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Mitigación de sequía sobre Panicum maximum mediante consorcios

bacterianos tolerantes y no tolerantes al estrés

Andrés Eduardo Moreno Galván

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN)

Bogotá D.C, Colombia

2017

Mitigación de sequía sobre Panicum maximum mediante consorcios


Andrés Eduardo Moreno Galván

Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título

de:

Magister en Ciencias - Microbiología

Directora:

Ph.D., Ruth Rebeca Bonilla Buitrago

Codirector:

Ph.D., Daniel Uribe Vélez

Línea de Investigación:

Microbiología Agrícola

Grupo de Investigación:

Sistemas Agropecuarios Sostenibles

Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias, Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN)

Bogotá D.C, Colombia

2017

A mi familia

Por ese amor y apoyo constante, por ser la

base de mis principios críticos e incentivar mi

pasión por la investigación

A mis amigos y compañeros

Siempre críticos, constructivos, y curiosos de

la vida, siempre brindándome un punto de

vista diferente

A mis maestros

Por infundir en mí ese pensamiento abierto,

compartir su conocimiento y nunca cohibir mi

curiosidad, por alimentar mis sueños y

comprender mis fallas

“Todos somos muy ignorantes, lo que ocurre

es que no todos ignoramos las mismas cosas”

Albert Einstein

Agradecimientos

A la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria – CORPOICA por financiar

este trabajo de investigación y darme la oportunidad de investigar sobre el tema.

Al Centro de Investigación Tibaitatá (CORPOICA-Cundinamarca) por facilitarme las

instalaciones y el tiempo necesario para culminar mis estudios de maestría.

A Sandra Lucía Cortes. Profesional de Apoyo a la Investigación. C.I Tibaitatá. CORPOICA.

Por su colaboración técnico-científica durante el desarrollo de este trabajo de

investigación.

A Ruth Rebeca Bonilla Buitrago. Ph.D Senior. C.I Tibaitatá. CORPOICA. Por su dirección,

colaboración, apoyo y aportes durante el desarrollo de este trabajo de investigación.

A Daniel Uribe Vélez. Profesor Asociado Ph.D. Instituto de Biotecnología de la Universidad

Nacional. Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá. Por su dirección y guía

técnico-científica durante el desarrollo de este trabajo de investigación.

A Martha Raquel Fontanilla. Profesor Asociado Ph.D. Instituto de Biotecnología de la

Universidad Nacional. Universidad Nacional de Colombia – Sede Bogotá. Por su constante

apoyo y guía técnico-científica durante mi proceso de formación académico.

A Socorro Prieto. Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional. Universidad

Nacional de Colombia – Sede Bogotá. Por su constante apoyo, amistad y acompañamiento

a durante mi proceso de formación académico.

Resumen y Abstract IX

Resumen

La sequía es un estrés de elevada severidad asociada a los efectos del cambio climático,

con impacto en el sector agropecuario. El Caribe seco colombiano es una región de

ganadería intensiva donde el pasto Guinea (Panicum maximum) representa la principal

fuente de alimentación bovina y es significativamente afectado por la sequía. Este estudio

decidió investigar sobre el potencial de consorcios bacterianos rizosféricos en la mitigación

de sequía sobre P. maximum. Se evaluaron tres consorcios XA, XB y XT aislados de la

rizósfera de la planta en invernadero sometiendo plantas de 40 días a 10 días de sequía.

La inoculación del consorcio XT produjo 48,9% más biomasa y 14,1% más elongación que

las plantas estresadas no inoculadas. Las plantas estresadas mostraron incrementos en

la actividad GR, acumulación de prolina y contenido de carotenoides. Se estableció la

cantidad de D-sorbitol para simular sequía en plántulas de P. maximum y el efecto del

consorcio XT sobre este estrés por 48h. Plántulas tratadas con D-sorbitol 300mM

incrementaron la actividad APX (67,0%), actividad GR (66,6%), peroxidación de lípidos

(140%) y acumulación de prolina (563%), comparadas con plantas no estresadas. El

consorcio XT redujo la actividad GR (29,9%) e incrementó la acumulación de prolina

(18,4%) en plantas estresadas con 300mM. El D-sorbitol afectó de manera variable las

habilidades PGPR del consorcio. Se identificó el potencial del consorcio XT en la

mitigación de los efectos deletéreos la sequía sobre P. máximum.

Palabras clave: Consorcios bacterianos, PGPR, Panicum maximum, sequía,

antioxidantes enzimáticos, antioxidantes no-enzimáticos

X Mitigación de sequía sobre Panicum maximum mediante consorcios bacterianos

tolerantes y no tolerantes al estrés

Abstract

Drought is a high severity stress enhanced by climatic change effects and with

repercussions on crop production. Colombian dry Caribbean region is dedicated to

intensive livestock breeding where guinea grass (Panicum maximum) represents the main

food source for animals and its heavily affected by drought. The aim of this study was to

identify the potential of P. maximum rhizospheric bacterial consortia on drought

amelioration in the plant. Three consortia XA, XB, and XT, were tested in 40-day plants

subjected to drought for ten days. Bacterial consortium XT increased dry biomass by 48,9%

and stimulate plant elongation by 14,1% compared to non-inoculated plants under stress.

Stressed plants showed increases in APX activity, proline accumulation, and carotenoid

content. The amount of D-sorbitol capable of simulating drought effects in P. maximum

after 48h was detected over 200mM. Plants treated with 300mM D-sorbitol showed

increased APX activity (67,0%), GR activity (66,6%), lipid peroxidation (140%), and proline

accumulation (563%) related to non-stressed plants. The consortium XT showed to reduce

GR activity (29,9%) and to increase proline accumulation (18,4%) in plants treated with the

consortium and 300mM D-sorbitol. D-sorbitol affected in different degrees PGPR abilities

of the consortium microorganisms. We identified the potential of bacterial consortium XT

inoculation on drought stress mitigation in P. maximum.

Keywords: Bacterial consortia, PGPR, Panicum maximum, drought, enzymatic

antioxidants, non-enzymatic antioxidants

Contenido XI

Contenido

Pág.

Resumen ........................................................................................................................ IX

Lista de figuras ............................................................................................................ XIII

Lista de tablas ............................................................................................................. XIV

Lista de Símbolos y abreviaturas ................................................................................ XV

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Consorcios bacterianos con potencial mitigador de sequía sobre Panicum maximum 7

1.1 Introducción ........................................................................................................ 7 1.2 Materiales y Métodos ....................................................................................... 11

1.2.1 Multiplicación de Microorganismos y Material Vegetal ................................... 11 1.2.2 Caracterización de microorganismos de los consorcios bacterianos .............. 12 1.2.3 Evaluación de consorcios bacterianos en la mitigación del estrés por sequía 14

1.3 Resultados y Discusión .................................................................................... 17 1.3.1 Caracterización de microorganismos de los consorcios bacterianos .............. 17 1.3.2 Efecto de consorcios bacterianos en la mitigación del estrés por sequía ....... 19

1.4 Conclusiones .................................................................................................... 29

2. Efecto de la adición de D-sorbitol como agente simulador de sequía en plantas de Panicum maximum tratadas con un consorcio de bacterias xerotolerantes ....... 31

2.1 Introducción ...................................................................................................... 31 2.2 Materiales y Métodos ....................................................................................... 32

2.2.1 Multiplicación de Microorganismos y Material Vegetal ................................... 32 2.2.2 Caracterización de microorganismos ............................................................. 33 2.2.3 Experimento 1: Simulación de estrés por sequía en plántulas de Panicum maximum ................................................................................................................. 36 2.2.4 Experimento 2: Efecto de la inoculación del consorcio XT sobre plántulas de Panicum maximum sometidas a estrés simulado ..................................................... 37

2.3 Resultados y Discusión .................................................................................... 39 2.3.1 Caracterización de microorganismos xerotolerantes ...................................... 39 2.3.2 Simulación de estrés por sequía y mitigación de este estrés simulado mediante un consocio de Bacillus spp. ..................................................................... 40 2.3.3 Efecto del D-sorbitol sobre las actividades PGPR de las cepas de consorcio bacteriano ................................................................................................................ 43 2.3.4 Conclusiones ................................................................................................. 49

XII Mitigación de sequía sobre Panicum maximum mediante consorcios bacterianos


3. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 51

3.1 Conclusiones .................................................................................................... 51 3.2 Recomendaciones ............................................................................................ 52

Bibliografía .................................................................................................................... 53

Contenido XIII

Lista de figuras

Pág.

Figura 1-1. Efecto de la aplicación de consorcios bacterianos sobre el crecimiento de

plantas de P. maximum sometidas a déficit hídrico. ....................................................... 20

Figura 1-2. Efecto de la aplicación de consorcios bacterianos sobre las actividades

enzimáticas antioxidantes APX y GR en plantas de P. maximum sometidas a déficit

hídrico. ........................................................................................................................... 22

Figura 1-3. Efecto de la aplicación de consorcios bacterianos sobre la concentración de

prolina foliar y la peroxidación de lípidos en plantas de P. maximum sometidas a déficit

hídrico. ........................................................................................................................... 24

Figura 2-1. Efecto de la adición de D-sorbitol en las actividades enzimáticas antioxidantes

APX y GR en plántulas de P. maximum control y tratadas con el consorcio XT. ............ 41

Figura 2-2. Efecto de la adición de D-sorbitol en la concentración de prolina foliar y la

peroxidación de lípidos en plántulas de P. maximum control y tratadas con el consorcio

XT. ................................................................................................................................. 43

Figura 2-3. Efecto de la adición de D-sorbitol sobre las habilidades promotoras de

crecimiento vegetal in vitro de las cepas de Bacillus sp., componentes del consorcio XT.

....................................................................................................................................... 44

Contenido XIV

Lista de tablas

Pág.

Tabla 1-1. Composición de los tratamientos de Panicum maximum evaluados .............. 15

Tabla 1-2. Características asociadas a las cepas componentes de los tres consorcios

obtenidos de la rizósfera de Panicum maximum ............................................................. 18

Tabla 1-3. Pigmentos fotosintéticos en plantas de Panicum maximum inoculadas con

consorcios bacterianos ................................................................................................... 25

Tabla 2-1. Identificación y caracterización de las cepas bacterianas del consorcio XT ... 39

Contenido XV

Lista de Símbolos y abreviaturas

Abreviaturas Abreviatura Término

ACC Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico ACCd Ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico desaminasa AIA Ácido indol acético APX Ascorbato peroxidasa BAFE Bacterias aerobias formadoras de esporas CAS Cromo azurol-S CAT Catalasa Chl Clorofila DHA Dehidroxiascorbato DHAR Dehidroxiascorbato reductasa DMSO Dimetilsulfóxido DTNB Ácido 5-5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) EPS Exopolisacáridos GR Glutatión reductasa GSH Glutatión reducido GSSG Glutatión oxidado IST Induced systemic tolerance MDA Malondialdehido MDHA Monodehidroxiascorbato MDHAR Monodehidroxiascorbato reductasa PGPR Plant growth-promoting rizhobacteria PUFA Polyunsaturated fatty acids ROS Reactive Oxygen Species SOD Superóxido dismutase TBA Ácido tiobarbitúrico TBARS Tiobarbituric acid reactive substances TCA Ácido tricloroacético TNB Ácido 2-nitro-5-tiobenzoico

Introducción

Las plantas en su entorno natural se ven sujetas a diversos cambios los cuales están

representados en estreses bióticos y abióticos, estos influencian tanto el crecimiento como

la productividad a diferentes niveles. La diversidad de factores abióticos a los cuales están

expuestas las plantas comprende bajas y altas temperaturas, inundación, salinidad, estrés

oxidativo y toxicidad por metales pesados, representando pérdidas económicas

considerables a nivel mundial y convirtiéndose en uno de los mayores problemas para la

agricultura (Coleman-Derr & Tringe, 2014; Mahajan & Tuteja, 2005). Sin embargo, estos

estreses han sido acentuados por actividades antropogénicas como sobre-fertilización,

prácticas agrícolas irresponsables, industrialización y deficiente control de emisiones, todo

esto asociado al fenómeno de cambio climático (Gontia-Mishra, Sasidharan, & Tiwari,

2014; Mahajan & Tuteja, 2005).

Dentro de la diversidad de estreses, la sequía es uno de los mayores factores abióticos

que presenta un efecto devastador sobre los cultivos alrededor del mundo, debido a que

usualmente se presenta acompañado de altas temperaturas y ocasionalmente salinidad;

dentro de las proyecciones para el año 2050 se estima que el 50% del terreno cultivable

esté severamente afectado por el déficit hídrico (Naveed, Hussain, Zahir, Mitter, &

Sessitsch, 2014). Así mismo, esto representará un ritmo acelerado de desertificación

global, donde la pérdida de terreno arable anual se duplicaría a finales de siglo (Naveed,

Hussain, et al., 2014; Wang et al., 2014). Una administración responsable del recurso

hídrico requiere una especial atención, y es debido a esto que el desarrollo tanto de

variedades vegetales tolerantes a diversos estreses, como el uso de microorganismos que

contribuyan en la adaptación de estas, se ha insertado como énfasis en los planes de

biotecnología agrícola en los diversos países (Naveed, Hussain, et al., 2014; Zolla, Badri,

Bakker, Manter, & Vivanco, 2013).

2 Introducción

A pesar que a través del desarrollo de estrategias de fitomejoramiento se han desarrollado

plantas tolerantes, el inconveniente de estas soluciones radica en que los beneficios

obtenidos no pueden ser fácilmente extrapolables ya que aplican a una sola especie

vegetal (Coleman-Derr & Tringe, 2014). Es por esto que las agro-biotecnologías modernas

han implementado la inducción de la tolerancia sistémica (IST – Induced Systemic

Tolerance) mediante la inoculación de poblaciones de microorganismos capaces de

modular la percepción del estrés por la planta haciendo más eficientes los mecanismos

propios de mitigación bajo condiciones de estrés, siendo estos efectos extrapolables a

diversas especies vegetales sin mayores inconvenientes (Lim & Kim, 2013; Naveed,

Hussain, et al., 2014; Zolla et al., 2013).

Según el 3er Censo Nacional Agropecuario (DANE, 2015), existen 62,8 millones de

hectáreas censadas para el área rural estando el 38,3% (42,3 millones ha) ocupado en

actividades agropecuaria, dentro de estos 42,3 millones de hectáreas el 80% (33,8

millones) se encuentra destinada al cultivo de pasturas y por ende a la actividad ganadera.

El pasto Guinea o Panicum maximum (Megathyrsus maximus) es una gramínea perenne

nativa de África, que presenta un alto potencial como forraje y juega un papel importante

en los trópicos y sub-trópicos, siendo cultivada de manera extensiva en países como

Colombia, Australia, USA y Brasil debido a sus altos rendimientos y calidad nutricional para

el ganado vacuno (Müller, Guimarães, Desjardins, & Mitja, 2004; Njarui, Gatheru, Mwangi,

& Keya, 2015). Siendo de la familia de las poáceas, esta gramínea con su porte alto (hasta

3m de altura) y vigoroso, con capacidad de crecer en un amplio rango de suelos y la

presencia de un sistema radical profundo lo cual le confiere eficiencia en la toma de agua,

es adecuada para la implementación en sistemas ganaderos tropicales(de Sousa et al.,

2011) como el Caribe Seco colombiano, sin embargo, no está exenta de sufrir por la

incidencia del estrés hídrico lo cual reduce su rendimiento.

En Colombia, el déficit hídrico se ha convertido en un factor limitante para el sector

agropecuario debido sus graves impactos incluyendo pérdida de cosechas y muerte de los

animales. Los períodos prolongados de déficit hídrico en diferentes regiones contribuyen

Introducción 3

al incremento del deterioro en el sector agropecuario, y es por esto que se hace apremiante

el desarrollo de estrategias de prevención y adaptación. En el caso de la ganadería, el

pasto Guinea (Panicum maximum) es la pastura más ampliamente usada en la región

Caribe Seco colombiano para la alimentación animal, por tanto, garantizar su disponibilidad

en épocas de bajas precipitaciones es imperante. Es por esto, que esta gramínea se

convierte en candidato de investigación relevante debido a su impacto sobre el sector

ganadero colombiano, la relación del impacto nocivo de la sequía y la necesidad de

estrategias de mitigación.

Existen antecedentes donde la aplicación de diversos microorganismos asociados a

diferentes plantas promueve la mitigación de los efectos de la sequía en las mismas, y

para abordar esta alternativa debemos partir del concepto de microbioma, el cual es

aquella comunidad ecológica de microorganismos comensales, simbiontes y patógenos

que comparte un organismo (Rout, 2014). Se ha demostrado que en la rizósfera de las

plantas este microbioma varía en función del suelo, la planta y las condiciones

edafoclimáticas (Marasco et al., 2012), por tanto, la evaluación de poblaciones selectas

partiendo de su capacidad de tolerar o no el estrés por sequía es una estrategia viable en

la construcción de agro-biotecnologías que permitan mitigar los efectos nocivos de este

estrés, permitiendo seleccionar poblaciones de un microbioma específico sometido a unas

condiciones particulares de estrés, como estrategia experimental para contribuir al

desarrollo de biotecnologías enfocadas al área agropecuaria.

De acuerdo con la planteado anteriormente, el objetivo general de este estudio fue:

“Identificar el potencial de consorcios bacterianos en la mitigación de las condiciones de

déficit hídrico en Panicum máximum”, proyectado como estrategia para contribuir al

desarrollo de biotecnologías enfocadas a la mitigación de la sequía en zonas de baja

disponibilidad de agua y altos requerimientos en relación a alimentación animal.

Para cumplir con el objetivo general, se plantearon los siguientes objetivos específicos:

• Identificar y seleccionar consorcios bacterianos con efecto mitigador de sequía

sobre Panicum maximum.

4 Introducción

• Determinar las características morfo-fisiológicas generadas bajo un modelo artificial

de simulación de sequía para Panicum maximum.

• Identificar el efecto de la inoculación de consorcios bacterianos sobre la mitigación

de los síntomas morfo-fisiológicos generados en Panicum maximum bajo

condiciones de estrés simulado.

Dentro del alcance posible para este estudio se proyectó el identificar un consorcio de

microorganismos con potencial de mitigar la severidad de los efectos del cambio climático

relacionados el déficit hídrico, como una estrategia efectiva en la mejora la producción de

biomasa vegetal bajo condiciones de este estrés abiótico. Sin embargo, debimos

contemplar las posibles limitaciones, donde podríamos encontrar que la interacción de los

microorganismos en los consorcios juegue un papel significativo en la respuesta de

Panicum maximum, ya grupos de 5 hasta 22 microorganismos diferentes estarían

estableciendo una dinámica con la planta que por los métodos empelados sería

complicada de determinar puntualmente.

Estos alcances y limitaciones están enmarcados dentro de la Agenda Quinquenal de la

Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria – CORPOICA dentro del

macroproyecto titulado “estrategias para mejorar la competitividad y sostenibilidad de los

sistemas de producción de leche y/o carne en el Caribe Seco” donde la meta específica es

poder generar un “Bioproducto con base en bacterias que disminuyan el impacto del estrés

hídrico en el pasto guinea probado bajo condiciones de invernadero”.

Para lograr el objetivo propuesto, un primer experimento bajo condiciones de invernadero

nos permitió evaluar el potencial y seleccionar entre tres consorcios bacterianos aislados

previamente de la rizósfera P. maximum. Esta selección se realizó mediante la

determinación de su capacidad de mitigar el estrés por sequía mediante suspensión de la

irrigación por 10 días, midiendo los efectos sobre la morfo-fisiología de la planta.

Posteriormente, un segundo experimento permitió evaluar el efecto de diferentes

concentraciones de D-Sorbitol como agente con capacidad para simular el estrés por

sequía determinando la respuesta fisiológica antioxidante en plántulas de P. máximum de

Introducción 5

25 días de desarrollo luego 48h de exposición al compuesto. Partiendo de la concentración

D-Sorbitol efectiva en simular el estrés, se evaluó la habilidad del consorcio bacteriano

seleccionado en mitigar el estrés simulado mediante D-sorbitol en Panicum máximum bajo

las mismas condiciones del experimento previo.

Adicionalmente, se evaluó el efecto de dicha concentración de D-sorbitol sobre el

crecimiento celular y algunas habilidades de promoción de crecimiento vegetal de las

bacterias pertenecientes al consorcio bacteriano seleccionado con el fin de realizar una

posible asociación con los resultados obtenidos en el tercer experimento.

Este estudio se presenta como el primero en Colombia en determinar el potencial de

consorcios bacterianos asociados a Panicum maximum en el Caribe Seco colombiano con

la capacidad de mitigar estrés por sequía bajo condiciones de invernadero, y a su vez es

pionero a nivel mundial en la investigación ambiente-planta-microorganismo en una

gramínea con potencial alimenticio en el área pecuaria. El posible uso de estos consorcios

en biotecnologías innovadoras como biofertilizantes de segunda generación se proyecta

como una estrategia de éxito en la batalla contra la severidad de los estreses asociados a

cambio climático como lo es el déficit hídrico.

1. Consorcios bacterianos con potencial mitigador de sequía sobre Panicum maximum

1.1 Introducción

En la naturaleza las plantas se ven expuestas a diversos estreses tales como predadores,

patógenos, sequía, salinidad, temperatura, metales pesados y déficit nutricional, entre

otros, siendo capaces de inducir la tolerancia mediante mecanismos tanto morfológicos

como fisiológicos (Gill & Tuteja, 2010). Diversos cambios en la morfo-fisiología de algunas

de sus partes -como disminución de área foliar y control de la apertura de los estomas

(bajo estrés hídrico)- permiten a la planta mitigar los diferentes efectos adversos

provenientes del estrés, estando estos acompañados de la producción de osmolitos y

enzimas para la protección de la homeóstasis, componentes importantes en la activación

de diferentes procesos de señalización y respuesta (Miransari, 2014). Definir estrés en el

caso de las plantas es un poco más complicado, ya que establecer una definición para una

planta depende de factores diversos como condiciones edafoclimáticas, genéticas, de

adaptación, entre otras (Prasch & Sonnewald, 2014); en resumen, lo que para una planta

inicia un episodio de estrés para otra es una condición óptima de desarrollo.

Con base en lo anterior, una definición práctica de estrés en plantas sería “la fuerza

adversa o condición que inhibe el funcionamiento normal de la planta”, dentro de las cuales

encontramos: estreses abióticos como frío (heladas y congelamiento), calor (altas

temperaturas), salinidad (sal), sequía (condiciones de déficit hídrico), exceso de agua

(encharcamiento), radiación (alta intensidad de luz UV y visible), químicos y contaminantes

(metales pesados, pesticidas y aerosoles), viento (arena y partículas transportables por

viento) y privación de nutrientes en el suelo. A su vez, los estreses bióticos se encuentran

representados por patógenos (virus, bacterias y hongos), insectos, herbívoros y roedores

(Mahajan & Tuteja, 2005).

8 Mitigación de sequía sobre Panicum maximum mediante consorcios bacterianos


La percepción de los diferentes tipos de estrés por parte de la planta es un proceso de

reconocimiento donde están involucradas moléculas que inician una respuesta (elicitores)

y sitios de unión de estas moléculas (receptores) claves para el proceso; en las plantas la

detección de estos tipos de estrés está asociada a proteínas alojadas en la membrana

plasmática, donde las señales tanto de estrés biótico como abiótico sirven como elicitores

de la respuesta (Mahajan & Tuteja, 2005; Prasch & Sonnewald, 2014).

Cuando el estrés es percibido la señal es transducida corriente abajo produciendo

mensajeros secundarios incluyendo calcio, especies reactivas del oxígeno (ROS – del

inglés Reactive Oxygen Species) e inositol fosfatos. Son estos mensajeros secundarios los

encargados de modular la concentración intracelular de Ca2+ la cual es reconocida y

posteriormente da inicio al sistema de señalización del estrés mediante una cascada de

fosforilación de MAP-quinasas hasta llegar a la activación de los genes de respuesta a

estrés o los factores de transcripción asociados a estos. Los productos de estos genes de

estrés finalmente enfocarán a la planta hacia la adaptación y contribuirán a la supervivencia

y recuperación bajo estas condiciones adversas (Mahajan & Tuteja, 2005; Miransari, 2014).

El estrés hídrico puede generarse a partir de dos condiciones, el exceso de agua o su

déficit, siendo este último el más común y conocido como sequía (Prasch & Sonnewald,

2014). Esta afecta fisiológicamente la bicapa lipídica aumentando la porosidad de la

membrana contribuyendo con la pérdida de su integridad, selectividad y de la

compartimentalización celular, así como la pérdida de actividades enzimáticas asociadas

a membrana. Sumado al daño de membrana, la deshidratación producida puede generar

denaturación parcial o total de las proteínas citosólicas y de organelos, esto, acompañado

del aumento intracelular de electrolitos puede causar una disrupción del metabolismo

celular (P. Ahmad et al., 2014; El-Afry, El-Nady, Abdelmonteleb, & Metwaly, 2012).

Consorcios bacterianos con potencial mitigador de sequía sobre Panicum

maximum

9

Es el incremento en la concentración intracelular de electrolitos, lo que hace que tanto

sequía como salinidad estén relacionados, ya que sus efectos abarcan deshidratación

celular y pérdida del balance osmótico, donde virtualmente cada aspecto de la fisiología

de las plantas, así como del metabolismo celular es afectado por ambos. En relación, uno

de los principales síntomas en las plantas estresadas, es el arresto de la división celular,

esto impacta directamente el desarrollo produciendo pérdida de biomasa, y en casos

severos, el inicio de la muerte celular programada (Coleman-Derr & Tringe, 2014; Loutfy

et al., 2012; Prasch & Sonnewald, 2014).

La producción de ROS está asociada como mecanismo de respuesta al estrés en las

plantas, en niveles bajos algunos de sus componentes actúan como elicitores de la

respuesta al estrés mientras en niveles elevados producen daños variados a nivel celular

de la planta. Dentro del grupo de especies reactivas del oxígeno encontramos, radical

superóxido (O2-*), oxígeno singlete (1O2), peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo

(OH·) (P. Sharma, Jha, Dubey, & Pessarakli, 2012). Dentro de los daños ocasionados por

estas ROS encontramos peroxidación de lípidos de la membrana, daños al fotosistemas I

y II, inactivación de enzimas por oxidación de los grupos tiol, daño a los ácidos nucleicos,

carbohidratos, e inicio de la muerte celular programada (Saed-Moucheshi, Pakniyat,

Pirasteh-Anosheh, & Azooz, 2014; P. Sharma et al., 2012).

A pesar del efecto nocivo de las ROS en la planta, cabe aclarar que del 1-2% del

O2consumido por las plantas es convertido en ROS, es por esto que naturalmente la planta

posee un sistema de detoxificación de ROS en el cual encontramos involucrados

mecanismos enzimáticos y no enzimáticos (Gill & Tuteja, 2010). Dentro de los primeros

encontramos un set de enzimas como la Superóxido dismutasa (SOD), encargada de la

rápida conversión del radical superóxido a peróxido de hidrógeno (menos tóxico), la

Catalasa (CAT), generando agua y oxígeno a partir de peróxido de hidrógeno, mientras la

Ascorbato peroxidasa (APX) convierte el peróxido de hidrogeno en agua (mayor afinidad

que la CAT) con una eficiencia mayor, lo que la hace un punto clave junto a la SOD en el

sistema detoxificación de ROS, finalmente la Glutatión reductasa (GR) es la encargada de



reducir el glutatión oxidado (GSSG) a glutatión (GSH) (Anwar Hossain, Hoque, Burritt, &

Fujita, 2014; Habibi, 2014; P. Sharma et al., 2012; Szőllősi, 2014)

Los mecanismos no enzimáticos están asociados a la producción de sustancias que

reduzcan el impacto de las ROS sobre la célula y su maquinaria, ya sea reaccionado con

ellas o protegiendo los sitios sensibles a oxidación. Estas sustancias son denominadas

“metabolitos de bajo peso molecular” dentro de ellos encontramos ácido ascórbico

(vitamina C), glutatión, α-tocoferoles, carotenoides, flavonoides y prolina, siendo esta

última la representante principal del grupo por su alto poder como equilibrador osmótico y

protector contra la inactivación de enzimas y DNA (Anwar Hossain et al., 2014; P. Sharma

et al., 2012).

A pesar que los avances en la biotecnología vegetal contribuyen con plantas resistentes a

diversos estreses, esta respuesta no puede ser extrapolada fácilmente y por tanto no

constituye una respuesta transversal (Coleman-Derr & Tringe, 2014). De manera contraria,

los microrganismos representan una estrategia plausible dentro de las diferentes

tecnologías emergentes en el control de los efectos del estrés abiótico y más aún del estrés

hídrico (Jisha, Vijayakumari, & Puthur, 2012). Ha sido demostrado el efecto benéfico de la

inoculación de microorganismos tanto a nivel de semilla como de plántula mitigando los

efectos del estrés en cultivos como trigo (Ramadoss, Lakkineni, Bose, Ali, & Annapurna,

2013), girasol(Sandhya, Z., Grover, Reddy, & Venkateswarlu, 2009), papa (Gururani et al.,

2013), maíz (Kavamura et al., 2013), cebada (Samarah, 2005), tomate (Grichko & Glick,

2001), soya (Kumari, Vaishnav, Jain, Varma, & Choudhary, 2015) y arroz (Ruíz-Sánchez

et al., 2011), entre otros.

La variedad de cultivos dentro de los cuales se ha producido una mitigación del estrés

abiótico por microorganismos es amplia, encontrando representantes de los géneros

Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, Burkholderia, Rhizobium, Azospirillum,

Bradyrhizobium, entre otros (Abbasi, Zahedi, Sadeghipour, & Akbari, 2013; Lim & Kim,

2013; Miri, Tohidi Moghadam, Ghooshchi, & Zahedi, 2013; Naveed, Hussain, et al., 2014;


maximum

11

Prudent, Salon, Souleimanov, Emery, & Smith, 2014). Es más, el microbioma al cuál estos

microrganismos pertenecen varía en función del suelo, la planta y el estadio de desarrollo

de esta última, haciendo la investigación de microorganismos mitigadores de estreses

abióticos aún más relevante (Zolla et al., 2013).En contraste a la gran diversidad y variedad

tanto de microrganismos como de cultivos, encontramos que los mecanismos mediante los

cuales estos microorganismos son capaces de mitigar el estrés son relativamente pocos,

mecanismos como producción de fitohormonas, exopolisacáridos (EPS), solubilización de

fósforo, formación de biopelículas y el control de los niveles etileno asociado estrés

mediante la actividad ACC-deaminasa, entre otros (Coleman-Derr & Tringe, 2014;

Gamalero & Glick, 2015; Naveed, Hussain, et al., 2014; Prudent et al., 2014).

Considerando lo anterior, el objetivo de este experimento fue Identificar y seleccionar

consorcios bacterianos con potencial para mitigar el efecto de la sequía sobre Panicum

maximum, mediante la evaluación del efecto de inocular diversas combinaciones de estos

consorcios en plántulas de 40 días de desarrollo sometidas luego a 10 días sin irrigación

bajo condiciones de invernadero.

1.2 Materiales y Métodos

1.2.1 Multiplicación de Microorganismos y Material Vegetal

Los microorganismos pertenecientes a los diferentes consorcios bacterianos fueron

proporcionados por la Colección de Microorganismos con Potencial Biofertilizantes

ubicado en el Laboratorio de Microbiología Agrícola - Centro de Investigación Tibaitatá de

la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA). Estos fueron

reconstituidos en medio Tripticasa de Soya (Merck®) a partir de viales en crioconservación

a -80°C e incubados a 30°C ± 2 por 24h previas a su uso.

Se emplearon semillas de Panicum maximum (SEMICOL®) a las cuales se les evaluó su

porcentaje de germinación mediante recuento en cámara húmeda durante 5 días. Para su

uso en los ensayos gnoctobióticos se realizó un protocolo de desinfección estándar de



3min hipoclorito 5% (v/v), 2min etanol 70% (v/v) y triple lavado en agua destilada estéril

(Rojas-Tapias et al., 2012) seguido de un secado en cámara de flujo vertical. La esterilidad

de las semillas fue comprobada colocando 5 semillas sobre agar tripticasa de soya y

llevándolas a incubar a 30°C ± 2 por 24h previas a su uso.

1.2.2 Caracterización de microorganismos de los consorcios bacterianos

▪ Consorcios bacterianos

Estos microorganismos fueron previamente aislados de la rizósfera de P. maximum en el

Laboratorio de Microbiología Agrícola (C.I Tibaitatá) y fueron catalogados por: (1) su

habilidad de crecer en una baja disponibilidad de agua regulada mediante la adición de

diferentes concentraciones de D-sorbitol a 40°C y (2) su crecimiento en diferentes medios

de cultivo. Los medios empleados para este último procedimiento fueron agar Ashby

(Yadav & Verma, 2014), Burks (Quagliano, Amarilla, Fernandes, Mata, & Miyazaki, 2001)

y Tripticasa de Soya (TSA) 10% (Merck®). Posteriormente, los microorganismos se

separaron en 3 grupos diferentes que conformando los consorcios evaluados: el consorcio

XA (8 bacterias Gram negativas con formación de quistes y producción de pigmentación

en medio Ashby), el consorcio XB (9 bacterias filamentosas) y el consorcio XT (5 bacterias

aerobias formadoras de esporas - BAFE).

Para los consorcios XT y XA, se prepararon los inóculos a partir de una colonia aislada de

cada una de las bacterias previamente reconstituidas en TSA (Merck®), y se inocularon

en 10mL de Caldo Tripticasa de Soya (TSB) (Merck®) por separado, y llevaron a incubar

a 30°C ± 2 durante 24h a 48h. Luego de esto se centrifugaron a 7000 rpm por 10min y se

realizaron lavados en NaCl 0,85% estandarizando la concentración de cada bacteria a

DO600nm= 0,5. Para cada solución bacteriana se realizó un recuento de células viables por

medio de diluciones seriadas en solución salina con siembra en superficie en TSA.


maximum

13

El consorcio XB fue obtenido mediante colección de la biomasa bacteriana en solución

salina a partir de un raspado de TSA luego de 5 días de incubación a 30°C ± 2. La

concentración de cada bacteria fue estandarizada a DO600nm= 0,5 DO600nm= 0,2. Para cada

solución bacteriana se realizó un recuento de células viables por medio de diluciones

seriadas en solución salina con siembra en superficie en TSA.

▪ Determinación cualitativa de producción de compuestos indólicos

La determinación de ácido indol acético (AIA) se realizó mediante técnica colorimétrica

descrita por Gordon y Weber (1951) con algunas modificaciones. Se tomaron alícuotas de

100uL cada bacteria ajustando y se inocularon en 5mL de medio TSB suplementado con

L-Triptófano 5mM en oscuridad. Luego de 48h de incubación a 30°C ± 2, las células se

recuperaron por centrifugación (10.000rpm por 5min) y se agregaron 750µL de

sobrenadante a 750µL de reactivo de Salkowski (12 g/L FeCl3 en 7.9 M H2SO4). La reacción

se llevó a cabo en oscuridad por 30min. El desarrollo de una coloración de rosa a rojo

indicó la producción de AIA.

▪ Determinación cualitativa de solubilización de fósforo

La detección se realizó empleando medio NBRIP sólido (1% glucosa; 0.5% Ca3(PO4)2;

0.5% MgCl2·6H2O; 0.02% KCl; 0.025% MgSO4·7H2O; 0.01% (NH4)2SO4; 1,4% agar-agar)

inoculado con microgotas 20µL de suspensiones celulares bacterianas estandarizadas a

OD600 = 0.5 preparadas en NaCl (0.85%). Luego de ser incubadas por 12 días a 30°C ± 2

la aparición de un halo de solubilización del fosfato tricálcico de al menos 2mm se interpretó

como capacidad solubilizadora de fosfato positiva (S. B. Sharma, Sayyed, Trivedi, & Gobi,

2013) .



▪ Determinación cualitativa de sideróforos

La detección se realizó empleando medio sólido CAS preparado según lo descrito por

Alexander y Zuberer (1991) e inoculado con microgotas 20µL de suspensiones celulares

bacterianas estandarizadas a OD600 = 0.5 preparadas en NaCl (0.85%). Luego de ser

incubadas por 12 días a 30°C ± 2 la aparición de un halo de color naranja en torno a las

microgotas se interpretó como capacidad de producción de sideróforos positiva.

1.2.3 Evaluación de consorcios bacterianos en la mitigación del estrés por sequía

Se llevaron a cabo tres experimentos individuales bajo condiciones de invernadero

empleando consorcios preparados por separado para cada uno, y separados por 15 días

en el tiempo de montaje. Cada experimento constó de tres bandejas de 12 alvéolos

plásticos cada uno con 1kg de sustrato estéril vermiculita-arena en relación 2:1. En cada

alvéolo se sembraron de manera uniforme 0,5g de semilla de P. maximum previamente

sometidas a 1h de contacto a 150 rpm y temperatura ambiente con cada tratamiento que

contuviera bacteria (Tabla 1-1).

Posterior a la emergencia de las semillas, cada experimento se mantuvo bajo irrigación

cada 48h con 50mL de agua destilada y una fertilización semanal con 50mL solución de

Hoagland al 50% (v/v) por alvéolo. Luego de 40 días de establecimiento (fecha usual de

corte de esta pastura) se realizó un raleo manteniendo entre 8 y 10 plantas uniformes por

alveolo. Posterior al establecimiento las plantas fueron sometidas a sequía severa durante

un período de 10 días por suspensión completa de la irrigación. Finalmente se

determinaron las variables morfo-fisiológicas: peso seco (g), altura (cm), concentración de

prolina foliar, concentración de pigmentos fotosintéticos, peroxidación de lípidos, y las

actividades enzimáticas antioxidantes: ascorbato peroxidasa (APX) y glutatión reductasa

(GR) para cada tratamiento.

Cada experimento constó de 9 tratamientos empleando 4 unidades experimentales

distribuidas completamente al azar. La unidad experimental se estableció como 1 alveolo


maximum

15

con 8 a 10 plantas desarrolladas en él. Para este experimento se tomó una unidad

experimental como una réplica, para un total de 4 réplicas por tratamiento.

Tabla 1-1. Composición de los tratamientos de Panicum maximum evaluados

Tratamiento Descripción

T1: Control Absoluto Panicum maximum irrigado al 100% de

capacidad de campo (Saxton & Rawls, 2006)

durante 50 días.

T2: Control Sequía Panicum maximum sometido a 10 días de

sequía luego de 40 días de establecimiento.

T3: XA Panicum maximum sometido a 10 días de

sequía luego de 40 días de establecimiento,

inoculado con el consorcio XA (8 aislamientos

bacterianos).

T4: XB Panicum maximum sometido a 10 días de


inoculado con el consorcio XB (9 aislamientos

bacterianos).

T5: XT Panicum maximum sometido a 10 días de


inoculado con el consorcio XT (5 aislamientos

bacterianos).

T6: XA+XB Panicum maximum sometido a 10 días de


inoculado con los consorcios XA+XB (16

aislamientos bacterianos)

T7: XA+XT Panicum maximum sometido a 10 días de


inoculado con los consorcios XA+XT (13


T8: XB+XT Panicum maximum sometido a 10 días de


inoculado con los consorcios XB+XT (14




T9: XA+XB+XT Panicum maximum sometido a 10 días de


inoculado con los consorcios XA+XB+XT (22


▪ Determinación de actividades enzimáticas antioxidantes

El extracto vegetal se obtuvo empleando 100 - 150mg de tejido vegetal fresco macerado

en nitrógeno líquido, adicionando 2mL de buffer Fosfato de Potasio 0,2M pH 7,5

suplementado con 0,1mM EDTA y homogenizando en vórtex por 5 segundos. Los

microtubos fueron centrifugados a 14000xg por 20min a 4°C, recuperando 1mL de

sobrenadante en un microtubo de 1,5mL manteniendo fríos los extractos en cama de hielo.

Para la determinación de la actividad Ascorbato Peroxidasa - APX (EC 1.11.1.11) (Nakano

& Asada, 1981) empelando 890 µL de Buffer fosfato de potasio 100mM (pH 7,5)

suplementado con 0,1mM EDTA, 50µL de extracto vegetal, 50µL de ascorbato 10mM, y

finalmente 10µL peróxido de hidrógeno para iniciar la reacción registrando la caída en la

absorbancia a 290nm cada 10 segundos durante 3min. El cálculo de la actividad se realizó

empleando el coeficiente de extinción molar del ascorbato reducido 2.8 mM /cm. La

actividad Glutatión Reductasa - GR (EC 1.20.4.2.) se determinó acorde con el protocolo de

Smith y colaboradores (1988) mediante la adición de 10μL de extracto junto a 1ml de

volumen final conteniendo 0.75mM DTNB, 0.1mM NADPH y 1mM GSSG donde se medirá

el incremento en la absorbancia a 412nm en función a la reducción del DNTB a TNB por

el GSH en la reacción.

▪ Determinación de Prolina

Se realizó un extracto vegetal de cada tratamiento empleando 100-150mg de material

vegetal fresco macerado en nitrógeno líquido adicionando 1mL de ácido 5-sulfosalicílico

3% (p/v) y colocando en agitación a 150rpm durante 60min. Luego de esto, los tubos fueron

centrifugados a 14000 rpm durante 5min recuperando el sobrenadante. La determinación

de la cantidad de prolina fue realizada mediante ninhidrína ácida y tolueno haciendo lectura

de la fase orgánica a 520nm (Bates, Waldren y Teare, 1973).


maximum

17

▪ Peroxidación de lípidos

Fue determinada mediante la detección de especies reactivas del ácido tiobarbitúrico

(TBARS – tiobarbirutic acid reactive substances) empleando ácido tricoloacético (TCA

0,1%) y ácido tiobarbitúrico (TBA 0,5%) siguiendo el método descrito por Jambunathan

(2010). La concentración de malondialdehido (MDA) se calculó empleando la ecuación de

Beer-Lambert mediante el coeficiente de extinción del MDA 155mM-1cm-1.

▪ Concentración de pigmentos fotosintéticos

Esta fue estimada empleando el método descrito por Hiscox e Israelstam, (1979) mediante

extracción con dimetilsulfoxido (DMSO - Sigma®) y empleando las ecuaciones de descritas

por Wellburn (1994).

▪ Análisis estadístico

Los datos fueron procesados, tratados y analizados empleando los programas IBM SPSS

Statistics (Ver. 22.0.0.0) y EXCEL 2016 (Microsoft®). El análisis estadístico se realizó

mediante ANOVA seguida de una clasificación de medias con test de Dunnett para

comparar los tratamientos con su control, y finalmente una identificación de subgrupos

mediante Tuckey HSD.

1.3 Resultados y Discusión

1.3.1 Caracterización de microorganismos de los consorcios bacterianos

De los aislamientos obtenidos solo el 22,7% fue capaz de crecer a 40°C±2 en un rango de

actividad de agua (Aw) entre 0,847-0,919, obteniendo el mismo porcentaje de



microorganismos para el rango entre 0,951-0,971Aw. El 54,5% restante tan solo toleró un

Aw de hasta 0,986. Respeto a las actividades promotoras del crecimiento vegetal el 22,7%

de los aislamientos presentó la capacidad de solubilizar fosfato tricálcico, el 77,3%

presentó la capacidad de producir sideróforos, mientras todos los aislamientos presentaron

la capacidad de producir compuestos indólicos (Tabla 1-2).

Respecto a la cantidad de células viables producidas en los consorcios evaluados el

consorcio XT presentó aproximadamente 2x108 UFC/mL (DO600nm aprox.= 0,5), el

consorcio XB 6x105 UFC/mL (DO600nm aprox.= 0,02) y el consorcio XA 2x109 UFC/mL

(DO600nm aprox.= 0,5).

Tabla 1-2. Características asociadas a las cepas componentes de los tres consorcios

obtenidos de la rizósfera de Panicum maximum

Consorcio

SOR (Aw40°C) Cepa Morfología

Actividad PGPR

P AIA Sid

XT 520 (0,847) XT 13 Bacilo G+ + + +

405 (0,919) XT 14 Bacilo G+ + + +

520 (0,847) XT 17 Bacilo G+ + + +

405 (0,919) XT 38 Bacilo G+ + + +

405 (0,919) XT 110 Bacilo G+ + + +

XB 85 (0,986) XB 11 Bacteria filamentosa G+ - + +

135 (0,971) XB 13 Bacteria filamentosa G+ - + +


235 (0,951) XB 31 Bacteria filamentosa G+ + + +





85 (0,986) XB 32 Bacteria filamentosa G+ + + +

XA 85 (0,986) XA 32 Bacilo G- + + -

85 (0,986) XA 31 Bacilo G- - + -


maximum

19

85 (0,986) XA 12 Bacilo G- - + +

85 (0,986) XA 13 Bacilo G- + + +

85 (0,986) XA 23 Bacilo G- - + +

85 (0,986) XA 11 Bacilo G- - + -

85 (0,986) XA 21 Bacilo G- - + -

85 (0,986) XA 33 Bacilo G- - + -

SOR: concentración máxima D-sorbitol g/L a 40°C que toleraron las cepas. Aw: actividad de agua teórica del D-sorbitol (g/L) a 40°C. Morfología: G+: Gram positivo. G-: Gram negativo. P: solubilización de fosfato. +: halo de solubilización de Ca3PO4 en medio NBRIP. AIA: producción de ácido indol acético. +: coloración rosa-rojo. Sid: producción de sideróforos. +: halo de pigmentación naranja en medio CAS.

1.3.2 Efecto de consorcios bacterianos en la mitigación del estrés por sequía

▪ Peso seco y altura de las plantas

Luego de 10 días de la suspensión de la irrigación las plantas vieron afectado

significativamente su desarrollo disminuyendo su altura en 30,2% y producción de biomasa

en 61,3% en relación al control absoluto (Figura 1-1). En relación con los resultados

obtenidos, los mecanismos de adaptación de las plantas al estrés se basan en optimizar

recursos como nutrientes, uso de agua, ajustes osmóticos y la respuesta del sistema

antioxidante (Mahajan & Tuteja, 2005). Dentro de los efectos más reportados se

encuentran la disminución tanto de la altura como de la tasa de reproducción celular, que

conlleva a la perdida de biomasa, estos permiten a la planta enfocar el uso de nutrientes a

funciones asociadas con tolerar el estrés. Adicionalmente, la disminución de biomasa

contribuye con la reducción del área de traspiración lo que minimiza la perdida de agua en

la planta (Ngumbi & Kloepper, 2016; Rojas-Tapias et al., 2012).

Las plantas tratadas con el consorcio XT presentaron una mayor producción de biomasa

(48,9%) y mayor altura (14,1%) al ser comparadas con el control de sequía (Figura 1-1).

Este efecto ha sido observado en diversos estudios donde la aplicación de PGPR ha

mitigado los efectos de la sequía, involucrando una reducción significativa en la perdida de

biomasa y altura de la planta en gramíneas como maíz y trigo, además de cultivos de soya



y frijol, entre otros (Kavamura et al., 2013; Kumar et al., 2016; Naveed, Hussain, et al.,

2014; Naveed, Mitter, Reichenauer, Wieczorek, & Sessitsch, 2014; Young et al., 2015).

Figura 1-1. Efecto de la aplicación de consorcios bacterianos sobre el crecimiento de plantas de P. maximum sometidas a déficit hídrico.

A) Peso seco foliar. B) Altura de la planta. La media es la representación de 3 réplicas biológicas de n=20. Las barras de error representan ± desviación estándar. * corresponde a las diferencias p < 0,05 contra el Control de Sequía por Dunnett. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey.

Con relación a los resultados obtenidos, se pudo establecer que el consorcio XT presenta

la capacidad de mitigar el estrés hídrico sobre P. maximum bajo el diseño experimental de

este estudio. Lo anterior está fuertemente asociado con las diversas habilidades

promotoras de crecimiento vegetal exhibidas por los microorganismos, donde la

producción de compuestos indólicos, solubilización de fosforo y producción de sideróforos,

entre otros, han sido asociados con la mitigación de los efectos de la sequía compensando

la perdida de biomasa y promoviendo la elongación de las plantas en diferentes cultivos

(Kavamura et al., 2013; Khan, Bano, & Babar, 2016; Rojas-Tapias et al., 2012).


maximum

21

▪ Actividades enzimáticas antioxidantes

A pesar que no pudieron establecerse diferencias (p>0,05) en la actividad enzimática

antioxidante APX debido a la variabilidad de los datos, puedo observarse una tendencia

de un incremento de entre 25-30% en esta actividad cuando las plantas se encontraban

tratadas con los consorcios (Figura 1-2). Ha sido reportado que la inoculación de PGPR

puede modular los mecanismos adaptativos de la planta en respuesta al estrés, donde

estas rizobacterias pueden estimular diversas actividades enzimáticas antioxidantes

incluyendo la APX, como en el caso de plantas de Solanum tuberosum tratadas con PGPR

las cuales pudieron tolerar y mitigar los efectos del estrés producido por metales pesados

y sequía (Gururani et al., 2013; Ngumbi & Kloepper, 2016).

En contraste, la actividad enzimática antioxidante GR se vio fuertemente estimulada bajo

condiciones de estrés incrementando significativamente su valor en 310% en relación al

control absoluto (plantas estresadas no inoculadas). Descartando el hecho de que no

pudieron establecerse diferencias estadísticamente significativas (p>0,05) entre la

inoculación de los consorcios y el control de sequía para esta actividad enzimática, se

identificó una tendencia a la disminución de aproximadamente un 25% en plantas

inoculadas con el consorcio XT (Figura 1-2). Lo anterior ha sido asociado en otros estudios

con la habilidad de los microorganismos con potencial de mitigación de sequía, de reducir

los niveles de actividades enzimáticas antioxidantes como la GR (E. Armada, Portela,

Roldán, & Azcón, 2014; Elisabeth Armada, Roldán, & Azcon, 2014) .



Figura 1-2. Efecto de la aplicación de consorcios bacterianos sobre las actividades enzimáticas antioxidantes APX y GR en plantas de P. maximum sometidas a déficit hídrico.

A) Ascorbato Peroxidasa – APX. B) Glutatión Reductasa - GR. La media es la representación de 3 réplicas biológicas de n=9. Las barras de error representan ± desviación estándar. * corresponde a las diferencias p < 0,05 contra el Control de Sequía por Dunnett. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey (5%).

Con base en la información de las plantas no tratadas con consorcios bacterianos,

encontramos que este estudio podría ser el primero en Colombia en describir la respuesta

antioxidante de plantas de P. maximum bajo sequía. Se pudo observar que la respuesta

enzimática antioxidante APX parece no verse influenciada de manera significativa por las

condiciones de estrés impartidas, sin embargo, la actividad enzimática GR se incrementa

de manera significativa en las plantas en presencia del estrés. Lo anterior podría significar

que el pasto Guinea bajo condiciones de sequía, estaría empleando altas concentraciones

de ascorbato no destinado a la actividad APX, el cuál es restaurado a partir de la actividad

enzimática GR lo cual justifica el incremento de esta actividad en plantas estresadas.

De forma especulativa, el uso de estos altos niveles ascorbato estarían generando

monodehidroxiascorbato (MDHA), este al no ser restaurado a ascorbato por la MDHA-

reductasa sufriría una deprotonación no-enzimática a dehidroxiascorbato (DHA) siendo

sustrato de la DHA-reductasa la cual lo transforma en ascorbato involucrando el trabajo de

la enzima GR (Habibi, 2014; Saed-Moucheshi et al., 2014).


maximum

23

Lo anterior estaría ocurriendo dado que las cantidades de ascorbato usado para control

enzimático y no-enzimático de H2O2 coparían la capacidad de restauración de ascorbato

de la MDHA-reductasa (MDHAR) donde el MDHA restante sería utilizado por la DHA para

restaurar los niveles de ascorbato en respuesta al estrés. Se ha descrito que en plantas

donde los niveles de la actividad enzimática GR se incrementa debido a la presencia del

estrés por sequía, también lo hace significativamente la actividad MDHAR. (Timmusk et

al., 2014, 2015).

▪ Peroxidación de lípidos y acumulación de prolina

La peroxidación de lípidos en las plantas sometidas a estrés está asociada con el daño

producido a la membrana, específicamente con la peroxidación de los ácidos grasos poli-

insaturados (PUFAs - polyunsaturated fatty acids) produciendo subespecies reactivas que

afectan DNA y proteínas (Habibi, 2014). Se pudo observar que el estrés por sequía genera

un aumento significativo de 370% la concentración de TBARS en plantas no tratadas con

consorcios en relación al control absoluto no estresado (Figura 1-3). En este estudio no

pudieron establecerse diferencias (p>0,05) asociadas a la producción de TBARS en las

plantas tratadas con los diferentes consorcios bacterianos frente al control de sequía.

Caso contrario se observó en la acumulación de prolina, donde pudo establecerse que las

plantas exhibieron una acumulación de 39,9-veces más prolina en el tejido de plantas

sometidas a sequía en relación al control absoluto (Figura 1-3). La acumulación de prolina

es una estrategia adoptada por las plantas, la cual les permite realizar el ajuste osmótico,

estando implicada en la protección de membranas y macromoléculas (Azarmi, Mozafari,

Abbaszadeh Dahaji, & Hamidpour, 2016; Saed-Moucheshi et al., 2014). Lo anterior

demuestra que la acumulación de este osmolito compatible hace parte importante de la

estrategia de P. maximum en la respuesta a estrés por sequía.

En relación, a pesar que la acumulación de prolina no demostró diferencias significativas

en las plantas tratadas con los consorcios, se pudo observar una tendencia en plantas



tratadas con los consorcios individuales XA, XB y XT los cuales presentaron disminuciones

de 35,5%, 31,6% y 14,8% respectivamente (sin diferencias significativas) bajo las

condiciones evaluadas.

Relacionado con lo anterior, plantas de trébol blanco (Trifolium repens L.) tratadas con B.

thurigensis y B. megatherium demostraron acumular menos prolina que el control

estresado bajo condiciones de sequía (Ortiz, Armada, Duque, Roldán, & Azcón, 2015). De

forma especulativa, la disminución de la intensidad de la concentración de prolina esté

posiblemente relacionada con un mecanismo de mitigación donde los consorcios

bacterianos donde se disminuye la necesidad de la síntesis de este osmolíto en respuesta

al estrés.

Figura 1-3. Efecto de la aplicación de consorcios bacterianos sobre la concentración de

prolina foliar y la peroxidación de lípidos en plantas de P. maximum sometidas a déficit

hídrico.

A) Concentración de prolina foliar. B) Peroxidación de lípidos (daño a membrana). La media es la representación de 3 réplicas biológicas de n=9. Las barras de error representan ± desviación estándar. * corresponde a las diferencias p < 0,05 contra el Control de Sequía por Dunnett. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey (5%).

▪ Pigmentos fotosintéticos

No se establecieron diferencias (p>0,05) en las cantidades de clorofila total (a+b) y clorofila

a producida en las plantas vinculadas a los diferentes tratamientos. En contraste, se

observó un aumento significativo en la cantidad de clorofila b encontrada en los tejidos de


maximum

25

plantas no inoculadas estresadas por sequía, indicando una síntesis elevada de esta bajo

condiciones de estrés. En relación, el consorcio XT mostró una cantidad similar de clorofila

b a la sintetizada bajo condiciones de irrigación (control absoluto), sin diferencias

significativas (p>0,05) con el control de sequía (Tabla 1-3).

Tabla 1-3. Pigmentos fotosintéticos en plantas de Panicum maximum inoculadas con consorcios bacterianos

Tratamiento Chl Total Chl a Chl b Carotenoides (x+c)

mg/mL/g de peso fresco

XA 263,77±36,92 a 174,94±30,50 a 88,83±20,06 ab* 88,88±14,80 b*

XB 277,13±64,81 a 186,08±36,88 a 91,04±30,21 ab* 82,66±16,93 bc*

XT 273,14±26,14 a 191,79±27,15 a 81,35±21,51 a* 104,11±14,14 ab

XA +XB 282,55±73,60 a 191,60±55,43 a 84,77±15,20 ab* 97,86±24,72 ab

XB +XT 268,26±48,42 a 192,07±12,62 a 90,17±15,31 ab 94,04±10,09 ab*

XA + XT 299,14±62,55 a 216,48±42,13 a 88,03±16,75 ab* 101,13±16,32 ab

XA + XB + XT 284,29±103,05 a 200,01±62,57 a 88,04±33,75 ab* 100,42±26,77 ab

Control Absoluto 298,64±68,37 a 230,74±56,37 a 78,43±13,07 b* 58,38±10,17 c*

Control Sequía 346,67±73,19 a 218,65±56,08 a 118,74±30,53 a 118,72±21,34 a

Chl= clorofila. La media es la representación de 3 réplicas biológicas de n=9. ± desviación estándar. * corresponde a las diferencias p < 0,05 contra el Control de Sequía por estadístico de Dunnett. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey (5%).

La síntesis de carotenoides se vio incrementada en 103,3% en las plantas bajo condiciones

de sequía en comparación con el control absoluto. Se observó una disminución significativa

(p<0,05) en la concentración de carotenoides observada en plantas tratadas con los

consorcios XA (-25,1%), XB (-30,4%), y el control absoluto (-50,8%) en comparación con

las plantas del control de sequía por el test de Dunnett. En contraste, los consorcios

inoculados no presentaron diferencias entre sí en la estimulación de la síntesis de

carotenoides (Tabla 1-3).

La síntesis de carotenoides ha sido adoptada por diversas plantas como una respuesta

asociada en combatir los efectos deletéreos de diferentes estreses, entre ellos la sequía



debido a que los carotenoides se utilizan al igual que la prolina como antioxidantes de bajo

peso molecular ayudando a contrarrestar los efectos deletéreos de las especies reactivas

del oxígeno que se producen durante la adaptación de la planta al estrés (R. Ahmad, Lim,

& Kwon, 2013; Pandey, Pandey, Prasad, & Böhmer, 2016). A pesar que la inoculación con

PGPR ha demostrado promover la síntesis de carotenoides en las plantas empleando su

actividad antioxidante a favor de la planta mitigando la perdida de biomasa (Elisabeth

Armada, Azcón, López-Castillo, Calvo-Polanco, & Ruiz-Lozano, 2015; Chakraborty,

Chakraborty, Chakraborty, & Dey, 2013), en este estudio se observó lo contrario,

encontrando menos concentración de estos en relación a la inoculación de consorcios

bacterianos bajo condiciones de sequía.

Basados a los resultados obtenidos en el estudio, podemos establecer que P. maximum

podría estar empleando la acumulación de altas concentraciones de prolina y carotenoides

como mecanismo no-enzimático de control de las especies reactivas del oxígeno para

contrarrestar los efectos deletéreos de la sequía.

Fue interesante observar que a pesar de no presentarse diferencias marcadas en la

respuesta enzimática antioxidante APX, así como en las no-enzimáticas prolina y

carotenoides de las plantas sometidas a sequía, se observó un efecto en las respuestas

morfológicas de producción de biomasa y elongación de las plantas tratadas con el

consorcio XT.

Lo anterior nos permitió deducir que tal vez este consorcio bacteriano estaría modulando

la respuesta al estrés mitigando así su efecto sobre P. maximum en relación a la reducción

de síntomas fisiológicos observados. En esta interacción planta-consorcio se observaron

una serie de tendencias de las variables medidas, las cuales puede que estén relacionadas

con la producción de biomasa y la elongación de las plantas. De hecho, se observó que

los valores de las tendencias se encontraron en un punto intermedio de aquellos

encontrados en las plantas del control de sequía y el absoluto. Esto último, indicaría que

la respuesta al estrés por parte de la planta habría variado por la intervención del consorcio


maximum

27

y en relación a variables que no fueron medidas sustentando la mayor producción de

biomasa observada.

De forma especulativa sobre los posibles mecanismos implicados no determinados en el

estudio, se estaría dando la modulación del ciclo ascorbato-glutatión sustentado en el

incremento de la actividad GR detectada en plantas bajo estrés tanto inoculadas con el

consorcio XT, como aquellas usadas como control. Esto podría estar asociado a un

incremento en las concentraciones de ascorbato y glutatión reducido (GSH) como parte

del ciclo Halliwell- Asada (APX-GR). Dado que la actividad enzimática APX no se vio

estimulada en relación a la inoculación de los consorcios bacterianos, la cantidad de

ascorbato que especulativamente se estaría restaurando por la actividad de la enzima GR

se estaría empleando en la desactivación o “quenching” directo de las especies reactivas

del oxígeno además de su función asociada a ser sustrato de la enzima APX (Renata

Szymanska, Dariusz Latowski, 2014).

Como no pudo establecerse una relación entre la aplicación de los consorcios sobre la

disminución en la peroxidación de lípidos (daño a membrana) producidos por el estrés,

podría especularse sobre una reducción de la severidad de impacto de los radicales

lipídicos libres sustentado en la mitigación de la perdida de biomasa en las plantas tratadas

con el consorcio XT.

Se ha reportado que bajo condiciones de estrés la inoculación con PGPR la concentración

de tocoferoles se incrementa en la planta (Salomon, Purpora, Bottini, & Piccoli, 2016). Los

tocoferoles (vitamina E) están relacionados con la reducción del impacto de radicales

lipídicos libres sobre el ADN y las proteínas en las plantas, donde al interactuar con los

radicales lipídicos libres el tocoferol se convierte en radical tocoferoxilo. Lo anterior estaría

relacionado con la especulación del incremento de la concentración de ascorbato en la

planta donde éste, estaría cumpliendo la función de restaurar el radical tocoferoxilo a

tocoferol.



Para sustentar lo anterior, se pudieron haber determinado la concentración de ascorbato y

las actividades enzimáticas MDHAR y DHAR asociadas a la restauración de las

concentraciones del ascorbato. Donde al observarse un incremento en estas como

respuesta a los consorcios se hubiese podido relacionar con un aumento del uso del

ascorbato en el control no-enzimático de los efectos de la sequía.

Finalmente, la inoculación de consorcios con potencial como el XT (BAFEs), podría estar

modulando la producción de carotenoides, acumulación de prolina, ascorbato, glutatión,

así como promoviendo la actividad enzimática GR, al interactuar con la planta mucho antes

de que se presente el episodio de sequía estimulando el sistema de protección basal de la

planta permitiéndole reaccionar de manera mucho más eficiente cuando es enfrentada al

estrés reduciendo significativamente el impacto de este sobre su desarrollo (diferencias en

biomasa y elongación).

En relación a esto último, se seleccionó al consorcio XT debido a su potencial de mitigación

se sequía observado los resultados exhibidos, adicionalmente este consorcio supera a los

demás tratamientos en su capacidad xerotolerante soportando la más baja disponibilidad

de agua (Aw) y por presentar todas habilidades promotoras del crecimiento vegetal in vitro

medidas.

A pesar de contar con condiciones semi-controladas durante el experimento, variaciones

en condiciones como la temperatura y la humedad relativa del invernadero pudieron influir

en el desarrollo de las plantas, lo cual podría explicar la varianza observada entre

experimentos para las actividades enzimáticas antioxidantes, principalmente en la

presencia de consorcios bacterianos. Esto corrobora la dificultad de establecer la

interacción de 22 microorganismos en diferentes combinaciones de consorcios donde la

interacción microorganismo-planta-ambiente es un tema que requiere todavía de una

investigación más detallada debido a las incógnitas que aun presenta este tema.


maximum

29

1.4 Conclusiones

Se identificó un grupo de cinco BAFES pertenecientes al consorcio XT con potencial en la

mitigación del estrés por sequía sobre Panicum maximum bajo condiciones de

invernadero, donde una posible interacción entre sus habilidades de tolerancia al estrés,

promoción de crecimiento vegetal y modulación de la percepción del estrés en la planta lo

señalaron como un principio activo con potencial de aplicación en nuevas biotecnologías

agropecuarias.

Pudo identificarse como P. maximum modula la respuesta al estrés por sequía bajo las

condiciones evaluadas, aplicando mecanismos de adaptación como el incremento

significativo de la actividad glutatión reductasa, la acumulación de prolina foliar y el

aumento en la síntesis de carotenoides. En relación, cabe resaltar que hasta el momento

en Colombia no se existían reportes de las estrategias de control antioxidante (enzimáticas

y no-enzimáticas) de la planta bajo estas condiciones de estrés.

A nuestro conocimiento, este es el primer trabajo en Colombia describir el efecto de

diferentes consorcios bacterianos asociados a Panicum maximum y la identificación de su

potencial en la mitigación de los efectos deletéreos de la sequía sobre el desarrollo de la

planta.

2. Efecto de la adición de D-sorbitol como agente simulador de sequía en plantas de Panicum maximum tratadas con un consorcio de bacterias xerotolerantes

2.1 Introducción

La sequía representa uno de los mayores problemas a nivel mundial en relación a los

efectos del cambio climático que generan un aumento en la severidad de los estreses

abióticos asociados a diversos cultivos (Kumar et al., 2016; Pandey et al., 2016). Ésta

presenta diferentes definiciones respecto al ámbito donde es interpretada, desde sequía

meteorológica definida como la ausencia de precipitación en un área geográfica, pasando

por la socio-económica asociada a la disponibilidad de sistemas relacionados al

abastecimiento del recurso hídrico para cumplir las demandas de una población, llegando

a la sequía agronómica la cual se define como el período donde la cantidad de agua

disponible en el suelo (humedad) se ve reducida impactando significativamente la

producción de los cultivos (Ngumbi & Kloepper, 2016).

Esta última clasificación de sequía definida agronómicamente, requiere de una atención

importante en el ámbito de investigación básica y aplicada para definir estrategias efectivas

que permitan la mitigación de los efectos deletéreos producidos por este estrés.

La investigación del déficit hídrico bajo parámetros controlados presenta una alta

importancia, debido a que permite establecer líneas base para observar el comportamiento

de diferentes especies vegetales. En relación, el uso de estresores osmóticos como el D-

sorbitol y el polietilenglicol (PEG) para simular la sequía mediante la reducción de la

disponibilidad de agua en un medio líquido ha sido una estrategia bien estudiada en plantas

32 Mitigación de sequía sobre Panicum maximum mediante consorcios


y microorganismos (Gopal & Iwama, 2007; Hsu & Kao, 2003; Legocka & Sobieszczuk-

Nowicka, 2011; Wu, Feng, Liang, Yuan, & Sun, 2014). De hecho, el uso de D-sorbitol en

plantas de almendro (Prunus L. spp.) permitió seleccionar variedades tolerantes a sequía

bajo condiciones de estrés simulado (Sorkheh, Shiran, Khodambshi, Rouhi, & Ercisli,

2010). La aplicación de estresantes como sorbitol, manitol, NaCl y peróxido de hidrógeno

en Arabidopsis thaliana incrementó la expresión de genes marcadores asociados con la

regulación de niveles de estrés oxidativo (NAC032 y AKR4C9), ácido abscísico (ABA)

(CYP707A3 y NCED3), deshidratación (LEA5, RD29B, y DREB2A) y de respuesta a

estreses moderados (ERF5, WRKY33, y MYB51) (Claeys, Van Landeghem, Dubois,

Maleux, & Inzé, 2014).

La simulación de estrés por sequía mediante D-sorbitol ha demostrado influenciar las

actividades antioxidantes de diversas plantas como maíz (Kolarovič, Valentovič, Luxová, &

Gašparíková, 2009), papa (Gopal & Iwama, 2007) y pepino (Abu-Romman & Suwwan,

2012), permitiendo observar en ventanas reducidas de tiempo de entre 48h a 90 días los

efectos de la sequía en comparación con una exposición directa al estrés, donde el

comportamiento del sistema enzimático antioxidante varía dependiendo del cultivo.

Considerando lo anterior, se plantearon dos objetivos para este experimento: (1) describir

las características morfo-fisiológicas generadas bajo un modelo artificial de simulación de

sequía con D-sorbitol para Panicum maximum y (2) determinar el efecto de la aplicación

de un consorcio de 5 cepas de Bacillus spp., sobre la mitigación de los síntomas morfo-

fisiológicos generados en la planta bajo condiciones de estrés simulado.

2.2 Materiales y Métodos

2.2.1 Multiplicación de Microorganismos y Material Vegetal

Los microorganismos pertenecientes al consorcio bacteriano XT fueron proporcionados

por la Colección de Microorganismos con Potencial Biofertilizantes ubicado en el

Laboratorio de Microbiología Agrícola - Centro de Investigación Tibaitatá de la Corporación

Efecto de la adición de D-sorbitol como agente simulador de sequía en plantas

de Panicum maximum tratadas con un consorcio de bacterias xerotolerantes

33

Colombiana de Investigación Agropecuaria (CORPOICA). Estos fueron reconstituidos en

medio Tripticasa de Soya (Merck®) a partir de viales en crioconservación a -80°C e

incubados a 30°C ± 2 por 24h previas a su uso.

Se emplearon semillas de Panicum maximum (SEMICOL®) a las cuales se les evaluó su

porcentaje de germinación mediante recuento en cámara húmeda durante 5 días. Para su

uso en los ensayos gnoctobióticos se realizó un protocolo de desinfección estándar de

3min hipoclorito 5% (v/v), 2min etanol 70% (v/v) y triple lavado en agua destilada estéril

(Rojas-Tapias et al., 2012) seguido de un secado en cámara de flujo vertical.

2.2.2 Caracterización de microorganismos

Se prepararon los inóculos de los 5 aislamientos a partir de una colonia aislada de cada

una de las bacterias previamente reconstituidas en Agar Tripticasa de Soya (TSA Merck®),

y se inocularon en 10mL de Caldo Tripticasa de Soya (TSB Merck®) por separado, y

llevaron a incubar a 30°C ± 2 durante 24h a 48h. Luego de esto se centrifugaron a 7000

rpm por 10min y se realizaron lavados en NaCl 0,85% estandarizando la concentración de

cada bacteria a DO600nm= 0,5.

▪ Caracterización molecular

La identificación de los 5 aislamientos se realizó por secuenciación del gen 16S rRNA. Se

realizó la extracción de DNA a partir de cultivos líquidos de 24h empleando el UltraClean®

DNA Isolation Kit (Mobio Laboratories, Inc.). El set de iniciadores empleado fue 1492R (5’

TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T 3’) y 27F (5’ AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG 3’)

(Weisburg, Barns, Pelletier, & Lane, 1991). Para la PCR se empleó el PCR Supermix Kit

(Invitrogen, Brasil) adicionando 2µl de DNA extraído. Las condiciones de PCR fueron las

siguientes: 5min a 95°C, seguido por 35 ciclos de 45s a 95°C, 45s a 55°C y 1,5min a 72°C,

y finalmente un ciclo de 10min a 72°C. Los productos de PCR fueron analizados en un gel

de electroforesis de agarosa 1% (p/v). Las muestras fueron secuenciadas por Macrogen

Inc. por el método Sanger. Las secuencias consenso fueron generadas mediante la



plataforma Mobyle@Pasteur (Neron et al., 2009) y comparadas contra bases de datos

curadas de 16S rRNA.

▪ Actividad ACC-deaminasa

La actividad fue cuantificada mediante la determinación de la cantidad de α-cetobutirato

producido por la deaminación del ACC (ácido 1-aminociclopropano-1-carboxílico) por la

enzima ACC deaminasa midiendo la absorbancia a 540nm, extrapolando los datos contra

una curva de ácido α-cetobutírico (Sigma®) como lo describieron Honma y Shimomura

(1978) y Penrose y Glick, (2003). Se produjeron suspensiones celulares a partir de cultivos

líquidos de 24h crecidos en Caldo Tripticasa de Soya (TSB Merck®) recuperadas por

centrifugación a 7000 rpm por 10min, reconstituyendo el pellet en solución salina. La

permeabilización de las células para permitir el ingreso del ACC, se realizó agregando 600

µL de Tris-HCl 100mM pH 8,5 y 30µL de tolueno mezclando en vórtex por 30s. Luego de

1h de incubación a 4°C, las células lisadas fueron centrifugadas a 12000 rpm por 10min y

se removió el tolueno. Las suspensiones de células permeabilizadas fueron utilizadas para

determinar la actividad enzimática junto con la cuantificación de proteína total por el

reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich®) con el fin de calcular el rendimiento enzimático por

mg de proteína producida por el microorganismo.

▪ Producción de compuestos indólicos

La determinación de ácido indol acético (AIA) se realizó mediante técnica colorimétrica

descrita por Gordon y Weber (1951) con algunas modificaciones. Se tomaron alícuotas de

100µL de cada bacteria ajustando su concentración a DO600nm=0,1 y se inocularon en 5mL

de medio TSB suplementado con L-Triptófano 5mM en oscuridad. Luego de 48h de

incubación a 30°C ± 2, las células se recuperaron por centrifugación (10.000rpm por 5min)

y se agregaron 750µL de sobrenadante a 750µL de reactivo de Salkowski (12 g/L FeCl3 en

7.9 M H2SO4). La reacción se llevó a cabo en oscuridad por 30min. Se determinó su

absorbancia a 530nm y la concentración de compuestos indólicos se calculó contra una

curva patrón de ácido indolacético (Merk®). Se determinó el contenido total de proteína por

el reactivo de Bradford (Sigma-Aldrich®) con el fin de calcular el rendimiento en la

producción de índoles por mg de proteína producida por el microorganismo.



35

▪ Determinación cuantitativa de solubilización de fosfatos

La detección se realizó empleando 5mL de medio NBRIP (1% glucosa; 0.5% Ca3(PO4)2;

0.5% MgCl2·6H2O; 0.02% KCl; 0.025% MgSO4·7H2O; 0.01% (NH4)2SO4) inoculado con

100µL de las suspensiones celulares bacterianas estandarizadas a OD600 = 0.5 preparadas

en NaCl (0.85%). Cada bacteria fue incubada por 15 días con 200 rpm de agitación y a

30°C ± 2. Luego de la incubación, se tomó 1mL de muestra y se centrifugo a 14000 rpm

por 5min. Se recuperó el sobrenadante para determinar la concentración de fósforo soluble

mediante el método de azul de fosfomolibdato a 712nm (Watanabe & Olsen, 1965)

siguiendo el protocolo del Kit SpectroQuant® (Merck®). La curva de calibración se realizó

empleando K2HPO4 (Merck®). Se determinó el contenido total de proteína por el reactivo

de Bradford (Sigma-Aldrich®) con el fin de calcular el rendimiento en la solubilización de

fosfato por mg de proteína producida por el microorganismo.

▪ Producción de exopolisacáridos (EPS)

La cantidad de EPS producida se evaluó determinando la concentración de azucares luego

de una digestión en medio ácido, acorde a lo descrito por Zhang and Fang, (2001) con

modificaciones de cultivo en medio TSB a 30°C ± 2 por 24h a 200 rpm de agitación orbital.

La extracción se realizó mediante la adición de EDTA 0.26M y NaCl 5M, centrifugando a

8000 rpm por 20min, seguido por recuperación del sobrenadante con adición de etanol frío

(-86°C) y centrifugación de nuevo. La determinación se realizó mediante la adición de

Fenol 5%(p/v) y H2SO4 98% seguida por un período de estabilización de 20min a 30°C ± 2

y por último lectura a 490nm, extrapolando los resultados contra una curva de D-glucosa

(Merck®). Se determinó el contenido total de proteína por el reactivo de Bradford (Sigma-

Aldrich®) con el fin de calcular el rendimiento en la producción de EPS por mg de proteína

producida por el microorganismo.

▪ Efecto del estrés simulado in vitro sobre las actividades PGPR de los microorganismos del consorcio XT

Con el objetivo de determinar el efecto del estrés simulado en la planta sobre el desempeño

de las actividades PGPR de los microorganismos, a cada uno de los 5 Bacillus sp., y su

consorcio (XT), se les determinaron sus habilidades de sintetizar EPS, solubilizar fosforo

a partir de Ca3PO4 y producir compuestos indólicos (AIA) bajo estrés producido por D-



sorbitol (Sigma-Aldrich®) al 0mM (control) y 200mM (estrés simulado). Se siguieron las

metodologías de determinación acorde a lo descrito previamente para cada una

suplementando los medios de cultivo respectivos con la concentración de D-sorbitol

correspondiente. En cada ensayo se determinó el contenido total de proteína por el reactivo

de Bradford (Sigma-Aldrich®) con el fin de calcular el rendimiento en cada una de las

actividades PGPR por mg de proteína producida por cada microorganismo.

2.2.3 Experimento 1: Simulación de estrés por sequía en plántulas de Panicum maximum

Se realizaron 3 repeticiones en el tiempo bajo condiciones de invernadero empleando 144

alvéolos de plántulas de 20 días (entre 3 y 5 por alvéolo) en dos bandejas de 72 alvéolos

mantenidas en sustrato estéril vermiculita y arena en relación 2:1. Se realizó irrigación por

suministro de 500mL de agua a la bandeja cada 48h, la fertilización se realizó con solución

de Hoagland al 50% una vez por semana aplicándola a la bandeja. Cuando alcanzaron los

20 días de desarrollo las plántulas de los alvéolos se removieron y se realizaron lavados

suaves de su raíz en agua destilada estéril con el fin de remover el sustrato adherido que

pudiera interferir con la interacción de la solución de D-sorbitol.

Los tratamientos consistieron en cuatro concentraciones de D-Sorbitol (Sigma-Aldrich®)

0mM, 100mM, 200mM y 300mM preparadas en agua destilada estéril (Claeys et al., 2014;

Jain, Tiwary, & Gadre, 2010). En cada tratamiento se utilizaron 10 plántulas (por repetición

del experimento) sumergiendo su raíz en 150mL de cada una de las cuatro

concentraciones de D-sorbitol en frascos ámbar de 500mL. Luego de 48h de contacto con

la solución de simulación de estrés, todas las plántulas fueron retiradas de las soluciones

respectivas y se colectaron sus hojas procesándolas en nitrógeno líquido hasta obtener un

polvo fino y homogéneo. Para cada tratamiento se determinaron las actividades

enzimáticas antioxidantes APX y GR, además de la concentración de prolina y

peroxidación de lípidos en los tejidos.



37

2.2.4 Experimento 2: Efecto de la inoculación del consorcio XT sobre plántulas de Panicum maximum sometidas a estrés simulado

Se realizaron 3 repeticiones en el tiempo del experimento bajo condiciones de invernadero

empleando 144 alvéolos de plántulas (entre 3 y 5 por alvéolo) de 20 días inoculadas luego

de emergencia 1mL del consorcio de los cinco Bacillus spp. por alvéolo. Las plantas fueron

mantenidas en el mismo sustrato y bajo las mismas condiciones de fertilización empleadas

en el experimento anterior.

Los tratamientos consistieron en tres concentraciones de D-Sorbitol (Sigma-Aldrich®) 0mM,

200mM y 300mM preparadas en agua destilada estéril (Claeys et al., 2014; Jain et al.,

2010). La distribución de plántulas su manipulación y actividades evaluadas sobre los

tejidos siguieron el mismo procedimiento explicado en la segunda parte del experimento

anterior. No se evaluó la concentración de 100mM debido a que no presentó los efectos

de simulación de sequía esperados en el experimento 1.

▪ Determinación de actividades enzimáticas antioxidantes

El extracto vegetal se realizó empleando 100 - 150mg de tejido vegetal fresco macerado

en nitrógeno líquido, adicionando 2mL de buffer Fosfato de Potasio 0,2M pH 7,5

suplementado con 0,1mM EDTA y homogenizando en vórtex por 5 segundos. Los

microtubos fueron centrifugados a 14000xg por 20min a 4°C, recuperando 1mL de

sobrenadante en un microtubo de 1,5mL manteniendo fríos los extractos en cama de hielo.

La determinación de la actividad Ascorbato Peroxidasa - APX (EC 1.11.1.11) se realizó

acorde al protocolo de Nakano y Asada (1981) empelando 890 µL de Buffer fosfato de

potasio 100mM (pH 7,5) suplementado con 0,1mM EDTA, 50µL de extracto vegetal, 50µL

de ascorbato 10mM, y finalmente 10µL peróxido de hidrógeno para iniciar la reacción

registrando la caída en la absorbancia a 290nm cada 10 segundos durante 3min. El cálculo

de la actividad se realizó empleando el coeficiente de extinción molar del ascorbato



reducido 2.8 mM /cm. La actividad Glutatión Reductasa - GR (EC 1.20.4.2.) se determinó

acorde con el protocolo de Smith et al., (1988) mediante la adición de 10μL de extracto

vegetal en 1ml de volumen final conteniendo 0.75mM DTNB (ácido 5-5'-ditiobis(2-

nitrobenzoico)), 0.1mM NADPH y 1mM GSSG (glutatión oxidado) donde se midió el

incremento en la absorbancia a 412nm en función a la reducción del DNTB a TNB (ácido

2-nitro-5-tiobenzoico) por el GSH (glutatión reducido) formado en la reacción. Se empleó

el coeficiente de extinción molar del TNB 14.15 M/cm.

▪ Determinación de Prolina

Se realizó un extracto vegetal de cada tratamiento empleando 100-150mg de material

vegetal fresco macerado en nitrógeno líquido adicionando 1mL de ácido 5-sulfosalicílico

3% (p/v) y colocando en agitación a 150rpm durante 60min. Luego, los tubos fueron

centrifugados a 14000 rpm durante 5min recuperando el sobrenadante. La determinación

de la cantidad de prolina fue realizada mediante la técnica de ninhidrína ácida y tolueno

haciendo lectura de la fase orgánica a 520nm descrita por Bates, Waldren y Teare, (1973).

▪ Peroxidación de lípidos

Fue determinada mediante la detección de especies reactivas del ácido tiobarbitúrico

(TBARS – tiobarbirutic acid reactive substances) empleando ácido tricoloacético (TCA

0,1%) y ácido tiobarbitúrico (TBA 0,5%) siguiendo el método descrito por Jambunathan

(2010). La concentración de malondialdehido (MDA) se calculó empleando la ecuación de

Beer-Lambert mediante el coeficiente de extinción del MDA 155mM-1cm-1.

▪ Análisis estadístico

Los datos fueron procesados, tratados y analizados empleando los programas IBM SPSS

Statistics (Ver. 22.0.0.0) y EXCEL 2016 (Microsoft®). El análisis estadístico se realizó

mediante ANOVA seguida de una clasificación de medias con test de Dunnett para



39

comparar los tratamientos con su control, y finalmente una identificación de subgrupos

mediante Tuckey HSD.

2.3 Resultados y Discusión

2.3.1 Caracterización de microorganismos xerotolerantes

Los aislamientos pertenecientes al consorcio XT fueron todos tolerantes a concentraciones

de D-sorbitol sobre los 400g/L (2200mM) e identificados molecularmente por

secuenciación del gen 16S rRNA como Bacillus spp. (Tabla 2-1).

A pesar que todas las cepas presentaron habilidades promotoras de crecimiento vegetal,

se destacó Bacillus sp., XT17 por su alta producción de EPS y compuestos indólicos,

mientras Bacillus sp., XT110 presentó una producción notable de compuestos indólicos y

solubilización de fósforo a partir de Ca3PO4 (Tabla 2-1). Ninguno de los aislamientos

presentó actividad ACC-deaminasa.

Tabla 2-1. Identificación y caracterización de las cepas bacterianas del consorcio XT

Cepa 16S rRNA (% similitud) PO4-3 AIA EPS ACCd

XT13 Bacillus subtilis (99) 0,60±0,04 c 76,56±16,12 c 0,50±0,01 bc Nd

XT14 Bacillus aryabhattai (99) 3,47±0,09 b 54,89±2,64 cd 0,36±0,03 c Nd

XT17 Bacillus amyloliquefaciens (99) 1,72±0,11 c 237,27±8,35 a 1,88±0,15 a Nd

XT38 Bacillus licheniformis (99) 0,98±0,01 c 35,31±2,01 d 0,67±0,10 b Nd

XT110 Bacillus aryabhattai (100) 11,13±1,44 a 159,55±16,36 b 0,52±0,04 bc Nd

PO4-3 (solubilización de fosfato): PO4

-3 µg/mg proteína. AIA (producción de índoles): AIA µg/mg proteína. EPS (producción de EPS): D-glucosa mg/mg proteína. ACCd (ACC-deaminasa): µmoles α-cetobutirato/h/mg proteína. Nd: no detectada. La media es la representación de n=3. ±: desviación estándar. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey (5%).



2.3.2 Simulación de estrés por sequía y mitigación de este estrés simulado mediante un consocio de Bacillus spp.

▪ Actividades antioxidantes

Los resultados mostraron que mediante la adición de D-sorbitol puede simularse

efectivamente el estrés por sequía en plántulas de P. maximum. Se observaron diferencias

significativas donde la concentración 300mM de D-sorbitol incrementó la actividad

enzimática APX en 67,0% en relación al control no estresado (0mM D-sorbitol) mientras

las concentraciones 100mM y 200mM no presentaron una estimulación marcada de la

actividad APX luego de 48h. En contraste, la actividad enzimática GR se vio estimulada

por las concentraciones de D-sorbitol 200mM y 300mM con incrementos del 61,8% y

66,6%, respectivamente, en relación al control no estresado (Figura 2-1).

Estos resultados concuerdan con algunos reportes obtenidos en especies de otras

gramíneas como maíz donde la aplicación de 300mM D-sorbitol en plántulas etioladas de

3 días produjeron un cambio en la actividad APX y GPX (guaicol peroxidasa) luego de 48h

de contacto (Kolarovič et al., 2009). Por otra parte, sobre el modelo vegetal Arabidopsis

thaliana se demostró que concentraciones de D-sorbitol entre 250mM y 300mM logran

incrementar la expresión de diversos genes asociados a respuestas adaptativas a estreses

abióticos, incluyendo sequía (Claeys et al., 2014).



41

Figura 2-1. Efecto de la adición de D-sorbitol en las actividades enzimáticas antioxidantes APX y GR en plántulas de P. maximum control y tratadas con el consorcio XT.

A) Ascorbato peroxidasa – APX. B) Glutatión reductasa – GR. La media es la representación de 3 réplicas biológicas de n=9. Las barras de error representan ± desviación estándar. * corresponde a las diferencias p < 0,05 contra el tratamiento 0mM D-sorbitol sin inocular por Dunnett. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey (5%).

Con respecto a las plantas tratadas con el consorcio (XT) de Bacillus spp., y sometidas D-

sorbitol se pudo observar que la actividad APX no presentó diferencias (p>0,05) al

relacionar los tratamientos no inoculados 0mM, 200mM y 300mM (Figura 2-1) con los

tratamientos tratados con el consorcio XT. Caso contrario se observó en la actividad GR

donde las plántulas inoculadas con el consorcio XT redujeron significativamente su

actividad en las concentraciones de 200mM y 300mM de D-sorbitol en 20,2% y 29,9%

respectivamente (Figura 2-1). Sin embargo, ninguna de las actividades antioxidantes se

vio estimulada en las plántulas inoculadas con el consorcio XT en ausencia de D-sorbitol

luego de 48h.

▪ Peroxidación de lípidos y acumulación de prolina

La adición de D-sorbitol como simulador de sequía induce la peroxidación de lípidos tanto

en plántulas no-inoculadas como en tratadas con concentraciones de 100mM, 200mM y

300mM produciendo incrementos de 87%, 114% y 140%, respectivamente, frente a



plántulas no-inoculadas y no sometidas a estrés. No pudo observarse una disminución

significativa de la peroxidación de lípidos en relación a la inoculación del consorcio

bacteriano bajo las concentraciones de sorbitol evaluadas (Figura 2-2).

Efectos similares fueron observados sobre callo friable de pepino (Cucumis sativus L.)

sometido a D-sorbitol 100mM (Abu-Romman, 2010), plántulas de maíz (Zea mays) a

200mM (Jain et al., 2010) y remolacha (Beta vulgaris L.) a 240mM (Wu et al., 2014), en las

cuales el estresor disminuyó la actividad de agua en las soluciones empleadas

produciendo estrés osmótico y promoviendo así la peroxidación de lípidos.

Se observó la misma tendencia de la peroxidación de lípidos cuando se determinó la

acumulación de prolina, a cuál fue estimulada por la adición de D-sorbitol en plánulas no-

inoculadas y tratadas con el estresor presentando incrementos significativos de 157,1%

(100mM), 391,6% (200mM) y 563% (300mM) luego de 48h de contacto.

Existen reportes donde la adición de D-sorbitol produjo de incrementos en la concentración

de prolina en plantas de maíz tratadas con D-sorbitol 300mM por 24h (Valentovič, Luxová,

Kolarovič, & Gašparíková, 2006), en plántulas de pepino tratadas con 100mM (Abu-

Romman & Suwwan, 2012) y de remolacha expuestas a D-sorbitol 240mM por 7 días (Wu

et al., 2014). Lo anterior ratifica la capacidad del D-sorbitol de simular satisfactoriamente

el estrés por sequía en P. maximum.

Las plantas tratadas con el consorcio XT bajo D-sorbitol 300mM fueron capaces de

acumular un 18,4% (p<0,05) más prolina que aquellas plantas no inoculadas y expuestas

al estresor (Figura 2-2). Lo anterior estaría relacionado que la inoculación del consorcio XT

estimularía la acumulación de prolina en la planta bajo esta concentración de 300mM del

estresor.



43

Figura 2-2. Efecto de la adición de D-sorbitol en la concentración de prolina foliar y la peroxidación de lípidos en plántulas de P. maximum control y tratadas con el consorcio XT.

A) Peroxidación de lípidos. B) Concentración de prolina foliar. La media es la representación de 3 réplicas biológicas de n=9. Las barras de error representan ± desviación estándar. * corresponde a las diferencias p < 0,05 contra el tratamiento 0mM D-sorbitol sin inocular por Dunnett. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey (5%).

2.3.3 Efecto del D-sorbitol sobre las actividades PGPR de las cepas de consorcio bacteriano

Al evaluar las respuestas de tres actividades PGPR (producción de EPS, solubilización de

fósforo y producción de AIA) de las bacterias individualmente y del consorcio en sí bajo

condiciones de estrés osmótico (D-sorbitol 200mM) pudimos observar diferencias en los

comportamientos individuales y grupales de las cepas de Bacillus spp.

Respecto a la producción de EPS el estrés simulado por D-sorbitol 200mM disminuyó

significativamente esta actividad en las cepas XT17 (-80,4%), XT110 (-55,6%) y al

consorcio (-66,3%), mientras se vio estimulada en las cepas XT14 (187,6%) y XT38

(88,5%) en relación a sus controles no estresados (Figura 2-3). La habilidad de solubilizar

fosfato a partir de Ca3PO4 no se vio afectada por el estrés en ninguno de casos evaluados.



La presencia de D-sorbitol 200mM disminuyó notablemente (p<0,05) la producción de AIA

tanto en las cepas de Bacillus sp., XT17 (-82,3%) y XT110 (-64,3%), así como en el

consorcio XT (-147%) en relación a sus controles no estresados. Sin embargo, a pesar de

no destacarse en la producción de índoles bajo condiciones no estresadas, las cepas

XT13, XT14 y XT38 no vieron afectada la producción de AIA bajo condiciones de estrés

(Figura 2-3).

Figura 2-3. Efecto de la adición de D-sorbitol sobre las habilidades promotoras de

crecimiento vegetal in vitro de las cepas de Bacillus sp., componentes del consorcio XT.

A) Producción de EPS. B) Solubilización de fosfato tricálcico. C) Producción de compuestos indólicos. La media es la representación n=3. Las barras de error representan ± desviación estándar. Las letras indican la distribución de subgrupos por HSD-Tukey (5%).



45

La producción de exopolisacáridos ha sido asociada con la protección celular contra

condiciones ambientales adversas así como a la formación de biopelículas, dado que los

EPS representan entre el 50-90% del carbono orgánico total en las biopelículas (Rinaudi

et al., 2006). La síntesis de EPS ha sido reportada como crucial para la diseminación de la

biopelícula en B. subtilis, donde esta contribuye a la colonización de la raíz durante el

crecimiento de la planta (Kavamura & Melo, 2014).

Se ha reportado que tanto bacterias asociativas como endófitas responden a los exudados

de la planta mediante la modulación en la expresión de diversos genes, tales como

aquellos asociados a la biosíntesis de EPS y la formación de biopelículas.

Gluconacetobacter. diazotrophicus es un ejemplo de lo anterior, donde se identificó que la

producción de EPS es crucial para la formación de su biopelícula (Souza, Ambrosini, &

Passaglia, 2015).

Con relación a los resultados obtenidos en este estudio, Kavamura y Melo, (2014)

reportaron que la formación de biopelícula se veía limitada en Bacillus sp., LMArzc189 bajo

concentraciones de D-sorbitol 300mM, lo cual podría asociarse con una disminución en la

producción de EPS bajo estas mismas condiciones de estrés. Lo anterior estaría asociado

con el hecho de que el consorcio bacteriano XT disminuye significativamente la producción

de EPS bajo estrés con D-sorbitol 200mM. Sin embargo, individualmente se destacaron

Bacillus sp., XT14 y Bacillus XT38 donde estas cepas incrementaron su producción de

EPS en presencia del estresor.

De forma interesante se pudo observar que el consorcio XT bajo condiciones no

estresadas (0mM) sobrepaso la producción de EPS en comparación a la mayoría de las

cepas individuales de Bacillus sp., (excepto por Bacillus sp., XT17). Esto podría explicar el

éxito del consorcio asociando esta característica a la promoción de adherencia, tolerancia

a desecación y posiblemente la formación de biopelícula. Sin embargo, cabe resaltar que

estos resultados podrían variar, cambiando su comportamiento bajo condiciones in vitro en



relación a aquellas encontradas en la rizósfera de la planta donde los exudados producidos

por la misma podrían presentar resultados diferentes sobre la síntesis de EPS.

Se ha reportado que plantas bajo estrés por sequía tratadas previamente con

microorganismos con capacidad de producir EPS mostraron incrementos tanto en su

biomasa y como en la microporosidad del suelo rizosférico con relación a controles no

tratados (Martine, A. R.; Mike, 2015).

A pesar que la producción de compuestos indólicos se vio afectada por el estrés en las

cepas de Bacillus sp., XT110 y el consorcio bajo condiciones in vitro, es interesante

observar que la producción de compuestos indólicos por parte del consorcio bajo

condiciones no estresadas superó entre un 35% a 117% la producción en comparación a

las cepas individuales. Lo anterior soportaría la ventaja de la coinoculación de varios

microorganismos en forma de un consorcio sobre una especie vegetal bajo condiciones no

asociadas al estrés abiótico. Sin embargo, para el consorcio el efecto del AIA se podría ver

compensado en la planta bajo condiciones de estrés por la presencia de varios

microorganismos independientemente de su densidad poblacional dentro del consorcio.

Con relación a las habilidades de promoción de crecimiento vegetal, se destacaron las

cepas XT13, XT14 y XT38 ya que no vieron afectadas su capacidad de solubilizar fosfato,

producir AIA ni EPS bajo condiciones de estrés, es más, las cepas XT14 y XT38

incrementan esta última actividad bajo condiciones de estrés, lo cual las convierte en

candidatas con potencial para futuras investigaciones en la mitigación de estrés por sequía.

Las concentraciones de D-sorbitol aplicadas a P. maximum en especial 200mM y 300mM,

permitieron simular de forma efectiva el estrés por sequía luego de 48h de exposición,

mostrando respuestas en la actividad antioxidante, acumulación de prolina y peroxidación

de lípidos similares a las obtenidas bajo la suspensión de la irrigación durante 10 días en



47

plantas de 40 días de desarrollo descritas en el capítulo de selección de consorcios

bacterianos con potencial de mitigación se sequía (sección 1.3.2).

Basados en los resultados reportados en la sección 1.3.2, el consorcio bacteriano XT aquí

evaluado demostró ser capaz de modular la respuesta adaptativa de P. maximum

mitigando las condiciones de sequía simulada mediante la adición de D-sorbitol como

estresante osmótico en las concentraciones de 200mM y 300mM.

Lo anterior corrobora que esta modulación de la respuesta adaptativa de P. maximum

observada en el estudio de selección de consorcios con potencial de mitigación de sequía,

donde el desarrollo de la planta (elongación y biomasa) se vio promovido bajo condiciones

de estrés, podría estar relacionado con la modulación de las actividades enzimáticas APX,

GR y la acumulación prolina. Sin embargo, los incrementos en la actividad de las primeras

y la acumulación de la segunda en respuesta al consorcio bacteriano se dieron

estrictamente bajo condiciones de estrés simulado mediante la adición de D-sorbitol.

Es más, los resultados en plántulas de 20 días inoculadas bajo estrés simulado, podrían

validar el mecanismo de acción con base en el incremento y diferencias en la actividad

enzimática GR expuesto en el Capítulo 1. En este las altas relaciones de ascorbato-

glutatión asumidas por el incremento en la actividad GR, tendrían un efecto indirecto sobre

la peroxidación de lípidos manteniendo los radicales lipídicos controlados mediante el

aumento hipotético de la concentración de α-tocoferoles mitigando el daño a la planta.

A pesar que la inoculación de plantas con diferentes PGPRs tanto individualmente como

en consorcios ha sido ampliamente reportada en la mitigación de estreses abióticos como

la sequía, los mecanismos implicados son amplios y requieren más investigación (Ngumbi

& Kloepper, 2016).



El identificar una concentración efectiva en plántulas de P. maximum capaz de simular los

efectos de la sequía, permitió establecer una línea de comparación para someter las

bacterias de los consorcios a dicho estrés (D-sorbitol 200mM) y observar los efectos de

este sobre las habilidades de promoción del crecimiento vegetal.

Basados en los resultados obtenidos en el Capítulo 1, donde el consorcio XT se destacó

por su habilidad de reducir la perdida de biomasa y elongación bajo condiciones de estrés

directo, podemos sumar la ausencia/presencia del estrés simulado sobre el consorcio y

sus habilidades PGPR, lo que nos permite dilucidar un poco del mecanismo que pueden

estar empleando las bacterias del consorcio XT en su establecimiento y como podrían estar

mitigando el estrés con base en sus habilidades de responder al mismo.

En relación con lo anterior, el consorcio XT bajo condiciones no estresadas fue capaz de

sintetizar una cantidad considerable de AIA, así como de exopolisacáridos. Estas dos

habilidades han sido previamente asociadas a cepas de Bacillus sp., con efectos directos

sobre la protección de la planta contra la sequía (Kavamura, Santos, Taketani,

Vasconcellos, & Melo, 2017), donde el AIA estimula la división celular en la planta

posiblemente contrarrestando el efecto de disminución en la tasa de crecimiento como

respuesta básica de la planta al estrés, mientras los EPS están relacionados con la

formación de biopelículas y la protección de la desecación tanto de las bacterias como de

la raíz.

Es interesante ver que posiblemente bajo condiciones de estrés la dinámica de los

microorganismos pueda estar cambiando en relación a las habilidades PGPR necesarias,

donde las cepas de mayores valores en las actividades como AIA y EPS bajo condiciones

normales puedan exhibir todo su potencial durante el establecimiento de la planta.

Mientras, aquellas con niveles más modestos en estas actividades no las ven reducidas

bajo la presencia del estrés, pudiendo tal vez mantener estables los efectos de promoción

aún bajo condiciones de sequía.



49

Al realizar una búsqueda de investigaciones asociadas al género Panicum, se encontró

que se han adelantado estudios de evaluación de actividades antioxidantes, acumulación

de prolina y peroxidación de lípidos en Panicum turgidum (Koyro, Hussain, Huchzermeyer,

& Khan, 2013), Panicum miliacium y Panicum sumatrense bajo condiciones de estrés por

salinidad (Bhaskaran & Panneerselvam, 2013), mientras en P. maximum se ha evaluado

su tolerancia a cobre mediada por la interacción con PGPR (Huo et al., 2012).

En relación a investigaciones de la interacción de PGPRs con P. maximum, existen pocos

reportes relacionados con promoción de crecimiento vegetal excepto por unos pocos

trabajos de aislamiento de bacterias endófitas fijadoras de nitrógeno (dos Santos, dos

Santos, Bakke, & Bakke, 2013; Patriquin & Döbereiner, 1978; Weier, Macrae, & Whittle,

1981). Sin embargo, no se encontraron estudios relacionados con la mitigación de sequía

sobre P. maximum por consorcios bacterianos y mucho menos evaluando la mitigación de

condiciones simuladas de sequía mediante la aplicación de PGPRs.

2.3.4 Conclusiones

Se logró establecer el uso de plántulas de P. maximum de 20 días con concentraciones de

200mM y 300mM como un modelo de simulación de sequía exitoso generando daños a la

membrana de las células, incrementando las actividades enzimáticas glutatión reductasa

y ascorbato peroxidasa, además de estimular la acumulación de prolina luego de 48h de

exposición. Este modelo logró reproducir de forma muy similar los efectos de una sequía

normal sobre plantas de 40 días sometidas a 10 días de suspensión de irrigación.

Se estableció que el consorcio bacteriano compuesto por 5 cepas de Bacillus sp., es capaz

de estimular las actividades enzimáticas ascorbato peroxidasa y glutatión reductasa,

regulando esta última debajo de los niveles expresados por la planta lo cual estaría



asociado a su mecanismo de mitigación del estrés simulado en P. maximum relacionado

con el ciclo ascorbato-glutatión.

A nuestro conocimiento, este es el primer trabajo a nivel nacional y mundial en describir el

efecto fisiológico de un modelo de simulación de sequía sobre Panicum maximum y el

establecimiento del potencial de mitigación de sus efectos mediante la inoculación de un

consorcio bacteriano de Bacillus spp.

3. Conclusiones y recomendaciones

3.1 Conclusiones

Se identificó y seleccionó un consorcio bacteriano de cinco Bacillus spp., con efecto

mitigador de sequía sobre Panicum maximum. donde posiblemente la relación entre sus

habilidades de tolerancia al estrés, promoción de crecimiento vegetal y modulación de la

percepción del estrés en la planta se establezca como la estrategia de garantizar su

sobrevivencia produciendo efectos con potencial agropecuario importantes aplicables en

nuevas biotecnologías

Se determinaron las características morfo-fisiológicas generadas bajo un modelo artificial

de simulación de sequía para P. maximum empleando D-sorbitol 200mM y 300mM sobre

plántulas de P. maximum de 20 días como un modelo de simulación de sequía exitoso

generando daños a la membrana de las células, incrementando las actividades

enzimáticas glutatión reductasa y ascorbato peroxidasa, además de estimular la

acumulación de prolina luego de 48h de exposición.

Se identificó como la inoculación del consorcio bacteriano de cinco Bacillus spp., en

plántulas de P. maximum modula la respuesta al estrés por sequía bajo el estrés simulado,

aplicando mecanismos de adaptación como el incremento significativo de la actividad

glutatión reductasa, la acumulación de prolina foliar. En relación, cabe resaltar que hasta

el momento en Colombia no se existían reportes de las estrategias de control antioxidante

(enzimáticas y no-enzimáticas) de la planta bajo estas condiciones de estrés.



A nuestro conocimiento, este es el primer trabajo en Colombia describir el efecto de

diferentes consorcios bacterianos asociados a Panicum maximum y la identificación de su

potencial en la mitigación de los efectos deletéreos de la sequía sobre el desarrollo de la

planta. Así mismo, este sería el primer trabajo a nivel local y mundial en describir el efecto

fisiológico de un modelo de simulación de sequía sobre P. maximum y el establecimiento

del potencial de mitigación de sus efectos mediante la inoculación de un consorcio

bacteriano de Bacillus spp.

3.2 Recomendaciones

Con el fin de comprender un poco mejor el sistema de regulación por el medio del cual los

microorganismos del consorcio XT modularían el sistema de respuesta enzimático y no

enzimático al estrés se podría realizar un experimento gnoctobiótico sobre P. maximum

bajo condiciones de desarrollo más estrictas como las obtenidas en una cámara de

crecimiento, manteniendo estables las variables de temperatura, humedad relativa,

luminosidad y horas luz para las plantas. Adicionalmente, se debería establecer el efecto

individual de las cepas del consorcio en comparación con los efectos del mismo sobre la

planta.

En relación, sería importante incluir la determinación de ácido ascórbico y las actividades

enzimáticas MDHAR (monodehidroxiascorbato-reductasa) y DHAR (dehidroxiascorbato-

reductasa) para poder identificar el uso del ascorbato en la respuesta antioxidante tanto

enzimática como no- enzimática de P. maximum y así para poder asociar su rol dentro del

ciclo Halliwell- Asada (ascorbato-glutatión). Así mismo sería interesante, incluir la

determinación de α-tocoferoles en plantas de P. maximum estresadas tratadas y no

tratadas con el consorcio de microorganismos para poder asociar su efecto sobre los

radicales lipídicos libres provenientes de la peroxidación de lípidos en respuesta al estrés

con la concentración de ascorbato producida. Esto último, validaría el posible rol de

ascorbato como restaurador de α-tocoferoles en pasto Guinea.

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Mitigación de sequía sobre Panicum maximum … · que presenta un efecto devastador sobre los...

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