Microscòpia de fluorescència

Marta Valeri-Sala, MSc, Biòloga

Responsable de la Unitat de Microscòpia

UAT - VHIR

Fluorescència Diagrama de Jablonski

S1’

S1

S0

1 3

2

Es tracta d’un tipus de luminiscència on, seguidament a l’absorció de

l’energia de la llum es produeix una emissió d’una longitud d’ona major

durant un curt període de temps (nanosegons).

Fluorescència Fluorocroms

Cromòfors

Els grups cromòfors són aquells components de les molècules capaços d’absorbir

la llum.

Generalment es tracta d’anells aromàtics.

Fluorescència Fluorocroms

Espectres dels fluorocroms

Stokes shift: descriu la diferència d’energia entre l’espectre d’emissió

i el d’absorció.

A major nº d’Stokes, major resolució espectral.

Fluorescència Fluorocroms

Espectres dels fluorocroms

Fluorescència Fluorocroms

Espectres dels fluorocroms

Fluorescència Fluorocroms

Propietats dels fluorocroms

Coeficient d’extinció molar ( e )

El coeficient d’extinció molar es calcula a una longitud d’ona concreta que coincideix

amb el seu màxim d’absorció.

Producció quàntica ( Q )

És la capacitat que tenen els fluorocroms d’absorbir fotons quan són excitats.

És la capacitat que tenen els fluorocroms d’emetre fotons quan aquests han estat

absorbits.

La intensitat de fluorescència emesa per un fluorocrom és proporcional al producte de

e x Q.

Fluorescència Fluorocroms

Propietats dels fluorocroms

Fotodestrucció

És la disminució de la intensitat de fluorescència de la mostra degut a la destrucció

irreversible d’un fluorocrom excitat.

Fer servir agents antifading en la preparació o fer servir

fluorocroms més resistents.

Està directament relacionada amb la intensitat d’excitació i el temps durant el qual

estem il·luminant la mostra.

Per reduir el seu efecte

es pot: Disminuir la intensitat de la llum excitadora i/o reduir el temps

d’adquisició.

Fer servir objectius d’elevada NA i/o filtres de banda ampla.

Fluorescència Fluorocroms

Propietats dels fluorocroms

Quenching

Es refereix, en general, a qualsevol procés que causi la reducció de la producció

quàntica d’un fluorocrom. Es produeix una pèrdua de fluorescència degut a la

transferència d’energia no radiant.

Es produeix bàsicament per la interacció amb l’entorn on es troba el fluorocrom.

FRET

Fluorescència Fluorocroms

Marcatge de proteïnes

Fluorescència Fluorocroms

Marcatge d’àcids nucleics

Fluorescència Fluorocroms

Sondes específiques d’orgànuls

Fluorescència Fluorocroms

Sondes per ions

Fluorescència Fluorocroms

Sondes per estat oxidatiu

Fluorescència Fluorocroms

Indicadors de pH

Fluorescència Proteïnes fluorescents

GFPs

Fluorescència Proteïnes fluorescents

Fluorescència Fluorocroms

Quantums Dots

Feature Benefit

Bright, photostable Ultrasensitive, even single molecule

detection possible.

Large Stokes Shift Avoid autofluorescence and can be

used with other fluorescence markers.

Same excitation range (UV-

Violet, 405 nm laser)

Multiplexing off single excitation

source.

Inert and Biologically stable Long term in vivo tracking.

Small animal in vivo imaging.

Emissions across the

spectrum, 525, 545, 565,

605, 655, 705, 800 nm.

Many choices for multiplexing and

multiparameter labeling.

Fluorescència Fluorocroms

Tria dels fluorocroms:

S’ha de saber el tipus i configuració del microscopi que farem servir.

S’haurien d’intentar evitar les zones de l’espectre on hi hagi

autofluorescència provinent del propi teixit o de la mostra.

Quan es trien sondes s’haurien de triar aquelles que siguin específiques de

molècules diana i que minimitzin la toxcicitat cel·lular.

Intentar escollir fluorocroms que tinguin espectres d’excitació i emissió

estrets (multicolor assay).

Triar fluorocroms amb una bona eficiència quàntica i que no es

descomposin ràpidament (fotoestables).

Millor descartar els fluorocroms de primera generació ( ex: FITC vs

Alexa488…).

Fluorescència Microscòpia

Microscòpia d’epifluorescència

convencional

Microscòpia Làser Confocal

Microscòpia spinning disk

Microscòpia multifotònica

Deconvolució

Microscòpia super-high resolution

Fluorescència Microscòpia

Compromís

Resolució espacial

Sensibilitat

(ràtio senyal/soroll de fons) Velocitat d’adquisició

Wide-field (CCD)

Scannig

Confocals (PMT)

Fluorescència Microscòpia

Fonts d’il·luminació

Làmpada de mercuri Làmpada de xenó

Làser

Fluorescència Microscòpia Wide field

Sistema òptic

Filtre d’excitació

Mirall dicroic

Filtre d’emissió

Objecte Imatge

Pla focal

Fluorescència Microscòpia

El principi de confocalitat

En microscòpia de fluorescència convencional

El punt de focus es sobreposa amb els que estan fora de focus.

Hi ha reducció de la resolució lateral i axial.

Hi ha reducció del contrast de la imatge.

Objecte Imatge

Pla focal

Fluorescència Microscòpia

El principi de confocalitat

En microscòpia confocal, els dos pinholes s’insereixen en plans focals

conjugats

S’elimina la llum dispersa dels plans no focals.

S’incrementa la resolució axial i lateral.

Es poden obtenir seccions òptiques i fer reconstruccions 3D.

Les imatges tenen més contrast i nitidesa.

Fluorescència

Resolució lateral Resolució axial Resolució lateral Resolució axial

Fórmula 0.61 lem/NA 2 n lem/NA2 0.4lem/NA 1.4 n lem/NA2

63X 1.4NA oil l488 213nm 756nm 140nm 530nm

Mida píxel 93nm 328nm 61nm 230nm

Resolució

Interval de rastreig seguint el criteri de Nyquist: ≤ r /2.3

Microscòpia de

fluorescència

Microscòpia

confocal

Microscòpia WF vs Confocal

WF MLC

Fluorescència

Microscòpia de fluorescència vs confocal

Captura simultània de

tota la imatge.

Captura de la imatge

punt per punt.

Velocitat d’adquisició WF > Velocitat d’adquisició MLC

Microscòpia WF vs Confocal

Imatges monocromes

Imatges policromes

CCD de superfície: Xips de polisilici on els píxels es disposen en forma de matriu.

L’adquisició de la imatge és simultània.

Fluorescència Microscòpia Widefield

Detecció: càmeres CCD

Gain de la càmera

IS0 100, 200...

Fluorescència Microscòpia Confocal

Detecció: PMT

Es tracta d’una superfície capaç d’emetre electrons

com a resposta a la incidència de fotons.

Aquests electrons són accelerats i multiplicats en

etapes successives per generar un corrent elèctric

mesurable que posteriorment serà digitalitzat al

convertidor analògic- digital.

Rep seqüencialment la llum emesa per la mostra.

Hv

Gain

Imatge digitalitzada

Microscòpia Imatge digital

S’hauria de tractar com un objecte matemàtic ja que és una matriu de números on el

valor numèric m(x,y) es tradueix en el valor d’intensitat de gris de la imatge al punt (x,y).

60 70 115

65 80 123

69 110 125

39

82

83

103

88

59

112

96

67

35

73

72

60

120

40

218

229

169

228

236

194

229

237

197

231

241

200

Resolució espacial Resolució cromàtica

Microscòpia Microscòpia WF vs Confocal

WF MC

Il·luminació simultània de tota la mostra.

Incidència simultània de la llum emesa

de tota la mostra en tot el CCD.

Detecció mitjançant càmera CCD.

Obtenció de seccions òptiques no

confocals, és a dir, amb contaminació de

la llum emesa provinent dels plans fora

de focus.

Il·luminació de la mostra punt per punt.

Rastreig de la mostra punt per punt i

detecció seqüencial de l’emissió.

Detecció mitjançant PMT.

Obtenció de seccions òptiques amb

informació únicament provinent del pla focal.

Microscòpia Microscopis Institut de Recerca

Widefield

Nikon Eclipse TE-2000-S

Olympus IX71

FSX100

DICT

Contrast Fases

- Microscopi d’alta velocitat

- Platina motoritzada (diferents

condicions, n significativa)

-Control de Condicions ambientals

(Tª i C02)

- Stacks en Z sense treure

informació fora de focus

Olympus BX61

CellR

Microscòpia Microscopis Institut de Recerca

Microdissector Leica LM 600

LCSM FV1000

Microscòpia Microscòpia WF vs Confocal

Tècniques de contrast (DICT , contrast de fases)

Són tècniques que presenten una fototoxicitat mínima.

Es fan servir per assajos de llarga durada, de migració i wound-healing.

Tècniques de marcatge fluorescent

Wide filed convencional: es fan servir per assajos d’alta resolució temporal

Bona ràtio S/N: obtenim imatges ben contrastades.

Possibilitat de marcar diferents molècules diana.

Es fa servir sovint en assajos en viu.

Es poden aplicar algoritmes de deconvolució de la imatge per millorar

el contrast.

CellR

Laser Scanning Confocal: es fa servir per assajos d’alta resolució espacial

Eliminació del senyal fora de focus.

Adquisicions 3D combinades amb t i l.

Tot i que els làsers són més invasius, també es poden fer adquisions en viu.

FV1000

Microscòpia CellR

Wound healing

Microscòpia CellR

Dr. Héctor G Palmer

Cèl·lules mare i càncer

Histones Fluorescents

Objectiu: 40X

Mida píxel: 0,2 micres

Temps exposició: 800ms

NºCamps: 64

Tipus d’imatge: FL / DICT

Interval de temps: 20min

Temps: 7,6h (550

frames/camp).

Microscòpia CellR

Dr. Kim Petersen

Factors de creixement i càncer

Objectiu: 10X

Mida píxel: 0,8 micres

Temps exposició: 500ms

(534ms)

Nº camps: 27

Tipus d’imatge: FL / DICT

Interval de temps: 15 min

Temps: 75h (272

frames/camp).

Cell GFP positives

Microscòpia CellR

Dra.María López Cavanillas

Teràpia del cor

Cordó de teixit cardíac

Objectiu: 4X

Mida píxel: 2micres

Temps exposició:

80ms

Nºcamps: 1

Tipus d’imatge: BF

Interval de temps: free

run

Temps: 32s (400

frames).

Microscòpia CellR

Fototoxcicitat

La causa majoritària és deguda a la formació de radicals d’oxigen degut a la transferència

d’energia no radiant dels fluorocroms en interaccionar amb l’entorn.

La longitud d’ona d’excitació i la seva intensitat i durada estan fortament correlacionades

amb la fototoxcicitat i per tant és conveninent triar fluorocromos que s’excitin a longituds

d’ona grans i disminuir el temps d’exposició i la intensitat de la font llumínica.

Disposar de sistemes de detecció altament sensibles.

Observar amb objectius d’obertura numèrica elevada.

Disminuir el factor de zoom.

Paràmetres del microscopi

Paràmetres ambientals

Comprovar les condicions fisiològiques : estabilitat de la temperatura i pH.

L’evaporació afecta a l’osmolaritat.

Microscòpia

Spinning disk

El pinhole de detecció es substitueix per un

disc giratori amb centenars d’obetures

agrupades en parells.

La font d’il·luminació no ha de ser

necessàriament un làser.

La velocitat de captura pot arribar fins a 360

imatges per segon.

El disc giratori tant sols transmet un 1% de la

il·luminació i es generen imatges molt tènues.

El gruix de la secció òptica és superior al gruix

obtingut amb microscòpia làser confocal.

Microscòpia

Microscòpia

Microscopi Multifotó

Microscopi confocal vs Multifotó

Microscòpia

Microscòpia

Microscopi Multifotó

S’aconsegueix excitar un fluorocrom amb l’absorció

de dos o més fotons de menor energia que, sumats,

aconsegueixen l’energia suficient per excitar els

electrons del fluorocrom.

Es fa servir un làser intermitent (polsos de durada molt

curta però enorme densitat):

Femtosegons (100)

Picosegons (10)

Només s’il·lumina el pla focal que es captura.

S’excita amb fotons infrarojos: Menor toxcicitat

Major poder de

penetració

Permet estudiar processos en cèl.lules vives i

teixits sense infringir un mal significatiu:

Microscòpia