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UT 1.Patrones para calibración y análisis Ensayos físicos

2º LACC

Mª José Fernández Simarro 1

UT 1. PATRONES PARA CALIBRACIÓN Y ANÁLISIS

Índice:

1. Necesidad de patrones en los laboratorios de análisis y ensayos

2. Comprobación de la exactitud de instrumentos

3. Los patrones en el análisis químico clásico: Volumetrías y Gravimetrías

4. Métodos de calibración

5. Validación de métodos analíticos

6. Materiales de referencia certificados (CRMs)

7. Cuestionario

1. Necesidad de patrones en los laboratorios de análisis y ensayos

Al realizar una medida en un análisis químico (como masa, concentración, volumen, etc) rara vez se mide el contenido de forma directa. Las concentraciones químicas se determinan por mediciones indirectas, que se basan en mediciones directas junto con calibraciones. Calibración, en el contexto químico, significa comprobación de la relación entre el contenido de la muestra y la respuesta del instrumento o método de ensayo.

Los patrones, sustancias patrón o estándar, son compuestos o materiales cuyo valor de cierta propiedad se acepta que es exacto. Existen patrones químicos que son sustancias puras, mezclas, soluciones, gases, o materiales como aleaciones, o sustancias biológicas que se emplean para calibrar y validar toda la metodología de un análisis o parte de ella. También hay patrones físicos que se emplean como referencia de las características de los materiales como, elasticidad, color, viscosidad y también de las unidades fundamentales de masa, tiempo, longitud y voltaje.

El análisis químico, tanto clásico como instrumental, se lleva a cabo con disoluciones diluidas. Las sustancias patrón también deben diluirse, y las soluciones patrón o estandar en realidad son las que intervienen en los procesos y reacciones químicas. En su preparación, la concentración se trata de ajustar tan cuidadosamente, que se puede aceptar que el error es despreciable.

2. Comprobación de la exactitud de instrumentos. Calibración

En el laboratorio, cada cierto tiempo es necesario chequear los instrumentos y los métodos para constatar su precisión y exactitud, y es la forma de conseguir trazabilidad.

La exactitud es una medida de la proximidad del valor medido al valor verdadero y deriva de los errores sistemáticos de las medidas, que son aquellos que afectan de forma constante y previsible a todas las medidas y por ello puede ser detectado y corregido. La calibración de instrumentos trata de evitar este tipo de errores o bien indicar qué correcciones hay que hacer al valor de la medida y supone el uso de patrones.

La calibración de un instrumento significa chequear su respuesta frente a un patrón, con el fin de obtener siempre la misma respuesta. Si la calibración revela que el equipo no se


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encuentra dentro de unos niveles de funcionamiento aceptables, entonces se tiene que emprender alguna acción correctora.

Por ejemplo, si se usa un pHmetro, que no ha sido calibrado correctamente, se comete un error sistemático. Supongamos que se cree que el pH del tampón usado para calibrar el equipo es 7, pero en realidad es 7,08. Todas las lecturas siguientes serán 0,08 unidades de pH erróneas por defecto. Si se lee un pH 5,60, el pH real de la muestra es 5,68. Este error sistemático se podría descubrir usando un segundo tampón de pH conocido (patrón), para comprobar el aparato.

Otro ejemplo sería una balanza que da un peso erróneo sistemáticamente. Puede calibrarse usando como referencia una pesa patrón; o si la experiencia demuestra que siempre da las pesadas con un error por exceso de 0,2 g, bastará con hacer una corrección en cada pesada restando 0,2.

La frecuencia con que se debe realizar la calibración depende de:

a. Tipo de instrumento: cuanto más sofisticado sea más calibraciones requiere. Ejemplos de equipos robustos son el pHmetro y la balanza.

b. Frecuencia de uso: si se utiliza muy de tiempo en tiempo debe calibrarse cada vez que se usa y si se usa continuamente ya depende de la robustez del instrumento.

c. Ubicación e instalación: si el instrumento está sometido a vibraciones, humedad, polvo, altas temperaturas, etc . requerirá mayor frecuencia de calibraciones.

d. Requerimientos de la metodología analítica: un equipo que se está usando en medios agresivos, como pueden ser ácidos concentrados o disolventes orgánicos, necesitará una calibración frecuente.

3. Los patrones en el análisis químico clásico: Volumetrías y Gravimetrías.

Los patrones utilizados como referencia en los métodos de análisis volumétrico y gravimétrico pueden ser primarios o secundarios. La exactitud del método analítico depende críticamente de estos.

Los patrones primarios son compuestos de elevada pureza y cuyo valor se acepta sin hacer referencia a otro patrón. Se caracterizan por ser compuestos:

• De elevada pureza, del 99,9% o más.

• De gran estabilidad atmosférica

• Que en su molécula no contienen agua de hidratación para que la composición del sólido no cambie con las variaciones en la humedad relativa.

• Baratos y se puedan conseguir con facilidad.

• De solubilidad razonable en el medio de titulación.

• Con una masa molar razonablemente grande para reducir al mínimo el error relativo asociado a la operación de pesada.

Muy pocos reactivos cumplen con todos estos criterios, por esta razón, a veces es necesario utilizar compuestos menos puros, o patrones secundarios, en lugar de uno primario; los patrones secundarios son patrones cuya pureza o cualquier otra propiedad de interés, se obtiene por comparación con un patrón primario.

La solución patrón ideal para un análisis volumétrico deberá:


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• Ser suficientemente estable para que solo sea necesario determinar una vez su concentración.

• Reaccionar rápido con el analito para reducir al mínimo el tiempo requerido entre las adiciones del reactivo.

• Reaccionar completamente con el analito para que se alcance satisfactoriamente el punto final.

• Reaccionar en forma selectiva con el analito para que esta reacción pueda describirse por una simple ecuación balanceada.

Las soluciones patrón pueden prepararse por disolución directa del patrón primario, pesando muy cuidadosamente la cantidad exacta que se disuelve en el disolvente adecuado y se lleva, exactamente, a un volumen final en un matraz aforado; o preparando una disolución de un patrón secundario que se valora o contrasta su concentración con una disolución de un patrón primario, esta se conoce como solución patrón secundaria.

4. Métodos de calibración.

Los métodos instrumentales de análisis se basan en la medida de la respuesta del aparato a cantidades conocidas de analito (patrones), y basándose en ellas se puede interpretar la respuesta a una muestra de contenido desconocido, de modo que permiten comprobar el contenido de analito y asegurar la exactitud de la metodología.

A la aplicación de los patrones para relacionar la respuesta del aparato con la concentración de analito se llama calibración.

Los métodos de calibración utilizados son: del patrón externo y de patrones agregados; el método de los patrones agregados a su vez se dividen en dos categorías: de patrón interno y de adición estandar, ambas se basan en añadir una cantidad conocida (spike, en inglés) de un patrón a cada muestra que se analiza.

En el método del patrón externo se analizan los patrones y el problema por separado. Se preparan una serie de patrones que contienen diferentes cantidades de analito junto con una matriz (matriz es todo lo que hay en la muestra problema menos el analito) semejante o idéntica a la de las muestras. Si el análisis es confiable y la muestra sencilla se puede eliminar la matriz y puede ser suficiente con un patrón y un blanco (el blanco tiene la misma composición que la muestra a excepción del analito).

Los métodos de patrones agregados se utilizan cuando la matriz de la muestra se desconoce o es tan compleja que no es posible utilizar un patrón externo con confianza; cuando la química de la preparación o del método de ensayo son complejas o muy variables; y cuando el ensayo depende de condiciones instrumentales de alta precisión y difíciles de controlar. Por ejemplo, en los análisis por cromatografía pequeñas variaciones de caudales de gas o líquido podrían variar la respuesta del detector.

El método de la adición estandar consiste en realizar una medición inicial del problema sin adición estándar y después agregar una cantidad de analito a cada muestra problema repitiendo la medición tras cada adición estandar. Por lo general las adiciones y las mediciones se realizan una o dos veces y la cantidad de analito presente originalmente en la muestra se encuentra mediante extrapolación.

El método del patrón interno consiste en agregar una cantidad conocida de un compuesto, diferente del analito, a cada réplica problema y al blanco. La señal del analito se compara con la del patrón interno, y de ese modo se determina el analito presente en el problema. El patrón agregado debe diferir lo suficiente del analito, desde el punto de vista


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químico, como para que no interfiera en el ensayo, y al mismo tiempo ser lo suficientemente similar, de modo que su respuesta refleje la respuesta del analito y permita compensar cualquier pérdida.

4.1. Aplicación de patrones externos a la calibración: curva de calibrado

El patrón externo se utiliza para calibrar métodos de ensayo cuando los componentes de la matriz y los reactivos adicionados, no provocan interferencias con el analito. También cuando el analista tiene suficiente control de las condiciones y puede mantener constantes las contribuciones de las interferencias a la medición.

La calibración externa de la respuesta del instrumento se realiza con patrones que contengan diferentes concentraciones de analito en soluciones con la matriz igual a la del problema. En los patrones, es importante mantener constantes las concentraciones de aquellas especies que contenga la matriz que ejerzan influencia en la medición, para que solo se modifique la concentración de las especies analizadas.

Consiste en preparar varios patrones de concentración xi y medir la señal del instrumento, yi, para cada patrón.

Señal del instrumento

Y1 Y2 Y3 Y4

Concentración X1 X2 X3 X4

Así se obtiene un conjunto de pares (yi , xi) cuya representación gráfica es a menudo una línea recta ya que la relación entre la señal y la concentración suele ser lineal (y = mx + b, donde m y b son constantes, m es la pendiente de la recta y b la ordenada en el origen), y si no lo fuese suele ser posible encontrar condiciones experimentales (bajas concentraciones) o hacer tratamientos matemáticos para lograrlo.

Los puntos experimentales obtenidos nunca se adaptan exactamente a una línea recta, siempre hay algunos que quedan fuera debido a errores en la medida. Existen varios métodos para averiguar la recta que mejor se ajusta al conjunto de puntos, que será aquella que pase lo más cerca posible de todos los puntos dejando unos por arriba y otros por abajo. El método de los mínimos cuadrados es el más empleado y se obtiene una recta de regresión de y sobre c, con su coeficiente de correlación o grado de proximidad de los puntos a esa recta y cuyo valor es 1 cuando todos los puntos están exactamente dentro de la recta.


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4.1.1. Cálculo de concentraciones en la curva de calibrado

La ecuación y = mx + b corresponde a la curva de calibrado y permite determinar la concentración de un analito en una muestra, basta con sustituir en la ecuación calculada el valor de la señal medida (yi) y despejar xi.

Esto puede hacerse de forma aproximada por interpolación gráfica: se trazan una paralela al eje X que pase por el punto y de la señal de la muestra y una paralela al eje Y que pase por el punto de corte de la primera recta trazada con la recta de ajuste. La intersección de esta segunda recta con el eje X da la concentración.

La gran ventaja de la curva de calibración es que proporciona una relación empírica entre la señal y la concentración que se adapta a cada sistema. Es decir, la señal analítica se ve influida por muy diversos factores como la naturaleza del disolvente y sus impurezas, el pH, la presión, la temperatura, etc; algunos métodos incluso requieren el cálculo previo de una constante que es característica de cada aparato, mientras la curva de calibrado da cuenta implícitamente de todos estos factores específicos del experimento y por ello permite minimizar muchos errores.

Para construir la curva de calibrado se adopta el siguiente procedimiento:

Paso 1. Preparar muestras conocidas de analito que cubran un intervalo adecuado de concentraciones y medir a respuesta del procedimiento analítico a estos patrones. Este procedimiento genera los datos de la mitad izquierda de la tabla.

Paso 2. Restar la absorbancia media de los tres blancos (0,099) de la absorbancia medida para obtener la absorbancia corregida. El blanco mide la respuesta del procedimiento cuando no hay proteína presente.

Paso 3. Trazar un gráfico con las absorbancias corregidas frente a la cantidad de proteína analizada. Hallar la recta que mejor se ajusta a los datos situados dentro del tramo lineal, es decir hasta el punto de 20 µg de proteína inclusive, descartando los puntos incoherentes como el de 0,392 para la muestra de 15 µg. Hallar la ecuación de la recta de regresión y su coeficiente de correlación.

Paso 4. Preparar la muestra desconocida y un blanco, realizar las medidas. Restar la absorbancia del nuevo blanco de la absorbancia obtenida para obtener la absorbancia corregida e interpolar en la curva de calibrado.

Ejemplo. En un análisis de proteínas mediante la formación de un producto coloreado, por espectrofotometría que da una señal de absorción de la luz que atraviesa la muestra proporcional a la cantidad de proteína, se obtuvieron los siguientes registros:

Absorbancia de replicas independientes

Absorbancia corregida Cantidad de

proteína

(mg) R1 R2 R3 R1 R2 R3

0 0.099 0.099 0.100 0.000 0.000 0.000

5.0 0.185 0.187 0.188 0.085 0.087 0.088

10.0 0.282 0.272 0.272 0.182 0.172 0.172

15.0 0.345 0.347 (0.392) 0.245 0.247 _

20.0 0.425 0.425 0.430 0.325 0.325 0.330

25.0 0.483 0.488 0.496 0.383 0.388 0.396


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4.2. Adición estándar.

Este método de calibrado es especialmente apropiada cuando la composición de la muestra desconocida o compleja y afecta a la señal analítica.

Por ejemplo, en análisis por emisión atómica se aspira una disolución de analito en una llama muy caliente que lo descompone en átomos energetizados. Los átomos emiten luz a frecuencias características de cada elemento. Ciertos componentes de la matriz pueden reaccionar con los átomos del analito y convertirlos en moléculas que no emiten luz a la longitud de onda de trabajo. La composición de la matriz afecta por lo tanto a la señal analítica. Puede ser que la matriz contenga elementos desconocidos que sea imposible incluir en las disoluciones patrón al construir la curva de calibrado. Si se añade un pequeño volumen de disolución concentrada de patrón a una muestra desconocida, no cambia mucho la concentración de la matriz, pero el efecto que la matriz ejerce sobre el analito del patrón será el mismo que el de la muestra problema. La relación entre la respuesta obtenida en la muestra con adición estándar con la concentración de analito en el patrón nos servirá para determinar la concentración de la muestra problema.

=

Expresando la concentración diluida del analito (disolución final) en términos de la concentración inicial del analito, se puede obtener la concentración de la muestra problema.

Ejemplo. El contenido en Na+ de un suero dio una señal de 4,27 mV en un análisis por emisión atómica. A continuación se añadieron 5,00 ml de NaCl 2,08 M a 95,0 ml de suero. Este suero enriquecido dio una señal de 7,98 mV. Hallar la concentración original de Na+ en el suero.

SOLUCIÓN: los moles de Na Cl añadidos son (0.0500 l) x (2.08 M) = 0.014 mol, y la concentración final de NaCl añadido es 0.014 mol/0.100 l = 0.104 M. Aplicando la ecuación anterior:

= � = 0.113 M

A menudo debemos calcular la concentración de una muestra, después de diluirla desde un volumen inicial Vi a Vf. En el ejemplo anterior la disolución de Na Cl 2.08 M se diluyó desde un Vi =5 a un Vf = 5.00 + 95.0 = 100.0 ml. La concentración del NaCl se diluye, pues, de 2.08 M a (Vi/Vf) x (2.08 M) = 0.104. La cantidad (Vi/Vf) se llama factor de dilución y se suelen usar para facilitar los cálculos.

4.2.1. Procedimiento gráfico para la adición estándar

Este método se ilustra en la figura siguiente (fig. 4.2.1.):


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Se pipetea en cada matraz volumétrico volúmenes iguales de la muestra desconocida. A continuación se añaden volúmenes crecientes de patrón a cada matraz. Finalmente, se diluye cada matraz hasta el enrase. Cada frasco contiene, pues, la misma concentración de muestra desconocida y diferentes concentraciones de patrón.

El siguiente paso es analizar cada disolución y construir el gráfico. El eje x representa la concentración de patrón añadido después de haber sido mezclado con la muestra. La abcisa en al origen de la recta extrapolada con signo cambiado es la concentración desconocida después de diluir la muestra al volumen final. En nuestro gráfico este valor es de 0.042 M., si la muestra original se diluyó en un factor de 10.0 (de 5.00 a 50.00 ml) durante la adición de estándar, la muestra original tenía una concentración de analito de (0.042 M) x (10.0 ) = 0,42. El intervalo más útil de adiciones de patrón debe aumentar la señal analítica entre 1,5 y 3 veces el valor original.

4.3. Patrón interno


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Este método es especialmente útil cuando la cantidad de muestra analizada o la respuesta del instrumento varía algo de una experiencia a otra, por razones que son difíciles de controlar y la curva de calibrado no se puede utilizar ya que esta solo es válida cuando las condiciones permanecen constantes durante todo el ensayo.

Los patrones internos son muy utilizados en cromatografía, porque la pequeña cantidad de muestra introducida en el cromatógrafo no es muy reproducible. También son útiles cuando se pueden dar pérdidas de muestra durante los pasos de preparación de la muestra para el análisis. Si se añade una cantidad conocida de patrón a la muestra desconocida antes de cualquier tratamiento, la relación de patrón a analito se mantiene constante, porque se pierde la misma fracción de ambos en cualquier operación.

Para usar un patrón interno, se prepara primero una mezcla conocida de patrón y analito, para medir la respuesta relativa del detector a las dos especies. En el cromatograma de la figura, el área bajo cada uno de los picos es proporcional a la concentración de las especies inyectadas en la columna.

Sin embargo, el detector de ordinario da una respuesta diferente frente a cada componente. Por ejemplo, si tanto el analito (X) como el patrón interno (S) tienen concentraciones de 10.0 mM, el área bajo el pico del analito puede ser 2.30 veces mayor que el área bajo el pico del patrón. En este caso se dice que el factor respuesta, F, de X es 2.30 veces mayor que el de S. El factor respuesta se calcula:

= F

La concentración de analíto y patrón a que se refiere la ecuación, es después de mezclados. Para calcular la concentración inicial se aplica el factor de dilución.

Ejemplo.


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5. Validación de métodos analíticos

La validación consiste en comprobar si una metodología analítica específica resulta satisfactoria para ser empleada por un analista y también por los diversos analistas de varios laboratorios. Esto supone que la metodología analítica seguida es exacta, específica, reproducible y robusta, dentro del intervalo específico en que el analito será analizado.

Es necesario validar los métodos analíticos porque cualquier operación de un procedimiento de medida supone introducir errores aleatorios y puede que también sistemáticos, debido a defectos de la instrumentación, defectos en el operador y defectos en el método de análisis. De hecho, validar un método supone investigar las posibles fuentes de error de cada una de las etapas del procedimiento.

La calibración que es el origen de un gran número de errores. Algunos ejemplos son: equivocaciones en los cálculos de las concentraciones, utilización de patrones que no lo son por no conocerse su pureza y estequiometría, empleo de patrones deteriorados debido a


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una mala conservación, no realizar la medida de un “blanco de reactivos” para comprobar el nivel de contaminación procedente de reactivos, medio ambiente y material utilizado, desprecio del efecto matriz

La validación de un método analítico alcanza tanto a la instrumentación utilizada como el método de análisis en toda su extensión, es decir, desde la toma de muestra hasta la etapa de detección final, sin olvidar comprobar su idoneidad o adecuación para el fin previsto (por ejemplo, un método poco preciso puede ser válido cuando el problema analítico no requiera gran precisión, como ocurre en muchos análisis clínicos).

La validación comienza por la instrumentación, primero se comprueba el estado en que se encuentra la instrumentación a utilizar. La regulación estipula cuatro requerimientos para la validación de un instrumento:

a. Asegurar la idoneidad del instrumento para la tarea encomendada: se realiza por lectura cuidadosa de las especificaciones del mismo.

b. Demostrar que cumple las especificaciones del fabricante: comprobar que responde adecuadamente a las prestaciones exigidas.

c. Conformidad demostrable con los patrones establecidos: calibración.

d. Documentación que evidencie su operatividad y la obtención de datos fiables: comprobar que el instrumento está operativo cuando trabaja bajo las condiciones específicas exigidas y sigue funcionando como originalmente. Siempre que tenga lugar una incidencia, como por ejemplo, el cambio de una lámpara en un espectrofotómetro, debe registrarse y comprobar el funcionamiento del equipo.

La segunda fase consiste en validar el método analítico, mediante la evaluación de seis parámetros incluidos en la norma ISO 3534-1:

1. Precisión 2. Exactitud 3. Límite de detección y de determinación 4. Selectividad 5. Intervalo de linealidad 6. Robustez

En algunas áreas es importante incluir otra serie de parámetros, tales como la recuperación, estabilidad del analito, costo, seguridad, etc.

En el caso de utilizar un método estándar u oficial, el proceso de validaciones rápido ya que bastará con calcular su precisión analizando varias replicas y comprobar su exactitud por medida de un patrón. Si se desea validar un método propio se lleva a cabo la validación completa evaluando todos los parámetros incluidos en la norma y estudiando todos los pormenores de cada etapa.

La exactitud resultado debe demostrarse utilizando alguna de las siguientes técnicas: análisis de diversas réplicas, estudios de recuperación, comparación con métodos alternativos, comparación con otros laboratorios y uso de materiales de referencia certificados.

A. Análisis de diversas réplicas: lo más sencillo es realizar análisis repetidos a partir de muestras diferentes (no sobre diferentes alícuotas de la disolución final). La obtención de resultados repetidos garantiza que no existe error de muestreo, probablemente no haya errores personales, pero no garantiza que no haya errores sistemáticos, como pérdida de analito en la etapa de mineralización. El número de réplicas suele ser de 10.


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B. Estudios de recuperación: consisten en añadir a la muestra el analito en concentración perfectamente conocida y similar a la que se presupone encontrar en el problema y aplicar el procedimiento completo de análisis a las muestras sin adición de analito y a las muestras adicionadas. A partir del resultado se evalúa el porcentaje recuperado del analito añadido. Una elevada recuperación, alrededor del 100% implica una correcta aplicación del método y ausencia de errores sistemáticos para el analito adicionado.

Sin embargo la respuesta no siempre es satisfactoria para el analito presente en la muestra sin adicionar porque una recuperación alta y reproducible a veces no garantiza un resultado exacto debido a que la adición del analito a la muestra no reproduce la situación real del analito en la misma y se pueden cometer errores como por ejemplo, de adición de una forma distinta de la forma química del analito original por desconocimiento de esta.

C. Comparación con métodos alternativos: supone la comparación estadística, por ejemplo de análisis de la varianza, entre el resultado obtenido mediante el método que se pretende validar y el obtenido mediante otro método alternativo. Cuanto más difieran los fundamentos y las etapas de preparación de ambos métodos, tanto más fiable será el proceso de comparación.

D. Comparación con otros laboratorios: consiste en realizar el estudio entre diversos laboratorios en el que cada laboratorio utiliza el mismo método analítico sobre las mismas muestras. Este procedimiento es caro, complicado y consume mucho tiempo por lo que no se suele usar para validar un método.

Los ejercicios inter-laboratorios de utilizan para el autocontrol de la calidad del laboratorio, para la elaboración de un material de referencia, etc. En general sirven para mejorar la calidad de trabajo de cada laboratorio

E. Uso de materiales de referencia certificados: consiste en aplicar todas las etapas del método propuesto al material de referencia y comparar estadísticamente el resultado obtenido con el valor de referencia. El material de referencia debe tener una matriz similar a la de la muestra a analizar y la concentración del analito debe estar lo más cercana posible a la presente en la muestra.

La robustez del método es otro de los parámetros que debe ser evaluado para validar un método, para ello se modifican las variables críticas del método: pH, fuerza iónica, tipo de columnas cromatográficas, pureza de los reactivos, etc. Cuanto más robusto sea el método, menos diferirán los resultados estadísticamente.

Un método normalizado debe validarse cuando se aplica por primera vez en el laboratorio, cuando se aplica a muestras o analitos diferentes para los que ha sido establecido, si se modifica alguna etapa o si se detecta alguna situación fuera de control. Un método propio, que se ha desarrollado en el laboratorio completa o parcialmente siempre debe validarse.

Todos los métodos de análisis, aunque validados deben someterse cada cierto tiempo a sistemas de control que permitan detectar la evolución de la propiedad medida con el tiempo. De esta forma, se podrá detectar rápidamente la presencia de errores y aplicar las medidas correctoras adecuadas.

6. Materiales de referencia certificados (CRMs)

Son patrones que tienen certificados uno o varios de sus valores de una o más de sus propiedades por procedimientos técnicamente válidos llevados a cabo por un organismo competente. No se trata únicamente de un certificado, sino que este certificado garantiza


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que un CRM sea, desde el punto de vista práctico, la mejor referencia posible en la verificación de la trazabilidad de un método analítico.

Por lo tanto, un CRM es un material, similar a las muestra reales que estamos analizando en nuestro laboratorio, y que un organismo competente nos certifica y garantiza el valor de la propiedad que nos interesa (por ejemplo a concentración de un analito).

6.1. Propiedades de los CRMs

Para que un material pueda ser considerado como CRM debe cumplir una serie de requisitos:

A. Trazabilidad: el valor de la propiedad certificada se ha obtenido utilizando diversos métodos analíticos cuyos principios de medida sean completamente diferentes y haciendo un ejercicio de inter-laboratorios.

B. Homogeneidad: es indispensable y significa que debe presentar el mismo valor de la propiedad certificada dentro de la misma unidad y en todas las unidades del CRM. Puede ser homogéneo respecto a la propiedad de interés aunque no lo sea respecto a otras, siempre que no influya en la primera.

C. Estabilidad: el material debe ser estable en las condiciones de envío y se debe conocer durante cuanto tiempo permanece estable el CRM desde su recepción y desde que se abre el recipiente. La estabilidad debe referirse tanto a las propiedades certificadas como a la matriz. Si los CRMs se ven afectados por factores como la luz, la tª o la exposición al oxigeno de la atmósfera, el fabricante debe indicar las condiciones de transporte, manejo y almacenamiento recomendadas.

D. Similitud con muestras reales: tanto la matriz como el valor de la propiedad a medir deben ser lo mas parecido posible a las muestras reales que serán analizadas con ese método analítico. Por ejemplo: si mi laboratorio analiza plomo a nivel de µg/L en agua del rio Segura, el mejor CRM es el agua del rio Segura. Como, probablemente, no exista como tal hemos de utilizar uno parecido que puede ser el CRM 1640-NIST, en el cual se encuentra certificado el plomo en aguas naturales recogidas en Clear Creek (Colorado, EEUU).

E. Incertidumbre: los valores certificados de la propiedad deseada deben ir acompañados por sus valores de incertidumbre. Esto informa de la calidad del CRM y es importante que se adecue a cada necesidad.

Los CRMs no siempre están disponibles, se calcula que solo hay entre un 5 y un 10 % de CRMs para los análisis que actualmente se hacen en todo el mundo, además son muy caros, por ejemplo el CRM 1515-NIST, elementos traza en 50 gramos de hojas de manzana cuesta 342 dólares. En la siguiente tabla aparecen una serie de CRMs.


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⋅ SRMs son materiales bien caracterizados y certificados que se producen en suficiente cantidad, es la caracterización que usa el National Institute of Standards and Technology (NIST) para un CRM.

⋅ E significa patrón de contenido elemental y M patrón de ajuste de matriz

Los organismos productores de CRMs son principalmente el NIST de EEUU(http://www.nist.gov) y en Europa el IRMM (Institute for Reference Materials and Measurments, http://www.irmm.jrc.be). Otros productores de reconocido prestigio son la IAEA (International Atomic Energy Agency, http://iaea.org ) , el NCR (National Research Council de Canadá, http://www.nrc-cnrc.gc.ca y el LGC (Laboratory of the Government Chemist del Reino Unido, http://www.lgc.co.uk)

7. Cuestionario

1. Un procedimiento normal para determinación de proteínas es el ensayo de porción de colorante de Bradford. Según ese método, la proteína se trata con un colorante que, al unirse a ella cambia su color de pardo a azul. La intensidad del color azul (medido por absorción de la luz a una longitud de onda de 595 nm) es proporcional a la cantidad de proteína presente.

Proteína (µg) 0.00 9.36 18.72 28.08 37,44

Absorbancia a 595 nm

0.466 0.676 0.883 1.086 1.280


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a) Determinar mediante la hoja de cálculo la ecuación de la recta determinada por esos puntos con un número razonable de cifras significativas.

b) Una muestra problema de proteína dio una absorbancia de 0.973. calcular el número de microgramos de proteína en el problema.

2. Considerar la curva de calibrado lineal de la figura 4.1.1. y suponer que se miden los siguientes valores de absorbancia: 0,265; 0.269; 0.272; 0.258 para cuatro muestras idénticas del problema, y 0.099; 0.091; 0.101; 0.097 para cuatro blancos.

a) Hallar la media y la desviación estándar de la absorbancia del problema y del blanco. b) Hallar la absorbancia corregida (y su incertidumbre) restando la media de los blancos

de la absorbancia media del problema. c) Calcular la concentración de la muestra en mg

3. Una muestra desconocida de Cu+2 dio una absorbancia de 0.262 en un análisis por absorción atómica. Después se mezclaron 1.00 ml de una disolución que contenía 100.0 ppm ( microgramos / l) de Cu+2 con 95.0 ml de problema, diluyendose la muestra a 100.0 ml en un matraz volumétrico. La absorbancia de la nueva disolución fue 0.500.

a) Escribir la expresión de cálculo para la concentración final de Cu+2 después de la dilución. Las unidades de concentración son ppm.

b) Calcular la concentración de Cu+2 en el problema.

4. Gráfico de adición estandar. El ensayo de una sustancia X se basa en su capacidad para catalizar una reacción que produce la sustancia Y radiactiva. La cantidad de Y producida en un tiempo prefijado es proporcional a la concentración de X en La disolución. Un problema que contiene X enana matriz compleja desconocida, y con un volumen inicial de 50.0 ml, se trató con incrementos de un patrón de X 0.531 M, y se obtuvieron los siguientes resultados:

Volumen añadido de X

(µl)

0 100.0 200.0 300.0 400.0

Cuentas/minuto de Y radiactivo

1084 1844 2473 3266 4010

Preparar un gráfico como el de la figura 4.2.1. y hallar la concentración de X en el problema original.

5. Patrón interno. El cloroformo se usa como patrón interno en la determinación del pesticida DDT en un análisis polarográfico, mediante el cual ambos se reducen en la superficie de un electrodo. Una mezcla que contiene cloroformo 0.500 mM y DDT 0.800 mM dio una señal de 15,3 µA para el cloroformo y 10.1 µA para el DDT. Se introdujeron 10 ml de una disolución problema, que contenía DDT, en un matraz aforado de 100 ml, se añadieron 10,2 µl de cloroformo (PM=119,39; densidad=1,494 g/ml), y la mezcla se diluyó hasta el enrase con un disolvente adecuado. Las señales polarográficas observadas para el cloroformo y el DDT fueron 29,4 y 8,7 µA, respectivamente. Hallar la concentración de DDT en el problema.

REFERENCIAS: Análisis químico cuantitativo (D.C. HARRIS, Ed. Reverte); Análisis Instrumental (SKOOG/LEARY, Ed. McGraw Hill); Química analítica contemporanea ( Rubinson, Ed. Pearson Educación), y otros.

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