiriendo poca experiencia previa para llevarlos a cabo. En el caso de los bovinos se requirió testear condiciones adicionales que

implicaron modificar detalles del protocolo para ajustar los mismos a la cinética de crecimiento de fibroblastos bovinos, a la

diferencia con que estos se transducen a una misma MOI con respecto a otras especies. Sin embargo, para ambas especies, establecer

el cultivo en forma estable, sin que las células varíen sus características sigue siendo un desafío. El cuello de botella en los procesos

de establecimiento de iPSC bovinas y porcinas sigue siendo establecer las condiciones de cultivo que favorezcan la expresión de los

genes endógenos de la red de pluripotencia e inactiven los exógenos utilizados en los protocolos de partículas lentivirales. Las células

totalmente reprogramadas aún suenan a utopía en estas especies, por lo que se aconseja seguir haciendo énfasis en los mecanismos

moleculares de establecimiento de pluripotencia y diferenciación.


2

170

7. PERSPECTIVAS

Este trabajo cuenta con el financiamiento del PICT Raíces 1727-2013. La Lic. Camila Vázquez Echegaray con beca de

ANPCyT asignada por dicho PICT proseguirá con los estudios que se derivan de este capítulo en el Laboratorio de la Regulación de

la Expresión Génica de células madre en el marco de su doctorado. La dirección es llevada a cabo actualmente por la Dra. Alejandra

Guberman, quien ha colaborado de forma activa y comprometida con la realización de esta tesis. Para el futuro se planea:

• Generar células iPSC bovinas y porcinas haciendo uso de partículas lentivirales que inserten el casete

STEMCCA, pero que la expresión de factores sea inducible por doxiciclina. Estas células servirán de

herramienta para evaluar diferentes vías de señalización que contribuyan a la expresión de genes de

pluripotencia y a proteínas específicas de las diferentes etapas de reprogramación.

• Solo en caso de lograr la inactivación de los genes exógenos OKSM y la reactivación de los endógenos, se

procederá a caracterizar la capacidad de las células de diferenciarse en los distintos linajes embrionarios

(endodermo, mesodermo y ectodermo) con protocolos de diferenciación in vitro (cuerpos embrioides) e in

vivo (teratomas).

• Utilizar los conocimientos que serán derivados de las perspectivas del primer capítulo para establecer

condiciones de mantenimiento de pluripotencia.

• Creemos que es necesario entender el proceso de reprogramación de estas especies en etapas, porque es muy

probable que las distintas etapas requieren distintas condiciones de cultivo para lograr en definitiva

establecer un protocolo exitoso de reprogramación.

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Anexo

171

ANEXO

1. PUESTA A PUNTO DE RT-qPCR

En la puesta a punto del análisis de expresión génica se utilizaron embriones obtenidos in vivo, vitrificados por OPS (Open

Pulled Straw), calentados y cultivados en medio SOF y MC-BGC. Para el calentamiento se siguió el protocolo descrito por Trigal et.,

(2012) (120). Brevemente:

• Las pajuelas se transportan en N2líquido. Al momento de uso, se toma la pajuela con pinza, se agita para sacar

el nitrógeno líquido, y se sumerge en la solución de calentamiento 1 colocada en placa p35 donde se buscan

los embriones.

• Se incuban los embriones 5 min en una gota solución de calentamiento 1: HSOF/PVA al 1% con 20% de SFB

y 0.25M de sacarosa.

• Luego se transfieren por otros 5 min más a una gota de solución de calentamiento 2:HSOF/PVA al 1% con

20% de SFB y 0.15M de sacarosa.

• Finalmente se lava en PBS y se incuba 24 h en medio SOF o MC-BGC en placa de 4 wells y en estufa a

37.5°C y 5 % CO2. Al inicio los embriones en estadio de mórula progresaron in vitro hasta formar

blastocistos.

Figura 82: Embriones bovinos (obtenidos in vivo y vitrificados) calentados y cultivados 24 h en medio SOF y MC-BGC.

Los blastocistos se colectaron en trizol y se conservaron a -80 °C hasta su análisis. La síntesis de c-DNA y qRT-PCR se

llevaron a cabo tal como se menciona en la sección Extracción de RNA, síntesis de c-DNA y qPCR de pooles de embriones (página

83).

Se llevó a cabo la detección de OCT4, SOX2 y NANOG:

SOF MC-BGC


172

Oct

4

Sox2

Nan

og

0

1

2

3

4

MC-BGC

Genes de pluripotencia

Exp

resió

n R

ela

tiva

Figura 83: Expresión Génica de blastocistos día 7 calentados y cultivados en MC-BGC versus control (SOF). n=2; N=12 por qRT-PCR

2. PUESTA A PUNTO DE ANTICUERPOS PARA IF

Para evaluar la idoneidad y performance de los anticuerpos Gata6 y Gata4 se analizaron cortes histológicos en parafina de

ovarios de fetos de cerdo de 31 y 70 días. Se procedió según el siguiente protocolo:

• Se lava el corte montado en portaobjetos sumergiendo el mismo en solución Histoclear (Marca Electron Microscopy

Sciences. Catálogo Número 6411001) durante 15 minutos a RT. Este lavado desparafina el tejido.

• Se rehidrata mediante sucesivos lavados de 10-15 minutos a RT con etanol al 100 %, 90% y 70%.

• Se coloca 10 min en solución de PBS (pH 7.4, importante para preservar las proteínas).

• Se prepara en el momento del uso una solución de 0.01M de buffer citrato pH 6 para recuperar la exposición de los

antígenos para ello se mezcla 9 ml de solución A con 41 ml de solución B y 450 ml de agua destilada, se ajusta el pH a 6

con NaOH:

- Solución A: 4.2 g de ácido cítrico en 200 ml de agua destilada.

- Solución B: 14.7 g de citrato de sodio en 500 ml de agua destilada.

• Se sumergen los portaobjetos en el buffer de citrato y se hierven en horno microondas a high level por 10 minutos (a los 2

minutos parar y observar que no se haya evaporado todo el buffer, agregar en la medida que se necesite para evitar que se

deshidrate).

• Se deja enfriar 20 minutos a RT.

• Se lava 3 veces con PBS durante 5 minutos cada lavado.

• Se marca la región de interés con lapicera de parafina, hidrofóbica, realizando círculos alrededor de cada sección.

• Se permeabiliza con solución de tritón x-100 al 1% preparado al momento del uso, durante 20 minutos (se calcula 1ml por

cada dos portaobjetos) en cámara húmeda.

• Se lava 3 veces con PBS durante 5 minutos cada lavado, en cámara húmeda.

• Se bloquea con solución de 5 % BSA en PBS a RT por 1 h 30 minutos en cámara húmeda (se agrega aproximadamente 30

µl por cada muestra).

• Se diluye los anticuerpos primarios en solución de bloqueo, se remueve la gota de bloqueo y se coloca 30 µl de solución

con anticuerpo en cada muestra. Se incuba toda la noche en cámara húmeda a 4 °C.


173

• Se lava 4 veces con PBST (1:1000 de tween 20) por 15 minutos cada lavado.

• Se diluye el anticuerpo secundario en solución de bloqueo y se incuba 40 minutos a RT en cámara húmeda, cubierto de la

luz.

• Se lava 4 veces con PBST (1:1000 de tween 20) por 15 minutos cada lavado.

• Se monta con reactivo de montaje Fluoroshield o similar, se coloca un cubreobjeto encima y se sella con barniz de uñas.

Se deja secar y finalmente se observa en microscopio o se guarda a 4 °C o -20 °C hasta su análisis.

31 días 70 días Control negativo

(sin anticuerpo primario)

GATA6

GATA4

Figura 84: Control positivo y negativo para anticuerpos Gata6 y Gata4. IHC de cortes histológicos de 31 días y 70 días de gónadas fetales de cerdo, Gata6 (verde) y Gata4 (rojo). También se muestran los controles negativos. Las imágenes fueron tomadas en microscopio de epifluorescencia con un objetivo de magnificación 100 x.

3. ALINEAMIENTO DE SECUENCIAS DE AMINOÁCIDOS DE LIF RATÓN, HUMANO Y BOVINO

Se analizaron los porcentajes de similaridad de las secuencias de aminoácidos de LIF en diferentes especies (primero el

análisis se llevó a cabo entre las tres secuencias en estudio: ratón, humano y bovino, luego de a dos: ratón/bovino y humano/bovino).

Se tomó una imagen de las secuencias formato FASTA analizadas, junto con la identificación de NCBI de las proteínas. Se tomaron

como referencias los precursores de LIF de cada especie (Figura 85), ya que también existen diferentes isoformas. Los alineamientos

se llevaron a cabo con la herramienta en línea clustal omega del siguiente sitio: http://www.uniprot.org/align/


174

Figura 85: Alineamientos de secuencias de aminoácidos de LIF para diferentes especies (ratón, humano y bovino respectivamente). Se presentan las secuencias FASTA analizadas, el alineamiento y el árbol filogenético en el que claramente se demuestra que las secuencias de humano y bovino pertenecen a la misma rama y que difiere de la de ratón.

El porcentaje de similaridad tomando en cuenta las tres proteínas es de 74.38%, mientras que el de ratón con bovino es de

77.34% y el de humano con bovino es de 89.60%. Por tanto, las secuencias de h-LIF y b-LIF se asemejan un 12.26% más que las de

m-LIF y b-LIF.


175

4. TRANSFECCIÓN DE FIBROBLASTOS BOVINOS CON EPISOMAS: PUESTA A PUNTO

Se puso a punto la transfección de fibroblastos fetales bovinos con agente de transfección Fugene de Promega y el vector GFP

episomal de Addgene (Catálogo número 27082). Las condiciones testeadas se resumen en la siguiente tabla:

Tabla 55: Condiciones de transfección de BEF

Condición 1 Condición 2 Condición 3

2.5 µg DNA 5 µl Fugene 600.000 densidad inicial por well

1µg DNA 8 µl Fugene 600.000 densidad inicial por well

0.625 µg DNA 5 µl Fugene 600.000 densidad inicial por well


4 µg DNA 8 µl Fugene 300.000 densidad inicial por well



Las células se plaquearon el día anterior en well de 6 cada condición por triplicado. La siguiente figura muestra las

imágenes capturadas en microscopio de fluorescencia a las 24 h y 48 h pos transfección. El porcentaje de células GFP positivas se

cuantificó por FACS.

24 h


600.0

00 cé

lulas

inicia

les po

r well


300.0

00 cé

lulas

inicia

les po

r well


176

48 h


600.0

00 cé

lulas

inicia

les po

r well


300.0

00 cé

lulas

inicia

les po

r well

Figura 86: BEF con GFP episomal a 24 y 48 h pos transfección. Imágenes tomadas con microscopio de fluorescencia.

13.3%

0.23 millones GFP +

17.2%

0.32 millones GFP +

7%

0.17 millones GFP +

26%

0.44 millones GFP +

23.2%

0.39 millones GFP +

7.8%

0.12 millones GFP +


177

5. REACTIVOS Y MEDIOS UTILIZADOS EN EL CAPÍTULO 1

5.1. Composición de medios utilizados en producción embrionaria (FAUBA)

5.1.1. Hialuronidasa

Se prepara un stock a 10X el que se alícuota y guarda a -20 °C; se lleva a 1X con TCM HEPES en el momento del uso.

1X: 1 mg/ml en TCM HEPES. 10X: 10 mg de hialuronidasa (hyaluronidase from bovine testes. Marca Sigma Aldrich. Catálogo

Número: H3884-100 mg) en 1 ml de TCM HEPES.

5.1.2. TALP-H

Tabla 56: Composición de TALPH, medio de mesada.

Componentes Concentración (mM) NaCl 114 KCl 3.20 MgCl2.6H2O 0.5 NaH2PO4 0.4 NaHCO3 2 Gentamicina 10 µg/ml HEPES 10 Glucosa 5 Piruvato de sodio 0.33 Rojo fenol 0.01 g CaCl22 H2O 2 Lactato de sodio 10 Agua ultra pura csp Volumen final 50 ml

Se mezclan los componentes y se filtra por membrana de 0.22 µm.

5.1.3. Medio de maduración

Tabla 57: Medio de maduración utilizado en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la FAUBA

Componentes Composición

TCM 199 (Gibco. Catálogo 31100-035) Base SFB (Internegocios) 10 % v/v FSH (Folltroping ® Bioniche) 10 µg/ml Piruvato de sodio (Sigma Aldrich. Catálogo P2256) 0.3 mmol/L Cisteamina (Sigma Aldrich. Catálogo M9768) 100 mmol/L Antibiótico y antimicótico (Gibco. Catálogo 15240-096) 2 % v/v

Se mezclan los componentes y se filtra por membrana de 0.22 µm. Se utiliza en el día o se almacena a 4 °C durante una semana.


178

5.1.4. Medio de fecundación

Tabla 58: Medio BO para fecundación in vitro (121)

Componentes Composición Cafeína 10 mM Heparina 10 µg/ml Glucosa 13.9 mM NaHCO3 37 mM CaCl22 H2O 2.25 mM NaCl 112 mM BSA Fraction V (solo para SWS) 5 mg/ml BSA FAF (solo para SDS) 6 mg/ml KCl 4.02 mM NaH2 PO4 H2O 0.83 mM MgSO4.7H2O 0.52 mM Piruvato de sodio 1.25 mM Fenol red 10 µg/ml Antibiótico (100x) 10 µl/ml


5.1.5. Medio de cultivo embrionario

El medio de cultivo empleado para los primeros 5 días fue el SOF citrato (fluido oviductal sintético) con 2.5 % de SFB. La

composición del SOF citrato se indica en la siguiente tabla, los reactivos empleados son marca Sigma Aldrich, al menos que se

especifique lo contrario:

Tabla 59: Composición medio SOF citrato para cultivo e embriones bovinos

Componentes Cantidad

NaCl 0.1258 g KCl 0.106 g KH2PO4 0.00324 g MgSO4.7H2O 0.00364 g NaHCO3 0.042 g Piruvato de sodio 0.0016 g BSA 0.06 g BME 0.6 ml MEM 0.2 ml Glutamina 0.001 g Hepes acid free 0.024 g Citrato de sodio tribase 0.002 g


179


Mioinositol 0.01 g Hepes sal de sodio 0.026 g CaCl22 H2O 0.00524 g Lactato de sodio (60% syrup) 6 µl Agua ultra pura c.s.p. Gentamicina (opcional) 0.001 g Volumen 20 ml


5.1.6. TCM HEPES (utilizado en la puesta a punto, ver anexo punto 1)

Se prepara de acuerdo a la siguiente tabla, se conserva a 4 ºC.

Tabla 60: Composición de medio de mesada, TCM HEPES


NaHCO3 0.021 g Penicilina 0.0065 g Hepes acid free 0.120 g Hepes Na 0.130 g Piruvato de sodio 0.00275 g Glutamina 0.005 g Agua pura 45 ml TCM 10X (Medio 199. Sigma Aldrich. Catálogo Número M5017-1L) 5 ml BSA 0.1 g Volumen 50 ml Osmolaridad 282 pH 7.4

5.1.7. H-SOF 1 % PVA (utilizado en la puesta a punto, ver anexo punto 1)

Tabla 61: Composición de HSOF como medio de mesada


NaCl 315 mg KCl 26.8 mg KH2PO4 2 mg NaHCO3 21 mg Penicilina 3.25 mg HEPES acid free 120 mg HEPES sal de sodio 130 mg Piruvato de sodio 2.75 mg


180


PVA 0.5 g CaCl22 H2O 12.6 mg Lactato de sodio (syrup 60 %) 23.5 µl Agua ultrapura csp Volumen final 50 l

5.2. Composición de medios utilizados en producción embrionaria (Nottingham)

5.2.1. Medio de lavado

• Medio M199 con 25 mM HEPES (Catálogo 22340-020 500 ml): 9 ml

• Suero Fetal Bovino (Marca PAA, inactivado por calor): 1ml

• Gentamicina (50 mg/ml): 10 µl

5.2.2. Medio de maduración

• Medio M199 (HEPES): 9 ml

• Suero Fetal Bovino (PAA, inactivado por calor): 1 ml

• EGF (10 µg/ml): 10 µl

• Pluset (5UI/ml): 20 µl

• Piruvato de sodio (100 mg/ml): 10 µl

• Cisteamina (11 mg/ml): 10 µl

• Glutamax (200 mM): 50 µl

• Gentamicina (50 mg/ml): 10 µl

Todos los reactivos se guardan alicuotados a -20 °C y se descongelan al momento del uso. Se mezclan los componentes y

se esteriliza con filtro de jeringa de 0.22 µm. Se equilibra en incubadora antes de su uso.

5.2.3. Medio de fecundación

Soluciones stock:

• CaCl2.H2O 78mg/ml: se pesan 1.560 g y se disuelven en 20 ml de agua estéril.

• MgCl2.6H2O 20 mg/ml: se pesan 400 mg y se disuelven en 20 ml de agua estéril.

• Na2HPO4.2H2O 9.4 mg/ml: se pesan 188 mg y se disuelven en 20 ml de agua estéril.

• Heparina 10 mg/ml: se pesan 200 mg y se disuelven en 20 ml de agua estéril.

• Epinefrina 1 mg/ml: se pesan 20 mg y se disuelven en 20 ml de agua estéril.

• Hipotaurina 1 mg/ml: se pesan 20 mg y se disuelven en 20 ml de agua estéril.

Filtrar por membrana de 0.22 µm y guardar a 4 °C. La epinefrina se guarda a -20 °C cubierta de la luz.


181

Tabla 62: Composición de soluciones para FIV

Medio de Fecundación Medio de lavado de ovocitos

Componentes 100 ml 250 ml NaCl 544 mg 1.70 g KCl 23 mg 110 mg Na2HPO4.2H2O 0.5 ml stock 1.225 ml stock MgCl2.6H2O 0.5 ml stock 1.25 ml stock NaHCO3 220 mg 42 mg HEPES No aplica 1.20 g Heparina 0.1 ml stock No aplica Epinefrina 0.1 ml stock No aplica Hipotaurina 0.05 ml stock No aplica Cafeína 27 mg No aplica Kanamicina 7.5 mg 18.5 mg Piruvato de sodio 100 mg 2.25 mg BSA 600 mg 1.50 g Lactato de sodio (60% syrup) 0.37 ml 0.465 ml CaCl2.2H2O 1.0 ml stock 1.0 ml stock

Los componentes del medio de cultivo son en su mayoría Marca Sigma Aldrich, a menos que se especifique lo contrario.

5.2.4. Medio de cultivo embrionario

Tabla 63: Composición medio de cultivo embrionario

c-SOF h-SOF

Componentes Cantidad Cantidad Agua ultrapura 100 ml 100 ml NaCl 629 mg 629 mg KCl 53.4 mg 53.4 mg KH2PO4 16.2 mg 16.2 mg MgSO4 18.2 mg 18.2 mg CaCl2.2H2O 26.2 mg 26.2 mg Lactato de sodio 60% syrup 75.7 µl 75.7 µl NaHCO3 210 mg 42 mg Piruvato de sodio 80 mg 80 mg L-glutamina 2.9 mg o 100 µl de solución 200mM 2.9 mg o 100 µl de solución 200mM Rojo fenol 1 mg o 200 µl de solución 5 mg/ml 1 mg o 200 µl de solución 5 mg/ml Citrato tribásico de sodio 10 mg 10 mg Myo inositol 49.9 mg No aplica BME 50x 2.25 ml No aplica MEM 100x 0.5 ml 0.5 ml


182

c-SOF h-SOF

Componentes Cantidad Cantidad HEPES No aplica 476.6 mg o 2 ml de solución 1M pH 7.4 7.4 Osmolaridad 270-280 mOsm 270-280 mOsm

Se mezclan los componentes y se esteriliza por membrana 0.22 µm. Se agrega la BSA 4 mg/ml o SFB al 10 % antes del

uso, se vuelve a esterilizar.

5.2.5. Medio de cultivo embrionario día 5 a 8

• Medio base: N2B27 preparado de acuerdo a lo detallado en la sección 4.1.4: Composición de medios

utilizados en producción embrionaria (FAUBA).

• N2B27 t2iGö: preparado de acuerdo a lo detallado en la sección 4.1.4: Composición de medios utilizados en

producción embrionaria (FAUBA).

• N2B27 h-LIF: se le agrega h-LIF: 20 ng/ml. LIF es el Factor inhibidor de leucemia (humano). Catálogo: 300-

05 (1 mg). Marca: Peprotech. Stock: 200 µg/ml, se reconstituye en 5 ml de PBS 0.1 % BSA. Se alícuota y

guarda a -80 °C.

• N2B27 t2iGö h-LIF: una combinación de los dos anteriores.

6. PROTOCOLOS GENERALES DE BILOGÍA MOLECULAR UTILIZADOS EN EL CAPÍTULO 2

6.1. Resuspención del plásmido

Se trabajó con el vector policistrónico STEMCCA, que contiene el casete de reprogramación con los cuatro factores de

Yamanaka, OSKM unidos por secuencias 2A e IRES. El mismo fue cedido gentilmente por el Dr. Gustavo Mostovlasky, de la

Universidad de Boston.

El vector fue extraído de un papel de filtro, método en el que se transportó desde el laboratorio de origen. Para ello, se

recortó la zona en donde se encuentra el plásmido (maniobra realizada con guantes), y se incubó con 100 µl buffer TE o agua mQ en

un eppendorf de 1.5 ml a RT por 5-30 minutos. Se mezcló con vortex y se quitó el papel de filtro con pinzas limpias. Se tomó 10 µl

del sobrenadante para transformar E. coli. Se almacena el resto del líquido y papel de filtro a -20 °C o -80 °C.

Tabla 64: Buffer TE

Componentes Composición Preparación Tris HCl pH 8 10 mM 5 ml de TrisHCl 1M EDTA pH 8 1 mM 1 m de EDTA 0.5 M Volumen 500 ml 494 ml de Agua destilada

El EDTA 0.5M se prepara disolviendo 186.1 g Na2EDTA 2H2O en 700 ml de agua destilada, y ajustando el pH a 8 con

10M de NaOH (50 ml aproximadamente), se afora a 1 litro con agua destilada.


183

El TrisHCl se prepara disolviendo 121 g de Tris Base en 800 ml de agua destilada. Se ajusta el pH a 8 con 1 M de HCl

agregando gota a gota con una pipeta pasteur limpia. Se afora a 1 litro. Esta solución se puede filtrar por membrana 0.2 µm de acetato

de celulosa. Se almacena refrigerada a 4-8°C.

6.2. Preparación de bacterias ultracompetentes

6.2.1. Protocolo

Las bacterias ultracompetentes poseen una eficiencia del orden de 108 colonias transformantes por mg de plásmido. Para

su preparación se incuba en esterilidad, un cultivo de la cepa E. coliDH5α en medio SOB a 18-22 °C con agitación moderada, hasta

que alcanza una DO600 de 0,55. Se transfiere el cultivo a un baño agua-hielo por 10 minutos. Luego se cosechan las bacterias

centrifugando a 3220 x g por 20 minutos a 4 °C y se lava resuspendiéndolas en 80 ml de Buffer Inoue frío. Se centrifuga nuevamente

a 2500 g por 10 minutos a 4 °C y se resuspenden las bacterias en 20 ml de Buffer Inoue frío. Se agrega 1,5 ml de DMSO, se mezcla

suavemente la suspensión de bacterias y se incuba en hielo por 10 minutos.

Rápidamente, se alicuota la suspensión en tubos eppendorfs pre-enfriados a -20 °C y estériles, y se sumergen

inmediatamente en un baño de nitrógeno líquido. El stock de bacterias ultracompetentes se conserva a -80 °C. Se determina la

eficiencia de transformación de las bacterias transformándolas con un plásmido de concentración conocida, sembrando tres diluciones

(1:10, 1:100 y 1:1000), y utilizando la siguiente ecuación:

donde UFC corresponde a las unidades formadoras de colonias, FD al factor de dilución realizado y µg DNA a la cantidad de vector

utilizado.

6.2.2. Soluciones: Medio SOB

Tabla 65: Composición medio SOB

Componente Cantidad

Extracto de levadura 5 g Triptona de carne 20 g NaCl 0.5 g KCl 250 mM 10 ml MgCl2 2M 5 ml Agua destilada estéril Csp 1 L

Se lleva a volumen y autoclava. Se conserva a RT. Si ha sido abierto en esterilidad (llama), se cierra y se conserva en heladera.


184

6.2.3. PIPES 0.5 M pH 6.7

Tabla 66: Solución PIPES para Buffer Inoue


PIPES 15.1 g Agua mQ csp 100 ml

6.2.4. Buffer Inoue

Tabla 67: Buffer Inoue para ultracompetentes


MnCl2 4 H2O 10.88 g CaCl2 2 H2O 2.20 g KCl 18.65 g PIPES 0.5 M pH 6.7 20 ml Agua mQ estéril Csp 1 L

Se esteriliza por membrana 0.22 µm.

6.3. Transformación de E. coli

La transformación de bacterias se realiza mediante la técnica de golpe de calor, o Heat Shock. Se utiliza bacterias

ultracompetentes de la cepa E. coliDH5α, una de las más utilizadas para la transformación con DNA plasmídico, ya que posee

mutaciones inactivantes tanto de enzimas endonucleasas que degradarían al DNA foráneo, como de recombinasas que podrían

producir recombinación homóloga entre los vectores y el cromosoma bacteriano.

Se utiliza 50 µl de bacterias ultracompetentes para cada transformación con vectores, y 100 µl de estas bacterias en el caso

de transformarlas con productos de ligación, debido a la baja eficiencia con la que ocurre la ligación. Trabajando en esterilidad y en

frío, una vez descongeladas las suspensiones, se agrega la solución con el plásmido a transformar y se incuba durante 20 a 30 minutos

en hielo para favorecer que los vectores interactúen con las células. Se realiza un control positivo transformando las bacterias con un

vector de concentración conocida y con resistencia al mismo antibiótico del plásmido de interés, y uno negativo, sin agregado de

DNA, como control de cepa y del antibiótico de selección. Una vez terminada la incubación en hielo, se colocan los tubos en un baño

a 42 °C durante 90 segundos e inmediatamente se incuban en un baño de agua hielo durante 5 minutos. Se agrega 1 ml de medio de

cultivo LB a cada tubo y se incuban a 37 °C durante 30 minutos a una hora.

Luego de la incubación, se centrifugan las células durante 5 minutos a 2700 g. Se descarta el sobrenadante, se resuspende

en aproximadamente 100 µl de LB remanente y se siembran las bacterias en placas LB agar conteniendo 100 µg/ml de ampicilina o

50 µg/ml de kanamicina, según corresponda. Se incuban las placas overnight a 37 °C y al día siguiente, se evalúa la presencia de

colonias transformantes.


185

Figura 87:Cultivo de E. coli en agar LB con ampicilina. Amplificación de STEMCCA. A: vector STEMCCA con OCT4, SOX2, KLF4 y C-MYC. B: controles positivos y negativos (el positivo con un vector conocido y el negativo con agua).C: STEMCCA con OCT4, SOX2, KLF4 y CHERRY.

6.4. Purificación del plásmido (miniprep)

Utilizamos el método de lisis alcalina de Birnboim y Doly para purificar DNA plasmídico con fines analíticos a baja

escala y de forma rápida. El protocolo utilizado se basa en la lisis alcalina de las bacterias utilizando NaOH y el detergente dodecil

sulfato de sodio (SDS).

Trabajando en esterilidad, se inoculan 2 ml de medio LB conteniendo ampicilina 100 µg/ml (o el antibiótico

correspondiente según el plásmido) con una colonia de bacterias transformadas con el plásmido a analizar, y se incuban las bacterias

a 37 °C toda la noche con agitación. Se centrifuga 1,5 ml de cada cultivo durante 5 minutos a 2700 g. Se descarta el sobrenadante y se

resuspende las bacterias en 100 µl de Solución 1. Se agregan 200 µl de Solución 2 y se mezcla suavemente por inversión. Luego, se

agregan 150 µl de Solución 3, se mezcla por inversión, y se centrifugan los tubos a máxima velocidad durante 15 minutos. Se separa

el sobrenadante que contiene el DNA plasmídico y se agregan 0,6 volúmenes de isopropanol o 2 volúmenes de etanol frío. Se

centrifugan los tubos a máxima velocidad durante 30 minutos. Se descarta el sobrenadante y se agregan 100 µl de alcohol 70 % para

disolver las sales remanentes, sin disolver el pellet. Se centrifuga a máxima velocidad durante 5 minutos, se descarta el sobrenadante

y se dejan secar los pellets a RT por 5 minutos. Por último, se resuspenden los pellets en 30 µl de H2OmQ.

6.5. Purificación de DNA plasmídico (midi prep)

En esterilidad, se inoculan 200 ml de medio LB conteniendo 100 µg/ml de ampicilina con 500 µl de un stock de E. coli

transformada con el plásmido de interés conservado en glicerol 15 % a -80 °C, y se incuba a 37 °C con agitación durante 12-16 horas.

Se centrifugan los cultivos de bacterias a 2700g durante 15 minutos y se descarta el sobrenadante. Se resuspende el pellet en 6 ml de

Solución 1 y se agregan 6 ml de Solución 2 que produce la lisis de las bacterias, se mezcla por inversión y se incuba en hielo durante

10 minutos. Luego, se agregan 6 ml de Solución 3, se mezcla por inversión y se incuba durante 5 minutos. Se centrifuga a 10.000 rpm

durante 30 minutos a 4 °C y se transfieren los sobrenadantes a nuevos tubos de centrífuga, filtrándolos a través de una gasa para

A B

C


186

evitar el pasaje de restos de precipitado. Se agregan 0,6 volúmenes de isopropanol, se mezcla y se incuba 5 minutos a RT. Se

centrifuga a máxima velocidad por 15 minutos a 4 °C. Se descarta el sobrenadante y se deja secar el pellet, el cual se resuspende en 2

ml de Buffer TE y se incuba con una concentración final de 100 µg/ml de RNAsa durante 30 minutos a RT. Finalmente, se utilizan

las columnas del kit Wizard Plus Maxipreps DNA Purification System (Promega) para purificar los DNA plasmídicos, siguiendo las

indicaciones del fabricante. Se eluye el DNA plasmídico de las columnas con 500 µl de Buffer TE o H2OmQ precalentada a 65 °C,

se cuantifica midiendo su concentración en NanoDrop 2000 y se realiza una electroforesis en gel de agarosa 0,8 % de una alícuota

para verificar su calidad. Para evaluar su identidad, se procede a realizar un mapa de restricción, cortando con enzimas determinadas

y mirando los tamaños de banda de los productos de la digestión.

6.6. Soluciones

6.6.1. Medio LB

Tabla 68: Composición medio LB

Componentes Para 1L Para 200 ml

Peptona 10 g 2g Extracto de levadura 5g 1g NaCl 5g 1g

Se lleva a volumen y autoclava. Se conserva a RT. Si ha sido abierto en esterilidad (llama), se cierra y se conserva en heladera.

6.6.2. Soluciones de miniprep

Tabla 69: Soluciones para miniprep

Solución I (40 ml): • TrisHCl pH 8 25 mM• EDTA 10 mM

Solución II (20 ml): • SDS 1 % • NaOH 0.2 M

Solución III (para 50 ml): • Acetato de sodio 3 M

Se prepara agregando: • 2 ml de TrisHCl pH 7.5 1 M • 0.8 ml de EDTA 0.5 M• 37.2 ml de Agua destilada

Se prepara agregando: • 2 ml de SDS 10 % • 4 ml de NaOH 1 M • 14 ml de Agua destilada.

Se prepara agregando: • 30 ml de Acetato de potasio

5M• 5.75 ml de Ácido acético

glacial 100 % • 14.25 ml de agua destilada.

6.7. Control de identidad del plásmido por digestión enzimática

Se chequeó la identidad del vector STEMCCA a través de la digestión enzimática de 1 µg de vector con las enzimas de un

solo corte: SpeI, BamHI y ClaI de Promega. La digestión se llevó a cabo de acuerdo a la siguiente tabla:


187

Tabla 70: Mezcla de reacción enzimática del vector STEMCCA

Agua libre de nucleasas 13.8 µl Buffer de Enzima 10x 2 µl BSA 10 µg/µl 0.2 µl Plásmido (1 µg) 1µl Mezclar y después añadir: SpeI BamHI ClaI

1 µl 1 µl 1 µl

Las enzimas se utilizaron en el buffer Multicore de Promega. Se incubó la mezcla de reacción O.N. a 37 °C en

termobloque. Al día siguiente se corrió un gel de 0.8 % de agarosa con la mezcla de 20 µl de la reacción más 4 µl de buffer de carga

6X. Se utilizó el marcador de peso molecular de 1kb, y se corrió en paralelo con vector sin digerir como control negativo.

Figura 88: Mapa de restricción vector STEMCCA. A: 1 µg de vector fue dirigido con BamHI, SpeI y ClaI para obtener tres fragmentos de 2391 bp, 3777 bp y 6168 bp. B: Control sin digerir. Gel de agarosa 0.8 %.

6.8. Extracción de DNA genómico

1. Se tripsiniza las células de 1 p60 y se transfiere 1/10 a eppendorf.

2. Se centrifuga a 1000 rpm (200- 300 g) durante 5 min.

3. Se descarta el sobrenadante y se lava con 200 µl PBS.

4. Se centrifuga a 1000 rpm (200- 300 g) durante 5 min.

5. Se resuspende el pellet en 100 µl de buffer de lisis agregándole 1 µl de proteinasa K (concentración final 100µg/ml).

En nuestro caso el stock es de 1.87 mg/ml, por lo que se agregan 5.34 µl de proteinasa K por eppendorf.

6. Se lisa durante 1 hora a 60 ºC con agitación intermitente.

7. Se precipita el ácido nucleico con 600 µl de isopropanol a RT por 5 min.

8. Se centrifuga a 13.000 a 16.000 x g a 4 ºC durante 15- 20 min.

9. Se descarta el sobrenadante y se lava el pellet con 200 µl EtOH 70 % (centrifugar a 13.000 x g durante 5 min).

10. Se seca al aire.

11. Se resuspende el pellet en 30-50 µl de agua.

12. Se rehidrata el DNA incubando 30 min aprox. a 65 ºC.

13. Se guarda el DNA a -20 ºC.

A B 6168 bp

3777 bp 3000 bp


188

Buffer de lisis:

TrisHCl pH 8.3 10 mM

- KCl 50 mM

- MgCl2 2 mM

- Gelatina 0.001%

- Nonidet-40 0.5 %

- Tween 20 0.5 %

Para 10 ml se coloca:

100 µl de TrisHCl 1M.

2 ml de KCl 250 mM

10 µl de MgCl2 2M

100 µl de gela 0.1%

50 µl de NP40

50 µl de Tween 20.

Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de una plataforma biotecnológica para el cultivo de células madre Referencias

189

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Modulación de genes involucrados en la pluripotencia bovina: desarrollo de … · 2019-04-03 ·...

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