DETERMINACIÓN DE MICROORGANISMOS

CONTAMINANTES DEL AGUA

Dra. Galdy Hernández ZárateMicrobiología Molecular

Departamento de Ciencias del MarInstituto Tecnológico de Boca del Río

Boca del Río, Ver.

Correo-e: galdyhz@gmail.comgahernanitboca@live.com

Temas

1. Importancia de los microorganismos.

2. Calidad microbiológica del agua, inocuidad y calidad

alimentaria, sanidad acuícola y vegetal.

3. Diagnóstico microbiano: métodos tradicionales vs métodos

biomoleculares.

4. Casos de estudio: granjas de producción acuícola/monitoreo

ambiental: calidad del agua (Quintana Roo y Veracruz)

MédicaSalud publica y socioeconómica

EcológicoDescomposición

Ciclos biogeoquímicosBioindicadores

Biorremediación

Industrial Alimenticia/Farmacéutica

Fermentaciones, probióticos

Ecología humana, animal, vegetalSimbiosis, nutrientes, descomposición

IndustriaAgrícola

EnergéticaBiocombustibles(biogas, biodisel)

Salud PúblicaBacterias, microalgas virus,

hongos, protozoos

Sanidad AnimalAcuícola/Pecuaria

Sanidad Vegetal (bacterias, hongos, viroides)

Inocuidad y calidad agroalimentariaAgua de riego/fertirrigación

Salud de los EcosistemasFlorecimientos algales nocivos (cianobacterias

dinoflagelados, microalgas)Biorremediación

Prevención, tratamiento, curade

enfermedades

Problemáticas: brotes de enfermedades en productos de importancia comercial

ACUÍOLAS

1980-Flavobacterium,

Pseudomonas,

Photobacterium, Aeromonas,

Moxarella: P. monodon

1990-V. harveyi, V.

parahaemolyticus, V. vulnificus:

peces, camarones.

1994-TSV IHHNV, HPV, IMNV,

MBV, YHV y WSSV: P. vannamei

P. stylirostris

AGRÍCOLAS

1990-Salmonella ponna: melon

cantaloupe

1995-E. coli O157:H7 (jugos,

rabanos, alfalfa)

1997-Hepatitis A: fresas

1999-Shigella: perejil

2003-Salmonella: mango

E. coli O157:H7 : ensaladas

2008-Salmonella: chiles

NOM-EM-038-FITO-2002

Detergentes

Sustancias InorgánicasFertilizantes

Xenobióticosorgánicos: COPs(HerbicidasPesticidas)

MedicamentosY Productos de Uso Personal

HidrocarburosMetales

Pesados

Grasas y Aceites

MICROBIOLÓGICA

Materia

OrgánicaContaminación:

vibrios, florecimientos algales tóxicos (fitoplacton)

PRINCIPALES CONTAMINANTES DEL AGUA

MARCADORES QUÍMICOS

Analgésicos, cafeína. - Bloqueadores solares, jabones, cremas, otros

(DDT y metabolitos)BioacumulaciónBiomagnificación

¿Por qué Estudiar la Calidad

Microbiologica del Agua?

Restaurantes

Inocuidadalimentaria

Hoteles

albercas, parquesecológicos, TA

Agua de lastrebuques y cruceros

Alimentosacuáticos y terrestres

Hidroagricola

Fertirrigación

(cianobacterias)

Aguas residuales

AmbientePlayas, ríos, lagunas,

lagos, manglarescenotes,

Prevenir la Contaminación Ambiental

Prevención y control de enfermedades, epidemias, plagas y brotesinfecciosos: humana, animal, vegetal y ambiental

Cultivos

Pecuaria, acuicola, agricola pesquera

Monitoreo de Calidad del Agua y del Producto

Canales de agua

fuente de abastecimiento

de agua y drenes colectores

Actividades de

manejo y procesamiento

Productos acuícolas, agrícolas y hortofrutícolas

verificación/prevención

Calidad

Inocuidad

AN

ALISIS H

AC

CP

Buenas practicas agrícolas,

higiénicas y de manufactura

PRODUCTORES

Determinación Microbiana: Identificación y Cuantificación

bacteriana

TTTTÉÉÉÉCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALESCNICAS TRADICIONALES

Microscópicas y Bioquímicas

� Tinciones

� Histológicas

� Fenotípicas

� Tiempos prolongados

� Variaciones: plasticidad fenotípica y metabólica

� Células viables no cultivables

� METODOS NORMADOS (NOMs Y NMXs)

�NMX-AA-102-SCFI-2006 (MF)�NMX-AA-042-SCFI-2005 (NMP)� NMX-AA-120-SCFI-2006 (IDEXX)

� NOM-110-SSA1-1994

Métodos para Detección de Coliformes

Métodos de Norma (NMX)

Microorganismos Indicadores

� Presencia, entrada, crecimiento o sobrevivencia de patógenos.

� Buenas prácticas de manejo

� Integridad del proceso que se realiza

INDICADORES DE CALIDAD

¿Qué Indica un MicroorganismoIndicador?:

Métodos para Detección de Coliformes

(Filtracion en Membrana o FM)

Conexión de la bomba de vacío y trampa

Colocación de los filtros Colocación de los embudos

Filtrado de la muestra

Retirar el papel filtroColocar el papel en el mediode cultivo correspondiente

Incubado de la muestra bajocondiciones específicas de

temperatura y tiempo

Ensayo Medio Temperatura de incubación

Tiempo de incubación

Aspecto de las colonias

Coliformes totales

m-EndoAgar

35,0 ± 0,5 °C 24 hcolonias rojas con reflejos metálicos

Coliformes fecales(TermotolerantesTermofilicas)

m-FC Agar 44,5 ± 0,2 °C 24 hcolonias azules

Métodos de FM para CT y CFPrueba Presuntiva

CT CF

• En tubos:En tubos:En tubos:En tubos:

• En charolas En charolas En charolas En charolas multipozosmultipozosmultipozosmultipozos

((((ColilertertColilertertColilertertColilertert////EnterolertEnterolertEnterolertEnterolert))))

Métodos para Detección de Coliformes (Método del NMP)

Ensayos enzimáticos o sustratos fluorogénicos

Tradicionales

Comerciales rápidos

Pruebas comerciales rápidas

Micro Tester Pro

Amarillo tenue IntensoColiform Test Kit

ColiscanWater Monitoring Kits

Parámetro Tipos de Agua

E. coli Residuales tratadas

Contacto directo

240 NMP/100 mL

Descarga aguas Residuales tratadas

Contacto ocasional 1,000 NMP/100 mL

Para consumo humano

0

Enterococos Áreas recreativas

0-200 NMP/100 mL

100 NMP/100 mL CERTIFICACIÓN

Shigella/Salmonella Para consumo humano

0

Vibrio cholerae

Para consumo humano

0

Parámetros Microbiológicos de Calidad del Agua Normados paradiferentes Usos del Agua

Descargas vertidas a suelo (uso en riego

agrícola

2,000 NMP/100 mL

NOM-001-ECOL-1996, NOM-001-SEMARNAT-1996, NOM-127-SSA1-1994, NOM-EM-034-FITO-2000

Suelos:<1,000 NMP/gr suelo seco

Manejo postcosechaAusencia

�E. coli (enteropatógena y otros) Staphylococcus

� Rickettsia Klebsiella

� Enterococcus sp. Listeria monocytogenes

� Salmonella

� Shigella

�Pseudomonas

�Clostridium

�Aeromonas

�Vibrio cholerae

�Vibrio vulnificus

�Vibrio parahaemolyticus

�Campylobacter

�Yersinia enterocolitica

Patógenos Microbianos Monitoreados en AguaBacterias

Asociación Mexicana de Bioseguridad

AMEXBIO

http://amexbio.org/

Monitoreo de Bacterias Patógenas en Agua

Monitoreo de Virus y Parásitos en Agua

� Enterovirus

� Virus Norwalk

� Hepatitis A. E

� Rotavirus

Monitoreo de Microalgas Nocivas en Agua

METODOS MOLECULARES DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

Basados en la PCR/Secuenciación:

PCR, RFLPs, ARDRAAFLPs, Rep-PCR, RAPDsRIR-PCR, ERIC-PCR,RT-PCR, DGGE, qPCR,Metagenómica

Basados en sondas para ADN o ARN:

ISH, FISH, dot blot

Basados en anticuerpos:

ELISA, Inmunocitoquímica, anticuerposfluorescentes, recombinantes, despliegue en fagos

MMMMÉÉÉÉTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARESTODOS MOLECULARES(ADN, ARN (ADN, ARN (ADN, ARN (ADN, ARN proteproteproteproteíííínasnasnasnas))))

Caracterización y diversidad genética de aislados ambientales (RADP)

Célula bacteriana

Cromosoma circular

ADN en forma de hélice

Huella genética

Clave de identificación única

G CC GT AT AA TT AG CC GA TA T

Marcadores Moleculares (RFLPs y RAPDs)

Detección molecular por PCR de genes de virulencia

ADN molde

Multiples copias

(1 millón)

SoluciSoluciSoluciSolucióóóón n n n de lavadode lavadode lavadode lavado

FormaldehidoFormaldehidoFormaldehidoFormaldehido al 6%al 6%al 6%al 6%

HIBRIDACIHIBRIDACIHIBRIDACIHIBRIDACIÓÓÓÓNNNN

LAVADOSLAVADOSLAVADOSLAVADOSVISUALIZACIVISUALIZACIVISUALIZACIVISUALIZACIÓÓÓÓNNNN

FISHFISHFISHFISHSonda fluorescenteSonda fluorescenteSonda fluorescenteSonda fluorescente

Microscopio de Microscopio de Microscopio de Microscopio de epifluorescenciaepifluorescenciaepifluorescenciaepifluorescencia

FIJACIFIJACIFIJACIFIJACIÓÓÓÓNNNN

Hibridación Fluorescente in situ

INMUNOLOGÍA Anticuerpos recombiantes por Despliegue en Fagos

FvCs

Inmunización

Z3

Síntesis VH y VL

PCRBazo y linfocitos B

Expresión, extracción y purificación de los FvCs contra V. harveyi

Búsqueda y selección de clonasContra V. harveyi por ELISA

RNAT

RT-PCR

Construcción

del vector fasmídico y transformación en E. coli

Despliegue en fagos

Caso de Estudio 1

Vibriosis y Coliformes en la

Acuicultura

Identificación molecular de Vibrio haveyi

• AbundanciaAbundanciaAbundanciaAbundancia natural, 74 spp.natural, 74 spp.natural, 74 spp.natural, 74 spp.

• PlasticidadPlasticidadPlasticidadPlasticidad fenotfenotfenotfenotíííípicapicapicapica y y y y metabmetabmetabmetabóóóólicalicalicalica

• UbicuidadUbicuidadUbicuidadUbicuidad y y y y adaptaciadaptaciadaptaciadaptacióóóónnnn a a a a sistemassistemassistemassistemas acuiculturalesacuiculturalesacuiculturalesacuiculturales

• PatPatPatPatóóóógenosgenosgenosgenos oportunistasoportunistasoportunistasoportunistas de de de de organismosorganismosorganismosorganismos acuacuacuacuááááticosticosticosticos

PRINCIPAL PROBLEMA EN LA ACUICULTURAPRINCIPAL PROBLEMA EN LA ACUICULTURA

PorPorPorPor ququququéééé VibrioVibrioVibrioVibrio spp.?spp.?spp.?spp.?

HOSPEDEROHOSPEDEROHOSPEDEROHOSPEDEROL. vannamei

PATPATPATPATÓÓÓÓGENOGENOGENOGENOV. harveyi

AMBIENTEAMBIENTEAMBIENTEAMBIENTESistemas

de cultivo

V. harveyi: un patógeno de organismos marinos cultivados

VHML

FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE FACTORES DE VIRULENCIA DE VibrioVibrioVibrioVibrio harveyiharveyiharveyiharveyi

Fosfolipasas

Cisteína-proteasaalcalina

Endotoxinas:Lipopolisacáridos

HemolisinasTLH

vhhA y vhhB

Metalo-Proteasa

dependiente de Zn2+,

proteasastermoestables o termolábiles.

ToxinasT1 y T2

PREVENCIPREVENCIPREVENCIPREVENCIÓÓÓÓNNNN

DETECCIDETECCIDETECCIDETECCIÓÓÓÓNNNN

MONITOREO MONITOREO MONITOREO MONITOREO Identific

ación

molecular de las cepas

Larvas

Juveniles

Adultos

Genes y factores de

virulencia

EstrategiaEstrategiaEstrategiaEstrategia paraparaparapara la la la la prevenciprevenciprevenciprevencióóóónnnn, control y , control y , control y , control y manejomanejomanejomanejo de de de de laslaslaslas enfermedadesenfermedadesenfermedadesenfermedades bacterianasbacterianasbacterianasbacterianas

Métodos

AisladosAisladosAisladosAislados dededede VibrioVibrioVibrioVibrio utilizadosutilizadosutilizadosutilizados en en en en esteesteesteeste estudioestudioestudioestudio....CEPA FUENTE ORIGEN

Ea Sistema de eclosión Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L.stylirostris)

1A-1 Agua de mar cercana a la costa Bahía Santa Bárbara, Son, Méx. (L. stylirostris)

M1 Agua de mar del fondo de estanques con reproductores

Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx (L. stylirostris)

M1-a Agua mar estanques reporductores “

PN-9801 Órgano linfoide de juveniles enfermos Filipinas (P. monodon)

ML Larvas Criadero La Paz, B. C. S., México (L. vannamei)

ML-1 Larvas “

10MZ1 Nauplios Criadero Mazatlán, Sin. México. (L. stylirostris)

10MZ2 Nauplios “

11MZ Nauplios “

Na-1 Nauplios Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L. stylirostris)

Na-2 Nauplios “

Z1 Agua de mar del fondo de un estanquecon reproductores

Criadero Golfo Santa Clara, Son, Méx. (L. stylirostris)

Z2 Agua de mar de la superficie de un estanque con reprorductores

“

Z3 Agua del mar cercana a la pared de un tanque con reproductores

“

15

ais

lad

os

de

sis

tem

as d

e p

rod

ucc

ión

Análisis de RestricciónExperimental (Digestión

MspI)

Análisis de RestricciónTeórico

Determinación de CepasVibrio sp.

ANÁLISIS MOLECULAR

Amplificación Gene 16S DNAr

RFLPs

Diseño de Oligonucleótidos

Identificaciónde V. harveyi

PCRRAPDs

Búsqueda de PatronesGenéticos en V. harveyiy Diferenciación entre

Cepas

Generación de AnticuerposEcoliclonales

Phage Display

ELISA

BBBBaseaseasease de de de de datosdatosdatosdatos deldeldeldelNCBI NCBI NCBI NCBI ((((GeneBankGeneBankGeneBankGeneBank))))

SelecciSelecciSelecciSeleccióóóónnnn de genes de de genes de de genes de de genes de V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyitxR, vhh-1, vhhB, luxL, luxM y

luxN

AlineamientoAlineamientoAlineamientoAlineamiento y y y y disedisedisediseñññño de o de o de o de oligosoligosoligosoligos para para para para pcrpcrpcrpcr usandousandousandousando el el el el programaprogramaprogramaprograma DNAStarDNAStarDNAStarDNAStar y la y la y la y la

base de base de base de base de datosdatosdatosdatos del del del del NCBINCBINCBINCBI

PCRPCRPCRPCR

IDENTIFICACIIDENTIFICACIIDENTIFICACIIDENTIFICACIÓÓÓÓN DE N DE N DE N DE V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyi

EstrategiaEstrategiaEstrategiaEstrategia utilizadautilizadautilizadautilizada paraparaparapara el el el el disedisedisediseññññoooo de primers.de primers.de primers.de primers.

RESULTADOS

Amplificación del gen 16S ADNr

1, 500 pb

PM C+ B C D E F G H I J K L M N Ñ O

Confirmación de Vibrio sp.?

14126Aislados ambientales

RFLPs del gen 16S ADNr con MspI. Carril R, V. harvyei (ATCC 14126), B, B. subtilis, E., E. coli, 1-15, aislados analizados, PM, peso molecular.

PM B 1 C+ B E 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

200015001000750

500

300

150

50

RFLPs: “corte” con enzimas de restricción

Tabla VIII. Oligonucleótidos utilizados en el PCR.

OLIGOOLIGOOLIGOOLIGO GEN GEN GEN GEN BLANCOBLANCOBLANCOBLANCO PRODUCTOPRODUCTOPRODUCTOPRODUCTO FUNCIFUNCIFUNCIFUNCIÓÓÓÓNNNN

TAMATAMATAMATAMAÑO DEL O DEL O DEL O DEL PRODUCTOPRODUCTOPRODUCTOPRODUCTO

pbpbpbpb

txRtxRtxRtxR txRtxRtxRtxR TxRTxRTxRTxR ReguladorReguladorReguladorRegulador de la de la de la de la transcripcitranscripcitranscripcitranscripciónnnn

629629629629

vhhvhhvhhvhh----1111

vhhvhhvhhvhh----BBBB

vhhvhhvhhvhh----1111

vhhBvhhBvhhBvhhB

ββββ----lactamasalactamasalactamasalactamasa

hemolisinahemolisinahemolisinahemolisina

HidrHidrHidrHidrólisislisislisislisis del del del del anilloanilloanilloanillo ββββ----lactlactlactlactámicomicomicomico de de de de antibiantibiantibiantibióticosticosticosticosEnzimaEnzimaEnzimaEnzima lisalisalisalisa eritrocitoseritrocitoseritrocitoseritrocitos

818 818 818 818

656656656656

luxLluxLluxLluxL luxLluxLluxLluxL autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor MolMolMolMoléculaculaculacula seseseseñalalalal paraparaparapara la la la la expresiexpresiexpresiexpresiónnnn de la de la de la de la

luminiscencialuminiscencialuminiscencialuminiscencia dependientedependientedependientedependientede de de de densidaddensidaddensidaddensidad celularcelularcelularcelular

292292292292

luxMluxMluxMluxM luxMluxMluxMluxM autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor 393393393393

luxNluxNluxNluxN luxNluxNluxNluxN ProteProteProteProteínananana LuxNLuxNLuxNLuxN SensarSensarSensarSensar y responder al y responder al y responder al y responder al autoinductorautoinductorautoinductorautoinductor

2048204820482048

Selección de Genes para el Diseño de Oligonucleótidos

Amplificación de cepas ambientales de V. harveyi con luxN

2048

1500

1000

750

500

PM M1 C+ Z3 Z2

luxNluxNluxNluxN

PCRAmplificación específica

� Hernández-Zárate G. and Olmos-Soto, J. 2000. Molecular

identification of pathogenic and nonpathogenic strains of Vibrio harveyi

using PCR and RAPD. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 722-727 p.

200015001000

750

500

300

Perfiles RAPDs para cepas V. harveyi

1281 1283 12901247 1254

R Z2 Z3 R Z2 Z3 R Z2 Z3R Z2 Z3 R Z2 Z3

RAPDsAmplificación inespecífica (gel agarosa con bromuro)

Perfiles RAPDs de aislados de Vibrio spp., V. harveyi y la cepa control, utilizando el oligonucleótido OPS-11.

Ea PN 1A-1 PM M1 Z3 Z2 Z1 R

2072

1500

600

200

RAPDsAmplificación inespecífica (gel poliacrilamida con plata)

R Vo Pd Vpa Vpe Vca Vpro Val PM

2000

1500

1000

750

500

300

150

50

Perfiles RAPDs de diferentes especies del género Vibrio, incluyendo V. harveyi.

RAPDs

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

Clona 8 Clona 18 CT C-

Abs (405 nm)

EnsayoEnsayoEnsayoEnsayo inmunoenziminmunoenziminmunoenziminmunoenzimááááticoticoticotico de de de de laslaslaslas clonasclonasclonasclonas seleccionadasseleccionadasseleccionadasseleccionadas especespecespecespecíííífiicasfiicasfiicasfiicas paraparaparapara V. V. V. V. harveyiharveyiharveyiharveyi. CT, . CT, . CT, . CT, control control control control E. coliE. coliE. coliE. coli Top10FTop10FTop10FTop10F’’’’virgen; Cvirgen; Cvirgen; Cvirgen; C----, control , control , control , control negativonegativonegativonegativo....

Anticuerpos Recombinantes

ELISA

14126141261412614126 Z2Z2Z2Z2

Z3Z3Z3Z3 EaEaEaEa

M1M1M1M1 PN9801PN9801PN9801PN9801

Propiedades hemolíticas de los aislados V. harveyi y Vibrio spp.

Carga Bacteriana en Tilapia

Granja BHT

(UFC/mL)

Vibrio

(UFC/mL)

1

5.7 x 104 80

4.1 x 104 75

2

4.7 x 103 69

1.6 x 105 58

Coliformes (NMP)

408.3

437.1

258.9

Caso de Estudio 2

Calidad Sanitaria en Áreas Recreativas de Quintana Roo

Evaluar de forma rápida y precisa

E. colienterococos

Presencia/ausencia por PCR:V. cholerae,

V. parahaemolyticusV. vulnificus

Corredor Turístico Isla Blanca-Cancún-Tulúm

Monitoreos:2007-210

12 Cenotes 4 Lagunas8 Playas

Indicadores de contaminación fecalen ambientes costeros de Q. Roo

Concentración bacteriana

Coliformes totales

E. coliEnterococos Vibrio

patogénico

Laguna NMP /100 ml

Nichupté 4, 083.0 20.2 186.9 +

Bojorquez (estación 1) 2, 167.0 10.0 225.5 +

Bojorquez (estación 2) 4, 674.3 62.6 823.0 +

Manatí 6, 910.3 157.9 179.1 ++

Chackmuchuck 1, 063.4 72.4 30.6 +

Especie C1 C2 C3 C4 C5 C6 %

V. p. total + + + + + + 100

V. p. patogénico -

+

+

+

-

+

+

-

+

+

-

+

50

83

V. c. total

V. c. toxigénico

- + - - + + 50

- - - - - - 0

V. v. total - + - - + + 50

V. v. patogénico - + - - + - 33

Profundidad (m) 20 4,5 2,0 0,5 1,5 2,0

Ocurrencia de Vibrio spp. en agua subterránea y cenotes del noreste de Quintana Roo, México.

Densidad promedio de indicadores microbiológicos en playas

turísticas del noreste de Quintana Roo, México.

Certificación de playas: NMX-AA-120-SCFI-2006 (100 enterococos/100 mL)

SSA-COFEPRIS (200 enterococos/100 mL)

Concentración bacteriana

Coliformes totales

E. coli Enterococos Vibrio patogénico

Playa NMP /100 ml

Los Niños 435.2 2.0 13.5 -

Tortugas 193.5 13.1 2.0 -

Las Perlas 45.0 10.6 <1 -

Isla Contoy 2.0 <1 3.0 -

1000

600

500

300

200

100

PM Vp Vp Vp Vv Vv Vc Vc

450 269 500 205 504 588 564

pb

Total

Patogénico

Vp: V. parahaemolyticus

Vv: V. vulnificus

Vc: V. cholerae

C2

V. cholera

toxigénico

ausente

Rebolledo-Vieyra M. y Hernández-Zárate, G. Unidad de Ciencias del Agua: El Agua y la

Investigación Científica. En: Luis del Castillo et al. CICY: treinta años de labor científica y

educativa. Centro de Investigación Científica de Yucatán, A. C. Mérida, Yuc. México. 2010. 383-

388 pp. ISBN 978-607-7823-04-9 (Incluye Fe de erratas).http://www.cicy.mx/documentos/cicy/ultimas_noticias/fe%20de%20erratas.pdf

http://www.cicy.mx/documentos/cicy/ultimas_noticias/cicy_30_anos_de_labor_cientifica_y_educativa.pdf

G R A C I A S …