Modelado, análisis y control de sistemas biológicos...

Modelado, análisis y control de sistemas biológicos biestables

Autor:

Jesús Jiménez Sobrado

Tutores:

Guillermo Heredia Benot Departamento de Ingeniería de Sistemas y Automática, Universidad de Sevilla.

Luis Merino Cabañas Departamento de Robótica, Visión y Control, Universidad Pablo de Olavide. Titulación:

Ingeniería Industrial Intensificación en Automática Industrial Año:

2013

Escuela Técnica Superior de Ingenieros UNIVERSIDAD DE SEVILLA

MODELADO, ANÁLISIS Y CONTROL DE UN SISTEMA BIOLÓGICO BIESTABLE

Autor:

Jesús Jiménez Sobrado

Ingeniería Industrial, intensificación en Automática Industrial.

Tutores:

Guillermo Heredia Benot

Departamento de Ingeniería de Sistemas y Automática, Universidad de Sevilla.

Luis Merino Cabañas

Departamento de Robótica, Visión y Control, Universidad Pablo de Olavide.

Septiembre, 2013

Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable

Índice

Índice del documento

Preámbulo I

1. Paradigma Actual de la biología sintética III

2. Perspectivas de la Biología Sintética IV

3. Biología Sintética e Ingeniería VI

4. iGEM International Genetically Engineered Machines VII

5. El grupo UPO-Sevilla VIII

6. FlashBacter IX

El Biestable Básico IX

El biestable Mejorado XII

Modelado, análisis y control de un sistema biológico biestable 1

1. Objeto 3

2. Alcance 5

3. Antecedentes. Discusión de Metodologías 7

Características de las Redes Reguladoras de Genes 7

Técnicas de modelado de redes reguladoras de genes 8

4. Decisión de las técnicas de modelado 13

Enfoque determinista 15

1. Especies y reacciones 17

El núcleo biestable 17

El biestable básico 19

El biestable modificado 21

2. Dinámica de las reacciones 24

Transcripción 24

Traducción 25

Índice

Represión 25

Degradación 26

Proteólisis 27

Inhibición ARN antisentido 27

3. Biestable Simple. Consideraciones de modelado 28

Represión y transcripción 28

Régimen permanente para la transcripción 28

Traducción 29

Parámetros 29

Modelo del biestable simple 30

4. Biestable modificado. Consideraciones de modelado 32

Agrupación de ecuaciones 34

Modelo del biestable modificado 34

5. Modelado del Sistema Biestable Simple en cinéticas simples 35

Consideraciones sobre el modelo en EDOs 35

6. Modelado del sistema biestable modificado en cinéticas simples 44

Consideraciones de modelado 44

7. Conclusión de los Modelos 50

Análisis de estabilidad determinista 51

1. Análisis de estabilidad del modelo del biestable simple 53

2. Análisis de estabilidad del sistema biestable mejorado 58

Análisis de bifurcaciones 63

1. Introducción de la teoría de bifurcaciones 65

2. Análisis de bifurcaciones del biestable simple 66

3. Estudio de bifurcaciones del modelo del biestable mejorado 72


Índice

Enfoque estocástico 81

1. La visión de Gillespie 83

Fundamentos de la Cinética Química Estocástica 83

La Ecuación Química Maestra 84

El Algoritmo de Simulación Estocástico 85

Tau-Leaping 87

Aspectos de interés del método 87

2. Scripts en Matlab 89

Algoritmos de simulación 89

Modelos de los sistemas 91

3. Selección de parámetros 95

4. Simulaciones estocásticas del biestable simple 98

5. Simulaciones estocásticas del biestable mejorado 102

Control de los sistemas biestables 109

1. Acciones de control de los biestables 111

Inducción 111

Degradación por temperatura 112

2. Modelo del biestable simple con acciones de control 113

3. Modelo del biestable mejorado con acciones de control 120

Análisis de los resultados experimentales en laboratorio 125

1. Experimentos en laboratorio 127

Sobre las medidas de los experimentos 127

2. Resultados experimentales del biestable básico 129

Conclusiones de los experimentos realizados sobre el biestable simple 133

3. Resultados experimentales del biestable mejorado 134

Conclusiones de los experimentos 136

4. Conclusiones generales de los experimentos en laboratorio 137

Índice

Conclusión final 139

Bibliografía 141

ANEXO: Fundamentos Biológicos


Preámbulo I

Preámbulo

Para la lectura de este proyecto fin de carrera, se aconseja la lectura este primer documento, donde se situará al lector dentro del marco histórico y científico en el que este estudio se desenvuelve.

A pesar de tratarse de un trabajo sobre Ingeniería Industrial, cuyo desarrollo radica en el estudio del modelado matemático de sistemas, los procesos sobre los que se trabajarán, tienen un cariz algo alejado de lo cotidiano dentro del mundo de la Ingeniería, en concreto, la biología molecular.

Así pues, también se recomienda hacer una lectura del anexo final “Fundamentos Biológicos”, donde se describen los entes e interacciones necesarias para la comprensión global del sistema que se va a tratar.

Muchas Gracias

II Preámbulo


Preámbulo III

1. Paradigma Actual de la biología sintética

La Revolución Industrial supuso un fuerte cambio de paradigma tecnológico y social que históricamente desembocó en un cambio Era. Durante la edad contemporánea las estructuras económicas europeas fueron remodeladas de tal forma que surgió una nueva estructura social acorde con las nuevas necesidades ocupacionales. A la par con la Revolución Industrial, el propio surgimiento de los modelos de estado democráticos no habría sido tan efectivo sin la participación de los vigentes avances tecnológicos que ayudaron a equiparar el poderío del ciudadano frente a las antiguas clases dominantes. Todo ello ha dado lugar a la adecuada transformación de la sociedad y de las relaciones propias que se establecen entre los diferentes estratos.

Todas las revoluciones de nuestra era han llevado consigo el descubrimiento de un nuevo concepto y el nacimiento de las ciencias que apoyaban estas ideas. La Primera Revolución Industrial se produjo después de la aparición de la máquina de vapor, las mejoras que se sucedieron tras ella incitaron el estudio de la Termodinámica y el uso de la energía térmica. Algo parecido ocurrió con la electricidad durante la denominada Segunda Revolución Industrial que, tras la formulación de las leyes de Maxwell, el estudio desembocó en nuevos avances técnicos. La conjunción del concepto (Energía térmica, democracia, electricidad,…) y el espíritu innovador propio del ser humano, es suficiente para que las bases de una nueva época se establezcan.

Una situación diferente está teniendo lugar con la Información. Ésta ha conseguido un objetivo mucho más amplio que las anteriores, estar presente en diversas disciplinas. Desde la biología con la genética, o la física con las actuales teorías de campos unificados, utilizan el concepto de Información como algo inherente en la realidad. Es esta idea la que radica en la computación o Internet. Por tanto, el avance actual de las ciencias no puede comprenderse sino como una relación interdisciplinar.

Observando el presente, podemos sugerir cuáles serán las disciplinas que están destinadas a revolucionar nuestra concepción del mundo en los años venideros. Entre las posibilidades dentro del mundo de la Ingeniería podemos encontrar el estudio de nuevos materiales que está consiguiendo grandes avances en los últimos años y por otro lado la robótica o la nanotecnología, que, aunque fueron grandes apuestas en las últimas décadas, no han conseguido diversificar su campo de aplicación o reformarse para tomar la iniciativa del verdadero cambio de paradigma que se esperaba de ellos.

La gran apuesta actual parece ser la Biología Sintética. Recordemos que las anteriores revoluciones comenzaron con una idea, un concepto, del cual surgen estudios en diferentes disciplinas y una ciencia la respalde. En este caso concreto, fue el descifrado del código genético junto con la posibilidad de creación de nuevas especies, la idea precursora de este campo de estudios.

IV Preámbulo

2. Perspectivas de la Biología Sintética

La Biología Sintética tiene unas perspectivas de aplicación verdaderamente asombrosas. Medio Ambiente, biomateriales, procesos industriales, bioenergías, Biomedicina son unos de tantos ámbitos en los que la biotecnología podría participar.

Leyendo el Informe de Vigilancia Tecnológica en Biología Sintética realizado por GENOMA ESPAÑA Tendencias en 2006 [1] podemos concretar éstas perspectivas de aplicación y hacernos una idea de cuán cercanas se encuentran. En el apartado sexto ‘Perspectivas Futuras de la Biología Sintética’ se analizan estos aspectos.

Sintetizando el análisis, el informe muestra el siguiente cuadro:

Como se observa en el cuadro resumen, se contempla los siguientes campos: Medio Ambiente, Materiales, Procesos Industriales, Energía y Biomedicina. Efectivamente, la Biología Sintética se muestra como el gigante capaz de revolucionar tantos ámbitos como quepa esperar.


Preámbulo V

La Fundación Alternativas sacó en 2011 un informe llamado Realidad y expectativas de la biología sintética. El documento recoge la transcripción de las ponencias de los participantes un seminario del Laboratorio de Alternativas.

Al final, se hace una recopilación de las conclusiones que se decidieron de las jornadas. Entre ellas, destaco:

“…

2. La aplicación de los sistemas de trabajo de la ingeniería a la resolución de problemas biológicos está originando avances muy significativos en la biología y en sus aplicaciones biotecnológicas.

3. El uso de los métodos de cálculo avanzado permite conocer el funcionamiento de sistemas biológicos complejos. Estos pueden ser distribuidos en unidades teóricas que pueden considerarse como “piezas” de un proceso completo.

…

7. Esta área científica se encuentra en sus fases iniciales. Aunque los grupos norteamericanos son los más avanzados, no existe demasiada diferencia con los pocos grupos europeos que trabajan en este campo.

8. En España hay varios grupos de gran calidad trabajando en biología sintética y las áreas relacionadas.

…” [2]

Entre estos comentarios, se destaca el gran avance que actualmente está sufriendo esta disciplina y cómo no hay grandes diferencias entre los grandes centro de investigación del mundo.

VI Preámbulo

3. Biología Sintética e Ingeniería

Veamos algunas de las definiciones de que se han dado a la Biología sintética:

”…la ingeniería de la biología: la síntesis de complejos, sistemas basados biológicamente inspirados que desempeñan funciones que no existen en la naturaleza.”

Según: Applying Engineering to Biology: Report of a NEST High-Level Expert Group

“…La Biología Sintética se define como la síntesis de biomoléculas o ingeniería de sistemas biológicos con funciones nuevas que no se encuentran en la naturaleza…”

Wikipedia: Biología Sintética

“…Diseño y fabricación de componentes biológicos que no existen en la naturaleza…”

Tanto en las definiciones citadas como en los pilares de la propia Biología Sintética, se incluye la Ingeniería, la creación y el estudio de Sistemas como parte fundamental de su desarrollo. Es por tanto, una de las tareas que los ingenieros han de ir abarcando si, de hecho, este campo tan asombroso puede llegar a revolucionar el mundo.

La Biología Sintética nace después del avance de la Biología de Sistemas y de la Ingeniería Genética. La primera se centra en el estudio de los organismos a través de simulaciones basadas en algoritmos de resolución de los modelos matemáticos que ajustan el comportamiento de los sistemas; mientras que la Ingeniería Genética ha conseguido modificar los genes de los organismos para crear nuevos entes biológicos.

Algunos autores han señalado que hay que adaptar los métodos de trabajo de la Ingeniería para el desarrollo de la Biología Sintética. Bajo este supuesto, las cuatro ideas básicas que se deben ir cubriendo son:

• Estandarización de partes biológicas • Reparto y especialización de tareas • Organización de jerarquías • Diseño de dispositivos autorreplicativos

Bajo estas premisas, aparece en el MIT (Massachusetts Institute of Technology) el primer concurso internacional de Biología Sintética llamado iGEM (International Genetically Engineered Machine)


Preámbulo VII

4. iGEM International Genetically Engineered Machines

La idea surge entre algunos profesores de ingeniería del MIT (Drew Endy y Tom Knight) con la finalidad de ser referencia internacional en Biología Sintética. Así, en 2003 en el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) comienza un curso de verano en el que un grupo de estudiantes diseñan sistemas biológicos. Esto evolucionó hacia una competición que año tras año ha crecido en número de participantes a nivel mundial. Desde 2004 con 5 equipos llegaron a 165 en 2011. El concurso ha conseguido ser uno de los pilares fundamentales de la Biología Sintética a nivel internacional [1].

El iGEM además de servir de herramienta educativa y difusiva, encaja perfectamente en este planteamiento. Además de estimular la creación de grupos de trabajo de estudiantes de diversas disciplinas, se está creando toma una base de datos de registros de partes [2] utilizadas por cada grupo, alcanzando un grado de estandarización dispositivos.

Las esperanzas que están puestas en esta ciencia y concretamente en este concurso han hecho que tenga unos patrocinadores del nivel de FBI, NASA o MathWorks, que además son ajenos a la investigación de este campo. Entre los logros que está consiguiendo este concurso, muestro dos de los proyectos que se han presentado:

• Grupo Imperial College de Londres. En 2011 participaron con el proyecto Auxin, que se presentaba como un refuerzo en la lucha contra la desertificación del planeta. Crearon un producto que ayudaba a las plantas a arraigar en zonas de desertificación. http://2011.igem.org/Team:Imperial_College_London

• Grupo Washington. En 2011 participaron con el proyecto “Make it or Break it: Diesel Production and Gluten Destruction, The Synthetic Biology Way”. Un doble trabajo sobre la producción de Biofuel utilizando bacterias genéticamente ingeniadas, y sobre la eliminación del Gluten de los alimentos como solución a aquellos que sufren Celiaquía. http://2011.igem.org/Team:Washington

Estos dos proyectos son claros ejemplos de cómo esta ciencia es de muy amplia aplicación y de cómo hoy por hoy ya está consiguiendo resultados tangibles.

Randy Rettberg, Ingeniero investigador del MIT de Massachusetts en la división de Ingeniería Biológica, dijo en otro artículo realizado por El País: “…la biología sintética la harán compañías nuevas y acabará creando su propia industria”.

VIII Preámbulo

5. El grupo UPO-Sevilla

En 2010 se crea este grupo por iniciativa de estudiantes de la licenciatura de Biotecnología en la Universidad Pablo de Olavide. Estos estudiantes (Adrián Arellano, David Caballero, Félix Reyes, Paola Gallardo, Eduardo Pavón y Eva Fernández) cuentan con el apoyo, supervisión y colaboración de los profesores Fernando Govantes y Luis Merino para participar por primera vez en el concurso iGEM en ese mismo año. Preparan el proyecto ‘Bacterial Crowding’ con el que terminan compitiendo. El objetivo principal del trabajo fue el de explorar la posibilidad de dirigir una pequeña población de bacterias hacia una diana expuesta en una superficie biológica para conseguir una interacción eficaz.

Fue el primer equipo andaluz y tercero de España en competir en el concurso y recibió una medalla de bronce honorífica por el trabajo realizado.

Página web del proyecto: http://2010.igem.org/Team:UPO-Sevilla

En 2011 tras la experiencia del año anterior, el grupo continúa su voluntad de competir y otros estudiantes y profesores se adhieren, logrando doblar el número de participantes.

• Alumnos: David Caballero, Aida Moreno, José Gutiérrez, Paola Gallardo, Adrián Arellano, Amalia Martínez, Eduardo Pavón, Félix Reyes, Yolanda González y Jesús Jiménez.

• Profesores: Luis Merino, Fernando Govantes, Víctor Álvarez, Manuel Béjar, Rafael Rodríguez, Antonio Prado, Antonio Pérez

La incorporación de personal más especializado hace posible realizar un proyecto más profundo y amplio. El objetivo general marcado fue el de sumergirse en el estudio de sistemas biológicos biestables. Basado en artículos de investigación y en trabajos ya realizados, consiguen preparar un trabajo competitivo.

En la competición regional europea celebrada en Amsterdam en Octubre del 2011, logran el pase a la final mundial y reciben el premio a la mejor labor de difusión ‘Best Human Practices Advance’. El mérito más reconocido, fuera de lo estrictamente científico, fue el de crear el primer blog en español sobre Biología Sintética [1] que tenía 66 post y recibió más 11.000 visitas hasta la fecha de la competición europea.

Página web del proyecto: http://2011.igem.org/Team:UPO-Sevilla


Preámbulo IX

6. FlashBacter

El proyecto presentado por el grupo UPO-Sevilla para el concurso de Biología Sintética iGEM 2011, pretendía continuar el trabajo realizado por numerosos investigadores en su búsqueda de sistemas biológicos biestables. La búsqueda de un biomarcador robusto, estable y de alta sensibilidad es la base de los sistemas de almacenamiento de la información en informática. El objetivo marcado fue el de la construcción de microorganismos que tengan la capacidad de almacenar información al igual que se hace en electrónica, en dos estados estables distinguibles.

En este sentido, el grupo subdividió parte del trabajo en 3 partes.

• El biestable básico (The Toggle Switch) – Este apartado, puso en marcha el dispositivo descrito por Timothy S. Gardner [1], y trabajar con él hasta conseguir sus curvas de funcionamiento.

• El biestable mejorado (Improving Toggle Switch) – Esta idea se basa en la del artículo mencionado anteriormente, pero lleva dos mejoras con el objetivo de lograr una estabilidad más evidente, y aumentar la robustez del sistema.

• El biestable epigenético (Epigentic Bistable) – Esta idea es algo más compleja desde el punto de vista biológico. De alguna manera, la robustez con este diseño estaría muy por encima de los anteriores. Además de usar unos fundamentos diferentes para conseguir tanto los estados de funcionamiento, como la estabilidad propia del sistema.

El Biestable Básico

El sistema básico consiste en un conjunto de dos represores controlados por dos promotores que se reprimen en presencia del represor gobernado por el promotor adversario.

La imagen esquemática del sistema recuerda al esquema de los biestable electrónicos tipo RS, donde tenemos dos señales de acción y dos salidas. A pesar de que pueda parecer más complejo, se tratan básicamente de mismos esquemas.

X Preámbulo

El cambio de estado se produce por la adición de un químico que se asocia con alta afinidad al represor 1 y lo inactiva. Así se favorece la síntesis del represor 2 y queda reprimida la expresión del primero. La estabilidad se encuentra en el propio ciclo de retroalimentación que provoca que la aparición de uno de los productos sea inhibidora de la acción contraria. Durante la síntesis del represor 2 se produce una molécula fluorescente (GFP – green fluorescent protein) que facilitará el reconocimiento de este estado ya que la bacteria, físicamente, se iluminará de color verde. Si en este momento, aumentamos la temperatura del ambiente en el que está inmersa la bacteria hasta unos 42ºC, la proteína represora 2 se desestabiliza y se degrada más rápidamente. Esto hace que la expresión del represor 1 sea posible al no sufrir la acción inhibitoria que ejercía la partícula adversaria. De forma análoga a la anterior, el represor 1 se unirá al promotor 1 evitando así la expresión de su competidor. La nueva producción de proteína lleva asociada otra partícula fluorescente (RFP – red fluorescent protein)

Veamos el Data Page elaborado por Amalia Martínez Segura en el marco de este proyecto.


Preámbulo XI

Otros sistemas parecidos a éste han sido desarrollados y probados por otros investigadores consiguiendo un éxito considerable. Sin embargo, la simplicidad de estas construcciones tiene ciertos inconvenientes en la consecución de un biestable con unas características similares a las de los informáticos:

• Baja velocidad en el cambio. Esto provoca que durante las etapas intermedias nos encontremos con una mezcla de partículas de ambos represores en convivencia transitoria que hace difícil la determinación del estado.

• En ausencia de señal de control, el sistema tiende espontáneamente a un estado aleatorio. Incluso en el caso de favorecer alguna expresión, la falta de autoexclusión hace fallar la robustez.

• Incluso con la inducción del químico, no siempre es posible asegurar que el estado se mantenga estable.

XII Preámbulo

El biestable Mejorado

El núcleo del sistema sigue siendo el mismo que el del biestable básico, sin embargo, en este caso se añaden dos nuevos efectos que mejorarán la exclusión de una reacción frente a la otra.

Los dos efectos que se añaden en este nuevo concepto son: Proteólisis y ARN antisentido.

PROTEÓLISIS

Cuando se expresa una de las proteínas represoras se crean además, proteasas. La labor de las proteasas es la de digerir las proteínas del estado anterior que queden en la bacteria. De esta manera se acelera la posición de la primera proteína como mayoritaria. La proteasa utilizada en la construcción es ClpX, que degrada sustratos a los que se les asocia un adaptador SspB.

ARN ANTISENTIDO

Durante la expresión de una de las proteínas, junto con ella se producen estas moléculas. Estos ARN tienen la misma estructura que la del ARN mensajero de la proteína adversaria. Cuando un ARN mensajero y su ARN antisentido se encuentran, se unen, eliminando así la posibilidad de que sean traducidas en una nueva proteína.


Preámbulo XIII

COMPORTAMIENTO GLOBAL

Estas dos nuevas acciones trabajan en colaboración con el sistema anterior para la robustez del sistema.

La idea por tanto, es añadir esta secuencia (Das4) específica en la fase de la proteína LacI y expresar condicionalmente el adaptador proteico bajo el promotor que controla el otro estado, de modo que cuando se añade IPTG, este inhibe la acción de lacI, que además es degradado por ClpX, incluso en ausencia de IPTG, eliminando cualquier actividad residual del inhibidor LacI y haciendo el cambio mucho más rápido.

En el otro caso además se incluirá en la fase de la GFP y su regulador correspondiente una secuencia con alta afinidad por un RNA antisentido específico que previsiblemente inhibirá su traducción. La secuencia se identifica como Ompn.

Veamos el Data Page realizado por Félix Reyes Martín y Yolanda Elisabet González Flores.

Estas implementaciones por un lado aumentarán radicalmente la velocidad de cambio de un estado a otro y por otro harán mucho más robusto todo el sistema, ya que los posibles niveles basales de los promotores y la relajación de los sistemas de inhibición se verán anulados imponiendo dos escalones más de regulación por la proteólisis e inhibición de la traducción.

XIV Preámbulo


Introducción 1

Modelado, análisis y control de un sistema biológico

biestable

El trabajo que se detalla en este documento compendia y profundiza en los estudios de modelado matemático que llevé a cabo durante el año 2011 para el proyecto de investigación 'Flashbacter' realizado por el grupo de trabajo UPO-Sevilla.

En el preámbulo del texto, se ha intentado situar al lector en el contexto de la Biología Sintética como marco científico y tecnológico. Además se recomienda la lectura del “Anexo: Fundamentos Biológicos” al final de este documento para el lector no conocedor de aspectos de biología molecular.

El desarrollo que se explica a continuación elaborará una argumentación que pasará desde la presentación de las construcciones a modelar y su comportamiento esperado, hasta la contraposición de los resultados extraídos de las simulaciones realizadas en Matlab, con los resultados experimentales presentados en el concurso de biología sintética iGEM 2011.

Además, a lo largo de todo este estudio, se mostrarán el bajo el cual se han alcanzado todos los sistemas, se procederá a un análisis de estabilidad, robustez y bifurcaciones en los parámetros. Tras ellos, y con el enfoque estocástico, se simularán los modelos estudiados, logrando así una comprensión mayor de los mismos.

Por último, y antes de las conclusiones finales del documento, mostraremos los resultados experimentales que, el grupo de investigación UPO-Sevilla de la Universidad Pablo de Olavide, realizaron durante el año 2011.

2 Introducción


Introducción 3

1. Objeto

El proyecto Flashbacter creó un sistema que variaba entre dos situaciones estables. Al igual que un conmutador puede estar abierto o cerrado, se planteó la posibilidad de tener un sistema viviente que asemejara su comportamiento al de un interruptor. Así, partiendo de diversos estudios actuales que habían conseguido sintetizar construcciones que actuaban de esa forma, se buscó ir un paso más allá en la creación de nuevas células que tuvieran un comportamiento más estable y robusto.

El problema surge en el momento de comprender el sistema una vez creado. Una bacteria es un sistema viviente cuyas interacciones internas no se pueden controlar desde el exterior. Aunque ésta se usa como chasis, i.e. como ambiente aislado, no es controlable cada aspecto de la evolución de las poblaciones. Además, tampoco es posible obtener una medición fiable de la cantidad de moléculas que se encuentran en su interior.

Dada la dificultad que se encuentra al tratar con sistemas vivientes donde no podemos predecir exactamente lo que ocurre en su interior, se hizo necesario tener una herramienta capaz de simular este funcionamiento de la forma más simple y rápida posible. Es esta necesidad la que se intentó cubrir con el trabajo que se presenta a continuación.

Por lo tanto, los objetivos generales que pretende cubrir este estudio son:

• Crear modelos fiables de los sistemas que comprende el proyecto Flashbacter. • Lograr que las simulaciones de estos modelos reproduzcan el comportamiento

cualitativo observado en laboratorio. • Profundizar en el estudio de los modelos, de forma que podamos conocer la

estabilidad y robustez de cada sistema. • Modelar las acciones de control sobre los sistemas. • Desarrollar herramientas de simulación, no sólo para estos sistemas.

4 Introducción


Introducción 5

2. Alcance

Tras haber definido el objeto del proyecto, se comenzó a plantear la alcanzabilidad de tales propósitos.

En un primer enfoque se pensó en la posibilidad de estudiar el sistema en laboratorio, de forma que pudiéramos obtener diferentes datos acerca del comportamiento de algunas de las especies interviniente. De esta forma, podríamos aproximar los modelos, conociendo parte de las evoluciones reales, a la realidad.

Esta primera idea se desechó debido a la dificultad de estudio de etapas tan específicas de las reacciones moleculares como a la cantidad de datos necesarios.

Se comprendió que lo primero que se haría era comenzar con el modelo matemático e ir simplificándolo hasta hacerlo lo más manejable posible. Así, a partir de estudios anteriores de otros científicos, podríamos establecer una meta alcanzable y realista.

El modelo simplista debería ayudarnos a comprender de forma global las respuestas observadas en laboratorio. Sin embargo, el modelo no podría asemejarse cuantitativamente a lo observado a través de los experimentos dada la dificultad de encontrar experimentos válidos para nuestra construcción en la bibliografía.

Así, establecemos los siguientes puntos a alcanzar dentro de este estudio:

• Crear modelos cualitativos. • Análisis de estabilidad de tales modelos. • Análisis paramétrico y de bifurcaciones. Establecer valores críticos. • Modelado cualitativo de las acciones de control. Comprender la manera en que

éstas afectan al sistema autónomo.

Por lo que, los resultados que de este documento extraigamos:

• No reflejarán los comportamientos estudiados en laboratorio. • Los valores de decisión que podamos obtener durante el desarrollo, serán

orientativos y cualitativos, entendiendo que suponen una barrera para la estabilidad o robustez del sistema, pero no así su valor concreto.

6 Introducción


Introducción 7

3. Antecedentes. Discusión de Metodologías

El problema al que nos enfrentamos al comenzar la tarea de modelado del sistema biológico es el de encontrar el método adecuado. Las redes reguladoras como sistemas biológicos reales no tienen un comportamiento ideal ni determinista, lo cual, implica que sea necesario utilizar técnicas de modelado no convencionales que nos pongan a disposición una visión más amplia y adecuada del funcionamiento interno de los entes biológicos que participan de la regulación.

Características de las Redes Reguladoras de Genes

La expresión de un gen es un proceso complejo regulado por varias etapas de diferentes niveles. Una red reguladora de genes se compone de la expresión de las proteínas reguladoras (que a su vez se descompone en la transcripción y traducción del gen), de su activación o inhibición, además de la síntesis y degradación de las especies intervinientes, tales como, ARN mensajero, ARN polimerasa, ribosomas, proteasas,... La gran cantidad de datos de los que se compone un sistema de este tipo convierte el estudio de su dinámica en una tarea compleja.

8 Introducción

Desde la visión de la mecánica clásica, dadas unas condiciones iniciales y definidas las ecuaciones diferenciales que gobiernan el comportamiento del sistema, es posible conocer el estado final que alcanzará en un determinado tiempo. Sin embargo hay varias razones por las que en nuestro sistema, esto no es válido:

• Incluso si el sistema evolucionara de forma determinista respecto a posición, velocidad, aceleración de las partículas y población de las especies, le evolución de cada una de ellas no puede ser calculada deterministamente.

• No se pueden evitar las implicaciones que resultan de la indeterminación cuántica. No podemos saber cuándo se producirá la reacción.

• El sistema real no puede estar mecánicamente aislado.

Según Adam P. Arkin, “Las simulaciones deterministas son suficientes para predecir el comportamiento medio de los niveles de población, pero no pueden abordar cuestiones sobre el ruido, el cambio aleatorio entre estados estables del sistema, o el comportamiento del sistema con unas pocas moléculas de las especies claves. Estos temas se tratan con simulaciones estocásticas” [1].

Técnicas de modelado de redes reguladoras de genes

Se expondrán a continuación algunas de las técnicas de modelado para redes reguladoras de genes, que se utilizan hoy día entre numerosos investigadores. Tras la exposición de los diferentes enfoques se incluirá una decisión y los motivos que han llevado a adoptarlos.

Entre las más importante se encuentran: Modelo en EDOs (Ecuaciones Diferenciales Ordinarias) acopladas, Redes de Petri, Booleanas o Bayesianas, o Ecuaciones Estocásticas.


Introducción 9

ECUACIONES DIFERENCIALES ORDINARIAS

Es el método más utilizado para el estudio de sistemas en ingeniería y ha sido amplia su aplicación para el estudio de sistemas reguladores de genes. Gracias a esto, en la literatura podemos encontrar un amplio número de enfoques de modelado por ecuaciones diferenciales ordinarias así como de diversas leyes cinéticas.

La regulación se modela mediante ecuaciones cinéticas del nivel de expresión de cada componente del sistema como una función de la concentración del resto de componentes.

𝑥 = [𝑥1, … , 𝑥𝑛]′ ≥ 0 Concentración de las proteínas, y otros elementos.

𝑑𝑥𝑖𝑑𝑡 = 𝑓𝑖(𝑥), 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 Ecuaciones cinéticas del nivel de expresión de cada elemento.

También existe una versión discreta en el caso en que se desee modelar los retrasos debidos al tiempo que requiere cada reacción en ocurrir.

Consideraciones

• Resulta adecuado utilizar el método cuando lo que son resultados cualitativos del sistema que se analiza.

• La simulación del funcionamiento de las redes se suele complementar con un análisis de bifurcaciones para investigar la sensibilidad de los regímenes permanentes y los valores de los ciclos límites de los parámetros.

• El principal problema que tiene este método es que es muy difícil encontrar valores para los parámetros cinéticos. Sólo están disponibles valores para sistemas que se han estudiado en profundidad.

• Los parámetros se estimaran usando técnicas de identificación de sistemas.

10 Introducción

REDES BAYESIANAS

El regulador génico es un sistema donde cada módulo recibe un número de entradas y las procesa según combinaciones lógicas que confiere al sistema una característica de causalidad. Por otro lado, la red se componente de diversos subconjuntos que realizan una función específica. Las redes bayesianas representan comúnmente una red de variables cuyas relaciones son causales. La probabilidad condicional, de la que hace uso esta técnica, parece las más adecuada para interpretar las relaciones que se establecen entre los subsistemas de los que se compone una red reguladora compleja.

La estructura de los sistemas reguladores de genes se modela a través de un grafo 𝐺 = ⟨𝑉,𝐸⟩. Los nodos representan los genes u otros elementos a los que se le asocie una variable aleatoria. Si el nodo es un gen, la variable describe su nivel de expresión. A cada variable aleatoria se le asocia una probabilidad condicional. El grafo G y las probabilidades condicionadas definen la red bayesiana.

𝑋 = {𝑥1, … , 𝑥𝑛} Variables aleatorias de la red

𝑖 ∈ 𝑉 , 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 Cada uno de los nodos de la red

Pr{𝑥1, … , 𝑥𝑛} = ∏ Pr{𝑥𝑖|𝑝𝑎(𝑋𝑖)}𝑛𝑖=1 Distribución de probabilidad de X

Consideraciones

• Este método es muy atractivo ya que la base estadística es muy sólida, permitiendo incorporar los aspectos estocásticos de las redes reguladores y los ruidos de las mediciones de forma natural en el modelo.

• Tienen el problema de eliminar la dinámica implícita en la regulación de genes. Una solución de este inconveniente es la de estudiarlos haciendo uso de las redes bayesianas dinámicas.


Introducción 11

REDES BOOLEANAS

Los nodos del gráfico de una red booleana, se asocian a un gen y otro elemento que participe en el sistema. Cada uno de los nodos se puede describir en 2 estados: activo/inactivo. El estado de un gen se puede describir como una variable Booleana que indique si está activa su expresión o no. Las interacciones entre los elementos también se pueden representar mediante funciones Booleanas que calcule el estado de un gen a través de la activación de otros.

𝑥� = {𝑥�1, … , 𝑥�𝑛} Variables booleanas que describen el estado de un sistema regulador de genes de n elementos.

𝑥�𝑖(𝑡 + 1) = 𝑏�𝑖�𝑥�(𝑡)�, 1 ≤ 𝑖 ≤ 𝑛 El nuevo estado de cada variable booleana se calcula a través del estado actual y de una función booleana 𝑏�𝑖.

Consideraciones

• No es posible incluir los efectos de aleatoriedad o ruidos. • Las redes booleanas son muy aconsejables en el caso de tener grandes redes

reguladoras de genes. Las simplificaciones que hace sobre la estructura de estos sistemas, permite analizarlos de una manera muy eficiente.

• Las transiciones entre estados se asumen síncronos, pero el algoritmo no es capaz de tratar con situaciones no simultáneas.

• El nivel de expresión de un gen sólo se puede modelar como activo/inactivo

12 Introducción

ECUACIONES ESTOCÁSTICAS MAESTRAS

Este método toma modelos discretos y estocásticos de la red reguladora. Tomando variables discretas para el número de moléculas de cada especie, y una función de distribución probabilística.

𝑝(𝑋, 𝑡 + ∆𝑡) = 𝑝(𝑋, 𝑡)�1 −�𝛼𝑗∆𝑡𝑚

𝑗=1

� + �𝛽𝑗∆𝑡𝑚

𝑗=1

Evolución temporal de las poblaciones

𝑚 El número de reacciones que pueden ocurrir en el sistema

𝛼𝑗∆𝑡 Probabilidad de que ocurra la reacción j en el intervalo de tiempo [𝑡, 𝑡 + ∆𝑡)

Hallando ∆𝑡 → 0 se alcanza la expresión de la ecuación maestra

𝜕𝜕𝑡𝑝(𝑋, 𝑡) = �𝛽𝑗 − 𝛼𝑗 · 𝑝(𝑋, 𝑡)

𝑚

𝑗=1

Consideraciones

• La resolución analítica resulta aún más complicada que en el enfoque determinista

• Bajo ciertas condiciones, la ecuación maestra se puede simplificar en ecuaciones diferenciales estocásticas, permitiendo aligerar el coste computacional para la resolución numérica.

• La aproximación de la realidad molecular de una red reguladora es mucho más cierta.


Introducción 13

4. Decisión de las técnicas de modelado

Las técnicas basadas en redes (Booleanas, Bayesianas) parecen muy adecuadas para sistemas reguladores de subconjuntos y especies al permitir establecer relaciones muy simples entre ellas. Aunque nuestro sistema no sea demasiado complejo, lo que pretendemos conseguir con el modelo es hacer una descripción capaz de reproducir los resultados mostrados en laboratorio de la bacteria.

Las redes no profundizan en las dinámicas de las reacciones, y centran su estudio en el comportamiento global. Además, parece no ser posible introducir en las probabilidades de las transiciones, las dinámicas propias de las reacciones moleculares. Por ese motivo, las redes no permiten alcanzar el nivel de profundidad en el estudio del comportamiento ni identificar los procesos que confieren la estabilidad. No nos interesa este enfoque, ya que no parece que cubra el objetivo planteado.

Por otro lado, el modelado en ecuaciones diferenciales ordinarias no lineales plantea una situación determinista y los efectos del ruido propio de un sistema molecular no se modelan. Una resolución analítica no tiene sentido plantearla para mecanismos donde la aleatoriedad gobierna el desarrollo dinámico de las especies. Sin embargo, parece muy adecuado comenzar con esta técnica para obtener unas primeras nociones del comportamiento global al que tenderá en función de los diferentes estados que pueda alcanzar.

Por último, acudimos a las ecuaciones estocásticas maestras. Parece el más adecuado de todos para hacer un estudio cuantitativo y cualitativo del sistema. El inconveniente que tenemos es que no tenemos tantas herramientas como en el caso anterior para comprender la estabilidad y robustez del sistema.

Por estos motivos, nos parece adecuado llevar a cabo un doble modelado. Comenzaremos estudiando el sistema a través del método por EDO. Tras el análisis de estabilidad y de bifurcaciones en los parámetros y una comprensión del comportamiento global que muestra el sistema, acudimos al modelado por ecuaciones estocásticas maestras.

14 Introducción


Enfoque Determinista 15

Enfoque determinista

En esta sección, comenzaremos recorriendo las especies participantes tanto en el biestable simple como en el mejorado, y las relaciones que se producen entre ellas, con el objeto de alcanzar un modelo de sistema en ecuaciones diferenciales ordinarias.

La estructura de este apartado continuará con el detalle de las posibles reacciones que se puedan establecer en entre las especies, para más tarde, analizar las dinámicas de cada especie. Seguiremos nombrado y aplicando las simplificaciones y consideraciones oportunas en búsqueda de la expresión de un sistema matemático manejable.

Para finalizar, mostraremos el modelado final y realizaremos un estudio preliminar de las constantes y parámetros que participan a fin de comprender el efecto sobre los resultados que se puedan extraer de las simulaciones.

Durante este apartado, gran parte del desarrollo se ha seguido el planteamiento propuesto por Timothy S. Gardner en el estudio: “Design and construction of synthetic gene regulatory networks” [2] publicado por la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Boston en el año 2000.

16 Enfoque Determinista



1. Especies y reacciones

El núcleo biestable

Identificamos esta unidad como el conjunto de especies y relaciones que en su funcionamiento autónomo logra alcanzar los objetivos mínimos y necesarios para mantener un comportamiento definido biestable. Por tanto, no incluimos las acciones que nos permitan modificar dichos estados, ni siquiera, nos referimos a un sistema robusto.

Aquí encontramos las expresiones de ambas proteínas represoras y las mutuas represiones de sus expresiones. El conjunto de especies que intervienen en el sistema propuesto son:

Promotores ARNm Represores

𝑃𝑟𝑚 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑙𝑎𝑐𝐼 𝐿𝑎𝑐𝐼

𝑃𝑙𝑎𝑐 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 𝑐𝐼

Además, estas especies reaccionan entre sí de la forma que muestra la siguiente imagen:


Por otro lado, las reacciones son:

Transcripción LacI 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑃𝑙𝑎𝑐 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼

Traducción LacI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐿𝑎𝑐𝐼

Represión LacI 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝑃𝑟𝑚 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚

Transcripción cI 𝑃𝑟𝑚 → 𝑃𝑟𝑚 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼

Traducción cI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 + 𝑐𝐼

Represión cI 𝑐𝐼 + 𝑃𝑙𝑎𝑐 → 𝑐𝐼|𝑃𝑙𝑎𝑐



El biestable básico

(Plásmido BBa_177038) [3]

Para completar el esquema hasta llegar al del biestable simple, debemos añadir sobre el núcleo anterior, las especies y dinámicas de las acciones que nos permitirán controlar el estado activo, además de los indicadores.

INDICADORES

Es necesario el modelado de los indicadores ya que cuando analicemos los resultados que se hagan en laboratorio, no obtendremos las evoluciones de las proteínas represoras sino de los indicadores. Por lo tanto es necesario conocer su dinámica para poder extrapolar los datos que extraigamos de los experimentos hacia un conocimiento interno del sistema. Analizamos este hecho de forma detenida.

Cuando el transcriptor, se encuentra con un promotor, comienza a leer la cadena y cuando termina de leer su código es cuando comienza a crear la cadena de ARN transcrito.

De la transcripción obtendremos una ARNm, una para la proteína represora y otra para el indicador. Las cadenas negras de la imagen, reflejan la presencia de terminadores. Estos entes tienen una significación y un objetivo claro para la traducción. La polimerasa detendrá su copia al encontrarse con un doble terminador, como la imagen patenta.

Una vez el mensajero se ha creado completamente, una ribosoma tomará este mensaje y creará la proteína análoga. Los terminadores indican al ribosoma el fin de una proteína y el comienzo de otra.

Por lo tanto, la síntesis de los indicadores se puede igualar a la dinámica de creación de proteínas represoras.

ACCIONES

Las acciones son el aumento de temperatura y la adición de un inductor.

• Aumento de Temperatura: concretamente a 42ºC temperatura a la que la proteína cI termosensible precipita su degradación.

• Adición de Inductor: mientras que la desaparición acelerada de proteína represora no afecta al funcionamiento mismo del núcleo biestable, la inducción

Prm LacI RFP

Plac cI GFP


sí que lo hará, ya que modulará la transcripción frente a la represión del agente adversario.


Traducción LacI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝑅𝐹𝑃



Traducción cI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 + 𝑐𝐼 + 𝐺𝐹𝑃


Inducción 1 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺 + 𝑃𝑟𝑚

Inducción 2 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺

Temperatura 𝑐𝐼 → 𝑛𝑢𝑙𝑙



El biestable modificado

(Plásmido BBa_K510019) [4]

(Plásmido BBa_K510036) [5]

De nuevo este sistema se basa en el anterior. Por tanto todo lo explicado hasta el momento se mantendrá, al menos las especies y su aportación. Las nuevas reacciones son la proteólisis y la inhibición por ARNas, llevando asociadas proteasas y ARN antisentido respectivamente.

PROTEÓLISIS

Tras el promotor Plac se encuentra el código de la proteína represora pero antes de llegar al indicador está insertada la cadena de la proteasa (encargada de digerir las proteínas). Observar que tanto la proteasa (Sspb) como el indicador (RFP) llevan un prefijo (Ompn). Éstas serán las cadenas de ARN sobre las que se pegará la ARN antisentido, obligándolas a quedar inservibles hasta su degradación. El represor del fago lambda no se consume.

ARN ANTISENTIDO

En esta rama del plásmido tenemos la misma estructura que en el biestable simple. Tras el promotor Prm se encuentra el código de la proteína represora y el indicador. También podemos ver como en este caso se han añadido un sufijo (Das4) a las proteínas. Este código quedará transcrito en una especia de cola unida a las proteínas originales. Esto implica que las proteasas serán sensibles a digerir esta cola, digiriendo tras ella el resto de la proteína

La creación de las ARN antisentido, se crea con el mismo promotor Prm, sin embargo este módulo no lo comparte con el resto de la cadena, sino que tiene una copia propia. Esto significa que su transcripción no se sitúa en el mismo instante que la del resto (LacI y GFP).

Plac cI(ts) Ompn::Sspb Ompn::RFP

Prm LacI::Das4 GFP::Das4

Prm ARNas

http://partsregistry.org/Part:BBa_K510036


Incluimos una tabla que recoge todas las especies intervinientes de este sistema:

Promotores ARNm Represores Inhibidores

𝑃𝑟𝑚 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑙𝑎𝑐𝐼 𝐿𝑎𝑐𝐼 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠

𝑃𝑙𝑎𝑐 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 𝑐𝐼 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏

Y además, en la siguiente imagen se muestra cómo se interrelacionan las especies y a través de qué mecanismos.

Ahora vemos una tabla resumen de todas las reacciones que se nombran en la imagen anterior.


Traducción LacI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐺𝐹𝑃



Traducción cI 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 + 𝑐𝐼 + 𝑅𝐹𝑃




Inhibición por ARNas 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠 + 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 → 𝑛𝑢𝑙𝑙

Proteólisis 1 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏 + 𝐿𝑎𝑐𝐼 → 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏

Proteólisis 2 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏 + 𝐺𝐹𝑃 → 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏

Inducción 1 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝑃𝑟𝑚 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺 + 𝑃𝑟𝑚

Inducción 2 𝐿𝑎𝑐𝐼 + 𝐼𝑃𝑇𝐺 → 𝐿𝑎𝑐𝐼|𝐼𝑃𝑇𝐺

Temperatura 𝑐𝐼 → 𝑛𝑢𝑙𝑙


2. Dinámica de las reacciones

Transcripción

Desarrollamos un modelo de la unión de la ARN polimerasa al elemento promotor y la transcripción completa de la molécula ARN mensajera tal que, siendo la reacción:

𝐴𝑅𝑁𝑝 + 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟𝜆𝑓

⇌ 𝜆𝑏

𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑛𝑠𝑐𝑟𝑖𝑝𝑡𝑜𝑟𝜆𝑓

→ 𝐴𝑅𝑁𝑝 + 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + 𝐴𝑅𝑁𝑚

Las ecuaciones de velocidad para cada elemento, son las siguientes:

𝐴𝑅𝑁𝑝̇ = −𝜆𝑓 · 𝐴𝑅𝑁𝑝 · 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + (𝜆𝑏 + 𝜆𝑐) · 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟̇ = −𝜆𝑓 · 𝐴𝑅𝑁𝑝 · 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + (𝜆𝑏 + 𝜆𝑐) · 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜

𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝚥𝑜̇ = 𝜆𝑓 · 𝐴𝑅𝑁𝑝 · 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 − (𝜆𝑏 + 𝜆𝑐) · 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜

𝐴𝑅𝑁𝑚̇ = 𝜆𝑐 · 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜

Este modelo de la transcripción es correcto para el caso en que la reacción se lleve a cabo en un volumen reactivo homogéneo. Sin embargo, resulta engorroso trabajar con tantas ecuaciones y parámetros, por ello ponemos atención en la reacción y en la formulación planteada por Michaelis-Menten para reacciones catalizadas por enzimas.

Primero comparamos las reacciones que modela con la transcripción:

𝐸 + 𝑆𝑘1

⇌ 𝑘−1

𝐸𝑆 𝑘2

→ 𝐸 + 𝑃

Podemos identificar enzima, sustrato y producto con nuestro modelo:

Sea: E = Promotor; S = ARNp; ES = Cc; P = ARNm

La diferencia frente a este modelo, es que el sustrato se consume al convertirse en producto. Sin embargo, en la transcripción, el ARN polimerasa queda libre al finalizar este proceso, pudiendo participar de nuevo en otra transcripción.

Por tanto,

[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ =𝜆𝑐 [𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟]0 · [𝐴𝑅𝑁𝑝]

[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚 𝐾𝑚 =

(𝜆𝑏 + 𝜆𝑐)𝜆𝑓

La constante de Michaelis queda como una ponderación de las cinéticas intervinientes en la cinética de la transcripción.



[𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟]0 se refiere a la concentración inicial de promotores, que dependerá del número de copias de plásmidos que absorba cada bacteria. Concretamente, por cada copia hay un promotor de cada represor.

Y el modelo completo del producto de la transcripción:

[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ =𝜆 · [𝐴𝑅𝑁𝑝]

[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚

Donde 𝜆 = 𝜆𝑐 [𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟]0

Los parámetros que aparecen en el factor de la ecuación diferencial que crea 𝐴𝑅𝑁𝑚, son constantes excepto [ARNp] que se refiere a una especie dentro de la bacteria e. coli.

Traducción

Continuamos con un razonamiento parecido al de la transcripción. Veamos primero como es la reacción de la traducción:

𝐴𝑅𝑁𝑚 + 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 𝑘𝑓

⇌ 𝑘𝑏

𝐶𝑜𝑚𝑝𝑙𝑒𝑗𝑜 𝑇𝑟𝑎𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑘𝑐

→ 𝐴𝑅𝑁𝑚 + 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 + 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟

Así, según Michaelis-Menten, obtenemos una expresión análoga a la de la transcripción,

[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]̇ =𝑘𝑐 [𝐴𝑅𝑁𝑚] · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎]

[𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] + 𝐾𝑚𝑢; 𝐾𝑚𝑢 =

𝑘𝑏 + 𝑘𝑐𝑘𝑓

𝑘𝑚𝑢 es, también, una ponderación de las cinéticas que intervienen, y además, ocurre de nuevo que tanto 𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎 como 𝐴𝑅𝑁𝑚 son especies de la bacteria y del sistema, respectivamente.

Represión

La reacción de la represión, no podemos modelarla con la formulación de Michaelis-Menten, ya que su comportamiento cooperativo difiere del predicho por éste. Sin embargo, como vimos, dentro de las cinéticas no Michaelianas, podemos usar la formulación planteada por Hill.

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + 𝛽 · 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟 ⇌ 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽

Se observa como la expresión, realmente comprende varias etapas. Primero, el represor debe formar un multímero de tamaño 𝛽,

𝛽 · 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟 ⇌ 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽

Y tras ello, encontrarse con el promotor al que unirse,

𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟 + 𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽 ⇌ 𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽


Evitándose así su lectura.

Tras formarse el multímero, se une competitivamente con la ARN polimerasa a los operadores del gen. La cooperatividad se patenta en la formación de multímeros.

�𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽�̇ =[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽

𝐾𝑖𝑢 + [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽

Transformando esta ecuación podemos ver el efecto de las constantes que aparecen en el modelo.

�𝑃𝑟𝑜𝑚𝑜𝑡𝑜𝑟|𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟𝛽�̇ =

[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽𝐾𝑖𝑢

1 + [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽𝐾𝑖𝑢

Se advierte más claramente la función de la constante Kiu. Hace una ponderación, significando que una parte de los represores que han formado el 𝛽-mero, participarán de la represión. A este valor, se le conoce como la constante del equilibrio de la unión efectiva del represor al promotor adverso.

Degradación

Las proteínas son sistemas vivientes que se sustituyen continuamente. Por tanto, todas mueren tras un periodo activo variable (desde unos minutos hasta semanas). La muerte o degradación en sus aminoácidos, es un proceso relativamente sencillo de modelar, ya que no nos interesa tanto el proceso de la degradación de la proteína sino cuán rápido se produce para cada tipo. El tiempo característico de cada proteína se mida en base a su vida media, de la cual se puede extraer la tasa de mortalidad δ (mortalidad/unidad de tiempo). Cualquier compuesto (ARNp, ARNm, proteína, proteasa, ARNas,…) que intervine en un sistema biológico tendrá una valor característico de vida media desde el cual estimaremos el valor del parámetro. En este sentido, la ecuación diferencial que modela esta desactivación es de primer orden (ley de acción de masa).

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ = 𝛿 · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]

La cantidad de moléculas que desaparecen es proporcional a su población.

Hay que mencionar que el valor de la tasa de mortalidad varía con la temperatura. En un caso especial, el represor cI, con un aumento de 37ºC a 42ºC, precipita este valor casi a la unidad.



Proteólisis

Como vimos en el apartado de fundamentos biológicos, este mecanismo lo realiza una proteasa, que se encarga de digerir las proteínas para las que esté diseñado. Veamos la reacción que explica el proceso de la proteólisis:

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎 + 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 → 𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎

La cinética que suponemos a este proceso será la acción de masa, una suposición apoyada sobre el argumento expuesto en el proceso de degradación: no nos interesa la dinámica propia de esta reacción sino saber cuántas proteínas se verán afectadas en el tiempo en función de la población de proteasas. En este proceso se consume proteína, mientras que la proteasa vuelve a quedar libremente funcional cuando se separa del degradado.

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎] · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]

El proceso de degradación vuelve a ser más complejo de lo que muestra la ecuación diferencial. La dinámica de este proceso es de segundo orden, y por tanto, la constante cinética tiene unas características diferentes:

𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 ∶ [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛]−1[𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1

Inhibición ARN antisentido

La inhibición del ARN mensajero gracias a un ARN antisentido análogo, se produce como se indicó en los fundamentos biológicos. La cinética de esta reacción no es conocida, sin embargo podemos suponerla como una reacción de primer orden (ley de acción de masa), ya que su efecto en el sistema es el comienzo de la unión entre las cadenas.

𝐴𝑅𝑁𝑚 + 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠 → 𝐴𝑅𝑁 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑏𝑙𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑒𝑛𝑎

El bloqueo de la traducción del ARNm se produce desde el instante en que estas dos hebras se aparean. Una vez que se ha formado este complejo, no queda más que esperar su degradación enzimática, ya que no puede participar de otro proceso y en el estudio general se tomará como una degradación.

[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ − = 𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 · [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠] · [𝐴𝑅𝑁𝑚]

Al igual que en la proteólisis, la constante cinética tiene las mismas unidades al tratarse de un proceso de dinámica de orden mayor:

𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 ∶ [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛]−1[𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1


3. Biestable Simple. Consideraciones de modelado

Represión y transcripción

Trataremos conjuntamente las reacciones de transcripción y la de represión, ya que podemos asumir de forma directa que la proteína represora se unirá compitiendo con la ARNp al promotor. Además, esta represión no sólo la realizará la proteína represora, sino que puede ocurrir que esta forme multímeros y que éstos también participen de la represión. Así, y siguiendo a T. S. Gardner [2] planteamos un modelo conjunto:


[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚 · �1 + �[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝐾𝑖𝑟 �

𝛼�

Añadiendo cualquier otra dinámica que afecte directamente a la población de ARNm podríamos conseguir un modelo matemático completo que describa su población

Régimen permanente para la transcripción

Según T. S. Gardner, basándose en otro documento [6] el tiempo necesario para la creación del 𝐴𝑅𝑁𝑚 es rápido en comparación con el tiempo necesario para la expresión final de una proteína. Esta suposición se ve respaldada por los siguientes datos extraídos de la base de datos de Harvard [7]:

• Velocidad de transcripción por ARN polimerasa en batería Escherichia Coli: 24/79

nucleótidos/segundo

• Velocidad de traducción por ribosomas en bacteria Escherichia Coli: 12/21

aminoácidos/segundo

Efectivamente, la transcripción es un proceso entre 2 y 4 veces más rápido que la traducción y podemos considerarlo cuasi-estático. Además a estos datos hay que sumarle el tiempo que tras la aparición de un ARN mensajero hasta su encuentro con el primer ribosoma. Podemos asegurar que la transcripción ocupa menos de un 30% en el tiempo de la expresión. Incluso, la componente estocástica intrínseca en estos procesos, favorece la implantación de esta suposición.

Por otro lado, hay que considerar, que esto no afecta a las condiciones de biestabilidad del sistema, aunque sí tendría un efecto a la cinética global.



𝛼�− 𝛿 · [𝐴𝑅𝑁𝑚]



Ecuación de la población de 𝐴𝑅𝑁𝑚 en el creada por la transcripción del plásmido y degradada por la acción vital.

Así que, suponemos el valor en régimen permanente del ARN mensajero:

[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ = 0,

[𝐴𝑅𝑁𝑚] =𝜆𝛿� · [𝐴𝑅𝑁𝑝]


𝛼�

Traducción

La cinética de es:

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ =𝑘𝑐 · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] · [𝐴𝑅𝑁𝑚]

[𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] + 𝐾𝑚𝑢

Sustituimos el valor de régimen permanente conocido del [𝐴𝑅𝑁𝑚]

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ =𝑘𝑐 · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎]

[𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] + 𝐾𝑚𝑢·

𝜆𝛿� · [𝐴𝑅𝑁𝑝]

[𝐴𝑅𝑁𝑝] + 𝐾𝑚 �1 + �[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝐾𝑖𝑟 �

𝛼�

Además de la degradación de la proteína

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ =

𝜆 · 𝑘𝑐 · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎]𝛿 · ([𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] + 𝐾𝑚𝑢)

1 + 𝐾𝑚[𝐴𝑅𝑁𝑝] · �1 + �[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]

𝐾𝑖𝑟 �𝛼�− 𝑑 · [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]

Unidades de los parámetros:

𝜆 = [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛] · [𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1 𝐾𝑚 = 𝐾𝑚𝑢 = 𝐾𝑖𝑟 = [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛] 𝛿 = 𝑘𝑐 = [𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1

Parámetros

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ =

𝜆 · 𝑘𝑐 · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎]𝛿 · ([𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] + 𝐾𝑚𝑢)

1 + 𝐾𝑚[𝐴𝑅𝑁𝑝] · �1 + �[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]

𝐾𝑖𝑟 �𝛼�− 𝑑 · [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]

Sobre esta ecuación, hacemos un estudio de los parámetros que aparecen tratando de reducir la expresión final

• Numerador del primer término: El único valor variable de esta expresión es [Ribosoma]. Atendemos al número total de ribosomas presentes en una bacteria


Escherichia Coli en condiciones normales, el cual se sitúa entre 6800/72000 [7]. El número de ribosomas libres a lo largo de la evolución de nuestro sistema, no logrará variar tanto en población como para que este factor sufra una modificación apreciable.

𝜆 · 𝑘𝑐 · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎]𝛿 · ([𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎] + 𝐾𝑚𝑢) ≅ 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 ∶ ([𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛][𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1)

• Factor de ponderación de la represión: Podemos hacer una suposición parecida a la anterior con la concentración de 𝐴𝑅𝑁𝑝 ya que la población media en una bacteria Escherichia Coli se sitúa entre 1500/11400 [7]. Por tanto, el valor de Km

[ARNp] potenciará o disminuirá el efecto que pueda provocar el término de la

represión al que acompaña.

𝐾𝑚[𝐴𝑅𝑁𝑝] ≅ 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 ∶ 𝑛𝑜 𝑡𝑖𝑒𝑛𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠

• Término de la represión: la simplificación de este proceso en la ecuación, significa que no podamos observar claramente cómo funciona la represión. Sin embargo, podemos mencionar las implicaciones de la constante 𝐾𝑖𝑟. Su valor supone, de nuevo, una ponderación de los represores libres hacia una proporción población que participará directamente de la represión.

[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝐾𝑖𝑟

= [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜 ∶ 𝑛𝑜 𝑡𝑖𝑒𝑛𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠

Modelo del biestable simple

El modelo del Núcleo Biestable queda como el siguiente sistema de ecuaciones diferenciales una vez que identificamos los términos reales y reagrupamos todo lo dicho anteriormente, expresamos de manera simple las reacciones que se producen por cada lado.

[𝐿𝑎𝑐𝐼]̇ =𝑐𝑡𝑒𝑠𝐿𝐴𝐶𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝐴𝐶𝐼�1 + [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝛼 �− 𝑐𝑡𝑒𝑑 · [𝐿𝑎𝑐𝐼]

[𝑐𝐼]̇ =𝑐𝑡𝑒𝑠𝐶𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐶𝐼 �1 + [𝐿𝑎𝑐𝐼]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝛽 �

− 𝑐𝑡𝑒𝑑 · [𝑐𝐼]

Por terminar de simplificar el modelo agrupamos constantes

𝑐𝑡𝑒𝑠𝐿𝐴𝐶𝐼′ =𝑐𝑡𝑒𝑠𝐿𝐴𝐶𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝐴𝐶𝐼



Y obtenemos finalmente el modelo más simplificado:


1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝐴𝐶𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝛼 − 𝑐𝑡𝑒𝑑 · [𝐿𝑎𝑐𝐼]


1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐶𝐼 · [𝐿𝑎𝑐𝐼]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝛽 − 𝑐𝑡𝑒𝑑 · [𝑐𝐼]

Con el último cambio de constantes, no varían las unidades de tales parámetros, aunque si una modulación.

𝑐𝑡𝑒𝑠 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑠í𝑛𝑡𝑒𝑠𝑖𝑠 ∶ [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛][𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑝𝑜𝑛𝑑𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 ∶ − [𝑥]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜 = 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑎 𝑞𝑢𝑒 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑣𝑖𝑒𝑛𝑒 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑟𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 ∶ − 𝑐𝑡𝑒𝑑 = 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑡𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑑𝑒𝑔𝑟𝑎𝑑𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ∶ [𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜]−1 [𝑥] = 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 ∶ [𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛]


4. Biestable modificado. Consideraciones de modelado

Para establecer las ecuaciones diferenciales de cada especie, debemos definir cada proceso que ocurre en el sistema e identificar con más detalle la rama del biestable que estamos estudiando. A pesar de que los sistemas tengan el mismo núcleo biestable, la adición de nuevos inhibidores, afectarán a las cinéticas ya descritas.

Comenzamos definiendo los procesos y las cinéticas.

TRANSCRIPCIÓN + REPRESIÓN



𝛼�

=𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟 · [𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝑒𝑓𝛼

TRADUCCIÓN

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ =𝑘𝑐 · [𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎𝑠] · [𝐴𝑅𝑁𝑚]

[𝑅𝑖𝑏𝑜𝑠𝑜𝑚𝑎𝑠] + 𝐾𝑚𝑢= 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑 · [𝐴𝑅𝑁𝑚]

INHIBICIÓN POR ARNAS

[𝐴𝑅𝑁𝑚]̇ = [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠]̇ = −𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 · [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠] · [𝐴𝑅𝑁𝑚]

PROTEÓLISIS

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ = −𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡 · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎] · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑎𝑠𝑎]

DEGRADACIÓN

[𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝚤𝑒]̇ = −𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔 · [𝑒𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑒]



Tabla resumen de las cinéticas y las especies intervinientes

ID PROCESO SE CREA SE CONSUME

1 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛼 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼 -

2 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑐𝐼 · [𝐿𝑎𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛽 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼 -

3 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛼 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠 -

4 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼] 𝐿𝑎𝑐𝐼 -

5 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼] 𝑐𝐼|𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏 -

6 𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 · [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠] - 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼|𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠

7 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡 · �𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏� - 𝐿𝑎𝑐𝐼

8 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼] - 𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼

9 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼] - 𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼

10 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚 · [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠] - 𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠

11 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝐿𝑎𝑐𝐼] - 𝐿𝑎𝑐𝐼

12 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝑐𝐼 · [𝑐𝐼] - 𝑐𝐼

13 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏 · �𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏� - 𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏


Agrupación de ecuaciones

Para alcanzar un sistema de ecuaciones diferenciales referenciadas únicamente a las especies represoras seguimos los siguientes pasos:

[𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼]̇ =𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛼− 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼]

[𝐿𝑎𝑐𝐼]̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼] − �𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡 · �𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏� − 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐿𝑎𝑐𝐼� · [𝐿𝑎𝑐𝐼]

Por otro lado, la rama de cI:

[𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼]̇ =𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑐𝐼 · [𝐿𝑎𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛽 − �𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 · [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠] + 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚� · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼]

Y por último, la proteína represora:

[𝑐𝐼]̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼]− 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]

Nos queda definir las poblaciones de ARNas y de la proteasa Psspb.

[𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠]̇ =𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛼− �𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼] + 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚� · [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠]

�𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏�̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼]− 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏 · �𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏�

Modelo del biestable modificado

Simplificamos las ecuaciones agrupando valores en torno a expresiones más simples. Para ello agrupamos parámetros de forma parecida a como lo hacíamos con el modelo del biestable simple:

[𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼]̇ =𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛼− 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼]

[𝐿𝑎𝑐𝐼]̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝐿𝑎𝑐𝐼] − �𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡 · �𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏�+ 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐿𝑎𝑐𝐼� · [𝐿𝑎𝑐𝐼]



[𝑐𝐼]̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼]− 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]

�𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏�̇ = 𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑𝑐𝐼 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼]− 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏 · �𝑃𝑠𝑠𝑝𝑏�

[𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠]̇ =𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼

1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝑎𝑐𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝛼− �𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 · [𝐴𝑅𝑁𝑚𝑐𝐼] + 𝑐𝑡𝑒𝑑𝑒𝑔𝐴𝑅𝑁𝑚� · [𝐴𝑅𝑁𝑎𝑠]



5. Modelado del Sistema Biestable Simple en cinéticas

simples

Consideraciones sobre el modelo en EDOs

Comencemos recordando las ecuaciones diferenciales planteadas:

𝑑𝑚1

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟1

1 + 𝑘𝑝𝑟1 · 𝑥2𝛽 − 𝑑𝑚 · 𝑚1

𝑑𝑚2

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟2

1 + 𝑘𝑝𝑟2 · 𝑥1𝛼− 𝑑𝑚 · 𝑚2

𝑑𝑥1𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑1 · 𝑚1 − 𝑑 · 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑2 · 𝑚2 − 𝑑 · 𝑥2

Sin considerar como se ha llegado a esta solución, desmenucemos el sistema reactivo. Lo que se nos muestra es la presencia de 4 entes cuyas ecuaciones de estado tienen dos términos, uno de síntesis (o creación) y otro de degradación (o destrucción). Cada término incluye una serie de parámetros que gobernarán la evolución temporal de estas variables.

Por tanto,

Variables de estado:

𝑋 = {𝑚1,𝑚2, 𝑥1, 𝑥2}

Parámetros generales:

• 𝑘𝑡𝑟 = Síntesis máxima de los ARNm • 𝑘𝑝𝑟 = Ponderación de la acción inhibidora de las proteínas represoras • 𝑘𝑡𝑑 = Síntesis máxima de las proteínas represoras • 𝑑𝑚 = Tasa de degradación de las ARNm • 𝑑 = Tasa de degradación de las proteínas represoras • 𝛼,𝛽 = Cooperatividad de la represión del promotor adverso

Antes de continuar con el modelo por ecuaciones estocásticas, profundizaremos un poco más en las capacidades de representación de las ecuaciones anteriores. Como se explicó en secciones anteriores, al experimentar con la bacteria real, la forma que tenemos para hacer las mediciones de las poblaciones de las proteínas que se expresan


es a través de una proteína fluorescente asociada a tal molécula. Sucede que cuando se crea una proteína de LacI, una GFP (proteína fluorescente verde) también lo hace en el mismo instante.

Hasta este momento no se ha incluido esta realidad en los modelos ni en los análisis. El motivo por el que se ha decidido hacer esto, es porque realmente no aporta conocimiento en el estudio determinista y de estabilidad. Sin embargo, llegamos al modelo estocástico resulta mucho más sencillo añadir este hecho sin implicar cambios sustanciales en los modelos.

Continuando con el modelado, pasamos a identificar la matriz estequiométrica de las reacciones mostradas

Reacciones Matriz Estequiométrica

𝑚1 𝑚2 𝑥1 𝑥2 𝑅𝐹𝑃 𝐺𝐹𝑃

𝑛𝑢𝑙𝑙 → 𝑚1 1 0 0 0 0 0

𝑛𝑢𝑙𝑙 → 𝑚2 0 1 0 0 0 0

𝑚1 → 𝑚1 + 𝑥1 + 𝑅𝐹𝑃 0 0 1 0 1 0

𝑚2 → 𝑚2 + 𝑥2 + 𝐺𝐹𝑃 0 0 0 1 0 1

𝑚1 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 -1 0 0 0 0 0

𝑚1 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 0 -1 0 0 0 0

𝑥1 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 0 0 -1 0 0 0

𝑥2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 0 0 0 -1 0 0

𝑅𝐹𝑃 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 0 0 0 0 -1 0

𝐺𝐹𝑃 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 0 0 0 0 0 -1

Así, con esto definido, pasamos a definir las propensidades de la cada reacción.

Id Reacción Función de propensidad

1 𝑛𝑢𝑙𝑙 → 𝑚1 𝑎1(𝑋) = 𝑘𝑡𝑟11+𝑘𝑝𝑟1·𝑥2

𝛼

2 𝑛𝑢𝑙𝑙 → 𝑚2 𝑎2(𝑋) = 𝑘𝑡𝑟21+𝑘𝑝𝑟2·𝑥1

𝛽

3 𝑚1 → 𝑚1 + 𝑥1 + 𝑅𝐹𝑃 𝑎3(𝑋) = 𝑘𝑡𝑑1 · 𝑚1

4 𝑚2 → 𝑚2 + 𝑥2 + 𝐺𝐹𝑃 𝑎4(𝑋) = 𝑘𝑡𝑑2 · 𝑚2



5 𝑚1 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎5(𝑋) = 𝑑𝑚 · 𝑚1

6 𝑚1 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎6(𝑋) = 𝑑𝑚 · 𝑚2

7 𝑥1 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎7(𝑋) = 𝑑 · 𝑥1

8 𝑥2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎8(𝑋) = 𝑑 · 𝑥2

9 𝑅𝐹𝑃 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎9(𝑋) = 𝑑𝐺𝐹𝑃 · 𝐺𝐹𝑃

10 𝐺𝐹𝑃 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎10(𝑋) = 𝑑𝑅𝐹𝑃 · 𝑅𝐹𝑃

Para comprender con más detalle cómo se comporta el sistema, debemos atender a los procesos o reacciones elementales que tienen lugar entre las moléculas. Por ejemplo, uno de los casos más llamativos es el siguiente, que nos servirá para comprender como la expresión matemática puede ocultar la complejidad que encierra.

Mientras que en el modelo anterior se representaba la síntesis del ARN mensajero con una ecuación cinética como la siguiente,

𝑑𝑚1

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟1 + 𝑘𝑝𝑟 · 𝑥𝛼

Explicando la reacción 𝑛𝑢𝑙𝑙 → 𝑚1, el conjunto de reacciones elementales es mucho mayor. Recordemos que en esta simplificación están reunidas: la represión cooperativa de la proteína represora contraria, que a su vez engloba la posible dimerización del represor y su adhesión sobre el promotor, influyendo así a la transcripción del ARN mensajero. Además no se está teniendo en cuenta el resto de especies que intervienen, el promotor, la proteína represora y sus multímeros, ni la ARN polimerasa que se encarga de la labor transcriptora.

Se muestra así la simplicidad del modelo anterior, ya sea en su versión determinista como estocástica. Trataremos pues de incluir en el análisis a continuación, tantas variables como sean posibles en busca de representar más fielmente la interacción conjunta.

En lo que sigue, se expondrá el nuevo modelo, incluyendo un nivel de detalle mayor, y abandonaremos finalmente este modelo de cinéticas complejas para trabajar en adelante con uno de cinéticas de primer orden.


Tipo de Agente Rama 1 Rama 2

Promotor 𝑂𝐿 𝑂𝐶

ARN mensajero 𝑀𝐿 𝑀𝐶

Proteína represora 𝐿 𝐶

Multímero represor (dímero) 𝐿2 𝐶2

Promotor/Represor 𝐶2𝑂𝐿 𝐿2𝑂𝐶

En los apartados anteriores se han dado las nociones suficientes para la comprensión de la función de cada agente dentro del sistema. Veamos el conjunto reactivo:

Nombre Reacción Propensidad

Transcripción LacI 𝑂𝐿 → 𝑂𝐿 + 𝑀𝐿 𝑎1 = 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿

Traducción LacI 𝑀𝐿 → 𝑀𝐿 + 𝐿 + 𝑅𝐹𝑃 𝑎2 = 𝑇𝑅𝐷𝐿 · 𝑀𝐿

Dimerización LacI 𝐿 + 𝐿 → 𝐿2 𝑎3 = 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2

Des-dimerización LacI 𝐿2 → 𝐿 + 𝐿 𝑎4 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2

Represión LacI 𝐿2 + 𝑂𝐶 → 𝐿2𝑂𝐶 𝑎5 = 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2 · 𝑂𝐶

Des-represión LacI 𝐿2𝑂𝐶 → 𝐿2 + 𝑂𝐶 𝑎6 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2𝑂𝐶

Transcripción cI 𝑂𝐶 → 𝑂𝐶 + 𝑀𝐶 𝑎7 = 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶

Traducción cI 𝑀𝐶 → 𝑀𝐶 + 𝐶 + 𝐺𝐹𝑃 𝑎8 = 𝑇𝑅𝐷𝐶 · 𝑀𝐶

Dimerización cI 𝐶 + 𝐶 → 𝐶2 𝑎9 = 𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2

Des-dimerización cI 𝐶2 → 𝐶 + 𝐶 𝑎10 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2

Represión cI 𝐶2 + 𝑂𝐿 → 𝐶2𝑂𝐿 𝑎11 = 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿

Des-represión cI 𝐶2𝑂𝐿 → 𝐶2 + 𝑂𝐿 𝑎12 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿

Degradación 𝑀𝐿 𝑀𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎13 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿

Degradación 𝑀𝐶 𝑀𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎14 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

Degradación 𝐿 𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎15 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿

Degradación 𝐶 𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎16 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶

Degradación 𝐿2 𝐿2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎17 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2

Degradación 𝐶2 𝐶2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎18 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2



Y la matriz estequiométrica queda:

E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 R1 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 R2 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 R3 0 0 0 0 -2 0 1 0 0 0 0 0 R4 0 0 0 0 2 0 -1 0 0 0 0 0 R5 0 -1 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 R6 0 1 0 0 0 0 1 0 -1 0 0 0 R7 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 R8 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 R9 0 0 0 0 0 -2 0 1 0 0 0 0

R10 0 0 0 0 0 2 0 -1 0 0 0 0 R11 -1 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 R12 1 0 0 0 0 0 0 1 0 -1 0 0 R13 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 R14 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 R15 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 R16 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 R17 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 R18 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 R19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 R20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1

Antes de pasar al siguiente apartado, vamos a agrupar estos eventos de forma que podamos extraer una expresión aproximada en ecuaciones diferenciales. Tras conocer todos los eventos modelados y sus cinéticas, los agrupamos por variable de estado:

𝑑𝑂𝐿𝑑𝑡

= 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿 − 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿

𝑑𝑂𝐶𝑑𝑡

= 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2𝑂𝐶 − 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2 · 𝑂𝐶

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿 − 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿

𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶 − 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

𝑑𝐿𝑑𝑡

= 𝑇𝑅𝐷𝐿 · 𝑀𝐿 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿

𝑑𝐶𝑑𝑡

= 𝑇𝑅𝐷𝐶 · 𝑀𝐶 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶

𝑑𝐿2𝑑𝑡

= 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿 · (𝐿 − 1) + 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2𝑂𝐶 − 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2 · 𝑂𝐶 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2

𝑑𝐶2𝑑𝑡

= 𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶 · (𝐶 − 1) + 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿 − 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2 − 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2


𝑑𝐿2𝑂𝐶𝑑𝑡

= 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2 · 𝑂𝐶 − 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2𝑂𝐶

𝑑𝐶2𝑂𝐿𝑑𝑡

= 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿 − 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿

Este se puede considerar el modelo del biestable simple en ecuaciones diferenciales ordinarias atendiendo a las reacciones elementales. Si aplicamos régimen permanente en algunos de los procesos, podremos conseguir una expresión asimilable a la original extraída en la sección del modelado determinista.

Antes de adentrarnos en un desarrollo matemático, vamos a simplificar las relaciones de estas ecuaciones:

Para empezar, la población de los promotores está relacionada directamente con la de sí mismo reprimido. Además esta relación es muy simple:


= −𝑑𝑂𝐿𝐶2𝑑𝑡

La resolución es de esta relación no lleva a:

𝑂𝐿(𝑡) − 𝑂𝐿(0) = 𝐶2𝑂𝐿(0) − 𝐶2𝑂𝐿(𝑡); 𝐶2𝑂𝐿(𝑡) = 𝑛0 − 𝑂𝐿(𝑡)

De esta forma, eliminamos 2 variables de estado, así como simplificamos las ecuaciones diferenciales


= 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝑛0 − (𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 + 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2) · 𝑂𝐿

𝑑𝑂𝐶𝑑𝑡

= 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝑛0 − (𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 + 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐿2) · 𝑂𝐶

𝑑𝑀𝐿


𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶 − 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

𝑑𝐿𝑑𝑡


𝑑𝐶𝑑𝑡


𝑑𝐿2𝑑𝑡

= 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2

𝑑𝐶2𝑑𝑡

= 𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2 − 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2



Además, es demostrable según la biología que, dada la alta concentración de partícula transcriptora, la concentración de promotor libre o reprimido, se alcanza instantáneamente, y no afecta a la dinámica. Por lo tanto, supondremos régimen permanente para las ecuaciones diferenciales de las poblaciones de promotor:

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝑛0 − (𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 + 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2) · 𝑂𝐿 = 0;

𝑂𝐶 =𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝑛0

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 + 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2

𝑂𝐿 =𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝑛0

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 + 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐿 ·

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝑛0𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 + 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2

− 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿

𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐶 ·

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝑛0𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 + 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2

− 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

𝑑𝐿𝑑𝑡


𝑑𝐶𝑑𝑡


𝑑𝐿2𝑑𝑡

= 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2

𝑑𝐶2𝑑𝑡


Así, finalmente tenemos esta expresión:

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐿 ·

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝑛0𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 + 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2

− 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿

𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐶 ·

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝑛0𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 + 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2

− 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

Además, suponemos el régimen permanente en la variación de las poblaciones de los dímeros represores:

𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝐷𝐺𝐿2 · 𝐿2 = 0;

𝐿2 =𝐷𝐼𝑀𝐿

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝐿2· 𝐿2

𝐶2 =𝐷𝐼𝑀𝐶

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 + 𝐷𝐺𝐶2· 𝐶2


Por último, añadiendo estas expresiones, obtenemos la expresión del sistema equivalente:

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡=

𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑛0

1 + 𝑅𝐸𝑃𝐶𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐷𝐼𝑀𝐶

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 + 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2− 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿

𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡=

𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑛0

1 + 𝑅𝐸𝑃𝐿𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐷𝐼𝑀𝐿

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2− 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

𝑑𝐿𝑑𝑡


𝑑𝐶𝑑𝑡


Ahora, procedemos a comparar los dos modelos y comprar los parámetros hasta encontrar sus relaciones:

𝑘𝑡𝑟 = 𝑇𝑅𝑁 · 𝑛0

𝑘𝑡𝑑 = 𝑇𝑅𝐷

𝑘𝑝𝑟 =𝑅𝐸𝑃𝑁𝑅𝐸𝑃

·𝐷𝐼𝑀

𝑁𝐷𝐼𝑀 + 𝐷𝐺𝑃

𝑑𝑚 = 𝐷𝐺𝑀

Aunque acabamos de identificar todos los parámetros de uno y otro modelo, de forma que podemos concluir que se tratan del mismo, aunque expresado de formas diferentes; tenemos que notar que existe una pequeña diferencia entre ambos:

𝑑𝑚1

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟1

1 + 𝑘𝑝𝑟1 · 𝑥2𝛽 − 𝑑𝑚1 · 𝑚1

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡=



𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 + 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2− 𝐷𝐺𝑀𝐿 · 𝑀𝐿

Mientras que en el modelo basado en las cinéticas de Michaelis-Menten la represión se hace a través de la proteína represora, considerando, además, la posibilidad de que también se haga a través de los diferentes multímeros que ésta pueda formar. Por tanto, aunque el modelo matemático sí lo contemple, realmente no tiene en cuenta las variables asociadas a estas subespecies.

Por otro lado, en el modelo de cinéticas de primer orden desarrollado en este último apartado del documento, se estudia de manera explícita la presencia y participación del dímero. Incluso, no se ha modelado la posibilidad de que la proteína represora pueda



inhibir la transcripción del promotor adverso. Esta diferencia de consideraciones entre uno y otro se patenta directamente ahora, cuando observamos que el parámetro 𝛽 aparece con un valor fijo y dado 2 en nuestro segundo modelo. Esto se podría considerar como un error, sin embargo, explicamos la capacidad de esta suposición:

• 𝐶 + 𝐶 → 𝐶2 es la reacción que hemos modelado hasta el momento, teniendo asociado una cinética tal que: 𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2. Luego, este dímero es el único considerado con inhibidor. Pero veamos la siguiente reacción:

• 𝛽 · 𝐶 → 𝐶𝛽 reacción que consideraría la creación del represor, β podrá valer 1, 2 o incluso mayor, en base a un factor de probabilidad asociado.

Este modelo, y las suposiciones hechas para extraer las ecuaciones, se han basado en el documento de Michail Stamatakis y Nikos V. Mantzaris [8], en el cual se indica:

“…A LacI dimer is sufficient for specific binding to the operator sequence... However, a LacI monomer is unable to bind lacO and exert any repressive effect (53). Thus, we assume that the repressor dimer binds to the operator (denoted as species O) with a one-to-one stoichiometry…”

Significando que la proteína represora no tendrá un efecto apreciable en las acciones de inhibición de la transcripción del promotor adverso.


6. Modelado del sistema biestable modificado en

cinéticas simples

Consideraciones de modelado

Tipo de Agente Rama 1 Rama 2

Promotor 𝑂𝐿 (𝑂𝐿′) 𝑂𝐶

ARN mensajero 𝑀𝐿 𝑀𝐶

Proteína represora 𝐿 𝐶

Multímero represor (dímero) 𝐿2 𝐶2

Inhibidor 𝑃𝑠 𝑀𝑎𝑠

Promotor/Represor 𝐶2𝑂𝐿 (𝐶2𝑂𝐿′ ) 𝐿2𝑂𝐶

En los apartados anteriores se han dado las nociones suficientes para la comprensión de la función de cada agente dentro del sistema. Veamos el conjunto reactivo:

Nombre Reacción Propensidad

Transcripción LacI 𝑂𝐿 → 𝑂𝐿 + 𝑀𝐿 𝑎1 = 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿

Traducción Laci 𝑀𝐿 → 𝑀𝐿 + 𝐿 𝑎2 = 𝑇𝑅𝐷𝐿 · 𝑀𝐿

Dimerización LacI 𝐿 + 𝐿 → 𝐿2 𝑎3 = 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2

Des-dimerización LacI 𝐿2 → 𝐿 + 𝐿 𝑎4 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2

Represión LacI 𝐿2 + 𝑂𝐶 → 𝐿2𝑂𝐶 𝑎5 = 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2 · 𝑂𝐶

Des-represión LacI 𝐿2𝑂𝐶 → 𝐿2 + 𝑂𝐶 𝑎6 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2𝑂𝐶

Transcripción cI 𝑂𝐶 → 𝑂𝐶 + 𝑀𝐶 𝑎7 = 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶

Traducción cI 𝑀𝐶 → 𝑀𝐶 + 𝐶 + 𝑃𝑠 𝑎8 = 𝑇𝑅𝐷𝐶 · 𝑀𝐶

Dimerización cI 𝐶 + 𝐶 → 𝐶2 𝑎9 = 𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2

Des-dimerización cI 𝐶2 → 𝐶 + 𝐶 𝑎10 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2

Represión cI 𝐶2 + 𝑂𝐿 → 𝐶2𝑂𝐿 𝑎11 = 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿

Des-represión cI 𝐶2𝑂𝐿 → 𝐶2 + 𝑂𝐿 𝑎12 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿

Transcripción de ARNas 𝑂𝐿′ → 𝑂𝐿′ + 𝑀𝑎𝑠 𝑎13 = 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿′

Represión de ARNas 𝐶2 + 𝑂𝐿′ → 𝐶2𝑂𝐿′ 𝑎14 = 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿′

Des-represión de ARNas 𝐶2𝑂𝐿′ → 𝐶2 + 𝑂𝐿′ 𝑎15 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿′



Digestión LacI 𝑃𝑠 + 𝐿 → 𝑃𝑠 𝑎16 = 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃𝑠 · 𝐿

Digestión LacI2 𝑃𝑠 + 𝐿2 → 𝑃𝑠 𝑎17 = 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃𝑠 · 𝐿2

Inhibición ARNas 𝑀𝑎𝑠 + 𝑀𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎18 = 𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 · 𝑀𝐶

Degradación 𝑀𝐿 𝑀𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎19 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿

Degradación 𝑀𝐶 𝑀𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎20 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

Degradación ARNas 𝑀𝑎𝑠 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎21 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝑎𝑠

Degradación 𝐿 𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎22 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿

Degradación 𝐶 𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎23 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶

Degradación Proteasa 𝑃𝑠 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎24 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝑃𝑠

Degradación 𝐿2 𝐿2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎25 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2

Degradación 𝐶2 𝐶2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎26 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2

Realizamos el mismo esfuerzo que hicimos con el modelo del biestable simple para la identificación de parámetros. Comenzamos con detallar las relaciones de cada reacción descrita con cada especie.

Volvemos a suponer la relación entre promotor y promotor reprimido que hicimos en el modelo del biestable simple:

𝑋2𝑂(𝑡) = 𝑛0 − 𝑂(𝑡);

Por lo tanto, las ecuaciones mostradas a continuación contemplan este paso:

𝑂𝐿 =𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝑛0


𝑂𝐶 =𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝑛0

𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 + 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2

𝑂𝐿′ =𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝑛0


𝑑𝑀𝐿


𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶 − 𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 · 𝑀𝐶 − 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

𝑑𝑀𝑎𝑠

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿′ − 𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 · 𝑀𝐶 − 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝑎𝑠


𝑑𝐿𝑑𝑡

= 𝑇𝑅𝐷𝐿 · 𝑀𝐿 − 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃 · 𝐿 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿

𝑑𝐶𝑑𝑡


𝑑𝑃𝑑𝑡

= 𝑇𝑅𝐷𝐶 · 𝑀𝐶 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝑃

𝑑𝐿2𝑑𝑡

= 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 − 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃 · 𝐿2 − 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2

𝑑𝐶2𝑑𝑡


Continuando con el desarrollo anterior, consideramos régimen permanente en los dímeros en las proteínas represoras:

𝐶2 =𝐷𝐼𝑀𝐶

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 + 𝐷𝐺𝑃· 𝐶2

𝐿2 =𝐷𝐼𝑀𝐿

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝑃 + 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃· 𝐿2

Incluyendo en la expresión de los promotores:

𝑂𝐿 = 𝑂𝐿′ =𝑛0


𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 + 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2

𝑂𝐶 =𝑛0


𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝑃 + 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃 · 𝐿2

Conocido esto, veamos el resto de ecuaciones:

(1) 𝑑𝑀𝐿


(2) 𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶 − 𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 · 𝑀𝐶 − 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶

(3) 𝑑𝑀𝑎𝑠

𝑑𝑡= 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿′ − 𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 · 𝑀𝐶 − 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝑎𝑠

(4) 𝑑𝐿𝑑𝑡




(5) 𝑑𝐶𝑑𝑡


(6) 𝑑𝑃𝑑𝑡


Por tanto, el último paso en este desarrollo, arroja la siguiente expresión:

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡=



𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 + 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2− 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿

𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡=



𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝑃 + 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃 · 𝐿2− (𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 + 𝐷𝐺𝑀) · 𝑀𝐶

𝑑𝑀𝑎𝑠

𝑑𝑡=

TRNL · 𝑛0


𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 + 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2− (𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝐶 − 𝐷𝐺𝑀) · 𝑀𝑎𝑠

𝑑𝐿𝑑𝑡


𝑑𝑃𝑑𝑡


𝑑𝐶𝑑𝑡


Antes de pasar a relacionar los parámetros de un modelo y otro, debemos notar una diferencia de forma entre las dinámicas del ARN mensajero de cI. Esta diferencia de forma en la función es, comparándola con el modelo extraído al comienzo de este documento:



𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡=



𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝑃 + 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃 · 𝐿2− (𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 + 𝐷𝐺𝑀) · 𝑀𝐶

Es sencillo encontrar la relación entre los parámetros de ambos modelos, sin embargo, para el siguiente caso, tenemos que pararnos a observar:

𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑐𝐼 =𝑅𝐸𝑃𝐿𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿

·𝐷𝐼𝑀𝐿

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝑃 + 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃

No podemos considerar que la expresión de la derecha sea una constante, ya que aparece la proteasa responsable de la digestión de la proteína represora LacI y de sus multímeros.


En este punto, nos preguntamos el porqué de esta diferencia de forma.

La estrategia de modelado seguida partía de los conocimientos de cinéticas propias de la biología para más tarde enlazarlos con los resultados de un planteamiento alejado del estudio biológico. El modelo en caja negra seguido en la segunda parte de los modelos, demostró en el primer sistema ser análogo con los desarrollos cinéticos biológicos, mientras que este segundo modelo, más complejo, parece no ser coherente.

Recordemos la obtención de la cinética de la transcripción reprimida:

A la reacción de transcripción se le asociaba una cinética de Michaelis-Menten, mientras que la represión se modelaba a través de la ecuación de Hill, donde el factor de cooperatividad de la represión quedaba modelado cómo una potencia de la población de represor.

Las reacciones asociados a estos procesos biológicos, así como sus expresiones, no tomaban en consideración la posible presencia de un multímero del represor de forma explícita, a pesar de que la ecuación de Hill sí que contempla esta situación.

Es por este motivo por el cual, a través del modelo en reacciones elementales y cinéticas de primer orden, donde sí se tiene en cuenta de forma explícita, aparece la supuesta contradicción.

Por tanto, siendo rigurosos deberíamos tenerla en cuenta en nuestro modelo. Sin embargo, comprendamos cómo se produce la proteólisis en este sistema, para tomar una decisión acertada:

A La proteína represora LacI se le asoció una cadena identificadora para que la proteasa la identificara como degradable. Así, se consigue que la digestión, tras la aparición de esta proteasa, se produjera lo más rápidamente posible. De hecho, es muy poco probable que la proteína sea capaz de formar dímeros en presencia de su digestora. Por otro lado, esta proteasa, consume tanto la proteína represora como sus multímeros con la misma rapidez. Estas conclusiones se basan en el documento de investigación utilizado por este grupo para diseñar el biestable mejorado, Engineering Controllable Protein Degradation [9].

Por este motivo, a la hora de hacer la correlación de ambos modelos, no vamos a tener en cuenta esta diferencia de resultados.



Por tanto, terminamos de realizar la identificación de parámetros cruzados:

𝑐𝑡𝑒𝑡𝑟 = 𝑇𝑅𝑁 · 𝑛0

𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑐𝐼 =𝑅𝐸𝑃𝑁𝑅𝐸𝑃

·𝐷𝐼𝑀

𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 + 𝐷𝐺𝑃

𝑐𝑡𝑒𝑡𝑑 = 𝑇𝑅𝐷

𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝑜𝑡 = 𝐷𝐼𝐺𝑃

𝑐𝑡𝑒𝑎𝑠 = 𝐼𝑁𝐻

Observando que la relación de los parámetros de la transcripción, traducción y represión se obtienen de la misma forma.


7. Conclusión de los Modelos

Presentamos de forma esquemática los modelos que se han extraído:

Biestable simple.

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐿

1 + 𝑘𝑝𝑟𝐿 · 𝐶𝛼− 𝑑𝑚 · 𝑀𝐿

𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐶

1 + 𝑘𝑡𝑟𝐶 · 𝐿𝛽− 𝑑𝑚 · 𝑀𝐶

𝑑𝐿𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐿 · 𝑀𝐿 − 𝑑 · 𝐿

𝑑𝐶𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐶 · 𝑀𝐶 − 𝑑 · 𝐶

Biestable modificado.

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐿


𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐶

1 + 𝑘𝑝𝑟𝐶 · 𝐿𝛽− (𝑘𝑖𝑛ℎ · 𝑀𝑎𝑠 + 𝑑𝑚) · 𝑀𝐶

𝑑𝑀𝑎𝑠

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐿

1 + 𝑘𝑝𝑟𝐿 · 𝐶𝛼− (𝑘𝑖𝑛ℎ · 𝑀𝐶 − 𝑑𝑚) · 𝑀𝑎𝑠

𝑑𝐿𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐿 · 𝑀𝐿 − 𝑘𝑝𝑟𝑜𝑡 · 𝑃 · 𝐿 − 𝑑 · 𝐿

𝑑𝑃𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐶 · 𝑀𝐶 − 𝑑 · 𝑃

𝑑𝐶𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐶 · 𝑀𝐶 − 𝑑 · 𝐶

A continuación, pasamos a estudiar la estabilidad de ambos sistemas y a comprobar la robustez aportada por los parámetros, así como un estudio de


Análisis de Estabilidad 51

Análisis de estabilidad determinista

Tras haber completado la definición completa de los sistemas en ecuaciones diferenciales ordinarias, pasamos a estudiar la estabilidad y robustez de los puntos de equilibrio.

Durante todo este apartado y en algunos sucesivos, eliminaremos del estudio, la relación con los parámetros biológicos y serán sustituidos por parámetros globales. Además, las ecuaciones, aun teniendo la misma forma y perteneciendo a la misma familia, se simplifican para tener un estudio más sencillo; más tarde, podremos correlar lo extraído de este análisis a los conceptos reactivos de los sistemas biológicos reales.

52 Análisis de Estabilidad



1. Análisis de estabilidad del modelo del biestable

simple

Observemos el modelo simple y busquemos, dentro de la familia de ecuaciones matemáticas, cual es la forma más simple:

𝑑𝑥1𝑑𝑡

=𝐴

1 + 𝐵 · 𝑥2𝑎− 𝑑 · 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

=𝐴′

1 + 𝐵′ · 𝑥1𝑎′− 𝑑′ · 𝑥2

Vamos a representar el espacio de estados de este sistema, sin asignar de forma intencionada los valores de los parámetros:

Se observa que la zona estable tiende a estar en la siguiente relación de variables de estado: x2 es inverso a x1.

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10Plano de fases

x1

x2


Además, representamos en el plano de fases las nullclinas de cada variable de estado en función de la otra variable:

Encontramos 3 puntos donde ambas curvas se cruzan. Estos puntos son, de hecho, los estados de equilibrio del sistema. Para comprobarlo, simulamos el sistema a un tiempo infinito haciendo uso de matlab con un programa que tiene la siguiente forma:

0 2 4 6 8 10 120

2

4

6

8

10

12Plano de fases

x1

x2



Los resultados los representamos sobre el plano de fases:

Efectivamente, se comprueban estos puntos como los de equilibrio del sistema.

Ahora que conocemos los puntos, necesitamos conocer su estabilidad. Aunque tenemos muchas herramientas para conseguir este objetivo, vamos a hacerlo de forma gráfica. Simulamos el sistema desde diferentes condiciones iniciales para conseguir la cuenca de atracción en el espacio de estados

0 2 4 6 8 10 120

2

4

6

8

10

12Plano de fases

x1

x2


Para demostrar la estabilidad de los puntos de equilibrio vamos a linealizar el sistema en torno a los 3 puntos para comprobar su estabilidad. Para este propósito vamos a sustituir los valores de los parámetros utilizados en las simulaciones:

𝑑𝑥1𝑑𝑡

= 𝑓(𝑥1, 𝑥2) =10

1 + 𝑥22− 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

= 𝑔(𝑥1,𝑥2) =10

1 + 𝑥12− 𝑥2

Mostramos la matriz jacobiana del sistema y calculamos los autovalores para cada estado de equilibrio:

𝐽(𝑥1,𝑥2) =

⎣⎢⎢⎢⎡ −1

20 · 𝑥2(1 + 𝑥22)2

20 · 𝑥1(1 + 𝑥12)2 −1

⎦⎥⎥⎥⎤

0 2 4 6 8 10 120

2

4

6

8

10

12Plano de fases

x1

x2



Para cada punto de equilibrio, los autovalores de la matriz jacobiana son:

El modelo no puede mostrar una situación más favorable, al menos en cuanto a puntos de equilibrio se refiere.

Pero es necesario observar con mayor detenimiento el recorrido del estado del sistema partiendo de cualquier estado inicial que no sea el estable.

Si nos vamos a un punto inicial alejado de las situaciones de equilibrio, la tendencia del sistema es acercarse al equilibrio inestable para salir despedido hacia uno de los estables en función de una proporción de igualdad entre ambas. Esto genera bastante desconcierto desde el momento en que sabemos que el sistema no es determinista ni tan ideal como muestra este plano de fases. La aleatoriedad con la que el sistema evoluciona, aunque por el cauce marcado por la topología mostrada, obliga a pensar que puede saltar de un estado a otro de forma sencilla.

Los estados del régimen permanente son, sin duda robustos y favorables para el comportamiento esperado, sin embargo, es el trazado en la evolución del sistema la que muestra dudas al respecto de cómo se alcanzan estos estados estables y el control propio del sistema.

Equilibrio Autovalores Tipo

𝑥1 ≫ 𝑥2 −0.8 −1.2 Foco estable

𝑥1 = 𝑥2 −2.6 −0.6 Punto de silla inestable

𝑥1 ≪ 𝑥2 −0.8 −1.2 Foco estable

0

5

5

2

5

3

5

4

5

5

2

4

6

8

2

2

4

6

8

3


2. Análisis de estabilidad del sistema biestable mejorado

No cabe duda, que trabajar con un sistema de 6 ecuaciones diferenciales hace realmente complicado alcanzar unas conclusiones parecidas a las anteriores. Sin embargo, de nuevo, nuestras salidas de interés serán las poblaciones de las proteínas represoras. Por tanto,

𝑑𝑚1

𝑑𝑡=

𝐴1 + 𝐵 · 𝑥2𝑎

− 𝑑𝑚 · 𝑚1

𝑑𝑚2

𝑑𝑡=

𝐴′

1 + 𝐵′ · 𝑥1𝑎′ − 𝐾𝐴 · 𝑖1 · 𝑚2 − 𝑑𝑚 · 𝑚2

𝑑𝑖1𝑑𝑡

=𝐴

1 + 𝐵 · 𝑥2𝑎− 𝐾𝐴 · 𝑖1 · 𝑚2 − 𝑑𝑚 · 𝑖1

𝑑𝑖2𝑑𝑡

= 𝐶′ · 𝑚2 − 𝐾𝑃 · 𝑖2 · 𝑥1 − 𝑑 · 𝑖2

𝑑𝑥1𝑑𝑡

= 𝐶 · 𝑚1 − 𝐾𝑃 · 𝑖2 · 𝑥1 − 𝑑 · 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

= 𝐶′ · 𝑚2 − 𝑑 · 𝑥2

Este será el sistema sobre el que vamos a trabajar de cara a sacar las conclusiones respecto de la estabilidad de funcionamiento.

Tal y como se dijo anteriormente, no podremos extraer conclusiones tan claras al estar trabajando con un sistema de 6 variables de estado y que además tiene ecuaciones de estado tan complejas; por lo que simularemos el sistema para obtener los puntos de equilibrio del sistema.

Primero, veamos el sistema para los valores de los parámetros dados en este análisis:

𝑑𝑚1

𝑑𝑡=

11 + 𝑥2𝑎

− 0.5 · 𝑚1

𝑑𝑚2

𝑑𝑡=

11 + 𝑥1𝑎

′ − 𝑖1 · 𝑚2 − 0.5 · 𝑚2

𝑑𝑖1𝑑𝑡

=1

1 + 𝑥2𝑎− 𝑖1 · 𝑚2 − 0.5 · 𝑖1

𝑑𝑖2𝑑𝑡

= 5 · 𝑚2 − 𝑖2 · 𝑥1 − 𝑖2

𝑑𝑥1𝑑𝑡

= 5 · 𝑚1 − 𝑖2 · 𝑥1 − 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

= 5 · 𝑚2 − 𝑥2



Las simulaciones del sistema, muestran cómo continuamos teniendo dos equilibrios estables, y sin conocer el punto de equilibrio inestable. Además, la evolución de las poblaciones de las proteínas represoras es mucho más óptima en este caso, según nuestro criterio de estabilidad.

La abertura con la que una variable tiende a su equilibrio es mayor que en el caso anterior, por tanto, se asegura que, a pesar de la aleatoriedad del sistema real, la cuenca de atracción que posea implica una desviación mayor. Esto también significa que cuando el sistema alcanza el valor estable en el régimen permanente, no saldrá de él fácilmente, a excepción de nuevas acciones que se puedan aplicar sobre el sistema.

0 2 4 6 8 10 12 14 160

2

4

6

8

10

12

14

16Plano de fases

x1

x2


Para estudiar la estabilidad de estos puntos, pasamos a calcular la matriz jacobiana de este sistema y a identificar los valores de los puntos de equilibrio.

−0.5 0 0 0 0 −2 · 𝑥2

(1 + 𝑥22)2

0 −(𝑖1 + 0.5) −𝑚2 0 −2 · 𝑥1

(1 + 𝑥12)2 0

0 −𝑖1 −(𝑚2 + 0.5) 0 0 −2 · 𝑥2

(1 + 𝑥22)2

0 5 0 −(𝑥1 + 1) −𝑖2 0

5 0 0 −𝑥1 −(𝑖2 + 1) 0

0 5 0 0 0 −1

Una vez conocido, calculamos los valores de los puntos de equilibrio y comprobamos los autovalores para la jacobiana en puntos.

Los puntos de equilibrio encontrados, para los valores establecidos son:

𝑚1∗ 𝑚2

∗ 𝑖1∗ 𝑖2∗ 𝑥1∗ 𝑥2∗ 1.9992 0.0040 1.9833 0.0018 9.9778 0.0200 0.0201 1.9838 0.0041 9.8274 0.0093 9.9188

Y los autovalores de la jacobiana expresada en estos puntos:

Eq 1 −10.979 −2.4912 −0.9998 + 0.0361𝑖

−0.9998 − 0.0361𝑖 −0.4955 −0.5018

Foco estable

Eq 2 −10.8367 −2.4810 −0.5038 −0.4771 −0.9999 -1.0259 Nodo estable

Para estudiar la estabilidad del sistema en sus puntos de equilibrio, vamos a basarnos en el principio de estabilidad de Lyapunov. Una vez identificados los puntos de equilibrio y sus valores, simulamos el sistema desde puntos alejados una distancia aleatoria de tal equilibrio y observamos su evolución.



Para el primer punto de equilibrio:

Donde se encuentra el círculo azul, está el foco estable y en la cruz, el punto de partida. Observamos que en todos los casos el sistema tiende a regresar al punto de equilibrio cercano.

8 10 12 14 16 180.02

0.03

0.04

0.05

0.06

8 10 12 14 16 180.01

0.02

0.03

0.04

0.05

4 6 8 10 120.02

0.04

0.06

0.08

6 7 8 9 100.02

0.04

0.06

0.08

8 10 12 14 160.02

0.03

0.04

0.05

0.06

6 8 10 12 140.02

0.04

0.06

0.08


Observamos lo que sucede con el otro punto de equilibrio, y los resultados que vamos a obtener son iguales (cualitativamente) a los del primero:

Los diferentes trazados que aparecen en alcanzar de nuevo el equilibrio, se deben a que aquí sólo estamos mostrando el espacio de estados de las 2 variables que nos interesan (los represores), sin embargo, los puntos de partida tienen variados todas las demás variables desde sus puntos valores de equilibrio.

0.01 0.015 0.02 0.025 0.037

8

9

10

11

0 0.02 0.04 0.06 0.080

5

10

15

0.01 0.015 0.02 0.025 0.034

6

8

10

0 0.01 0.02 0.03 0.048

8.5

9

9.5

10

0.01 0.015 0.02 0.025 0.038

10

12

14

0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.060

5

10

15


Análisis de Bifurcaciones 63

Análisis bifurcaciones

Este apartado del proyecto quiere profundizar en el conocimiento de los sistemas tratados hasta el momento. Además de sacar conclusiones sobre los parámetros y su influencia para el trazado de las poblaciones de las variables de estado, estudiaremos la probabilidad de que el sistema se encuentre con puntos de bifurcación reales.

64 Análisis de Bifurcaciones



1. Introducción de la teoría de bifurcaciones

A continuación, realizaremos un estudio de bifurcaciones de los parámetros del sistema. Además de observar sus efectos sobre la cuenca de atracción, con el análisis de bifurcaciones pretendemos encontrar los valores límites de la estabilidad del sistema en función de los parámetros.

Antes de continuar con este paso, haremos una pequeña introducción teórica de este estudio, y las implicaciones que tiene sobre el modelo analizado.

Teoría de bifurcaciones

La teoría de bifurcaciones se encarga del análisis topológico y estructural de un sistema de ecuaciones diferenciales. Así, podemos estudiar diferentes características de una familia de ecuaciones matemáticas como, por ejemplo, la cuenca de atracción. En nuestro caso, veremos cómo cambia el vector de estados en régimen permanente a través de los parámetros y extraeremos información acerca de los límites de operación.

Veamos un ejemplo clásico:

�̇� = 𝑟 + 𝑥2

En función del valor de 𝑟 encontramos diferentes tipos de puntos de equilibrio:

El diagrama de bifurcación para los valores de 𝑥 en régimen permanente en función del valor del parámetro 𝑟 es:


2. Análisis de bifurcaciones del biestable simple

Consideramos en este apartado, al igual que en los anteriores, y por simplificar el análisis, que es sistema es simétrico i.e. que los parámetros de las ecuaciones son parejos. Aunque esto no es cierto, nos ayudará a comprender de forma más directa los resultados que extraigamos.

Siendo el sistema:

𝑑𝑥1𝑑𝑡

=𝐴

1 + 𝐵 · 𝑥2𝛼− 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

=𝐴′

1 + 𝐵′ · 𝑥1𝛼′− 𝑥2

Comenzamos con el parámetro A. Los valores que se le asignan a esta magnitud serán desde 0 a 35.

0 5 10 15 20 250

5

10

15

20

25

x1

x2



La gráfica muestra los tres caminos que sigue el sistema cuando partimos desde cada situación de equilibrio y variamos el parámetro A desde 0 a 35. Las tres línea que aparecen en la imagen se deben al punto de equilibrio del cual parten en el estudio de bifurcación:

Línea roja x1 > x2 Línea negra x1 = x2 Línea azul x1 < x2

Vemos que existe un punto de bifurcación. Pero antes, veamos los diagramas de bifurcaciones donde se muestra la evolución de cada variable de estado en función del valor del parámetro.


Parámetro: A Límite inferior: 0 Límite superior: 5

Observaciones: Encontramos que existe un punto a través del cual los 3 estados de equilibrios tienden al mismo y único equilibrio. Valor crítico: 1.9

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

X: 1.9Y: 0.9744

A

x1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

X: 1.9Y: 0.9743

A

x2



Parámetro: B Límite inferior: 0 Límite superior: 5

Observaciones: De nuevo tenemos un punto de bifurcación que se encuentra en medio de la imagen. Es interesante cómo afecta el valor de este parámetro a la evolución de los puntos de equilibrios. Veamos cómo afecta a cada variable de estado. Valor crítico: 0.039

0 0.05 0.1 0.150

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 0.039Y: 5.04

B

x1

0 0.05 0.1 0.150

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 0.039Y: 5.023

B

x2


Parámetro: alfa Límite inferior: 1 Límite superior: 3

Observaciones: También encontramos un punto de bifurcación, al igual que en los anteriores. Ese punto es el mismo en las tres ocasiones, sólo que alcanzado desde cada uno de los parámetros. Valor crítico: 1.31

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.80

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 1.31Y: 2.441

alfa

x1

1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.80

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 1.31Y: 2.37

alfa

x2



Compendiamos los resultados obtenidos y sus interpretaciones:

Parámetro Valor límite 𝐴 1.9 𝐵 0.039 𝛼 1.31


1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐿𝐴𝐶𝐼 · [𝑐𝐼]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝛼 − 𝑐𝑡𝑒𝑑𝐿𝐴𝐶𝐼 · [𝐿𝑎𝑐𝐼]


1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟𝐶𝐼 · [𝐿𝑎𝑐𝐼]𝑒𝑓𝑒𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝛽 − 𝑐𝑡𝑒𝑑𝐶𝐼 · [𝑐𝐼]

Recordando el significado de las constantes, podemos establecer una relación entre el parámetro biológico y su valor límite para no encontrar situaciones no estables o de no equilibrios.

𝑐𝑡𝑒𝑠 > 1.9

𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟 > 0.039

𝛼,𝛽 > 1.31

𝑐𝑡𝑒𝑠1 + 𝑐𝑡𝑒𝑝𝑟

> 1.9


3. Estudio de bifurcaciones del modelo del biestable

mejorado

Hacer lo mismo que para el biestable simple y pasamos por cada uno de los parámetros globales y estudiamos si existen puntos de bifurcación, conociendo así valores críticos de estos.

De nuevo, supondremos que las cinéticas de las reacciones parejas son iguales. Recordando el sistema:

𝑑𝑚1

𝑑𝑡=

𝐴1 + 𝐵 · 𝑥2𝑎

− 𝑑𝑚 · 𝑚1

𝑑𝑚2

𝑑𝑡=

𝐴′

1 + 𝐵′ · 𝑥1𝑎′ − 𝐾𝐴 · 𝑖1 · 𝑚2 − 𝑑𝑚 · 𝑚2

𝑑𝑖1𝑑𝑡

=𝐴

1 + 𝐵 · 𝑥2𝑎− 𝐾𝐴 · 𝑖1 · 𝑚2 − 𝑑𝑚 · 𝑖1

𝑑𝑖2𝑑𝑡

= 𝐶′ · 𝑚2 − 𝐾𝑃 · 𝑖2 · 𝑥1 − 𝑑 · 𝑖2

𝑑𝑥1𝑑𝑡

= 𝐶 · 𝑚1 − 𝐾𝑃 · 𝑖2 · 𝑥1 − 𝑑 · 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

= 𝐶′ · 𝑚2 − 𝑑 · 𝑥2

Los parámetros a analizar serán: A, B, C, KA, KP y alfa.

A pesar de no conocer el equilibrio inestable del sistema estudiaremos cómo varían los estados estables del biestable mejorado a través de los valores de los parámetros. Además en los siguientes diagramas de bifurcación, la línea que hace referencia a la rama inestable del sistema se ha superpuesto como idea cualitativa de lo que debe ocurrir en entre las dos ramas estables.

En las simulaciones realizadas con algunos toolbox de Matlab, sí que hemos llegado a encontrar el equilibrio inestable pero sólo para algunos casos específicos sin lograr, una línea continua que mostrar.



Parámetro: A Límite inferior: 0 Límite superior: 5

Observaciones: A partir de un valor crítico, tenemos una situación biestable, mientras que por debajo de éste, el sistema tiende a un único equilibrio Valor crítico: 0.3

0 0.5 1 1.5 2 2.5-5

0

5

10

15

20

25

X: 0.3Y: 0.08329

A

x1

0 0.5 1 1.5 2 2.5-5

0

5

10

15

20

25

X: 0.3Y: 2.947

A

x2


Parámetro: B Límite inferior: 0 Límite superior: 0.5


0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 0.075Y: 0.1319

B

x1

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.250

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 0.075Y: 9.638

B

x2



Parámetro: C Límite inferior: 0 Límite superior: 5


0 0.5 1 1.5 2 2.50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

X: 1.8Y: 0.1301

C

x1

0 0.5 1 1.5 2 2.50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

X: 1.8Y: 3.425

C

x2


Parámetro: KA Límite inferior: 0 Límite superior: 10

Observaciones: Este parámetro no afecta a la biestabilidad. Sin embargo, sí que observamos cómo incrementa el valor de régimen permanente de una de las ramas, y baja el valor de la otra. Su acción provoca un alejamiento de los puntos de equilibrio. Aquí encontramos de nuevo otro punto de bifurcación asociado. Valor crítico: 0

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

KA

x1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

KA

x2



Parámetro: KP Límite inferior: 0 Límite superior: 5

Observaciones: La proteólisis afecta a la estabilidad del sistema de la misma forma en que lo hace la inhibición por ARN antisentido. Así, no encontramos ningún punto de bifurcación en función de este parámetro. Valor crítico: -

0 0.5 1 1.5 2 2.50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

KP

x1

0 0.5 1 1.5 2 2.50

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

KP

x2


Parámetro: alfa Límite inferior: 1 Límite superior: 5

Observaciones: Este parámetro resulta decisivo para la biestabilidad y muestra un valor crítico por debajo del cual se precipita a una única situación de equilibrio. Valor crítico: 1.36

1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 30

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 1.36Y: 0.04176

alfa

x1

1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 30

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

X: 1.36Y: 9.747

alfa

x2



Cómo resumen del análisis de bifurcaciones de los parámetros del biestable mejorado, veamos la tabla de parámetros críticos:

Parámetro Valor crítico A 0.3 B 0.075 C 1.8 KA 0 KP - alfa 1.36

Los valores encontrados no llegan a tener demasiado interés por sí mismos. Lo que resulta interesante es conocer la capacidad de que los parámetros para modificar la estabilidad del sistema. Para un estudio más profundo del sistema sería necesario tener unos valores de referencia más específicos.


Enfoque Estocástico 81

Enfoque estocástico

A diferencia del enfoque determinista, donde se asocia una ecuación diferencial ordinaria a cada especie para describir su evolución, en el enfoque estocástico se asocia una probabilidad a cada interacción entre las moléculas, y mediante un algoritmo se simula el conjunto de proteínas, y sus interacciones de forma aleatoria, pero siguiendo una distribución conocida

.

En esta sección se tratará el modelado de los sistemas Biestable Simple y Biestable, mejorado a partir del enfoque mostrado por Gillespie, entre otros autores, y la resolución del sistema a partir del algoritmo que lleva su nombre.

82 Enfoque Estocástico



1. La visión de Gillespie

El método determinista asocia una ecuación diferencial para la evolución de cada población molecular. Con el conjunto de ecuaciones se plantea el sistema a resolver. Éste método en ecuaciones diferenciales se basa en una serie de hipótesis falsas para nuestro supuesto:

• Las poblaciones son variables continuas: FALSO. Las poblaciones de la especies son entes enteros que varían su magnitud de forma discreta.

• Conocer las poblaciones en un instante de tiempo determinado es suficiente para predecir su evolución: FALSO. El choque entre moléculas es un proceso estocástico, ya que no podemos hacer un seguimiento de las posiciones, velocidad, aceleraciones, fuerzas intervinientes e incertidumbre cuántica; lo cual significa que no podemos predecir el estado final a través de unas condiciones iniciales generales.

• Los sistemas químicos no están mecánicamente aislados (la temperatura no es constante) y la bacteria en función del estado de madurez crea un ambiente diferente.

Estos son algunas por las que la solución aportada por este método es muy sesgada; debido a que la aproximación al comportamiento real es muy laxa.

Daniel T Gillespie comenzó a describir su método sobre sistemas químicos [10], lo cual terminó extrapolando a sistemas biológicos debido a las semejanzas que hay entre sistemas de este tipo.

La cinética química estocástica trata de describir la evolución temporal de un sistema químico homogéneo de una forma que tenga en cuenta la discreción y la aleatoriedad. Los fundamentos teóricos se exponen a continuación.

Fundamentos de la Cinética Química Estocástica

Sea un sistema homogéneo de 𝑁 especies químicas (𝑆1, … , 𝑆𝑁) que interaccionan a través de 𝑀 canales de reacción (𝑅1, … ,𝑅𝑀). El sistema se supone confinado en un volumen constante Ω y en equilibrio térmico a una temperatura constante. Sea 𝑋𝑖(𝑡) el número de moléculas de la especie 𝑆𝑖 en el sistema en el tiempo 𝑡, queremos estudiar la evolución del vector de estado 𝑋(𝑡) = (𝑋1(𝑡), . . . ,𝑋𝑁(𝑡)) dado, asumiendo que parte de un estado inicial 𝑋(𝑡0) = 𝑥0. Cada canal reactivo 𝑅𝑗 se supone elemental, i.e. describe un evento físico que ocurre instantáneamente. El canal reactivo 𝑅𝑗 se caracteriza por dos cantidades:


• El vector de cambio de estados 𝑣𝑖𝑗 = (𝑣𝑖1, … , 𝑣𝑖𝑁), donde cada componente 𝜈𝑖𝑗 se define como el cambio de la población molecular de la especie 𝑆𝑖 causada por una reacción 𝑅𝑗. Si el sistema se encuentra en el estado 𝑥, y ocurre una 𝑅𝑗, el sistema cambia su estado a 𝑥 + 𝜈𝑖 . El vector 𝜈𝑖𝑗 se conoce como la matriz estequiométrica del sistema reactivo.

• La función de propensidad 𝑎𝑗 se define de forma que 𝑎𝑗(𝑥)𝑑𝑡 de la probabilidad de que, dado 𝑋(𝑡) = 𝑥, ocurra 𝑅𝑗 dentro de Ω en el siguiente instante infinitesimal [𝑡, 𝑡 + 𝑑𝑡).

Si 𝑅𝑗 es una reacción mono-molecula Si → producto/s r, la física que hay detrás de la mecánica cuántica implica la existencia de una constante 𝑐𝑗 tal que la función de propensidad asociada queda aj(x) = cj · xj

Si 𝑅𝑗 es una reacción bi-molecular 𝑆𝑖 + 𝑆𝑗 → 𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜/𝑠, la física cuántica implica la existencia de una constante 𝑐𝑗 tal que la función de propensidad asociada queda:

aj(x) = �cj · xi · xi′ , i ≠ i′ cj · 1

2 · xi · (xi − 1), i = i′ en función de si las especias sean la misma o

diferentes.

Notar como 𝑐𝑗 para una reacción mono-.molecular es la constante cinética 𝑘𝑗 de la cinética química determinista convencional, mientras que 𝑐𝑗 para una reacción bi-molecular es 𝑘𝑗/𝛺 en el caso de reactivos diferentes, o 2 · 𝑘𝑗/𝛺 si son el mismo.

La Ecuación Química Maestra

Intentamos calcular la probabilidad 𝑃(𝑥, 𝑡|𝑥0, 𝑡0) de que 𝑋(𝑡) sea igual a 𝑥, dado 𝑋(𝑡0) = 𝑥0. Usando las leyes de la probabilidad:

𝑃(𝑥, 𝑡 + 𝑑𝑡|𝑥0, 𝑡0) = 𝑃(𝑥, 𝑡|𝑥0, 𝑡0) ∗ �1 −�𝑎𝑗(𝑥)𝑑𝑡𝑀

𝑗=1

� + �𝑃�𝑥 − 𝑣𝑗 , 𝑡�𝑥0, 𝑡0� ∗ (𝑎𝑗�𝑥 − 𝑣𝑗�𝑑𝑡𝑀

𝑗=1

El primer término de la derecha es la probabilidad de que, estando el sistema en el estado 𝑥 y en el instante de tiempo 𝑡, no ocurra ninguna reacción en el intervalo [𝑡, 𝑡 + 𝑑𝑡) y el segundo término, es la probabilidad de que el sistema cambie su estado actual 𝑥 en el instante de tiempo 𝑡, a través de una reacción 𝑅𝑗 en el instante consecutivo [𝑡, 𝑡 + 𝑑𝑡).



Sustrayendo el término 𝑃(𝑥, 𝑡|𝑥0, 𝑡0) de ambos lados, dividiendo por 𝑑𝑡 y tendiendo al límite 𝑑𝑡 → 0:

𝝏𝑷(𝒙, 𝒕|𝒙𝟎, 𝒕𝟎)𝝏𝒕

= ��𝒂𝒋�𝒙 − 𝒗𝒋, 𝒕�𝒙𝟎, 𝒕𝟎� − 𝒂𝒋(𝒙)𝑷(𝒙, 𝒕|𝒙𝟎, 𝒕𝟎)�𝑴

𝒋=𝟏

Ecuación Química Maestra

A pesar del aspecto que muestra, la resolución no puede hacerse de manera analítica excepto en casos muy simples. Si todas las reacciones fuesen mono-moleculares, todas las funciones de propensidad serían lineales con las variables de estado. Pero su alguna ecuación fuese de un orden mayor, el aspecto de la ecuación y su resolución se vuelven mucho más complejos.

El Algoritmo de Simulación Estocástico

La resolución de la Ecuación Quimifica Maestra no resulta útil en nuestros problemas, por eso buscamos un enfoque diferente. De nuevo Daniel T Gillespie nos enseña el camino por proceder [10]. Se ha comprobado que el siguiente método es muy efectivo: generar trayectorias numéricas para el vector de estado 𝑋(𝑡).

• Se define 𝑝(𝜏, 𝑗|𝑥, 𝑡)𝑑𝑡 como la probabilidad de que, dado 𝑋(𝑡) = 𝑥, la próxima reacción que ocurrirá en el sistema en el siguiente intervalo infinitesimal de tiempo [𝑡 + 𝜏, 𝑡 + 𝜏 + 𝑑𝜏) y que será la reacción 𝑅𝑗. Para derivar una expresión analítica, además,

• Se define 𝑃0(𝜏|𝑥, 𝑡) como la probabilidad de que, dado 𝑋(𝑡) = 𝑥, no ocurra ninguna reacción en el siguiente intervalo [𝑡, 𝑡 + 𝜏).

Por las leyes de probabilidad se obtienen estas ecuaciones:

𝑝(𝜏, 𝑗|𝑥, 𝑡) = 𝑃0(𝜏|𝑥, 𝑡) ∗ 𝑎𝑗(𝑥)𝑑𝜏

𝑃0(𝜏 + 𝑑𝜏|𝑥, 𝑡) = 𝑃0(𝜏|𝑥, 𝑡) ∗ �1− � 𝑎𝑗′(𝑥)𝑑𝜏𝑀

𝑗′=1

�

Si en la última ecuación aplicamos el límite de 𝑑𝜏 → 0 se encuentra que:

P0(τ|x, t) = exp (−a0(x)τ) , donde

𝑎0(𝑥) = � 𝑎𝑗′(𝑥)𝑀

𝑗′=1

Quedando finalmente la expresión cómo:

𝑝(𝜏, 𝑗|𝑥, 𝑡) = 𝑎𝑗(𝑥) · 𝑒𝑥𝑝 (−𝑎0(𝑥) · 𝜏)


Haciendo uso del método de inversión de la teoría de Monte-Carlo concluimos el método general para el Algoritmo de Simulación Estocástico.

MÉTODO GENERAL PARA EL ALGORITMO DE SIMULACIÓN ESTOCÁSTICO

1. Inicialización del tiempo y del estado del sistema 𝑡 = 𝑡0 𝑥 = 𝑥0

2. Con el sistema actualizado en tiempo y estado, evaluamos las funciones de propensidad y su suma: 𝑎𝑗(𝑥)

𝑎0(𝑥) = � 𝑎𝑗′(𝑥)𝑀

𝑗′=1

3. Se generan los valores del paso temporal y de las reacciones a partir de dos

valores aleatorios (variable aleatoria entre 0 y 1) 𝑟1, 𝑟2 → 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟𝑒𝑠 𝑎𝑙𝑒𝑎𝑡𝑜𝑟𝑖𝑎𝑠

𝜏 =1

𝑎0(𝑥)ln �

1𝑟1�

Buscamos el valor de índice j’, para conocer la reacción asociada que se producirá en el siguiente paso temporal. Para ello, el índice debe cumplir la siguiente condición:

� 𝑎𝑗′(𝑥) ≤ 𝑟2𝑎0(𝑥) ≤ � 𝑎𝑗′(𝑥)𝑗

𝑗′=1

𝑗−1

𝑗′=1

4. Se aplicará el efecto que corresponda con el reemplazo del nuevo estado

temporal y del nuevo estado: 𝑡 ← 𝑡 + 𝜏 𝑥 ← 𝑥 + 𝑣𝑗

5. Se guardan los valores de (𝑥, 𝑡) y se vuelve al paso 2 o se termina la simulación si se ha alcanzado el tiempo total de simulación.



Tau-Leaping

El tau-leaping es una estrategia de simulación acelerada. Se trata de una forma simple donde se requiere que τ sea pequeño para satisfacer la condición de salto, El cambio inducido por un salto debe ser lo suficientemente pequeño como para que los cambios en las funciones de propensidad sean lo suficientemente pequeños.

Si 𝑋(𝑡) = 𝑥, y si elegimos un tau lo suficientemente pequeño, las funciones de propensidad serán casi constantes, entonces, la reacción 𝑅𝑗 debe ocurrir aproximadamente en veces en el intervalo de tiempo [𝑡, 𝑡 + 𝜏).

𝑋(𝑡 + 𝜏) = 𝑥 + �𝑣𝑗 · 𝑃𝑗(𝑎𝑗(𝑥)𝑑𝜏)𝑀

𝑗=1

Fórmula básica del algoritmo tau-leaping

En ella tenemos que:

x = X(t) Pj(mj) Variable aleatoria independiente de Poisson con media (y varianza) 𝑚𝑗

𝑃(𝑎, 𝜏) se define como el número de eventos que ocurrirán en el tiempo 𝜏 dado que 𝑎 · 𝑑𝑡 es la probabilidad de que el evento ocurra en algún intervalo infinitesimal de tiempo dt, donde a es una constante real y positiva.

El método de integración de la ecuación química maestra de Gillespie, es muy lento ya que en cada paso de integración, supone que sólo se produce una reacción, mientras que en tau-leaping en cada paso, todas las reacciones se producen según una variable de Poisson

Aspectos de interés del método

• A partir de la expresión de la ecuación química maestra, el algoritmo de simulación estocástico permite la resolución numérica de sistemas químicos homogéneos. El método consiste en asignar pasos temporales entre eventos reactivos moleculares.

• El algoritmo de simulación estocástica como procedimiento de simulación numérica de sistemas químicos homogéneos, asigna pasos temporales entre eventos reactivos moleculares según las directrices de la ecuación química maestra.

• El algoritmo tiene en cuenta la naturaleza discreta y estocástica de los sistemas químicos reactivos. Por este motivo es más útil que el método basado en ecuaciones diferenciales ordinarias.


• La simulación de cada reacción molecular hace que el método sea lento al aplicarlo en un sistema reactivo realista.

• El método de integración por tau-leaping es una mejora en la rapidez de la resolución. La suposición de cada función de propensidad como variable de Poisson permite ejecutar cada reacción en cada paso en integración.



2. Scripts en Matlab

Algoritmos de simulación

A partir de lo explicado en el anterior, pasamos mostrar los programas que hemos realizado en matlab para la resolución y simulación de los modelos estudiados hasta el momento.

gillespie.m ...

%inicialización vector tiempo vtiempo(1)=0; %condiciones iniciales especies(:,1)=0.01*ones(nesp,1); %iniciación del algoritmo ind=2; while(vtiempo(ind-1)<tsim) %cálculo de las propensidades modelo %elección de la reacción cumprop=cumsum(prop); al1=rand(); al2=rand(); Rind=find(al1*sum(prop)<cumprop,1); %elección del salto temporal tau=log(1/al2)/(sum(prop)); %actualización del tiempo vtiempo(ind)=vtiempo(ind-1)+tau; %actualización de las poblaciones de las especies especies(:,ind)=especies(:,ind-1)+R(:,Rind); for i=1:nesp if(especies(i,ind)<0) especies(i,ind)=0; end end %visor de evolución del algoritmo vtiempo(ind)/tsim %actualización del índice ind=ind+1; end

...


Además, hemos implementado el algoritmo tau-leaping para lograr simulaciones de los sistemas de forma más rápida.

tauleaping.m ...

%inicialización vector tiempo vtiempo(1)=0; %condiciones iniciales especies(:,1)=0.01*ones(nesp,1); %inicialización del algoritmo ind=2; tau=0.1; while vtiempo(ind-1)<tsim %cálculo de propensidades modelo %actualización del vector de estados for i=1:nesp Rn(i)=sum(random('poiss',prop(:)*tau).*R(i,:)'); especies(i,ind)=especies(i,ind-1)+Rn(i); if(especies(i,ind)<0) especies(i,ind)=0; end end %actualización vector tiempo vtiempo(ind)=vtiempo(ind-1)+tau; %actualziación del índice ind=ind+1; %visor de evolución del algoritmo vtiempo(ind-1)/tsim end

...



Modelos de los sistemas

BIESTABLE SIMPLE

bsimple\Modelo.m ...

% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 % Ol Oc Ml Mc L C L2 C2 L2Oc C2Ol RFP GFP % 1. Ol -> Ol + Ml % 2. Ml -> Ml + L + RFP % 3. L + L -> L2 % 4. L2 -> L + L % 5. L2 + Oc -> L2Oc % 6. L2Oc -> L2 + Oc % 7. Oc -> Oc + Mc % 8. Mc -> Mc + C + GFP % 9. C + C -> C2 % 10.C2 -> C + C % 11.C2 + Ol -> C2Ol % 12.C2Ol -> C2 + Ol % 13.Ml -> null % 14.Mc -> null % 15.L -> null % 16.C -> null % 17.L2 -> null % 18.C2 -> null % 19.RFP -> null % 20.GRP -> null %La dimerización se producirá en función del factor de cooperatividad a=1+boolean(random('poiss',alfa)-1); b=1+boolean(random('poiss',beta)-1); %Cálculo de las propensidades prop(1) = par(1) * especies(1,ind-1); prop(2) = par(2) * especies(3,ind-1); prop(3) = par(3) * especies(5,ind-1)^a; prop(4) = par(4) * especies(7,ind-1); prop(5) = par(5) * especies(7,ind-1) * especies(2,ind-1); prop(6) = par(6) * especies(9,ind-1); prop(7) = par(7) * especies(2,ind-1); prop(8) = par(8) * especies(4,ind-1); prop(9) = par(9) * especies(6,ind-1)^b; prop(10)= par(10)* especies(8,ind-1); prop(11)= par(11)* especies(8,ind-1) * especies(1,ind-1); prop(12)= par(12)* especies(10,ind-1); prop(13)= par(13)* especies(3,ind-1); prop(14)= par(14)* especies(4,ind-1); prop(15)= par(15)* especies(5,ind-1); prop(16)= par(16)* especies(6,ind-1); prop(17)= par(17)* especies(7,ind-1); prop(18)= par(18)* especies(8,ind-1); prop(19)= par(19)* especies(11,ind-1); prop(20)= par(20)* especies(12,ind-1);


% 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 % Ol Oc Ml Mc L C L2 C2 L2Oc C2Ol RFP GFP %Matriz estequiométrica R=[ 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0; %1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0; %2 0 0 0 0 -a 0 1 0 0 0 0 0; %3 0 0 0 0 a 0 -1 0 0 0 0 0; %4 0 -1 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0; %5 0 1 0 0 0 0 1 0 -1 0 0 0; %6 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0; %7 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1; %8 0 0 0 0 0 -b 0 1 0 0 0 0; %9 0 0 0 0 0 b 0 -1 0 0 0 0; %10 -1 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0; %11 1 0 0 0 0 0 0 1 0 -1 0 0; %12 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0; %13 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0; %14 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0; %15 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0; %16 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0; %17 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0; %18 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0; %19 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1]'; %20

BIESTABLE MEJORADO

bmejorado\Modelo.m

... % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 %Ol Oc Ol' Ml Mc Mas L C P L2 C2 L2Oc C2Ol C2Ol' GFP RFP %1. Ol -> Ol + Ml %2. Ml -> Ml + L + GFP %3. L + L -> L2 %4. L2 -> L + L %5. L2 + Oc -> L2Oc %6. L2Oc -> L2 + Oc %7. Oc -> Oc + Mc %8. Mc -> Mc + C + P %9. C + C -> C2 %10. C2 -> C + C %11. C2 + Ol -> C2Ol %12. C2Ol -> C2 + Ol %13. Ol' -> Ol' + Mas %14. C2 + Ol' -> C2Ol' %15. C2Ol' -> C2 + Ol' %16. P + L -> P %17. P + L2 -> P %18. P + GFP -> P %19. Mas + Mc -> null %20 Ml -> null %21. Mc -> null %22. Mas -> null %23. L -> null %24. C -> null %25. P -> null



%26. L2 -> null %27. C2 -> null %28. GFP -> null %29. RFP -> null %La dimerización se producirá en función del factor de cooperatividad a=1+boolean(random('poiss',alfa)-1); b=1+boolean(random('poiss',beta)-1); %Cálculo de propensidades prop(1) = par(1) * especies(1,ind-1); prop(2) = par(2) * especies(4,ind-1); prop(3) = par(3) * especies(7,ind-1)^a; prop(4) = par(4) * especies(10,ind-1); prop(5) = par(5) * especies(10,ind-1) * especies(2,ind-1); prop(6) = par(6) * especies(12,ind-1); prop(7) = par(7) * especies(2,ind-1); prop(8) = par(8) * especies(5,ind-1); prop(9) = par(9) * especies(8,ind-1)^b; prop(10)= par(10)* especies(11,ind-1); prop(11)= par(11)* especies(11,ind-1) * especies(1,ind-1); prop(12)= par(12)* especies(13,ind-1); prop(13)= par(13)* especies(3,ind-1); prop(14)= par(14)* especies(13,ind-1) * especies(3,ind-1); prop(15)= par(15)* especies(14,ind-1); prop(16)= par(16)* especies(9,ind-1) * especies(7,ind-1); prop(17)= par(17)* especies(9,ind-1) * especies(10,ind-1); prop(18)= par(18)* especies(9,ind-1) * especies(15,ind-1); prop(19)= par(18)* especies(5,ind-1) * especies(6,ind-1); prop(20)= par(19)* especies(4,ind-1); prop(21)= par(20)* especies(5,ind-1); prop(22)= par(21)* especies(6,ind-1); prop(23)= par(22)* especies(7,ind-1); prop(24)= par(23)* especies(8,ind-1); prop(25)= par(24)* especies(9,ind-1); prop(26)= par(25)* especies(10,ind-1); prop(27)= par(26)* especies(11,ind-1); prop(28)= par(27)* especies(15,ind-1); prop(29)= par(28)* especies(16,ind-1); % 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 %Ol Oc Ol' Ml Mc Mas L C P L2 C2 L2Oc C2Ol C2Ol' GFP RFP %Matriz Estequiométrica R=[0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%1 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0;%2 0 0 0 0 0 0 -a 0 0 1 0 0 0 0 0 0;%3 0 0 0 0 0 0 a 0 0 -1 0 0 0 0 0 0;%4 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0 0;%5 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 -1 0 0 0 0;%6 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%7 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1;%8 0 0 0 0 0 0 0 -b 0 0 1 0 0 0 0 0;%9 0 0 0 0 0 0 0 b 0 0 -1 0 0 0 0 0;%10 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 1 0 0 0;%11 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 -1 0 0 0;%12 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%13 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 1 0 0;%14 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 -1 0 0;%15 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%16 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0;%17


0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0;%18 0 0 0 0 -1 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%19 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%20 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%21 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%22 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0 0;%23 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0 0;%24 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0 0;%25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0 0;%26 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0 0 0 0 0;%27 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1 0;%28 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 -1]';%29

...



3. Selección de parámetros

En los modelos mostrados, aparecían los parámetros como un vector cuyas componentes guardan los valores para cada una de las reacciones. Veamos estos scripts:

bsimple\parametros.m bmejorado\parametros.m

... parbs par(1) = TRN; par(2) = TRD; par(3) = DIM; par(4) = NDIM; par(5) = REP; par(6) = NREP; par(7) = TRN; par(8) = TRD; par(9) = DIM; par(10)= NDIM; par(11)= REP; par(12)= NREP; par(13)= DGM; par(14)= DGM; par(15)= DGP; par(16)= DGP; par(17)= DGP; par(18)= DGP; par(19)= DGR; par(20)= DGG; alfa=coop; beta=coop; nesp=12;

... parbs par(1) = TRN; par(2) = TRD; par(3) = DIM; par(4) = NDIM; par(5) = REP; par(6) = NREP; par(7) = TRN; par(8) = TRD; par(9) = DIM; par(10)= NDIM; par(11)= REP; par(12)= NREP; par(13)= TRN; par(14)= REP; par(15)= NREP; par(16)= DIGP; par(17)= DIGP; par(18)= DIGP; par(19)= INH; par(20)= DGM; par(21)= DGM; par(22)= DGM; par(23)= DGP; par(24)= DGP; par(25)= DGP; par(26)= DGP; par(27)= DGP; par(28)= DGG; par(29)= DGR; alfa=coop; beta=coop; nesp=16;


Y estos variables toman los siguientes valores:

bmejorado\parbs.m ... TRN=0.5; TRD=4; REP=1; NREP=2.4; DIM=2; NDIM=0.001; INH=1.5; DIGP=1.5; DGM=0.462; DGP=0.2; DGR=0.01; DGG=0.001; coop=2;

Esta elección se ha basado en múltiples documentos y bibliografías:

- Documento de investigación de Michail Stamatakis y Nikolaos V. Mantzaris llamado Comparison of Deterministic and Stochastic Models of the lac Operon Genetic Network y publicado en Febrero de 2009 en la revista Biophysical Journal [8]. En este paper, tratan de comprender como un estudio estocástico del operón Lac puede aportar un conocer más amplio del comportamiento de esta red reguladora genética. Así, crean un modelo del operón Lac de reacciones simples partiendo del modelo determinista. A través de simulaciones de ambos sistemas alcanzan un estudio comparativo de las bondades de cada enfoque. Es en este desarrollo donde asocian valores a los parámetros utilizados. Dado que nuestro modelo se basa en gran parte en el operón lac, y las reacciones que se ha detallado en este proyecto no difieren en gran medida del desarrollado por estos investigadores, tomamos estos valores como referencia.

- Registro de partes de iGEM (http://parts.igem.org/Main_Page). Todas las estructuras genéticas creadas por cada equipo en el concurso iGEM, pasan a formar parte de una base de datos. Además de detallar la secuencia genética, algunos de ellos, llevan incluidos un pequeño estudio y caracterización del ente diseñado. Concretamente, nuestro grupo utilizó la proteína GFP (Green Fluorescent Protein) como indicadors del estado de las bacterias. Gracias a esta base de datos, tenemos valores reales de su caracterización. GFP: http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_E0040

- Base de datos binumbers de Harvard [7]: http://bionumbers.hms.harvard.edu/ Esta página compendia valores de propiedades biológicas extraidos de documentos de investigación.

http://parts.igem.org/Main_Page

http://parts.igem.org/wiki/index.php?title=Part:BBa_E0040

http://bionumbers.hms.harvard.edu/



Ha resultado muy útil su consulta, ya que al no disponer de valores reales, hemos podido tomar decisiones en cuanto a qué órdenes de magnitud manejábamos para todo tipo de reacciones.

Antes de continuar con los resultados de matlab, cabe destacar el valor asignados a los indicadores RFP y, especialmente, al GFP. En la bibliografía encontramos que:

𝑑𝑅𝐹𝑃 ≈ 0.01 𝑚𝑖𝑛−1

𝑑𝐺𝐹𝑃 ≈ 0.00035 𝑚𝑖𝑛−1 a pesar de que en las simulaciones se toma: 0.001 𝑚𝑖𝑛−1

Resulta muy llamativa la elección de estas proteínas como indicadores por dos motivos principales.

- La degradación del indicador verde resulta hasta mil veces más lenta que las de las proteínas que pretende indicar. Esto implica que en las observaciones gran parte de las dinámicas quedan ocultas.

- Las tasas de degradación de ambas son muy dispares. La proteína roja es más de 10 veces más rápida.

Lo expuesto ha sido de vital importancia al intentar comprender los experimentos realizados en laboratorio por el equipo.

Podemos comprobar que con estos valores, se están por encima de los valores críticos definidos en el estudio de bifurcaciones llevado a cabo con los modelos deterministas.


4. Simulaciones estocásticas del biestable simple

A continuación expondremos algunas simulaciones realizadas del modelo estocástico a través del algoritmo basado en las teorías de Daniel Gillespie [11].

Las condiciones iniciales para las variables de estado del sistema que se han utilizado suponen una pequeña población de cada una de las especies.

Población de represor LacI Población de represor cI

Excepto en alguna simulación, en general, el sistema no llega a alcanzar un estado de equilibrio dominante. Esto es lo lógico al haber impuesto unos parámetros iguales para cada reacción. Sin embargo, cabría esperar que, en cuanto uno de los represores alcanzara un estado de nivel alto, el contrario no tendría la capacidad de alcanzar la dominancia del sistema.



Por otro lado, lo que sí que ocurre es que aunque ninguna domine, cuando un represor tiene un nivel alto, el contrario lo tiene bajo. Esto significa que el sistema (con los valores de los parámetros dados) muestra el comportamiento de un biestable.

Además, observamos de esta misma simulación, los resultados que se obtienen de la evolución de las poblaciones de los indicadores:

Población de represor RFP (LacI) Población de represor GFP (cI)

Lo primero que llama la atención al observar estos resultados es cómo el GFP no deja de crecer en ningún momento de la simulación. Recordando el valor de la semi vida de esta proteína, recordamos cómo tarda más de 10 veces en degradarse que el RFP. Es por esto, la discordancia de observaciones entre las poblaciones de las proteínas represoras y los indicadores.

Si sólo tuviésemos esta información, podríamos falsamente suponer que el cI (GFP) tiene una tendencia a ser dominante en el sistema.

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Veamos que ocurre, si continuamos la simulación desde el estado obtenido al final de la anterior:



Las poblaciones de los represores mantienen esa lucha constante en la que nadie alcanza el poder; mientras que para los indicadores, se observa como hay un ganar aparente en cada caso, el GFP.

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5. Simulaciones estocásticas del biestable mejorado

Las condiciones iniciales para las variables de estado del sistema que se han utilizado suponen una pequeña población de cada una de las especies.

Tras realizar una gran cantidad de simulaciones del sistema, nos damos cuenta de cómo los parámetros cinéticos asociados las nuevas reacciones son capaces de modificar los resultados finales de forma apreciable. Ya que no disponemos de valores orientativos, y a la vista de los resultados mostrados, decidimos tomar finalmente los siguientes:

𝐼𝑁𝐻 = 0.1; 𝐷𝐼𝐺𝑃 = 2;

A continuación mostraremos algunas de las simulaciones por las que hemos elegido éstas, sin embargo, podemos hacer un desarrollo teórico:

Las nuevas interacciones incluidas, a diferencia del biestable simple, no son parejas en el sentido de acciones iguales y contrarias. Por un lado, la inhibición ARN antisentido actúa directamente sobre el ARN mensajero de una de las ramas (concretamente del ARNm cI); mientras que la proteasa digiere el represor, sus multímeros y su reporter.

Esto significa que cada una de las acciones se aplica en diferentes etapas de la expresión de los genes, afectando de manera diversa a la dinámica global del sistema.

Además, La población de ARNm es bastante menor que la de represor por varios motivos:

• La cinética asociada a la transcripción es bastante menor que la asociada a la traducción.

• La cinética asociada a la degradación del ARNm es mayor que la asociada a la degradación del represor.

𝑑𝐶𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑 · 𝑀𝐶 − 𝑑 · 𝐶

En el régimen permanente encontramos una relación entre la cantidad de ARNm y el represor asociado:

𝑘𝑡𝑑 · 𝑀𝐶 − 𝑑 · 𝐶 = 0;

𝛿𝐶 = �𝑘𝑡𝑑𝑑� · 𝛿𝑀𝐶

Valiendo esta proporción (con los valores utilizados en los modelos) 𝑘𝑡𝑑𝑑

= 20.

Significando que un pequeña variación en el ARN del represor afectará mucho a la



población final de la proteína. Es por este motivo por el que se ha decido equiparar el efecto que puedan aplicar las reacciones, dándole un valor de un orden de magnitud menor a la inhibición por ARN antisentido frente a la digestión por proteólisis.

Población de represor cI Población de represor LacI

Estos resultados no muestran una estabilidad mayor que las del biestable simple. Vemos cómo en las tres primeras imágenes, el sistema tiende a oscilar entre ambos estados sin que ninguno de ellos logre dominar el sistema. En la quinta simulación, encontramos esa situación ideal, en la que un estado se mantiene por encima del otro y con un nivel de expresión suficientemente alto, ocurriendo un cambio de estados casi ideal.

Veamos los resultados para los indicadores:


Población de represor RFP Población de represor GFP

En este caso, el GFP no tiende a crecer indefinidamente a pesar de poseer la misma semivida que en el sistema simple. El motivo, es que la proteólisis también se aplica a este indicador. Por tanto a medida que existe más RFP (Y por tanto cI), habrá más proteasa, y el GFP irá disminuyendo su población.

Ya que los resultados de las poblaciones de las proteínas, mostraban cierto potencial a mantener un estado expresión alto, vamos a realizar un conjunto de simulaciones a partir de un estado inicial marcado como dominancia del GFP.

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Partiendo desde el punto final de las 6 simulación anterior, el sistema se comporta de la manera que mostramos en esta imagen. Es interesante constatar que una vez el sistema puede lograr un punto de equilibrio, no lo abandona en ninguno de las 6 experimentos. Hemos encontrado por tanto un sistema que con una pequeña inducción de uno de los estados, parece mantenerlo indefinidamente. Efectivamente, la probabilidad nos asegura que hay posibilidades de que el sistema cambie aleatoriamente su estado. Sin embargo, podemos asegurar que este sistema muestra un comportamiento más estable que el anterior.

Si vemos ahora la imagen con los resultados para los indicadores:



Constatamos que el GFP sigue comportándose de la misma forma ya pesar de que el represor al que está asociado ha alcanzado el régimen permanente, ésta proteína sigue creciendo hasta alcanzar su régimen permanente.

Si partimos desde un estado contrario al anterior, los resultados muestran el mismo comportamiento para la otra rama del biestable. Logrando incluso mayor estabilidad, la proteasa digiere casi completamente al represor contrario como al indicador.

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Y los resultados para los indicadores:



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Control de los Sistemas Biestables 109

Control de los sistemas biestables

En este apartado vamos a considerar las acciones de control sobre los sistemas, sus cinéticas y la efectividad de estas acciones para alcanzar los estados estables deseados.

Como se indicó en el preámbulo de este documento, as acciones son de tipos muy diferentes. Por un lado tendremos la adición de un químico en el sistema que será capaz de transformar algunas de las reacciones que se producen naturalmente en el sistema. Mientras que por otra parte, el aumento de la temperatura hasta 42ºC logra modificar la estructura de una proteína específica, provocando su degradación casi instantánea.

Comprobaremos con las simulaciones, cómo se producen los cambios de estado. Para más tarde hacer una correlación de las experiencias y resultados que el algoritmo de resolución muestra con los experimentos realizados en laboratorio.

110 Control de los Sistemas Biestables



1. Acciones de control de los biestables

El sistema diseñado por el grupo de investigación UPO-Sevilla, basándose en el documento, citado durante todo este desarrollo, de Timothy S. Gardner, utiliza señales de diferente tipo para lograr modificar el estado posible del sistema.

El objeto de estas construcciones era el de diseñar sistemas biológicos que mostraran estados activos/inactivos, además de poder modificar estos valores.

Recordemos el núcleo biestable del sistema simple (el sistema mejorado diseñado por este grupo, basa su funcionamiento en éste mismo núcleo, aunque añadiendo nuevas reacciones que afianzan la robustez y estabilidad).

El control de la expresión de un represor o su adverso se debe hacer a través de las acciones de represión que ejercen estas proteínas. Si conseguimos negar, mediante acciones opuestas, estas reacciones, podremos controlar el estado de expresión.

Esta idea es la que subyace en los mecanismos que explico a continuación y que se utilizan en ambos diseños: Inducción y degradación por temperatura.

Inducción

La inducción es el proceso por el cual, una especie química puede realizar la reacción contraria a la represión. Para ello, se adhiere al represor para el que está destinado, obligando a este a desacoplarse del promotor. Veamos su desarrollo y modelado.

Mecanismo 1: Inductorγ + Represorβ → Inductorγ|Represorβ

Mecanismo 2: Inductorγ + Promotor|Represorβ → Inductorγ|Represorβ + Promotor

El proceso que lleva a cabo un inductor es complejo. El desarrollo que aquí expongo se fundamenta, además, en el documento de Michail Stamatakis y NV Mantzaris: Comparison of Deterministic and Stochastic Models of the lac Operon Genetic Network Publicado por Biophys el 2009 [8]. En este se detalla como el inductor reacciona a través de dos mecanismos. Por un lado, uniéndose al dímero libre del represor y por otro, al complejo formado tras la represión (promotor|represor). De esta forma se consigue liberar al promotor del multímero gracias al segundo mecanismo y además, al adherirse también al represor libre como indica la primera etapa, dificulta que pueda volver a ser inhibido.

De nuevo, el inductor trabaja a través del proceso descrito por Hill, sin embargo, en este caso, lo hace de forma no-cooperativa. Significando que, las moléculas de inductor se van adhiriendo a la molécula represora.


La ecuación que evalúa la cantidad de represor libre tras la inducción:

[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒 =[𝑅𝑒𝑝𝑟𝑒𝑠𝑜𝑟]𝛽 𝐾⁄

�1 + [𝐼𝑛𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑟]𝐾𝑖

�𝛾

Las constantes tienen un claro significado. 𝐾 Pondera el número de represores que serán afectados por la inducción, mientras que el denominador, explica de qué forma se aplica en función de la cantidad de inductor. 𝐾𝑖 Constante de unión efectiva del inductor y el represor. 𝛾, El número máximo de moléculas de inductor que pueden unirse a un multímero.

Degradación por temperatura

La acción para paliar la represión contraria se aplica directamente al represor. A través del aumento de temperatura se consigue controlar la población de represor cI (ts).

Esta proteína extraída del fago Lambda posee la característica de ser termosensible, significando que al alcanzar una cierta temperatura (42ºC) se precipita su degradación. La ecuación cinética de esta reacción no varía en su forma, sino que el parámetro aumenta su valor a medida que aumenta la temperatura muy por encima del valor teórico de degradación en condiciones normales de trabajo a 37ºC.

Por tanto, la modelización de este efecto la haremos de la siguiente manera:

[𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]̇ = (𝛿 + ∆𝛿(𝑇)) · [𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎]



2. Modelo del biestable simple con acciones de control

Recuperando la expresión del modelo del biestable simple, e incluyendo los efectos de la inducción y de la degradación por temperatura:

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐿

1 + 𝑘𝑝𝑟𝐿 · 𝐶𝛼− 𝑑𝑚 · 𝑀𝐿 𝑑𝐿

𝑑𝑡= 𝑘𝑡𝑑𝐿 · 𝑀𝐿 − 𝑑 · 𝐿

𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐶

1 + 𝑘𝑡𝑟𝐶 · 𝐿𝛽1 + 𝑘𝑖𝑛𝑑 · 𝐼𝛾

− 𝑑𝑚 · 𝑀𝐶 𝑑𝐶𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐶 · 𝑀𝐶 − (𝑑 + ∆𝑑) · 𝐶

Además, para utilizar el modelo de cinéticas de primer orden con el que simulábamos estocásticamente el sistema, incluimos las reacciones que el inductor aplica sobre el sistema. La degradación por temperatura no modifica ni añade ninguna de las reacciones hasta ahora tratadas.

Reacciones elementales

Nombre Reacción Propensidad Transcripción LacI 𝑂𝐿 → 𝑂𝐿 + 𝑀𝐿 𝑎1 = 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿 Traducción Laci 𝑀𝐿 → 𝑀𝐿 + 𝐿 + 𝑅𝐹𝑃 𝑎2 = 𝑇𝑅𝐷𝐿 · 𝑀𝐿 Dimerización LacI 𝐿 + 𝐿 → 𝐿2 𝑎3 = 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 Des-dimerización LacI 𝐿2 → 𝐿 + 𝐿 𝑎4 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 Represión LacI 𝐿2 + 𝑂𝐶 → 𝐿2𝑂𝐶 𝑎5 = 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2 · 𝑂𝐶 Des-represión LacI 𝐿2𝑂𝐶 → 𝐿2 + 𝑂𝐶 𝑎6 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2𝑂𝐶 Inducción tipo 1 𝐼2 + 𝐿2 → 𝐼2𝐿2 𝑎7 = 𝐼𝑁𝐷 · 𝐼2 · 𝐿2 Des-inducción 1 𝐼2𝐿2 → 𝐼2 + 𝐿2 𝑎8 = 𝑁𝐼𝑁𝐷 · 𝐼2𝐿2 Inducción tipo 2 𝐼2 + 𝐿2𝑂𝐶 → 𝐼2𝐿2 + 𝑂𝐶 𝑎9 = 𝐼𝑁𝐷′ · 𝐼2 · 𝐿2𝑂𝐶 Des-inducción 2 𝐼2𝐿2 + 𝑂𝐶 → 𝐿2𝑂𝐶 + 𝐼2 𝑎10 = 𝑁𝐼𝑁𝐷′ · 𝐼2𝐿2 · 𝑂𝐶 Transcripción cI 𝑂𝐶 → 𝑂𝐶 + 𝑀𝐶 𝑎11 = 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶 Traducción cI 𝑀𝐶 → 𝑀𝐶 + 𝐶 + 𝐺𝐹𝑃 𝑎12 = 𝑇𝑅𝐷𝐶 · 𝑀𝐶 Dimerización cI 𝐶 + 𝐶 → 𝐶2 𝑎13 = 𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2 Des-dimerización cI 𝐶2 → 𝐶 + 𝐶 𝑎14 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2 Represión cI 𝐶2 + 𝑂𝐿 → 𝐶2𝑂𝐿 𝑎15 = 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿 Des-represión cI 𝐶2𝑂𝐿 → 𝐶2 + 𝑂𝐿 𝑎16 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿 Degradación 𝑀𝐿 𝑀𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎17 = 𝐷𝐺𝑀𝐿 · 𝑀𝐿 Degradación 𝑀𝐶 𝑀𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎18 = 𝐷𝐺𝑀𝐶 · 𝑀𝐶 Degradación 𝐿 𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎19 = 𝐷𝐺𝐿 · 𝐿 Degradación 𝐶 𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎20 = 𝐷𝐺𝐶 · 𝐶 Degradación 𝐿2 𝐿2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎21 = 𝐷𝐺𝐿2 · 𝐿2 Degradación 𝐶2 𝐶2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎22 = 𝐷𝐺𝐶2 · 𝐶2 Degradación 𝑅𝐹𝑃 𝑅𝐹𝑃 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎23 = 𝐷𝐺𝑅 · 𝑅𝐹𝑃 Degradación G𝐹𝑃 𝐺𝐹𝑃 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎24 = 𝐷𝐺𝐺 · 𝐺𝐹𝑃


Antes de mostrar las simulaciones estocásticas del modelo completo con las acciones de control, vamos a comprobar cómo modifican los estados estables del sistema.

Para el sistema determinista de ecuaciones diferenciales, vamos a trabajar con el siguiente modelo, ya que simplifica el análisis y las conclusiones que podamos extraer serán las mismas:

𝑑𝑥1𝑑𝑡

=𝐴

1 + 𝐵 · 𝑥2𝑎− 𝑥1

𝑑𝑥2𝑑𝑡

=𝐴′

1 + 𝐵′ · 𝑥1𝑎′1 + 𝐼2

− (1 + 𝛿𝑡) · 𝑥2

Comenzamos con un estudio de bifurcaciones para estos dos nuevos parámetros que harán las veces de las acciones de control, mostraremos los resultados con el formato utilizado en ese apartado:



Adición de IPTG Límite inferior: 1 Límite superior: 10

Observaciones: En cuento que el nivel de IPTG alcanza un valor crítico, los tres valores tienden a colapsar en un único equilibrio, más estable Valor crítico: 1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

I

x1

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

I

x2


Aumento de temperatura dT

Límite inferior: 0 Límite superior: 3

Observaciones: Observamos que cuando la temperatura aumenta, el factor de degradación provoca que el sistema sólo puede alcanzar un estado Valor crítico: 0.8

0 0.5 1 1.5 2 2.5 30

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

dT

x1

0 0.5 1 1.5 2 2.5 30

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

dT

x2



Tras comprobar los resultados de las acciones (o de acciones proporcionales) nos damos cuenta que podemos, a través de ellas, situar el sistema en un estado único. Además, la capacidad de estas acciones demuestra que sólo es necesario alcanzar un nivel de excitación suficiente para llevar al sistema al estado que necesitamos, mientras que con acciones por debajo de un efecto menor del crítico, puede no alcanzarlo, tal y cómo comprobamos en las simulaciones estocásticas.

Por tanto, vamos a simular el sistema estocásticamente, aplicando estas acciones por encima de los valores críticos determinados.

Las imágenes muestran las poblaciones de las proteínas represoras a lo largo del tiempo, mientras las barras verde y rojas, están representando las inducciones que se aplican sobre el sistema, donde la banda verde significa el tiempo en el cual se aplica el IPTG (para inducir la producción de cI, también en color verde) mientras que la banda roja muestra el tiempo en el que mantenemos la temperatura de la bacteria a 42ºC provocando la desaparición casi instantánea y mantenida de la proteína cI induciendo, por tanto, la expresión de LacI.


Los resultados experimentales muestran el comportamiento estable de este sistema cuando mantenemos las acciones de control constantes durante la fase del estado que deseamos. Esto significa que a pesar de tener un sistema con dos estados inducibles, no podemos conseguir que el sistema mantenga una estabilidad tras aplicar una acción sobre el sistema.

Por otro lado también resulta muy interesante observar los resultados sobre las poblaciones de los indicadores.

Aun conociendo los instantes de inducción:

• IPTG: desde el minuto 0 al 100 • Temperatura: desde el minuto 800 al 1200

No podemos asegurar a la vista de estas imágenes, que las acciones de control tengan un efecto directo sobre las poblaciones. Notamos como a pesar del estado inducido, es siempre el GFP el que mantiene un nivel de expresión (su población) muy por encima del RFP. Los indicadores no son capaces de reproducir desde la observación directa conclusiones al respecto de estado del sistema. Hay que tener en cuenta que no tenemos posibilidad de conocer las poblaciones de ninguna proteína, sino que las

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0 500 1000 1500 2000 0 500 1000 1500 2000

0 500 1000 1500 2000 0 500 1000 1500 2000



medidas en los experimentos se realizan a través de la luminosidad de cada una de ellas. Esto provoca que no sólo perdamos información debido al efecto integral que la lenta expresión de estas proteínas provoca, sino que además, las variaciones de población no serán directamente reproducibles a través del lector de placas. Es éste el motivo más importante por el cual, no llegamos a adaptar nuestros modelos a los resultados experimentales más allá de reproducir el comportamiento cualitativo.


3. Modelo del biestable mejorado con acciones de

control

𝑑𝑀𝐿

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐿


𝑑𝑀𝐶

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐶

1 +𝑘𝑝𝑟𝐶 · 𝐿𝛽

1 + 𝑘𝑖𝑛𝑑 · 𝐼𝛾− (𝑘𝑖𝑛ℎ · 𝑀𝑎𝑠 + 𝑑𝑚) · 𝑀𝐶

𝑑𝑀𝑎𝑠

𝑑𝑡=

𝑘𝑡𝑟𝐿

1 + 𝑘𝑝𝑟𝐿 · 𝐶𝛼− (𝑘𝑖𝑛ℎ · 𝑀𝐶 − 𝑑𝑚) · 𝑀𝑎𝑠

𝑑𝐿𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐿 · 𝑀𝐿 − 𝑘𝑝𝑟𝑜𝑡 · 𝑃 · 𝐿 − 𝑑 · 𝐿

𝑑𝑃𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐶 · 𝑀𝐶 − 𝑑 · 𝑃

𝑑𝐶𝑑𝑡

= 𝑘𝑡𝑑𝐶 · 𝑀𝐶 − (𝑑 + ∆𝑑) · 𝐶

Además, incluimos las reacciones en el modelo de cinéticas simples para el trabajo estocástico:

Nombre Reacción Propensidad Transcripción LacI 𝑂𝐿 → 𝑂𝐿 + 𝑀𝐿 𝑎1 = 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿 Traducción Laci 𝑀𝐿 → 𝑀𝐿 + 𝐿 𝑎2 = 𝑇𝑅𝐷𝐿 · 𝑀𝐿 Dimerización LacI 𝐿 + 𝐿 → 𝐿2 𝑎3 = 𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 Des-dimerización LacI 𝐿2 → 𝐿 + 𝐿 𝑎4 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐿 · 𝐿2 Represión LacI 𝐿2 + 𝑂𝐶 → 𝐿2𝑂𝐶 𝑎5 = 𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2 · 𝑂𝐶 Des-represión LacI 𝐿2𝑂𝐶 → 𝐿2 + 𝑂𝐶 𝑎6 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐿 · 𝐿2𝑂𝐶 Inducción tipo 1 𝐼2 + 𝐿2 → 𝐼2𝐿2 𝑎7 = 𝐼𝑁𝐷 · 𝐼2 · 𝐿2 Des-inducción 1 𝐼2𝐿2 → 𝐼2 + 𝐿2 𝑎8 = 𝑁𝐼𝑁𝐷 · 𝐼2𝐿2 Inducción tipo 2 𝐼2 + 𝐿2𝑂𝐶 → 𝐼2𝐿2 + 𝑂𝐶 𝑎9 = 𝐼𝑁𝐷′ · 𝐼2 · 𝐿2𝑂𝐶 Des-inducción 2 𝐼2𝐿2 + 𝑂𝐶 → 𝐿2𝑂𝐶 + 𝐼2 𝑎10 = 𝑁𝐼𝑁𝐷′ · 𝐼2𝐿2 · 𝑂𝐶 Transcripción cI 𝑂𝐶 → 𝑂𝐶 + 𝑀𝐶 𝑎11 = 𝑇𝑅𝑁𝐶 · 𝑂𝐶 Traducción cI 𝑀𝐶 → 𝑀𝐶 + 𝐶 + 𝑃𝑠 𝑎12 = 𝑇𝑅𝐷𝐶 · 𝑀𝐶 Dimerización cI 𝐶 + 𝐶 → 𝐶2 𝑎13 = 𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2 Des-dimerización cI 𝐶2 → 𝐶 + 𝐶 𝑎14 = 𝑁𝐷𝐼𝑀𝐶 · 𝐶2 Represión cI 𝐶2 + 𝑂𝐿 → 𝐶2𝑂𝐿 𝑎15 = 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿 Des-represión cI 𝐶2𝑂𝐿 → 𝐶2 + 𝑂𝐿 𝑎16 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿 Transcripción de ARNas 𝑂𝐿′ → 𝑂𝐿′ + 𝑀𝑎𝑠 𝑎17 = 𝑇𝑅𝑁𝐿 · 𝑂𝐿′ Represión de ARNas 𝐶2 + 𝑂𝐿′ → 𝐶2𝑂𝐿′ 𝑎18 = 𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2 · 𝑂𝐿′



Des-represión de ARNas 𝐶2𝑂𝐿′ → 𝐶2 + 𝑂𝐿′ 𝑎19 = 𝑁𝑅𝐸𝑃𝐶 · 𝐶2𝑂𝐿′ Digestión LacI 𝑃𝑠 + 𝐿 → 𝑃𝑠 𝑎20 = 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃𝑠 · 𝐿 Digestión LacI2 𝑃𝑠 + 𝐿2 → 𝑃𝑠 𝑎21 = 𝐷𝐼𝐺𝑃 · 𝑃𝑠 · 𝐿2 Inhibición ARNas 𝑀𝑎𝑠 + 𝑀𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎22 = 𝐼𝑁𝐻 · 𝑀𝑎𝑠 · 𝑀𝐶 Degradación 𝑀𝐿 𝑀𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎23 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐿 Degradación 𝑀𝐶 𝑀𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎24 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝐶 Degradación ARNas 𝑀𝑎𝑠 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎25 = 𝐷𝐺𝑀 · 𝑀𝑎𝑠 Degradación 𝐿 𝐿 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎26 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿 Degradación 𝐶 𝐶 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎27 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶 Degradación Proteasa 𝑃𝑠 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎28 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝑃𝑠 Degradación 𝐿2 𝐿2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎29 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐿2 Degradación 𝐶2 𝐶2 → 𝑛𝑢𝑙𝑙 𝑎30 = 𝐷𝐺𝑃 · 𝐶2

Veamos, al igual que hicimos con el biestable simple, cómo resulta la característica de los estados en función de las acciones de control, las mismas que utilizábamos con el sistema simple.


Simulamos el sistema gracias al algoritmo de Gillespie. Además asociamos los mismos valores de los parámetros que decidimos para el simple, al mejorado, a excepción lógica de las reacciones propias de éste sistema. Para estas últimas, continuaremos con la misma línea que explicamos durante las simulaciones sin acciones de control. Por tanto, vemos los resultados que ofrece un conjunto de simulaciones estocásticas:

Observamos, cómo la inducción por IPTG no resulta tan fuerte como cabría esperar, al menos con los parámetros asignados, mientras que la inducción por temperatura funciona mucho mejor. Sin embargo, es llamativo cómo al retirar el aumento de la temperatura, el sistema no llega a mantener este estado indefinidamente, al menos encontramos en la mayoría de los resultados mostrados, cómo el LacI (rojo) vuelve a superar por unos instantes la población de cI (verde).



Si pasamos nuestra atención a los resultados de los inductores, la imagen cambia significativamente.

Aunque en principio pueda parecer que tiene una evolución parecida a la que muestra el biestable simple, hay que considerar cómo, el GFP en este caso sí que disminuye su población en periodos cortos de tiempo considerando su constante de degradación. Confirmamos que la proteasa continúa trabajando. Sin embargo, no podemos hacer las mismas conclusiones para la estabilidad del sistema. Esperábamos poder encontrar un sistema lo suficientemente robusto cómo para no tener que aplicar una acciones de control demasiado alargadas en el tiempo.

Se comprueba que el sistema mantiene finalmente los estados estables mientras se mantiene constante las inducciones.

0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000

0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000

0 200 400 600 800 1000 0 200 400 600 800 1000


Análisis de los Resultados Experimentales 125

Análisis de los resultados experimentales en

laboratorio

En esta sección se presentarán los resultados de los experimentos que llevaron a cabo el grupo iGEM sobre los sistemas biestables simple y mejorado.

Tras la presentación se hará un análisis donde intentaremos sacar las máximas conclusiones posibles al respecto del comportamiento real mostrado en laboratorio.

126 Análisis de los resultados Experimentales



1. Experimentos en laboratorio

Para la presentación del proyecto Flashbacter del grupo de estudiantes de la universidad Pablo de Olavide, se llevaron a cabo una serie de experimentos en laboratorio de las construcciones de los biestables.

En este apartado presentaremos una breve descripción de las construcciones y del procedimiento de los experimentos con la idea de comprender los resultados que de estas pruebas se extrajeron.

Sobre las medidas de los experimentos

A diferencia del modelado llevado a cabo durante este documento, el sistema real difiere en varios puntos:

- Hemos analizado el comportamiento de los sistemas en una única bacteria a la que se le ha supuesto una vida eterna.

- No se considera que esta bacteria se replica y subdivide cada cierto tiempo. Esto implicaría en los modelos, que las poblaciones se dividirían por la mitad, pasando a tener que considerar el doble de sistemas ambientes.

- La bacteria mantiene un volumen a lo largo del tiempo. Esto, de nuevo es falso, ya que este sistema viviente aumenta su tamaño hasta un nivel en el que se subdivide.

- La adición de IPTG al sistema se ha considerado directa e instantánea. Cuando se añade este químico a la colonia de bacterias, tiene que difundirse a través de las paredes de ser vivo hasta alcanzar el mismo ambiente en el que se encuentra nuestros plásmidos.

- …

Frente a estas diferencias de consideraciones, tenemos en cuenta lo siguiente:

- La utilización de una bacteria escherichia coli donde incluir nuestro sistema se debe a que ofrece un espacio cerrado y aislado. Además necesitamos este ambiente ya que es necesario disponer de otros entres biológicos como ARNp o ribosomas para que el plásmido cumpla su cometido.

- La presencia de reporters de cada uno de los represores se debe a la necesidad de tener por un lado, un indicador visual del estado de la bacteria, mientras que por otro lado, no ayuda a tener una referencia para conocer las poblaciones de represores de la colonia de bacterias.

- Para la demostración del comportamiento biestable no es preciso estudiar la bacteria donde se desarrolla mientras ésta no le afecte sensiblemente.


Además, antes de presentar los resultados, vamos a hacer algunos comentarios acerca de la toma de datos.

Dada la imposibilidad de poder medir tanto el tamaño de la población de bacterias y dentro de cada una la población, no sólo de los represores, sino del resto de especies importantes para nuestros análisis, las medidas se hacen sobre la fluorescencia de la colonia.

Se utiliza un lector de placas (por fluorescencia) para realizar las medidas. Este aparato excita el sistema con una longitud de onda específica (GFP 501nm, RFP 584nm), para que la muestra emita una luz de diferente longitud (GFP 511nm, RFP 607nm) que se recogen gracias a un detector. Además, este aparato puede medir la densidad óptica, que nos sirve como orientación para determinar la cantidad de bacterias que hay en el cultivo.



2. Resultados experimentales del biestable básico

Estos experimentos se realizaron para el siguiente plásmido (el del sistema simple)

El plásmido y sus genes detallados se pueden consultar en el siguiente enlace del registro de partes de iGEM:

Biobrick: BBa_K177038

Enlace: http://partsregistry.org/Part:BBa_K177038

Y recordamos el data page del biestable simple:

http://partsregistry.org/Part:BBa_K177038


Respecto a las gráficas mostradas, tenemos que señalar que los valores para la fluorescencia del indicador verde están escalados (7 veces) para poder ajustarlos a los valores del indicador rojo. Este hecho, se explicó cuando se hizo la selección de parámetros.

Experimentos realizados dejando al sistema evolucionar sin aplicación de ninguna de las acciones de control.

En la primera gráfica, cuando el GFP deja de crecer y comienza a bajar su población, el RFP tiende a crecer. Sucede algo parecido en la segunda, donde podemos observar un cambio del sistema aleatorio, donde el GFP tiende a caer su población mientras el RFP crece.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

0 100 200 300 400

Fluo

resc

enci

a

Tiempo

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 100 200 300 400 500 600

Fluo

resc

enci

a

Tiempo



Tras dejar el sistema durante una noche inducido por IPTG, en el instante 0 de las gráficas se aumenta la temperatura del sistema hasta 42ºC

Las tres gráficas muestran el mismo comportamiento cualitativo. Al aumentar la temperatura, la población de GFP y por tanto de cI(ts) disminuye, desreprimiendo la expresión de LacI y provocando un aumento de la población de RFP.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

0 100 200 300 400

Fluo

resc

enci

a

Tiempo

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 100 200 300 400 500 600

Fluo

resc

enci

a

Tiempo

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 100 200 300 400 500 600

Fluo

resc

enci

a

Tiempo


Tras dejar el sistema durante una noche a temperatura de 42ªC, en el instante 0 de las gráficas se induce el sistema añadiendo IPTG

Este caso es especial, ya que el único experimento que parece confirmar lo que esperamos obtener es el primero de ellos, mientras que el resto, sorprendentemente muestran todo lo contrario.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

0 100 200 300 400

Fluo

resc

enci

a

Tiempo

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

0 100 200 300 400 500 600

Fluo

resc

enci

a

Tiempo

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 100 200 300 400 500 600

Fluo

resc

enci

a

Tiempo



Conclusiones de los experimentos realizados sobre el biestable simple

A la vista de todos los resultados, no podemos llegar a asegurar la biestabilidad del sistema ni siquiera cuando aplicamos las acciones de control para los que se diseñó.

Al aumentar la temperatura, la población de represor termosensible cae casi a 0, por eso funciona bastante bien este cambio de estado. Sin embargo, a través de la inducción por IPTG no observamos el cambio esperado.

Este resultado se puede explicar probablemente por el bajo efecto inductor que tiene este químico en nuestro sistema. También es posible que la inducción por IPTG no se realizara durante el tiempo necesario o con la cantidad suficiente como para inestabilizar el estado actual.


3. Resultados experimentales del biestable mejorado

A continuación mostramos la construcción, basada en el plásmido anterior, del biestable mejorado.

En este caso, tenemos dos plásmidos:

Plásmido: BBa_K510019

Enlace: http://parts.igem.org/Part:BBa_K510019?title=Part:BBa_K510019

Plásmido: BBa_K510036

Enlace: http://parts.igem.org/Part:BBa_K510036?title=Part:BBa_K510036

http://parts.igem.org/Part:BBa_K510019?title=Part:BBa_K510019




Y recordamos el data page del sistema mejorado

Presentamos a continuación los resultados de los experimentos realizados con esta construcción:

CAMBIO POR TEMPERATURA

Esta imagen muestra el cambio de estados cuando aplicamos el aumento de temperatura. En este caso, el cambio es mucho más claro que en el sistema simple.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Fluo

resc

enci

a

Tiempo


INDUCCIÓN POR IPTG

Para los experimentos de la inducción de IPTG, caso que fallaba en la construcción primaria, no sólo se ha comprobó que la adición de este químico indefinidamente, provocaba y mantenía el cambio de estado, sino que se hicieron varios experimentos para comprobar que el sistema es capaz de mantener éste estado sin una aplicación continua de la acción de control.

Conclusiones de los experimentos

A la vista de los datos mostrados y a pesar de no disponer de más experimentos que mostrar, se llegó a la conclusión de que efectivamente, el sistema mejorado funcionaba de forma más robusta. Incluso, en los experimentos realizados (aunque no muestren este documento) se observó que el sistema funciona mucho mejor cuando el número de copias del plásmido que contiene únicamente al promotor y el ARN mensajero antisentido del cI, es mucho mejor ya que parece mostrar que pierda la condición de biestabilidad.

Por otra parte, se hace patente que la inducción por IPTG aplica un efecto mucho más estable que en el biestable simple, ya que podemos encontrar algunos valores para los que no es necesario continuar con la inducción mientras queramos mantener el estado.

La inducción por temperatura también nos enseña que tras una inducción determinada en el tiempo, se mantiene tras ella el estado deseado. En los experimentos con el simple no sucede esto cuando dejamos de mantener la temperatura elevada y tras volver a los 37ºC, el sistema volvía a mostrar estado aleatorios.



4. Conclusiones generales de los experimentos en

laboratorio

A la vista de todos los resultados, podemos afirmar que, en el laboratorio, el biestable creado a partir del primero funciona mucho mejor que simple, y las acciones de control, temperatura y adición de IPTG, mejoran el comportamiento estable de los estados.

Tal y cómo se comentaba en el objeto del proyecto, los experimentos buscaban un interpretación cualitativa de las construcciones. La caracterización realizada es suficiente como para afirmar el objetivo final del proyecto Flashbacter: crear un sistema biestable con mayor estabilidad que el propuesto por diversos grupos de investigación anteriores.

Efectivamente, se corroboró lo esperado: La construcción mejorada a partir del biestable propuesto por Timothy S. Gardner, muestra un comportamiento más robusto y más estable, eliminando la necesidad de aplicar inducciones de los estados mientras queramos su mantenimiento.


Conclusión 139

Conclusión final

Al principio del proyecto, pretendíamos crear modelos de los sistemas creados por el

grupo Flashbacter, de forma que nos permitiera comprender mejor tanto el

comportamiento final en los experimentos en laboratorio, cómo a nivel más interno de

las bacterias. Es por eso, que no estudiábamos realmente el sistema dentro del chasis de

la bacteria, sino el comportamiento del sistema per se y sus capacidades. A lo largo del

documento, se ha justificado objeto y las limitaciones que tenían este tipo de sistemas.

Por tanto, comenzábamos este estudio mediante la creación de un modelo determinista

de ambos sistemas. Comprendimos durante este desarrollo, que a pesar de la

complejidad de las reacciones biológicas que se establecen entre las moléculas

biológicas, la interpretación que de éstas hicieron Michaelis-Menten, simplificaba

suficiente la creación del modelo. Además, nos aventuramos en un modelado a través

de cinéticas simples que resultó ser equivalente a los primeros tras aplicar algunas

condiciones de régimen permanente, apoyadas tanto por la biología como por el estudio

de la rapidez de estas cinéticas. Tales modelos, además, los podemos encontrar en

numerosos artículos de investigación sobre biología de sistemas o de biología sintética

propiamente. De hecho, muchos de los mencionados en la bibliografía han resultado de

gran ayuda a la hora de plantear, comprender y cerrar las ecuaciones cinéticas.

Por otro lado, lo mostrado tanto en los estudios de estabilidad como en los de

bifurcaciones, confirmaron lo que sabíamos del sistema y cómo los parámetros

terminaban afectando a la biestabilidad del sistema. Establecimos valores críticos de los

parámetros, o al menos, indicamos la manera de conocerlos. Así, pudimos establecer

unos valores mínimos, implicando la existencia de los dos estados estables. A pesar de

que a través del estudio determinista, no pudiéramos enlazar lo que estos estudios

resultaban, a través de la extrapolación del concepto matemático al biológico, supimos

enfocar los resultados hacia la realidad que tales modelos pretendían simular.

140 Conclusión

Fue a través del enfoque estocástico, cuando todo logró sentido. Al realizar las

simulaciones de los sistemas, se patentó la realidad de los experimentos. La lucha que se

establece cuando los sistemas comienzan a “funcionar” se mostraba claramente que en

las simulaciones, y además, a través de los programas realizados en matlab, podemos

realizar simulaciones variando parámetros y observar cómo, el resultado final, cambia.

Sin embargo, y aquí nos enfrentamos con nuestra naturaleza como ingenieros, no nos

sirve de nada, encontrar los parámetros que más optimizan el sistema, ya que un

sistema biológico cómo el que estudiamos no es variable a nuestro antojo. Las

herramientas de que hemos hecho uso durante todo este trabajo, resultan muy

potentes para conocer la profundidad de las construcciones y su funcionamiento y para

hacer la caracterización del sistema. Sin embargo, a través de éstas no podemos

replantear la construcción hacia situaciones más favorables para el objetivo marcado. Es

por este motivo por el que no se planteó en el proyecto Flashbacter el realizar un

estudio determinista ni estocástico para conocer las reacciones limitantes sino, que se

necesitó la creación de uno más complejo para alcanzar mayor robustez y estabilidad en

los equilibrios.

La herramienta desarrollada en Matlab, podría ayudarnos a hacer verdades simulaciones

del sistema cómo para desarrollar un controlador o aspectos algo más complejos, si

fuésemos capaces de realizar experimentos con tal construcción y obteniendo valores

de ciertos parámetros claves.

Además, a medida que profundizábamos en la creación de estos modelos, logramos

comprender cómo las etapas reactivas se solapaban, y llegamos a tantear la posibilidad

de crear algunos valores característicos de las reacciones asociados a la partícula que

participaba. A pesar de todo, decidimos no incluir este análisis, ya que, finalmente, no

aportaba suficiente información para nuestro análisis, pero podríamos platear esta idea

en el estudio generalizado de la biología de sistemas.

Cómo conclusión final al desarrollo de los modelos, la satisfacción en cuanto a los

objetivos marcados es más que suficiente. Sin embargo, tras el trabajo realizado, y

probablemente, desde nuestra visión cómo ingenieros, nos queda cierta insatisfacción.

Bibliografía 141

Bibliografía

1. McAdams HH Arkin, AP. (1997). Stochastic mechanisms in gene expression. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 94:814–19.

2. Gardner T (2000). Design and construction of synthetic gene regulatory

networks. Disertación del Doctorado, Escuela de Ingenieros de la Universidad de

Boston.

3. http://parts.igem.org/Part:BBa_K177038?title=Part:BBa_K177038



6. Alberts B, Bray D, Lewis J, et al (1994). Molecular Biology of the Cell. 3ra edición.

New York: Garland Science.

7. http://bionumbers.hms.harvard.edu/

8. Stamatakis M, Mantzaris N (2009). Comparison of Deterministic and stochastic

Models of the lac Operon Genetic Network, Biophysical Journal, Volumen 96

Páginas 887-906.

9. McGinness KE, Baker TA and Sauer RT (2006). Engineering Controllable Protein

Degradation. Mol Cell 22:701-707.

10. Gillespie, D. T. (2007). Stochastic simulation of chemical kinetics. Annual Review

of Physical Chemistry 58: 35–55

11. Gillespie, D. T. (1977). Exact stochastic simulation of coupled chemical

reactions. Journal of Physical Chemistry 81: 2340–2361

12. Curtis H, Barnes S N, Schnek, A, Massarini, A (2008). Biología. 7ma Edición.

Editorial Panamericana.

http://gardnerlab.bu.edu/publications/Gardner.TS_PhDThesis_2000.pdf

http://gardnerlab.bu.edu/publications/Gardner.TS_PhDThesis_2000.pdf




http://bionumbers.hms.harvard.edu/

TITULO DEL PROYECTO

2 Sección

13.

ANEXO: Fundamentos Biológicos I

ANEXO: Fundamentos Biológicos

Se desarrollará en este apartado unas nociones de biológica molecular básica necesarias para la comprensión del funcionamiento de las construcciones que se detallarán más adelante.

Comenzaré por incluir unas definiciones de los entes partícipes y las relaciones que se crean entre ellos. Tras esto, haremos un estudio de las cinéticas de las reacciones intervinientes.

Este anexo pretende servir de base para aquellos cuyas nociones de la biología molecular no son suficientes, y están extraídos del libro Biología, de Curtis [12].

II ANEXO: Fundamentos Biológicos

ANEXO: Fundamentos Biológicos III

Contenido del Anexo:

1. Definiciones de Entes Biológicos ............................................................................... V

2. La expresión genética ............................................................................................. VIII

Dogma Central de la Biología Molecular ................................................................ VIII

3. La regulación de la expresión genética ..................................................................... X

Operón ....................................................................................................................... X

Fago Lambda.............................................................................................................. X

4. Otras reacciones biológicas ...................................................................................... XI

Proteólisis ................................................................................................................. XI

ARN Antisentido ....................................................................................................... XI

5. Cinéticas Enzimáticas ............................................................................................. XIII

Michaelis-Menten .................................................................................................. XIII

Inhibición enzimática ............................................................................................... XV

Cinéticas no Michaelianas ..................................................................................... XVII

IV ANEXO: Fundamentos Biológicos

ANEXO: Fundamentos Biológicos V

1. Definiciones de Entes Biológicos

Proteína

Compuesto orgánico complejo constituido por una o más cadenas polipeptídicas, cada una formada por muchos (100 o más) aminoácidos unidos por enlaces peptídicos.

Enzima

Molécula de proteína globular que acelera una reacción química específica. Son proteínas con la capacidad de manipular a otras moléculas.

Proteasa

Son enzimas que pueden romper los enlaces de las cadenas de polipéptidos. Sirven para controlar el nivel de proteínas no deseadas. El proceso por el que estas enzimas realizan la digestión de las proteínas, se conoce como Proteolisis.

ADN (Ácido Desoxirribonucleico)

El portador de la información genética en las células, compuesto por dos cadenas complementarias de nucleótidos enrolladas en una doble hélice, capaz de autorreplicarse y de dirigir la síntesis de RNA.

ARN (Ácido Ribonucleico)

Clase de ácidos nucleicos caracterizada por la presencia del azúcar ribosa y la pirimidina uracilo; incluye ARNm, ARNt y ARNr. El ARN es el material genético de muchos virus.

ARN Mensajero (ARNm)

Un tipo de moléculas de ARN, cada una de las cuales es complementaria de una hebra de ARN. Lleva la información genética del cromosoma a los ribosomas, donde se traduce a proteína.

ARN de Transferencia (ARNt)

Clase de ARN pequeños con dos sitios funcionales; uno reconoce un aminoácido específico activado; el otro lleva el triplete de nucleótidos (anticodón) para ese aminoácido. Cada tipo de ARNt acepta un aminoácido activado específico y lo transfiere a una cadena polipeptídica naciente, según lo especifica la secuencia de nucleótidos del ARNm que está siendo traducido.

VI ANEXO: Fundamentos Biológicos

ARN Ribosómico (ARNr)

Tipo de molécula de ARN que se encuentra junto con proteínas características en los ribosomas; se transcribe a partir del ADN de los bucles de cromatina que forman el nucléolo.

ARN Antisentido (ARNas)

Un ARNm antisentido es complementario a un ARNm endógeno. Su función es la de bloquear la expresión de un gen, ya que se adhiere al ARNm y no permite que este pueda ser traducido.

Ribosoma

Organela pequeña compuesta por proteína y ácido ribonucleico; sitio de traducción en la síntesis de proteínas; en las células eucarióticas, unido frecuentemente al retículo endoplásmico.

Gen

Molécula de DNA que desempeña una función específica, tal como codificar una molécula de RNA o un polipéptido.

Cromosoma

La estructura que lleva los genes. Los cromosomas eucarióticos son filamentos o bastones de cromatina que aparecen contraídos durante la mitosis y la meiosis y que en otros momentos están contenidos en un núcleo. Los cromosomas procarióticos consisten en un círculo de ADN con el que se asocian varias proteínas.

Operón

Unidad de expresión y regulación de genes bacterianos. En el cromosoma bacteriano, un segmento de ADN que consiste en un promotor, un operador y un grupo de genes estructurales adyacentes que codifican para proteínas involucradas en una vía metabólica. Los genes estructurales se transcriben en una sola molécula de ARNm y su transcripción es regulada por una proteína represora.

ANEXO: Fundamentos Biológicos VII

Promotor

Segmento específico de ADN al cual se une la ARN polimerasa para iniciar la transcripción del ARNm desde un operón.

Represor

En genética, una proteína que se une al operador impidiendo que la ARN polimerasa se una al promotor y transcriba los genes estructurales del operón; lo codifica un gen conocido como regulador.

Plásmido

En los procariotas, una molécula de ADN circular, pequeña, extracromosómica, de replicación independiente.

Procariota

Célula que carece de núcleo y orgánelas limitadas por membrana.

Bacteria Escherichia Coli (E. Coli)

Organismo procariota, sin núcleo celular definido, perteneciente al género de las enterobacterias. Fue descrita por primera vez en 1885 por Theodore von Escherich, y es probablemente el organismo más estudiado.

VIII ANEXO: Fundamentos Biológicos

2. La expresión genética

La expresión genética y su regulación es la idea en la que se basa nuestro dispositivo y por tanto será preciso definirla y profundizar en los agentes que intervienen además de los mecanismos que nos hará posible controlarla y modificarla.

Dogma Central de la Biología Molecular

Se describe mediante un proceso de dos etapas, transcripción y traducción. De esta manera es como se transforma el código genético en la proteína que recoge.

La información que almacena una cadena de ADN se divide en genes. Un gen codificador de proteínas consiste en un promotor (secuencia de pares de bases

que especifica donde debe comenzar la transcripción), seguido de la secuencia de codificación de la proteína (secuencia codificante de la proteína) y de un terminador (secuencia que especifica el final de la transcripción).

Fig. Esquema de la estructura de un gen

La Transcripción es la síntesis de una copia de ARN a partir de un segmento de ADN. El ARN se sintetiza mediante la enzima ARN polimerasa. Cuando la enzima encuentra un promotor, recorre la cadena del gen, a medida que crea una cola tras de si con el código ya transcrito. A la molécula de ARN que se crea tras esta etapa se llama ARN mensajero (ARNm). Finalmente, la molécula formada se separa del ADN al encontrarse un una secuencia terminadora

La Traducción es la síntesis de la cadena de polipéptidos (proteína) especificado en el ARNm. Cuando el ARN mensajero encuentra un ribosoma, éste lo recorre y sitúa los polipéptidos necesarios de acuerdo a la secuencia que lee. Finalmente, se separan el ARNm y el ribosoma tras crearse la proteína correspondiente.

ANEXO: Fundamentos Biológicos IX

Hay que destacar que, aunque cada molécula nombrada tiene una vida, tras la traducción, la molécula de ARNm está de nuevo disponible para realizar una nueva copia si, eventualmente, se encontrase con un ribosoma. Al igual ocurre con el ribosoma.

X ANEXO: Fundamentos Biológicos

3. La regulación de la expresión genética

Los mecanismos naturales de los que hacemos uso para poder controlar la expresión de proteínas se basan en la represión o inhibición, e inducción.

La represión genética es el mecanismo por el que se inhibe la transcripción de un promotor y de su secuencia génica. Esto ocurre de varias maneras en la naturaleza, sin embargo, en nuestro caso, la forma de conseguir tal objetivo es obstaculizando físicamente la unión primera entre el promotor y la enzima transcriptora.

La inducción por tanto, se refiere al mecanismo contrario. Un agente, normalmente una enzima, elimina la barrera posible entre el promotor y la ARN polimerasa. Mientras la represión inhibe la transcripción, es la inducción a través de un inductor, la que la reactiva.

El tipo de regulación natural que dará lugar a nuestro esquema es el de Operón.

Operón

Los genes estructurales del operón codifican un grupo de proteínas funcionalmente relacionadas. La transcripción es controlada por secuencias en el promotor y en el operador, adyacentes a los genes estructurales y capaces de unir proteínas específicas. El promotor contiene una posición de unión para la ARN polimerasa. El operador es el sitio de unión para un represor, proteína codificada por otro gen, el regulador. Cuando el represor se une a la molécula de ADN en el sitio operador, la ARN polimerasa no puede iniciar la transcripción del ARNm. Cuando el represor no está presente, la ARN polimerasa puede unirse y comenzar su movimiento a lo largo del cromosoma, permitiendo que ocurra la transcripción y la síntesis de proteínas.

El Operón Lac Será el operón específico con el que trabajamos. Fue el primer operón en ser estudiado y comprendido. En la bacteria Escherichia Coli es requerido para el transporte y metabolismo de la lactosa.

Fago Lambda

Los fagos son virus que afectan únicamente a las bacterias. En nuestro caso, usamos un mecanismo del fago lambda, ya que éste virus afecta la bacteria Escherichia Coli, y produce una proteína represora llamada cI. Se conoce como proteína lambda dado su origen. el represor actúa como inhibidor de la transcripción insertándose en un sitio específico del genoma.

ANEXO: Fundamentos Biológicos XI

4. Otras reacciones biológicas

Durante el desarrollo del documento, aparecen otros procesos biológicos que no pertenecen propiamente a la regulación genética. Estas son las siguientes.

Proteólisis

Los procesos por proteólisis contemplan las degradaciones de proteínas mediante enzimas específicas llamadas proteasas. La digestión intracelular, se produce cuando una proteasa se encuentra con la proteína.

ARN Antisentido

Una hebra complementaria de un ARNm permite la inhibición de la molécula de ARNm a la que es análoga. El ARN antisentido se “aparea” con su ARNm complementario formando una molécula de doble hebra que puede no traducirse y termina degradándose enzimáticamente.

Para comprender mejor el efecto de un ARN antisentido, incluyo una breve explicación:

El ADN está compuesto de una serie de módulos, llamadas bases. Hay 4 tipos de bases nitrogenadas: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T), que se colocarán una tras otras en una determinada disposición. Una cadena de ADN se asocia con otra cadena de ADN complementaria formando uniones entre parejas de bases. Las uniones posibles son: Citosina-Guanina y Adenina-Timina y viceversa, Guanina-Citosina y Timina-Adenina. De esta manera se forman las cadenas de doble hélice (una por cada cadena de ADN) de pares de bases (uniones C↔G, A↔T).

Cuando ocurre la transcripción, la doble hélice se “abre” habilitando la lectura de una de las cadenas de ADN. A medida que la ARN polimerasa comienza a leer la cadena, va creando una cola con la misma cadena transcrita. Al terminar, el segmento formado se llama ARN mensajero. La terminología usada (transcripción, ARN mensajero) hace referencia lo siguiente. Una cadena de ARN no tiene las mismas bases o nucleótidos que el ADN, sino que usa en vez de la Timina (T) el Uracilo (U). Cuando la ARNp crea su cola, las ribonucleótidos son los complementarios uno a uno, es decir, C↔G, A↔U

XII ANEXO: Fundamentos Biológicos

Si una cadena de ADN fuese algo así

La cadena de ARN mensajero será

Entendido esto, un ARN antisentido es precisamente el complementario de la cadena de ARN. Fíjese que es igual que la cadena de ADN primera excepto porque aparece el U de uracilo en vez de la T de timina.

Así, se consigue que la cadena de ARN mensajera no pueda ser leída ni traducida.

A-C-G-T-C-A-A-C-C-T-T

U-G-C-A-G-U-U-G-G-A-A

U-G-C-A-G-U-U-G-G-A-A

A-C-G-U-C-A-A-C-C-U-U

ANEXO: Fundamentos Biológicos XIII

5. Cinéticas Enzimáticas

Michaelis-Menten

Estas cinéticas fueron estudiadas por Leonor Michaelis y Maude Menten, que crearon modelos que ajustaban la velocidad de acción de estos procesos.

Lejos de querer hacer un estudio de la cinética enzimática, expondré brevemente el mecanismo que reproducen las reacciones inherentes en nuestro sistema.

Las enzimas catalizan las reacciones para las que se existen específicamente. Para que pueda operar necesita de un sustrato, con el que se una, para generar productos. Una vez se completa, la enzima queda liberada para servir de catalizador a otros sustratos.

Haciendo un símil con un proceso ingenieril, las enzimas actúan como agentes nucleantes al igual que lo hacen las impurezas o paredes del recipiente durante la solidificación de materiales fundidos. Ofrecen un sitio donde la energía necesaria para continuar esa etapa es menor.

La cinética de Michaelis-Menten proporciona el siguiente planteamiento.

𝐸 + 𝑆𝑘1⇌𝑘−1

𝐸𝑆𝑘2→ 𝐸 + 𝑃

Esta ecuación no contempla la reversión del paso del complejo a producto. Esta suposición no es crítica y simplifica mucho la formulación del producto:

𝑑[𝐸𝑆]𝑑𝑡

= 𝑓𝑜𝑟𝑚𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐸𝑆 − 𝑟𝑜𝑡𝑢𝑟𝑎 − 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜


= (𝑘1 · ([𝐸𝑡] − [𝐸𝑆]) · [𝑆]) − 𝑘−1[𝐸𝑆] − 𝑘2[𝐸𝑆]

Asumiendo régimen permanente,


= 0 → 𝑘1 · ([𝐸𝑡] − [𝐸𝑆]) · [𝑆] = 𝑘−1[𝐸𝑆] + 𝑘2[𝐸𝑆]

[𝐸𝑆] =𝑘1[𝐸𝑡][𝑆]

𝑘1[𝑆] + 𝑘−1 + 𝑘2 [𝐸𝑆] =

[𝐸𝑡][𝑆][𝑆] + 𝐾𝑚

XIV ANEXO: Fundamentos Biológicos

Así podemos calcular la producción de producto como:

𝑣 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]𝐾𝑚 + [𝑆] 𝐾𝑚 =

𝑘2 + 𝑘−1𝑘1

Ecuación de Michaelis-Menten, una ecuación de velocidad para reacciones enzimáticas de sustrato único. La constante de Michaelis Km se define como la concentración a la que la velocidad de reacción es la mitad de la Vmax.

𝐾𝑚= 𝑇𝑖𝑒𝑛𝑒 𝑢𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑢𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜. 𝑆𝑒 𝑒𝑣𝑎𝑙ú𝑎 𝑎 𝑙𝑎 𝑚𝑖𝑡𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑉𝑚𝑎𝑥 𝑉𝑚𝑎𝑥

= 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 �𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝑡𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜� .𝑉𝑒𝑙𝑜𝑐𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.2

0.4

0.6

0.8

1

[S]

V

Cinética de Michaelis-Menten

Km

Vmax

V

Vmax/2

ANEXO: Fundamentos Biológicos XV

Inhibición enzimática

Explicado anteriormente en los apartados de Regulación génica y Operón, es el mecanismo por el que controlamos la expresión génica o más concretamente la acción enzimática, se produce ha través de la inhibición.

Los inhibidores pueden clasificarse en 2 grupos funcionales:

- Irreversibles

- Reversibles: competitivos y no competitivos

Atendiendo a las características de la regulación génica del operón Lac, nuestro estudio debe situarse dentro de los reversibles y competitivos ya que el inhibidor se une con la enzima. Esto tiene un significado en las cinéticas de Michaelis-Menten vistas anteriormente.

Comencemos estudiando las reacciones que se producen:

En la imagen se aprecia como la unión entre enzima e inhibidor no permite al sustrato adherirse, cortando así la transformación del sustrato en producto.

Esto provoca una variación en la constante llamada de Michaelis Km.

𝑣 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]

[𝑆] + 𝐾𝑚 �1 + [𝐼]𝐾𝑖�

Vemos como el término que lleva ahora adosada la constante 𝐾𝑚 es la unidad en el caso de que no haya inhibidor, y como su presencia provoca un aumento aparente del valor de la contante de Michaelis.

XVI ANEXO: Fundamentos Biológicos

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.2

0.4

0.6

0.8

1

[S]

V

Cinética de Michaelis-Menten con Inhibición

Vmax

Michaelis-Menten con Inhibición

Michaelis-Menten sin Inhibición

ANEXO: Fundamentos Biológicos XVII

Cinéticas no Michaelianas

Se le da este nombre a un tipo de reacciones enzimáticas que dan lugar a unas curvas con trazado sigmoideo, provocado por el concepto de cooperatividad y alosterismo. Los primeros estudios que se realizaron de las proteínas cooperativas los realizo Hill en 1910. La idea que subyace tras la cooperatividad es la unión de varias enzimas para realizar la inhibición e implica una ralentización del proceso.

De nuevo sucede lo mismo que en el apartado anterior, se modifica la constante de Michaelis. Sin embargo, Hill plantea un nuevo modelo muy parecido al de las cinéticas enzimáticas comunes.

La reacción de unión:

𝐸 + 𝑆1 → 𝐶1 + 𝑆2 → ⋯ → 𝐸 + 𝑃 𝐸 + 𝑛𝑆 → 𝐸𝑆𝑛 → 𝐸 + 𝑃

Sea la reacción de cooperatividad, donde la cinética por ella expresada es:

𝑣 =𝑉𝑚𝑎𝑥[𝑆]𝑛

𝐾𝐻 + [𝑆]𝑛

El trazado de esta curva es la siguiente:

En la imagen se puede observar la variación respecto a la cinética de Michaelis-Menten. Además podemos identificar dos estados diferentes:

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100

0.2

0.4

0.6

0.8

1

[S]

V

Cinética enzimática cooperativa

Michaelis-Menten

Cooperatividad Negativa

Cooperatividad Positiva

XVIII ANEXO: Fundamentos Biológicos

Cooperatividad positiva: la unión al sustrato es más fácil medida que se acerca la enzima a la saturación. La evolución de este comportamiento es sigmoidal

Cooperatividad negativa: la unión al sustrato es más difícil a medida que la enzima satura. La evolución es hiperbólica.

Modelado, análisis y control de sistemas biológicos...

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