Técnicas de Laboratorio para la Técnicas de Laboratorio para la

Investigación de los Efectos Investigación de los Efectos

Ambientales en los Seres Vivos Ambientales en los Seres Vivos

Programa de Doctorado Programa de Doctorado

"Gestión y Salud Ambiental“"Gestión y Salud Ambiental“

Curso 2010-11 Curso 2010-11

III PARTE: Introducción a la Microscopía Electrónica.III PARTE: Introducción a la Microscopía Electrónica.

III PARTE: Introducción a la Microscopía Electrónica.III PARTE: Introducción a la Microscopía Electrónica.

Sesiones Teóricas:Sesiones Teóricas:

1. Introducción a la Microscopía Electrónica.1. Introducción a la Microscopía Electrónica.

1.1. Fundamentos de la Microscopía Óptica y Electrónica.1.1. Fundamentos de la Microscopía Óptica y Electrónica.

1.2. Tipos de microscopios electrónicos.1.2. Tipos de microscopios electrónicos.

1.3. Breve historia de la Microscopía Electrónica.1.3. Breve historia de la Microscopía Electrónica.

1.4. Aplicaciones.1.4. Aplicaciones.

1.5. Ejemplos.1.5. Ejemplos.

2. Tratamiento de muestra para Microscopía Electrónica.2. Tratamiento de muestra para Microscopía Electrónica.

3. Técnicas avanzadas de fijación, inclusión y detección en Microscopía Electrónica de Transmisión.3. Técnicas avanzadas de fijación, inclusión y detección en Microscopía Electrónica de Transmisión.

Sesiones Prácticas:Sesiones Prácticas:

1. Pre-tratamiento de muestra.1. Pre-tratamiento de muestra.

2. Obtención de cortes ultrafinos para Microscopía Electrónica de Transmisión.2. Obtención de cortes ultrafinos para Microscopía Electrónica de Transmisión.

3. Observación de muestras a Microscopio Electrónico de Transmisión.3. Observación de muestras a Microscopio Electrónico de Transmisión.

1.1. Fundamentos de la microscopía óptica y electrónica.1.1. Fundamentos de la microscopía óptica y electrónica.

Sistema de alto vacíoSistema de alto vacíoSistema de alto vacíoSistema de alto vacío

Esquema de una Bomba Difusora Esquema de una Bomba Difusora Esquema de una Bomba Rotatoria Esquema de una Bomba Rotatoria

Analogías y diferencias entre Analogías y diferencias entre microscopio óptico y electrónicomicroscopio óptico y electrónicoAnalogías y diferencias entre Analogías y diferencias entre

microscopio óptico y electrónicomicroscopio óptico y electrónico

OPTICOOPTICO ELECTRÓNICOELECTRÓNICO

Fotones Electrones

220 voltios 20.000 voltios

Lentes de vidrio Lentes electromagnéticas

Imagen por absorción de luz Imagen por dispersión y pérdida de e-

Lentes distancia focal fija: x4, x10, x20, x40, x60, x100

Lentes con distancia focal variable

Visión directa por ojo humano Visión por impresión en pantalla fluorescente

Posibilidad de color Blanco y negro

Imagen mejor que foto Foto mejor que imagen

Aprox 1.000 aumentos Hasta 450.000 aumentos

1.2. Tipos de microscopios electrónicos.1.2. Tipos de microscopios electrónicos.

TRANSMISIÓNTRANSMISIÓN

BARRIDOBARRIDO

núcleonúcleo

nucleolonucleolo

Membrana nuclearMembrana nuclear

Pared celularPared celular

citosolcitosol

Esquema y foto de un METEsquema y foto de un METEsquema y foto de un METEsquema y foto de un MET

Esquema y foto Esquema y foto de un MEBde un MEBEsquema y foto Esquema y foto de un MEBde un MEB

1897 J. J. Thompson (P. N. Fisica 1906) anuncia la existencia de partículas cargadas negativamente, denominadas luego electrones.

1924 Louis-Victor de Broglie (P.N. Fisica 1930) propone que los electrones en movimiento tienen propiedades ondulatorias.

1926 Busch prueba que es posible enfocar un haz de electrones con una lente magnética cilíndrica, estableciendo las bases de la óptica electrónica.

1931 Ernst Ruska (P.N. Fisica 1986) y colegas construyen el primer microscopio electrónico de transmisión.

1932 A.C. Van Dorsten (Philips Research Laboratories) comienza a estudiar las lentes magnéticas.

1935 Max Knoll demuestra la factibilidad del microscopio electrónico de barrido; tres años después Von Ardenne construye un instrumento prototipo.

1939 Siemens produce el primer microscopio electrónico de transmisión comercial.

1942 Microscopio Electrónico de Transmisión de 400 kV desarrollado por Philips Research Laboratories.

1944 William and Wyckoff introducen la técnica de sombreado metalico.

1945 Porter (P.N. Fisiologia y Medicina 1972), Claude (P.N. Fisiologia y Medicina 1974) y Fullam utilizaron el microscopio electrónico para examinar células

en cultivo de tejidos luego de fijarlas y teñirlas con tetróxido de osmio.

1946 Philips introduce su primer prototipo de microscopio electrónico comercial en Oxford.

1948 Pease y Baker preparan confiablemente secciones finas (0,1 a 0,2 m de grosor) de material biológico.

1950 H. Latta y J. F. Hartman introducen la cuchilla de vidrio para ultramicrotomía.

1952 Palade (P. N. Fisiología y Medicina 1975) , Porter (P.N. Fisiología y Medicina 1972), y Sjöstrand desarrollan métodos de fijación y seccionamiento fino

que permitieron ver por vez primera muchas estructuras intracelulares. En una de las primeras aplicaciones de estas técnicas, H. E. Huxley demostró que los

músculos esqueléticos contienen un arreglo solapado de filamentos proteínicos, apoyando la hipótesis de los filamentos deslizantes de la contracción

muscular.

1956 Glauert y asociados demuestran que la resina epóxica Araldita era un agente de embebimiento altamente efectivo para microscopía electrónica.

1959 Singer utiliza anticuerpos acoplados a ferritina para detectar moléculas en las células utilizando el microscopio electrónico.

1959 Brenner y Horne ampliaron la técnica de tinción negativa, inventada cuatro años antes por Hall, a una técnica de uso general para la visualización de

virus, bacterias y filamentos proteínicos.

1961 Luft introdujo la resina de embebimiento Epón.

1963 Sabatini, Bensch y Barrnett introducen el glutaraldehido (usualmente seguido por tetróxido de osmio) como un fijador para la microscopía electrónica.

1965 Cambridge Instruments produce el primer microscopio electrónico de barrido comercial.

1966 Branton demuestra que la crio-fractura permite visualizar el interior de las membranas.

1968 de Rosier y Aaron Klug (P.N. Química 1982) describen las técnicas para la reconstrucción tridimensional de estructuras a partir de micrografías

electrónicas.

1975 Henderson y Unwin determinan la primera estructura de una proteína de membrana mediante reconstrucción computacional de micrografías

electrónicas de muestras no teñidas.

1993 Se logra la resolución de 1 Å en un Philips CM-200/300 en la Universidad de Tübingen.

1.3. Breve historia de la Microscopía Electrónica.1.3. Breve historia de la Microscopía Electrónica.

1.4. Aplicaciones.1.4. Aplicaciones.

Microscopio electrónico de barrido:

- Geología: Investigaciones geomineras, cristalográficas, mineralógicas y petrológicas. Estudio morfológico y estructural de las muestras.

- Estudio de materiales: Caracterización microestructural de materiales. Análisis cristalino. Valoración del deterioro. Tipo de degradación.

- Metalurgia: Control de calidad y estudio de fatiga de materiales.

- Odontología: estructura del esmalte y deterioro.

- Paleontología y Arqueología: Caracterización de aspectos morfológicos.

- Control de Calidad: Fibras, curtidos, etc.

- Peritajes: Estudios de muestras de cualquiera de las áreas antes mencionadas.

- Medicina Forense: Análisis morfológico de pruebas.

- Biología (botánica), Biomedicina y Medicina: Estudio morfológico.

- Estudio químico y estructural de obras de arte, alteración de monumentos, calidad, identificación de pigmentos (restauración, autentificación)

Control de calidad: lana o fibras especiales (mohair o Kashmir)

Imagen de la rotura de una varilla de acero obtenida mediante un Microscopio Electrónico de Barrido.

Velcro

Torno de dentista

Diatomea

EjemplosEjemplos

Cristal de nieve

1.4. Aplicaciones.1.4. Aplicaciones.

Microscopio electrónico de transmisión:

- Investigación en Ciencias Biológicas. (Tamaño del objeto)

- Diagnóstico de enfermedades de origen microbiano. Ejemplo: diagnóstico

rápido de enfermedades víricas que proporciona la respuesta mucho antes que los

métodos de cultivo tradicionales.

- Ciencia de los materiales y metalurgia.

Microscopio Electrónico de Barrido y ÓpticoMicroscopio Electrónico de Barrido y Óptico

Lavandula latifoliaLavandula latifolia

(alhucema o espliego)(alhucema o espliego)

1.5. Ejemplos:1.5. Ejemplos:

Microscopio Electrónico de Transmisión y BarridoMicroscopio Electrónico de Transmisión y Barrido

Biología CelularBiología Celular

1.5. Ejemplos:1.5. Ejemplos:

2. Tratamiento de muestra para Microscopía electrónica.2. Tratamiento de muestra para Microscopía electrónica.

Microscopía Electrónica de Barrido

1.- Fijación.

2.- Deshidratación (punto crítico).

3.- Metalización (ion sputtering).

2. Tratamiento de muestra para Microscopía electrónica.2. Tratamiento de muestra para Microscopía electrónica.

Microscopía Electrónica de Transmisión

1.- Fijación.

2.- Post-fijación.

3.- Deshidratación

4.- Inclusión en resina (polimerización)

5.- Corte (ultramicrotomo)

6.- Tinción con metales.

Microscopios disponibles en la Universidad de HuelvaMicroscopios disponibles en la Universidad de Huelva

Microscopio electrónico de barrido (SEM-EDS).Microscopio electrónico de barrido (SEM-EDS). JEOL JSM 5410. El microscopio electrónico de barrido con detector de energía JEOL JSM 5410. El microscopio electrónico de barrido con detector de energía

dispersiva (SEM-EDS) permite obtener imágenes microscópicas de minerales, polen, y tejido vegetal y animal. A través del detector EDS además se puede realizar microanálisis (en dispersiva (SEM-EDS) permite obtener imágenes microscópicas de minerales, polen, y tejido vegetal y animal. A través del detector EDS además se puede realizar microanálisis (en un punto de 2 µm de tamaño) de elementos mayoritarios. Además de imágenes de electrones secundarios (SEI) se puede obtener imágenes de electrones retrodispersados (BSEI) un punto de 2 µm de tamaño) de elementos mayoritarios. Además de imágenes de electrones secundarios (SEI) se puede obtener imágenes de electrones retrodispersados (BSEI) los cuales informan sobre las variaciones composicionales internas de la muestra. los cuales informan sobre las variaciones composicionales internas de la muestra.

Microscopio electrónico ambiental (ESEM):Microscopio electrónico ambiental (ESEM): FEI modelo Quanta 200. FEI modelo Quanta 200.

Voltaje de aceleración de 0,2 Kv. a 30 Kv. Voltaje de aceleración de 0,2 Kv. a 30 Kv.

Tres modos de operación:Alto vacío (modo convencional), bajo vacío (< 1.3 mbar) y ultra alto vacío (<26 mbar). Tres modos de operación:Alto vacío (modo convencional), bajo vacío (< 1.3 mbar) y ultra alto vacío (<26 mbar).

Resolución de 3,5 nm (en los tres modos de operación). Resolución de 3,5 nm (en los tres modos de operación).

Sistema de Microanólisis por Dispersión de Energía de Rayos-X EDAX. Sistema de Microanólisis por Dispersión de Energía de Rayos-X EDAX.

Resolución de 135 ev (Ka del Mn). Resolución de 135 ev (Ka del Mn).

Elementos analizables desde el B al U. Elementos analizables desde el B al U.

AplicacionesAplicaciones

En el campo de ciencias de los materiales. En el campo de ciencias de los materiales.

En el Sector Agroalimentario. En el Sector Agroalimentario.

En geología, minería, metalografía,... En geología, minería, metalografía,...

En ciencias biológicas. En ciencias biológicas.

Control de procesos industriales - Control de calidad. Control de procesos industriales - Control de calidad.

Microscopios disponibles en la Universidad de HuelvaMicroscopios disponibles en la Universidad de Huelva

Microscopio electrónico de transmisión (TEM):Microscopio electrónico de transmisión (TEM): TEM JEOL modelo JEM 1011. TEM JEOL modelo JEM 1011.

Voltaje de aceleración de 40 Kv a 100 Kv. Voltaje de aceleración de 40 Kv a 100 Kv.

Resolución en imagen puntual de 0,4 nm. Resolución en imagen puntual de 0,4 nm.

Resolución en imagen estructural de 0,2 nm. Resolución en imagen estructural de 0,2 nm.

Rango de aumentos hasta 600.000 X. Rango de aumentos hasta 600.000 X.

Equipado con cámara digital MEGAVIEW III y software de análisis de imagen. Equipado con cámara digital MEGAVIEW III y software de análisis de imagen.

AplicacionesAplicaciones

Ciencias Biológicas y en el campo de la Cristalografía. Ciencias Biológicas y en el campo de la Cristalografía.

Ciencias de los Materiales. Ciencias de los Materiales.

Microscopios disponibles en la Universidad de HuelvaMicroscopios disponibles en la Universidad de Huelva

Diseño de un experimento con microscopía electrónicaDiseño de un experimento con microscopía electrónica

MÉTODO CIENTÍFICO:

-Observación.- Formulación de Hipótesis. - Experimentación.- Emisión de Conclusiones.

Observación: Los científicos se caracterizan por una gran curiosidad y el deseo de conocer. Cuando un científico encuentra un hecho o fenómeno interesante lo primero que hace es observarlo con atención. La Observación consiste en examinar atentamente los hechos y fenómenos que tienen lugar en la naturaleza y que pueden ser percibidos por los sentidos.

Formulación de hipótesis: Después de las observaciones, el científico se plantea el cómo y el porqué de lo que ha ocurrido y formula una hipótesis. Formular una hipótesis consiste en elaborar una explicación provisional de los hechos observados y de sus posibles causas. Experimentación: Una vez formulada la hipótesis, el científico debe comprobar si es cierta. Para ello realizará múltiples experimentos modificando las variables que intervienen en el proceso y comprobará si se cumple su hipótesis. Experimentar consiste en reproducir y observar varias veces el hecho o fenómeno que se quiere estudiar, modificando las circunstancias que se consideren convenientes. Durante la experimentación, los científicos acostumbran a realizar múltiples medidas de diferentes magnitudes físicas. De esta manera pueden estudiar qué relación existe entre una magnitud y la otra. Emisión de conclusiones: El análisis de los datos experimentales permite al científico comprobar si su hipótesis era correcta y dar una explicación científica al hecho o fenómeno observado. La emisión de conclusiones consiste en la interpretación de los hechos observados de acuerdo con los datos experimentales. A veces se repiten ciertas pautas en todos los hechos y fenómenos observados. En este caso puede enunciarse una ley. Una ley científica es la formulación de las regularidades observadas en un hecho o fenómeno natural. Por lo general, se expresa matemáticamente. Las leyes científicas se integran en teorías. Una teoría científica es una explicación global de una serie de observaciones y leyes interrelacionadas.