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MINISTERIO DE SALUD DE LA REPÚBLICA DE BELARÚS ENTIDAD ESTATAL CENTRO REPUBLICANO CIENTÍFICO PRÁCTICO DE HIGIENE COORDINADO Vicedirector de Bel GIM (firmado) T.A. Kolomiets “24” 08 2010 APROBADO Viceministro Médico Estatal Principal de la República de Belarús (firmado) V.I. Kachan “24” 08 2010 Sello: Comité Estatal de Estandarización, Metrología y Certificación de la República de Belarús * GOSSTANDART * Empresa Unitaria Republicana INSTITUTO ESTATAL DE METROLOGÍA DE BELARÚS Sello: Ministerio de Salud de la República de Belarús TÉCNICA DE DETECCIÓN DE NITROSAMINAS EN LOS ALIMENTOS Y MATERIA PRIMA ALIMENTICIA CON EL USO DEL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICACIA MVI.MN 3543-2010 Timbre: MVI habilitada por la Empresa Unitaria Republicana Instituto Estatal de Metrología de Belarús Certificado de habilitación № 585/2010 del “24” 08 2010 Director de la Entidad Estatal Centro Republicano Científico Práctico de Higiene (firmado) V.P. Filonov ___ 2010 Sello: República de Belarús, ciudad de Minsk * Entidad Estatal * Centro Republicano Científico Práctico de Higiene Minsk 2010
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MINISTERIO DE SALUD DE LA REPUacuteBLICA DE BELARUacuteS
ENTIDAD ESTATAL
CENTRO REPUBLICANO CIENTIacuteFICO PRAacuteCTICO DE HIGIENE
COORDINADO
Vicedirector de Bel GIM
(firmado) TA Kolomiets
ldquo24rdquo 08 2010
APROBADO
Viceministro
Meacutedico Estatal Principal de la Repuacuteblica de
Belaruacutes
(firmado) VI Kachan
ldquo24rdquo 08 2010
Sello
Comiteacute Estatal de Estandarizacioacuten Metrologiacutea
y Certificacioacuten de la Repuacuteblica de Belaruacutes
GOSSTANDART
Empresa Unitaria Republicana
INSTITUTO ESTATAL DE METROLOGIacuteA
DE BELARUacuteS
Sello
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
TEacuteCNICA
DE DETECCIOacuteN DE NITROSAMINAS EN LOS ALIMENTOS
Y MATERIA PRIMA ALIMENTICIA
CON EL USO DEL MEacuteTODO
DE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICACIA
MVIMN 3543-2010
Timbre
MVI habilitada por la Empresa Unitaria
Republicana Instituto Estatal de Metrologiacutea de
Belaruacutes
Certificado de habilitacioacuten
5852010
del ldquo24rdquo 08 2010
Director de la Entidad Estatal Centro
Republicano Cientiacutefico Praacutectico de Higiene
(firmado) VP Filonov
___ 2010
Sello
Repuacuteblica de Belaruacutes ciudad de Minsk
Entidad Estatal Centro Republicano
Cientiacutefico Praacutectico de Higiene
Minsk 2010
MINISTERIO DE SALUD DE LA REPUacuteBLICA DE BELARUacuteS
ENTIDAD ESTATAL
CENTRO REPUBLICANO CIENTIacuteFICO PRAacuteCTICO DE HIGIENE
COORDINADO
Vicedirector de Bel GIM
___ TA Kolomiets
____ de 2010
APROBADO
Viceministro
Meacutedico Estatal Principal de la Repuacuteblica de
Belaruacutes
___ VI Kachan
____ de 2010
TEacuteCNICA
DE DETECCIOacuteN DE NITROSAMINAS EN LOS ALIMENTOS
Y MATERIA PRIMA ALIMENTICIA
CON EL USO DEL MEacuteTODO
DE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICACIA
MVIMN - 2010
Director de la Entidad Estatal Centro
Republicano Cientiacutefico Praacutectico de Higiene
___ VP Filonov
___ 2010
Minsk 2010
1 Campo de aplicacioacuten
El presente documento ldquoTeacutecnica de deteccioacuten de nitrosaminas en alimentos y materia
prima alimenticia con el uso del meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida de alta eficaciardquo establece el
meacutetodo para realizar las mediciones de la concentracioacuten total (en adelante concentracioacuten) de la
suma de las nitrosaminas volaacutetiles (en adelante NA) la dimetilnitrosamina (en adelante
DMNA) y la dietilnitrosamina (en adelante DENA) en los alimentos (productos caacuternicos y
embutidos pescado y productos de pescado en los alimentos para nintildeos elaborados a base de
productos caacuternicos pescado y harina) asiacute como en la materia prima alimenticia (en los granos
carne cruda pescado) aplicaacutendose para ello el meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida con detector de
fluorescencia
El meacutetodo estaacute destinado para ser aplicado por las entidades e instituciones que esteacuten
ejerciendo la fiscalizacioacuten sanitaria estatal por las instituciones de investigacioacuten cientiacutefica y
demaacutes entidades interesadas
La dimetilnitrosamina es una sustancia oleosa con una densidad (en adelante d 18 ) de 101
temperatura de ebullicioacuten de 152-153 degC es soluble en agua etanol eacuteter y demaacutes disolventes
orgaacutenicos La foacutermula estructural de la misma es (CH 3 ) 2 N ndash N=0 su peso molecular es 7408
grmol
La dietilnitrosamina es una sustancia oleosa con d 20 de 095 temperatura de ebullicioacuten de
1769 degC es soluble en agua etanol eacuteter y demaacutes disolventes orgaacutenicos La foacutermula estructural
de la misma es (C2
H 5 ) 2 N ndash N=0 su peso molecular es 10213 grmol
Las DMNA y DENA disponen de un amplio espectro de accioacuten toacutexica y pueden provocar
tumores de diferente localizacioacuten
De acuerdo a las Normas reglas sanitarias y normativas higieacutenicas ldquoRequerimientos
higieacutenicos de calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y los alimentosrdquo aprobados por
el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009 la concentracioacuten maacutexima
admisible (CMA) de la NA en la carne productos caacuternicos y embutidos es de no maacutes de 0002
mgkg en los productos ahumados de no maacutes de 0004 mgkg en el pescado fresco y cerveza no
maacutes de 0003 mgkg en los alimentos para nintildeos no se permite con una sensibilidad del meacutetodo
de 0001 mgkg y en granos (malta cervecera) no maacutes de 0015 mgkg [1]
La teacutecnica estaacute basada en la deteccioacuten de la NA por medio de la destilacioacuten con vapor de
agua y extraccioacuten con disolvente orgaacutenico la desnitrogenacioacuten de la NA con Aacutecido Bromhiacutedrico
en aacutecido aceacutetico hasta obtenerse las respectivas aminas los derivados de aminas de cloruro de
dimetilamino-naftaleno-5-sulfonilordquo (en adelante cloruro de dansilo) la separacioacuten
cromatograacutefica y deteccioacuten cuantitativa de los derivados que se hayan formado con el uso de la
teacutecnica de cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con detector fluorescencia
El liacutemite de cuantificacioacuten de la presente teacutecnica es de 00005 mgkg para la DMNA y de
000075 mgkg para la DENA
La identificacioacuten de los dansil-derivados de la NA se realiza a traveacutes de por los tiempos de
retencioacuten y la deteccioacuten cuantitativa del contenido de la DMNA y DENA se llevaraacute a cabo con
el uso del meacutetodo de estaacutendar interno En calidad de estaacutendar interno se aplicaraacute la
dipropilnitrosamina (en adelante DPNA) la cual se encuentra conforme con los requerimientos
que se establecen para seleccionar el estaacutendar interno en el marco de un anaacutelisis cuantitativo con
el uso de la teacutecnica de cromatografiacutea liacutequida y es la maacutes aceptable para obtenerse un resultado
seguro [2]
2 Indicadores de precisioacuten de la teacutecnica
Los valores relativos de los indicadores de precisioacuten del meacutetodo (repetitividad y precisioacuten
intermedia) con una probabilidad confiable de P ndash 95 estaacuten indicados en el cuadro 1
2
Cuadro 1 ndash Liacutemites de las mediciones y valores relativos de los indicadores de precisioacuten
del meacutetodo (probabilidad confiable de P = 95)
NA Banda de
mediciones
mgkg
Liacutemite
miacutenimo de
las
mediciones
X LOQ
mgkg
Desviacioacuten relativa
estaacutendar
Liacutemite de
repetitividad
(para dos
resultados
de
detecciones
en paralelo)
r
Liacutemite de la
precisioacuten
intermedia
(para dos
resultados
de
mediciones)
r )(1 ТО
de la
repetitividad
S r
de la
precisioacuten
intermedia
S )(1 ТО
DMNA De 00005
a 05000
inclusive
00005 63 65 176 182
DENA De 000075
a 075000
inclusive
000075 59 65 165 182
Usaacutendose el presente meacutetodo deberaacute realizarse una evaluacioacuten del indicador de la
precisioacuten (deteccioacuten de la desviacioacuten de laboratorio) de acuerdo al STB ISO 5725-4 asiacute como la
evaluacioacuten de la incertidumbre de las mediciones al ser realizadas en un laboratorio puntual
3 Medios para realizar las mediciones dispositivos auxiliares agentes quiacutemicos y
material
31 Medios para realizar las mediciones
Cromatoacutegrafo liacutequido de alta eficacia el cual incluiraacute
- una bomba con desgasificador de vaciacuteo
- un termorregulador de columnas
- un detector fluorescente
- un sistema de mando y procesamiento de datos
Agilent 1100
Pesas de laboratorio electroacutenicas con una precisioacuten de 00001 g
Adventurer AR2140
Marca Ohaus
Microjeringa para el cromatoacutegrafo ldquoHamiltonrdquo 50mkl
con una divisioacuten de escala de 1 mkl
Marca Sigma-
Aldrich fabricante
de EEUU
Pipeta de 2da categoriacutea de precisioacuten de 01 cmsup3 con una divisioacuten de
escala de 0002 cmsup3
GOST 20292-74
Pipetas 1-1-1-1
1-1-1-2
1-1-1-5
1-1-1-10
GOST 29227-91
Matraz aforado 2-(501002002505001000) - 2 GOST 1770-74
Cilindro aforado 3-(501000) - 1 GOST 1770-74
Probeta con seccioacuten pulida П-2-(510) 1423 ХС GOST 1770-74
32 Dispositivos y equipos auxiliares
Acondicionador de aire H 07 ZP Marca Samsung
Bantildeo Mariacutea HB4 digital Marca IKA
Bantildeo de arena
Evaporador de vaciacuteo giratorio ИР-1М TU 25-11-917-74
Bantildeo Mariacutea TU 64-1-423-72
Tolvas ВД-1-500 GOST 25336-82
3
Tolvas coacutenicas de vidrio con un diaacutemetro de 30-33 mm GOST 25336-82
Matraz К г -50-1423 ТС GOST 25336-82
Matraz K-1-250-2932 TC GOST 25336-82
Una picadora de carne y trituradora
Tazas de porcelana para la evaporacioacuten (de un diaacutemetro de 55 mm
volumen de 20 cmsup3)
Laacutempara UV OKH-11 TU 84-1-1618-77
Refrigerador con una caacutemara de congelacioacuten
Sistema de filtracioacuten y desgasificacioacuten del eluyente
Podraacuten utilizarse igualmente otros medios de medicioacuten y dispositivos auxiliares cuya
precisioacuten no sea inferior a la de los aparatos recomendados por la teacutecnica
33 Reactivos quiacutemicos y material
Columna metaacutelica para la cromatografiacutea liacutequida
(250x46) Eclipse XDB-C18 5 mkm
Marca Agilent
990967-902
Dimetilnitrosamina ρ=101 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
7756
Dietilnitrosamina ρ=095 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
0756
Dipropilnitrosamina 100 mg Marca Supelko
de cataacutelogo
48554
Metanol para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Fluka
Acetona para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge998 Marca Sigma-
Aldrich
Acetonitrilo para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Sigma-
Aldrich
Benceno ge995 para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Fluka
Aacutecido aceacutetico ge99 Marca Sigma-
Aldrich
Hidroacutegeno bromurado en aacutecido aceacutetico ge33 Marca Sigma-
Aldrich de
cataacutelogo 18735
Metileno cloroso para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Merck
Sulfato de sodio anhidro ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfuacuterico 95-98 Marca Sigma de
cataacutelogo D2625-1г
Hidroacutexido de sodio ge98 Marca Sigma-
Aldrich
Bicarbonato de sodio 997-1003 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfaniacutelico ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Cloruro de Sodio ge995
Marca Sigma-
Aldrich
Agua destilada GOST 6709-72
Filtros de papel ldquobanda azulrdquo TU-6-09-1678-86
Filtros de celulosa regenerada con un diaacutemetro de 47 mm y tamantildeo de
las ceacutelulas de 045 mkm
Marca Agilent
3150-0576
Podraacuten ser utilizados agentes quiacutemicos y material con caracteriacutesticas no inferiores a las
arriba indicadas
4 Meacutetodo de medicioacuten
De conformidad con el presente meacutetodo las mediciones se llevaraacuten a cabo con el uso de
la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con deteccioacuten de fluorescencia realizaacutendose al inicio
las siguientes etapas de preparacioacuten de los ensayos
- destilacioacuten de las nitrosaminas con vapor de agua
- extraccioacuten liacutequido-liacutequido desde el medio acuoso al disolvente orgaacutenico
- obtencioacuten de las aminas ndash desnitrogenacioacuten
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico y evaporacioacuten de la humedad
- obtencioacuten de dansil-derivados de las aminas
- reextraccioacuten de dansil-derivados desde el medio acuoso y de acetona al disolvente
orgaacutenico
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico
- cromatografiacutea de los dansil-derivados obtenidos
5 Requerimientos de seguridad
El local donde se lleve a cabo la deteccioacuten de la NA deberaacute estar equipado
obligatoriamente de una ventilacioacuten por aspiracioacuten
El trabajo con las NA deberaacute realizarse en un sitio cerrado con aspiracioacuten usando medios
individuales de proteccioacuten (lentes guantes y etc)
En el laboratorio donde se realice el trabajo con las NA volaacutetiles canceriacutegenas siempre
deberaacute estar disponible una solucioacuten de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico para destruir las NA
volaacutetiles en caso de que lleguen a parar en los lugares de trabajo y el suelo Al finalizar el
trabajo con el fin de destruir las NA volaacutetiles en el aire se haraacute un tratamiento en el local con
rayos UV durante 30 minutos
El desplazamiento y almacenamiento de las NA se realizaraacute en ampollas de cristal
soldadas envueltas en un tejido de asbesto y embaladas en envases metaacutelicos soldados por
parafina
Las NA se almacenaraacuten en un refrigerador individual donde no haya muestras
analizadas
6 Requerimientos en relacioacuten a la cualificacioacuten del operador
A la realizacioacuten de las mediciones y procesamiento de los resultados del anaacutelisis de
cromatografiacutea podraacuten acceder personas con formacioacuten superior especializada que dispongan de
experiencia de trabajo en el campo de la cromatografiacutea liacutequida que hayan estudiado los
requerimientos de seguridad y la presente teacutecnica la guiacutea de uso del cromatoacutegrafo liacutequido y la
instruccioacuten para el uso de los sistemas de procesamiento de los datos cromatograacuteficos
7 Condiciones de las mediciones
Las mediciones de laboratorio de acuerdo a la presente teacutecnica se llevaraacuten a cabo en las
siguientes condiciones
- la temperatura del aire en la preparacioacuten de las soluciones incluyendo las graduadas
seraacute de (20plusmn2) ordmC
- la temperatura del aire en las mediciones deberaacute ser de (20plusmn5) ordmC
- la presioacuten atmosfeacuterica seraacute de 840-1067 kPa
- la humedad del aire seraacute de (65plusmn15) a una temperatura de 25 ordmC
- la tensioacuten en la red de alimentacioacuten deberaacute ser de (230plusmn10) V
- la frecuencia de la corriente alterna seraacute de (50plusmn04) Hz
Las mediciones en el cromatoacutegrafo liacutequido seraacuten realizadas en las condiciones
recomendadas por los documentos teacutecnicos del dispositivo y la presente teacutecnica
8 Preparativos para realizar las mediciones
Antes de realizarse las mediciones deberaacuten llevarse a cabo los siguientes trabajos
preparar los aparatos de medicioacuten preparar soluciones establecer las caracteriacutesticas de
graduacioacuten seleccionar y preparar las muestras para el anaacutelisis
81 Preparativos de los aparatos de medicioacuten
El cromatoacutegrafo liacutequido se prepara para el funcionamiento de acuerdo a la instruccioacuten de
uso Se establecen regiacutemenes de funcionamiento para la columna y el detector Para la
desgasificacioacuten el matraz con el eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-
50ordmC abrieacutendose simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz hasta la temperatura
ambiente la fase moacutevil estariacutea lista para su aplicacioacuten El eluyente deberaacute estar siempre cerrado
con un tapoacuten y guardarse en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC
82 Preparacioacuten de las soluciones
821 Solucioacuten de cloruro de dansilo con una concentracioacuten de 05 mgcmsup3
La muestra pesada de cloruro de dansilo de un peso de 265 mg se colocaraacute en un matraz
aforado de una capacidad de 50 cmsup3 se disolveraacute en 20 cmsup3 de acetona y se conduciraacute hasta la
marca con acetona La solucioacuten preparada se guardaraacute en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC previniendo minuciosamente la penetracioacuten de humedad en la misma El plazo de
almacenamiento no superaraacute los 3 meses
822 La solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico (solucioacuten denitrozante)
En un matraz coacutenico de una capacidad de 50 cmsup3 se vierten 5 cmsup3 de solucioacuten 33 de
aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico y tambieacuten se antildeaden 45 cmsup3 de aacutecido aceacutetico helado La
mezcla se guardaraacute en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en una vajilla de vidrio
oscuro El plazo de almacenamiento no podraacute superar un mes Un indicio de la ineptitud para
usarse la solucioacuten es la aparicioacuten de una coloracioacuten amarilla y marroacuten
823 Solucioacuten separadora con un pH de 105
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
MINISTERIO DE SALUD DE LA REPUacuteBLICA DE BELARUacuteS
ENTIDAD ESTATAL
CENTRO REPUBLICANO CIENTIacuteFICO PRAacuteCTICO DE HIGIENE
COORDINADO
Vicedirector de Bel GIM
___ TA Kolomiets
____ de 2010
APROBADO
Viceministro
Meacutedico Estatal Principal de la Repuacuteblica de
Belaruacutes
___ VI Kachan
____ de 2010
TEacuteCNICA
DE DETECCIOacuteN DE NITROSAMINAS EN LOS ALIMENTOS
Y MATERIA PRIMA ALIMENTICIA
CON EL USO DEL MEacuteTODO
DE CROMATOGRAFIacuteA LIacuteQUIDA DE ALTA EFICACIA
MVIMN - 2010
Director de la Entidad Estatal Centro
Republicano Cientiacutefico Praacutectico de Higiene
___ VP Filonov
___ 2010
Minsk 2010
1 Campo de aplicacioacuten
El presente documento ldquoTeacutecnica de deteccioacuten de nitrosaminas en alimentos y materia
prima alimenticia con el uso del meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida de alta eficaciardquo establece el
meacutetodo para realizar las mediciones de la concentracioacuten total (en adelante concentracioacuten) de la
suma de las nitrosaminas volaacutetiles (en adelante NA) la dimetilnitrosamina (en adelante
DMNA) y la dietilnitrosamina (en adelante DENA) en los alimentos (productos caacuternicos y
embutidos pescado y productos de pescado en los alimentos para nintildeos elaborados a base de
productos caacuternicos pescado y harina) asiacute como en la materia prima alimenticia (en los granos
carne cruda pescado) aplicaacutendose para ello el meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida con detector de
fluorescencia
El meacutetodo estaacute destinado para ser aplicado por las entidades e instituciones que esteacuten
ejerciendo la fiscalizacioacuten sanitaria estatal por las instituciones de investigacioacuten cientiacutefica y
demaacutes entidades interesadas
La dimetilnitrosamina es una sustancia oleosa con una densidad (en adelante d 18 ) de 101
temperatura de ebullicioacuten de 152-153 degC es soluble en agua etanol eacuteter y demaacutes disolventes
orgaacutenicos La foacutermula estructural de la misma es (CH 3 ) 2 N ndash N=0 su peso molecular es 7408
grmol
La dietilnitrosamina es una sustancia oleosa con d 20 de 095 temperatura de ebullicioacuten de
1769 degC es soluble en agua etanol eacuteter y demaacutes disolventes orgaacutenicos La foacutermula estructural
de la misma es (C2
H 5 ) 2 N ndash N=0 su peso molecular es 10213 grmol
Las DMNA y DENA disponen de un amplio espectro de accioacuten toacutexica y pueden provocar
tumores de diferente localizacioacuten
De acuerdo a las Normas reglas sanitarias y normativas higieacutenicas ldquoRequerimientos
higieacutenicos de calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y los alimentosrdquo aprobados por
el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009 la concentracioacuten maacutexima
admisible (CMA) de la NA en la carne productos caacuternicos y embutidos es de no maacutes de 0002
mgkg en los productos ahumados de no maacutes de 0004 mgkg en el pescado fresco y cerveza no
maacutes de 0003 mgkg en los alimentos para nintildeos no se permite con una sensibilidad del meacutetodo
de 0001 mgkg y en granos (malta cervecera) no maacutes de 0015 mgkg [1]
La teacutecnica estaacute basada en la deteccioacuten de la NA por medio de la destilacioacuten con vapor de
agua y extraccioacuten con disolvente orgaacutenico la desnitrogenacioacuten de la NA con Aacutecido Bromhiacutedrico
en aacutecido aceacutetico hasta obtenerse las respectivas aminas los derivados de aminas de cloruro de
dimetilamino-naftaleno-5-sulfonilordquo (en adelante cloruro de dansilo) la separacioacuten
cromatograacutefica y deteccioacuten cuantitativa de los derivados que se hayan formado con el uso de la
teacutecnica de cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con detector fluorescencia
El liacutemite de cuantificacioacuten de la presente teacutecnica es de 00005 mgkg para la DMNA y de
000075 mgkg para la DENA
La identificacioacuten de los dansil-derivados de la NA se realiza a traveacutes de por los tiempos de
retencioacuten y la deteccioacuten cuantitativa del contenido de la DMNA y DENA se llevaraacute a cabo con
el uso del meacutetodo de estaacutendar interno En calidad de estaacutendar interno se aplicaraacute la
dipropilnitrosamina (en adelante DPNA) la cual se encuentra conforme con los requerimientos
que se establecen para seleccionar el estaacutendar interno en el marco de un anaacutelisis cuantitativo con
el uso de la teacutecnica de cromatografiacutea liacutequida y es la maacutes aceptable para obtenerse un resultado
seguro [2]
2 Indicadores de precisioacuten de la teacutecnica
Los valores relativos de los indicadores de precisioacuten del meacutetodo (repetitividad y precisioacuten
intermedia) con una probabilidad confiable de P ndash 95 estaacuten indicados en el cuadro 1
2
Cuadro 1 ndash Liacutemites de las mediciones y valores relativos de los indicadores de precisioacuten
del meacutetodo (probabilidad confiable de P = 95)
NA Banda de
mediciones
mgkg
Liacutemite
miacutenimo de
las
mediciones
X LOQ
mgkg
Desviacioacuten relativa
estaacutendar
Liacutemite de
repetitividad
(para dos
resultados
de
detecciones
en paralelo)
r
Liacutemite de la
precisioacuten
intermedia
(para dos
resultados
de
mediciones)
r )(1 ТО
de la
repetitividad
S r
de la
precisioacuten
intermedia
S )(1 ТО
DMNA De 00005
a 05000
inclusive
00005 63 65 176 182
DENA De 000075
a 075000
inclusive
000075 59 65 165 182
Usaacutendose el presente meacutetodo deberaacute realizarse una evaluacioacuten del indicador de la
precisioacuten (deteccioacuten de la desviacioacuten de laboratorio) de acuerdo al STB ISO 5725-4 asiacute como la
evaluacioacuten de la incertidumbre de las mediciones al ser realizadas en un laboratorio puntual
3 Medios para realizar las mediciones dispositivos auxiliares agentes quiacutemicos y
material
31 Medios para realizar las mediciones
Cromatoacutegrafo liacutequido de alta eficacia el cual incluiraacute
- una bomba con desgasificador de vaciacuteo
- un termorregulador de columnas
- un detector fluorescente
- un sistema de mando y procesamiento de datos
Agilent 1100
Pesas de laboratorio electroacutenicas con una precisioacuten de 00001 g
Adventurer AR2140
Marca Ohaus
Microjeringa para el cromatoacutegrafo ldquoHamiltonrdquo 50mkl
con una divisioacuten de escala de 1 mkl
Marca Sigma-
Aldrich fabricante
de EEUU
Pipeta de 2da categoriacutea de precisioacuten de 01 cmsup3 con una divisioacuten de
escala de 0002 cmsup3
GOST 20292-74
Pipetas 1-1-1-1
1-1-1-2
1-1-1-5
1-1-1-10
GOST 29227-91
Matraz aforado 2-(501002002505001000) - 2 GOST 1770-74
Cilindro aforado 3-(501000) - 1 GOST 1770-74
Probeta con seccioacuten pulida П-2-(510) 1423 ХС GOST 1770-74
32 Dispositivos y equipos auxiliares
Acondicionador de aire H 07 ZP Marca Samsung
Bantildeo Mariacutea HB4 digital Marca IKA
Bantildeo de arena
Evaporador de vaciacuteo giratorio ИР-1М TU 25-11-917-74
Bantildeo Mariacutea TU 64-1-423-72
Tolvas ВД-1-500 GOST 25336-82
3
Tolvas coacutenicas de vidrio con un diaacutemetro de 30-33 mm GOST 25336-82
Matraz К г -50-1423 ТС GOST 25336-82
Matraz K-1-250-2932 TC GOST 25336-82
Una picadora de carne y trituradora
Tazas de porcelana para la evaporacioacuten (de un diaacutemetro de 55 mm
volumen de 20 cmsup3)
Laacutempara UV OKH-11 TU 84-1-1618-77
Refrigerador con una caacutemara de congelacioacuten
Sistema de filtracioacuten y desgasificacioacuten del eluyente
Podraacuten utilizarse igualmente otros medios de medicioacuten y dispositivos auxiliares cuya
precisioacuten no sea inferior a la de los aparatos recomendados por la teacutecnica
33 Reactivos quiacutemicos y material
Columna metaacutelica para la cromatografiacutea liacutequida
(250x46) Eclipse XDB-C18 5 mkm
Marca Agilent
990967-902
Dimetilnitrosamina ρ=101 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
7756
Dietilnitrosamina ρ=095 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
0756
Dipropilnitrosamina 100 mg Marca Supelko
de cataacutelogo
48554
Metanol para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Fluka
Acetona para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge998 Marca Sigma-
Aldrich
Acetonitrilo para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Sigma-
Aldrich
Benceno ge995 para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Fluka
Aacutecido aceacutetico ge99 Marca Sigma-
Aldrich
Hidroacutegeno bromurado en aacutecido aceacutetico ge33 Marca Sigma-
Aldrich de
cataacutelogo 18735
Metileno cloroso para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Merck
Sulfato de sodio anhidro ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfuacuterico 95-98 Marca Sigma de
cataacutelogo D2625-1г
Hidroacutexido de sodio ge98 Marca Sigma-
Aldrich
Bicarbonato de sodio 997-1003 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfaniacutelico ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Cloruro de Sodio ge995
Marca Sigma-
Aldrich
Agua destilada GOST 6709-72
Filtros de papel ldquobanda azulrdquo TU-6-09-1678-86
Filtros de celulosa regenerada con un diaacutemetro de 47 mm y tamantildeo de
las ceacutelulas de 045 mkm
Marca Agilent
3150-0576
Podraacuten ser utilizados agentes quiacutemicos y material con caracteriacutesticas no inferiores a las
arriba indicadas
4 Meacutetodo de medicioacuten
De conformidad con el presente meacutetodo las mediciones se llevaraacuten a cabo con el uso de
la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con deteccioacuten de fluorescencia realizaacutendose al inicio
las siguientes etapas de preparacioacuten de los ensayos
- destilacioacuten de las nitrosaminas con vapor de agua
- extraccioacuten liacutequido-liacutequido desde el medio acuoso al disolvente orgaacutenico
- obtencioacuten de las aminas ndash desnitrogenacioacuten
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico y evaporacioacuten de la humedad
- obtencioacuten de dansil-derivados de las aminas
- reextraccioacuten de dansil-derivados desde el medio acuoso y de acetona al disolvente
orgaacutenico
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico
- cromatografiacutea de los dansil-derivados obtenidos
5 Requerimientos de seguridad
El local donde se lleve a cabo la deteccioacuten de la NA deberaacute estar equipado
obligatoriamente de una ventilacioacuten por aspiracioacuten
El trabajo con las NA deberaacute realizarse en un sitio cerrado con aspiracioacuten usando medios
individuales de proteccioacuten (lentes guantes y etc)
En el laboratorio donde se realice el trabajo con las NA volaacutetiles canceriacutegenas siempre
deberaacute estar disponible una solucioacuten de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico para destruir las NA
volaacutetiles en caso de que lleguen a parar en los lugares de trabajo y el suelo Al finalizar el
trabajo con el fin de destruir las NA volaacutetiles en el aire se haraacute un tratamiento en el local con
rayos UV durante 30 minutos
El desplazamiento y almacenamiento de las NA se realizaraacute en ampollas de cristal
soldadas envueltas en un tejido de asbesto y embaladas en envases metaacutelicos soldados por
parafina
Las NA se almacenaraacuten en un refrigerador individual donde no haya muestras
analizadas
6 Requerimientos en relacioacuten a la cualificacioacuten del operador
A la realizacioacuten de las mediciones y procesamiento de los resultados del anaacutelisis de
cromatografiacutea podraacuten acceder personas con formacioacuten superior especializada que dispongan de
experiencia de trabajo en el campo de la cromatografiacutea liacutequida que hayan estudiado los
requerimientos de seguridad y la presente teacutecnica la guiacutea de uso del cromatoacutegrafo liacutequido y la
instruccioacuten para el uso de los sistemas de procesamiento de los datos cromatograacuteficos
7 Condiciones de las mediciones
Las mediciones de laboratorio de acuerdo a la presente teacutecnica se llevaraacuten a cabo en las
siguientes condiciones
- la temperatura del aire en la preparacioacuten de las soluciones incluyendo las graduadas
seraacute de (20plusmn2) ordmC
- la temperatura del aire en las mediciones deberaacute ser de (20plusmn5) ordmC
- la presioacuten atmosfeacuterica seraacute de 840-1067 kPa
- la humedad del aire seraacute de (65plusmn15) a una temperatura de 25 ordmC
- la tensioacuten en la red de alimentacioacuten deberaacute ser de (230plusmn10) V
- la frecuencia de la corriente alterna seraacute de (50plusmn04) Hz
Las mediciones en el cromatoacutegrafo liacutequido seraacuten realizadas en las condiciones
recomendadas por los documentos teacutecnicos del dispositivo y la presente teacutecnica
8 Preparativos para realizar las mediciones
Antes de realizarse las mediciones deberaacuten llevarse a cabo los siguientes trabajos
preparar los aparatos de medicioacuten preparar soluciones establecer las caracteriacutesticas de
graduacioacuten seleccionar y preparar las muestras para el anaacutelisis
81 Preparativos de los aparatos de medicioacuten
El cromatoacutegrafo liacutequido se prepara para el funcionamiento de acuerdo a la instruccioacuten de
uso Se establecen regiacutemenes de funcionamiento para la columna y el detector Para la
desgasificacioacuten el matraz con el eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-
50ordmC abrieacutendose simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz hasta la temperatura
ambiente la fase moacutevil estariacutea lista para su aplicacioacuten El eluyente deberaacute estar siempre cerrado
con un tapoacuten y guardarse en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC
82 Preparacioacuten de las soluciones
821 Solucioacuten de cloruro de dansilo con una concentracioacuten de 05 mgcmsup3
La muestra pesada de cloruro de dansilo de un peso de 265 mg se colocaraacute en un matraz
aforado de una capacidad de 50 cmsup3 se disolveraacute en 20 cmsup3 de acetona y se conduciraacute hasta la
marca con acetona La solucioacuten preparada se guardaraacute en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC previniendo minuciosamente la penetracioacuten de humedad en la misma El plazo de
almacenamiento no superaraacute los 3 meses
822 La solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico (solucioacuten denitrozante)
En un matraz coacutenico de una capacidad de 50 cmsup3 se vierten 5 cmsup3 de solucioacuten 33 de
aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico y tambieacuten se antildeaden 45 cmsup3 de aacutecido aceacutetico helado La
mezcla se guardaraacute en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en una vajilla de vidrio
oscuro El plazo de almacenamiento no podraacute superar un mes Un indicio de la ineptitud para
usarse la solucioacuten es la aparicioacuten de una coloracioacuten amarilla y marroacuten
823 Solucioacuten separadora con un pH de 105
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
1 Campo de aplicacioacuten
El presente documento ldquoTeacutecnica de deteccioacuten de nitrosaminas en alimentos y materia
prima alimenticia con el uso del meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida de alta eficaciardquo establece el
meacutetodo para realizar las mediciones de la concentracioacuten total (en adelante concentracioacuten) de la
suma de las nitrosaminas volaacutetiles (en adelante NA) la dimetilnitrosamina (en adelante
DMNA) y la dietilnitrosamina (en adelante DENA) en los alimentos (productos caacuternicos y
embutidos pescado y productos de pescado en los alimentos para nintildeos elaborados a base de
productos caacuternicos pescado y harina) asiacute como en la materia prima alimenticia (en los granos
carne cruda pescado) aplicaacutendose para ello el meacutetodo de cromatografiacutea liacutequida con detector de
fluorescencia
El meacutetodo estaacute destinado para ser aplicado por las entidades e instituciones que esteacuten
ejerciendo la fiscalizacioacuten sanitaria estatal por las instituciones de investigacioacuten cientiacutefica y
demaacutes entidades interesadas
La dimetilnitrosamina es una sustancia oleosa con una densidad (en adelante d 18 ) de 101
temperatura de ebullicioacuten de 152-153 degC es soluble en agua etanol eacuteter y demaacutes disolventes
orgaacutenicos La foacutermula estructural de la misma es (CH 3 ) 2 N ndash N=0 su peso molecular es 7408
grmol
La dietilnitrosamina es una sustancia oleosa con d 20 de 095 temperatura de ebullicioacuten de
1769 degC es soluble en agua etanol eacuteter y demaacutes disolventes orgaacutenicos La foacutermula estructural
de la misma es (C2
H 5 ) 2 N ndash N=0 su peso molecular es 10213 grmol
Las DMNA y DENA disponen de un amplio espectro de accioacuten toacutexica y pueden provocar
tumores de diferente localizacioacuten
De acuerdo a las Normas reglas sanitarias y normativas higieacutenicas ldquoRequerimientos
higieacutenicos de calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y los alimentosrdquo aprobados por
el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009 la concentracioacuten maacutexima
admisible (CMA) de la NA en la carne productos caacuternicos y embutidos es de no maacutes de 0002
mgkg en los productos ahumados de no maacutes de 0004 mgkg en el pescado fresco y cerveza no
maacutes de 0003 mgkg en los alimentos para nintildeos no se permite con una sensibilidad del meacutetodo
de 0001 mgkg y en granos (malta cervecera) no maacutes de 0015 mgkg [1]
La teacutecnica estaacute basada en la deteccioacuten de la NA por medio de la destilacioacuten con vapor de
agua y extraccioacuten con disolvente orgaacutenico la desnitrogenacioacuten de la NA con Aacutecido Bromhiacutedrico
en aacutecido aceacutetico hasta obtenerse las respectivas aminas los derivados de aminas de cloruro de
dimetilamino-naftaleno-5-sulfonilordquo (en adelante cloruro de dansilo) la separacioacuten
cromatograacutefica y deteccioacuten cuantitativa de los derivados que se hayan formado con el uso de la
teacutecnica de cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con detector fluorescencia
El liacutemite de cuantificacioacuten de la presente teacutecnica es de 00005 mgkg para la DMNA y de
000075 mgkg para la DENA
La identificacioacuten de los dansil-derivados de la NA se realiza a traveacutes de por los tiempos de
retencioacuten y la deteccioacuten cuantitativa del contenido de la DMNA y DENA se llevaraacute a cabo con
el uso del meacutetodo de estaacutendar interno En calidad de estaacutendar interno se aplicaraacute la
dipropilnitrosamina (en adelante DPNA) la cual se encuentra conforme con los requerimientos
que se establecen para seleccionar el estaacutendar interno en el marco de un anaacutelisis cuantitativo con
el uso de la teacutecnica de cromatografiacutea liacutequida y es la maacutes aceptable para obtenerse un resultado
seguro [2]
2 Indicadores de precisioacuten de la teacutecnica
Los valores relativos de los indicadores de precisioacuten del meacutetodo (repetitividad y precisioacuten
intermedia) con una probabilidad confiable de P ndash 95 estaacuten indicados en el cuadro 1
2
Cuadro 1 ndash Liacutemites de las mediciones y valores relativos de los indicadores de precisioacuten
del meacutetodo (probabilidad confiable de P = 95)
NA Banda de
mediciones
mgkg
Liacutemite
miacutenimo de
las
mediciones
X LOQ
mgkg
Desviacioacuten relativa
estaacutendar
Liacutemite de
repetitividad
(para dos
resultados
de
detecciones
en paralelo)
r
Liacutemite de la
precisioacuten
intermedia
(para dos
resultados
de
mediciones)
r )(1 ТО
de la
repetitividad
S r
de la
precisioacuten
intermedia
S )(1 ТО
DMNA De 00005
a 05000
inclusive
00005 63 65 176 182
DENA De 000075
a 075000
inclusive
000075 59 65 165 182
Usaacutendose el presente meacutetodo deberaacute realizarse una evaluacioacuten del indicador de la
precisioacuten (deteccioacuten de la desviacioacuten de laboratorio) de acuerdo al STB ISO 5725-4 asiacute como la
evaluacioacuten de la incertidumbre de las mediciones al ser realizadas en un laboratorio puntual
3 Medios para realizar las mediciones dispositivos auxiliares agentes quiacutemicos y
material
31 Medios para realizar las mediciones
Cromatoacutegrafo liacutequido de alta eficacia el cual incluiraacute
- una bomba con desgasificador de vaciacuteo
- un termorregulador de columnas
- un detector fluorescente
- un sistema de mando y procesamiento de datos
Agilent 1100
Pesas de laboratorio electroacutenicas con una precisioacuten de 00001 g
Adventurer AR2140
Marca Ohaus
Microjeringa para el cromatoacutegrafo ldquoHamiltonrdquo 50mkl
con una divisioacuten de escala de 1 mkl
Marca Sigma-
Aldrich fabricante
de EEUU
Pipeta de 2da categoriacutea de precisioacuten de 01 cmsup3 con una divisioacuten de
escala de 0002 cmsup3
GOST 20292-74
Pipetas 1-1-1-1
1-1-1-2
1-1-1-5
1-1-1-10
GOST 29227-91
Matraz aforado 2-(501002002505001000) - 2 GOST 1770-74
Cilindro aforado 3-(501000) - 1 GOST 1770-74
Probeta con seccioacuten pulida П-2-(510) 1423 ХС GOST 1770-74
32 Dispositivos y equipos auxiliares
Acondicionador de aire H 07 ZP Marca Samsung
Bantildeo Mariacutea HB4 digital Marca IKA
Bantildeo de arena
Evaporador de vaciacuteo giratorio ИР-1М TU 25-11-917-74
Bantildeo Mariacutea TU 64-1-423-72
Tolvas ВД-1-500 GOST 25336-82
3
Tolvas coacutenicas de vidrio con un diaacutemetro de 30-33 mm GOST 25336-82
Matraz К г -50-1423 ТС GOST 25336-82
Matraz K-1-250-2932 TC GOST 25336-82
Una picadora de carne y trituradora
Tazas de porcelana para la evaporacioacuten (de un diaacutemetro de 55 mm
volumen de 20 cmsup3)
Laacutempara UV OKH-11 TU 84-1-1618-77
Refrigerador con una caacutemara de congelacioacuten
Sistema de filtracioacuten y desgasificacioacuten del eluyente
Podraacuten utilizarse igualmente otros medios de medicioacuten y dispositivos auxiliares cuya
precisioacuten no sea inferior a la de los aparatos recomendados por la teacutecnica
33 Reactivos quiacutemicos y material
Columna metaacutelica para la cromatografiacutea liacutequida
(250x46) Eclipse XDB-C18 5 mkm
Marca Agilent
990967-902
Dimetilnitrosamina ρ=101 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
7756
Dietilnitrosamina ρ=095 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
0756
Dipropilnitrosamina 100 mg Marca Supelko
de cataacutelogo
48554
Metanol para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Fluka
Acetona para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge998 Marca Sigma-
Aldrich
Acetonitrilo para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Sigma-
Aldrich
Benceno ge995 para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Fluka
Aacutecido aceacutetico ge99 Marca Sigma-
Aldrich
Hidroacutegeno bromurado en aacutecido aceacutetico ge33 Marca Sigma-
Aldrich de
cataacutelogo 18735
Metileno cloroso para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Merck
Sulfato de sodio anhidro ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfuacuterico 95-98 Marca Sigma de
cataacutelogo D2625-1г
Hidroacutexido de sodio ge98 Marca Sigma-
Aldrich
Bicarbonato de sodio 997-1003 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfaniacutelico ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Cloruro de Sodio ge995
Marca Sigma-
Aldrich
Agua destilada GOST 6709-72
Filtros de papel ldquobanda azulrdquo TU-6-09-1678-86
Filtros de celulosa regenerada con un diaacutemetro de 47 mm y tamantildeo de
las ceacutelulas de 045 mkm
Marca Agilent
3150-0576
Podraacuten ser utilizados agentes quiacutemicos y material con caracteriacutesticas no inferiores a las
arriba indicadas
4 Meacutetodo de medicioacuten
De conformidad con el presente meacutetodo las mediciones se llevaraacuten a cabo con el uso de
la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con deteccioacuten de fluorescencia realizaacutendose al inicio
las siguientes etapas de preparacioacuten de los ensayos
- destilacioacuten de las nitrosaminas con vapor de agua
- extraccioacuten liacutequido-liacutequido desde el medio acuoso al disolvente orgaacutenico
- obtencioacuten de las aminas ndash desnitrogenacioacuten
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico y evaporacioacuten de la humedad
- obtencioacuten de dansil-derivados de las aminas
- reextraccioacuten de dansil-derivados desde el medio acuoso y de acetona al disolvente
orgaacutenico
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico
- cromatografiacutea de los dansil-derivados obtenidos
5 Requerimientos de seguridad
El local donde se lleve a cabo la deteccioacuten de la NA deberaacute estar equipado
obligatoriamente de una ventilacioacuten por aspiracioacuten
El trabajo con las NA deberaacute realizarse en un sitio cerrado con aspiracioacuten usando medios
individuales de proteccioacuten (lentes guantes y etc)
En el laboratorio donde se realice el trabajo con las NA volaacutetiles canceriacutegenas siempre
deberaacute estar disponible una solucioacuten de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico para destruir las NA
volaacutetiles en caso de que lleguen a parar en los lugares de trabajo y el suelo Al finalizar el
trabajo con el fin de destruir las NA volaacutetiles en el aire se haraacute un tratamiento en el local con
rayos UV durante 30 minutos
El desplazamiento y almacenamiento de las NA se realizaraacute en ampollas de cristal
soldadas envueltas en un tejido de asbesto y embaladas en envases metaacutelicos soldados por
parafina
Las NA se almacenaraacuten en un refrigerador individual donde no haya muestras
analizadas
6 Requerimientos en relacioacuten a la cualificacioacuten del operador
A la realizacioacuten de las mediciones y procesamiento de los resultados del anaacutelisis de
cromatografiacutea podraacuten acceder personas con formacioacuten superior especializada que dispongan de
experiencia de trabajo en el campo de la cromatografiacutea liacutequida que hayan estudiado los
requerimientos de seguridad y la presente teacutecnica la guiacutea de uso del cromatoacutegrafo liacutequido y la
instruccioacuten para el uso de los sistemas de procesamiento de los datos cromatograacuteficos
7 Condiciones de las mediciones
Las mediciones de laboratorio de acuerdo a la presente teacutecnica se llevaraacuten a cabo en las
siguientes condiciones
- la temperatura del aire en la preparacioacuten de las soluciones incluyendo las graduadas
seraacute de (20plusmn2) ordmC
- la temperatura del aire en las mediciones deberaacute ser de (20plusmn5) ordmC
- la presioacuten atmosfeacuterica seraacute de 840-1067 kPa
- la humedad del aire seraacute de (65plusmn15) a una temperatura de 25 ordmC
- la tensioacuten en la red de alimentacioacuten deberaacute ser de (230plusmn10) V
- la frecuencia de la corriente alterna seraacute de (50plusmn04) Hz
Las mediciones en el cromatoacutegrafo liacutequido seraacuten realizadas en las condiciones
recomendadas por los documentos teacutecnicos del dispositivo y la presente teacutecnica
8 Preparativos para realizar las mediciones
Antes de realizarse las mediciones deberaacuten llevarse a cabo los siguientes trabajos
preparar los aparatos de medicioacuten preparar soluciones establecer las caracteriacutesticas de
graduacioacuten seleccionar y preparar las muestras para el anaacutelisis
81 Preparativos de los aparatos de medicioacuten
El cromatoacutegrafo liacutequido se prepara para el funcionamiento de acuerdo a la instruccioacuten de
uso Se establecen regiacutemenes de funcionamiento para la columna y el detector Para la
desgasificacioacuten el matraz con el eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-
50ordmC abrieacutendose simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz hasta la temperatura
ambiente la fase moacutevil estariacutea lista para su aplicacioacuten El eluyente deberaacute estar siempre cerrado
con un tapoacuten y guardarse en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC
82 Preparacioacuten de las soluciones
821 Solucioacuten de cloruro de dansilo con una concentracioacuten de 05 mgcmsup3
La muestra pesada de cloruro de dansilo de un peso de 265 mg se colocaraacute en un matraz
aforado de una capacidad de 50 cmsup3 se disolveraacute en 20 cmsup3 de acetona y se conduciraacute hasta la
marca con acetona La solucioacuten preparada se guardaraacute en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC previniendo minuciosamente la penetracioacuten de humedad en la misma El plazo de
almacenamiento no superaraacute los 3 meses
822 La solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico (solucioacuten denitrozante)
En un matraz coacutenico de una capacidad de 50 cmsup3 se vierten 5 cmsup3 de solucioacuten 33 de
aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico y tambieacuten se antildeaden 45 cmsup3 de aacutecido aceacutetico helado La
mezcla se guardaraacute en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en una vajilla de vidrio
oscuro El plazo de almacenamiento no podraacute superar un mes Un indicio de la ineptitud para
usarse la solucioacuten es la aparicioacuten de una coloracioacuten amarilla y marroacuten
823 Solucioacuten separadora con un pH de 105
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
2
Cuadro 1 ndash Liacutemites de las mediciones y valores relativos de los indicadores de precisioacuten
del meacutetodo (probabilidad confiable de P = 95)
NA Banda de
mediciones
mgkg
Liacutemite
miacutenimo de
las
mediciones
X LOQ
mgkg
Desviacioacuten relativa
estaacutendar
Liacutemite de
repetitividad
(para dos
resultados
de
detecciones
en paralelo)
r
Liacutemite de la
precisioacuten
intermedia
(para dos
resultados
de
mediciones)
r )(1 ТО
de la
repetitividad
S r
de la
precisioacuten
intermedia
S )(1 ТО
DMNA De 00005
a 05000
inclusive
00005 63 65 176 182
DENA De 000075
a 075000
inclusive
000075 59 65 165 182
Usaacutendose el presente meacutetodo deberaacute realizarse una evaluacioacuten del indicador de la
precisioacuten (deteccioacuten de la desviacioacuten de laboratorio) de acuerdo al STB ISO 5725-4 asiacute como la
evaluacioacuten de la incertidumbre de las mediciones al ser realizadas en un laboratorio puntual
3 Medios para realizar las mediciones dispositivos auxiliares agentes quiacutemicos y
material
31 Medios para realizar las mediciones
Cromatoacutegrafo liacutequido de alta eficacia el cual incluiraacute
- una bomba con desgasificador de vaciacuteo
- un termorregulador de columnas
- un detector fluorescente
- un sistema de mando y procesamiento de datos
Agilent 1100
Pesas de laboratorio electroacutenicas con una precisioacuten de 00001 g
Adventurer AR2140
Marca Ohaus
Microjeringa para el cromatoacutegrafo ldquoHamiltonrdquo 50mkl
con una divisioacuten de escala de 1 mkl
Marca Sigma-
Aldrich fabricante
de EEUU
Pipeta de 2da categoriacutea de precisioacuten de 01 cmsup3 con una divisioacuten de
escala de 0002 cmsup3
GOST 20292-74
Pipetas 1-1-1-1
1-1-1-2
1-1-1-5
1-1-1-10
GOST 29227-91
Matraz aforado 2-(501002002505001000) - 2 GOST 1770-74
Cilindro aforado 3-(501000) - 1 GOST 1770-74
Probeta con seccioacuten pulida П-2-(510) 1423 ХС GOST 1770-74
32 Dispositivos y equipos auxiliares
Acondicionador de aire H 07 ZP Marca Samsung
Bantildeo Mariacutea HB4 digital Marca IKA
Bantildeo de arena
Evaporador de vaciacuteo giratorio ИР-1М TU 25-11-917-74
Bantildeo Mariacutea TU 64-1-423-72
Tolvas ВД-1-500 GOST 25336-82
3
Tolvas coacutenicas de vidrio con un diaacutemetro de 30-33 mm GOST 25336-82
Matraz К г -50-1423 ТС GOST 25336-82
Matraz K-1-250-2932 TC GOST 25336-82
Una picadora de carne y trituradora
Tazas de porcelana para la evaporacioacuten (de un diaacutemetro de 55 mm
volumen de 20 cmsup3)
Laacutempara UV OKH-11 TU 84-1-1618-77
Refrigerador con una caacutemara de congelacioacuten
Sistema de filtracioacuten y desgasificacioacuten del eluyente
Podraacuten utilizarse igualmente otros medios de medicioacuten y dispositivos auxiliares cuya
precisioacuten no sea inferior a la de los aparatos recomendados por la teacutecnica
33 Reactivos quiacutemicos y material
Columna metaacutelica para la cromatografiacutea liacutequida
(250x46) Eclipse XDB-C18 5 mkm
Marca Agilent
990967-902
Dimetilnitrosamina ρ=101 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
7756
Dietilnitrosamina ρ=095 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
0756
Dipropilnitrosamina 100 mg Marca Supelko
de cataacutelogo
48554
Metanol para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Fluka
Acetona para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge998 Marca Sigma-
Aldrich
Acetonitrilo para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Sigma-
Aldrich
Benceno ge995 para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Fluka
Aacutecido aceacutetico ge99 Marca Sigma-
Aldrich
Hidroacutegeno bromurado en aacutecido aceacutetico ge33 Marca Sigma-
Aldrich de
cataacutelogo 18735
Metileno cloroso para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Merck
Sulfato de sodio anhidro ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfuacuterico 95-98 Marca Sigma de
cataacutelogo D2625-1г
Hidroacutexido de sodio ge98 Marca Sigma-
Aldrich
Bicarbonato de sodio 997-1003 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfaniacutelico ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Cloruro de Sodio ge995
Marca Sigma-
Aldrich
Agua destilada GOST 6709-72
Filtros de papel ldquobanda azulrdquo TU-6-09-1678-86
Filtros de celulosa regenerada con un diaacutemetro de 47 mm y tamantildeo de
las ceacutelulas de 045 mkm
Marca Agilent
3150-0576
Podraacuten ser utilizados agentes quiacutemicos y material con caracteriacutesticas no inferiores a las
arriba indicadas
4 Meacutetodo de medicioacuten
De conformidad con el presente meacutetodo las mediciones se llevaraacuten a cabo con el uso de
la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con deteccioacuten de fluorescencia realizaacutendose al inicio
las siguientes etapas de preparacioacuten de los ensayos
- destilacioacuten de las nitrosaminas con vapor de agua
- extraccioacuten liacutequido-liacutequido desde el medio acuoso al disolvente orgaacutenico
- obtencioacuten de las aminas ndash desnitrogenacioacuten
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico y evaporacioacuten de la humedad
- obtencioacuten de dansil-derivados de las aminas
- reextraccioacuten de dansil-derivados desde el medio acuoso y de acetona al disolvente
orgaacutenico
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico
- cromatografiacutea de los dansil-derivados obtenidos
5 Requerimientos de seguridad
El local donde se lleve a cabo la deteccioacuten de la NA deberaacute estar equipado
obligatoriamente de una ventilacioacuten por aspiracioacuten
El trabajo con las NA deberaacute realizarse en un sitio cerrado con aspiracioacuten usando medios
individuales de proteccioacuten (lentes guantes y etc)
En el laboratorio donde se realice el trabajo con las NA volaacutetiles canceriacutegenas siempre
deberaacute estar disponible una solucioacuten de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico para destruir las NA
volaacutetiles en caso de que lleguen a parar en los lugares de trabajo y el suelo Al finalizar el
trabajo con el fin de destruir las NA volaacutetiles en el aire se haraacute un tratamiento en el local con
rayos UV durante 30 minutos
El desplazamiento y almacenamiento de las NA se realizaraacute en ampollas de cristal
soldadas envueltas en un tejido de asbesto y embaladas en envases metaacutelicos soldados por
parafina
Las NA se almacenaraacuten en un refrigerador individual donde no haya muestras
analizadas
6 Requerimientos en relacioacuten a la cualificacioacuten del operador
A la realizacioacuten de las mediciones y procesamiento de los resultados del anaacutelisis de
cromatografiacutea podraacuten acceder personas con formacioacuten superior especializada que dispongan de
experiencia de trabajo en el campo de la cromatografiacutea liacutequida que hayan estudiado los
requerimientos de seguridad y la presente teacutecnica la guiacutea de uso del cromatoacutegrafo liacutequido y la
instruccioacuten para el uso de los sistemas de procesamiento de los datos cromatograacuteficos
7 Condiciones de las mediciones
Las mediciones de laboratorio de acuerdo a la presente teacutecnica se llevaraacuten a cabo en las
siguientes condiciones
- la temperatura del aire en la preparacioacuten de las soluciones incluyendo las graduadas
seraacute de (20plusmn2) ordmC
- la temperatura del aire en las mediciones deberaacute ser de (20plusmn5) ordmC
- la presioacuten atmosfeacuterica seraacute de 840-1067 kPa
- la humedad del aire seraacute de (65plusmn15) a una temperatura de 25 ordmC
- la tensioacuten en la red de alimentacioacuten deberaacute ser de (230plusmn10) V
- la frecuencia de la corriente alterna seraacute de (50plusmn04) Hz
Las mediciones en el cromatoacutegrafo liacutequido seraacuten realizadas en las condiciones
recomendadas por los documentos teacutecnicos del dispositivo y la presente teacutecnica
8 Preparativos para realizar las mediciones
Antes de realizarse las mediciones deberaacuten llevarse a cabo los siguientes trabajos
preparar los aparatos de medicioacuten preparar soluciones establecer las caracteriacutesticas de
graduacioacuten seleccionar y preparar las muestras para el anaacutelisis
81 Preparativos de los aparatos de medicioacuten
El cromatoacutegrafo liacutequido se prepara para el funcionamiento de acuerdo a la instruccioacuten de
uso Se establecen regiacutemenes de funcionamiento para la columna y el detector Para la
desgasificacioacuten el matraz con el eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-
50ordmC abrieacutendose simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz hasta la temperatura
ambiente la fase moacutevil estariacutea lista para su aplicacioacuten El eluyente deberaacute estar siempre cerrado
con un tapoacuten y guardarse en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC
82 Preparacioacuten de las soluciones
821 Solucioacuten de cloruro de dansilo con una concentracioacuten de 05 mgcmsup3
La muestra pesada de cloruro de dansilo de un peso de 265 mg se colocaraacute en un matraz
aforado de una capacidad de 50 cmsup3 se disolveraacute en 20 cmsup3 de acetona y se conduciraacute hasta la
marca con acetona La solucioacuten preparada se guardaraacute en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC previniendo minuciosamente la penetracioacuten de humedad en la misma El plazo de
almacenamiento no superaraacute los 3 meses
822 La solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico (solucioacuten denitrozante)
En un matraz coacutenico de una capacidad de 50 cmsup3 se vierten 5 cmsup3 de solucioacuten 33 de
aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico y tambieacuten se antildeaden 45 cmsup3 de aacutecido aceacutetico helado La
mezcla se guardaraacute en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en una vajilla de vidrio
oscuro El plazo de almacenamiento no podraacute superar un mes Un indicio de la ineptitud para
usarse la solucioacuten es la aparicioacuten de una coloracioacuten amarilla y marroacuten
823 Solucioacuten separadora con un pH de 105
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
Acondicionador de aire H 07 ZP Marca Samsung
Bantildeo Mariacutea HB4 digital Marca IKA
Bantildeo de arena
Evaporador de vaciacuteo giratorio ИР-1М TU 25-11-917-74
Bantildeo Mariacutea TU 64-1-423-72
Tolvas ВД-1-500 GOST 25336-82
3
Tolvas coacutenicas de vidrio con un diaacutemetro de 30-33 mm GOST 25336-82
Matraz К г -50-1423 ТС GOST 25336-82
Matraz K-1-250-2932 TC GOST 25336-82
Una picadora de carne y trituradora
Tazas de porcelana para la evaporacioacuten (de un diaacutemetro de 55 mm
volumen de 20 cmsup3)
Laacutempara UV OKH-11 TU 84-1-1618-77
Refrigerador con una caacutemara de congelacioacuten
Sistema de filtracioacuten y desgasificacioacuten del eluyente
Podraacuten utilizarse igualmente otros medios de medicioacuten y dispositivos auxiliares cuya
precisioacuten no sea inferior a la de los aparatos recomendados por la teacutecnica
33 Reactivos quiacutemicos y material
Columna metaacutelica para la cromatografiacutea liacutequida
(250x46) Eclipse XDB-C18 5 mkm
Marca Agilent
990967-902
Dimetilnitrosamina ρ=101 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
7756
Dietilnitrosamina ρ=095 gcmsup3 Marca Sigma
de cataacutelogo N
0756
Dipropilnitrosamina 100 mg Marca Supelko
de cataacutelogo
48554
Metanol para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Fluka
Acetona para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge998 Marca Sigma-
Aldrich
Acetonitrilo para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia ge999 Marca Sigma-
Aldrich
Benceno ge995 para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Fluka
Aacutecido aceacutetico ge99 Marca Sigma-
Aldrich
Hidroacutegeno bromurado en aacutecido aceacutetico ge33 Marca Sigma-
Aldrich de
cataacutelogo 18735
Metileno cloroso para la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia Marca Merck
Sulfato de sodio anhidro ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfuacuterico 95-98 Marca Sigma de
cataacutelogo D2625-1г
Hidroacutexido de sodio ge98 Marca Sigma-
Aldrich
Bicarbonato de sodio 997-1003 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfaniacutelico ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Cloruro de Sodio ge995
Marca Sigma-
Aldrich
Agua destilada GOST 6709-72
Filtros de papel ldquobanda azulrdquo TU-6-09-1678-86
Filtros de celulosa regenerada con un diaacutemetro de 47 mm y tamantildeo de
las ceacutelulas de 045 mkm
Marca Agilent
3150-0576
Podraacuten ser utilizados agentes quiacutemicos y material con caracteriacutesticas no inferiores a las
arriba indicadas
4 Meacutetodo de medicioacuten
De conformidad con el presente meacutetodo las mediciones se llevaraacuten a cabo con el uso de
la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con deteccioacuten de fluorescencia realizaacutendose al inicio
las siguientes etapas de preparacioacuten de los ensayos
- destilacioacuten de las nitrosaminas con vapor de agua
- extraccioacuten liacutequido-liacutequido desde el medio acuoso al disolvente orgaacutenico
- obtencioacuten de las aminas ndash desnitrogenacioacuten
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico y evaporacioacuten de la humedad
- obtencioacuten de dansil-derivados de las aminas
- reextraccioacuten de dansil-derivados desde el medio acuoso y de acetona al disolvente
orgaacutenico
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico
- cromatografiacutea de los dansil-derivados obtenidos
5 Requerimientos de seguridad
El local donde se lleve a cabo la deteccioacuten de la NA deberaacute estar equipado
obligatoriamente de una ventilacioacuten por aspiracioacuten
El trabajo con las NA deberaacute realizarse en un sitio cerrado con aspiracioacuten usando medios
individuales de proteccioacuten (lentes guantes y etc)
En el laboratorio donde se realice el trabajo con las NA volaacutetiles canceriacutegenas siempre
deberaacute estar disponible una solucioacuten de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico para destruir las NA
volaacutetiles en caso de que lleguen a parar en los lugares de trabajo y el suelo Al finalizar el
trabajo con el fin de destruir las NA volaacutetiles en el aire se haraacute un tratamiento en el local con
rayos UV durante 30 minutos
El desplazamiento y almacenamiento de las NA se realizaraacute en ampollas de cristal
soldadas envueltas en un tejido de asbesto y embaladas en envases metaacutelicos soldados por
parafina
Las NA se almacenaraacuten en un refrigerador individual donde no haya muestras
analizadas
6 Requerimientos en relacioacuten a la cualificacioacuten del operador
A la realizacioacuten de las mediciones y procesamiento de los resultados del anaacutelisis de
cromatografiacutea podraacuten acceder personas con formacioacuten superior especializada que dispongan de
experiencia de trabajo en el campo de la cromatografiacutea liacutequida que hayan estudiado los
requerimientos de seguridad y la presente teacutecnica la guiacutea de uso del cromatoacutegrafo liacutequido y la
instruccioacuten para el uso de los sistemas de procesamiento de los datos cromatograacuteficos
7 Condiciones de las mediciones
Las mediciones de laboratorio de acuerdo a la presente teacutecnica se llevaraacuten a cabo en las
siguientes condiciones
- la temperatura del aire en la preparacioacuten de las soluciones incluyendo las graduadas
seraacute de (20plusmn2) ordmC
- la temperatura del aire en las mediciones deberaacute ser de (20plusmn5) ordmC
- la presioacuten atmosfeacuterica seraacute de 840-1067 kPa
- la humedad del aire seraacute de (65plusmn15) a una temperatura de 25 ordmC
- la tensioacuten en la red de alimentacioacuten deberaacute ser de (230plusmn10) V
- la frecuencia de la corriente alterna seraacute de (50plusmn04) Hz
Las mediciones en el cromatoacutegrafo liacutequido seraacuten realizadas en las condiciones
recomendadas por los documentos teacutecnicos del dispositivo y la presente teacutecnica
8 Preparativos para realizar las mediciones
Antes de realizarse las mediciones deberaacuten llevarse a cabo los siguientes trabajos
preparar los aparatos de medicioacuten preparar soluciones establecer las caracteriacutesticas de
graduacioacuten seleccionar y preparar las muestras para el anaacutelisis
81 Preparativos de los aparatos de medicioacuten
El cromatoacutegrafo liacutequido se prepara para el funcionamiento de acuerdo a la instruccioacuten de
uso Se establecen regiacutemenes de funcionamiento para la columna y el detector Para la
desgasificacioacuten el matraz con el eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-
50ordmC abrieacutendose simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz hasta la temperatura
ambiente la fase moacutevil estariacutea lista para su aplicacioacuten El eluyente deberaacute estar siempre cerrado
con un tapoacuten y guardarse en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC
82 Preparacioacuten de las soluciones
821 Solucioacuten de cloruro de dansilo con una concentracioacuten de 05 mgcmsup3
La muestra pesada de cloruro de dansilo de un peso de 265 mg se colocaraacute en un matraz
aforado de una capacidad de 50 cmsup3 se disolveraacute en 20 cmsup3 de acetona y se conduciraacute hasta la
marca con acetona La solucioacuten preparada se guardaraacute en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC previniendo minuciosamente la penetracioacuten de humedad en la misma El plazo de
almacenamiento no superaraacute los 3 meses
822 La solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico (solucioacuten denitrozante)
En un matraz coacutenico de una capacidad de 50 cmsup3 se vierten 5 cmsup3 de solucioacuten 33 de
aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico y tambieacuten se antildeaden 45 cmsup3 de aacutecido aceacutetico helado La
mezcla se guardaraacute en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en una vajilla de vidrio
oscuro El plazo de almacenamiento no podraacute superar un mes Un indicio de la ineptitud para
usarse la solucioacuten es la aparicioacuten de una coloracioacuten amarilla y marroacuten
823 Solucioacuten separadora con un pH de 105
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
Aldrich
Bicarbonato de sodio 997-1003 Marca Sigma-
Aldrich
Aacutecido sulfaniacutelico ge990 Marca Sigma-
Aldrich
Cloruro de Sodio ge995
Marca Sigma-
Aldrich
Agua destilada GOST 6709-72
Filtros de papel ldquobanda azulrdquo TU-6-09-1678-86
Filtros de celulosa regenerada con un diaacutemetro de 47 mm y tamantildeo de
las ceacutelulas de 045 mkm
Marca Agilent
3150-0576
Podraacuten ser utilizados agentes quiacutemicos y material con caracteriacutesticas no inferiores a las
arriba indicadas
4 Meacutetodo de medicioacuten
De conformidad con el presente meacutetodo las mediciones se llevaraacuten a cabo con el uso de
la cromatografiacutea liacutequida de alta eficacia con deteccioacuten de fluorescencia realizaacutendose al inicio
las siguientes etapas de preparacioacuten de los ensayos
- destilacioacuten de las nitrosaminas con vapor de agua
- extraccioacuten liacutequido-liacutequido desde el medio acuoso al disolvente orgaacutenico
- obtencioacuten de las aminas ndash desnitrogenacioacuten
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico y evaporacioacuten de la humedad
- obtencioacuten de dansil-derivados de las aminas
- reextraccioacuten de dansil-derivados desde el medio acuoso y de acetona al disolvente
orgaacutenico
- eliminacioacuten del disolvente orgaacutenico
- cromatografiacutea de los dansil-derivados obtenidos
5 Requerimientos de seguridad
El local donde se lleve a cabo la deteccioacuten de la NA deberaacute estar equipado
obligatoriamente de una ventilacioacuten por aspiracioacuten
El trabajo con las NA deberaacute realizarse en un sitio cerrado con aspiracioacuten usando medios
individuales de proteccioacuten (lentes guantes y etc)
En el laboratorio donde se realice el trabajo con las NA volaacutetiles canceriacutegenas siempre
deberaacute estar disponible una solucioacuten de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico para destruir las NA
volaacutetiles en caso de que lleguen a parar en los lugares de trabajo y el suelo Al finalizar el
trabajo con el fin de destruir las NA volaacutetiles en el aire se haraacute un tratamiento en el local con
rayos UV durante 30 minutos
El desplazamiento y almacenamiento de las NA se realizaraacute en ampollas de cristal
soldadas envueltas en un tejido de asbesto y embaladas en envases metaacutelicos soldados por
parafina
Las NA se almacenaraacuten en un refrigerador individual donde no haya muestras
analizadas
6 Requerimientos en relacioacuten a la cualificacioacuten del operador
A la realizacioacuten de las mediciones y procesamiento de los resultados del anaacutelisis de
cromatografiacutea podraacuten acceder personas con formacioacuten superior especializada que dispongan de
experiencia de trabajo en el campo de la cromatografiacutea liacutequida que hayan estudiado los
requerimientos de seguridad y la presente teacutecnica la guiacutea de uso del cromatoacutegrafo liacutequido y la
instruccioacuten para el uso de los sistemas de procesamiento de los datos cromatograacuteficos
7 Condiciones de las mediciones
Las mediciones de laboratorio de acuerdo a la presente teacutecnica se llevaraacuten a cabo en las
siguientes condiciones
- la temperatura del aire en la preparacioacuten de las soluciones incluyendo las graduadas
seraacute de (20plusmn2) ordmC
- la temperatura del aire en las mediciones deberaacute ser de (20plusmn5) ordmC
- la presioacuten atmosfeacuterica seraacute de 840-1067 kPa
- la humedad del aire seraacute de (65plusmn15) a una temperatura de 25 ordmC
- la tensioacuten en la red de alimentacioacuten deberaacute ser de (230plusmn10) V
- la frecuencia de la corriente alterna seraacute de (50plusmn04) Hz
Las mediciones en el cromatoacutegrafo liacutequido seraacuten realizadas en las condiciones
recomendadas por los documentos teacutecnicos del dispositivo y la presente teacutecnica
8 Preparativos para realizar las mediciones
Antes de realizarse las mediciones deberaacuten llevarse a cabo los siguientes trabajos
preparar los aparatos de medicioacuten preparar soluciones establecer las caracteriacutesticas de
graduacioacuten seleccionar y preparar las muestras para el anaacutelisis
81 Preparativos de los aparatos de medicioacuten
El cromatoacutegrafo liacutequido se prepara para el funcionamiento de acuerdo a la instruccioacuten de
uso Se establecen regiacutemenes de funcionamiento para la columna y el detector Para la
desgasificacioacuten el matraz con el eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-
50ordmC abrieacutendose simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz hasta la temperatura
ambiente la fase moacutevil estariacutea lista para su aplicacioacuten El eluyente deberaacute estar siempre cerrado
con un tapoacuten y guardarse en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC
82 Preparacioacuten de las soluciones
821 Solucioacuten de cloruro de dansilo con una concentracioacuten de 05 mgcmsup3
La muestra pesada de cloruro de dansilo de un peso de 265 mg se colocaraacute en un matraz
aforado de una capacidad de 50 cmsup3 se disolveraacute en 20 cmsup3 de acetona y se conduciraacute hasta la
marca con acetona La solucioacuten preparada se guardaraacute en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC previniendo minuciosamente la penetracioacuten de humedad en la misma El plazo de
almacenamiento no superaraacute los 3 meses
822 La solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico (solucioacuten denitrozante)
En un matraz coacutenico de una capacidad de 50 cmsup3 se vierten 5 cmsup3 de solucioacuten 33 de
aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico y tambieacuten se antildeaden 45 cmsup3 de aacutecido aceacutetico helado La
mezcla se guardaraacute en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en una vajilla de vidrio
oscuro El plazo de almacenamiento no podraacute superar un mes Un indicio de la ineptitud para
usarse la solucioacuten es la aparicioacuten de una coloracioacuten amarilla y marroacuten
823 Solucioacuten separadora con un pH de 105
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
requerimientos de seguridad y la presente teacutecnica la guiacutea de uso del cromatoacutegrafo liacutequido y la
instruccioacuten para el uso de los sistemas de procesamiento de los datos cromatograacuteficos
7 Condiciones de las mediciones
Las mediciones de laboratorio de acuerdo a la presente teacutecnica se llevaraacuten a cabo en las
siguientes condiciones
- la temperatura del aire en la preparacioacuten de las soluciones incluyendo las graduadas
seraacute de (20plusmn2) ordmC
- la temperatura del aire en las mediciones deberaacute ser de (20plusmn5) ordmC
- la presioacuten atmosfeacuterica seraacute de 840-1067 kPa
- la humedad del aire seraacute de (65plusmn15) a una temperatura de 25 ordmC
- la tensioacuten en la red de alimentacioacuten deberaacute ser de (230plusmn10) V
- la frecuencia de la corriente alterna seraacute de (50plusmn04) Hz
Las mediciones en el cromatoacutegrafo liacutequido seraacuten realizadas en las condiciones
recomendadas por los documentos teacutecnicos del dispositivo y la presente teacutecnica
8 Preparativos para realizar las mediciones
Antes de realizarse las mediciones deberaacuten llevarse a cabo los siguientes trabajos
preparar los aparatos de medicioacuten preparar soluciones establecer las caracteriacutesticas de
graduacioacuten seleccionar y preparar las muestras para el anaacutelisis
81 Preparativos de los aparatos de medicioacuten
El cromatoacutegrafo liacutequido se prepara para el funcionamiento de acuerdo a la instruccioacuten de
uso Se establecen regiacutemenes de funcionamiento para la columna y el detector Para la
desgasificacioacuten el matraz con el eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-
50ordmC abrieacutendose simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz hasta la temperatura
ambiente la fase moacutevil estariacutea lista para su aplicacioacuten El eluyente deberaacute estar siempre cerrado
con un tapoacuten y guardarse en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC
82 Preparacioacuten de las soluciones
821 Solucioacuten de cloruro de dansilo con una concentracioacuten de 05 mgcmsup3
La muestra pesada de cloruro de dansilo de un peso de 265 mg se colocaraacute en un matraz
aforado de una capacidad de 50 cmsup3 se disolveraacute en 20 cmsup3 de acetona y se conduciraacute hasta la
marca con acetona La solucioacuten preparada se guardaraacute en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC previniendo minuciosamente la penetracioacuten de humedad en la misma El plazo de
almacenamiento no superaraacute los 3 meses
822 La solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico (solucioacuten denitrozante)
En un matraz coacutenico de una capacidad de 50 cmsup3 se vierten 5 cmsup3 de solucioacuten 33 de
aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico y tambieacuten se antildeaden 45 cmsup3 de aacutecido aceacutetico helado La
mezcla se guardaraacute en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en una vajilla de vidrio
oscuro El plazo de almacenamiento no podraacute superar un mes Un indicio de la ineptitud para
usarse la solucioacuten es la aparicioacuten de una coloracioacuten amarilla y marroacuten
823 Solucioacuten separadora con un pH de 105
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
En un matraz aforado de 500 cmsup3 se colocan 32 g de NaOH y se vierten 200 cmsup3 de agua
destilada Se mezcla todo hasta que el aacutelcali se disuelva por completo y se antildeaden 200 g de
NaHCO3 La solucioacuten se remueve minuciosamente hasta una disolucioacuten completa de la sal se
aumenta el volumen de la solucioacuten con el agua destilada hasta alcanzarse la marca La solucioacuten
se guardaraacute en vajilla de polietileno El plazo de almacenamiento seraacute de 3 meses
824 Solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se vierten 200 cmsup3 de agua destilada Se antildeaden 67 cmsup3
de aacutecido sulfuacuterico concentrado (de una densidad de 198 gcmsup3) lo cual se remueve y se deja
enfriar hasta la temperatura del ambiente El volumen se aumenta hasta llegarse a la marca con
agua destilada El plazo de almacenamiento es ilimitado
825 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DMNA ( de cataacutelogo 7756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado
6
con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8251 Solucioacuten de trabajo de la DMNA con una concentracioacuten de 101 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 10 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3 de
DMNA (apartado 825) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
826 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA ( de cataacutelogo 0756) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con
alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una
vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1
antildeo
8261 Solucioacuten de trabajo de la DENA con una concentracioacuten de 95 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 100 cmsup3 se vierten 20 cmsup3 de alcohol metiacutelico Se antildeade 1 cmsup3
de DENA (apartado 826) con una pipeta de 1 cmsup3 y el volumen se ve aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se deja almacenar en una vajilla de
vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
827 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 250 cmsup3 se trasladaraacute de forma cuantitativa una muestra de
DPNA de un peso de 100 mg ( de cataacutelogo de 48554) disolvieacutendola en alcohol metiacutelico y se
aumentaraacute el volumen del contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
se remueve y se guardaraacute en una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de
2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 1 antildeo
8271 Solucioacuten de trabajo de la DPNA con una concentracioacuten de 2 mkgcmsup3
En un matraz aforado de 200 cmsup3 se colocaraacute 1 cmsup3 de solucioacuten de trabajo de DPNA con
una concentracioacuten de 400 mkgcmsup3 con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 luego se antildeadiraacuten 20 cmsup3
de alcohol metiacutelico se revolveraacute el contenido de forma minuciosa y se aumentaraacute el volumen del
contenido con alcohol metiacutelico hasta alcanzarse la marca La mezcla se remueve y se guardaraacute en
una vajilla de vidrio oscuro en el refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de
6 meses
828 Fase moacutevil para cromatoacutegrafo liacutequido ndash mezcla de acetonitrilo con agua (73)
En caso de no haber desgasificador dentro de la estructura del cromatoacutegrafo liacutequido la
preparacioacuten del eluyente se realizaraacute de forma siguiente Dentro de un matraz coacutenico de 1000
cmsup3 se verteraacuten 700 cmsup3 de acetonitrilo Se antildeadiraacuten 300 cmsup3 de agua destilada se revolveraacute lo
obtenido de forma minuciosa y se realizaraacute la desgasificacioacuten Para la desgasificacioacuten el matraz
con eluyente se colocaraacute en bantildeo Mariacutea a una temperatura de 40-50ordmC abrieacutendose
simultaacuteneamente el tapoacuten Despueacutes de enfriarse el matraz con el eluyente hasta la temperatura
del ambiente el eluyente se filtraraacute a traveacutes de un sistema para filtraje y desgasificacioacuten despueacutes
de lo cual la fase moacutevil estaraacute lista para su uso El eluyente se estaraacute guardando en un
refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC en vajilla cerrada El plazo de almacenamiento es
ilimitado
7
829 Preparacioacuten de las soluciones graduadas
8291 Preparacioacuten de la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA con
concentraciones de 0303 mkgcmsup3 y 0456 mkgcmsup3 respectivamente
En un matraz aforado de 1000 cmsup3 con tapoacuten esmerilado se mezclaraacuten 30 cmsup3 de la
solucioacuten DMNA (de acuerdo al apartado 8251) 48 cmsup3 de DENA (de acuerdo al apartado
8261) medidos con pipetas de 5 cmsup3 y el volumen de lo obtenido seraacute aumentado con alcohol
metiacutelico hasta alcanzarse la marca La solucioacuten se remueve y se guardaraacute en vajilla de vidrio
oscuro en un refrigerador a una temperatura de 2ordmC a 8ordmC durante no maacutes de 6 meses
8292 Separacioacuten de NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
Dentro de un matraz para la destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con un generador de vapor
y refrigerador recto de acuerdo al dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de agua destilada
se antildeadiraacute la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) asiacute como
seraacute antildeadida la solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) en cantidades indicadas en el
cuadro 2 A la mezcla se antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de
cloruro de sodio 10 cmsup3 de la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se
conectaraacute el matraz con el sistema y las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua
reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un matraz de 250 cmsup3
Dicho procedimiento se llevaraacute a cabo para cada solucioacuten graduada antildeadieacutendose la
solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) y la solucioacuten de trabajo
de DPNA (apartado 8271) de conformidad con el cuadro 2
Cuadro 2 - Preparacioacuten de las soluciones graduadas
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
de la solucioacuten graduada Volumen de la mezcla de
DMNA y DENA cmsup3
Volumen de la solucioacuten de
trabajo de DPNA cmsup3
1 017 1
2 083 1
3 330 1
4 660 1
5 1000 1
8293 Extraccioacuten de las NA del destilado
Cada 250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 8292 se colocaraacuten en un
embudo separador de 500 cmsup3 El matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso que luego
se vierte en el embudo separador con el destilado La mezcla se agitaraacute de forma intensiva
durante 5 minutos y se dejaraacute hasta que las fases se definan claramente La extraccioacuten con el
metileno cloroso se repetiraacute nuevamente dos veces con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten de
extracto en metileno cloroso se verteraacute a traveacutes del embudo con un filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz para extraccioacuten por destilacioacuten
con un volumen de 100 cmsup3 El filtro con sulfato de magnesio se lavaraacute con 10 cmsup3 de
extragente
8294 Obtencioacuten de dansil-derivados de las NA
En el extracto seco se antildeadiraacuten 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido
aceacutetico preparada de acuerdo al apartado 822 luego lo obtenido se revertiraacute y se dejaraacute para
el proceso de
8
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a la temperatura del ambiente El metileno cloroso
se evaporaraacute en un evaporador rotatorio a la temperatura del bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30ordmC hasta
alcanzarse aproximadamente 2 cmsup3 El extracto obtenido se trasladaraacute a una taza de porcelana el
matraz para evaporacioacuten se enjuagaraacute con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conectaraacute con el
contenido de la taza de porcelana El extracto de forma cuidadosa se evaporaraacute en un bantildeo de
arena a una temperatura de no maacutes de 120ordmC hasta secarse perfectamente
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
del enfriamiento a la taza de porcelana con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten
separadora (apartado 823) y con movimientos circulares se disolveraacute el residuo seco Al
extracto obtenido con una pipeta de 1 cmsup3 se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de cloruro de dansilo preparado
de acuerdo al apartado 821 lo obtenido se revertiraacute y se trasladaraacute de forma inmediata a una
probeta con tapoacuten esmerilado de 5 cmsup3 Despueacutes la probeta bien cerrada seraacute colocada en bantildeo
Mariacutea con una temperatura de 55 ordmC por no menos de 40 minutos a fin de realizarse el proceso
de obtencioacuten de los dansil-derivados
Posteriormente la probeta seraacute extraiacuteda del bantildeo Mariacutea y se dejaraacute enfriar hasta la
temperatura del ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeadiraacute 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se
agitaraacute intensamente durante 5 minutos y se dejaraacute hasta el momento de la divisioacuten clara de las
fases De la capa superior transparente de benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute
un extracto transparente el cual seraacute trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten
esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se
tomaraacute el extracto transparente de benzol y acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El
volumen total de los disolventes del extracto se apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta
conseguirse un ambiente perfectamente seco y exclusivamente dentro de un armario con
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se antildeadiraacute 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute
fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose intensamente
Con ayuda del meacutetodo arriba mencionado se prepararaacuten cinco series de soluciones de
acuerdo al cuadro 2 en tres frecuencias para cada tipo de concentracioacuten
En el cuadro 3 se indicaraacute la concentracioacuten de las NA presentes en forma de dansil-
derivados en las soluciones obtenidas graduadas
Las soluciones obtenidas de dansil-derivados de DMNA DENA y DPNA se guardaraacuten
en un refrigerador durante 20 diacuteas a una temperatura de 4-5 ordmC Al transcurrir 20 diacuteas en caso de
que las soluciones registren desviaciones de los indicadores iniciales de acuerdo al apartado
832 y 91 las mismas no deberaacuten ser utilizadas posteriormente y se prepararaacuten de nuevo
Cuadro 3 ndash Concentracioacuten de las NA en las soluciones graduadas
de la solucioacuten
graduada
Concentracioacuten de las NA mkgcmsup3
DMNA DENA DPNA
1 005 008 200
2 025 038 200
3 100 150 200
4 200 301 200
5 303 456 200
8295 Revisioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos utilizados (ensayo en vaciacuteo)
Antes de realizar los caacutelculos seraacute necesario realizar la revisioacuten de los agentes quiacutemicos
utilizados en relacioacuten a su pureza (se llevaraacute a cabo para una prueba) Para ello en un matraz de
destilacioacuten de 500 cmsup3 conectado con la caldera de vapor y el refrigerador recto de acuerdo al
dibujo del Anexo A se colocaraacuten 250 cmsup3 de
9
agua destilada y se antildeadiraacute una solucioacuten de trabajo de DPNA (apartado 8271) A la mezcla se
antildeadiraacuten 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido sulfamiacutenico 10 g de cloruro de sodio 10 cmsup3 de
la solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se revuelve se conectaraacute el matraz con el sistema y
las NA se extraeraacuten por destilacioacuten con vapor de agua reuniendo 250 cmsup3 de destilado en un
matraz de 250 cmsup3 Luego se realizaraacuten acciones de acuerdo a los apartados 8293 y apartado
8294
83 Establecimiento de la caracteriacutestica de graduacioacuten
831 Condiciones de la cromatografiacutea
La cromatografiacutea de las soluciones de graduacioacuten y el ensayo en vaciacuteo se realizaraacuten con
ayuda de un cromatoacutegrafo liacutequido con detector fluorescente en las siguientes condiciones
- columna de acero inoxidable (250x46 mm) llenada con sorbente Eclipse XDB-
C18 con tamantildeo de las partiacuteculas de 5 mkm
- temperatura de la columna 30degC
- fase moacutevil ndash mezcla de acetonitrilo y agua en una proporcioacuten de 73
- velocidad de eluacioacuten ndash 12 cmsup3min
- longitud de la honda de excitacioacuten ndash 350 nm
- filtro de emisioacuten ndash 530 nm
- coeficiente de reforzamiento del Multiplicador Fotoelectroacutenico ndash 10
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
- ancho del pico gt 02 min repercusioacuten permanente 4 seg
- volumen de la muestra inyectada ndash 20 mkl
- el tiempo de retencioacuten de los dansil-derivados de las NA seraacute establecido de
acuerdo a las soluciones de graduacioacuten con las condiciones arriba indicadas de la cromatografiacutea
832 Caacutelculo del coeficiente relativo graduado
Para calcular el coeficiente relativo graduado de cada NA que se determina se utilizaraacuten
soluciones de graduacioacuten preparadas de conformidad con los apartados 8292-8294 y la
muestra testigo Para ello la parte de aliacutecuota de 0020 cmsup3 de cada solucioacuten graduada se
introduce en un inyector del cromatoacutegrafo liacutequido Se registran las superficies de picos de
DMNA y DENA y el estaacutendar interno La cromatografiacutea de cada solucioacuten graduada y la muestra
testigo se realizaraacute tres veces
Se calcularaacuten los coeficientes de graduacioacuten relativos K irel para cada concentracioacuten de
DMNA y DENA en relacioacuten al estaacutendar interno con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 de
acuerdo a las foacutermulas (1) ndash (6) Los valores medios de los coeficientes K rel seraacuten calculados
con ayuda de las foacutermulas (7) (8) para cada NA que se determine (DMNA y DENA) dentro de
la banda total de mediciones
S oDMNAtestig = 3
3
1
testigoj
jDMNAS
(1)
donde
S oDMNAtestig es la superficie promedia del pico de DMNA en la muestra testigo
testigojDMNAS es la superficie del pico de DMNA con la medicioacuten j de la muestra testigo
S oDENAtestig = 3
3
1
j
gojDENAtestiS
(2)
S oDENAtestig es la superficie promedia del pico de DENA en la muestra testigo
gojDENAtestiS es la superficie del pico de DENA con la medicioacuten j de la muestra testigo
10
K ijrelDMNA= )(
int
int
oDMNAtestigijDMNAest
ijestiDMNA
SSC
SC
(3)
donde
K ijrelDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DMNA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDMNAC es la concentracioacuten de DMNA en solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDMNAS es la superficie de pico de DMNA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDMNA=9
9
1
j
ijrelDMNAK
(4)
donde
K irelDMNA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DMNA
en solucioacuten i graduada
De forma anaacuteloga se calcularaacute el coeficiente relativo graduado K iDENA para la
concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada
K ijrelDENA = )(
int
int
oDENAtestigijDENAest
ijestiDENA
SSC
SC
(5)
donde
K ijrelDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la solucioacuten i de DENA de acuerdo a los
resultados de la medicioacuten j
iDENAC es la concentracioacuten de DENA en la solucioacuten i graduada (cuadro 3) mkgcmsup3
ijDENAS es la superficie de pico de DENA a raiacutez de la medicioacuten j de la solucioacuten i graduada
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (DPNA) en la solucioacuten i graduada mkgcmsup3
( intestC = 200 mkgcmsup3)
intijestS es la superficie de pico del estaacutendar interno (DPNA) a raiacutez de la medicioacuten j de la
solucioacuten i graduada
K irelDENA =9
9
1
j
ijrelDENAK
(6)
donde
K irelDENA es el valor relativo promedio del coeficiente graduado para la concentracioacuten de DENA
en solucioacuten i graduada
11
K relDMNA= 5
5
1
i
irelDMNAK
(7)
K relDMNA es el valor medio del coeficiente relativo de graduacioacuten para el DMNA en toda la
banda de concentraciones
K relDENA =5
5
1
i
irelDENAK
(8)
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
K relDENA es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA en toda la
banda de concentraciones
84 Seleccioacuten de muestras para el anaacutelisis
La seleccioacuten de muestras se llevaraacute a cabo de conformidad con el STB 1036 El peso de
una muestra promedia del alimento o materia prima alimenticia no deberaacute ser menos de 1 kg
Las muestras seleccionadas se guardaraacuten en una caacutemara de congelacioacuten a una
temperatura de menos 8 degC a menos 18 degC
9 Realizacioacuten del anaacutelisis
Antes de realizarse el anaacutelisis de la muestra estudiada deberaacuten cumplirse las siguientes
etapas
1) Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
2) Verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo)
3) Preparacioacuten de la muestra analizada
4) Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
91 Verificacioacuten de la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten
Para controlar la estabilidad del coeficiente de graduacioacuten antes de realizarse el anaacutelisis
de las muestras estudiadas dentro del inyector del cromatoacutegrafo se introducen una sola vez las
soluciones de graduacioacuten 2 y 4 (de conformidad con el cuadro 3) preparadas de acuerdo a los
apartados 8292-8294 y una muestra testigo Despueacutes de ello se calcularaacute el K practDMNA y el
K practDENA de acuerdo a las formulas (3) y (5) La desviacioacuten de los coeficientes relativos de
graduacioacuten para la DMNA y la DENA en cada una de las soluciones de los valores obtenidos en
el marco del caacutelculo del coeficiente relativo de graduacioacuten de acuerdo al apartado 832 no
deberaacute superar un 10 para cada NA determinada
rel
practrel
K
KK 100 le 10 (9)
donde
K rel es el valor promedio del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA
obtenido en el caacutelculo de acuerdo al apartado 832
K pract es el valor del coeficiente relativo de graduacioacuten de la DMNA o DENA obtenido en la
revisioacuten del coeficiente de graduacioacuten
12
En caso de obtenerse el valor del coeficiente de graduacioacuten que se diferencie maacutes de un
10 de cualquier NA que se esteacute determinando seraacute necesario adoptar medidas para liquidar las
razones del incumplimiento de la condicioacuten (9)
92 Control de la muestra testigo
La verificacioacuten de la pureza de los agentes quiacutemicos (control de la muestra testigo) se
llevaraacute a cabo al usarse un nuevo lote de agentes quiacutemicos de acuerdo al apartado 8295 La
solucioacuten que se obtenga se someteraacute dos veces a la cromatografiacutea Las concentraciones de la
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
DMNA y la DENA en una muestra testigo calculadas de acuerdo a los apartados 1011
1012 no deberaacuten superar respectivamente los 00010 mgkg y 000075 mgkg En caso de
superarse los liacutemites indicados seraacute necesario adoptar medidas para limpiar los agentes quiacutemicos
utilizados o sustituirlos En caso de que la suma de concentraciones que se esteacuten determinando
en la NA dentro de una muestra testigo no supere los 00001 mgkg al calcularse los resultados
de las mediciones se permitiraacute que no se tome en consideracioacuten el contenido de la NA en la
muestra testigo
93 Preparacioacuten de la muestra analizada
931 Separacioacuten de las NA por medio de la extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua
La muestra media de 1 kg se tritura se revierte minuciosamente y de la muestra obtenida
seraacuten extraiacutedas 2 muestras pesadas de 100 g (pesadas con una precisioacuten de 01 g) Cada muestra
pesada seraacute colocada en un matraz de fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra pesada se le
antildeaden 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se antildeade una solucioacuten de
DPNA con una concentracioacuten de 2 mkg cmsup3 (apartado 8271) y en volumen de 1 cmsup3 A la
mezcla obtenida se antildeaden 10 g de cloruro de sodio 10 g de sulfato de sodio 1 g de aacutecido
sulfaniacutelico 10 cmsup3 de solucioacuten 1 n de aacutecido sulfuacuterico La mezcla se remueve el matraz se instala
en el sistema de extraccioacuten por destilacioacuten con vapor de agua de las NA y se recogen 200-250
cmsup3 de destilado El esquema del dispositivo para extraccioacuten por destilacioacuten se indicaraacute en el
Anexo A
932 Extraccioacuten de las NA del destilado
200-250 cmsup3 de destilado obtenido de acuerdo al apartado 931 se colocan en un
embudo separador de 500 cmsup3 el matraz se enjuaga con 20 cmsup3 de metileno cloroso el cual se
vierte posteriormente en un embudo separador con el destilado la mezcla se agita de forma
intensiva durante 5 minutos y se deja hasta que se realice una clara segregacioacuten de las fases La
extraccioacuten con metileno cloroso se repite dos veces maacutes con porciones de 20 cmsup3 Cada porcioacuten
de extracto en metileno cloroso se vierte a traveacutes de un embudo con filtro de papel llenado con 5
g de sulfato de sodio anhidro o sulfato de magnesio en un matraz de extraccioacuten por destilado de
100 cmsup3 El filtro con sulfato de sodio se lava con 10 cmsup3 de extragente Posteriormente al
extracto seco se antildeaden 2 cmsup3 de solucioacuten 33 de aacutecido bromhiacutedrico en aacutecido aceacutetico
preparada de acuerdo al apartado 822 lo obtenido se revuelve y se deja para el proceso de
desnitrogenacioacuten por no menos de 30 minutos a una temperatura del ambiente El metileno
cloroso se evapora en un evaporador rotativo a la temperatura de bantildeo Mariacutea de no maacutes de 30 ordmC
El extracto obtenido se trasladaraacute cuantitativamente a una taza de porcelana el matraz de
evaporacioacuten se enjuaga con 05 cmsup3 de aacutecido aceacutetico y se conecta con el contenido de la taza de
porcelana El extracto se evaporaraacute delicadamente en un bantildeo de arena a una temperatura de no
maacutes de 120ordmC hasta que esteacute perfectamente seco
La taza con el residuo seco se dejaraacute enfriar hasta la temperatura del ambiente Despueacutes
de enfriarse a la taza de porcelana se antildeadiraacuten 06 cmsup3 de solucioacuten separadora y con movimientos
circulares se disolveraacute el sobrante seco Al extracto obtenido se antildeadiraacuten 08 cmsup3 de solucioacuten de
cloruro de dansilo preparado de acuerdo al apartado 821 lo obtenido seraacute revuelto e
inmediatamente se trasladaraacute
13
la mezcla a una probeta de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado La probeta con el tapoacuten apretado se
colocaraacute en un bantildeo Mariacutea con una temperatura de 55degC por no menos de 40 minutos para ser
sometida al proceso de obtencioacuten de los dansil-derivados
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
Luego la probeta se extrae del bantildeo Mariacutea y se deja enfriar hasta la temperatura del
ambiente A la solucioacuten obtenida se antildeade 1 cmsup3 de benzol lo obtenido se agita durante 5
minutos y se deja hasta que las fases se definan claramente De la capa superior transparente de
benzol y acetona con una pipeta de 20 cmsup3 se tomaraacute el extracto transparente el cual seraacute
trasladado a una probeta seca de 5 cmsup3 con tapoacuten esmerilado Despueacutes de ello la extraccioacuten con
benzol se repetiraacute una vez maacutes y de nuevo se tomaraacute el extracto transparente de benzol y
acetona unieacutendolo con la primera porcioacuten El volumen total de los disolventes del extracto se
apartaraacute soplando en el flujo de nitroacutegeno hasta conseguirse un ambiente perfectamente seco y
exclusivamente dentro de un armario con extraccioacuten Al residuo seco que se haya obtenido se
antildeade 1 cmsup3 de fase moacutevil se cerraraacute fuertemente y se disolveraacute el residuo seco agitaacutendose
intensamente La solucioacuten transparente obtenida se someteraacute a la cromatografiacutea dos veces en las
condiciones de cromatografiacutea indicadas en el apartado 831
94 Preparacioacuten de la muestra con adicioacuten
La preparacioacuten y el anaacutelisis de la muestra con adicioacuten se llevaraacuten a cabo 1 vez dentro de
una serie de 5 muestras Para ello de la prueba media de la muestra preparada de acuerdo al
apartado 931 se seleccionaraacuten 2 muestras pesadas de 100 g con una precisioacuten de 01 g Cada
muestra pesada seraacute colocada en un matraz con un fondo redondo de 500 cmsup3 A la muestra
pesada se antildeadiraacuten 150 cmsup3 de agua destilada y con ayuda de una pipeta de 1 cmsup3 se inyectaraacute la
solucioacuten de DPNA con una concentracioacuten de 200 mkgcmsup3 (apartado 8271) de un volumen de
1 cmsup3 asiacute como la solucioacuten principal de la mezcla de DMNA y DENA (apartado 8291) en un
volumen de 33 cmsup3 con ayuda de una pipeta de 5 cmsup3
El posterior anaacutelisis se realizaraacute de acuerdo a los apartados 931-932
10 Resultados de las mediciones
101 Caacutelculo del contenido de las NA
1011 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDMNAtestig = 1int
1int
testigoest
relDMNAoDMNAtestigest
S
KSC (10)
donde
C 1oDMNAtestig es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDMNAtestigS es la superficie del pico de la DMNA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDMNA es el coeficiente relativo graduado para la DMNA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (7))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3 ( intestC = 200 mkgcmsup3)
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DMNA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDMNAtestig usando una foacutermula para ello (10)
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
14
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DMNA de la muestra testigoС oDMNAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDMNAtestig = 2
21 oDMNAtestigoDMNAtestig CC (11)
donde
С oDMNAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1012 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
La concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo seraacute calculada con fundamento a
las mediciones indicadas de acuerdo al apartado 92
C 1oDENAtestig = 1int
1int
testigoest
relDENAoDENAtestigest
S
KSC (12)
donde
C 1oDENAtestig es la concentracioacuten de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al cromatograma 1
mkgcmsup3
1oDENAtestigS es la superficie del pico de la DENA en la muestra testigo de acuerdo al
cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo graduado para la DENA (se calcularaacute de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (200 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int testigoestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en la muestra testigo de
acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga se calcularaacute la concentracioacuten de la DENA de acuerdo al
cromatograma 2 C 2oDENAtestig usaacutendose una foacutermula para ello (12)
Luego se calcularaacute la concentracioacuten media de la DENA de la muestra testigoС oDENAtestig
usaacutendose para ello la siguiente foacutermula
С oDENAtestig = 2
21 oDENAtestigoDENAtestig CC (13)
donde
С oDENAtestig es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en una muestra testigo
mkgcmsup3
1013 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DMNA en la prueba de la muestra
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
C 1 1aDMNAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDMNAaDMNAmuestrest
S
KSC (14)
donde
C 1 1aDMNAmuestr es la concentracioacuten de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDMNAmuestr es la superficie del pico de la DMNA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
15
K relDMNA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DMNA (localizado de acuerdo a la
foacutermula 7)
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno (2 mkgcmsup3) mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (14) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DMNA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDMNA
El valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDMNAmuestr1 = 2
211 aDMNAmuestraDMNAmuestr CC (15)
donde
С aDMNAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X 1 aDMNAmuestr =
( 1С aDMNAmuestr - 1С oDMNAtestig ) х V (16)
P 1
donde
X 1 aDMNAmuestr es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la muestra de la primera prueba en paralelo g
V es el volumen del extracto analizado cmsup3
De forma anaacuteloga se calcularaacute el contenido de la DMNA para la segunda muestra en
paralelo (X traIIDMNAmues )
X traIIDMNAmues =
( IIС aDMNAmuestr - C oDMNAtestig ) х V (17)
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
P II
donde
X traIIDMNAmues es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo mkgg (mgkg)
IIС aDMNAmuestr es el valor promedio de la concentracioacuten de la DMNA en la segunda prueba en
paralelo de la muestra mkg cmsup3 el cual se calcularaacute de forma similar al caso de la prueba
paralela de acuerdo a las foacutermulas (14) (15)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
El valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X DMNA = 2
1 traIIDMNAmuesaDMNAmuestr XX (18)
donde
X DMNA es el valor promedio del contenido de la DMNA en la muestra analizada mgkg
16
1014 Caacutelculo de la concentracioacuten de la DENA en la prueba de la muestra
C 1 1aDENAmuestr = 1int1
11int
muestraest
relDENAaDENAmuestrest
S
KSC (19)
donde
C 1 1aDENAmuestr es la concentracioacuten de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1 mkgcmsup3
S 1 1aDENAmuestr es la superficie del pico de la DENA en la muestra analizada de la primera liacutenea
paralela de acuerdo al cromatograma 1
K relDENA es el coeficiente relativo de graduacioacuten para la DENA (seraacute calculado de acuerdo a una
foacutermula (8))
intestC es la concentracioacuten del estaacutendar interno mkgcmsup3
1int1 muestraestS es la superficie del pico del estaacutendar interno (DPNA) en una muestra testigo de la
primera liacutenea paralela de acuerdo al cromatograma 1
De forma anaacuteloga con ayuda de una foacutermula (19) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA de acuerdo al cromatograma 2 del primer ensayo en paralelo de la muestra C 21 muestraDENA
El valor promedio de la concentracioacuten de DENA en el primer ensayo en paralelo de la
muestra en caso de cumplirse la condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute
calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
С aDENAmuestr1 = 2
2111 aDENAmuestraDENAmuestr CC (20)
donde
С aDENAmuestr1 es el valor promedio de la concentracioacuten de la DENA en el primer ensayo en
paralelo de la muestra mkgcmsup3
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
El contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo se calcularaacute de acuerdo a la
siguiente foacutermula
X aDENAmuestr1 =
(С aDENAmuestr1 - C oDENAtestig ) х V (21)
P 1
donde
X aDENAmuestr1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo mkgg (mgkg)
P 1 es la muestra pesada de la primera prueba en paralelo g
De forma similar de acuerdo a las foacutermulas (20)-(21) se calcularaacute la concentracioacuten de la
DENA para la segunda prueba en paralelo de la muestra (X traIIDENAmues )
X traIIDENAmues =
(С traIIDENAmues - C oDENAtestig ) х V (22)
P II
donde
X traIIDENAmues es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo mkgkg (mgkg)
P II es la muestra pesada de la muestra de la segunda prueba en paralelo g
17
El valor promedio del contenido de DENA en la muestra en caso de cumplirse la
condicioacuten de repetitividad indicada en el apartado 111 seraacute calculado de acuerdo a la siguiente
foacutermula
X DENA = 2
11 traIIDENAmuesaDENAmuestr XX (23)
donde
X DENA es el valor promedio del contenido de DENA en la muestra analizada mgkg
Los valores promedios del contenido de DMNA y DENA se redondean hasta la quinta
cifra despueacutes de la coma
1015 Caacutelculo del contenido de la suma de DMNA y DENA en la muestra
El contenido de la suma de DMNA y DENA (X DENADMNA ) mgkg en la muestra
analizada seraacute calculado de acuerdo a la siguiente foacutermula
X DENADMNA = X DMNA + X DENA (24)
Los valores del contenido de la suma de DMNA yo DENA se redondean hasta la cuarta
cifra despueacutes de la coma
En caso de que la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica C LOQDMNA o C LOQDENA respectivamente se daraacute una evaluacioacuten unilateral
de la concentracioacuten masiva de DMNA o DENA en la muestra en forma de X DMNA ltX LOQDMNA o
X DENA ltX LOQDENA (los valores X LOQDMNA X LOQDENA se indican en el cuadro 1) En caso de que la
concentracioacuten masiva solamente de una de las NA que se determinan sea inferior al liacutemite de
medicioacuten de la teacutecnica el resultado se emitiraacute para otra NA
11 Verificacioacuten de la aceptabilidad de los resultados de los ensayos
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
La aceptabilidad de los resultados se verificaraacute de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002 Los
resultados de las investigaciones deberaacuten ser obtenidos en condiciones de repetitividad y
precisioacuten intermedia
111 Control de acuerdo al estaacutendar interno
La desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno en todas las muestras
ensayadas no deberaacute superar un 10 del valor obtenido al calcularse el coeficiente relativo de
graduacioacuten En caso de que la desviacioacuten de la superficie del pico del estaacutendar interno supere el
valor indicado seraacute necesario aclarar y eliminar sus razones y repetir el anaacutelisis
111 Control de la repetitividad de los resultados de las mediciones
El control se realizaraacute de acuerdo a dos resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de repetitividad El valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones para cada NA que se defina deberaacute compararse con el valor absoluto de los liacutemites
de la repetitividad r absDMNA y r absDENA que seraacuten calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
r absDMNA = r nDMNA x 001 x X DMNA (25)
donde
r nDMNA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
18
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DMNA es la concentracioacuten masiva de la DMNA en dos muestras en paralelo mgkg
r absDENA = r nDENA x 001 x X DENA (26)
donde
r nDENA es el valor relativo del liacutemite de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
001 es el coeficiente para recalcular los porcentajes
X DENA es la concentracioacuten masiva de la DENA en dos muestras en paralelo mgkg
En caso de que para el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en las pruebas en paralelo se cumplan las siguientes condiciones
X I aDMNAmuestr - X II aDMNAmuestr le r absDMNA (27)
X I aDENAmuestr - X II aDENAmuestr le r absDENA (28)
ambos resultados se consideraraacuten aceptables y en calidad de resultado de las mediciones de la
concentracioacuten masiva de la NA respectiva se indicaraacute el valor promedio de X DMNA y de
X DENA calculado con ayuda de foacutermulas especiales (18) (23)
En caso de que el valor de la diferencia absoluta entre los dos resultados de las
mediciones en paralelo de la concentracioacuten masiva de la DMNA o DENA supere el valor r abs se
deberaacuten obtener dos resultados maacutes En caso de que la diferencia entre los cuatro resultados de
las investigaciones para la DMNA y DENA sea inferior o igual a la escala criacutetica (foacutermulas (29)
ndash (30)) el valor promedio aritmeacutetico de los cuatro resultados (foacutermulas (33) ndash (34)) deberaacute
indicarse como resultado final de las mediciones X finDMNA y X finDENA
| X DMNAmax - X DMNAmin | le CR DMNA950 (29)
| X DENAmax - X DENAmin | le CR DENA950 (30)
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
CR DMNA950 = 001 X finDMNA 36 σ rDMNA (31)
CR DENA950 = 001 X finDENA 36 σ rDENA (32)
donde
σ rDMNA es el indicador de repetitividad para la DMNA (cuadro 1)
σ rDENA es el indicador de repetitividad para la DENA (cuadro 1)
36 es el coeficiente de la banda criacutetica para n = 4 con P= 95
X finDMNA X finDENA son los valores promedios aritmeacuteticos de los cuatros resultados de las
mediciones calculados de acuerdo a las siguientes foacutermulas
X finDMNA = 4
4
1
i
iDMNAX
(33)
X finDENA = 4
4
1
i
iDENAX
(34)
Caso al obtenerse los cuatro resultados de las mediciones las condiciones (29) (30) no se
cumplan se deberaacute aclarar y eliminar la razoacuten de los resultados insatisfactorios y llevarse a cabo
de nuevo las mediciones
112 Control de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia
19
La revisioacuten de la aceptabilidad de los resultados de las mediciones obtenidos en
condiciones de precisioacuten intermedia se llevaraacute a cabo de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
Despueacutes de revisarse los resultados obtenidos de las determinaciones en paralelo de
acuerdo al criterio de repetitividad del apartado 111 se calcularaacuten el Х DMNA y el Х DENA
Х DMNA =
Х 1 DMNA + Х II DMNA (35)
2
donde
Х 1 DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de una
foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de
una foacutermula (18) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DMNA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DMNA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Х DENA =
Х 1 DENA + Х II DENA (36)
2
donde
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
Х 1 DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el primer operador mgkg
Х II DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de una
foacutermula (23) con ayuda de dos mediciones en paralelo por el segundo operador mgkg
Х DENA es el valor promedio de la concentracioacuten masiva de la DENA calculado a base de los
resultados de las mediciones de los dos operadores mgkg
Se calcularaacuten las diferencias absolutas de los resultados para Х 1 DMNA Х II DMNA Х 1 DENA
y Х II DENA los compararaacuten con el valor de la diferencia criacutetica CR abs
CR absDMNA = CR DMNA950 001 X DMNA (37)
CR absDENA = CR DENA950 001 X DENA (38)
CR DMNA950 = 2
2
2
)(DMNA
DMNATOI
rr (39)
donde
DMNATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DMNA indicado en el cuadro 1
DMNAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DMNA indicado en el cuadro 1
CR DENA950 = 2
22
)(
DENADENATOI
rr (40)
donde
DENATOIr )( es el liacutemite relativo de la precisioacuten intermedia para la DENA indicado en el cuadro 1
20
DENAr es el liacutemite relativo de la repetitividad para la DENA indicado en el cuadro 1
Si para el valor de las diferencias absolutas entre los resultados se cumplen las siguientes
condiciones
| X I DMNA - X II DMNA | le CR absDMNA (41)
| X I DENA - X II DENA | le CR absDENA (42)
los resultados finales obtenido en condiciones de precisioacuten intermedia se consideraraacuten
aceptables y los valores promedios de Х DMNA y Х DENA calculados de acuerdo con las
foacutermulas (35) (36) podraacuten ser usados en calidad de resultado declarado
En caso de superarse la normativa indicada deberaacuten aclararse y eliminarse las razones
que deriven en los resultados insatisfactorios de control de la precisioacuten intermedia
113 Control del nivel de extraccioacuten
Para controlar el nivel de extraccioacuten se utilizaraacuten los resultados del anaacutelisis de las
muestras con adicioacuten obtenidos de acuerdo al apartado 94 y las mismas muestras sin adicioacuten
de acuerdo al apartado 93 El caacutelculo del nivel de extraccioacuten (Rec) se llevaraacute a cabo de acuerdo
a las siguientes foacutermulas
X obDMNA= 2
1 IIobDMNAobDMNA XX (43)
donde
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
X obDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
IIobDMNAX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDMNA= 2
1 AIIcontrDMNcontrDMNA XX (44)
donde
X contrDMNA es el contenido promedio de la DMNA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDMNAX1 es el contenido de la DMNA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDMNX es el contenido de la DMNA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DMNAmedadic = Х DMNAobr - Х contrDMNA (45)
donde
X DMNAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DMNA obtenido de forma experimental mgkg
Rec DMNA = teorDMNAadic
medDMNAadic
X
X
100 (46)
donde
Rec DMNA es el nivel de extraccioacuten de la DMNA de la muestra
teorDMNAadicX es el valor de la adicioacuten de la DMNA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDMNAadicX = 001000 mgkg)
X ENAobD = 2
1 IIobDENAobDENA XX (47)
donde
X obDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra con adicioacuten mgkg
obDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
21
IIobDENAX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo con adicioacuten mgkg
X contrDENA= 2
1 AIIcontrDENcontrDENA XX (48)
donde
X contrDENA es el contenido promedio de la DENA en una muestra sin adicioacuten mgkg
contrDENAX1 es el contenido de la DENA en la primera muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
AIIcontrDENX es el contenido de la DENA en la segunda muestra en paralelo sin adicioacuten mgkg
X DENAmedadic = Х DENAobr - Х contrDENA (49)
donde
X DENAmedadic es el valor de la adicioacuten de la DENA obtenido de forma experimental
Rec DENA = teorDENAadic
medDENAadic
X
X
100 (50)
donde
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
Rec DENA es el nivel de extraccioacuten de la DENA de la muestra
teorDENAadicX es el valor de la adicioacuten de la DENA calculado de acuerdo al procedimiento de
preparacioacuten mgkg ( medDENAadicX = 001505 mgkg)
En caso de que el nivel de extraccioacuten de DMNA y DENA se encuentre dentro de una
banda de un 90 a un 110 los resultados de las mediciones se consideraraacuten satisfactorios
Caso contrario seraacute necesario adoptar medidas para eliminar las razones de dicha
disconformidad
12 Verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de los ensayos
La verificacioacuten de la estabilidad de los resultados de las mediciones se realizaraacute con el
uso del mapa de Shewhart (mapa R de las bandas) de acuerdo al STB ISO 5725-6-2002
apartado 62
Se utilizaraacuten los datos obtenidos en el marco del anaacutelisis de las pruebas de trabajo Los
mapas de control seraacuten elaborados por separado para las DMNA y las DENA
Al elaborarse el mapa de control se calcularaacuten los siguientes paraacutemetros
- liacutenea central d 2 x σ r
donde d 2 = 1128 (coeficiente para el caacutelculo de la liacutenea central para n=2)
- liacutemites de ajuste UCL=D 2 x σ r
donde D 2 = 3686 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites de ajuste para n=2)
- liacutemites preventivos UCL=D 2 (2) x σ r
donde D 2 (2) = 2834 (coeficiente para el caacutelculo de los liacutemites preventivos para n=2)
σ r es la desviacioacuten estaacutendar de la repetitividad (cuadro 1)
De acuerdo a los resultados de mediciones obtenidos para DMNA y DENA en los mapas
de control se indicaraacute el valor de la banda relativa w
w = 100 2)(
||
21
21
xx
xx
(51)
donde
x 1 y x 2 son los resultados de las mediciones en paralelo del contenido de NA mgkg calculados
para DMNA y DENA de acuerdo a las foacutermulas (16) (17) y (21) (22) respectivamente
100 es el coeficiente para recalcular a por cientos
22
Los valores obtenidos se indicaraacuten en una hoja de datos del mapa de control de acuerdo al
modelo indicado en el cuadro 4
Cuadro 4 ndash Hoja de datos del mapa de control
Data del anaacutelisis Resultados de las
mediciones en
paralelo x 1 x 2
mgkg
Banda relativa w Desviacioacuten estaacutendar
relativa de la
repetitividad s r
DMNA DENA DMNA DENA DMNA DENA
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
La evaluacioacuten de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r calculada de
acuerdo a los datos del mapa de control se deduciraacute conforme a la siguiente foacutermula
s r = 22
|
)( dwdLWL
i
i (52)
donde
L es el nuacutemero de las mediciones realizadas
La evaluacioacuten obtenida de la desviacioacuten estaacutendar relativa de la repetitividad s r seraacute
utilizada en el lugar del indicador establecido de repetitividad en el marco de la elaboracioacuten del
mapa de control de bandas
Posteriormente se aplicaraacuten los pasos conforme a los requerimientos del STB ISO 5725-
6-2002 apartado 622
13 Tramitacioacuten de los resultados de las mediciones
Los resultados de las mediciones seraacuten tramitados de acuerdo al modelo que deberaacute
incluir la siguiente informacioacuten
- nombre (coacutedigo) de la muestra
- fechas de las mediciones
- resultados de las mediciones
- apellido del operador
El resultado garantizado de las mediciones emitido por el laboratorio podraacute reflejarse de
forma siguiente
(X DENADMNA plusmnU (X DENADMNA )) mgkg (53)
donde X DENADMNA es el contenido de la suma de NA obtenido de conformidad con la presente
teacutecnica y calculado de acuerdo a una foacutermula (24) a raiacutez de los resultados de 2 investigaciones e
paralelo de una muestra
U (X DENADMNA ) es el valor absoluto de la evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del
resultado de las mediciones de la suma de DMNA y DENA mgkg
La evaluacioacuten de la indeterminacioacuten ampliada del resultado de las mediciones de la suma
de DMNA y DENA se llevaraacute a cabo de acuerdo a las teacutecnicas de evaluacioacuten de la
indeterminacioacuten aprobadas de conformidad con el orden establecido
23
La teacutecnica ha sido elaborada por el laboratorio de investigaciones cromatograacuteficas de la
Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y Quiacutemicas de la Entidad Estatal RNPTs de Higiene del
Ministerio de Salud de la Repuacuteblica de Belaruacutes
Autores
Jefe de la Seccioacuten de Investigaciones Fiacutesicas y
Quiacutemicas Candidato a Doctor en Quiacutemica
NI Marusich
Cientiacutefico Principal
NP Levoshuk
Cientiacutefico Menor
IN Masalov
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
Bibliografiacutea
[1] ldquoRequerimientos higieacutenicos de la calidad e inocuidad de la materia prima alimenticia y
alimentosrdquo aprobados por el Decreto del Ministerio de Salud 63 del 09 de junio de 2009
[2] Styskin EL Itsikson LB Braude EV ldquoCromatografiacutea liacutequida praacutectica de alta eficaciardquo ndash
Moscuacute ldquoQuiacutemicardquo 1986 ndash paacutegina 288
[3] STB ISO 5725-6-2002 ldquoExactitud (caraacutecter correcto y precisioacuten) de las teacutecnicas y los
resultados de las medicionesrdquo Parte 6 ldquoUso de los valores de la exactitud en la praacutecticardquo ndash
Minsk Gosstandart 2003 ndash paacutegina 42
[4] Guiochon G Guillemin K ldquoCromatografiacutea cuantitativa de gas para los anaacutelisis de
laboratorio y control industrialrdquo Parte 2 ndash M Mir 1994 ndash paacutegina 375
24
Anexo A
(De caraacutecter obligatorio)
Dibujo A1 Esquema de la instalacioacuten para la destilacioacuten con vapor de agua a fin de separar las
NA volaacutetiles de la muestra
1 Generador de vapor
2 Agua destilada
3 Matraz de fondo redondo
4 Homogenizado del producto analizado
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
5 Bantildeo con glicerina
6 Vocal Viurz
7 Tuberiacutea sobre seccioacuten pulida
8 Vocal barbater
9 Refrigerador Liebig
10 Allonge
11 Receptor
25
