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Modelo macro cinético de la producción de conidios en

fermentación sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum

Jeimy Geraldin Macias Camacho

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental

Bogotá D.C., Colombia

2017

Modelo macro cinético de la producción de conidios en

fermentación sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum

Jeimy Geraldin Macias Camacho

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ingeniería Química

Directora:

M.Sc. Nubia Moreno Sarmiento

Codirectora:

Ph.D. Ivonne del Socorro Gutiérrez Rojas

Línea de Investigación:

Bioinsumos

Grupo de Investigación:

Bioprocesos y Bioprospección

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ingeniería

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental,

Bogotá D.C., Colombia

2017

A mis padres por todo su apoyo y

paciencia durante este proceso.

A mi papi Vicente quien a pesar de ya no estar conmigo

me enseñó a creer siempre en mi

Agradecimientos

A mis padres Francisco Macias y Carmenza Camacho, sin quienes no sería la persona

que soy hoy en día, gracias por apoyarme en cada decisión que he tomado y por

comprender las múltiples ausencias en este tiempo.

A mis directoras, la ingeniería Nubia Moreno Sarmiento y la doctora Ivonne Gutiérrez

Rojas, por la confianza que depositaron en mí desde el inicio de este trabajo, por brindarme

las condiciones necesarias, el apoyo y los conocimientos para cumplir los objetivos de esta

tesis, además de hacerme crecer como profesional al enfrentarme a nuevos retos.

Al Instituto de Biotecnología, Biocultivos y a la Universidad Nacional por brindarme las

condiciones necesarias para la culminación de este trabajo de investigación.

A los docentes del Instituto de Biotecnología y del departamento de ingeniería Química y

ambiental por todos los conocimientos que me permitieron crecer de forma académica y

profesional.

A mis compañeros del Laboratorio de Fermentaciones, los que se encuentran actualmente

y los que ya no están, en especial a Diana Vergara, Diana Vinchira, Iván Cabeza y Daniel

Méndez, quienes durante este tiempo se convirtieron en grandes amigos y un apoyo

incondicional; a Geraldin Tibasosa, por haberme dado la mayor parte de los conocimientos

que tengo en este momento de microbiología y por haberme tenido mucha paciencia

cuando decidí iniciar en este campo de investigación.

A todas las personas que de una u otra manera aportaron a la finalización de este trabajo.

A todos ustedes mil y mil gracias.

Resumen y Abstract VII

Resumen

En el presente trabajo se desarrolló un modelo matemático, el cual reproduce el

comportamiento de la cepa Penicillium pinophilum HC1 en el proceso de producción de

conidios, generación de biomasa, consumo de fuente de carbono y nitrógeno

Para generar el modelo, se analizaron los efectos de limitación por fuente de carbono y

nitrógeno a escala laboratorio y piloto. Estos ensayos permitieron evidenciar, que la

limitación por carbono es el principal inductor de la producción de conidios de Penicillium

pinophilum HC1 en cultivo sumergido en operación por lote.

En el desarrollo del modelo inicialmente se evaluaron siete modelos no estructurados no

segregados para la tasa de crecimiento, utilizando como estrategia de cálculo la

evaluación simultanea de los perfiles de crecimiento experimentales; este método no

permitió simular el proceso, debido a la complejidad del sistema.

Teniendo en cuenta lo anterior, se desarrolló el modelo por análisis de fenómenos

biológicos presentes en el sistema, es decir, limitación de carbono y nitrógeno para

generación de biomasa y conidios, y consumo de sustratos.

Por último se adiciono al modelo la ruta metabólica asociada a la producción de biomasa,

ya que dentro de los ensayos experimentales se encontró que la biomasa tiene un efecto

limitante en la producción de conidios.

Se recomienda para mejorar la predicción del proceso evaluar la influencia de diversos

factores, como aireación, temperatura y pH, puesto que estos permanecieron constantes

durante esta evaluación

Palabras clave: Penicillium pinophilum, conidios, modelo, bioprocesos

Resumen y Abstract IX

Abstract

In the present work, a mathematical model was developed, which reproduces the behavior

of the Penicillium pinophilum HC1 strain in the process of conidial production, biomass

generation, consumption of carbon and nitrogen source

To generate the model, the effects of limitation by carbon and nitrogen source at laboratory

and pilot scale were analyzed. These tests showed that carbon limitation is the main

inducer of the production of conidia of Penicillium pinophilum HC1 in submerged culture in

operation by lot.

In the development of the model, initially, seven non-segregated unstructured models were

evaluated for the growth rate, using as a calculation strategy the simultaneous evaluation

of the experimental growth profiles; this method did not allow to simulate the process, due

to the complexity of the system.

Taking into account the above, the model was developed by analyzing biological

phenomena present in the system, that is, carbon and nitrogen limitation for generation of

biomass and conidia, and consumption of substrates.

Finally, the metabolic path associated with the production of biomass was added to the

model, since within the experimental tests it was found that the biomass has a limiting effect

on the production of conidia.

It is recommended to improve the prediction process evaluate the influence of various

factors such as aeration, temperature and pH, since these remained constant during this

evaluation

Keywords: Penicillium pinophilum, conidia, model, bioprocess.

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ....................................................................................................................... VII

Lista de figuras ............................................................................................................ XIII

Lista de tablas .............................................................................................................. XV

Lista de Símbolos y abreviaturas .............................................................................. XVII

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Objetivos ................................................................................................................... 3 Objetivo General ........................................................................................................ 3 Objetivos Específicos ................................................................................................. 3

2. Marco Teórico ........................................................................................................... 4 2.1.1 Penicillium spp. ..................................................................................... 5 2.1.2 Conidiogénesis ...................................................................................... 7 2.1.3 Producción de conidios ....................................................................... 10 2.1.4 Variables que afectan el proceso de conidiogénesis ........................... 13 2.1.5 Inductores ........................................................................................... 13 2.1.6 Variables físicas .................................................................................. 15 2.1.7 Limitación de nutrientes ...................................................................... 17 2.1.8 Régimen operacional .......................................................................... 20 2.1.9 Lote ..................................................................................................... 20 2.1.10 Continuo .............................................................................................. 21 2.1.11 Lote alimentado ................................................................................... 21 2.1.12 Modelos matemáticos ......................................................................... 22 2.1.13 Modelos de crecimiento para el género Penicillium spp. ..................... 24 2.1.14 Rutas metabólicas asociadas a la generación de biomasa ................. 26 2.1.15 Antecedentes de investigación ............................................................ 28

3. Materiales y métodos ............................................................................................. 30 3.1.1 Microorganismo ................................................................................... 30 3.1.2 Tren de inóculo ................................................................................... 30 3.1.3 Ensayos preliminares .......................................................................... 31 3.1.4 Limitación por sustrato ........................................................................ 31 3.1.5 Fermentaciones a escala piloto (100 L) ............................................... 33 3.1.6 Métodos analíticos .............................................................................. 33

Contenido XII

3.1.7 Cuantificación de biomasa .................................................................. 33 3.1.8 Cuantificación de sacarosa residual .................................................... 33 3.1.9 Cuantificación de amonio residual ...................................................... 34 3.1.10 Cuantificación de conidios .................................................................. 34 3.1.11 Tolerancia térmica .............................................................................. 34 3.1.12 Modelo ................................................................................................ 34 3.1.13 Generación de parámetros ................................................................. 35 3.1.14 Análisis de sensibilidad del modelo ..................................................... 40 3.1.15 Validación de modelo .......................................................................... 40 3.1.16 Análisis de estabilidad de modelo ....................................................... 40

4. Resultados y Análisis de Resultados ................................................................... 42 4.1.1 Ensayos preliminares .......................................................................... 42 4.1.2 Ensayos con limitación de sustratos a escala laboratorio (3 litros) ...... 47 4.1.3 Ensayos a escala piloto 100 litros ....................................................... 59 4.1.4 Modelo matemático............................................................................. 67

5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 87 Conclusiones ........................................................................................................... 87 Recomendaciones ................................................................................................... 88

Bibliografía .................................................................................................................... 89

A. Anexo: Medios de cultivo ...................................................................................... 101

B. Anexo: Protocolos experimentales .................................................................... 105

C. Anexo: Cinéticas ensayos limitación ................................................................ 114

D. Anexo: Derivadas a partir de Table curve 2d .................................................... 124

E. Anexo: Balance estequiométrico....................................................................... 129

F. Anexo: Balance estequiométrico intracelular ................................................... 131

G. Anexo: Análisis de sensibilidad del modelo ..................................................... 134

Lista de figuras XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura 2 - 1 Producción, área mundial y generación de tamo de arroz paddy.. ............... 4

Figura 2 - 2 Conidioforos observados en Penicillium ........................................................ 8

Figura 2 - 3 Proceso de conidiogénesis ........................................................................... 9

Figura 2 - 4 Factor de fricción en la columna de burbujeo como descriptor del régimen de

flujo ............................................................................................................................... 15

Figura 2 - 5 ruta metabólica para la formación de biomasa ........................................... 27

Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis .......................................... 27

Figura 4 - 1 Producción de conidios en diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%) .....433

Figura 4 - 2 Producción de biomasa para diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%) ..444

Figura 4 - 3 Cinética de biomasa variando el porcentaje inicial de inóculo ....................455

Figura 4 - 4 Cinética de producción de conidios variando el porcentaje inicial de inóculo

......................................................................................................................................466

Figura 4 - 5 Comportamiento de la productividad de biomasa variando las

concentraciones iniciales de fosfato de amonio y sacarosa ...........................................477

Figura 4 - 6 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación por fuente de nitrógeno ......488

Figura 4 - 7 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación por fuente de carbono……...

489

Figura 4 - 8 Comportamiento del consumo máximo de sacarosa escala 3L ................... 51

Figura 4 - 9 Porcentaje de amonio consumido a las 144 horas escala 3 L ..................... 52

Figura 4 - 10 Comportamiento de los conidios generados respecto a las concentraciones

iniciales de fosfato de amonio y sacarosa ...................................................................... 53

Lista de figuras XIV

Figura 4 – 11 Producción máxima de conidios para las diferentes condiciones evaluadas

....................................................................................................................................... 54

Figura 4 - 12 A. Crecimiento vegetativo en medio sin limitación (40x). B. Diferenciación en

medio limitado sacarosa y amonio (100x). ...................................................................... 58

Figura 4 - 13 Biomasa producida en fermentación de 100 L ......................................... 599

Figura 4 - 14 Amonio residual en la fermentación de 100 litros ....................................... 62

Figura 4 - 15 Sacarosa residual para la fermentación de 100 litros ................................. 63

Figura 4 - 16 Producción de conidios en fermentación de 100 ........................................ 64

Figura 4 - 17Comportamiento de la tasa de crecimiento respecto a las concentraciones

iniciales de fosfato de amonio y sacarosa ....................................................................... 70

Figura 4 - 18 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de

fuente de carbono sacarosa ............................................................................................ 74

Figura 4 - 19 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de

fuente de amonio ............................................................................................................ 76

Figura 4 - 20 Producción máxima de conidios para las diferentes condiciones evaluadas

....................................................................................................................................... 81

Lista de tablas XV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 2 - 1 Producción de conidios y biomasa para diferentes especies de Penicillium. 12

Tabla 2 - 2 Concentraciones de calcio inductoras de conidiogénesis para diferentes

especies de Penicillium. ................................................................................................. 14

Tabla 2 - 3 Variables físicas reportadas para cultivo sumergido de diferentes especies de

Penicillium. ..................................................................................................................... 16

Tabla 2 - 4 fuentes de carbono utilizadas en el proceso de conidiogénesis .................... 19

Tabla 2 - 5 Ecuaciones propuestas en la literatura para la generación de biomasa de

Penicillium ...................................................................................................................... 25

Tabla 3 - 1 Concentraciones para los ensayos de limitación de sustrato ........................ 32

Tabla 3 - 2 Modelos utilizados para la tasa de crecimiento ............................................. 35

Tabla 4 - 1 Valores de tasa de crecimiento maxima y constante de afinidad por fuente de

carbono .......................................................................................................................... 49

Tabla 4 - 2 Valores de tasa de crecimiento máxima y constante de afinidad por fuente de

nitrógeno ........................................................................................................................ 49

Tabla 4 - 3 Valores de tasa de crecimiento de biomasa y otros metabolitos secundarios

para Penicillium sp. ........................................................................................................ 50

Tabla 4 - 4 Resultados análisis de varianza (ANOVA), para generación de biomasa,

producción de conidios, consumo de sacarosa y consumo de amonio. .......................... 55

Tabla 4 - 5 Concentraciones seleccionadas para los ensayos en reactor de 100 L ........ 56

Tabla 4 - 6 Resultados germinación y tolerancia térmica ensayos escala 3 litros ........... 57

Tabla 4 - 7 Comparación de biomasa máxima producida en el reactor de 3 y 100 L ..... 60

Lista de tablas XVI

Tabla 4 - 8 Comparación porcentaje de amonio consumido ensayos de 3 y 100 L) ........ 62

Tabla 4 - 9 Comparación producción de conidios en escala de 3 y de 100 L ................. 65

Tabla 4 - 10 Constantes obtenidas para los diferentes modelos aplicados ..................... 68

Tabla 4 - 11 Coeficientes de varianza de las constantes obtenidas según el análisis de

sensibilidad realizado. ..................................................................................................... 69

Tabla 4 - 12 Valores 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠 análisis de sensibilidad limitación de carbono .............. 72

Tabla 4 - 13 Valores coeficientes de correlación R2 con los valores de 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠

promedio ......................................................................................................................... 73

Tabla 4 - 14 Valores 𝑘𝑛 para ensayos de limitación de nitrógeno ................................... 73

Tabla 4 - 15 Valores coeficientes de correlación R2 con el valor de 𝑘𝑛 promedio ............ 73

Tabla 4 - 16 Valores 𝑚1 para ensayos con presencia de fase estacionaria. ................... 75

.Tabla 4 - 17 Valores 𝑚2 para ensayos con presencia de fase estacionaria. .................. 77

Tabla 4 - 18 Valores 𝜇𝑝𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠 análisis de sensibilidad limitación de carbono ............ 78

Tabla 4 - 19 Valores de coeficiente de correlación para cada uno de los ensayos a escala

laboratorio 3 litros ........................................................................................................... 78

Tabla 4 - 20 Parámetros constantes usados en la iteración con la ruta metabólica (Yuan

et al., 2010) ..................................................................................................................... 80

Lista de símbolos y abreviaturas XVII

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas

Símbolo Término Unidad Definición

𝑘 Constante - Constantes de ajuste de modelo

𝑘𝑖 Constante de inhibición por sustrato c

g/L Concentración máxima de

la fuente de carbono inhibitoria

𝑘𝑛 Coeficiente afinidad de sustrato al nitrógeno

g/L Concentración de sustrato

en la que la bacteria empieza a crecer

𝑘𝑠 Constante de afinidad con fuente de carbono

g/L Concentración de sustrato

en la que la bacteria empieza a crecer

𝑚2 Mantenimiento por fuente nitrógeno

g/g.h Gramos nitrógeno por gramos de biomasa

𝑚1 Mantenimiento por fuente de carbono

g/g.h Gramos carbono por gramos de biomasa

𝑛 Sustrato fuente de nitrógeno g/L Gramos de fosfato de amonio por litro

𝑠 Sustrato fuente de carbono g/L g sustrato / L de medio

V Volumen L

x Biomasa g/L gramos de biomasa por litros de medio

𝑌𝑥𝑠 Rendimiento biomasa producto

por fuente de carbono g/g

gramos de biomasa y producto por gramos de

carbono

Lista de tablas XVIII

Símbolo Término Unidad Definición

𝑌𝑥𝑛

Rendimiento biomasa nitrógeno g/g gramos de biomasa por gramos de nitrógeno

𝑥(𝑡) Solución exacta - -

�̅�(𝑡) Solucion aproximada - -

Símbolos con letras griegas

Símbolo Término Unidad SI Definición

α, β, 𝛾 Constantes relacionadas al producto

µ Velocidad específica de crecimiento

𝜇max Velocidad específica máxima de crecimiento

𝛿, 휀 Constantes relacionadas a error

Subíndices Subíndice Término

s carbono

m máxima

n nitrógeno

0 Inicial

Superíndices Superíndice Término

𝑛 Exponente, potencia

Introducción

Penicillium sp. HC1, identificado como Penicillium pinophilum, es un hongo celulolítico y

xilanolítico aislado de suelo del Departamento del Tolima - Colombia, y seleccionado por

la alianza Biocultivos S.A - Universidad Nacional de Colombia – IBUN (Pedraza-Zapata et

al., 2016; Gutierrez et al. 2011 ), con el fin de desarrollar un bioinoculante para acelerar la

degradación in situ de residuos de cosecha. Actualmente, dicho producto se encuentra en

trámite de registro ante el ICA y se espera que con su uso se disminuya el impacto

ambiental negativo derivado de la disposición inadecuada de estos residuos y se aumente

la productividad del cultivo, al permitir que los nutrientes contenidos en estos retornen al

suelo mejorando su estructura y aportando materia orgánica.

En general los cultivos durante la etapa de cosecha producen una gran cantidad de

residuos, los cuales deben ser dispuestos para iniciar el siguiente cultivo. En el caso del

arroz, es frecuente la quema a cielo abierto de estos residuos con el fin de disminuir el

tiempo entre cosechas. Esta práctica ocasiona un daño ambiental por las emisiones que

se generan (70% CO2, 7% CO, 0.7% CH4 y 2.1% N2O) (Pathak et al., 2006); además,

deteriora la calidad del suelo, genera pérdida de microfauna benéfica y de nutrientes

contenidos en ese material vegetal.

Una alternativa para este problema es la biodegradación de los residuos mediante

microorganismos con actividad celulolítica y ligninolítica, ya que de esta manera se logra

reincorporar al suelo nutrientes tales como nitrógeno, fósforo, potasio y azufre (Naklang et

al., 1999) Con base en los beneficios que ofrece implementar el proceso de biodegradación

de residuos poscosecha en los campos de cultivos inicialmente de arroz, el grupo de

investigación de Bioprocesos y Bioprospección, en alianza con la empresa Biocultivos S.A.,

desarrolló un inoculante a partir de microorganismos con actividad ligninolítica y

celulolítica; con este fin se seleccionó la cepa Penicillium pinophilum HC1 (Gutiérrez et al.,

2011).

2 Modelo macro cinético de la producción de conidios en fermentación

sumergida por lotes a partir de Penicillium pinophilum

Se tiene información previa del grupo de investigación, respecto al comportamiento de este

microorganismo en diferentes medios de cultivo; por ejemplo, usando diferentes fuentes

de carbono y nitrógeno (Gutiérrez et al, 2015) además de diferentes relaciones entre estas;

de esto se encontró que en fuentes complejas de carbono como la harina de arroz con una

fuente inorgánica de nitrógeno genera una mayor producción de conidios, sin embargo

debido a que las fuentes complejas de carbono no permiten realizar mediciones precisas

en las etapas de escalamiento, se realizaron ensayos teniendo como base los mejores

resultados de las fuentes simples de carbono.

Durante el proceso de escalamiento se ha observado que este microorganismo presenta

respuestas altamente sensibles a ciertas condiciones de estrés, lo cual ocasiona que se

generen productos no deseados; por esta razón, para entender el comportamiento del

microorganismo y el proceso de conidiogénesis, en este trabajo se desarrollaron ensayos

variando las concentraciones iniciales de carbono y nitrógeno, con el fin de observar el

comportamiento respecto al consumo de sustratos, formación de conidios y generación de

biomasa.

A partir de los datos obtenidos en el presente trabajo se generó un modelo macro cinético

asociado a la producción de conidios, para esto se decidió incluir parte de la ruta

metabólica asociada a la generación de biomasa. Este modelo se desarrolló con el fin de

generar herramientas para la implementación de estrategias de Ingeniería de Sistemas de

Procesos. Adicionalmente, el análisis del proceso a través de modelos matemáticos facilita

futuros procesos de escalamiento optimización y automatización del sistema.

1. Objetivos

Objetivo General

Establecer un modelo macro cinético de la producción de conidios a partir de Penicillium

pinophilum en fermentación sumergida por lotes

Objetivos Específicos

Evaluar la influencia de la limitación de fuentes de carbono y nitrógeno en la

generación de biomasa y generación de conidios.

Determinar el comportamiento en términos de crecimiento, producción de conidios

y consumo de sustratos en fermentación sumergida por lotes.

Ajustar y validar un modelo matemático para la formación de conidios.



2. Marco Teórico

Los residuos vegetales en el cultivo de arroz han venido incrementándose con el aumento

de la producción de arroz; según la FAO (2014) entre 2013 y 2014 se incrementó en 2.87

millones de toneladas la producción de arroz paddy y por cada hectárea de cultivo se

generan entre 4 y 8 toneladas de residuos verdes (Medina, 2010 ) (Figura 2-1).

2004

2005

2006

2007

2008

2009

2010

2011

2012

2013

2014

400

600

800

1000

150

160

170

180

ProducciónÁrea Tamo

Pro

du

cció

n/T

am

o(M

illo

nes t

on

ela

das/

añ

o)

Áre

a (M

illon

es H

a)

Figura 2 - 1 Producción, área mundial y generación de tamo de arroz paddy. (FAO, 2014).

Existen diversas opciones para el uso de los residuos vegetales, por ejemplo nano

partículas (Lu y Hsieh, 2012; Wu et al, 2011; Wu et al., 2009), biosílica (Pan et al., 2017),

biorrefinerías (Abraham et al., 2016), biogás (Narra et al., 2016), bioetanol (Goel y Wati,

2016; Kumar et al., 2016), alimento para animales (Sarnklong et al., 2010) y materia prima

para la industria del papel (Juwono y Subawi, 2014); sin embargo, todas ellas tienen altos

costos asociados a la remoción de los residuos hasta el sitio de uso.

Pequeños y medianos agricultores no están en capacidad de absorber los costos que ello

demanda; por esta razón, se recurre a la quema a cielo abierto, ya de esta manera se

libera el terreno para tener un mayor número de cosechas durante el año y se eliminan los

residuos poscosecha de una forma económica.

Capítulo 2. Marco Teórico 5

Sin embargo, esta práctica ocasiona un impacto ambiental negativo, ya que se estima que

la quema de biomasa, como madera, hojas, árboles y pastos —incluidos los residuos

agrícolas—, producen el 40% del dióxido de carbono (CO2), 32% del monóxido de carbono

(CO), 20% del material particulado o partículas de materia suspendidas y 50% de los

hidrocarburos aromáticos poli cíclicos (HAP) emitidos al ambiente a escala mundial

(Kambis y Levine 1996). Adicional a esto, se causan otros daños ambientales como

pérdida de la materia orgánica, nutrientes, estructura del suelo, micro fauna benéfica, entre

otras.

Una alternativa a la quema de residuos, es la degradación biológica e incorporación al

suelo, a través de microorganismo con actividad celulolítica y ligninolítica, este proceso

ocurre de manera natural en tiempos largos, que los agricultores del trópico no están en

disposición de esperar para realizar su siguiente cultivo. Por esta razón, el uso de

inoculantes microbianos disminuye el tiempo de degradación y hace posible la

reincorporación de la materia orgánica producida, disminuyendo los costos asociados a los

nutrientes que se deben adicionar para cada cosecha.

Con este objetivo, en el Instituto de Biotecnología, el Grupo de Bioprocesos y

Bioprospección está desarrollando un proceso de producción de un inoculante elaborado

a partir de Penicillium pinophilum. Este ha sido evaluado en condiciones de laboratorio y

campo sobre residuos pos cosecha de arroz; utilizando este inoculante el proceso de

degradación en campo tarda 30 días, momento en el cual la materia orgánica y los

nutrientes pueden ser reincorporados en la preparación del suelo para el cultivo.

La comercialización del inoculante exige que el producto sea estable en el tiempo, por esta

razón, se decidió formular el producto a partir de estructuras de resistentes y tolerantes a

condiciones ambientales, para el caso de P. pinophillum los conidios cumplen con estas

características (Gutiérrez et al 2015, Duran, 2017)

2.1.1 Penicillium spp.

Penicillium es un género fúngico diverso presente a nivel mundial, sus especies tienen

diversas aplicaciones como descomposición de materia orgánica, producción de

micotoxinas, generación de enzimas y antibióticos. Algunas especies, generan un impacto

negativo al ser fitopatógenos en diversos cultivos (Frisvad et al., 2004; Pitt y Hocking, 2009;



Samson et al., 2010), mientras otras tienen efectos positivos, por ejemplo en la industria

de alimentos son usadas para la producción de quesos como Camembert o Roquefort o

salchichas maduradas; también es capaz de degradar celulosa, quitina, almidón, azúcares,

lignina, entre otros (Barnett y Hunter, 1998). Sin embargo su mayor impacto es la

producción de penicilina, que revolucionó los enfoques médicos para el tratamiento de

enfermedades bacterianas (Visagie et al., 2014a); adicionalmente tiene aplicaciones en

otros campos como agentes biocontroladores (Larroche y Gros, 1997) y catalizadores para

la biotransformación (Smith y Calam, 1980).

Este hongo se caracteriza por tener cadenas de conidios paralelas, sin formar columnas;

los conidios son elípticos, lisos, de color verde pálido o amarillento. Las colonias son de

color verde a verde amarillo o amarillo brillante a anaranjado en medios que contienen

azúcar; las hifas superficiales están salpicadas de gránulos amarillos y el reverso y

substrato se colorean profundamente de rojo; en otras condiciones de medio y acidez, el

substrato puede colorearse de amarillo, de anaranjado, o de rojo. Los conidióforos tienen

un tamaño de 100 - 200 micras (Loustau Gomez de Membrillera, 1950; Visagie et al.,

2014b). Adicional a esto se ha descrito como un hongo filamentoso, heterótrofo, saprofito,

aerobio facultativo (Barnett y Hunter, 1998).

En este caso se trabajó con una cepa nativa de Penicillium pinophilum HC1 del cepario del

Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia. Este hongo pertenece

al reino Fungi, subdivisión Ascomycota, Clase Eurotiomycetes, orden Eurotiales, familia

Trichocomaceae, género Penicillium, especie pinophilum (“Mycobank,” 2017).

Penicllium pinophilum ha sido descrito por diversos autores como un hongo celulolítico,

xilanolítico y ligninolítico debido a la capacidad que tiene de producir enzimas como

celulasa, β-glucosidasa, endoglucanasa, xilanasa, y lacasa (Brown et al., 1987;

Claeyseens et al.,1989; Dhakar et al., 2014; Jeya et al., 2010; Maharana, 2016; Pol et al.,

2012; Wood et al., 1986, Mccrae et al., 1989 ), por otra parte este hongo presenta

características como degradación de polietileno (Volke-Seplveda et al., 2002), promoción

de crecimiento vegetal (Visagie et al., 2014; Maity et al., 2014), producción de enzimas

como glucosa oxidasa (Rando et al., 1997), feruloyl/ρ-coumaroyl esterasa (Castanares et

al., 1992) y Poli(3-hidroxibutirato)-depolimerasa (Panagiotidou et al., 2014) y generación

de metabolitos secundarios como ácido 2 metil 4 hidroxibenzoico (Stefano y Nicoletti,


1999), funicona (Stefano et al., 2002), 3-O-metilfunicona (Buommino et al., 2011), ácido

micofenólico (Ramos et al., 2012) y metabolitos fenólicos (Wu et al., 2016)

2.1.2 Conidiogénesis

La reproducción asexual es un modo reproductivo común para un grupo diverso de hongos

que incluye muchas especies importantes desde el punto de vista médico, industrial y

agrícola. Las esporas asexuadas de hongos superiores se denominan conidios y, aunque

hay gran variedad de forma y función conidial, todos los conidios representan propágulos

asexuales no móviles que se forman en la punta de células conidiógenas especializadas,

estos no se forman a través del rompimiento progresivo del citoplasma. El proceso de

conidiación implica temas comunes de desarrollo, incluyendo la regulación temporal y

espacial de la expresión génica, la especialización celular y la comunicación intercelular

(Adams et al., 1998).

La conidiogénesis es el proceso que lleva a la formación de los conidios; este proceso es

un aspecto especializado del crecimiento vegetativo, en el cual la división mitótica del

núcleo es seguida por delimitación y eventualmente separación de una porción de hifa

como un conidio (Moss, 1987); esta puede ser de dos tipos, blástica y tálica. En la

conidiogénesis blástica hay un pequeño brote en la célula conidiógena que da lugar al

conidio; por otra parte en la conidiogénesis tálica se forman conidios por modificación del

micelio preexistente (Sigler, 1989). La conidiogénesis blástica se clasifica en holoblástica

y enteroblástica; la primera hace referencia al proceso en el cual ambas paredes de la

célula conidiógena participan en la formación del conidio, la segunda se refiere al proceso

en el cual no participa ninguna pared o solamente la pared interna de la célula conidiógena,

en ese caso el conidio sale a través de una abertura en la pared de la célula madre, se

rodea de una nueva pared y deja una cicatriz. Este tipo de reproducción se da en varios

hongos como Penicillium spp. y Aspergillus spp. (Dijkterhuis y Samson, 2002).

El género Penicillium, se caracteriza por formar conidios en una estructura ramificada

llamada conidióforo la cual termina en células conidiógenas llamadas fiálides. Las

ramificaciones se ubican formando verticilos. Si hay sólo un verticilo de fiálides el pincel es

monoverticilado. Las ramificaciones de un pincel poli verticilado son ramas, rámulas,

métulas y fiálides Figura 2 - 2. Los conidios generados en fiálides suelen llamarse



fialoconidios para indicar su origen (Webster, 1986). En la fiálide, se dan sucesivas

divisiones mitóticas al dividirse el núcleo, cada una de las cuales da como resultado una

nueva célula hija especializada (conidio) (Hansberg y Aguirre, 1990); este proceso se

extiende simultáneamente el extremo apical que luego se estrangula separando la recién

formada célula reproductiva. Se llama conectivo a la porción de pared que une entre sí a

los conidios permitiendo la formación de cadenas, y en algunas especies se aprecia

claramente con el microscopio óptico (Webster, 1986).

Figura 2 - 2 Conidioforos observados en Penicillium, A. conidióforos con fiálide solitaria. B.monoverticilados. C. Bifurcado. D, E. Biverticilado F. Terverticilado. G. Poliverticilado (Visagie et al., 2014)

El ciclo de vida de Penicillium tiene las siguientes fases: adaptación de los conidios al

nuevo ambiente fisicoquímico; germinación de conidios que se extiende en hifas

generando la fase exponencial la cual corresponde al crecimiento del microorganismo; la

fase estacionaria es el equilibrio entre el incremento y decrecimiento de las hifas, luego

estas se diferencian en conidióforos y estas estructuras producen nuevos conidios

(Kolmark, 1984) (Desfarges et al., 1987); el comportamiento descrito se observa en la

Figura 2 - 3.


Figura 2 - 3 Proceso de conidiogénesis (Canteri y Ghoul, 2015a)

En forma más detallada el proceso de germinación da como resultado la formación de un

tubo germinal, cuyo crecimiento temprano se apoya en la movilización y utilización de

compuestos de almacenamiento en el conidio. A medida que el tubo germinal se desarrolla,

contribuye a la biosíntesis y extensión por absorción y metabolismo de los nutrientes del

medio. La extensión de hifas es un ejemplo extremo de crecimiento celular polarizado ya

que la extensión celular está restringida a una estrecha zona definida por el ápice de hifas

que se estrecha. La tasa de extensión se acelera a medida que aumenta la longitud del

tubo germinal y el crecimiento se vuelve auto catalítico (Papagianni, 2004).

En condiciones apropiadas, el micelio vegetativo da lugar a un micelio reproductor que

apoya la producción de estructuras reproductoras. El tipo de reproducción y la morfología

de las estructuras obtenida son clave en la identificación de hongos. Por lo tanto, el conidio

fúngico puede considerarse como el principio y el final del proceso de diferenciación. En

los hongos miceliales, las hifas se crecen por un proceso altamente polarizado de

ramificación celular conocido como extensión de la punta. A medida que la punta se



extiende, las ramas periódicas se forman en o cerca del vértice de la punta. Estas ramas

también se extienden de una manera polarizada como nuevas puntas. Los dos procesos

de extensión y ramificación de la punta permiten al organismo colonizar y utilizar

eficientemente el sustrato, y rara vez se encuentran en organismos distintos de los hongos,

lo que lleva a que se les denomine marcas del reino fúngico (Heath, 1995)

Para dar inicio al proceso de conidiación es necesario generar estímulos ambientales,

entre los cuales se encuentran la limitación por nutrientes, el estrés osmótico y la

acumulación de moléculas autorreguladoras que informan sobre la generación de

estructuras de reproducción (Roncal y Ugalde, 2003).

Después de la inducción del proceso de conidiación, se llevan a cabo las siguientes cuatro

etapas; las hifas vegetativas de crecimiento apical detienen inmediatamente la extensión

(etapa 1). La célula apical está delimitada por un tabique y comienza a hincharse, con la

concomitante formación de ramas subapicales (etapa 2). La célula apical se diferencia en

una fiálide (etapa 3), que finalmente brota en su punta, dando lugar al primer conidio (etapa

4). Una vez que el primer conidio se ha formado en la fiálide, un nuevo conidio aparece en

intervalos aproximadamente de hora en hora aproximadamente, dando por resultado una

cadena de conidios. Los capullos subapicales formados en las primeras etapas también

se diferencian en fiálides que producen conidios, dando lugar a la formación de estructuras

pinceladas características llamadas “penicilli”, las cuales dan origen al nombre del género

(Penicillium) (Roncal y Ugalde, 2003).

2.1.3 Producción de conidios

La producción industrial de insumos a partir de organismos miceliales (filamentosos) es

más complicada que la de microorganismos unicelulares (bacterias y levaduras), ya que

según la forma en que se desee generar el producto final las condiciones que se deben

controlar varían; generalmente los productos a partir de hongos se formulan con conidios

ya que estas estructuras de reproducción presentan un mayor estabilidad, tolerancia y se

garantiza una mayor concentración de propágulos que con el micelio vegetativo (Stanbury

et al., 2016).

La mayoría de los hongos usados a nivel industrial son capaces de generar conidios, éstos

se buscan en dos tipos de producción: cuando la inducción del proceso de conidiogénesis


activa un metabolismo secundario de interés (Chalier y Crouzet, 1998; Ibba et al., 1987) o

para formulación directa de productos biológicos. Para esto se han desarrollado tres

técnicas básicas con el fin de obtener una alta concentración de conidios: fermentación en

medio solidificado, fermentación en medio sólido y fermentación sumergida (Stanbury et

al., 2016).

La fermentación en medio sólido se refiere a la producción de conidios de manera

superficial en medios químicamente definidos con agar. Una técnica usual es "roll-bottle"

usada para la producción de conidios de P. chrysogenum; ésta consiste en preparar el

medio en botellas cilíndricas luego el medio se enfría a 45°C en un molino de rodillos de

manera tal que el agar se establece como una envoltura cilíndrica dentro de la botella. A

pesar de los problemas técnicos que tiene este tipo de producción proporciona una gran

superficie para el cultivo de conidios en un recipiente de poco tamaño. Por medio de este

tipo de fermentaciones se han obtenido producciones de conidios de P. chrysogenum del

orden de 108 a 1010 conidios/ml (El Sayed, 1992; Hockenhull, 1980) para el caso de P.

camemberti se han obtenido producciones de conidios de 107 conidios/ml (Krasniewski et

al., 2006).

Las fermentaciones en sustrato sólido son aquellas en las cuales el crecimiento se produce

sobre una matriz sólida en ausencia (o casi ausencia) de agua libre (Singhania et al., 2009).

Los microorganismos con crecimiento micelial se adaptan bien a tales sistemas, ya que su

crecimiento en forma de hifas facilita la colonización de sustratos sólidos; este tipo de

contacto entre el organismo de proceso y un sustrato sólido permite el uso de

concentraciones de sustrato muy elevadas pero con un sistema de "liberación lenta", de

esta manera el microorganismo crece en un ambiente similar al natural ya que controla su

alimentación al solubilizar el sustrato. Por este método se induce el proceso de conidiación

debido a que ese sistema se asocia a un medio con limitación de nutrientes (Stanbury et

al., 2016). Para este tipo de fermentaciones es común el uso de cereales como arroz, trigo

(salvado), cebada o maíz; en estos sistemas el proceso de conidiogénesis de un hongo

dado se ve particularmente afectado por la cantidad de agua añadida al cereal antes de la

esterilización y la humedad relativa de la atmósfera, que debería ser lo más alta posible

durante la conidiación (Vezina et al., 1975).



La producción de conidios en medios solidificados o sólidos por hongos pertenecientes al

filo Ascomycota es normalmente inducida por el desarrollo de hifas que sobresalen en la

atmósfera (Adams et al., 1998). Sin embargo, muchos de estos hongos generan conidios

en cultivo líquido sumergido (un matraz de agitación o fermentador) si se emplea un medio

adecuado con nutrientes limitados (Vezina et al., 1975). El proceso de cultivo líquido

sumergido consiste en el cultivo de un organismo, en un medio líquido definido en un

tanque llamado fermentador, que puede ser aireado y / o agitado (Canteri y Ghoul, 2015a).

Este enfoque es más conveniente que el uso de medios sólidos o solidificados ya que de

esta manera se disminuyen los riesgos de contaminación y se puede generar un proceso

de escalamiento. Esta técnica fue adoptada por primera vez en 1946 al inducir el proceso

de conidiogénesis en fermentación sumergida para Penicillium notatum adicionando 2,5%

de cloruro de calcio en un medio definido de nitrato-sacarosa (Foster et al., 1946). Algunas

producciones reportadas se encuentran en la Tabla 2 - 1

Tabla 2 - 1 Producción de conidios y biomasa para diferentes especies de Penicillium.

Conidios/ml Biomasa

(g/L)

Tiempo

(h)

Vol.

(L) Especie Referencia

4.00x108 - 96 - P. notatum (Foster, et al, 1946)

8.00x107 8,00 80 0,025 P. notatum (Hadley y Harrold, 1958)

3.75X106 2,50 150 2 P.

chrysogenum (Riguelato et al.,1968)

5.88x106 0,20 72 1 P. notatum (Pitt y Poole, 1981)

6.30 x108 12,00 72 60 P. paxilli (Ibba et al., 1987)

2.30x107 8,12 168 0,050 P. oxalicum (Pascual et al., 1997)

1.60 x108 4,00 96 10 P.

camemberti

(Bockelmann et al.,

1999)

3.20 x108 2,20 168 0,050 P.

camemberti (Boualem et al., 2014)

5.00x106 6,40 168 0,050 P.

camemberti (Boualem et al., 2015)


La producción de conidios en fermentación sumergida tiene una serie de ventajas como

permitir un mayor control sobre las variables a evaluar, obtener resultados en poco tiempo

y bajos costos de medio, además se tiene la posibilidad de escalamiento, automatización

y obtención del producto sin operaciones posteriores de separación (Bockelmann et al.,

1999) pero los conidios producidos bajo estas condiciones tienen menor viabilidad y

eficacia (Pascual et al., 2000). Esta última desventaja presente en la fermentación líquida

no se presenta en la fermentación sólida o en medio solidificado, aunque en este sistema

(sólido) se tienen problemas como los costos de maquinaria, la esterilidad y el control de

humedad (Desfarges et al., 1987).

2.1.4 Variables que afectan el proceso de conidiogénesis

El comportamiento del crecimiento en procesos que implican microorganismos miceliales

es un parámetro importante que se debe tener en cuenta durante las fermentaciones

líquidas (Canteri y Ghoul, 2015a). La morfología macro y microscópica de hongos

filamentosos se puede modificar a través de control en variables como el pH, oxígeno

disuelto, agitación y alimentación. Teniendo en cuenta esto, la inducción del proceso de

conidiogénesis es sensible a ciertos tipos de estrés, inductores, variables físicas (aire, luz,

agitación) y limitación de nutrientes (Canteri y Ghoul, 2015a; Roncal y Ugalde, 2003). A

continuación se da una explicación detallada de cada variable.

2.1.5 Inductores

Los inductores son iones o compuestos que activan el proceso de conidiogénesis bajo

condiciones específicas; dentro de estos se encuentran, sales, ácidos y terpenoides. El ion

calcio, permite controlar el tiempo de inicio del proceso de conidiogénesis teniendo en

cuenta que este se relaciona con el tiempo de crecimiento vegetativo (Pitt y Poole, 1981).

En otros casos la inducción de la producción de conidios se asocia con la producción de

metabolitos secundarios como es el caso de la crisogenina, patulina y conidiogenona

producidas a partir de P. chrysogenum (Foster et al., 1946), P. paxilli (Ibba, Taylor,

Weedon, & Mantle, 1987) y P. cyclopium (Roncal et al., 2002) respectivamente. En algunos

casos se genera ácido oxálico como es el caso de P. bilaii (Cunningham & Kuiack, 1992),

o metil cetonas para el caso de P. roqueforti (Chalier y Crouzet, 1998) sustancias que

actúan como inductores. También se ha asociado la producción de conidios con la



inhibición de metabolitos secundarios como es el caso de la paxilina producida por P. paxilli

(Ibba et al., 1987).

Se ha demostrado que la asociación del calcio con el micelio sigue una cinética bifásica,

la cual consiste en una fase rápida independiente del metabolismo, seguida por una fase

dependiente del metabolismo más lenta. La primera fase se puede explicar como la

adsorción del catión a la superficie celular, mientras que la segunda fase muestra la

cinética de saturación la cual está principalmente mediada por mecanismos de transporte

activo (Canteri y Ghoul, 2015b; Ugalde y Pitt, 1986; Ugalde et al, 1990). El calcio al ser

adsorbido por las paredes inhibe el crecimiento celular; sin embargo, al encontrarse en

concentraciones subóptimas se promueve el crecimiento micelial (Bockelmann, Portius,

Lick, & Heller, 1999). En la Tabla 2 - 2 se presenta el intervalo de concentraciones de calcio

que ha sido reportado en la literatura como inductor de conidiogénesis para diferentes

especies de Penicillium, intervalo que varía entre 0,02 y 50 g/L.

Tabla 2 - 2 Concentraciones de calcio inductoras de conidiogénesis para diferentes especies de Penicillium.

Sustancia Concentración g/L Microorganismo Referencia

CaCl2 5 – 50 P. chrysogenum (Foster et al., 1946)

CaCl2 1,00 P. notatum (Hadley y Harrold, 1958)

CaCl2 10,0 P. griseofulvum (Morton, 1961)

CaCl2 1,11 P. notatum (Pitt y Poole, 1981)

CaCl2 0,99 P. cyclopium (Ugalde y Pitt, 1983)

CaCl2 20,00 P. Paxilli (Ibba et al., 1987)

CaCO3 20,00 P. Urticae (Pazout y Schröder, 1988)

CaHPO4 0,02 P. bilaii (Cunningham y Kuiack, 1992)

CaCl2 4,44 P. oxalixum (Pascual et al., 1997b)

CaCl2 1,60 P. camemberti (Bockelmann et al., 1999)

CaCl2 1,11 P. cyclopium (Roncal et al., 2002)


2.1.6 Variables físicas

El crecimiento de microorganismos filamentosos se ve afectado por condiciones físicas

como pH, temperatura, agitación y aireación, pero se deben tener en cuenta otros factores

físicos que afectan la morfología como la geometría del fermentador, los sistemas de

agitación, la tasa de esfuerzo cortante y la reología (Canteri & Ghoul, 2015).

Los hongos filamentosos pueden presentar dos tipos de crecimiento macroscópicos,

micelial y pellets, cada uno está asociado a una aplicación final determinada, es decir para

el caso de producción de metabolitos secundarios se prefiere el crecimiento en forma de

pellets ya que de esta manera se disminuyen las operaciones de separación posteriores,

mientras para el caso de los bioinsumos, donde el microrganismo es el producto final, es

necesario considerar un crecimiento homogéneo que permita una fácil aspersión en

campo. La morfología macroscópica se puede controlar por medio de condiciones

hidrodinámicas determinadas, como se puede observar en la Figura 2 - 4 donde

velocidades de aire superficial bajas y factores de fricción altos generan la formación de

pellets.

Figura 2 - 4 Factor de fricción en la columna de burbujeo como descriptor del régimen de flujo (García-Soto et al., 2006)

La condiciones apropiadas de aireación se ven afectadas por los iones presentes en el

medio, se ha encontrado que al aumentar la concentración de calcio disminuye la

concentración de oxígeno y se requiere aumentar la agitación o aumentar el flujo de aire

(Bockelmann et al., 1999).



Por otra parte un factor ambiental que afecta el proceso de diferenciación y la morfología

en hongos es el pH, ya que no solo influencia el proceso de conidiogénesis sino también

la formación de pellets (Whitaker & Long, 1973). El crecimiento vegetativo está asociado a

pH bajos, mientras la producción de conidios generalmente está asociada a pH cercanos

al neutro, en este caso es necesario controlar el pH ya que en condiciones cercanas a la

neutralidad se activa la formación de pellets (S. J. Pirt & Callow, 1959). En la Tabla 2 - 3

se encuentran las condiciones utilizadas en diferentes escalas para la producción de

conidios, se puede observar que las condiciones de aireación y agitación utilizadas son

generalmente bajas y en el caso de P. cyclopium no se utiliza agitación, y la temperatura

usualmente se mantiene en 25 °C.

Tabla 2 - 3 Variables físicas reportadas para cultivo sumergido de diferentes especies de Penicillium.

Microorganismo Aireación

vvm Agitación

rpm Temperatura

°C Volumen

L Referencia

P. notatum N.A 125 25 0,025 (Hadley y Harrold,

1958)

P. notatum 1 150 25 2,0 (Pitt y Poole, 1981)

P. cyclopium 0,5 --- 25 2,0 (Ugalde y Pitt,

1983)

P. cyclopium 1,5 --- 25 2,0 (Ugalde y Pitt,

1986)

P. Paxilli 1 367 24 60 (Ibba et al., 1987)

P. Urticae N.A 0,5

250 600

24

0,1 0,6

(Pazout y Schröder, 1988)

P. bilaii N/A 200 22 0,125 (Cunningham y Kuiack, 1992)

P. oxalicum N/A 150 25 0,050 (Pascual et al.,

1997b)

P. camemberti 0,3 100 25 10 (Bockelmann et al.,

1999)

P. cyclopium N/A 150 25 0,005 (Roncal et al.,

2002)

P. camemberti N/A 150 18-30 0,050 (Boualem et al.,

2014)


2.1.7 Limitación de nutrientes

La iniciación de la formación de los conidios para continuar con el crecimiento micelial y

posterior generación de nuevos conidios, se debe a un cambio en la composición de los

nutrientes o a la limitación de uno de los sustratos. El principal efecto de la composición

del medio se da en la transición de las etapas de crecimiento del microorganismo

(germinación, crecimiento vegetativo y conidiación), sin embargo los efectos de activación

o inhibición dependen de los componentes adicionados al medio. (Canteri y Ghoul, 2015).

Uno de los factores más importantes en el proceso de conidiogénesis es la deficiencia

nutricional ya que por medio de ésta se disminuye la tasa de crecimiento activando la

generación de estructuras de reproducción (Pitt y Poole, 1981; Roncal y Ugalde, 2003).

Bajo condiciones nutricionales y ambientales equilibradas, el crecimiento del hongo

permanece normalmente vegetativo. Sin embargo, si las condiciones de crecimiento

cambian y se desequilibran por la deficiencia nutricional y / o por cambios críticos en los

parámetros ambientales esenciales, el patrón de crecimiento vegetativo puede cambiar,

dando lugar a la formación de la morfología reproductiva asexual. El crecimiento se

considera desequilibrado cuando la tasa de crecimiento del organismo está limitada por

factores como la temperatura, concentración de oxígeno, dióxido de carbono y pH; sin

embargo el crecimiento desequilibrado no siempre da lugar al proceso de conidiogénesis,

por ejemplo la limitación de carbono puede causar autolisis (Smith et al., 1981).

La limitación de nitrógeno es el principal desencadenante de la coniodiogénesis (Znidarsic

y Pavko, 2001; Vezina et al., 1965). Algunas especies del género Penicillium generan

conidios bajo condiciones de limitación de la fuente de carbono y nitrógeno, para P.

cyclopium el agotamiento de nitrógeno y su relación con la concentración de calcio son los

factores más importantes que desencadenan el proceso de conidiogénesis, el agotamiento

del nitrógeno y la adición de calcio a un medio con alta relación C: N son las condiciones

que inducen este proceso (Pascual et al., 1997b). La producción de conidios en P.

griseofulvum es inducida por la transferencia del microorganismo a medios libres de

nitrógeno con altas concentraciones de calcio y azúcar (Morton, 1961). Sin embargo para

el caso de P. chrysogenum se encontró que el proceso de conidiogénesis se induce en

medios con limitación de glucosa (Righelato et al., 1968). Por otra parte se encontró para

P. griseofolvum que en ciertas condiciones, la privación de nitrógeno puede inducir



producción de conidios y este proceso puede revertirse completamente añadiendo un

nuevo suministro de nitrógeno en las primeras etapas del proceso (Morton, 1960); este

comportamiento se confirmó en P. candidum: mediante el control del consumo de nitrógeno

se observó que al agotarse completamente el nitrógeno del medio se desencadena la

producción de conidios, pero al adicionar nuevamente nitrógeno al medio se detiene este

proceso, reanudando el crecimiento vegetativo, con respecto a la fuente de carbono se

encontró para esta especie que las altas concentraciones de glucosa favorecen el

crecimiento vegetativo, mientras que las bajas concentraciones incrementan la formación

de conidios (Canteri y Ghoul, 2015)

Con respecto a la fuente de carbono es necesario tener en cuenta que el tipo y la

concentración de la fuente de carbono son importantes en la evolución y desarrollo de la

fermentación ya que afectan la cinética de crecimiento, la tasa de producción conidios y el

rendimiento final. La concentración inicial de glucosa afecta la longitud de los filamentos,

lo cual muestra que hay una relación entre la tasa específica de crecimiento y la frecuencia

de fragmentación (Papagianni, 1999). Adicional a esto, se debe considerar la fuente de

carbono apropiada para cada microorganismo ya que algunas especies de Penicillium

necesitan crecer con fuentes simples como monosacáridos, disacáridos y alcoholes

provenientes de azucares o complejas como polisacáridos por ejemplo almidón, celulosa,

pectina entre otros (Moss, 1987). En algunos casos los medios complejos con

concentraciones altas de sales generan mejores índices de conidiación; sin embargo, no

se han encontrado explicaciones de la utilidad de estas concentraciones en el medio para

mejorar este proceso (Vezina et al., 1965).

En la Tabla 2 - 4 se encuentran algunas composiciones de fuentes de carbono y nitrógeno

reportadas para el crecimiento de diferentes especies del genero Penicillium, se puede

observar que las fuentes de carbono simples como glucosa o sacarosa son comunes para

el proceso de conidiogénesis, mientras que las fuentes de nitrógeno usadas son nitrato de

sodio o potasio y sulfato de amonio.


Tabla 2 - 4 fuentes de carbono utilizadas en el proceso de conidiogénesis

Fuente carbono

Conc. Fuente

nitrógeno Conc. Microorganismo Referencia

Sacarosa 20 g/L NaNO3 6 g/L P. notatum (Foster et al.,

1946; Hadley y Harrold, 1958)

Sacarosa 5 g/L (NH4)2SO4 1 g/L Aspergillus niger (Broderick y

Greenshields, 1981)

Sacarosa 5 g/L NaNO3 1,3 g/L Aspergillus niger (Broderick y

Greenshields, 1982)

Sacarosa 30 g/L NaNO3 3 g/L P. paxilli (Ibba et al., 1987)|

Glucosa 50 g/L (NH4)2SO4 1,6 g/L P. griseofulvum (Bent y Morton,

1963)

Sacarosa 20 g/L - - P. notatum (Pitt y Poole,

1981)

Glucosa 5 g/L Extracto de

levadura 20 g/L P. roqueforti

(Chalier y Crouzet, 1998)

Glucosa 100 g/L C2H3O2NH4 2,1 g/L P. camembertii (Bockelmann et

al., 1999)

Glucosa 50 g/L KNO3 2,940 g/L

P. oxalicum

(Pascual et al., 2000)

Maltosa Glucosa

Sacarosa Almidon

Asparagina Peptona NaNO3 KNO3

P. sclerotigenum (Cutrim et al.,

2006)

Glucosa 4 g/L NH4Cl 1,8 g/L P. camembertii (Adour et al.,

2006)

Glucosa 50 g/L KNO3 1 g/L P. camembertii (Boualem et al.,

2014)

Glucosa 0,99 -

49,6g/L (NH4)2SO4 2,24 g/L P. camembertii

(Pazout y Schröder, 1988)

Glucosa 50 g/L 50 g/L

KNO3 -

2,3 g/L -

P. oxalicum (Pascual et al.,

1997a)

Glucosa Sacarosa Almidon

H. Arroz * S. Trigo *

20 g/L 20 g/L

21,6 g/L 21,3 g/L 27 g/L

Triptosa Ext. Levad* (NH4)2HPO4

KNO3

7,98 g/L 9,18 g/L 4,63 g/L 7,08 g/L

P. sp. HC1 (Gutierrez-Rojas

et al.,2015)

* H. arroz (Harina de arroz), S. Trigo (Salvado de Trigo), Ext. Levad (Extracto de levadura)



2.1.8 Régimen operacional

2.1.9 Lote

El crecimiento en cultivos por lote se produce en una cantidad limitada de nutrientes hasta

que el crecimiento se restringe por agotamiento de estos o desarrollo de condiciones

desfavorables. El crecimiento del lote se divide normalmente en varias fases. La primera,

la fase de adaptación (lag), es un período de preparación para el crecimiento que puede

requerir germinación de conidios, adaptaciones fisiológicas, síntesis de sistemas

enzimáticos necesarios para la utilización de sustrato, o eliminación de compuestos

inhibidores llevados con el inóculo (Prosser, 1995b).

La adaptación incluye la formación de enzimas y productos intermedios para apoyar la

reanudación del crecimiento. La duración de esta fase depende no sólo del estado

fisiológico del hongo, sino también de la morfología y el nivel del inóculo. Los inóculos de

conidios requieren un período de germinación (Smith & Calam, 1980), mientras que los

inóculos que presentan precipitación pueden requerir cierto grado de alteración mecánica

antes de la inoculación (Greasham, 1991).

La fase exponencial se caracteriza por un aumento significativo de la masa celular. La tasa

de crecimiento de las hifas depende no sólo de la cepa del hongo, sino también de las

condiciones fisicoquímicas del medio ambiente. Al igual que en los medios sólidos, el

crecimiento exponencial resulta de la auto catálisis mediante la producción exponencial de

ramas, cada una de las cuales se extiende a una velocidad lineal. Se produce una

reducción de la tasa de crecimiento específico cuando el hongo comienza a experimentar

un entorno de crecimiento desfavorable, tal como la limitación de un nutriente requerido,

el desarrollo de un valor de pH adverso o la acumulación de productos finales del

metabolismo que son inhibidores (Papagianni, 2004).

La fase estacionaria se puede definir de forma simplista como el equilibrio entre el aumento

de masa de hifas y su disminución. Sin embargo, si la masa de hifas acumula el material

de almacenaje intracelular durante la fase de crecimiento reducido, puede observar un

aumento ligero en la masa hifal durante el metabolismo endógeno de estos materiales de

almacenaje. Además, si las hifas empiezan a autolizarse, se puede esperar un incremento

en los productos de autólisis (Papagianni, 2004).


2.1.10 Continuo

En el cultivo por lotes, la velocidad de crecimiento es sólo constante durante la fase

exponencial, lo cual representa una limitación con respecto al estudio de la fisiología y las

propiedades de los organismos a tasas de crecimiento específicas submáximas . Esto se

puede conseguir usando un cultivo continuo, en el que se suministra medio fresco al cultivo

a una velocidad constante, mientras que el fluido de cultivo y la biomasa se eliminan a la

misma velocidad de tal modo que el volumen del cultivo permanece constante. Los

estudios de cultivo continuo han demostrado ser valiosos para los estudios fisiológicos,

pero la técnica no es ampliamente utilizada en industrias, a pesar de que puede

proporcionar una mayor productividad que el cultivo por lotes. Los principales problemas

son la necesidad de esterilizar grandes volúmenes de medio continuamente, el

mantenimiento de cultivos axénicos y la regresión de las cepas productoras (Prosser,

1995b).

2.1.11 Lote alimentado

La mayoría de las fermentaciones industriales a gran escala que implican hongos

filamentosos implican cultivo alimentado por lotes en el que la biomasa se cultiva

inicialmente en cultivo discontinuo hasta que el sustrato se utiliza completamente. Luego

se añade nutriente fresco, y se puede obtener el producto deseado, pero de una manera

diferente a la descrita en la sección anterior. Por ejemplo, se puede suministrar una forma

concentrada de un componente, o componentes, del medio original, en lugar de un medio

completo. De forma similar, se puede añadir un precursor del producto. El objetivo es

promover la formación de productos pero no necesariamente aumentar la concentración

de biomasa. El sustrato se convierte inmediatamente al entrar en el fermentador por los

altos niveles de biomasa activa. El metabolismo está dirigido hacia la formación del

producto, en lugar del crecimiento o a la inhibición del sustrato y la represión de catabolitos

se minimiza. El control máximo de los cultivos de lote alimentado se logra mediante la

adición de sustrato en momentos determinados por propiedades específicas del medio que

se monitorea continuamente (Prosser, 1995b).

Una diferencia importante entre el cultivo alimentado y continuo es que la tasa de

crecimiento específico no es constante en el primero; sin embargo, un análisis del cultivo



por lote alimentado predice el establecimiento de un estado pseudo-estacionario, en el cual

la tasa de crecimiento específico es igual a la velocidad de dilución; a diferencia de la

situación en un quimiostato, el volumen aumenta continuamente en el cultivo alimentado

en lote y, por tanto, disminuye la tasa de crecimiento específico (Pirt, 1975)

2.1.12 Modelos matemáticos

Un modelo matemático es una descripción de un proceso o sistema en forma matemática.

Las ecuaciones matemáticas describen las cinéticas de crecimiento, muestran los cambios

temporales en la biomasa u otras características de crecimiento; por lo tanto, estas

ecuaciones por si mismas son modelos matemáticos (Prosser, 1995b).

Se pueden hacer algunas distinciones entre cinética y otras formas de modelos

matemáticos de crecimiento fúngico. La primera, y más importante, se refiere a la función

del modelo. Las ecuaciones cinéticas se usan generalmente para describir los cambios en

las propiedades de un cultivo en la forma más simple y conveniente. En consecuencia, son

de naturaleza empírica y pueden basarse únicamente en datos experimentales. No

necesitan basarse en ningún conocimiento de los mecanismos de crecimiento

subyacentes, aunque este conocimiento aumentará su fiabilidad (Prosser, 1995b).

Los modelos generalmente funcionan como hipótesis cuantitativas, basadas en conjuntos

de supuestos relativos a un aspecto particular del crecimiento de los hongos, estas

predicciones son utilizadas como una base del trabajo experimental. Generalmente es

necesario verificar la concordancia entre los datos experimentales y los predichos, ya que

esta información proporcionará apoyo a las suposiciones subyacentes del modelo,

mientras que las discrepancias pueden dar lugar a la modificación o rechazo de estos

supuestos (Prosser, 1995b).

Por otra parte los bioprocesos en los cuales se utilizan hongos filamentosos normalmente

se llevan a cabo en fermentación sumergida, para este caso una descripción de todo el

proceso implica el modelamiento de la cinética microbiana y el comportamiento del reactor.

Este último incluye la descripción de los gradientes de concentración en el biorreactor, los

cuales son generados por el patrón de los flujos de la fase líquida y gaseosa. Además, la

descripción de los fenómenos de transferencia de masa es una parte importante en el

modelo de biorreactor, especialmente en los procesos donde se utilizan hongos


filamentosos, es necesario describir la transferencia de oxígeno de la fase de gas a la fase

líquida, ya que estos procesos son a menudo operados con limitaciones de transferencia

debido a la alta viscosidad obtenida durante el proceso de fermentación (Moser, 1988).

La fase biótica en un biorreactor está constituida por una población de células individuales

y por lo tanto es necesario combinar un modelo cinético para células individuales con un

modelo de población cuando la cinética de reacción global se va a cuantificar.

Generalmente se asume que todas las células en la población son idénticas, en este caso

la población puede ser descrita por el mismo vector de estado y se puede aplicar un modelo

de población simple (No segregado). Cuando la diversidad de las células individuales es

descrita en el modelo de población este es normalmente referido como un modelo

segregado. En muchos casos la cinética de las células individuales se hace como un

modelo no estructurado como por ejemplo el modelo de Monod. Estos modelos pueden

describir condiciones de crecimiento equilibradas bastante bien; sin embargo, fallan al

describir el crecimiento en condiciones de estado transiente, por ejemplo en operación por

lote alimentado. Al incluir información del estado celular se puede obtener un modelo

generalmente válido, capaz de describir el crecimiento tanto en estado estacionario como

en estado transiente. Los modelos en los cuales se incluye la información del estado celular

son normalmente llamados modelos estructurados (Nielsen, 1992).

El estado de la célula es determinado exclusivamente por su composición y es

teóricamente posible establecer un modelo estructurado que describa el comportamiento

celular completo, aunque generalmente se incluyen únicamente algunos componentes y

reacciones centrales según el sistema evaluado. El número de componentes intracelulares

incluidos en un modelo estructurado depende del objetivo del modelo que se desee

generar; habitualmente se usan de 2-5 hasta 20 modelos simples estructurados para la

simulación de los procesos microbiológicos examinando el comportamiento a nivel celular

(Nielsen, 1992; Tang et al., 2017).

Para algunos sistemas microbianos no se conocen los mecanismos exactos detrás de los

procesos de diferenciación, por ejemplo germinación de conidios y conidiación, por lo tanto

en estos casos puede ser valioso describir la cinética de forma individual y morfológica,

seguida por una descripción de conversión entre las diferentes formas morfológicas. Este

enfoque hace referencia a la estructura morfológica, y es una valiosa extensión del enfoque



tradicional del modelo estructurado intracelularmente, especialmente para la descripción

del crecimiento de hongos filamentosos (Nielsen, 1992)

En un modelo morfológicamente estructurado se dividen las células en un número finito Q

de formas morfológicas (o clases) y se asume que la composición intracelular es la misma

para todas las células en cada clase. Este tipo de modelos representa un vínculo entre los

modelos de población segregada y no segregada. Cuando Q=1 se tiene un modelo no

segregado y cuando Q → ∞ se tiene un modelo segregado (Nielsen, 1992).

2.1.13 Modelos de crecimiento para el género Penicillium spp.

A pesar de lo mostrado anteriormente, para el caso de hongos, debido a su crecimiento

filamentoso la complejidad de los modelos tiene mayor diversidad ya que se tienen en

cuenta parámetros como la morfología y la diferenciación (Prosser, 1995a). Por esta razón

para este tipo de microorganismos se encuentran modelos diferentes a los reportados para

bacterias, dentro de estos se encuentran los modelos morfológicos, que consideran el

crecimiento y la forma de la hifa. Los primeros modelos buscaban una relación entre forma

de la hifa y su tasa de crecimiento, asumiendo una forma básica de cilindro para esta

estructura, por lo cual la ecuación se desarrolló en términos del radio de la misma (Prosser

y Trinci, 1979).

En términos generales los modelos matemáticos reportados para el género Penicillium

están enfocados hacia la producción de biomasa o metabolitos secundarios principalmente

penicilina, enzimas como lipasa, debido a que estos productos son los más relevantes a

nivel industrial. Teniendo en cuenta esto se evidencia la necesidad de generar un modelo

para la producción de conidios, que son las estructuras de mayor tolerancia para la

formulación de un producto comercial y un modelo matemático permitiría predecir su

comportamiento y llevar a cabo de manera eficiente los procesos de escalamiento y

optimización.

Algunos modelos reportados para Penicillium están asociados a la producción de penicilina

a partir de P. chrysogenum desarrollados en lote alimentado; sin embargo, estos modelos

presentan diferentes niveles de complejidad: estructurado y mecanístico (Aynsley et al.,

1990), cinético (Nielsen y Jorgensen, 1996), estructurado (Paul y Thomas, 1996), con

multiplicidad cinética (Patnaik, 1999), estructurado con sustratos mixtos (Paul et al., 1998),


no estructurado mecanístico (Birol et al., 2002), macro cinético estequiométrico (Yuan et

al., 2010).

Para el caso de producción de biomasa se encuentran modelos como, no estructurado con

crecimiento diáuxico a partir de P. camembertii en lote (Amnare et al., 2005), morfológico

a partir de P. chrysogenum (Meyerhoff & Bellgardt, 1995), cinético (Monod) a partir de P.

chrysogenum por lote (Goudar & Strevett, 1998), segregado (lote alimentado) a partir de

P. chrysogenum (Tiller et al., 1994). Algunas de las ecuaciones propuestas para la

generación de biomasa se encuentran en la Tabla 2 - 5.

Tabla 2 - 5 Ecuaciones propuestas en la literatura para la generación de biomasa de Penicillium

Ecuaciones Simbolos Referencia

𝝁 =𝟏

𝒙

𝒅𝒙

𝒅𝒕

𝝁 =𝑳𝒐𝒈𝒆 𝟐

𝒕𝒅

𝜇 Tasa especifica de crecimiento

𝑡𝑑 tiempo duplicación 𝑥 Biomasa

(Righelato et al.,1968)

𝒅

𝒅𝒕(𝑮. 𝒙) =

𝒙𝒅𝑮

𝒅𝒕+𝑮𝒅𝒙

𝒅𝒕

𝑮 masa total de caldo 𝑥 Biomasa

(Heijnen et al., 1979)

𝒅𝒙

𝒅𝒕= 𝝁𝒙

𝑺

𝑲𝒙𝒙 + 𝑺

𝑪𝑳𝑲𝒐𝒙𝒙 + 𝑪𝑳

−

𝑿𝑽𝒅𝑽

𝒅𝒕

𝑉 volumen 𝐶𝐿 concentración

oxigeno

(Bajpai y Reuß, 1980)

𝒅𝑿

𝒅𝒕= 𝝁𝑿 − 𝑫𝑿

𝝁 = 𝝁𝒔𝒎𝒂𝒙𝑺

𝑲𝒙 + 𝑺

𝑋 biomasa 𝑆 Sustrato D: Dilucion

(Tiller et al., 1994)

𝝁 =𝝁𝒎𝒂𝒙𝑺

𝑲𝒙𝑿+ 𝑺

𝑋 biomasa

𝑆 Sustrato

(Menezes et al., 1994)

𝝁 =𝝁𝒎𝒂𝒙𝑺

𝑲𝒙𝑿+𝑺f

𝑋 biomasa 𝑆 Sustrato

(Meyerhoff y Bellgardt, 1995)

𝒅𝒙

𝒅𝒕=𝝁𝒎𝒂𝒙𝑺

𝑲𝒙𝑿+ 𝑺− 𝒌𝒅𝑿

𝑿 = 𝑿𝟎 + 𝒀(𝑺𝟎 − 𝑺)


𝑆0 Sustrato inicial 𝑋0 Biomasa inicial

𝐾𝑥 cte afinidad

(Goudar y Strevett, 1998)

𝝁 =𝝁𝒎𝒂𝒙𝒂𝟎𝑺

𝑲𝒙 + 𝑺

𝒂𝟎 Crecimiento activo (Paul et al., 1998)



Tabla 2 - 5 Ecuaciones propuestas en la literatura para la generación de biomasa de Penicillium (continuación)

Ecuaciones Simbolos Referencia 𝑑𝑥

𝑑𝑡= 𝜇𝑚𝑥 (1 −

𝑥

𝑥𝑚)

𝑥(𝑡) =𝑥𝑚

1 + (𝑥𝑚𝑥0− 1) 𝑒𝜇𝑚𝑡

𝑋0 biomasa inicial

𝑥𝑚 biomasa máxima 𝝁𝒎 tasa de crecimiento

máxima

(Van De Lagemaat y Pyle, 2005)

𝜇 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝑆

𝑛

𝐾𝑠 + 𝑆𝑛

𝑑𝑥

𝑑𝑡= 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑥 (1 −

𝑥

𝑥𝑚)

𝑆 = 𝑆0 + 𝑆1(1 − 𝑒𝜇𝑚𝑎𝑥𝑡)


𝝁𝒎𝒂𝒙 tasa de crecimiento máxima

𝑺𝟏 concentracion en el tiempo de sustrato 𝑺𝟎 Concentracion inicial de sustrato

(Ardestani et al., 2010)

𝜇 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝑆

𝐾𝑠 + 𝑆

𝑑𝑥

𝑑𝑡= (𝜇 + 𝜇𝑏𝑎𝑙𝑎𝑛𝑐𝑒) − 𝑀𝑥


𝑀 mantenimiento

(Yuan et al., 2010)

2.1.14 Rutas metabólicas asociadas a la generación de biomasa

La formación de biomasa se asume principalmente de ribulosa-5-Fosfato y Acetyl-CoA,

mientras la producción y consumo de energía únicamente en forma de ATP. No se usan

NADPH y FADH para simplificar el balance electrónico (Yuan, Liu, & Geng, 2010). Cabe

señalar que la red metabólica simplificada mostrada en la Figura 2 - 5 está lejos de ser

completa para los balances de ATP y NADH debido a que se ignoran muchas otras vías

(por ejemplo, la síntesis del producto). Sin embargo, se parte del supuesto que la

producción / consumo de ATP y NADPH son capturados por las rutas consideradas (Yuan

et al., 2010).


Figura 2 - 5 ruta metabólica para la formación de biomasa (Yuan et al., 2010)

En la formación de biomasa las principales rutas son:

Embden-Meyerhof-Parnas (EMP)

Pentosa fosfato

Ciclo de los ácidos tricarboxílicos

El proceso de formación de biomasa en términos metabólicos inicia cuando la glucosa

entra a la célula a través de la pared celular y es fosforilada a glucosa-6-fosfato (G6P). En

la ruta de Pentosa Fosfato, una pequeña porción de G6P es oxidada a ribulosa-5-fosfato

la cual es asimilada como biomasa. La parte restante de G6P es oxidada en la ruta EMP.

Como consecuencia de la glicólisis, se forma piruvato, el cual es oxidado a acetyl-CoA y

metabolizado en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA) (Godzeski y Stone, 1955).



A partir de la ruta metabólica explicada anteriormente se generan metabolitos como citrato,

α-cetoglutarato, succinil-CoA, malato y oxaloacetato formados en el ciclo TCA. Estos

metabolitos son usados para sintetizar constituyentes celulares o consumidos para

producir energía para el mantenimiento y crecimiento celular.(Jørgensen et al., 1995).

También se tiene en cuenta que acompañado con el crecimiento aerobio de micelio, la

cadena de respiración suple ATP y NAD constantemente(Smith et al., 1983).

2.1.15 Antecedentes de investigación

El aislamiento de Penicillium sp. codificado como HC1 y posteriormente identificado como

Penicillium pinophilum en el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional, se

obtuvo a partir de un tamizaje de microorganismos con actividad celulolítica en suelos

rizosféricos de cultivos de arroz en los departamentos de Tolima y Meta y en suelo

rizosférico y material vegetal de palma de aceite en descomposición, de las regiones de

Guainía y Vichada. A partir de estas muestras se obtuvieron un total de 436 aislamientos

bacterianos y 55 aislamientos fúngicos con actividad celulolítica. De estos últimos se

seleccionaron ocho aislamientos fúngicos (HC1, HC2, HC3, HC4, 7.4, 7.5, 7.5* y 8) con

base en los resultados de actividad enzimática en agar carboximetil celulosa (1% p/v), a

los que se les evaluó la producción de celulasas totales en medios líquidos y se

identificaron por claves taxonómicas. Se encontró que de los ocho aislamientos, cinco

pertenecen al género Penicillium, corroborando así la abundancia de este género en el

suelo y su protagonismo en la degradación de residuos celulósicos (Pedraza-Zapata et al.,

2016).

Los ocho aislamientos seleccionados fueron evaluados en condiciones de microcosmos

sobre tamo de arroz para determinar su capacidad de degradación, midiendo la producción

de CO2 durante sesenta días. Se encontró que con Penicillium pinophilum HC1 se

producen 140,33 ± 2,6 mgCO2/g tamo, superior a los demás aislamientos evaluados,

probablemente debido a su capacidad de producción de enzimas celulolíticas, resultados

que son reportados por Pedraza-Zapata et al. (2016). El tamo tratado con este

microorganismo fue incorporado al suelo y empleado para el crecimiento de plantas de

arroz en condiciones de invernadero, mostrando que esta práctica tiene una influencia

positiva en parámetros como peso seco del tallo, peso seco de la raíz, longitud del tallo y

longitud de raíz (Sanchez-Rodriguez, 2012).


Con base en lo anterior se estableció Penicillium pinophilum HC1 como un hongo

celulolítico y xilanolítico, y fue seleccionado por la alianza Biocultivos S.A – Universidad

Nacional de Colombia-IBUN, como principio activo de un bioinoculante utilizado para

acelerar la degradación de cosecha in situ0 (Gutiérrez, 2017).

Teniendo en cuenta que este aislamiento forma parte de un producto que será

comercializado se vio la necesidad de establecer las condiciones apropiadas de

crecimiento de este microorganismo en escala industrial, para esto inicialmente se

evaluaron las características morfológicas en medios sólidos encontrando que los conidios

obtenidos en este tipo de fermentación presentan porcentajes de germinación y tolerancia

térmica cercanos al 100 % (Gutiérrez, 2017). Posteriormente se evaluaron a escala

laboratorio los medios de cultivo líquido apropiados para el crecimiento de la cepa

seleccionada variando las fuentes de carbono y nitrógeno; a partir de estos resultados se

seleccionaron los medios con mejor producción de conidios, correspondientes a dos

fuentes de carbono (sacarosa y almidon) y dos fuentes de nitrógeno (Fosfato diamonio y

extracto de levadura) (Gutiérrez-Rojas et al., 2015). Adicionalmente se evaluaron

condiciones que inducen el proceso de conidiogénesis tales como la luz, concentraciones

de calcio (Rodriguez y Romero, 2014) y relaciones carbono nitrógeno (Datos sin publicar

(Duran, 2017) ). A partir de los resultados variando las relaciones C:N se encontró que la

mayor producción de conidios se da en fuentes de carbono complejas con relaciones C:N

altas, y la mayor tolerancia térmica a 50 °C se obtiene en fuentes de carbono complejas

con fuente de nitrógeno inorgánica; sin embargo, en el caso de las fuentes de carbono

simples se obtienen buenas producciones (1010 conidios/g) y tolerancias altas a 50°C

(58%) pero dependen de la concentración de carbono inicial (limitada) y la relación C:N

(alta) (Gutiérrez, 2017).

Teniendo en cuenta lo anterior en el presente proyecto se pretende obtener las condiciones

del medio de cultivo en las cuales se presenta la formación de conidios del aislamiento P.

pinophilum HC1, con el fin de generar un modelo matemático para el proceso de

conidiogénesis, ya que de esta manera se pueden mejorar las posteriores fases de

generación del producto, escalamiento y automatización.

3. Materiales y métodos

Esta investigación se dividió en 4 etapas; durante la primera etapa a través de ensayos

preliminares, se establecieron condiciones como medio de cultivo, inóculos y tiempo de

crecimiento; posteriormente, a partir de las condiciones establecidas se iniciaron los

ensayos de limitación de fuente de carbono y de nitrógeno a escala laboratorio (3 litros).

En la tercera fase se establecieron las condiciones para las cinéticas a escala piloto y los

valores iniciales para la iteración del modelo. Por último, con la información obtenida a

escala laboratorio y escala piloto se estableció el modelo y se realizó su validación a escala

piloto empleando una condición de operación diferente a las empleadas para su

establecimiento.

3.1.1 Microorganismo

El microorganismo utilizado durante el desarrollo de este trabajo fue el aislamiento

Penicillium pinophilum HC1, conservado como una suspensión de conidios (1x108

conidios/ml) en crioviales con glicerol al 20% a -20 C Se preparó un banco monospórico

(Anexo B-1), el cual fue caracterizado morfológicamente, macroscópicamente en medio

PDA y microscópicamente con azul de lactofenol.

3.1.2 Tren de inóculo

El tren de inóculo utilizado consta de tres fases, preinóculo, inóculo y producción. El

preinóculo se realizó en Erlenmeyer de 500 mL con 200 mL de medio harina de arroz

(Anexo A); se inoculó con 1 mL de suspensión de conidios y se incubó por 96 horas a 150

rpm y 25 °C. El inóculo consistió en 6 litros de medio sacarosa – cloruro de amonio (Anexo

A) inoculado con 200 mL de preinóculo e incubado a 25°C con aireación constante durante

96 horas. La producción de conidios se realizó en diferentes escalas 100 litros, 20 litros y

Capítulo 3. Materiales y métodos 31

4 litros. Se inocularon los medios bajos condiciones de asepsia, utilizando 2.5% de inoculo.

El medio utilizado y el tiempo de crecimiento variaron según cada caso.

3.1.3 Ensayos preliminares

Los ensayos preliminares constan de dos etapas, la selección del medio de cultivo y la

selección del porcentaje de inóculo, en cada una de estas etapas se realizaron las cinéticas

de sustratos, biomasa y conidios.

La selección del medio de cultivo se realizó a partir de dos medios denominados MB1 y

MB2 (Anexo A), el primer medio tiene como fuente de carbono sacarosa y el segundo

almidón, estos medios fueron seleccionados a partir de resultados previos del grupo de

investigación. (Gutierrez et al, 2017).

La selección del porcentaje de inóculo se realizó variando dos porcentajes de inóculo, 2,5%

y 5%, teniendo como variable de respuesta la generación de conidios en el medio.

Las fermentaciones se realizaron en recipientes de vidrio de 20 litros de capacidad con 15

litros de medio, a 25 °C, con aireación constante. Las cinéticas se realizaron durante un

periodo de 6 días con muestras cada 24 horas. Se cuantificó la biomasa, consumo de

sustrato, pH, recuento de conidios y se determinó la velocidad específica de crecimiento

máxima para cada experimento. Cada ensayo se realizó por triplicado.

3.1.4 Limitación por sustrato

Los ensayos de limitación por sustrato tuvieron como objetivo determinar el

comportamiento del microorganismo frente a diferentes concentraciones de fuente de

carbono y nitrógeno; para este caso se estableció un diseño de experimentos factorial

aleatorizado de dos variables con 4 niveles de concentración inicial de fuente de nitrógeno

((NH4)2HPO4) en un intervalo de 0,07 a 2,7 g/L y 5 niveles de concentración inicial de fuente

de carbono (sacarosa) en un intervalo de 0,274 a 2,5 g/L; las demás sales (Anexo A)

permanecieron constantes. El valor máximo de concentración que se usó para la fuente de

carbono se determinó por medio de ensayos previos.

Las fermentaciones se realizaron en recipientes de vidrio de 4 litros de capacidad con 3

litros de medio, a 25 °C, con aireación constante. Las cinéticas se realizaron durante un



periodo de 6 días con muestras cada 24 horas. Se cuantificó la biomasa, consumo de

sustrato, pH, recuento de conidios y se determinó la velocidad específica de crecimiento

máxima para cada experimento. Se utilizó como porcentaje de inóculo 2.5%. Cada ensayo

se realizó por triplicado. En la Tabla 3 - 1 se muestran las concentraciones utilizadas en los

ensayos a escala laboratorio.

Tabla 3 - 1 Concentraciones para los ensayos de limitación de sustrato

Ensayo sacarosa

g/L

fosfato di amónico

g/L

C/N

mol/mol

1 0,274 0,070 79,19

2 0,274 0,900 0,702

3 0,274 1,800 0,351

4 0,274 2,700 0,234

5 0,625 0,070 206,8

6 0,625 0,900 1,608

7 0,625 1,800 0,804

8 0,625 2,700 0,536

9 1,250 0,070 413,5

10 1,250 0,900 3,216

11 1,250 1,800 1,608

12 1,250 2,700 1,072

13 1,875 0,070 620,3

14 1,875 0,900 4,824

15 1,875 1,800 2,412

16 1,875 2,700 1,608

17 2,500 0,070 827,1

18 2,500 0,900 6,432

19 2,500 1,800 3,216

20 2,500 2,700 2,144


3.1.5 Fermentaciones a escala piloto (100 L)

Los ensayos para las cinéticas a escala piloto fueron desarrollados con operación por lote

en un biorreactor de 100 litros aireado. Se utilizaron 80 L de medio (Anexo A), el cual fue

esterilizado con vapor durante 40 minutos. El porcentaje de inóculo utilizado fue 2,5%. El

pH del medio permaneció libre y la temperatura en 25 °C. El flujo de aire se suministró

manteniendo la presión de entrada de aire en 13 psi y el periodo de fermentación fue de 2

días. Con muestreo cada 4 horas durante las primeras 12 horas.

Las concentraciones de fuente de carbono y nitrógeno se seleccionaron con base en los

resultados obtenidos en los ensayos de limitación, es decir se seleccionaron aquellos

ensayos en los cuales se obtuvo una mayor concentración de conidios. En los casos en

que estos valores fueron similares se realizó una discriminación por medio de pruebas de

tolerancia térmica y germinación.

3.1.6 Métodos analíticos

Para cada muestra se determinó concentración de biomasa, amonio residual, sacarosa

residual, conidios, y pH, con el fin de obtener la información necesaria para el ajuste del

modelo matemático, adicional a esto se determinó germinación, tolerancia térmica de los

conidios y morfología del microorganismo.

3.1.7 Cuantificación de biomasa

La biomasa se cuantificó por peso seco, tomando muestras de 10 ml por triplicado y

separando por filtración al vacío con membranas de tamaño de poro de 10 μm, luego esta

se dejó secar en horno a 80 °C hasta peso constante.

3.1.8 Cuantificación de sacarosa residual

La metodología aplicada para la determinación de azúcares reductores fue la técnica DNS

(Miller, 1959). Teniendo en cuenta que el medio tiene como sustrato sacarosa, se realizó

hidrólisis de la misma por medio de invertasa. Las concentraciones se determinaron

usando una curva de calibración previamente elaborada empleando sacarosa hidrolizada.



(ANEXO B-4). Luego de la reacción, las muestras fueron cuantificadas con un

espectrofotómetro Genesys 10s UV-Vis (Thermo Fisher scientific, USA).

3.1.9 Cuantificación de amonio residual

La concentración de amonio residual en el medio de cultivo se midió por el método de

Berthelot, (Gumel et al., 2012), en este método el hipoclorito y el fenol generan un

compuesto azul al reaccionar con amonio, el cual se puede cuantificar a 640 nm. Luego de

la reacción (ANEXO B-3), la coloración fue cuantificada con un espectrofotómetro Genesys

10s UV-Vis (Thermo Fisher scientific, USA). El amonio residual fue calculado por medio de

una curva de calibración con concentraciones de amonio conocidas.

3.1.10 Cuantificación de conidios

La cuantificación de conidios se realizó, filtrando la muestra a través de jeringas con

algodón, y realizando recuento de la suspensión obtenida en cámara de Neubauer a 40x

cada 24 horas

3.1.11 Tolerancia térmica

Se tomaron 6 alicuotas de 600 µL de suspensión de conidios de cada muestra en

Eppendorf de 1 mL, estas se obtuvieron por medio de filtración utilizando jeringas con

algodón y ajustando la concentración a 1x107 conidios/ml por centrifugación a 6000 rpm

durante 15 minutos. 3 de estas alícuotas se incubaron durante una hora a 45 °C y las

restantes se incubaron durante 1 hora a 50 °C empleando un baño termostatado.

Posteriormente en un área de 1 cm2 de agar-agua (19 g/L) se sembraron alícuotas de 10

µL y se incubaron durante 18 horas a 25 °C. Después se retiró el espacio delimitado de

agar y se observó al microscopio el número de conidios germinados y sin germinar. Todos

los ensayos se llevan a cabo por triplicado.

3.1.12 Modelo

La generación del modelo se realizó a partir de las cinéticas obtenidas en las

fermentaciones a escala laboratorio (4 litros); posteriormente este modelo fue ajustado con

parámetros teóricos adicionales relacionados con características metabólicas asociadas a


la generación de biomasa, por último se verifico la validez del mismo en escala piloto (100

litros).

3.1.13 Generación de parámetros

La generación de parámetros se realizó a partir de las derivadas de cada una de las

cinéticas; éstas se obtuvieron con el software Table curve 2d (Systat Software Inc, San

Jose Caifornia 2007)®. Posteriormente se estimaron los parámetros del modelo usando

todas las cinéticas simultáneamente; para esto se usó como función objetivo el criterio de

mínimos cuadrados (Ecuación 1) donde 𝑦𝑖 es el valor experimental, 𝑓(𝑥𝑖) es el dato

predicho por el modelo.

𝑅𝑆𝑆 =∑(𝑦𝑖 − 𝑓(𝑥𝑖))2 Ecuación 1

Para la generación del modelo se tuvieron en cuenta las siguientes restricciones:

1. Los sustratos limitantes son únicamente sacarosa y amonio

2. El proceso no tiene limitación de otros nutrientes

3. La temperatura (25 °C), la agitación y el aire son constantes, el pH no es controlado

4. El inóculo es biomasa libre de conidios.

Para la generación de los términos asociados a la tasa de crecimiento (𝜇) inicialmente se

probaron 7 modelos diferentes, mostrados en la Tabla 3 - 2; evaluando el ajuste de los

datos experimentales por medio de la comparación del coeficiente de correlación (R2).

Tabla 3 - 2 Modelos utilizados para la tasa de crecimiento

Modelo Ecuación Nombre

1 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠

𝑘𝑠 + 𝑠 Monod

2 𝜇𝑥 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠

𝑘𝑠 + 𝑠 𝑛

𝑘𝑛 + 𝑛

3 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠

𝑘𝑠 + 𝑠 (1 −

𝑠

𝑠𝑛)

4 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥

𝑠

𝑘𝑠 + 𝑠 +𝑠2

𝑘𝑖

Haldane



Tabla 3 – 2 continuación Modelos utilizados para la tasa de crecimiento

Modelo Ecuación Nombre

5 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 (1 − exp (−𝑠

𝑘𝑠)) Teisser

6 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 (𝑠𝑛

𝑘𝑠 + 𝑠𝑛) Moser

7 𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥 (𝑠

𝑘𝑠𝑥 + 𝑠) contois

A partir de los resultados obtenidos en el ajuste de los modelos para la tasa de crecimiento,

se realizó un análisis a través de los siguientes fenómenos biológicos :

1. Limitación de fuente de carbono en la generación de biomasa

2. Limitación de fuente de nitrógeno en la generación de biomasa

3. Limitación de fuente de carbono en la producción de conidios

Adicional a esto cada uno de los fenómenos se dividió en las diferentes fases de

crecimiento:

1. Fase de adaptación (Lag)

2. Crecimiento exponencial

3. Fase estacionaria

Teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente se evaluaron las siguientes constantes:

1. 𝑘𝑠, constante de afinidad para la fuente de carbono

2. 𝑘𝑛, constante de afinidad para la fuente de nitrógeno

3. 𝜇𝑚𝑎𝑥 tasa de crecimiento máxima asociada a la biomasa

4. 𝜇𝑝𝑚𝑎𝑥 tasa de crecimiento máxima asociada a la generación de producto

5. 𝑚1, mantenimiento asociado a la fuente de carbono

6. 𝑚2, mantenimiento asociado a la fuente de nitrógeno

Las constantes se evaluaron siguiendo el siguiente algoritmo de cálculo (Figura 3 - 1).


Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis



Continuación Figura 3 - 1 Algoritmo de cálculo modelo de conidiogénesis




3.1.14 Análisis de sensibilidad del modelo

El análisis de sensibilidad de modelo se realizó ajustando las ecuaciones propuestas a

cada uno de los perfiles de crecimiento y comparando los valores de las constantes

obtenidas. Se utilizó como variable de respuesta el valor de coeficiente de correlación (R2)

y la comparación de los valores obtenidos se realizó por medio de coeficiente de varianza.

3.1.15 Validación de modelo

La validación del modelo se realizó evaluando el coeficiente de correlación (R2) de los datos

experimentales y los generados por el modelo.

3.1.16 Análisis de estabilidad de modelo

Se realizaron análisis de estabilidad para el modelo seleccionado de la figura 3 - 1; este

análisis se realizó por demostración matemática teniendo como base el siguiente criterio.

𝑥(𝑡) es la función la función asociada a los diferentes fenómenos analizados en el modelo.

𝑥(𝑡) es solución estable si dado que 휀 > 0 tal que


|𝑥(𝑡) − �̅�(𝑡0)| < 휀 ∀ 𝑡 , 𝑡 > 0

Se llega a

|𝑥0 − �̅�0| < 휀 ^ 𝛿 ≥ 휀

La solución de las ecuaciones diferenciales se realizó tomando el sistema como problemas

de valor inicial.

4. Resultados y Análisis de Resultados

4.1.1 Ensayos preliminares

La fase experimental de este trabajo se realizó en medios aireados a diferentes escalas;

sin embargo, los resultados previos del grupo de investigación se desarrollaron a escala

Erlenmeyer, utilizando como inóculo una suspensión de conidios (Gutiérrez, 2017;

Gutiérrez et al., 2015; Duran, 2017; Tibasosa, 2014). Por esta razón, fue necesario realizar

una fase preliminar con el fin de conocer el comportamiento del microorganismo bajo las

nuevas condiciones establecida, determinar el medio de cultivo y establecer ell porcentaje

de inóculo con el cual se va a trabajar.

Para determinar el medio de cultivo, se estableció como variable de respuesta la máxima

producción de conidios, para esto se realizaron los perfiles de producción de conidios de

cada uno de los medios a evaluar Figura 4-1. A partir de esto se encontró que, la

producción máxima de conidios en los medios MB1 C:N 50:1, MB1 C:N 25:1 y MB2 C:N

10:1 fue de 1.68x105, 4.93x104 y 2.45x104 conidios/ml respectivamente, esta concentración

se alcanza después de la hora 96 de cultivo para cada caso. Adicionalmente se logró

evidenciar que en sistemas con aireación la producción de conidios es mejor para medios

con fuentes de carbono simples (sacarosa) con mayor relación C:N, que para medios con

fuentes de carbono complejas (almidón), al obtener un incremento en la producción a la

hora 120 del 16%

Capítulo 4. Resultados 43

0 24 48 72 96 120 1440

5.0104

1.0105

1.5105

2.0105

MB1 C:N 50:1

MB1 C:N 25:1

MB2 C:N 10:1

Tiempo (h)

Co

nid

ios/m

l

Figura 4 - 1 Producción de conidios en diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%)

A partir de los resultados obtenidos en los ensayos preliminares, se seleccionó el medio

de MB1, ya que en este medio se obtuvo una producción de conidios mayor comparada

con los medios MB1, este medio generó 1,68x105 conidios/ml.

Los resultados mostrados en la Figura 4 - 1, permiten sugerir un efecto de la fuente de

carbono del medio y la relación C:N del mismo sobre la generación de conidios, donde se

evidenció que la producción de conidios aumenta al aumentar la relación carbono-

nitrógeno utilizando fuentes de carbono simples, en este caso la relación C:N 50:1 del

medio MB1 generó la mayor producción de conidios en el tiempo de fermentación

evaluado.

Estas observaciones coinciden con resultados previos de la línea de investigación a escala

laboratorio en Erlenmeyer, en los cuales se encontró que la mayor producción de conidios

se da a relaciones de C:N 50 y 80 utilizando bajas concentraciones de fuente de carbono

(Gutiérrez, 2017). Aunque las concentraciones iniciales son diferentes y afectan el

comportamiento del microorganismo, estos resultados nos permiten establecer una

tendencia preliminar del microorganismo respecto a estas variables. Un efecto similar se

reportó previamente en estudios con Penicllium camemberti, en donde la presencia de una

relación C:N de 122:1 con glucosa inicial de 100 g/L y C:N 168:1 con glucosa inicial de 60

g/L permitieron la producción de 1.6x108 conidios/ml y 3.2x108 conidios/ml respectivamente

(Bockelmann et al., 1999; Boualem et al.,2014 ).

Para el caso de la producción de biomasa se encontró que la mayor concentración de

biomasa obtenida fue de 6,047±0,46 g/L, 5,26±0,12 g/L y 7,53±0,59 g/L para los medios



MB1 C:N 50:1, MB1 C:N 25:1 y MB2 C:N 10:1 respectivamente (Figura 4 - 2). A partir de

estos datos se identifica una disminución del 18.7% en el crecimiento de biomasa para el

caso del medio MB1 al aumentar la relación carbono-nitrógeno.

Los resultados obtenidos para la generación de biomasa (Figura 4 - 2), permiten evidenciar

que la fermentación de P. pinophilum HC1 es dependiente de la relación carbono nitrógeno

utilizada en el medio. Un efecto similar se observó en ensayos a escala Erlenmeyer en

donde se encontró que las menores concentraciones de biomasa se obtenían a mayores

relaciones C:N con menores concentraciones iniciales de fuente de carbono (Gutiérrez,

2017).

Este comportamiento es similares al obtenido en P. camemberti ya que para una relación

C:N 122.3:1 se producen 4.0 g/L de biomasa (Bockelmann et al., 1999) y para una C:N

168.44:1 se tiene una biomasa de 2.2 g/L, (Boualem et al., 2014). Con base en esto, los

autores indican una reducción de la biomasa del 45% al aumentar la relación carbono

nitrógeno y disminuir la fuente de carbono de 100 g/L a 50 g/L.

0 24 48 72 96 120 1440

2

4

6

8 MB1 C:N 25:1

MB1 C:N 50:1

MB2 C:N 10:1

Tiempo (h)

Bio

masa g

/L

Figura 4 - 2 Producción de biomasa para diferentes medios de cultivo (inóculo 2,5%)

Estos resultados, podrían permitir asumir un comportamiento general a los hongos del

genero Penicillium en términos de producción de conidios y biomasa en asociación a la

relación C:N utilizada durante la fermentación. Sin embargo, evaluaciones realizadas en

P. chrysogenum han demostrado comportamientos contrastantes a los obtenidos para P.

pinophilum HC1 y los reportados para P. camemberti. Por ejemplo, se ha observado que


P. camemberti produce 8 g/L de biomasa en relaciones C:N de 10:1 (Hadley & Harrold,

1958) y 2.5 g/L de biomasa en condiciones de C:N de 5:1 para estas condiciones el sistema

se encontraba bajo condiciones de limitación de fuente de carbono (Riguelato et al., 1968),

en este caso se definió una disminución del 50% en la relación C:N lo cual ocasionó una

disminución en la generación de biomasa del 68.75 %.

Teniendo en cuenta lo anterior, se puede observar que el género Penicillium según la

especie varía su comportamiento respecto a la concentración inicial de fuente de carbono

y la relación C:N. Para el caso de P. pinophilum se logró evidenciar que sacarosa es una

fuente de carbono adecuada para la generación de conidios, sin embargo las mayores

producciones se obtuvieron al disminuir la concentración de la misma.

Respecto a los experimentos en los cuales se evaluó el efecto del porcentaje de inóculo

(Figura 4 - 3) se observa que el aumento de inóculo favorece la generación de biomasa, al

tener una diferencia del 30% en la hora 120 de crecimiento, sin embargo para todos los

casos se observa que la fase exponencial de crecimiento se da en las primeras 24 horas.

0 24 48 72 96 120 1440

2

4

6MB1 (50:1) 2,5%

MB1 (50:1) 5%

MB2 2,5%

MB2 5%

Tiempo (h)

Bio

masa g

/L

Figura 4 - 3 Cinética de biomasa variando el porcentaje inicial de inóculo

Para los medios evaluados se observó que al disminuir el porcentaje de inóculo los

recuentos de conidios aumentan (Figura 4 - 4), es decir se tiene un aumento del 10% en

la concentración de conidios al disminuir el inóculo del 5% al 2,5%, adicional a esto bajo

las condiciones evaluadas el proceso de diferenciación se da a partir de la hora 96 de

crecimiento.



0 24 48 72 96 120 1441.0100

1.0101

1.0102

1.0103

1.0104

1.0105

1.0106

MB1 (50:1) 2,5%

MB1 (50:1) 5%

MB2 2,5%

MB2 5%

Tiempo (h)

co

nid

ios/m

l

Figura 4 - 4 Cinética de producción de conidios variando el porcentaje inicial de inóculo

El inóculo utilizado para la evaluación del proceso de conidiogénesis generalmente es una

suspensión de conidios obtenida de medios sólidos (Bockelmann et al., 1999; Broderick y

Greenshields, 1981; Pitt y Poole, 1981; Roncal et al., 2002); sin embargo, en este caso se

decidió iniciar la fermentación a partir de biomasa ya que en pruebas realizadas durante la

fase de exploración (resultados no mostrados en este trabajo), se evidenció que al iniciar

las fermentaciones con conidios provenientes de fermentaciones sólidas el proceso de

germinación de los mismos no es eficiente, es decir el microorganismo permanece por

largos periodos (10 días) en la fase previa a la germinación de los mismos y la generación

de nuevos conidios en medios aireados no se observa. Por otra parte, para garantizar que

el inóculo sea solamente biomasa el microorganismo debe estar en un medio libre de

calcio, esto también fue evidenciado en ensayos previos del grupo de investigación

(resultados sin publicar).

Se evaluó el porcentaje de inóculo ya que está reportada la influencia de este en el proceso

de conidiogénesis (Roncal et al., 2002), teniendo en cuenta que se pasa de un medio libre

de calcio a un medio con fuente de calcio es necesario controlar la cantidad de inóculo con

la cual se inicia el proceso, de lo contrario la producción de conidios no es favorable, la

inducción por iones calcio se da a través de pulsos del mismo en el tiempo, este tiempo se

puede reducir por medio del inóculo (cantidad o concentración) (Hadley y Harrold, 1958).

Los resultados preliminares permitieron confirmar la influencia de la fuente de carbono y el

porcentaje de inoculo en el proceso de conidiogénesis, adicional a esto a partir de estos

datos se establecieron las condiciones para iniciar los ensayos en escala de 3 litros, las


cuales son medio MB1 según el diseño de experimentos de la Tabla 3 - 1 e inoculo al 2.5%,

ya que bajo estas condiciones se obtuvo la mayor producción de conidios. Estas variables

permanecieron fijas durante el desarrollo del trabajo.

4.1.2 Ensayos con limitación de sustratos a escala laboratorio (3 litros)

Los ensayos de limitación se llevaron a cabo en escala de 3 litros con aireación constante

a 25 °C; para estos se utilizó el medio y el porcentaje de inóculo seleccionados en los

ensayos mostrados anteriormente.

Para este caso a partir del diseño factorial se evaluaron las cinéticas de biomasa, sustratos

y producto con el fin de establecer el modelo no estructurado no segregado, además de

seleccionar la concentración inicial de los medios que se evaluaron en escala piloto.

A partir de la Figura 4 - 5 se puede observar que la biomasa es dependiente de la

concentración inicial de sacarosa y fosfato de amonio obteniendo las mayores

productividades en las condiciones de 1.875 g/L de sacarosa y 2.7 g/L de fosfato de

amonio.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,51,0

1,52,0

2,5

Pro

ductivid

ad d

e B

iom

asa g

/Lh

Sac

aros

a in

icia

l g/L

Fosfato de amonio inicial g/L

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

Sacarosa g/L

0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Fosfa

to d

e a

monio

g/L

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Productividad de biomasa g/Lh

Figura 4 - 5 Comportamiento de la productividad de biomasa variando las

concentraciones iniciales de fosfato de amonio y Sacarosa

Con respecto a la tasa de crecimiento se observó que la mayor fue de 0,1838 h-1 para las

concentraciones de sustrato 2,700 g/L fosfato de amonio y 1,875 g/L sacarosa, además de

tener un comportamiento tipo monod al variar la concentración de sacarosa (figura 4 - 6)



y la concentración de fosfato de amonio (figura 4 – 7). Resultados similares fueron

obtenidos para P. chrysogenum WIS 54-1255 bajo condiciones de limitación de glucosa

(glucosa inicial inferior a 20 g/L) en un cultivo continuo de dos litros (Riguelato et al., 1968).

A partir de los resultados obtenidos del crecimiento de microorganismo se pueden

establecer condiciones nutricionales favorables para el proceso de conidiogénesis de esa

especie, por ejemplo con respecto al rendimiento en biomasa se puede observar que las

mayores productividades se obtienen en el medio con sacarosa inicial 1.875 g/L (Figura 4

- 5), pero las concentraciones de conidios obtenidas son bajas en estas condiciones

(Figura 4 - 10); este comportamiento es similar al reportado para P. sclerotigenum, donde

los autores al evaluar el efecto de la interacción carbono-nitrógeno en el crecimiento

encontraron que el mejor estado nutricional está asociado al crecimiento micelial y que

esta condición no es necesariamente la mejor para la producción de conidios,

habitualmente estas condiciones inhiben el proceso de reproducción (Cutrim et al., 2006).

Algunos autores afirman que para que la conidiación se produzca en hongos filamentosos

debe haber un control del patrón normal de crecimiento vegetativo. Tal cambio puede ser

promovido por la limitación de la tasa de crecimiento(Smith et al., 1981). Con base en esto

se hallaron las tasas de crecimiento para cada uno de los sistemas (Tabla 4 – 1 y Tabla 4

– 2 ), con el fin de evaluar por medio del coeficiente R2 el comportamiento del sistema.

0.000 0.625 1.250 1.875 2.5000.0

0.1

0.2

0.30,007

0,9

1,8

2,7

Concentracion Sacarosa (g/L)

µ (

1/h

)

Fosfato amonio g/L

Figura 4 - 6 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación fuente de nitrógeno


Tabla 4 - 1 Valores de tasa de crecimiento maxima y constante de afinidad por fuente de

carbono

Fosfato amonio g/L 0,007 0,9 1,8 2,7

𝜇𝑚𝑎𝑥 0,07301 0,1099 0,1076 0,07172

0,01007 0,03312 ~ 1.483e-016 0,01692

R2 0,8593 0,6573 0,7524 0,9543

Por otra parte, comparar el intervalo encontrado para la tasa de crecimiento del

microorganismo (0,07 – 0,24 h-1) coincide con los resultados reportados por diferentes

autores para el mismo género (Tabla 4 - 3). Sin embargo, se observó bajo las tasas de

crecimiento encontradas son más altas (incluir porcentaje) que las reportadas en sistemas

para P. chrysogenum con limitación de glucosa (Righelato et al., 1968), esto permite inferir

que para el caso del género Penicillium la tasa de crecimiento depende no solo de la

especie con la cual se esté trabajando sino también de la fuente de carbono utilizada y las

condiciones de crecimiento establecidas para el sistema.

0.0 0.9 1.8 2.70.0

0.1

0.2

0.30,245

0,625

1,25

1,875

2,5

Concentración fosfato de amonio (g/L)

µ (

1/h

)

Sacarosa g/L

Figura 4 - 7 Tasa de crecimiento (μ) ensayos de limitación fuente de carbono

Tabla 4 - 2 Valores de tasa de crecimiento máxima y constante de afinidad por fuente de

nitrogeno

Sacarosa g/L 0,245 0,625 1,25 1,875 2,5

𝜇𝑚𝑎𝑥 0,1077 0,2207 0,2456 0,08951 0,07086

𝑘𝑛 0,2869 0,1219 5,2550 0,1134 0,1134



R² 0,6755 0,9858 0,9971 0,8868 0,9890

Tabla 4 - 3 Valores de tasa de crecimiento de biomasa y otros metabolitos secundarios para Penicillium sp.

𝝁𝒎𝒂𝒙 (𝟏/𝒉) producto Referencia

0,11 Penicilina (Bajpai y Reuß, 1980)

0,06 Penicilina (Tiller et al., 1994)

0,04 Penicilina (Tiller et al., 1994)

0,18 Penicilina (Heijnen et al., 1979)

0,11 Penicilina (Genon y Saracco, 1992)

0,023-0,075 Biomasa (Righelato et al., 1968)

0,130 Penicilina (Menezes et al., 1994)

0,07 Ácido micofenolico (Ardestani et al,. 2010)

0,078 Penicilina (Meyerhoff y Bellgardt, 1995)

0,130 Biomasa (Goudar y Strevett, 1998)

0,033 Penicilina (Paul et al,. 1998)

0,092 Penicilina (Birol et al., 2002)

0,17 Tanasa (Van De Lagemaat y Pyle, 2005)

0,05 Penicilina (Yuan et al., 2010)

0,167 Biomasa (Gougouli y Koutsoumanis, 2010)

A partir de los perfiles generados se determinó el consumo de sacarosa para cada uno de

los medios (Figura 4 - 8) con base en estos resultados se logró evidenciar que el consumo

de sacarosa es proporcional a la sacarosa inicial suministrada al medio y no es

dependiente de la concentración inicial de fosfato de amonio en el medio, excepto para el

medio con concentración inicial de fosfato de amonio cercana a cero, en este caso el

consumo de sacarosa presentó una disminución para las concentraciones iniciales de

1,875 g/L y 2,5 g/L de sacarosa.


0,27

4

0,62

51,

25

1,87

52,

5

0.000

0.005

0.010

0.015

0.0200,007

0,9

1,8

2,7

(NH4)2PO4 g/L

Sacarosa g/L

Sacaro

sa c

on

su

mid

a g

/Lh

Figura 4 - 8 Comportamiento del consumo máximo de sacarosa escala 3L

Con respecto a los resultados obtenidos para el consumo de fuente de carbono se puede

evidenciar que a mayor disposición de fuente de carbono el consumo aumenta , ya que

bajo estas condiciones se genera un mayor crecimiento del microorganismo como se

mostró anteriormente, sin embargo se debe tener en cuenta que el consumo de fuente de

carbono no está asociado únicamente a la generación de biomasa, esta fuente es usada

también para biosíntesis y mantenimiento (Adour et al., 2006), también se ha reportado

para otras especies como P. chrysogenum WIS 54-1255 que la fuente de carbono se usa

principalmente como fuente de energía, los autores llegaron a esta conclusión al aumentar

la concentración por encima de la cantidad necesitada para mantenimiento, adicional a

esto afirman que se obtienen conidios y conidióforos si la cantidad de glucosa es similar a

la cantidad requerida para mantenimiento (Righelato et al., 1968),

Al evaluar el consumo de amonio se encontró que para los diferentes medios evaluados el

microorganismo consume en promedio el 50% de la fuente de amonio suministrada (Figura

4 - 9).



0,00

70,

91,

82,

7

0

20

40

60

80

1000,274

0,625

1,875

2,5

Sacarosa g/L

Fosfato de amonio g/L

Am

on

io c

on

su

mid

o %

Figura 4 - 9 Porcentaje de amonio consumido a las 144 horas escala 3 L

Adicional a esto se logró evidenciar que el consumo de amonio en algunos casos es

independiente de la concentración de sacarosa inicial en el medio, como en los medios

con fosfato de amonio inicial 0,007 g/L y 1,8 g/L, sin embargo para casos como el medio

0.625 g/L sacarosa y 0.9 g/L de sacarosa el consumo de fosfato de amonio fue del 96%

(Figura 4 - 9).

En cuanto al consumo de amonio a partir de la Figura 4 - 9 se puede observar que el

microorganismo consume en promedio el 50% de la fuente de nitrógeno proporcionado,

este efecto es similar al reportado para P. camemberti para este caso los autores afirman

que la limitación de nitrógeno no tiene un efecto en la conidiogénesis ya que la fuente de

nitrógeno estuvo presente hasta el final de la fermentación y el consumo de la misma fue

del 30 al 50 % (Bockelmann et al., 1999).

Para el caso de la producción de conidios se evidenció que esta variable es dependiente

de la concentración inicial de sacarosa en el medio, obteniendo las mayores producciones

de conidios cuando la concentración de la fuente de carbono es cercana a cero (Figura 4

- 10). En la Figura 4 - 10 se encuentran los valores máximos de producción de conidios

para cada una de las concentraciones de sacarosa y fosfato de amonio evaluado, en este

caso se observó que la mayor producción se encuentra en el intervalo 1x106 a 3.8x106


conidios/ml en los medios con limitación de carbono más alta.

0,0

5,0e+5

1,0e+6

1,5e+6

2,0e+6

2,5e+6

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,00,5

1,01,5

2,0

Conid

ios/m

l

Sac

aros

a g/

L


0,0

5,0e+5

1,0e+6

1,5e+6

2,0e+6

2,5e+6

Sacarosa g/L

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Fo

sfa

to d

e A

mo

nio

g/L

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0

5e+5

1e+6

2e+6

2e+6

conidios/ml

Figura 4 - 10 Comportamiento de los conidios generados respecto a las concentraciones iniciales de fosfato de amonio y sacarosa

A partir de estos resultados se puede decir que el proceso de conidiogénesis para P.

pinophilum es dependiente de la concentración inicial de fuente de carbono ya que al

aumentar la concentración de sacarosa en el medio se disminuye la producción de

conidios. Un comportamiento similar fue reportado para P. chrysogenum en este caso los

autores reportan que el procesos de conidiogénesis en esta especie se dan principalmente

por limitación de nitrógeno, pero para un aislamiento (WIS 54-1255) encontraron que la

limitación por fuente de carbono es necesaria en la producción de conidios (Righelato et

al., 1968). También fue reportada la inducción por limitación de fuente de carbono para P.

camemberti, este efecto fue evaluado con tres concentraciones de glucosa, los autores

encontraron que al disminuir la cantidad inicial en el medio se obtenía una mayor

concentración de conidios y al usar un medio sin glucosa observaron que el proceso de

conidiogénesis era eficiente (Bockelmann et al., 1999)

En otros casos como P. oxalicum se obtuvieron niveles máximos de conidiación al limitar

la cantidad de nitrógeno y añadir calcio los autores concluyeron que el agotamiento del

nitrógeno y la adición de calcio a un medio con alta relación C: N son los factores que

inducen la conidiación (Pascual et al., 1997). Este efecto también fue observado en P

griseofulvum y P. chrysogenum (Morton, 1961), sin embargo como se ha mostrado para P.

pinophilum la cantidad de nitrógeno en el medio no es significativa si la concentración de

sacarosa se encuentra en concentraciones bajas , esto se puede verificar al observar el

comportamiento del microorganismo bajo diferentes concentraciones de fuente de



nitrógeno, donde no se da un efecto significativo en términos de la producción de conidios

en concentraciones cercanas a cero de fuente de carbono, para las demás

concentraciones se puede observar que la concentración de nitrógeno en el intervalo

evaluado (0.007 – 2.7 g/L) genera variaciones de máximo 32%.

Adicionalmente, como se puede observar en la Error! Reference source not found.1 para

casos como 0,625 y 2,5 g/L de sacarosa se observa una mayor producción de conidios en

la condición de 0.9 g/L de fosfato di amonio, sin embargo para los dos condiciones

restantes 1,25 y 1,875 g/L de sacarosa el efecto es contrario ya que en esta concentración

de fosfato de amonio presenta la menor concentración de conidios bajo las condiciones

evaluadas, a partir de esto se puede evidenciar que la producción de conidios se puede

optimizar en términos de las condiciones iniciales de fuente de carbono y nitrógeno,

aunque es necesario evaluar bajo estas condiciones la influencia de las variables que se

mantuvieron constantes durante el desarrollo del diseño experimental.

0.07

0.90

1.80

2.70

0.07

0.90

1.80

2.70

0.07

0.90

1.80

2.70

0.07

0.90

1.80

2.70

0.07

0.90

1.80

2.70

0

2

4

6

80,274

0,625

1,25

1,875

2,5

sacarosa g/L


Lo

g c

on

idio

s/m

l

Figura 4 - 11 Producción máxima de conidios para las diferentes condiciones evaluadas

La evaluación por limitación de carbono para la producción de conidios se realizó en 7

perfiles de crecimiento asociados a los ensayos 2, 3, 4, 7, 8, 15 y 16. En este caso se

encontraron valores biológicamente estables para los ensayos 2, 3, y 4 como se puede

observar en la Tabla 4 - 18.


Todos los resultados se analizaron estadísticamente por medio del software Sigma Plot ®

(Systat Software Inc, San Jose Caifornia 2007) . Para cada una de las variables de

respuesta se realizó una prueba Anova de dos variables con el fin de identificar el efecto

que tienen la sacarosa inicial, el amonio inicial y la interacción de los dos sobre cada una

de las variables evaluadas.

Para el caso del rendimiento de la biomasa y el consumo de sacarosa se encontró que

todas las variables y su interacción son significativas con un valor de p<0,0001 pero la de

mayor significancia es la concentración inicial de sacarosa, para el caso del consumo de

amonio todas las variables y su interacción también son significativas, pero en este caso

la de variable de mayor significancia es la concentración de amonio inicial. Sin embargo,

para el caso de la producción de conidios la concentración de sacarosa inicial es la variable

significativa con un valor de p<0,0001. (Tabla 4 – 4)

Tabla 4 - 4 Resultados análisis de varianza (ANOVA), para generación de biomasa, producción de conidios, consumo de sacarosa y consumo de amonio.

Biomasa Conidios Consumo de

Sacarosa Consumo de

Amonio

Factor F Valor p F Valor p F Valor p F Valor p

a Sacarosa

121,83 < 0,0001 19,86 < 0,0001 372,19 < 0,0001 7,29 0,0051

b Amonio

21,48 < 0,0001 2,05 0,1283 48,66 < 0,0001 72,59 < 0,0001

ab 3,85 0,0013 0,89 0,5623 21,54 < 0,0001 2,71 0,0131

La concentración inicial de carbono y nitrógeno tienen un efecto en las variables de

respuesta evaluadas (Biomasa y producción de conidios) (Tabla 4 - 4); para el caso de la

biomasa la concentración de sacarosa tiene un efecto significativo sobre esta variable, este

comportamiento se relaciona con los balances estequiométricos del sistema donde se

evidencia que el reactivo limite es la sacarosa (ANEXO E). A pesar de que se ha reportado

que la producción de biomasa se relaciona directamente con la concentración de carbono

y nitrógeno inicial (Duarte, 1995), para este caso específico las concentraciones de

nitrógeno evaluadas no presentan una influencia significativa en el crecimiento del



microorganismo, probablemente esto se debe a que el sustrato limitante en este caso es

la sacarosa y las cantidades de amonio utilizadas se encuentran en todos los casos en

exceso.

Adicional a esto, al realizar el análisis estadístico por medio de ANOVA se encontró que

únicamente la concentración inicial de sacarosa es significante en la producción de

conidios con un valor p< 0.0001 pero el fosfato de amonio no es significante ya que

presenta un valor p de 0.1283 (Tabla 4 - 4).

Con base en los resultados mostrados anteriormente se seleccionaron los medios que se

utilizaron en la escala de 100 litros, teniendo en cuenta que la variable de respuesta es la

mayor producción de conidios y que en esta la concentración de sacarosa inicial es la que

tiene influencia. Se escogió como medios de evaluación uno por cada concentración de

sacarosa evaluada, cada uno de ellos se nombró como ensayos A, B, C, D y E (Tabla 4 -

5).

Para los casos en los cuales se observaron recuentos sin diferencias significativas se le

realizo a las muestras pruebas de tolerancia térmica y se seleccionaron aquellos medios

que presentaran tolerancias mayores

Tabla 4 - 5 Concentraciones seleccionadas para los ensayos en reactor de 100 L

Ensayo

limitación

Ensayo

Escala piloto

Sacarosa

g/L

Fosfato diamonio

g/L

Relación

C/N

4 A 0,274 2,700 0,234

7 B 0,625 1,800 0,804

11 C 1,250 1,800 1,608

15 D 1,875 1,800 2,412

18 E 2,500 0,900 6,432

Se evaluó el porcentaje de germinación y tolerancia térmica a 45 °C y 50 °C (Tabla 4 - 6)

para los ensayos en los cuales no se encontró una mayor cantidad de conidios entre cada

uno de los bloques analizados, los bloques se analizaron respecto a la concentración inicial

de fuente de carbono. En el caso de los medios con mayor limitación de fuente de carbono,

se encontró una tendencia entre la concentración de fosfato de amonio y el porcentaje de

germinación, donde a mayor concentración de fosfato de amonio se encontró un mayor


porcentaje de germinación del microorganismo, la misma tendencia se observó en cuanto

a la tolerancia térmica. Para los ensayos asociados a las concentraciones iniciales de

sacarosa 1,25 y 2,5 g/L de sacarosa no fue necesario realizar pruebas térmicas ya que

únicamente con el criterio de concentración de conidios se seleccionó el medio con mayor

producción; sin embargo, para los demás medios al realizar las pruebas de germinación y

tolerancia se observó que la concentración apropiada de fosfato de amonio es 1,8 g/L.

Tabla 4 - 6 Resultados germinación y tolerancia térmica ensayos escala 3 litros

Germinación Tolerancia 45 °C

ensayo Sacarosa

g/L Fosfato

diamonio g/L C/N Promedio Desv. Est. Promedio

Desv. Est.

1 0,274 0,070 24,78 90,23 1,960 27,07 1,498

2 0,274 0,900 2,579 97,50 1,015 33,63 1,662

3 0,274 1,800 1,279 97,23 0,802 50,80 1,473

4 0,274 2,700 0,860 98,67 0,737 80,70 1,539

5 0,625 0,070 206,8 N/A N/A N/A N/A

6 0,625 0,900 5,884 0 0 0,00 0,000

9 1,25 0,007 413,5 - - - -

10 1,25 0,070 11,77 - - - -

11 1,25 0,900 5,836 - - - -

12 1,25 1,800 3,922 - - - -

13 1,875 0,070 620,3 0 0 0 0

14 1,875 0,900 17,60 N/A N/A

15 1,875 1,800 8,754 76,57 2,084 0 0

16 1,875 2,700 5,884 0 0 0 0

17 2,5 0,070 827,1 - - - -

18 2,5 0,900 23,53 - - - -

19 2,5 1,800 11,67 - - - -

20 2,5 2,700 7,845 - - - -

Para cada uno de los ensayos mostrados anteriormente se realizaron observaciones

morfológicas, por medio de un microscopio óptico y tinciones con azul de lactofenol, en

este caso se encontró que las estructuras de diferenciación se formaban bajo condiciones

de limitación de nutrientes (Figura 4 - 12 B), mientras que en los medios sin limitación de

nutrientes predomina el crecimiento vegetativo (Figura 4 - 12 A)



El crecimiento de los hongos depende de condiciones nutricionales y ambientales, si estas

son equilibradas el microorganismo permanecerá en estado vegetativo (Figura 4 - 12 A) ,

de lo contrario el patrón de crecimiento puede cambiar dando lugar a la formación de

morfología asexual (Figura 4 - 12 B). Este cambio se puede dar por deficiencia nutricional

(Smith et al., 1981), en este caso la diferenciación ocurre al pasar el microorganismo de

un medio en equilibrio (sin limitación de nutrientes) a un medio con baja concentración de

fuente de carbono y nitrógeno. Este comportamiento se observó en Penicillium pinophilum

HC1 ya que se observó crecimiento micelial para los medios sin limitación y diferenciación

para los medios con limitación de nutrientes.

Figura 4 - 12 A. Crecimiento vegetativo en medio sin limitación (40x). B. Diferenciación en medio limitado sacarosa y amonio (100x).

A B


4.1.3 Ensayos a escala piloto 100 litros

Los ensayos a escala piloto se llevaron a cabo en reactor de 100 litros, manteniendo la

presión de entrada a 13 psi, sin agitación mecánica, y temperatura de 25 °C; para estos

ensayos se utilizó el medio y el porcentaje de inóculo seleccionados en los ensayos

preliminares (Sección 4.1.1), los medios utilizados fueron los reportados en la Tabla 4 - 5.

Para cada ensayo se realizaron cinéticas durante 48 horas tiempo en el cual se alcanza la

fase estacionaria; este tiempo se estableció a través de ensayo previos (resultados no

mostrados). Para cada caso se establecieron las cinéticas de biomasa, sustratos y

producto.

El comportamiento de la biomasa en el tiempo para el reactor de 100 litros presentó una

fase exponencial durante las primeras 24 horas, alcanzando una concentración máxima

de biomasa de 4,88 g/L para el caso del ensayo E y una cantidad mínima de 0,3 g/L para

el caso del ensayo A (Figura 4 - 13), es decir la mayor producción de biomasa está

asociada al medio con mayor concentración de sacarosa.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

1

2

3

4

5

60,274 2,700

0,625 1,800

1,250 1,800

1,875 1,800

2,500 0,900

Tiempo (h)

sacarosa

g/L

sacarosa

g/L

sacarosa (NH4)2PO4

g/L g/L

Bio

masa (

peso

seco

) g

/L

Figura 4 - 13 Biomasa producida en fermentación de 100 L

Considerando que al realizar el cambio de escala las cinéticas de crecimiento se

modificaron. Por esta razón, se decidió hacer una comparación para los medios evaluados

entre las dos escalas (Tabla 4 - 7). Encontrando que al cambiar de escala la biomasa

máxima presenta una reducción en promedio del 56% excepto para el ensayo E en el cual

la biomasa máxima se duplicó, sin embargo estos valores de biomasa en el reactor de 100

litros se obtuvieron en menores tiempos esto implica que el rendimiento de esta variable



aumentó en algunos casos como el ensayo B, C y E mientras que para los ensayos A y D

los rendimientos disminuyeron.

La biomasa máxima producida en las dos escalas evaluadas (Tabla 4 - 7) se puede

observar que el rendimiento de la biomasa generada en el reactor de 3 litros es 2 veces

mayor que en el reactor de 100 litros, probablemente esto se debe a que este

microorganismo necesita un mayor control en cuanto a la reología del medio y el estrés

hidrodinámico que tiene durante su crecimiento, especialmente en los casos de limitación

de nutrientes, un efecto similar fue observado para P. chrysogenum al variar diferentes

aireaciones en diferentes escalas encontraron que el flujo de aire utilizado ocasiona una

disminución en la producción de biomasa (Makagiansar et al., 1993).

Tabla 4 - 7 Comparación de biomasa máxima producida en el reactor de 3 y 100 L (Ensayo A 0,274 g/L sacarosa 2,700 g/L fosfato diamonio, Ensayo B 0,625 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo C 1,250 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo D 1,875 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo E 2,500 g/L sacarosa 0,900 g/L fosfato diamonio)

Ensayo

Biomasa máxima (3 litros)

Biomasa máxima (100 litros)

Diferencias

g/L h g/L h g/L h g/Lh Biomasa* Productividad*

A 2,9676 24 0,1277 0,3433 48 0,0072 -88% -94%

B 5,1088 144 0,0361 2,0550 24 0,0856 -60% 137%

C 3,0726 96 0,0330 2,3442 24 0,0977 -24% 196%

D 5,1471 48 0,1090 2,4550 48 0,0511 -52% -53%

E 2,3538 24 0,1017 4,8850 24 0,2035 108% 100%

* El negativo indica los porcentajes asociados a reducción de biomasa o rendimiento

Las cinéticas obtenidas en el reactor de 100 litros respecto al amonio residual (Figura 4 -

14) muestran que el consumo de amonio se da durante las primeras 24 horas, luego

permanece estable en el medio. Este tiempo coincide con la fase exponencial de

crecimiento del microorganismo.

Adicional a esto se puede observar que después de la hora 24 de crecimiento se inicia una

fase de muerte, en el caso de microorganismos miceliales este proceso está asociado con


la autolisis, debido a que agota la fuente de carbono disponible en el medio. La autolisis

fúngica es un proceso multietapa, el cual tiene en cuenta la permeabilización parcial de la

membrana celular y las fugas de material intracelular en etapas posteriores (White,

McIntyre, Berry, & McNeil, 2002), este proceso se observa principalmente durante el

crecimiento apical, ya que la célula bajo condiciones de estrés migra los nutrientes hacia

las puntas, con el fin de fortalecer las paredes de las estructuras de reproducción (Kikuma,

Arioka, & Kitamoto, 2007). Estas características de muerte celular fúngica han sido

reportadas en procesos industriales como la producción de cefalosporinas y penicilinas

(White, 1999)(Reyes, Martinez, Alfonso, Copa-Patino, & Soliveri, 1990; White et al., 2002).

Este comportamiento es importante para la producción de conidios ya que como se

mencionó anteriormente se debe tener una disminución en la biomasa para obtener una

mayor producción de conidios, adicional a esto se ha reportado en A. oryzae que la

autolisis ocurre durante la formación de conidióforos y conidios, los autores afirman que

los componentes intracelulares se reconstituyeron mediante un proceso autofágico para

que las hifas aéreas se diferenciaran en células específicas como vesículas de

conidióforos, fiálides y conidios (Kikuma et al., 2007).

El comportamiento del amonio residual en el reactor de 100 litros se puede observar en la

Figura 4 - 14, a partir de la cual se puede decir que el mayor consumo de nitrógeno se da

durante las primeras 24 horas de crecimiento pasado este tiempo se estabiliza el sistema,

este tiempo coincide en algunos casos con los tiempo de mayor producción de biomasa,

con esto se puede decir que el crecimiento de biomasa está asociado con el nitrógeno

disponible del medio pero no es un factor limitante del sistema. Esto se puede comprobar

con el balance estequiométrico (Anexo E) del sistema, en el cual se observa que el reactivo

limitante en la producción de biomasa es la fuente de carbono.

Adicional a esto el consumo de nitrógeno está relacionado con la sacarosa disponible en

el medio, ya que en los medios con mayor limitación se encuentran residuales de nitrógeno

mayores, es decir el microorganismo crece en proporción a los nutrientes suministrados.



0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500.0

0.2

0.4

0.6

0.80,274 2,700

1,875 1,800

0,625 1,800

1,250 1,800

2,500 0,900

tiempo h

Sacarosa (NH4)2PO4 g/L g/L

am

on

io g

/l

Figura 4 - 14 Amonio residual en la fermentación de 100 litros

Para el caso del porcentaje de amonio consumido en cada escala se puede observar que

el consumo es similar excepto los dos últimos ensayos D y E, los cuales corresponden a

las concentraciones más altas de sacarosa evaluadas, adicional a esto se observa que en

promedio el consumo de sacarosa en el reactor es de 58.2%.

Tabla 4 - 8 Comparación porcentaje de amonio consumido ensayos de 3 y 100 L (Ensayo

A 0,274 g/L sacarosa 2,700 g/L fosfato diamonio, Ensayo B 0,625 g/L sacarosa 1,800 g/L

fosfato diamonio, Ensayo C 1,250 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo D

1,875 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo E 2,500 g/L sacarosa 0,900 g/L

fosfato diamonio)

Ensayo Amonio consumido (3 litros)

% Amonio consumido (100 litros)

%

A 62 56

B 60 60

C 55 63

D 70 38

E 51 74


Para el caso de los perfiles generados en términos de sacarosa residual se observó una

tendencia similar a la obtenida para el caso del amonio donde el mayor consumo se da

durante las primeras 24 horas (Figura 4 - 15). También se observa que para todas las

escalas al finalizar el ensayo permanece un residual cercano al 50% de la sacarosa

adicionada al inicio.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 500

1

2

3

0,625 1,800

1,250 1,800

1,875 1,800

2,500 0,900

0,274 2,700

Tiempo h

Sacarosa (NH4)2PO4

Sacaro

sa g

/L

Figura 4 - 15 Sacarosa residual para la fermentación de 100 litros

Por otra parte, el consumo de sacarosa en los ensayos del reactor de 100 litros es mayor

comparado con el del reactor de 3 litros, en la escala de 100 litros el consumo de sacarosa

se incrementa en promedio 50%, el aumento de consumo de sacarosa está asociado al

crecimiento celular por lo tanto se puede relacionar esta variable inversamente con la

producción de conidios.

Para el caso de la producción de conidios en el fermentador de 100 litros se evidenció que

la generación de conidios se da a partir de la hora 24 y la mayor producción al igual que

en la escala de 3 litros está en el medio con mayor limitación de glucosa (

Figura 4 - 16).



0 12 24 36 480

2.0104

4.0104

6.0104

8.0104

2.0105

4.0105

6.0105

8.0105

0,274 2,700

0,625 1,800

1,250 1,800

1,875 1,800

2,500 0,900

tiempo h

Sacarosa (NH4)2PO4

g/L g/Lco

nid

ios/m

l

Figura 4 - 16 Producción de conidios en fermentación de 100 L

A partir de las cinéticas obtenidas en el reactor de 100 litros para la producción de conidios,

mostradas en la

Figura 4 - 16 se puede observar que la producción de conidios se da a partir de la hora 24

para todos los casos, sin embargo para el caso del medio con limitación de sacarosa

(Medio A) la producción de conidios a la hora 48 es 1,4 veces mayor comparado con lo

obtenido en los demás medios bajo las mismas condiciones, esto indica que la limitación

de fuente de carbono induce el proceso de conidiogénesis pero los rendimientos aumentan

si la concentración de sacarosa inicial en el medio es cercana a cero, esto coincide con los

resultados reportados para P. chrysogenum donde a pesar de ser común la inducción en

medios libres de nitrógeno (Morton, 1961) para el caso de la cepa nativa WIS 54-1255 la

producción de conidios se da en medios limitados de glucosa.

Al comparar las concentraciones de conidios obtenidas en las dos escalas se observa que

al realizar el cambio de escala se da una reducción de entre el 9% y el 26% (Tabla 4 - 9),

sin embargo, estas concentraciones se obtienen en menores tiempos lo cual implica que

las productividades en algunos casos se dupliquen.


Tabla 4 - 9 Comparación producción de conidios en escala de 3 y de 100 L (Ensayo A

0,274 g/L sacarosa 2,700 g/L fosfato di amonio, Ensayo B 0,625 g/L sacarosa 1,800 g/L

fosfato di amonio, Ensayo C 1,250 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato diamonio, Ensayo D

1,875 g/L sacarosa 1,800 g/L fosfato di amonio, Ensayo E 2,500 g/L sacarosa 0,900 g/L

fosfato di amonio)

Ensayo

Producción máxima conidios (3 litros)

Producción máxima conidios (100 litros)

Diferencia

log𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠

𝑚𝑙 h log

𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠𝑚𝑙ℎ

log𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠

𝑚𝑙 h log

𝑐𝑜𝑛𝑖𝑑𝑖𝑜𝑠𝑚𝑙ℎ

% *

A 6,4649 144 0,0449 5,8663 48 0,1222 -9%

B 5,1027 144 0,0354 4,1761 48 0,0870 -18%

C 5,3921 72 0,0748 4,8751 48 0,1016 -10%

D 5,1357 72 0,0713 4,3979 48 0,0916 -14%

E 5,5682 144 0,0387 4,0969 48 0,0854 -26%

* El negativo indica los porcentajes asociados a reducción de conidios

En los medios de cultivo seleccionados el microorganismo presentó producción de

conidios; sin embargo, la concentración obtenida fue inferior en periodos de tiempo más

cortos que los presentados en los ensayos de 3 litros como se puede observar en la Tabla

4 - 9; esta disminución está entre el 10-26%. Probablemente este efecto se debe al cambio

en las condiciones reológicas del sistema; este comportamiento es similar al reportado por

otros autores respecto al efecto que tiene el estrés mecánico y la aireación sobre la pared

celular de las hifas, en algunos casos se ha encontrado que bajo algunas condiciones se

puede generar ruptura de la pared celular lo cual implicaría una reducción en la tasa de

crecimiento y en diferenciación (White et al., 2002)

En este caso se puede decir que el proceso de conidiogénesis está relacionado con la

cantidad de biomasa generada por el microorganismo, es decir el medio A, presenta

mayores productividades en cuanto a la producción de conidios, pero la biomasa generada

es cercana a cero, esto comprueba el comportamiento obtenido en la escala anterior,

donde se evidenció el efecto que tiene el crecimiento vegetativo sobre la diferenciación y



como los medios con limitación en la fuente de carbono y nitrógeno disminuyen el

crecimiento micelial.

Adicional a esto se logró evidenciar que, las mejores condiciones para la producción de

conidios se encuentran en medios limitados de fuente de carbono, en la Figura 4 - 15 se

encuentra la cinética de sacarosa residual en el medio, para este caso se observó que el

mayor consumo de sacarosa se da durante las primeras 24 horas, lo cual coincide con el

comportamiento de consumo de la fuente de nitrógeno. Al comparar el comportamiento de

sacarosa residual con la producción de conidios se puede observar que la generación de

conidios se da en el momento en que se estabiliza el consumo de fuente de carbono.


4.1.4 Modelo matemático

El modelo matemático desarrollado está compuesto por un sistema de ecuaciones

diferenciales asociadas al comportamiento cinético del microorganismo y una ruta

metabólica asociada a la generación de biomasa reportada para P. chrysogenum por Yuan

et al. (2010). El modelo generado durante el desarrollo de este trabajo se caracteriza por

ser el primer modelo cinético para la generación de conidios de una cepa de Penicillium.

La anterior afirmación se puede realizar debido a que los modelos reportados para este

género están asociados principalmente a la producción de metabolitos secundarios como

la penicilina (Aynsley et al., 1990; Nielsen y Jorgensen, 1996; Paul y Thomas, 1996;

Patnaik, 1999; Paul et al., 1998; Birol et al., 2002; Yuan et al., 2010). Adicionalmente, el

modelo generado hace parte del proceso de obtención de un producto biológico celulolítico

de uso agrícola el cual tiene como base de formulación las estructuras de reproducción

asexual (conidios) de Penicillium pinophilum.

Para la generación del modelo, se analizó el comportamiento del microorganismo en

condiciones de limitación de carbono variando la concentración inicial de nitrógeno, como

se mencionó en la sección 3.1.4 esto se realizó por medio de un diseño factorial utilizando

el medio MB1. A partir de este diseño se obtuvieron cinéticas para cada una de las

variables a considerar en el modelo, sustratos, producto y biomasa.

El modelo está constituido por cuatro ecuaciones diferenciales de parámetros en su

mayoría no lineales. Las ecuaciones son capaces de reproducir el crecimiento del hongo,

la evolución de conidios producidos y la degradación de nutrientes sacarosa y fosfato de

amonio.

Los principales supuestos del modelo son:

- Temperatura contante en el medio

- Aireación constante

- El nutriente limitante es el carbono

- La fuente de nitrógeno no es limitante



Biomasa

La evolución de la biomasa se definió por un balance de masa dinámico, se considera una

tasa de crecimiento específica y un término de muerte para el hongo. Se asumió una

cinética de muerte de primer orden.

La primera estimación de modelo se realizó a partir de los modelos de descritos en la Tabla

3 - 2, para este caso se determinaron los parámetros de cada ecuación, solucionando el

sistema de ecuaciones simultáneamente para todos los perfiles de crecimiento, los valores

obtenidos se encuentran reportados en la Tabla 4 - 10.

Tabla 4 - 10 Constantes obtenidas para los diferentes modelos aplicados

parámetro modelo

1 modelo

2 modelo

3 modelo

4 modelo

5 modelo

6 modelo

7

𝝁𝒎𝒂𝒙 0,0097 0,0180 0,0113 0,2877 0,0096 0,0110 0,0110

𝒌𝒔 0,0010 0,0100 0,0100 0,0100 0,0100 0,0100 0,0100

𝒏 ó 𝒌𝒏 -- 0,1000 0,1955 0,0029 -- -- --

Al realizar el análisis de sensibilidad de las constantes para cada una de los perfiles de

crecimiento, se encontró que debido a la complejidad del sistema las constantes no son

adecuadas para el sistema, esto se comprobó comparando cada una las constantes entre

si por medio del coeficiente de varianza. Como se muestra en la Tabla 4 - 11 los

coeficientes obtenidos son altos para considerar adecuados los parámetros generados.

Los resultados del análisis de sensibilidad se encuentran en el Anexo F.

𝑑𝑥

𝑑𝑡= 𝜇𝑥 Ecuación 2


Tabla 4 - 11 Coeficientes de varianza de las constantes obtenidas según el análisis de sensibilidad realizado.

parámetro modelo

1 modelo

2 modelo

3 modelo

4 modelo

5 modelo

6 modelo

7

𝒌𝒅 1214% 223% 127% 38% 61% 75% 94%

𝐦𝟏 453% 321% 92% 94% 78% 259% 145%

𝐦𝟐 636% 240% 107% 150% 214% 228% 265%

𝝁𝒎𝒂𝒙 366% 148% 77% 49% 69% 69% 98%

𝒌𝒔 256% 99% 43% 57% 70% 103% 119%

𝒏 ó 𝒌𝒏 -- 71% 21% 11% -- 34% --

𝒌𝒊 -- -- -- 31% -- -- --

𝝁𝒎𝒂𝒙 456% 104% 11% 30% 55% 87% 84%

Teniendo en cuenta lo anterior se decidió realizar el análisis del sistema por fenómenos

biológicos, utilizando como principal factor la limitación de carbono y nitrógeno. Donde

𝜇𝑚𝑎𝑥 es la velocidad específica de crecimiento máxima cuando 𝑠 ≫ 𝐾𝑆 y la concentración

de los demás nutrientes es constante, 𝐾𝑆 es el valor de la concentración de sustrato

limitante en la que la velocidad específica de crecimiento es la mitad de su valor máximo y

𝑠 la concentración de sustrato en el medio. En la literatura para modelos de crecimiento de

Penicillium sp, el modelo de limitación ha sido ampliamente estudiado para mostrar el

crecimiento micelial (Yuan et al., 2010).

Para el caso de la biomasa se tiene una clara influencia en la tasa de crecimiento por la

limitación de fuente de carbono y nitrógeno como se observa en la figura 4 - 17, es decir

es necesario que los dos términos se encuentren en el sistema de ecuaciones.



0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

0,20

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,51,0

1,52,0

µ (

1/h

)

Fos

fato

de

amon

io g

/L

Sacarosa g/L

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18


0,5 1,0 1,5 2,0 2,5

Sacaro

sa g

/L

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

0,04

0,06

0,08

0,10

0,12

0,14

0,16

0,18

Figura 4 - 17 Comportamiento de la tasa de crecimiento respecto a las concentraciones iniciales de fosfato de amonio y sacarosa

Con base en lo anterior se seleccionó la Ecuación 3 para predecir el comportamiento de la

tasa de crecimiento donde el primer término hace referencia a la tasa de crecimiento

máximo, el segundo término está relacionado con la limitación por fuente de carbono

(sacarosa) y el tercer término hace referencia a la limitación por fuente de nitrógeno.

𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠


𝑘𝑛 + 𝑛 Ecuación 3

La Ecuación 3 corresponde al modelo 2 evaluado previamente, como se observó en la

Tabla 4 - 11 solucionar el modelo con todos los perfiles al tiempo no es una estrategia

adecuada debido a la complejidad del sistema. Teniendo en cuenta esto, es necesario

evaluar las constantes bajo los siguientes supuestos:

1) La evaluación para generación de biomasa se realiza inicialmente sobre la fase

exponencial de los perfiles de crecimiento (Ecuación 2)

2) Limitación por carbono, asumiendo exceso de fuente de nitrógeno tal que 𝑘𝑛 ≫ 𝑛,

generando que el segundo término tienda 1, por lo tanto la ecuación asociada a la

tasa de crecimiento queda reducida a la Ecuación 4; para solucionar esta ecuación

únicamente se consideran aquellos perfiles de crecimiento que presentan limitación

por fuente de carbono, se seleccionaron los perfiles en los cuales al finalizar la

fermentación se tenía nitrógeno residual. A partir de esto se encuentran los valores

de 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠.


𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠

𝑘𝑠 + 𝑠 Ecuación 4

3) Limitación por nitrógeno, asumiendo exceso de fuente de carbono tal que 𝑘𝑠 ≫ 𝑠,

generando que el segundo término tienda 1, por lo tanto la ecuación asociada a la

tasa de crecimiento queda reducida a la ecuación 5 Error! Reference source not

found.; para solucionar esta ecuación únicamente se consideran aquellos perfiles

de crecimiento que presentan limitación por fuente de nitrógeno, se seleccionaron

los perfiles en los cuales al finalizar la fermentación no se tenía nitrógeno residual.

Para este caso se mantiene el valor de 𝜇𝑚𝑎𝑥 encontrado previamente y se itera el

valor de 𝑘𝑛

𝜇 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑛

𝑘𝑛 + 𝑛 Ecuación 5

La evaluación por limitación de carbono se realizó en 15 perfiles de crecimiento asociados

a los ensayos 2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 18, 19 y 20, las concentraciones de estos

ensayos se encuentran en la Tabla 3 - 1. Se tomo como valor de inicialización el promedio

obtenido de los valores de la tabla 4 – 1 y 4 – 2. Al realizar el análisis de sensibilidad a este

sistema usando como función objetivo el coeficiente de correlación R2 se encontró que

para todos los ensayos se obtuvieron valores de 𝜇𝑚𝑎𝑥 y 𝑘𝑠 coherentes a los reportados por

otros autores y a los calculados previamente para cada ensayo (

Tabla 4 - 12). Con el fin de obtener un solo valor se generó un 𝜇𝑚𝑎𝑥 promedio de 0,1872

y un 𝑘𝑠 de 0,05765, se verificó este nuevo valor nuevamente para los perfiles de



crecimiento encontrando valores de R2 de 0,8464 a 0,9834 para 13 de los perfiles

evaluados (Tabla 4 - 13).

Tabla 4 - 12 Valores 𝝁𝒎𝒂𝒙 y 𝒌𝒔 análisis de sensibilidad limitación de carbono

Ensayo 𝝁𝒎𝒂𝒙 𝒌𝒔 R2

2 0,0091 0,0850 0,8674

3 0,2342 0,2341 0,8349

4 0,1240 0,0026 0,8586

7 0,1533 0,0096 0,7103

8 0,1537 0,0096 0,6848

10 0,0495 0,0123 0,9208

11 0,0360 0,0010 0,7395

12 0,1788 0,0225 0,7167

14 0,1500 0,0700 0,9763

15 0,1500 0,0700 0,9681

16 0,1500 0,0700 0,9601

18 0,9000 0,0500 0,9502

19 0,1254 0,0940 0,882

20 0,2069 0,0764 0,8119


Tabla 4 - 13 Valores coeficientes de correlación R2 con los valores de 𝝁𝒎𝒂𝒙 y 𝒌𝒔 promedio

Ensayo R2 Ensayo R2

2 0,8464 12 0,8735

3 0,9668 14 0,9718

4 0,9834 15 0,9661

7 0,9034 16 0,9522

8 0,9753 18 0,5265

10 0,5371 19 0,8553

11 0,9175 20 0,7876

Para el caso de la evaluación por limitación de nitrógeno se realizó en 6 perfiles que

presentaban esta característica asociados a los ensayos 1, 5, 6, 9, 13 y 17, a partir de esto

se encontraron valores biológicamente válidos para cinco ensayos excepto para el ensayo

6 (Tabla 4 - 14). Al obtener un valor 𝑘𝑛 promedio de 0,09668 se obtuvieron valores de

0,2130 a 0,5265 respecto al coeficiente de correlación R2 estos se pueden observar en la

Tabla 4 - 15

Tabla 4 - 14 Valores 𝒌𝒏 para ensayos de limitación de nitrógeno

Ensayo 𝒌𝒏 R2

1 0,08633 0,74740

5 0,08895 0,22860

6 0,08633 0,66030

9 0,13697 0,23590

13 0,09041 0,29210

17 0,09114 0,27390

Tabla 4 - 15 Valores coeficientes de correlación R2 con el valor de 𝑘𝑛 promedio

Ensayo R2

1 0,5265

5 0,213

6 0,4163



9 0,2431

13 0,2964

17 0,2733

Los valores reportados para la tasa de crecimiento de biomasa máxima se encuentran en

la Tabla 4 - 3, al comparar estos valores con los hallados para el modelo evaluado se

puede observar que el valor encontrado para la tasa de crecimiento máxima es similar al

reportado para sistemas en los cuales se busca la generación de biomasa (Gougouli y

Koutsoumanis, 2010), esto es congruente con el sistema evaluado, ya que la producción

de conidios está asociada directamente al metabolismo primario del microorganismo.

Teniendo en cuenta la complejidad del sistema biológico evaluado, la estrategia de cálculo

implementada mostró ser adecuada, al permitir hallar valores biológicamente coherentes.

También se evidencio que realizar las comparaciones en términos de las derivadas en

cada punto experimental, se obtienen ajustes con bajas diferencias entre si.

Fuente de carbono

El primer término de la ecuación para fuente de carbono está destinado al crecimiento del

hongo, es decir la fuente de carbono aporta los elementos necesarios para la síntesis de

biomasa y la energía necesaria para este proceso. El segundo término corresponde al

mantenimiento, este término considera el aporte de energía para mantener vivo al

microorganismo y además aporta los materiales necesarios para la formación de productos

extracelulares, en este caso este parámetro fue ajustado a partir de los perfiles de

crecimiento en los cuales se observó consumo de sacarosa luego de alcanzar la fase

estacionaria del sistema (Ecuación 6).

𝑑𝑠

𝑑𝑡= (−

1

𝑌𝑥/𝑠−𝑚1)𝜇𝑥 Ecuación 6

El rendimiento 𝑌𝑥/𝑠 se obtiene a partir de los perfiles de crecimiento sin generación de

conidios mostrados en la Figura 4 - 18, utilizando la Ecuación 7 se encontró que el

rendimiento 𝑌𝑥/𝑠 es de 0,6239.


𝑌𝑥/𝑠 =𝑑𝑥/𝑑𝑡

𝑑𝑠/𝑑𝑡=𝑑𝑥

𝑑𝑠 Ecuación 7

0 24 48 72 96 120 1440

1

2

3

4

5

Tiempo (h)

Bio

masa (

peso

seco

) g

/L

0 24 48 72 96 120 14410

15

20

25

Tiempo (h)

Sacaro

sa g

/L

Figura 4 - 18 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de fuente de carbono sacarosa

La determinación de la constante de mantenimiento para sacarosa 𝑚1 se realizó en los

perfiles de los ensayos 10, 11, 12, 16, 18, 19 y 20, puesto que en estos perfiles se observó

fase estacionaria durante el periodo de tiempo evaluado. Sin embargo, únicamente se

observaron valores para la constante de mantenimiento en los ensayos 16 y 19 como se

observa en la Tabla 4 -16 con un valor promedio 𝑚1 de 0,01.

Tabla 4 - 16 Valores 𝒎𝟏 para ensayos con presencia de fase estacionaria.

Ensayo 𝒎𝟏 R2

10 0 0,9202

11 0 0,7395

12 0 0,7167

16 0,01 0,9601

18 0 0,9502

19 0,01 0,8820

20 0 0,8119

A B



A partir del análisis por fenómenos se logró evidenciar que aunque la mayoría de los

perfiles de crecimiento presentan una influencia significativa en cuanto a la limitación por

carbono, no en todos los casos se encontraron valores biológicamente coherentes, una

posible explicación a esto es que el microorganismo se comporta de manera diferente

según la concentración inicial de nutrientes y la relación carbono nitrógeno, por esta razón

el sistema de ecuaciones propuesto no es adecuado para todos los perfiles de crecimiento.

Fuente de nitrógeno

El modelo utilizado supone que la fuente de nitrógeno, es amonio el cual se incorpora a la

biosíntesis de compuestos nitrogenados (Smith & Berry, 1976), adicional a esto se asume

que el nitrógeno es utilizado para el crecimiento y para el mantenimiento celular; en este

caso este parámetro fue ajustado a partir de los perfiles de crecimiento en los cuales se

observó consumo de nitrógeno luego de alcanzar la fase estacionaria del sistema

(Ecuación 8).

𝑑𝑛

𝑑𝑡= (−

1

𝑌𝑛/𝑠−𝑚2)𝜇𝑥 Ecuación 8

El rendimiento 𝑌𝑥/𝑛 se obtiene a partir de los perfiles de crecimiento sin generación de

conidios mostrados en la figura 4 – 19, utilizando la ecuación 9 se encontró que el

rendimiento 𝑌𝑥/𝑛 es de 4,8085.

𝑌𝑥/𝑠 =𝑑𝑥/𝑑𝑡

𝑑𝑛/𝑑𝑡=𝑑𝑥

𝑑𝑛 Ecuación 9


0 24 48 72 96 120 1440

1

2

3

4

5

Tiempo (h)

Bio

masa (

peso

seco

) g

/L

Figura 4 - 19 A. Perfil de crecimiento en términos de biomasa B. Perfil de consumo de fuente de amonio

La determinación de la constante de mantenimiento para amonio 𝑚2 se realizó en los

perfiles de los ensayos 10, 11, 12, 16, 18 y 19, puesto que en estos perfiles se observó

fase estacionaria durante el periodo de tiempo evaluado. En este caso, se observaron

valores para la constante de mantenimiento en todos los ensayos propuestos como se

observa en la Tabla 4 - 17 con un valor promedio 𝑚2 de 0,3017

.Tabla 4 - 17 Valores 𝑚2 para ensayos con presencia de fase estacionaria.

Ensayo 10

Ensayo 11

Ensayo 12

Ensayo 16

Ensayo 18

Ensayo 19

𝒎𝟐 0,3305 0,2961 0,3305 0,2110 0,3232 0,3152

R2 0,3706 0,4142 0,3796 0,4524 0,5317 0,4185

Producción de conidios

La tasa neta de producción de conidios está representada por una ecuación asociada al

efecto que tienen la limitación de fuente de carbono en la producción del mismo, en este

0 24 48 72 96 120 1441.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

Tiempo (h)

Am

on

io g

/L

A B



caso no se considera la limitación de fuente de nitrógeno ya que se observó que este factor

no tiene un efecto significativo en esta variable como se mostró en la Tabla 4 - 4. Teniendo

en cuenta esto se decidió usar la Ecuación 10 para representar la producción de conidios

en el tiempo y la Ecuación 11 para representar la tasa neta de producción de conidios en

el tiempo. Para este caso el valor promedio de 𝜇𝑃𝑚𝑎𝑥 es 0,0025 h-1

𝑑𝑝

𝑑𝑡= 𝜇𝑃

1

𝑥 Ecuación 10

𝜇𝑃 = 𝜇𝑃𝑚𝑎𝑥 (𝑠

𝑘𝑠 + 𝑠) Ecuación 11

La evaluación por limitación de carbono para la producción de conidios se realizó en 7

perfiles de crecimiento asociados a los ensayos 2, 3, 4, 8, y 16.

Tabla 4 - 18 Valores 𝝁𝒑𝒎𝒂𝒙 y 𝒌𝒔 análisis de sensibilidad limitación de carbono

Ensayo 𝝁𝑷𝒎𝒂𝒙 R2

2 0,0022

0,8399

3 0,0032 0,8493

4 0,0034 0,7307

8 0,0024 0,7758

16 0,0013 0,9890

A partir de las ecuaciones mostradas anteriormente se obtuvieron los valores de

coeficientes de correlación mostrados en la Tabla 4 - 19. Donde se puede observar que el

ajuste del modelo aplicado es válido para la mayoría de los perfiles de crecimiento

evaluados.

Tabla 4 - 19 Valores de coeficiente de correlación para cada uno de los ensayos a escala laboratorio 3 litros

Ensayo X S N P

1 0,7859 0,9078 0,8930 0,9911

2 0,9006 0,8423 0,9159 0,7785

3 0,7738 0,9367 0,9789 0,9732

4 0,7038 0,6979 0,8763 0,8753

5 0,6503 0,8283 0,8875 0,7221


6 0,7296 0,7067 0,7167 0,8839

7 0,9878 0,7912 0,7799 0,8612

8 0,7123 0,7966 0,7195 0,9926

9 0,9321 0,6681 0,7191 0,9172

10 0,8638 0,9255 0,9273 0,7660

11 0,8079 0,7802 0,8652 0,7764

12 0,8545 0,8205 0,8095 0,8231

13 0,6083 0,8498 0,9517 0,7356

14 0,7514 0,7377 0,8158 0,8991

15 0,8932 0,9600 0,9407 0,7652

16 0,8832 0,7226 0,7099 0,8395

17 0,8794 0,9773 0,7131 0,8052

18 0,8425 0,9919 0,8061 0,8092

19 0,8399 0,7605 0,9505 0,7156

20 0,9752 0,9113 0,9801 0,7619

Modelo macro cinético

El ajuste de modelo macro cinético se realizó teniendo en cuenta las ecuaciones obtenidas

del balance estequiométrico intracelular (Anexo F), y mostro un ajuste de 85% respecto al

r2

Este modelo ha adoptado la suposición básica que se encuentra en la literatura (Bellgardt,

1983), que todas las reacciones intracelulares están en estado seudo estacionario, o en

otras palabras, no hay una acumulación significativa de los metabolitos intracelulares en

cada paso de simulación. Esta suposición es razonable si se elige el paso de simulación

en muy corto plazo (0,1 h) en comparación con todo el período de fermentación. Sin

embargo, desde un paso de simulación al otro, las variables de estado se someten a

estímulos generados por los cambios del sustrato específico 𝑞𝑠, el cual se asume según la

ecuación 12.

𝑞𝑠 = −𝑑𝑆

𝑑𝑡

Ecuación 12

Con el ajuste macro cinético se incluyó una parte de la ruta metabólica asociada a la

generación de biomasa, lo cual permite tener una aproximación más cercana al



comportamiento del sistema de la producción de conidios, ya que anteriormente se mostró

la relevancia de la concentración de biomasa en el proceso de producción de conidios.

A partir del balance intracelular mostrado en el Anexo F, se llega al siguiente sistema de

ecuaciones (ecuación 13 – ecuación 17)

𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1 = 𝑞𝑠 Ecuación 13

𝑟𝑔𝑟 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4𝑟𝑇𝐶𝐶 = 2𝑟𝑂2 Ecuación 14

𝜇𝐾𝐵1 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4(𝑟𝐴𝐶 − 𝜇𝐾𝐵2) = 2𝑟𝑂2 Ecuación 15

3𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝑇𝐶𝐶 + 2𝑃/𝑂𝑟𝑂2 = 𝑞𝑠 + 𝜇/𝑌𝐴𝑇𝑃 +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 16

3𝑟𝐺6𝑃 + (𝑟𝐴𝐶 + 𝐾𝐵2) + 2𝑃/𝑂𝑟𝑂2 = (𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1) + 𝜇/𝑌𝐴𝑇𝑃 +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 17

Organizando el sistema de ecuaciones anterior se llega al siguiente arreglo matricial.

[

1221

𝐾𝐵12𝐾𝐵1 − 4𝐾𝐵2

−𝐾𝐵1 − 𝐾𝐵2 − 1/𝑌𝐴𝑇𝑃0

051−1

0−22𝑃/𝑂0

] [

𝑟𝐺6𝑃𝜇𝑟𝐴𝐶𝑟𝑂2

] = [

𝑞𝑠0

𝑚𝐴𝑇𝑃0

]

Solucionando la matriz anterior se llega a la siguiente expresión de tasa de crecimiento

(Ecuación 18), manteniendo constantes los parámetros mostrados en la Tabla 4 - 20, los

cuales son tomados de la literatura.

Tabla 4 - 20 Parámetros constantes usados en la iteración con la ruta metabólica (Yuan et al., 2010)

Parámetro Valor

KB1 mol/g 0,0001

KB2 mol/g 0,00074

Y ATP g/g 10


m ATP mol/g h 0,0015

P/O 1,5

𝜇𝑟𝑥𝑛 = 211,844 𝑞𝑠 − 0,0144 Ecuación 18

Esta expresión forma el modelo macro cinético en términos de biomasa al sumar la

ecuación 3 y la ecuación 18. En la Figura 4 - 20 se muestra el ajuste de modelo para el

ensayo 4 de limitación.

𝜇𝐹𝑖𝑛𝑎𝑙 = 𝜇 + 𝜇𝑟𝑥𝑛 = 𝜇𝑚𝑎𝑥𝑠


𝑘𝑛 + 𝑛+ 211,844 𝑞𝑠 − 0,0144

Figura 4 - 20 Ajuste del modelo ensayo 4 3 Litros (0,274 g/L de sacarosa, 2,7 g/L fosfato de amonio)

Adicional a esto, se encontró que los parámetros obtenidos a escala laboratorio presentan

un ajuste del 85%. Sin embargo, es necesario incluir parámetros adicionales de

transferencia de masa, como el kla, ya que al realizar el cambio de escala, se tienen

cambios respecto a condiciones como aireación y agitación (Doran, 2013). Por otro lado,

es necesario tener en cuenta que al realizar fermentaciones con un microorganismo



filamentoso se debe tener control reológico durante el proceso de crecimiento, ya que al

aumentar la concentración celular se disminuye la transferencia de oxígeno en el medio.

Demostración matemática de la estabilidad del modelo no estructurado-no

segregado

Estado estable

𝑑𝑥

𝑑𝑡=𝑑𝑠

𝑑𝑡=𝑑𝑃

𝑑𝑡= 0

Solución trivial Solución no trivial

La solución trivial asume que el valor de

biomasa es cero, es decir no hay biomasa

cargada dentro del reactor y por lo tanto la

biomasa en el tiempo permanece

constante

La solución no trivial toma el valor de

biomasa diferente de cero

- Análisis biomasa

𝑑𝑥

𝑑𝑡

𝑑𝑥

𝑑𝑡= (𝜇 − 𝑘𝑑)𝑥

Solucionando como problema de valor inicial

𝑥(𝑡) = 𝑐𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡

𝑥(𝑡0) = 𝑥0

𝑥0 = 𝑐𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0

𝑐 =𝑥0

𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0

𝑥(𝑡) =𝑥0𝑒

−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡

𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0= 𝑥0𝑒

−(𝜇−𝑘𝑑)(𝑡0−𝑡)

Dado que 휀 > 0 tal que

|𝑥0𝑒(𝜇−𝑘𝑑)(𝑡0−𝑡) − 𝑥0̅̅ ̅𝑒

(𝜇−𝑘𝑑)(𝑡0−𝑡)̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅̅ ̅| < 휀

|𝑥0 − 𝑥0̅̅ ̅|𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡 < 휀𝑒−(𝜇−𝑘𝑑)𝑡0

Capitulo 4. Resultados 83

𝑡 = 𝑡0 |𝑥0 − 𝑥0̅̅ ̅| < 휀 = 𝛿

Teniendo en cuenta esto la solución es asintóticamente estable si

(𝜇 − 𝑘𝑑) > 0

- Análisis producción de conidios

𝑑𝑝

𝑑𝑡

𝑑𝑝

𝑑𝑡= (𝛼𝜇 + 𝛽)𝑥


𝑑𝑝 = (𝛼𝜇 + 𝛽)𝑥𝑑𝑡

𝑝(𝑡) = (𝛼𝜇 + 𝛽)𝑥(𝑡 + 𝑐)

𝑝0 = 𝑡0 + 𝑐

𝑐 = 𝑝0 − 𝑡0

𝑝(𝑡) = (𝑡 + 𝑝0 − 𝑡0)


|(𝑡 + 𝑝0 − 𝑡0) − (𝑡 + 𝑝0̅̅ ̅ − 𝑡0)| < 휀

|𝑝0 − 𝑝0̅̅ ̅|(𝑡 − 𝑡0)(𝑡 − 𝑡0) < 휀

𝑡 = 𝑡0 |𝑝0 − 𝑝0̅̅ ̅| < 휀 = 𝛿

Teniendo en cuenta lo anterior la solución del sistema es estable, en cualquier caso.

- Análisis sacarosa

𝑑𝑠

𝑑𝑡

𝑑𝑠

𝑑𝑡= (−

1

𝑌𝑥/𝑠𝜇 +𝑚)𝑥



𝑑𝑠

𝑑𝑡= (−

𝑑𝑠𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡

𝜇 + 𝑚)𝑥

𝑑𝑠

𝑑𝑡= −


𝜇𝑥 +𝑚𝑥

𝑑𝑠

𝑑𝑡+


𝜇𝑥 = 𝑚𝑥

𝑑𝑠

𝑑𝑡(1 +

𝜇𝑥

𝑑𝑥𝑑𝑡

) = 𝑚𝑥

𝑑𝑠

𝑑𝑡=

𝑚𝑥

1 +𝜇𝑥𝑑𝑥/𝑑𝑡


𝑑𝑠 = (𝑚𝑥


)𝑥𝑑𝑡

𝑠(𝑡) = (𝑚𝑥


)𝑥(𝑡 + 𝑐)

𝑠0 = 𝑡0 + 𝑐

𝑐 = 𝑠0 − 𝑡0

𝑠(𝑡) = (𝑡 + 𝑠0 − 𝑡0)


|(𝑡 + 𝑠0 − 𝑡0) − (𝑡 + 𝑠0̅ − 𝑡0)| < 휀

|𝑠0 − 𝑠0̅|(𝑡 − 𝑡0)(𝑡 − 𝑡0) < 휀

𝑡 = 𝑡0 |𝑠0 − 𝑠0̅| < 휀 = 𝛿


Resultados 85

- Análisis amonio

𝑑𝑛

𝑑𝑡

𝑑𝑛

𝑑𝑡= (−

1

𝑌𝑥/𝑛𝜇 +𝑚)𝑥

𝑑𝑛

𝑑𝑡= (−

𝑑𝑛𝑑𝑡𝑑𝑥𝑑𝑡

𝜇 + 𝑚)𝑥

𝑑𝑛

𝑑𝑡= −


𝜇𝑥 +𝑚𝑥

𝑑𝑛

𝑑𝑡+


𝜇𝑥 = 𝑚𝑥

𝑑𝑛

𝑑𝑡(1 +

𝜇𝑥

𝑑𝑥𝑑𝑡

) = 𝑚𝑥

𝑑𝑛

𝑑𝑡=

𝑚𝑥


86


𝑑𝑛 = (𝑚𝑥


)𝑥𝑑𝑡

𝑛(𝑡) = (𝑚𝑥


)𝑥(𝑡 + 𝑐)

𝑛0 = 𝑡0 + 𝑐

𝑐 = 𝑛0 − 𝑡0

𝑛(𝑡) = (𝑡 + 𝑛0 − 𝑡0)


|(𝑡 + 𝑛0 − 𝑡0) − (𝑡 + 𝑛0̅̅ ̅ − 𝑡0)| < 휀

|𝑛0 − 𝑛0̅̅ ̅|(𝑡 − 𝑡0)(𝑡 − 𝑡0) < 휀

𝑡 = 𝑡0 |𝑛0 − 𝑛0̅̅ ̅| < 휀 = 𝛿


El análisis de estabilidad se realizó para el modelo no segregado no estructurado encontrando

que el sistema tiene un comportamiento asintóticamente estable para los casos en que la tasa de

crecimiento sea mayor que la constante de muerte, esto quiere decir que para garantizar la

estabilidad del sistema se debe tener condiciones de concentración de sustrato tales que

satisfagan esta restricción.

Por medio del análisis de sensibilidad realizado para cada uno de los parámetros propuestos, se

evidenció que para el caso de los términos de crecimiento celular la expresión seleccionada es

adecuada. Además, por medio de esta estrategia se lograron obtener valores biológicamente

validos sin tener interferencias por las restricciones matemáticas

Capítulo 5. Conclusiones y Recomendaciones 87

5. Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones

- La evaluación del efecto de la concentración inicial de los sustratos sacarosa y fosfato de

amonio, en escala laboratorio mostró el efecto inductor que tiene la limitación de sustratos

en la producción de conidios. Así mismo, los parámetros obtenidos a partir de estos

ensayos fueron el punto de partida para la generación del modelo propuesto.

- Se desarrolló un modelo matemático teniendo en cuenta el efecto limitante de los

sustratos, el cual generó un ajuste apropiado en ciertas condiciones que incluye una parte

de la ruta metabólica del microorganismo asociada al crecimiento, lo que permitió una

mejor simulación de los resultados experimentales.

- El modelo matemático propuesto muestra el efecto positivo que tiene la fuente de carbono

sobre la tasa de crecimiento del microorganismo. Por otra parte, la mayor producción de

conidios se obtiene a bajas tasas de crecimiento en limitación de fuente de carbono. Por

lo tanto un esquema de producción apropiado consistiría en una primera etapa de

producción de biomasa en condiciones de alta concentración de carbono y una segunda

etapa para la producción de conidios en condiciones limitantes de fuente de carbono.



Recomendaciones

- Evaluar el efecto de la fuente de nitrógeno (fosfato de amonio) sobre la calidad y la

producción de los conidios, con el fin de determinar la concentración óptima que permita

obtener una buena producción de conidios.

- Evaluar la influencia de diversos factores, como aireación, temperatura y pH para

aumentar los rendimientos y la productividad del proceso.

- Evaluar el esquema de producción en dos etapas optimizando las condiciones de fuente

de carbono para la formación de biomasa en la primera etapa, de tal manera que se

obtenga su mayor producción la cual deberá ingresar a la segunda etapa en condiciones

restrictivas de carbono para la formación de conidios.

- Evaluar los metabolitos generados al final de la fase exponencial y al inicio de la formación

de conidios, con el fin de identificar aquellos que tengan un efecto inductor sobre la

diferenciación.

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A. Anexo: Medios de cultivo

Medio harina de arroz

Compuesto Concentración g/l Marca

Harina de arroz 20

Triptosa 5 Sharlau

Glucosa 15 Ciacomeq

Medio sacarosa-cloruro amonio (inóculo)

Compuesto Concentración g/l Marca

Sacarosa 20 Riopaila

Cloruro de amonio 2 Ciacomeq

Sulfato de magnesio 0,5 Ciacomeq

Cloruro de potasio 0,5 Campota

Fosfato de potasio di básico 1,0 Merck

Micro elementos ml/L 0,1

Sales medio de crecimiento

Compuesto Concentración g/L Marca

sulfato de magnesio 0,5 Ciacomeq

cloruro de potasio 0,5 Campota

fosfato potasio di básico 1,0 Merck

Carbonato de calcio 0,5 Campota

Micro elementos medio de crecimiento ml/L 0,1

pH 6.5 ajustado con NaOH o H3PO4

Micro elementos inóculo




Na2MoO4 2H2O 5,0 Panreac

H3BO3 3,0 Panreac

ZnSO4 7H2O 0,01 Panreac

CuSO4 5H2O 0,15 Panreac

MnSO4 2H2O 0,45 Panreac

CoCl2 0,2 Panreac

En solucion HCl 0,1 N

Micro elementos medio de crecimiento


FeSO4 2,0 Panreac

CaCl2 2,0 Ciacomeq

CoCl2 6H2O 0,2 Panreac

CuCl2 2H2O 0,01 Panreac

NiCl3 6H2O 0,2 Panreac

MnCl2 4H2O 0,03 Panreac

ZnSO4 7H2O 0,1 Panreac

H3BO3 0,3 Panreac

NaMoO4 2H2O 0,03 Panreac

En solución HCl 0,1 N

A. Anexo: Medios de cultivo 103

Medio MB1 50:1


Sacarosa 10,0 Riopaila

Fosfato diamonio 0,46 Merck



fosfato potasio dibasico 1,0 Merck


Microelementos medio de crecimiento ml/L 0,1

pH 6,5 ajustado con NaOH o H3PO4

Medio MB1 25:1


Sacarosa 10,0 Riopaila










Medio MB2


Almidón 10,0 Almiyuca








B. Anexo: Protocolos experimentales

B-1. Preparación de banco de trabajo

Medio de cultivo

Compuesto Concentración (g/l) Marca

PDA 39 Sharlau

Agua CSP 1L

Procedimiento

1. Preparar cajas de petri con 25 ml de PDA estéril, el medio se esteriliza durante 20

minutos a 121 °C.

2. A caja se adiciona 250 𝜇𝑙 de conidios almacenados a -20 C en viales (1ml) de

glicerol con concentración 108

3. La suspensión de conidios se homogeniza con asa de drigalski

4. Se dejan incubando durante 8 días a 25 °C.

5. Finalizado el periodo de incubación, se adiciona a cada caja 10 ml de solución

Tween 80 0,1% v/v NaCl 0.85% p/v

6. Cada caja se raspa por medio de asas de drigalski y por medio de pipetas de vidrio

se transfiere la suspensión a tubos falcón de 50 ml

7. La suspensión obtenida es filtrada por medio de jeringas con algodón estériles

8. El filtrado obtenido en el paso anterior se lava, centrifugando a 5000 rpm durante

15 min, luego se descarta el sobrenadante y se completa el volumen obtenido

inicialmente con solución de Tween 80-NaCl, esta nueva suspensión homogeniza



con un vortex y nuevamente se centrifuga a 5000 rpm por 15 minutos se descarta

el sobrenadante, este procedimiento se repite dos veces.

9. Finalizado el proceso de lavado se completa al volumen necesario, con solucion de

Tween 80- NaCl, y se verifica la concentración 2x108 por recuento de conidios en

cámara de Neubauer.

10. La suspensión anterior se mezcla con glicerol al 40% v/v en un proporción 50:50

11. Esta nueva suspensión se almacena en viales de 1 ml a -20 C

12. Cada 6 meses se verifica la viabilidad de estos viales

B-2. Determinación de la concentración de biomasa

Procedimiento

1. Secar papel filtro hasta peso constante

2. Filtrar al vacio 10 ml de muestra

3. Lavar la muestra 3 veces, adicionando 10 ml de agua y filtrando nuevamente

4. Secar a 75 ºC el papel filtro hasta peso constante

5. Pesar el papel con la muestra y cuantificar.

Nota 1: Si se necesita determinar también la concentración de sustratos remanentes en el

medio de cultivo, se debe conservar el filtrado que resulta antes de los lavados.

B. Anexo: Protocolos experimentales 107

B-3. Determinación de amonio mediante la técnica de berthelot y curva

de calibración

Preparación de soluciones

- Solución de fenol 11.1% (11.1 g de fenol/ 100 mL de etanol al 95%).

- Solución de nitroprusiato (0.5 g de nitroprusiato/100 mL agua destilada y almacenar

en botella ambar).

- Citrato alcalino (adicionar 200 g citrato trisodico + 10 g de hidróxido de sodio en

700 mL de agua destilada y aforara a 1000 mL).

- Hipoclorito de sodio, solución comercial al 5.25%.

- Solución oxidante (10 mL de citrato alcalino + 2.5 mL de hipoclorito de sodio

comercial 5.25% que se debe preparar justo antes de adicionar no se debe

almacenar).

- Solución madre se Sulfato de amonio 10mg/L (en agua destilada)

Reactivos

- Solución de fenol 11.1% (11.1 g de fenol/ 100 mL de etanol al 95%)

- Solución de nitroprusiato (0.5 g de nitroprusiato/100 mL agua destilada y almacenar

en botella ambar)

- Citrato alcalino (adicionar 200 g citrato trisodico + 10 g de hidróxido de sodio en

700 mL de agua destilada y aforara a 1000 mL)

- Hipoclorito de sodio, solución comercial al 5.25%:

- Solución oxidante (10 mL de citrato alcalino + 2.5 mL de hipoclorito de sodio

comercial 5.25% que se debe preparar justo antes de adicionar no se debe

almacenar).

- Muestra del sobrenadante del medio de cultivo



Procedimiento

1. Tomar del sobrenadante 100 μl y diluirlo en 4900 μl de agua destilada en un

tubo de ensayo. Atención: con esto se logra una dilución 1:50 que puede ser

insuficiente en ciertos casos, ver la nota aclaratoria al final del protocolo para

determinar la mejor dilución.

2. Adicionar al tubo anterior a 200 μl de fenol, 200 μl de nitroprusiato y 500 μl de

solución oxidante.

3. Agitar los tubos e incubar a temperatura ambiente por una hora en un lugar

iluminado. Se debe desarrollar un color azul aguamarina cuya intensidad será

proporcional a la concentración de amonio en la muestra.

4. Leer a 640 nm.

Preparación del blanco

Es la solución contra la cual se comparan las muestras, se adicionan 5000 μl de agua

destilada a un tubo de ensayo y se continua desde el paso 2. El blanco se debe preparar

al tiempo con las muestras para evitar errores experimentales adicionales.

Precauciones: El fenol penetra la piel rápidamente, en particular cuando está líquido,

causando lesiones severas que pueden ser fatales. Es corrosivo sobre los tejidos

corporales, causando severas quemaduras químicas y debido a sus propiedades de

anestésico local, las quemaduras cutáneas pueden ser indoloras. Usar siempre guantes y

gafas para su manipulación y trabajar en un lugar con buena ventilación.

Curva de calibración

Para la elaboración de la curva de calibración se prepara una solución madre de fosfato

de amonio o cloruro de amonio de 10 mg/L a partir de la cual se preparan en tubos de

ensayo las soluciones descritas en la siguiente tabla:


Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Solución madre de

sulfato de amonio

(mL)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8

Agua destilada ( mL) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4 3.8 3.6 3.4 3.2

Volumen final ( mL)

5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Concentración

Fosfato de amonio

(mg/L)

0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 2.4 2.8 3.2 3.6

Concentración

Amonio

(g/L)

0

1,09X1

0-4

2,18

X10-4

3,27

X10-4

4,36

X10-4

5,45

X10-4

6,55

X10-4

7,64

X10-4

8,73

X10-4

9,82

X10-4

Una vez se tienen las soluciones anteriores en los tubos de ensayo, se continua

con el procedimiento desde el paso 2 y se grafica la absorbancia contra la

concentración de cada muestra. Se hace la regresión lineal correspondiente y se

obtiene así la ecuación de absorbancia (y) en términos de la concentración (x).

CURVA DE CALIBRACION AMONIO

0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.00100.0

0.2

0.4

0.6

0.8

y=449.62x-0.003

R2=0.9951

Concentración NH4 (g/L)

Ab

so

rban

cia

(640 n

m)



Cada vez que se preparen los reactivos hay que elaborar una nueva curva de calibración.

La ecuación despejada para la curva obtenida con los reactivos actuales es:

Concentración NH4 (g/L) = ((Absorbancia /449.62) + 0.003)*Factor de dilución

Nota 1: El límite de detección de la técnica aquí descrita es 3.6 mg/l, por lo tanto debe

procurarse que la concentración de la muestra a leer se encuentre por debajo de este valor,

de lo contrario será necesario hacer una dilución. Dada la sensibilidad de la técnica, las

diluciones que se deben realizar son muy altas por lo que es necesario emplear micro

pipetas calibradas que permitan tomar los volúmenes correctos. Adicionalmente, es

importante tener en cuenta que la cantidad de reactivos empleada fue establecida para un

volumen de muestra de 5 mL, por lo tanto si se usa un volumen mayor se deben ajustar

los volúmenes de reactivos, y verificar con una muestra de concentración conocida.


B-4 Cuantificación de sacarosa mediante invertasa y DNS (curva de

calibración)

Preparación de soluciones

- Solucion DNS

43.0 g Tartrato de sodio y potasio,

1.8 g Hidroxido de sodio

1.0 g Acido Dinitro Salicilico (DNS),

100 ml de agua

Disolver en 60 ml de agua el tartrato de sodio y el hidróxido de sodio en agitación

constante, este proceso puede durar aproximadamente 12 horas, el tartrato se

debe adicionar lentamente.

Disolver aparte en 20 ml de agua el DNS, en un recipiente ambar o protegido de la

luz ya que este reactivo es fotosensible.

En un balón aforado adicionar, primero la solución de tartrato y luego la solución de

DNS, homogenizar y aforar a 100 ml. La solución se debe almacenar en recipiente

ambar, en un lugar oscuro.

- Invertasa

0.025 g invertasa / 100 ml buffer acetatos 0.1 M pH 4.6

Buffer acetatos para hidrólisis enzimática

[H+] = keq[CH3COOH]

[CH3COO] Acido AceticoAcetato de sodio

Concentración

mol/L

Peso molecular

g/mol

Densidad

g/ml

[CH3COOH] 0,17 60 1.53

[CH3COO] 0,1 82.03 No Aplica

Para 100 ml, se necesitan 0.66 ml de acido acético glacial y 0.8203 g de acetato de sodio

La solución de invertasa se debe almacenar a 4 °C, periódicamente se debe verificar la actividad enzimática con una solución de concentración conocida.



Procedimiento

1. Tomar 500 μL del filtrado de la muestra

2. Adicionar 500 μL de solución invertasa

3. Incubar durante 30 minutos a 60 °C en baño termostatado

4. Pasar las muestras durante 5 minutos a hielo para detener la reacción

5. Diluir la muestra con agua destilada

6. Tomar 250 μL de la solución obtenida en el paso 5

7. Adicionar 250 μL de solución DNS

8. Incubar en agua a ebullición durante 5 minutos

9. Pasar a hielo durante 5 minutos para detener la reacción

10. Adicionar 2.5 ml de agua

11. Homogenizar las muestras con vortex

12. Leer a 540 nm (durante la lectura mantener las muestras en un lugar oscuro)

Preparación de blanco

Es la solución contra la cual se comparan las muestras, se adicionan 250 μl de agua

destilada a un tubo de ensayo y se continua desde el paso 7. El blanco se debe preparar

al tiempo con las muestras para evitar errores experimentales adicionales.

Curva de calibración

Para la elaboración de la curva de calibración se prepara una solución madre de sacarosa

4 g/L a partir de la cual se preparan en tubos de ensayo las soluciones descritas en la

siguiente tabla:

Blanco 1 2 3 4 5 6 7 8

Solución madre

de sacarosa

(mL)

0 0.625 1.250 1.875 2.500 3.125 3.750 4.375 5.000

Agua destilada ( mL)

5 4.375 3.750 3.125 2.500 1.875 1.250 0.625 0

Volumen final ( mL)

5 5 5 5 5 5 5 5 5


Concentración

Sacarosa

(g/L)

0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0

Una vez se tienen las soluciones anteriores en los tubos de ensayo, se continua

con el procedimiento desde el paso 1 y se grafica la absorbancia contra la

concentración de cada muestra. Se hace la regresión lineal correspondiente y se

obtiene así la ecuación de absorbancia (y) en términos de la concentración (x).

CURVA DE CALIBRACION SACAROSA

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.00.0

0.5

1.0 y=0.2712x-0.0259

R2=0.9923

Concentración Sacarosa (g/L)

Ab

so

rban

cia

(540 n

m)

Cada vez que se preparen los reactivos hay que elaborar una nueva curva de calibración.

La ecuación despejada para la curva obtenida con los reactivos actuales es:

Concentración Sacarosa (g/L) = ((Absorbancia /0.2712) + 0.0259)*Factor de dilución

C. Anexo: Cinéticas ensayos limitación

C-1 Biomasa

Biomasa (Sacarosa 0.274 g/L)

0 24 48 72 96 120 1440

1

2

3

40.007 g/L Fosfato Amonio




Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440

2

4





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l

C. Anexo : Cinéticas ensayos de limitación 115


0 24 48 72 96 120 1440

1

2

3





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440

2

4

6





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440

2

4





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l



C-2 Sacarosa residual

Sacarosa residual (Sacarosa 0.274 g/L)

0 24 48 72 96 120 1440.0

0.1

0.2

0.30.007 g/L Fosfato Amonio




Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


Sacarosa Residual (Sacarosa 1.25 g/L)

0 24 48 72 96 120 1440.0

0.5

1.0

1.5





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440.0

0.5

1.0

1.5

2.0





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440

1

2





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l



C-3 Amonio residual

Amonio residual (Sacarosa 0.274 g/L)

0 24 48 72 96 120 1440.0

0.2

0.4

0.6





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440.0

0.2

0.4

0.6





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l



0 24 48 72 96 120 1440.0

0.2

0.4

0.6





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440.0

0.2

0.4

0.6





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l


0 24 48 72 96 120 1440.0

0.2

0.4

0.6





Tiempo (h)

co

ncen

tracio

n

g/l



C-4 Producción de conidios

Recuento conidios (Sacarosa 0.274 g/L)

0 24 48 72 96 120 1441.01003

1.01004

1.01005

1.01006

1.01007





Tiempo (h)

Co

nid

ios/m

l


0 24 48 72 96 120 1441.0103

1.0104

1.0105

1.0106





Tiempo (h)

Co

nid

ios/m

l



0 24 48 72 96 120 1440

1.0104

2.0104

3.0104

4.0104

2.0105

4.0105

6.0105

8.0105

1.0106





Tiempo (h)

Co

nid

ios/m

l


0 24 48 72 96 120 1440

2.0104

4.0104

6.0104

8.0104

1.0105

2.0105

3.0105

4.0105

5.0105





Tiempo (h)

Co

nid

ios/m

l


0 24 48 72 96 120 1440

1.0105

2.0105

3.0105

4.0105

5.0105





Tiempo (h)

Co

nid

ios/m

l



C-5 pH

pH (Sacarosa 0.274 g/L)

0 24 48 72 96 120 1446.0

6.2

6.4

6.6

6.8





Tiempo (h)

pH


0 24 48 72 96 120 1443

4

5

6

7





Tiempo (h)

pH



0 24 48 72 96 120 1440

2

4

6





Tiempo (h)

pH


0 24 48 72 96 120 1440

2

4

6





Tiempo (h)

pH


0 24 48 72 96 120 1440

2

4

6





Tiempo (h)

pH

D. Anexo: Derivadas a partir de Table curve 2d

D-1 dx/dt

t ensayo 1 ensayo 2 ensayo 3 ensayo 4 ensayo 5

0 0,1107 0,1005 0,2792 0,1415 0,1834

24 0,0291 0,0558 0,0010 -0,0201 -0,0129

48 -0,0040 0,0111 -0,0499 -0,0403 -0,0093

72 -0,0248 -0,0272 -0,0217 -0,0170 -0,0182

96 -0,0160 -0,0250 -0,0006 -0,0185 -0,0191

120 -0,0001 -0,0176 -0,0111 -0,0112 -0,0147

144 -0,0504 -0,0069 -0,0153 -0,0026 -0,0064


0 0,0079 0,1225 0,1429 0,0234 0,0059

24 0,0254 0,0068 0,0153 0,0195 0,0132

48 0,0821 0,0063 0,0004 0,0380 0,0300

72 0,0284 0,0351 -0,0048 0,0185 0,0336

96 -0,0668 0,0071 -0,0057 -0,0116 -0,0279

120 -0,0323 -0,1636 -0,0039 -0,0248 -0,0273

144 -0,0152 -0,5631 -0,0001 -0,0435 -0,0136


0 0,1185 0,1417 0,3367 0,2963 0,3333

24 0,0097 0,0188 0,0766 0,0398 0,0683

48 0,0336 0,0314 -0,0766 0,0127 -0,0302

72 0,1008 0,0269 -0,0491 -0,0023 -0,0312

96 -0,0770 0,0013 -0,0229 -0,0129 -0,0033

120 -0,0416 -0,0236 -0,0452 -0,0214 -0,0153

144 -0,0150 -0,0394 -0,0766 -0,0285 -0,1361

F. Anexo : Balance estequiométrico intracelular 125


0 0,7390 0,1271 0,3883 0,7951 0,4752

24 -0,0183 -0,0001 -0,0235 -0,0457 -0,0353

48 -0,0258 -0,0015 -0,0166 -0,0269 -0,0250

72 -0,0316 -0,0019 -0,0136 -0,0185 -0,0204

96 -0,0365 -0,0022 -0,0117 -0,0136 -0,0177

120 -0,0408 -0,0024 -0,0105 -0,0102 -0,0158

144 -0,0447 -0,0026 -0,0096 -0,0077 -0,0144

D-2 ds/dt


0 -2,74E-01 -2,74E-01 -2,74E-01 -2,74E-01 -9,61E-03

24 -1,03E+00 -1,03E+00 -1,03E+00 -1,03E+00 -7,47E-03

48 -3,90E-22 -3,90E-22 -3,90E-22 -3,90E-22 -4,86E-03

72 -1,47E-32 -1,47E-32 -1,47E-32 -1,47E-32 -2,72E-03

96 -5,57E-43 -5,57E-43 -5,57E-43 -5,57E-43 -1,38E-03

120 -2,10E-53 -2,10E-53 -2,10E-53 -2,10E-53 -1,04E-04

144 -7,93E-64 -7,93E-64 -7,93E-64 -7,93E-64 -1,83E-03


0 -4,13E-03 -7,79E-03 -2,28E-02 -2,23E-04 -2,39E-03

24 -6,33E-03 -6,09E-03 -9,10E-03 -3,50E-02 -2,58E-02

48 -2,81E-03 -3,52E-03 -2,32E-03 -1,89E-02 -2,46E-02

72 -1,07E-03 -2,25E-03 -2,03E-04 -1,17E-02 -1,00E-02

96 -2,33E-05 -1,39E-03 -4,88E-04 -7,47E-03 -4,57E-04

120 -6,92E-05 -7,48E-04 -9,16E-04 -4,57E-03 -4,89E-04

144 -4,95E-04 -2,32E-04 -1,68E-03 -2,42E-03 -7,77E-04


0 -4,56E-03 -4,08E-03 -2,53E-02 -2,76E-02 -4,90E-03

24 -1,72E-02 -1,53E-02 -6,66E-03 -1,46E-02 -2,46E-02

48 -1,48E-02 -9,50E-03 -4,99E-03 -1,07E-02 -2,53E-02

72 -8,79E-03 -6,69E-03 -6,11E-03 -1,17E-02 -1,54E-02

96 -4,81E-03 -4,87E-03 -8,67E-03 -1,33E-02 -3,07E-03

120 -2,65E-03 -3,53E-03 -1,22E-02 -1,11E-02 -6,79E-04

144 -1,51E-03 -2,47E-03 -1,63E-02 -8,22E-04 -3,63E-03




0 -7,58E-02 -1,17E-02 -2,83E-02 -1,09E-01 -3,86E-02

24 -1,87E-02 -1,40E-02 -6,07E-02 -1,65E-02 -5,41E-02

48 -1,18E-02 -1,42E-02 -4,70E-02 -4,80E-02 -2,99E-02

72 -1,27E-02 -1,30E-02 -2,26E-03 -2,89E-03 -8,36E-03

96 -4,46E-03 -1,06E-02 -1,24E-03 -3,74E-04 -5,49E-03

120 -5,14E-03 -7,33E-03 -3,09E-03 -4,32E-04 -3,53E-03

144 -1,70E-02 -3,15E-03 -1,64E-02 -4,86E-05 -2,08E-03

D-3 dn/dt


0 -7,00E-03 -4,81E-03 -1,06E-02 -2,84E-02 -7,00E-03

24 -2,64E-13 -2,48E-03 -4,62E-03 -2,68E-03 -2,64E-13

48 -9,98E-24 -1,09E-03 -1,80E-03 -1,08E-03 -9,98E-24

72 -3,77E-34 -3,05E-04 -1,06E-03 -1,17E-03 -3,77E-34

96 -1,42E-44 -1,94E+00 -1,32E-03 -1,69E-03 -1,42E-44

120 -5,37E-55 -1,61E-04 -1,52E-03 -2,36E-03 -5,37E-55

144 -2,03E-65 -6,85E-04 -6,03E-04 -3,09E-03 -2,03E-65


0 -1,71E-02 -3,85E-01 -2,95E-02 -7,00E-03 -8,93E-02

24 -2,88E-03 -6,57E-03 -2,88E-03 -2,64E-13 -1,31E-03

48 -3,30E-04 -2,90E-03 -5,12E-04 -9,98E-24 -7,81E-04

72 -1,82E-04 -9,46E-04 -9,43E-05 -3,77E-34 -3,75E-04

96 -6,38E-04 -4,61E-05 -2,14E-04 -1,42E-44 -3,31E-05

120 -1,75E-05 -1,02E-04 -5,46E-04 -5,37E-55 -2,16E-04

144 -4,13E-04 -1,11E-03 -9,75E-04 -2,03E-65 -1,97E-04



0 -2,73E-01 -3,57E-02 -7,00E-03 -8,49E-03 -2,37E-02

24 -2,83E-04 -4,71E-03 -2,64E-13 -1,07E-03 -4,08E-03

48 -4,83E-04 -1,51E-03 -9,98E-24 -3,07E-04 -4,45E-04

72 -6,59E-04 -4,23E-04 -3,77E-34 -1,02E-03 -4,00E-04

96 -7,18E-04 -1,36E-04 -1,42E-44 -7,52E-04 -8,10E-04

120 -6,38E-04 -3,20E-04 -5,37E-55 -2,87E-04 -7,87E+00

144 -4,03E-04 -8,47E-04 -2,03E-65 -1,15E-03 -2,01E-03


0 -3,07E-02 -7,00E-03 -1,06E-02 -2,35E-02 -3,28E-02

24 -7,07E-03 -2,64E-13 -2,58E-03 -3,77E-03 -9,06E-04

48 -1,52E-03 -9,98E-24 -8,81E-04 -9,35E-04 -1,10E-03

72 -2,32E-03 -3,77E-34 -2,19E-03 -4,62E-03 -1,11E-03

96 -1,30E-03 -1,42E-44 -9,55E-05 -9,69E-05 -1,02E-03

120 -8,32E-04 -5,37E-55 -3,16E-04 -5,37E-04 -8,49E-04

144 -9,24E+05 -2,03E-65 -7,81E-04 -6,63E-04 -6,08E-04

D-4 dp/dt


0 0,35649 0,33547 0,30118 0,30235 0,35059

24 0,07434 0,07953 0,07638 0,08081 0,05978

48 0,02090 -0,01511 -0,00561 -0,00167 -0,02179

72 0,00510 -0,01128 -0,00132 0,00003 -0,00677

96 0,00877 0,02817 0,03270 0,03103 -0,00779

120 0,02490 0,04041 0,03995 0,03646 0,00000

144 0,04986 -0,03741 -0,03612 -0,03855 0,00000


0 0,42288 0,32523 0,39525 -0,02820 0,00000

24 0,04653 0,06266 0,03135 0,06564 0,10374

48 0,01378 -0,00523 -0,00563 0,14585 0,09152

72 0,01491 -0,00454 0,02455 0,03286 -0,03667

96 -0,00015 -0,00040 0,00640 -0,00056 0,00000

120 0,00443 0,00303 -0,03138 -0,01042 0,00000

144 -0,02337 0,06253 0,08417 -0,00921 0,00000




0 0,000000 0,000000 0,474264 3,04E-52 0,45562

24 0,108279 0,086560 0,065678 8,04E-42 0,03916

48 0,073133 0,051907 -0,032847 2,13E-31 -0,01986

72 0,033441 0,019807 -0,019805 5,64E-21 0,00381

96 0,002392 -0,002211 -0,004112 1,49E-10 0,00388

120 -0,014902 -0,012328 0,004153 3,96E+00 -0,01147

144 -0,015822 -0,010149 -0,029586 0,00E+00 0,02640


0 0,37671 0,00000 -0,02563 -0,12718 0

24 0,06630 0,09109 0,07576 0,03973 0

48 -0,01063 0,06567 0,10589 0,00895 0

72 -0,00618 0,02195 0,00201 0,06766 0

96 -0,00105 -0,00501 0,00571 0,01945 0

120 -0,00619 0,00503 0,01653 -0,00969 0

144 0,03775 0,06574 0,02983 0,02556 0

E. Anexo: Balance estequiométrico

𝑞𝐶𝐻2𝑂𝐶𝐻2𝑂 + 𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4 + 𝑞𝑂2𝑂2 → 𝑞𝐶𝐻1.70𝑂0.58𝑁0.15𝐶𝐻1.70𝑂0.58𝑁0.15 + 𝑞𝐶𝑂2𝐶𝑂2 + 𝑞𝐻2𝑂𝐻2𝑂

sacarosa X O2 (NH4)2HPO4 CO2 H2O

C 1 1 0 0 1 0

H 2 1.7 0 9 0 2

O 1 0.58 2 4 2 1

N 0 0.15 0 2 0 0

Variables medidas (𝐸𝑚𝑞𝑚) : sacarosa, fosfato de amonio, biomasa

Variables calculadas (𝐸𝑐𝑞𝑐) oxigeno, dióxido de carbono, agua

𝐸𝑚𝑞𝑚 + 𝐸𝑐𝑞𝑐 = 0 → 𝑞𝑐 = −𝐸𝑐−1 𝐸𝑚 𝑞𝑚

(

1210

0942

11.70.580.15

) . (

𝑞𝐶𝐻2𝑂𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4

𝑞𝑥) + (

0020

1 020

0210

) . (

𝑞𝑂2𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂

) =

(

000000)

(

𝑞𝑂2𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂

) = −(

0020

1 020

0210

)

−1

(

1210

0942

11.70.580.15

) . (

𝑞𝐶𝐻2𝑂𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4

𝑞𝑥)

(

𝑞𝑂2𝑞𝑥𝑞𝐶𝑂2𝑞𝐻2𝑂

) = −(

0020

11.70.580.15

1020

0210

)

−1

(

1210

0942

) (𝑞𝐶𝐻2𝑂

𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4)

(𝑞𝐶𝐻2𝑂

𝑞(𝑁𝐻4)2𝐻𝑃𝑂4) = (

−0.025−0.052

)

(

0020

1 020

0210

)

−1

= (

−1010

−0.25000.5

0.5000

7.576.67−6.67−5.67

)

(


) = −(

−1010

−0.25000.5

0.5000

7.576.67−6.67−5.67

)(

1210

0942

) (−0.025−0.052

)

(


) = (

0.74890.6933−0.6683−0.3303

)

F. Anexo: Balance estequiométrico intracelular

Ecuaciones estequiométricas

Fosforilación de glucosa

𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 + 𝐴𝑇𝑃𝑞→ 𝐺6𝑃 Ecuación 19

Ya que una pequeña parte de G6P entra a la ruta de pentosa fosfato se tiene

𝐺6𝑃 + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝑟𝑔𝑟→ 𝑅5𝑃 + 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 Ecuación 20

𝑅5𝑃𝑟𝐵1→ 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 Ecuación 21

𝑟𝐵1 = 𝜇𝐾𝐵1 Ecuación 22

El resto de G6P entra a la ruta de glicolisis para formar piruvato

𝐺6𝑃 + 3𝐴𝐷𝑃 + 2𝑁𝐴𝐷 𝑟𝐺6𝑃→ 2 𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 3𝐴𝑇𝑃 + 2𝑁𝐴𝐷𝐻 Ecuación 23

Piruvato es oxidado a acetyl-CoA

𝑃𝑖𝑟𝑢𝑣𝑎𝑡𝑜 + 𝑁𝐴𝐷 𝑟𝐴𝑐→ 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴 +𝑁𝐴𝐷𝐻 Ecuación 24

En el ciclo TCA, acetyl-CoA es principalmente consumido en las siguientes dos rutas7

𝐴𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴 + 𝐴𝐷𝑃 + 4𝑁𝐴𝐷𝑟𝑇𝐶𝐶→ 2𝐶𝑂2 + 𝐴𝑇𝑃 + 4𝑁𝐴𝐷𝐻 Ecuación 25



𝐴𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 − 𝐶𝑜𝐴𝑟𝐵2→ 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎 Ecuación 26

𝑟𝐵2 = 𝜇𝐾𝐵2 Ecuación 27

ATP adiciona es producido en la cadena de respiración(E. Smith et al., 1983)

1 2⁄ 𝑂2 +𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝑃 𝑂⁄ 𝐴𝐷𝑃 𝑟𝑂2→ 𝑃 𝑂⁄ 𝐴𝑇𝑃 Ecuación 28

El consumo de energía en forma de ATP es asumida principalmente para crecimiento

celular y mantenimiento(S. Pirt, 1965)

𝑟𝐵2 =𝜇

𝑌𝐴𝑇𝑃+ 𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 29

𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1 = 𝑞𝑠 Ecuación 30

Balance de carbono de las ecuaciones Ecuación 21 a Ecuación 23

𝑟𝑔𝑟 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4𝑟𝑇𝐶𝐶 = 2𝑟𝑂2 Ecuación 31

La primera parte de la Ecuación 31 corresponde a la producción de NAD y la segunda

corresponde a NADH tomando 𝑟𝑔𝑟 = 𝑟𝐵1 = 𝜇𝐾𝐵1 y 𝑟𝑇𝐶𝐶 = 𝑟𝐴𝑐 − 𝑟𝐵2 = 𝑟𝐴𝑐 − 𝜇𝐾𝐵2,

sustituyendo 𝑟𝑔𝑟 y 𝑟𝑇𝐶𝐶 por 𝜇𝐾𝐵1 y (𝑟𝐴𝑐 − 𝜇𝐾𝐵2), se obtiene la expresión

𝜇𝐾𝐵1 + 2𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝐴𝐶 + 4(𝑟𝐴𝑐 − 𝜇𝐾𝐵2) = 2𝑟𝑂2 Ecuación 32

La producción de ATP está dada por

3𝑟𝐺6𝑃 + 𝑟𝑇𝐶𝐶 + 2𝑃 𝑂𝑟𝑂2⁄ = 𝑞𝑠 + 𝜇 𝑌𝐴𝑇𝑃⁄ +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 33


Sustituyendo 𝑞𝑠 y 𝑟𝑇𝐶𝐶 con (𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1) y (𝑟𝐴𝑐 + 𝜇𝐾𝐵2)

3𝑟𝐺6𝑃 + (𝑟𝐴𝑐 + 𝜇𝐾𝐵2) + 2𝑃 𝑂𝑟𝑂2⁄ = (𝑟𝐺6𝑃 + 𝜇𝐾𝐵1) + 𝜇 𝑌𝐴𝑇𝑃⁄ +𝑚𝐴𝑇𝑃 Ecuación 34

F. Anexo : Análisis de sensibilidad del modelo 134

G. Anexo: Análisis de sensibilidad del modelo

Modelo 1

Ensayos limitación de sustrato (Tabla 3 – 1)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

kd 0,24 -0,02 0,18 -0,26 0,23 1,34 -5,68 -0,01 0,14 0,02 0,67 0,14 0,01 0,04 0,55 1,50 -0,07 -0,33 2,05 1,77

m1 0,02 0,00 0,01 -0,03 0,00 0,08 -0,66 0,00 0,00 0,00 0,44 0,02 -0,01 0,00 0,13 0,31 -0,01 -0,06 0,45 0,34

m2 0,01 0,00 0,00 -0,02 0,00 0,06 -0,26 0,00 0,00 0,00 0,05 0,00 0,00 0,00 0,09 0,23 0,00 -0,01 0,07 0,05

μmax 5,31 0,00 1,03 -0,48 111,36 1,58 -5,68 199,87 52,73 -156,08 0,71 742,06 -0,02 0,16 0,62 1,87 -0,14 -0,20 2,13 1,85

ks 6,73 -0,27 1,62 0,19 1129,95 0,22 0,00 3327,94 531,28 12340,13 0,12 6935,95 -0,02 16,99 -0,01 0,17 0,48 -0,24 0,01 0,10

μpmax 1,79 0,00 2,10 3,89 0,51 0,74 -313 0,00 0,68 0,52 10,55 0,48

-

45,37 2,12 0,37 8,89 12,66 -0,02 1,06 0,89

H. Anexo : Análisis de sensibilidad del modelo 135

Modelo 2


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

kd 0,0014 0,0199 0,0341 0,0001 0,0044 0,0322 0,0000 0,8700 0,0000 0,0337 1,2579 0,6392 0,0526 0,0000 0,0538 0,0512 0,0000 0,0123 0,0303 0,0168

m1 0,0002 0,0027 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,1452 0,0000 0,0000 0,9414 0,2310 0,0000 0,0044 0,0036 0,0002 0,0000 0,0021 0,0029 0,0009

m2 0,0000 0,0022 0,0000 0,0000 0,0000 0,0004 0,0007 0,0397 0,0000 0,0000 0,1009 0,0394 0,0000 0,0201 0,0016 0,0000 0,0000 0,0000 0,0001 0,0009

μmax 0,0425 0,1106 0,3073 0,0414 0,0647 0,3074 0,0459 0,8976 0,0122 0,0000 1,4090 0,7455 0,1408 0,1662 0,2132 0,1481 0,0062 0,0868 0,0948 0,0444

ks 0,4763 0,5756 1,8644 0,2294 1,3730 2,1876 0,3507 0,0000 1,0505 1,1177 0,1698 0,0651 1,0143 3,8178 0,3172 0,1985 1,5134 0,7637 0,6601 0,6567

kn 0,5716 0,5265 1,0735 0,6465 0,5722 0,9612 0,3498 0,0000 0,5278 1,0535 0,0000 0,0000 0,3264 0,4093 0,4210 0,3476 1,5040 0,6944 0,3674 0,3887

μpmax 0,8554 0,9889 1,4886 0,4864 1,3862 1,1559 0,6509 5,5795 0,9878 1,1702 5,4954 0,1410 2,7394 0,3330 0,8348 0,7894 0,8532 0,8770 0,9621 0,9060

Modelo 3


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

kd 0,736 0,835 0,000 0,000 0,307 0,000 0,065 0,000 0,504 0,000 0,092 0,838 0,000 0,482 0,000 0,820 0,062 0,000 0,000 0,895

m1 0,259 0,241 0,660 0,004 0,282 0,000 0,000 0,143 0,535 0,429 0,072 0,883 0,001 0,486 0,366 0,437 0,403 0,064 0,004 0,162

m2 0,000 0,216 0,324 0,000 0,362 0,009 0,001 0,279 0,000 0,708 0,000 0,330 0,000 0,606 0,366 0,244 0,467 0,207 0,000 0,020

μmax 1,021 1,055 0,062 0,085 0,624 0,096 0,408 0,393 0,896 0,281 0,490 1,068 0,352 0,582 0,209 0,987 0,000 0,300 0,085 1,130

ks 0,975 0,993 1,033 0,960 0,729 0,746 0,772 0,433 0,892 0,990 0,000 0,807 0,788 0,000 0,366 0,953 0,767 0,656 0,593 0,993

n 1,427 1,479 1,169 1,238 1,198 1,240 1,425 1,058 1,984 0,615 1,197 1,458 1,096 1,361 1,085 1,545 1,424 1,122 1,478 1,519

μpmax 0,976 0,994 0,994 0,948 0,885 0,942 0,951 0,731 0,999 0,999 0,715 0,979 0,916 0,647 0,845 0,983 0,905 0,928 0,914 0,999



Modelo 4


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

kd 0,044 0,285 0,266 0,228 0,372 0,186 0,194 0,190 0,275 0,106 0,236 0,100 0,396 0,377 0,173 0,432 0,220 0,169 0,184 0,225

m1 0,000 0,034 0,039 0,000 0,000 0,087 0,030 0,052 0,117 0,000 0,200 0,076 0,121 0,092 0,302 0,086 0,045 0,065 0,092 0,076

m2 0,001 0,014 0,009 0,000 0,000 0,103 0,050 0,082 0,000 0,000 0,000 0,063 0,143 0,352 0,315 0,273 0,000 0,079 0,000 0,000

μmax 0,921 1,086 1,112 1,080 1,135 0,738 0,880 0,812 0,891 0,344 0,828 0,353 1,059 0,848 1,115 1,039 1,098 0,754 1,110 1,106

ks 4,020 1,022 0,964 1,022 0,981 0,905 0,970 0,950 0,951 1,003 0,894 0,437 1,017 1,149 0,961 0,972 0,987 0,947 0,987 0,987

Kn 1,282 1,015 0,999 1,000 0,969 1,371 1,083 1,115 1,000 1,000 1,000 1,000 0,996 0,978 0,998 0,991 0,993 1,155 0,993 0,982

ki 1,629 1,054 1,047 0,932 1,078 0,854 0,927 0,888 0,916 0,366 0,894 0,584 1,012 1,166 1,052 1,019 1,062 0,874 1,071 1,066

μpmax 0,536 1,006 1,002 1,010 1,061 0,998 0,990 0,989 0,923 1,009 0,835 0,198 1,270 0,771 1,076 1,570 1,052 0,987 1,017 1,258

Modelo 5


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

kd 0,242 0,272 0,232 0,277 0,433 0,053 0,198 0,200 0,290 0,034 0,091 0,353 0,739 0,392 0,529 0,515 0,229 0,159 0,191 0,229

m1 0,021 0,016 0,011 0,027 0,000 0,000 0,069 0,106 0,078 0,000 0,102 0,131 0,147 0,119 0,198 0,117 0,068 0,101 0,191 0,176

m2 0,006 0,008 0,005 0,011 0,000 0,014 0,050 0,082 0,000 0,000 0,000 0,018 0,032 0,452 0,109 0,080 0,000 0,079 0,000 0,000

μmax 2,879 0,993 0,600 1,142 1,135 0,000 0,871 0,792 0,796 0,000 0,101 0,390 1,489 0,844 0,856 0,965 1,088 0,751 1,086 1,086

ks 3,673 1,038 0,689 1,032 0,944 0,905 0,973 0,957 0,876 3,554 0,722 0,459 1,016 1,162 1,018 0,924 0,991 0,957 1,005 1,004

μpmax 1,845 2,795 2,104 1,043 0,000 2,002 0,990 0,989 0,830 0,712 0,975 0,423 2,322 0,772 1,076 1,875 1,052 0,988 1,017 1,258

H. Anexo : Análisis de sensibilidad del modelo 137

Modelo 6


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

kd 0,350 0,275 0,404 1,026 0,194 0,996 0,998 0,999 0,343 0,034 2,721 0,800 0,691 0,604 0,740 0,730 0,559 0,738 0,993 0,574

m1 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,014 0,063 0,120 0,116 0,000 2,117 0,268 0,132 0,080 0,074 0,063 0,036 0,160 0,202 0,127

m2 0,163 0,024 0,107 0,000 0,003 0,000 0,000 0,000 0,013 0,000 0,233 0,045 0,000 0,721 0,000 0,000 0,000 0,075 0,033 0,028

μmax 0,475 0,333 0,576 1,178 0,251 1,113 1,143 1,182 0,439 0,000 2,811 1,496 0,737 0,601 0,681 0,680 0,554 1,097 1,134 0,712

ks 0,331 0,175 0,255 0,969 1,397 0,992 0,990 0,986 0,337 0,989 0,000 1,163 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,178 0,821 0,000

Kn 0,633 0,797 0,295 1,024 0,967 1,014 1,017 1,024 0,140 1,103 1,415 0,873 0,809 1,158 1,097 0,934 0,822 0,517 1,147 0,986

ki 0,771 2,398 0,534 0,994 4,340 1,000 1,000 1,000 4,305 1,257 0,591 0,986 0,839 0,773 0,841 0,864 0,916 0,247 1,001 0,978

μpmax 0,350 0,275 0,404 1,026 0,194 0,996 0,998 0,999 0,343 0,034 2,721 0,800 0,691 0,604 0,740 0,730 0,559 0,738 0,993 0,574

Modelo 7


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

kd 0,221 0,001 0,680 0,132 0,268 0,199 0,071 0,328 0,073 0,034 0,090 0,070 0,033 0,170 0,150 0,303 0,029 0,079 0,295 0,106

m1 0,023 0,000 0,000 0,011 0,013 0,000 0,000 0,037 0,000 0,000 0,021 0,026 0,000 0,020 0,129 0,053 0,003 0,000 0,052 0,096

m2 0,007 0,000 0,509 0,004 0,000 0,007 0,002 0,010 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,269 0,046 0,040 0,001 0,001 0,010 0,031

μmax 0,499 0,018 0,807 0,178 0,687 0,217 0,079 0,259 0,978 0,000 1,030 1,858 0,008 0,991 0,802 0,332 0,049 0,028 0,315 1,065

ks 2,521 0,001 0,965 1,470 0,489 3,231 2,480 1,522 0,870 1,090 1,843 0,476 2,346 1,146 9,616 0,531 0,382 1,244 0,984 0,945



μpmax 0,765 0,000 0,601 1,070 0,172 1,010 0,675 2,547 0,904 1,187 0,003 0,000 0,869 1,025 0,217 0,769 0,907 0,945 2,843 1,020

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