DINAMICA, SELECCION Y ESTABILIDAD DE POBLACIONES

BACTERIANAS EN BARROS ACTIVADOS

Mariana Lozada1; Raúl F. Itria2; Eva L. M. Figuerola1; Luis A. de Tullio2 & Leonardo Erijman1*

1Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI-CONICET). Facultad de

Ciencias Exactas y Naturales, UBA. Vuelta de Obligado 2490 (1428) Buenos Aires, Argentina; 2INTI-

Ingeniería Ambiental. Paseo Colón 850 (1063) Buenos Aires, Argentina.

*Tel: 011-4783-2871; Fax: 011-4786-8578; E-mail: erijman@dna.uba.ar

Mariana Lozada es Licenciada en Ciencias Biológicas, egresada de la Facultad de Ciencias Exactas y

Naturales de la Universidad de Buenos Aires (UBA) y becaria del Consejo Nacional de Investigaciones

Científicas y Técnicas (CONICET) en el Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología

Molecular (INGEBI-UBA-CONICET).

Raul Fabio Itria es Licenciado en Ciencias Biológicas, egresado de la Facultad de Ciencias Exactas y

Naturales de la Universidad de Buenos Aires (UBA). Se desempeña como responsable técnico del

Laboratorio Biológico de INTI-Ingenieria Ambiental.

Eva Figuerola es Licenciada en Ciencias Químicas, egresada de la Facultad de Ciencias Exactas y

Naturales de la Universidad de Buenos Aires (UBA) y becaria del Consejo Nacional de Investigaciones

Científicas y Técnicas (CONICET) en el Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología

Molecular (INGEBI-UBA-CONICET).

Luis Alberto de Tullio es Ingeniero Quimico y Sanitarista, egresado de la Facultad de Ingeniería de la

Universidad de Buenos Aires (UBA). Se desempeña como responsable técnico del sector de Ingeniería de

INTI-Ingeniería.

Leonardo Erijman es Doctor en Ciencias Químicas, egresado de la Facultad de Ciencias Exactas y

Naturales de la Universidad de Buenos Aires (UBA) e Investigador Adjunto del Consejo Nacional de

Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET). Se desempeña en el Instituto de Investigaciones en

Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI-UBA-CONICET). Tel: 011-4783-2871; Fax: 011-4786-

8578. E-mail: erijman@dna.uba.ar

Palabras claves: Tratamiento de efluentes; detergentes no iónicos; biología molecular; ANOVA

RESUMEN

Se ha investigado la dinámica de comunidades bacterianas en sistemas de barros activados a escala de

laboratorio utilizando técnicas de biología molecular. Las poblaciones bacterianas son sistemas altamente

dinámicos y pueden diverger sin afectar el rendimiento del proceso. La presencia de nonilfenol etoxilados en

el líquido crudo tiene una fuerte influencia sobre la composición de la comunidad. A partir de un inóculo no

aclimatado es posible seleccionar grupos de bacterias dominantes, estables y reproducibles en réplicas

independientes. Estas especies, adaptadas a utilizar con máxima eficiencia los recursos nutricionales

disponibles, no son aislables en medios de cultivo sintéticos.

INTRODUCCION

El rendimiento y la estabilidad de los procesos biológicos de tratamiento de efluentes están condicionados

por la adaptación y evolución de las comunidades microbianas presentes. La composición de las

comunidades microbianas dependen a su vez del tipo de efluente y otras presiones selectivas, tales como el

tiempo de retención celular, la temperatura, las condiciones redox y demás factores extrínsecos.

Generalmente, el diseño y la operación de los sistemas de tratamiento se realizan sin la suficiente

consideración de los procesos biológicos involucrados. Por lo tanto, la falta de control sobre la estabilidad del

proceso o sobre la calidad del tratamiento suele ser consecuencia del escaso conocimiento sobre la

influencia de factores ambientales o biológicos en la estructura y dinámica de las comunidades bacterianas

responsables de los procesos de degradación. Ejemplos frecuentes se encuentran en los desbalances de

las condiciones ambientales, que conducen a la masiva proliferación de especies filamentosas, que

interfieren negativamente sobre la floculación y pueden llevar a la paralización completa del tratamiento. Por

el contrario, la estrecha vinculación entre factores ambientales y la supervivencia de bacterias nitrificantes ha

resultado clave en la optimización de procesos biológicos destinados a la eliminación de nitrógeno de aguas

residuales.

Ecología del proceso de barros activados

Los barros activados son ecosistemas en los que ocurren mútiples interacciones que pueden explicarse con

modelos ecológicos clásicos 1. Cada proceso de tratamiento posee su microfauna característica. En barros

activados, una sucesión de comunidades de protozoos (fagelados, ciliados, etc.) y metazoos (rotíferos,

nematodos) se desarrolla durante la maduración del barro activado. Estos microorganismos eucarióticos se

encuentran en un estado de balance ecológico con el medio y por lo tanto la abundancia relativa de los

distintos grupos puede ser vinculada con las condiciones de carga orgánica y la calidad de efluente

producido (en particular los tiempos de residencia celular y la relación F/M). La relación ocurre porque si bien

existe un rango relativamente amplio en el que los protozoos son capaces de sobrevivir, hay un rango más

estrecho en el que pueden estar presentes gran cantidad. En forma equivalente, el número, tipo, abundancia

y actividad (movimiento y hábitos de alimentación) de rotíferos presentes en el proceso de tratamiento es

indicativo del nivel trófico (nutricional). Sin embargo, las poblaciones de protozoos y metazoos en plantas de

tratamiento de efluentes también se ven afectadas por muchos otros factores, tanto físicos (oxígeno disuelto,

temperatura, retención hidráulica), como químicos (pH, salinidad, presencia de tóxicos, concentración de

nutrientes orgánicos e inorgánicos), por lo que a menudo el alcance de esta valiosa información obtenida con

microscopía convencional es limitado, especialmente cuando se trata de efluentes de origen industrial.

Información mucho más detallada del proceso puede obtenerse investigando en forma directa la composición

de los actores claves del proceso de tratamiento, i.e. las bacterias. Debido a la falta de una tecnología

apropiada para el estudio de la estructura de la comunidad bacteriana, hasta hace poco la misma era

considerada sólo como una masa homogénea capaz de convertir compuestos orgánicos en compuestos

inorgánicos inocuos.

Análisis de comunidades bacterianas

Actualmente se sabe que solamente 5 a 15% de la totalidad de bacterias presentes en muestras de barros

activados pueden ser detectadas mediante conteo en cultivos de laboratorio 2,3. Los métodos tradicionales de

cultivo han sido utilizados con éxito para aislar microorganismos con la capacidad de transformar

contaminantes orgánicos. Sin embargo la experiencia demuestra que esos organismos raramente son

representativos de los responsables de las principales transformaciones que ocurren in situ, y no son

capaces de competir cuando son adicionados para tal fin en innumerables intentos de bioaumentación 4,5. En

los últimos años la introducción de nuevos métodos moleculares de análisis han posibilitado un progreso

extraordinario en el análisis de poblaciones microbianas complejas 6. Estos métodos, que utilizan

preferentemente como marco de referencia la secuencia del gen para la subunidad pequeña del ARN

ribosomal (16S rADN), han servido para mostrar la enorme riqueza de diversidad microbiana en la naturaleza

y a la vez han puesto en evidencia las limitaciones de las técnicas tradicionales de cultivo para caracterizar

esta biodiversidad.

El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de la composición del efluente sobre la estructura de la

comunidad bacteriana en sistema de barros activados durante un período de 21 meses. Como sistema

modelo se han investigado los aspectos microbiológicos asociados a la biodegradación de detergentes no

iónicos. Los nonilfenol polietoxilados (NPE), son detergentes ampliamente utilizados en una variedad de

procesos industriales. Las consecuencias ecotoxicológicas del uso masivo de estos compuestos han atraído

la atención desde que se advirtió la acumulación en cursos de agua de metabolitos producidos por su

biodegradación parcial, los cuales representan un riesgo sanitario significativo, debido a que producen

modificaciones en el sistema reproductivo de peces, aves y mamíferos por acción de disrupción de la

actividad hormonal 7.

SISTEMA EXPERIMENTAL

La utilización de sistemas a escala de laboratorio permite controlar las variables ambientales y biológicas

relevantes al proceso, de modo de analizar los efectos producidos por la variación de un único factor, en este

caso la composición del efluente.

Para ello se ha utilizado un proceso semi-continuo de barros activados (SCAS), instrumentado según norma

ISO 9887:1992 8 siguiendo un protocolo diario de llenado, alimentación, sedimentación y decantación.

Cuatros reactores idénticos de un volúmen útil de 3 litros, fueron inoculados inicialmente con barro

proveniente de una planta de barros activado para el tratamiento de efluentes industriales, y alimentados con

efluente sintético previamente esterilizado, de la siguiente composición:160 mg/l de peptona, 110 mg/l de

extracto de levadura, 30 mg/L de urea, 9 mg/L de NaCl, 4 mg/l de CaCl2·2H2O, 2 mg/l MgSO4·7 H2O, 278

mg/l K2HPO4, 80 mg/l KH2PO4). Dos de los reactores (N1 y N3) recibieron adicionalmente 60 mg/l NPE (10

unidades etoxilo en promedio) durante todo el período de estudio. La temperatura se mantuvo controlada en

20 ± 2 °C, y el pH en 7.0 ±0.2.

Este modelo experimental de réplicas, en el que existe un duplicado para la variable en estudio, le otorga

validez estadística a los resultados obtenidos, ya que permite diferenciar entre la variabilidad correspondiente

al tratamiento que se le aplica y la que es intrínseca de cada reactor por su intercambio con el medio

ambiente o aquella debida a procesos estocásticos que ocurren en sus comunidades. Las mediciones fueron

tratadas estadísticamente mediante el análisis de varianza (ANOVA) del tipo anidado, en el cual se separan

en distintos componentes las varianzas correspondientes a las réplicas y a los tratamientos 9.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Funcionamiento del proceso

A lo largo de todo el período examinado, todos los reactores produjeron una eliminación de DBO > 95%.

Para los reactores control la eliminación de DQO fue similar, mientras que en los reactores alimentados con

NPE el promedio de eliminación de DQO fue 82±5 %. Esta diferencia es consecuencia del carácter

recalcitrante, es decir de difícil biodegradación, de los productos de descomposición primaria de NPE. La

acumulación de productos de degradación primaria en el líquido tratado fue confirmado por electroforesis

capilar 10.

Estructura microscópica del barro

La observación microscópica de las muestras de barros provenientes de los SCAS reveló que el agregado

continuo del detergente NPE redujo significativamente el número de bacterias filamentosas (identificadas a

través de una clave dicotómica como Microthrix parvicella), obteniénose flocs más compactos y de rápida

sedimentación (Fig. 1). La alteración en la comunidad microbiana del barro, debida a la presencia del

detergente en el medio de alimentación, se vio asimismo reflejada en un descenso en el índice volumétrico

de lodos (IVL).

Diversidad bacteriana

La figura 2A muestra un perfil de la diversidad genética de las comunidades bacterianas en cada uno de los

reactores. En electroforesis en geles con gradientes desnaturalizantes (DGGE), fragmentos de ADN de igual

longitud, pero distinta secuencia son separados en base a la diferente mobilidad electroforética de la

molécula de ADN parcialmente disociada en un gel de poliacrilamida conteniendo un gradiente lineal de

agentes desnaturalizantes (urea-formamida) 11,12.

diente desnaturalizante para N3) y controles (C2 y C4).

miento. Escala: unidades de

A B Fig. 1: Microfotografías decontraste de fases representativasde muestras de barro de losreactores alimentados con NPE(A) y controles (B)

Fig. 2: (A) Electroforesis en gel de grareactores alimentados con NPE (N1 yM: marcadores. (B) análisis de agrupadistancia relativa porcentual.

Para este propósito, luego de un período de aclimatación de 21 meses, se

aisló el ADN genómico bacteriano a partir de una muestra de barro de cada

uno de los reactores. Los fragmentos del gen para la subunidad pequeña del

ARN ribosomal fueron amplificados por reacción en cadena de la polimerasa

(PCR). El producto de esta reacción consistió en una mezcla de amplicones

de PCR correspondientes a cada una de las bacterias presentes en las

muestras, que fueron separados en forma subsiguiente por DGGE. El

resultado fue un perfil de bandas representativo de cada muestra (una

“huella digital”), para los cuales cada banda corresponde específicamente a

una secuencia de ADNr de uno de los miembros predominantes de la

comunidad bacteriana (Fig. 2A).

Se observa que los reactores alimentados con NPE comparten las bandas

dominantes (bandas A, B y C), ausentes en el inóculo original y en los

reactores control, sugiriendo la selección de especies por la presencia del

detergente en la alimentación.

Agrupamiento y similitud de los reactores

Los perfiles de DGGE fueron digitalizados para estudiar el grado de similitud entre reactores en un análisis

de agrupamiento (cluster analysis). En este caso los reactores se agrupan en base a una matriz de distancia

general basada en la presencia o ausencia de las bandas. La distancia entre dos muestras está calculada

como:

distancia(x,y)=(número de x i≠ yi)/i

donde x e y son dos muestras de los reactores e i número de bandas totales. A partir de esta matriz

mediante el algoritmo conocido como UPGMA (unweighted pair-group average) se van agrupando las

muestras en base a su distancia relativa 13. En la Fig 2B se observa la formación de dos grupos claramente

diferenciados, uno correspondiente a los reactores que reciben NPE, y otro a los reactores control.

En la figura 3 se muestra una matriz de similitud comparando los reactores de a pares. Las coordenadas x e

y.corresponden a las abundancias relativas de las bandas de cada uno de los reactores. El resultado es un

gráfico de correlación, que en la comparación de una muestra consigo misma correspondería a una diagonal.

Comparando los reactores que recibieron NPE con los reactores control, la mayoría de los puntos se

distribuyen a lo largo de los ejes, indicando un gran porcentaje de bandas que no se

comparten (uno de las coordenadas es igual a cero). Cuando se comparan entre sí las réplicas de reactores

(N1 con N3 y C2 con C4) se observa una aproximación a la diagonal que indica una correlación positiva

altamente significativa (p<0.01) entre las abundancias relativas de las especies bacterianas de ambos

reactores.

El hecho que cada una de los pares de réplicas sean similares, pero no idénticos entre sí, significa que

reactores independientes que han sido tratados como duplicados pueden presentar un rendimiento

equivalente con distinta composición de bacterias. La correlación entre N1 y N3 es mayor que entre C2 y

C4, de lo cual se concuye que que la presencia de una mayor presión selectiva, por agregado de un

compuesto de difícil degradación (NPE), limita parcialmente la variabilidad entre réplicas (Fig. 3).

Relación entre el agrupamiento y las especies dominantes

Con el fin de identificar las bandas responsables del agrupamiento de las muestras, se tomaron muestras de

los reactores correspondientes a t=21 meses y se llevó a cabo un análisis de agrupamiento de dos vías (two

way joining) (Fig. 4). En este tipo de análisis se reordena la matriz de abundancias relativas de las especies

Fig. 3: gráficos decorrelación para lasabundancias relativas delas especies bacterianas enlos reactores alimentadoscon NPE (N1 y N3) ycontroles (C2 y C4). Losíndices de correlación seindican sólo cuandoresultaron significativos,junto con el valor p designificancia estadísticacorrespondiente.

bacterianas de manera de agrupar simultáneamente variables (reactores) y casos (especies). Luego esta

nueva matriz se grafica en base a una escala de tonos que codifican para un valor límite de abundancia, y se

puede observar gráficamente las bandas que determinan los grupos en cuestión.

Nuevamente la réplicas de reactores agrupan entre sí, dependiendo de la presencia o ausencia de NPE en el

efluente utilizado para la alimentación de los reactores, siendo las bandas más intensas que correlacionan

con este agrupamiento las bandas previamente identificadas como A, y C. (Fig 4).

Biodiversidad y dominancia

Las diferencias entre las estructura de las respectivas comunidades microbiana también fueron cuantificadas

a través la diversidad de especies, una expresión de la estructura de la comunidad. Las medidas de

diversidad tienen en cuenta tanto el número de especies presentes en una muestra (riqueza) como su

abundancia relativa (dominancia). Cuando existen pocas especies que representan un gran porcentaje del

total, la comunidad en cuestión posee alta dominancia.

Él índice de Simpson considera no sólo el número de especies (s) y el número total de individuos (N), sino

también la proporción del total que representa cada especie. Si dos individuos son tomados al azar en la

comunidad, la probabilidad que ambos pertenezcan a la misma especie será:

D = Σni (ni-1)/N (N-1),

donde ni es e número total de individuos de una especie particular.

El valor D es por lo tanto una medida de la dominancia, es decir la concentración de N individuos entre s

especies.

La tabla I muestra que en los reactores con NPE el índice l aumenta en el tiempo, mientras que permanece

aproximadamente constante para los reactores control. Con el transcurso del tiempo, el valor de p

(probabilidad de que las diferencias observadas sean debidas al azar) desciende marcadamente en

comparación a las réplicas y las diferencias se hacen significativas (p<0.001) a partir de los 21 meses.

Fig. 4: Análisis deagrupamiento de dos víaspara los reactoresalimentados con NPE (N1y N3) y controles (C2 yC4). A y C: bandascorrespondientes al gelDGGE que se muestra enla Figura 2A. La escala degrises corresponde alímites de abundanciarelativa porcentual deespecies bacterianas.

Tabla I: índices de dominancia de Simpson ± desvío estándar para reactores alimentados con NPE(N1 y N3) y controles (C2 y C4), a 4, 12 y 21 meses del inicio del experimento. NS: no significativo. S:significativo. p: valor de significancia estadística. N= 3 experimentos independientes.

N1 N3 C2 C4 S p

4 meses 0,09±0,01 0,09±0,01 0,09±0,01 0,09±0,01 NS 0,7801

12 meses 0,11±0,01 0,12±0,02 0,09±0,01 0,09±0,02 NS 0,0650

21 meses 0,14±0,03 0,17±0,03 0,06±0,01 0,08±0,01 **S 0,0002

Esto quiere decir que si bien existen diferencias entre las réplicas, éstas aportan una proporción pequeña a

la variabilidad total observada, la cual debe ser explicada principalmente por la variación efecto del

tratamiento. Por lo tanto, mientras que las especies bacterianas en los controles están distribuidas más

equitativamente, la presencia de detergente en el tratamiento provoca diferencias significativas en la

estructura de las comunidades bacterianas, las cuales son reflejadas en la dominancia de unas pocas

especies en los reactores tratados,.

Identificación de especies dominantes y detección in situ

Las bandas dominantes de los geles fueron recortadas de los geles, reamplificadas y secuenciadas.para

determinar su identidad filogenética. La comparación en base de datos de las secuencias de ácidos

nucleicos revelaron alto grado de similitud con especies bacterianas pertenecientes a las subclases beta y

gama de la división Proteobacteria y a miembros de la división Acidobacteria, para los cuales los miembros

filogenéticamente más cercanos aún no han podido ser aislados en cultivos de laboratorio (Lozada et al.,

enviado a publicación).

La abundancia de las especies dominantes fue evaluada in situ utilizando el método de hibridación

fluorescente (FISH). Esta técnica se basa en el uso de una sonda molecular, consistente en un

oligonucleótido (fragmento de ADN simple cadena de 18-20 nucleótidos) marcado con un compuesto

fluorescente, que se une específicamente a la molécula de ARN ribosomal de un único tipo de

microorganismo (o un grupo de microorganismos). Las bacterias que han incorporado y retenido la sonda

marcada, son detectadas específicamente dentro del floc bacteriano por su fluorescencia cuando son

visualizadas en un microscopio de epifluorescencia.

Para ver el resto de las células presentes en el floc biológico se utiliza otro reactivo (DAPI), que tiñe el ADN

de todas las células, y fluoresce en una longitud de onda que puede ser detectada independientemente en la

misma muestra.

El uso de marcadores específicos para la subclase beta de la división Proteobacteria (Fig. 5). y el grupo III de

la división Acidobacteria permitieron confirmar que en reactores tratados con NPE, miembros de estos

grupos filogenéticos representan respectivamente el 34±4 % y 13±2 % del total de bacterias, siendo ambos

minoritarios en los reactores control (tabla II)

Tabla II: Porcentajes de los grupos Acidobacteria y Betaproteobacteria calculados a partir dehibridación in situ fluorescente de muestras de barro de los reactores alimentados con NPE ycontroles.. N>1000 células por conteo con DAPI.

N1 N3 C2 C4 S p

%Acidobacteria 12±1,5 14±4,4 0,3±0,1 0,5±0,24 **S 5,2 E-15

% beta-Proteobacteria 36±4,2 27±7,2 9±2,6 5±1,9 **S 1, 1 E-05

La dominancia de unas pocas especies está en general relacionada con el desequilibrio de algún factor

ambiental en particular como determinante de la estructura de la comunidad. Esto corresponde a una de las

definiciones de stress ambiental. En términos de la capacidad de tratamiento, la comunidad bacteriana se

especializa para la degradación de compuestos dificílmente biodegradables a costa de un descenso en su

diversidad. Consecuentemente, puede producirse una pérdida de redundancia funcional que aumenta la

vulnerabilidad del sistema, ya que el proceso se hace dependiente de un número más limitado de especies

Fig. 5: Microfotografíascorrespondientes ahibridación in situfluorescente (FISH) demuestras de barro de losreactores alimentados conNPE y controles, con lasonda BET42a, específicapara la subclase beta de ladivisión Proteobacteria(paneles de la derecha).Las microfotografías de laizquierda corresponden ala tinción de célulastotales con DAPI

para funcionar correctamente

Por otra parte, la abundancia de especies que no son aislables en cultivos de laboratorio es razonable debido

al alto grado de especialización que se da como resultado de mecanismos de sucesión ecológica en

ambientes complejos. En estas condiciones se favorecen especies microbianas que por su alta afinidad con

los sustratos adoptan estrategias de máximo aprovechamiento de los recursos nutricionales disponibles.

CONCLUSIONES

Las poblaciones bacterianas son sistemas altamente dinámicos y pueden diverger sin afectar el rendimiento

del proceso. La presencia de nonilfenol etoxilados en el líquido crudo tiene una fuerte influencia sobre la

composición de la comunidad microbiana en el reactor. No obstante, a partir de un inóculo no aclimatado es

posible seleccionar grupos de bacterias dominantes, estables y reproducibles en réplicas independientes.

Estas especies, adaptadas a utilizar con máxima eficiencia los sustratos disponibles no son aislables en

medios de cultivo sintéticos.

La metodología utilizada aquí provee una base para la mejor caracterización y optimización del

funcionamiento de procesos de tratamiento. El hecho que las bacterias que aparecen como funcionalmente

dominantes en los sistemas estabilizados no son aislables en medios de cultivos sintéticos debe tenerse en

cuenta al considerar la selección de microorganismos destinados a mejorar el rendimiento de plantas de

tratamiento o para la recuperación de procesos fuera de régimen, en experiencias de bioaumentación.

Las técnicas moleculares de análisis permiten investigar la dinámica de las poblaciones bacterianas a un alto

nivel de resolución dentro sistemas extremadamente complejos, tales como los barros activados. La

información que se deriva de dichas investigaciones pueden contribuir a un mayor control sobre la estabilidad

y eficiencia de los procesos de tratamiento.

BIBLIOGRAFIA

1. Curtis, T.P., Head, I.M. & Graham, D.W. (2003).Theoretical Ecology for engineering biology.

Environmental Science & Technology 37, 64A-70A.

2. Mezzanotte, V., Prato, N., Sgorbati, S. & Citterio, S. (2004).Analysis of microbiological characteristics

of wastewater along the polishing sequence of a treatment plant. Water Environment Research 76,

463-467.

3. Wagner, M., Amann, R., Lemmer, H. & Schleifer, K.-H. (1993).Probing activated sludge with

oligonucleotides specific for proteobacteria: Inadequacy of culture-dependent methods for describing

microbial community structure. Applied & Environmental Microbiology 59, 1520-1525.

4. Head, I.M., Saunders, J.R. & Pickup, R.W. (1998).Microbial evolution, diversity, and ecology. A

decade of ribosomal rRNA analysis of uncultivated microorganisms. Microbial Ecology 35, 1-21.

5. Watanabe, K., Teramoto, M. & Harayama, S. (2002).Stable augmentation of activated sludge with

foreign catabolic genes harboured by an indigenous dominant bacterium. Environmental Microbiology

4, 577-583.

6. Amann, R.I., Ludwig, W. & Schleifer, K.H. (1995).Phylogenetic identification and in situ detection of

individual microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews 59, 143-169.

7. White, R., Jobling, S., Hoare, S.A., Sumpter, J.P. & Parker, M.G. (1994).Environmentally persistent

alkylphenolic compounds are estrogenic. Endocrinology 135, 175-181.

8. ISO:9887. Water quality. Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds in an

aqueous medium. Semi-continuous activated sludge method (SCAS). International Organization for

Standardization. Geneve, Switzerland, 1992.

9. Zar, J.H. Biostatistical Analysis, Prentice Hall International (UK), 1999.

10. Lozada, M. et al. (2004).Bacterial community shifts in nonylphenol polyethoxylates-enriched activated

sludge. Water Research 38, 2077-2086.

11. Muyzer, G., De Waal, E.C. & Uitterlinden, A.G. (1993).Profiling of complex microbial population by

denaturing gradient gel electrophoresisanalysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding

for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 59, 695-700.

12. Casserly, C. & Erijman, L. (2003).Molecular monitoring of microbial diversity in an UASB reactor.

International Biodeterioration & Biodegradation 52, 7-12.

13. Sneath, P.H.A. & Sokal, R.R. Numerical taxonomy, (W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1973).