OBJETIVO: Identificar las especies patgenas de las vas gastrointestinales a travs del coprocultivo y de sus reacciones bioqumicas INTODUCCION La alta incidencia de procesos infecciosos entricos en la poblacin en general, en pases desarrollados y en vas de desarrollo, y sus elevados ndices de morbimortalidad entre determinadas subpoblaciones (nios y ancianos), hacen que este tipo de patologa siga cobrando gran inters desde el punto de vista clnico y microbiolgico. En pases en vas de desarrollo suele ser la causa ms frecuente de muerte y desnutricin en pacientes en edad peditrica. En pases desarrollados, debido al aumento de la calidad de vida, hay una disminucin de la frecuencia y mortalidad, siendo la mayora de los procesos autolimitados y resueltos con tratamiento adecuado. FINALIDAD DEL COPROCULTIVO La finalidad del coprocultivo es determinar el pronostico del o los agentes causantes de las infecciones intestinales y toxiinfeccin alimentaria estas por lo general estn producidas por m. O. Pertenecientes a la familia de las entero bacterias no por ello se descarta a otros m. O. Como stafilococcus productores de entero toxinas Estreptococos , Clostridios , etc. As como tambin virus , hongos y parsitos . La bsqueda del agente causal no se descarta despus de procesado una sola muestra ,la eliminacin del posible agente patgeno se hace muchas beses en forma intermitente obligando al microbilogo repetir el anlisis por lo comn despus de una semana . INDICACIONES DEL COPROCULTIVO Generalmente suele indicarse en un cuadro entrico infeccioso persistente de ms de 2 3 das, se aconseja la toma de muestras para exmenes de laboratorio. Se recomienda la evaluacin del cuadro: su duracin, su gravedad (grado de deshidratacin, fiebre, sangre en heces, prdida de peso, etc.); y la evaluacin de los antecedentes clnicos del paciente: uso reciente de antibiticos (diarreas asociadas a uso de antibiticos), edad del paciente (los rota virus son la primera causa de gastroenteritis deshidratante en nios), ingestin de mariscos poco cocidos (orienta hacia la infeccin por vibriones o virus smil Norwalk), viajes a zonas tropicales (aumentaran las infecciones por parsitos, virus, y E. coli entero hemorrgico O157), en huspedes inmuncomprometidos se tendran que considerar un amplio espectro de agentes etiolgicos (bacterianos, parasitarios, vricos y micolgicos), en brotes epidmicos se debe orientar hacia la presencia de S. aureus, Cl. perfringens, Salmonella, Vibriones, Shigella, Campylobacter, E. coli, B. Creus. Algunos de ellos escapan a la rutina diagnstica (S. aureus, B. Creus, etc.) porque lo que suele interesar es el estudio de su poder toxignico. Finalmente en cuadros gastroentricos que persisten durante ms de 10 das, se recomiendan los exmenes parasicolgicos. ETIOLOGA El nmero de microorganismos responsables de cuadros entricos se ha ido ampliando debido al mejor conocimiento de los mismos y al desarrollo de mtodos diagnsticos cada vez ms sensibles.

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Diversos microorganismos afectan directamente o a travs de sus toxinas al tubo digestivo provocando cuadros diarreicos, dolor abdominal, vmitos, fiebre, etc. Las infecciones gastrointestinales pueden tener una etiologa bacteriana y/o toxiinfeccin alimentara, vrica y parasitaria. BACTERIANA : Entre las que incluiremos Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Shigella, Yersinia entero colitica ,E. Coli entero patgeno , Psedomonas , Aeromonas , hidrfila , Pleciomonas , B. Creus , Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, vibrios, y otras menos frecuentes como Mycobacterium tuberculosis . VIRICA : Los virus productores de gastroenteritis son Rotavirus, Adenovirus, virus Norwalk, entre otros. PARASITARIA : Los agentes etiolgicos parasitarios pueden representar un amplio grupo de los que slo mencionaremos algunos como Giardia lambia , Cryptosporidium, Entamoeba histoltica, Ciclos porra, Blastocystis, etc. MICOTICA : levaduras como cndida albicans . Al igual que en el caso de otras muestras humanas, sera conveniente que el clnico orientase al laboratorio sobre el proceso de infeccin y la etiologa sospechosa. Todo ello repercutir en beneficio del paciente, permitiendo ganar tiempo en la obtencin del diagnstico y disminuyendo el coste del precio del anlisis. Esta orientacin es de gran importancia, y en caso de no recibirla, sin ningn tipo de reparos debe ser el microbilogo quien la solicite al mdico para que le d informes sobre detalles epidemiolgicos, perodo de incubacin, as como si el paciente cursa o no con fiebre. Es preciso recordar que las intoxicaciones alimentarias, es decir, las debidas a toxinas producidas fuera del hospedador y despus ingeridas, generalmente no cursan con fiebre y tienen un perodo de incubacin muy corto; en cambio, las producidas directamente por microorganismos cursan habitualmente con fiebre y tardan ms en aparecer. En la tabla 1 se justifica, en parte, lo expuesto. RELACION ENTRE ALGUNOS TIPOS DE GASTROENTERITIS Y LA FIEBRE (1) Patologa causada por Perodo de incubacin (3) Sntomas comunes (4) (2) Nuseas, vmitos, calambres abdominales, Staphylococcus aureus. Toxina (termoestable). 26 horas. diarrea (30 %), sin fiebre o muy poca. Diarrea, dolor abdominal, Salmonella. Infeccin 1236 horas. por lo comn fiebre. Diarrea lquida con mucus; Shigella Infeccin 2472 horas. la fiebre es habitual Toxina (moderadamente Diarrea, calambres, sin Clostridium perfringens. 612 horas. termoestable) fiebre o muy poca. Gastroenteritis inicial Clostridium botulinum. Toxina (termoestable) Variable (de horas a das) seguida por efectos de tipo curare. Microorganismos

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(1) La tabla describe algunos microorganismos productores de gastroenteritis. (2) Patologa causada por la produccin de toxinas o por enteroinvasividad. (3) El efecto patolgico se manifiesta generalmente antes si el microorganismo produce toxinas. (4) Entre los sntomas de gastroenteritis figura siempre la diarrea y slo en los casos de infeccin es habitual la fiebre. OBTENCIN DE LA MUESTRA Se utilizaran heces recientes en un recipiente limpio de boca ancha y cierre hermtico con un volumen mnimo de 2 a 4 g en heces pastosas y 5 a 10 ml en heces lquidas. En general debe desaconsejarse el uso de hisopos rectales y restringirlo a casos excepcionales como en neonatos. En muestras digestivas se puede utilizar aspirado gstrico o duodenal. Las biopsias y muestras obtenidas por endoscopia son fundamentales para la bsqueda de Helicobacter pylori (biopsia gstrica y duodenal). La biopsia rectal es empleada para la deteccin de Entamoeba histoltica. El meconio se suele utilizar para estudio perifrico en neonatos con riesgo de sepsis. En muestras para estudio parasicolgico se envan con frecuencia estas en frascos cerrados con lquido conservador. La obtencin de la muestra se har depositando directamente la misma en un recipiente estril, para lo cual puede servir una placa de Petri o un frasco de boca ancha. En caso de no ser posible esta toma directa, se recoger con una cuchara estril alguna porcin del material fecal recin emitido, que no haya entrado en contacto con el frasco receptor (orinal), y se verter en un contenedor estril. Se recomienda procesar las muestras en el menor tiempo posible puesto que un numero de m. O. No sobreviven a lo cambios en el PH lo cual ocurre cuando baja la temperatura , esto es especialmente importante cuando se trata de Shigella y un numero apreciable de salmonellas , si se desea preservar las muestras se deben de someter a la accin de un preservante como el buffer fosfato 0.033 M mezclado con igual volumen de glicerina se estar frente a un PH de 7.0 . las muestras se obtienen por evacuacin natural o mediante frotis rectal de una evacuacin natural tomar las porciones que presenten mucosidad y sangre , cuando se obtiene la muestra por frotis rectal se debe de utilizar una torunda de 6 y sembrar inmediatamente en los medios apropiados o en su efecto colocar en un medio de transporte . este mtodo de toma de muestra es por lo general utilizado en lactantes . El producto as recogido se debe sembrar inmediatamente, incluso en la misma habitacin del paciente si ello es posible, pues algunos patgenos intestinales, concretamente Shigella y algunas especies de Salmonella, sobreviven muy poco tiempo a los cambios de pH que sufren las heces en contacto con el ambiente. En caso de no poder sembrar la muestra in situ, y ante la necesidad de mandarla a un laboratorio, aunque est relativamente cercano, es conveniente enviar parte de ella, incluida en algn medio de transporte que mantenga el pH cercano a la neutralidad. Entre estos medios de transporte se pueden citar: a) Buffer fosfato 0,033 M, mezclado en partes iguales con glicerina. b) Medio tamponado con indicador (Sachs, 1939). Es parecido al anterior, con la innovacin de incluir un indicador, que seala que el medio slo se puede utilizar en condiciones de coloracin rosa y que se debe desechar cuando adquiere tonalidad amarilla. 3

c) Medio de Hajna. Es un excelente medio para el transporte de heces que contienen Salmonella o Shigella.. Puede adquirirse comercializado en forma deshidratada y aadirle, una vez rehidratado, glicerina al 30 por 100. d) Caldo GN. Debido tambin a Hajna. e) Medio de transporte de CaryBlair. Es quiz el ms aceptado universalmente. Permite incluso la recuperacin de anaerobios. NMERO DE MUESTRAS Si con la primera muestra no se detecta la presencia de entero patgenos, es necesario enviar dos tomas ms en diferentes das. MUESTRAS INADECUADAS No se consideran adecuadas las heces emitidas no procesadas antes de 2 horas y no refrigeradas y el envo de tres muestras de heces el mismo da. OBSERVACIONES Las muestras debern tomarse antes de la administracin de antibiticos y se debe indicar siempre en el volante de peticin el juicio diagnstico de presuncin, la edad y explcitamente algunas investigaciones especiales como toxina de C. difficile. PROCESAMIENTO Y VALORACIN

OBSERVACIN DE LA MUESTRA Se puede realizar un examen microscpico para detectar polimorfo nucleares (sugiere infeccin por un patgeno invasivo) y flora predominante. Al recibir la muestra en el laboratorio se observarn detenidamente sus caractersticas, tales como el olor, color, consistencia, o la presencia de mucosidades, sangre, o restos de alimentos sin digerir. Estos detalles pueden orientar algo el diagnstico; as, por ejemplo, unas heces lquidas con grumos en forma de agua de arroz, harn pensar en el clera, o la sangre y mucosidades indicarn una sintomatologa inflamatoria del intestino, que puede ser debida a una disentera. Hay autores que completan esta apreciacin microscpica, mezclando en un porta una pequea porcin de heces con una gota de azul de metileno, tapndolo con un cubre y observando la preparacin con objetivo de inmersin, intentando descubrir leucocitos. Su presencia denotar que hay inflamacin en el intestino, la cual suele estar producida por agentes infecciosos invasores como Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo; en cambio, ante un proceso gastroentertico, con heces exentas de glbulos blancos, se sospecha una etiologa virsica, o una bacteriana capaz de producir toxina, como vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum o E. coli entero txico. Incluso hay investigadores que afinan ms, y con una tcnica de coloracin como la de Wright, llegan a establecer las distinciones etiolgicas expuestas en la tabla 2. ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES ASOCIADAS CON LEUCOCITOS FECALES Enfermedad Tipo de leucocito predominante (2) 4

Porcentaje de pacientes con leucocitosis fecal (1) Shigelosis Salmonelosis (no por S. typhi) Fiebre tifoidea E. coli (invasor) Colitis ulcerosa (activa) 100 82 100 100 100 Leucocitos polimorfo nucleares (media 84 %). Leucocitos polimorfo nucleares (media 75 %). Leucocitos mononucleares (media 95 %) Leucocitos polimorfonucleares (media 85 %). Leucocitos polimorfonucleares (media 88%) (eosinfilos, media 8 %). Por lo general mononucleares, salvo infeccin bacteriana secundaria

Disentera amebiana (activa) Variable Controles sanos, diarrea virsica, clera. 010

La leucocitosis fecal se puede apreciar, simplemente, por observacin entre porta y cubre. El tipo de leucocitos se observa despus de una coloracin de Gram. EXAMEN DIRECTO CON SOLUCION DE LUGOL Y SOLUCION SALINA Es un mtodo muy fcil de realizar , valido para la bsqueda de huevecillos, trofozoitos, larvas y quistes de helmintos y protozoarios. TCNICA: Se toma un fragmento de materia fecal de aproximadamente 1mm de dimetro con el aplicador. Se lleva a un porta, el cual contendr una gota de solucin salina o yodo lugol. Se emulsiona perfectamente, se protege con un cubre y se observa al microscopio. Si la muestra tiene moco con sangre se realiza una toma igual del sitio. EXAMEN RUTINARIO Consiste fundamentalmente en la inoculacin de la muestra diluida en solucin fisiolgica en diversos medios de cultivo, alguno de ellos general como el Agar sangre para evaluacin general de la flora. Otros medios moderadamente selectivos para aislamiento de entero bacterias patgenas como MacConkey, SalmonellaShigella, XLD (xilosalisinadesoxicolato), CIN (cefsulodinairgasannovobiocina) que permiten el crecimiento de Salmonella, Shigella, Yersinia. Sabouraud cloranfenicol para cndida cuando se presenta en disbacteriosis. Medios lquidos de enriquecimiento, para la recuperacin de algunos microorganismos, como el medio de Selenito Medios para Campylobacter como el medio de Skirrow, en ambiente microaeroflico. Tambin en este mismo ambiente, diversos medios como el Agar sangre, se pueden emplear para Helicobacter. Deteccin de rotavirus y adenovirus en nios, especialmente en meses invernales y de temperatura templada. CULTIVOS O PRUEBAS ESPECIALES

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Se debe hacer constar en el volante de peticin esa circunstancia. Por ejemplo para deteccin de Vibrio sp. con medios como agua de peptona y TCBS. En toxina de Clostridium difficile, especial atencin a enfermos que hayan usado recientemente antibiticos durante algunos das. Deteccin de toxina de E. coli entero patgeno O157H7 en heces hemorrgicas. En los casos poco frecuentes de bsqueda de cepa Salmonella lactosa positiva, aadir a los medios habituales Agar sulfito bismuto o verde brillante. Aeromonas mesfilas con temperatura de incubacin de 25 a 30 C. Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Bacillus cereus relacionados con brotes de toxiinfeccin alimentaria, slo en laboratorios que realicen anlisis de alimentos. Ensayos para virus causantes de esta patologa, como rotavirus, adenovirus , etc. AISLAMIENTO Y CULTIVO MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO Muestra de materia fecal en frasco con tapa. Placas estriles de: agar soya tripticasena, agar EMB, agar endo, agar SS, agar verde brillante. , Mac Conkey , XLD . Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo tetrationato. Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo nutritivo estril. Tubo de 16 x 150 con 5 ml de caldo selenito Mechero, asa, incubadora. Al da siguiente: Placas con coprocultivo. Equipo de coloracin de Gram Serie de tubos de cultivo para pruebas bioqumicas tales como TSI , SIM , LIA , CITRATO DE SIMONS , UREA , etc. Mechero, asa, tina, puente, piseta. Lmpara de alcohol. SIEMBRA DE MUESTRAS PARA BACTERIOLOGA BIOSEGURIDAD Tmense precauciones de asepsia al manipular los especimenes. al inocular en los tubos es indispensable el uso de mascarillas y gorra. trabajar siempre frente a la flama del mechero

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Para hacer el coprocultivo, es decir, la siembra de las muestras fecales, se recogern aquellas partes del contenido intestinal que llamen ms la atencin por su aspecto sanguinolento o mucoso, pues es all donde abundan los microorganismos patgenos. La inoculacin se efectuar sobre medios de cultivo propios y selectivos de los principales patgenos intestinales, incluyendo, dada su importancia, un medio de enriquecimiento para Salmonella (Selenito o tetrationato). Las cepas de Salmonella aisladas se identificarn por pruebas bioqumicas y se confirmar su identidad mediante un polivalente serolgico. No es necesario que los pequeos laboratorios dispongan de todo el amplio material perecedero para serotipificar a Salmonella. La presencia de Shigella tambin se confirmar serolgicamente Es discutible la inclusin rutinaria de mtodos y medios para el diagnstico de Vibrio cholerae y Campylobacter. El primero porque es poco frecuente y adems porque las caractersticas clnicas del paciente y las de la muestra ya orientaran hacia ello en caso necesario. El segundo porque, aunque actualmente ocupa el primer puesto en incidencia patolgica intestinal, su metodologa de cultivo e incubacin resulta cara para una prctica sistemtica de todas y cada una de las solicitudes. En este caso se valorar individualmente cada muestra, concediendo especial importancia a la edad del paciente y a la consistencia del producto. Todo lo tratado demuestra que la Microbiologa es una ciencia viva, en constante desarrollo, y que su investigador, aunque tenga establecidos unos esquemas tericos a seguir, deber en ocasiones hacer uso de improvisaciones prcticas, vinculadas a su experiencia cientfica. las muestras obtenidas segn los mtodos sealados estas deben ser procesadas en el menor tiempo posible utilizando para ello una torunda o una ansa de kolle sembrar mas o menos 1 g de muestra en los medios de enriquecimiento escogiendo de preferencia las porciones que presentan mucosidad y sangre paralelamente se deben sembrar en placas con agar Salmonella Shigella , agar verde brillante , xld agar y agar mac conkey este ultimo con la finalidad de aislar E. Coli entero patgeno (EPI) muy comn en las diarreas infantiles , los medios sembrados deben dejarse en incubacin por 24 48 horas a 37C . ESQUEMA A SEGUIR EN EL PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA DEL COPROCULTIVO PROCEDIMIENTO 1) Sembrar una asada de materia fecal sospechosa en el tubo de caldo de tetrationato. Inocular con asa por emulsin. 2) De la misma manera sembrar otra asada de la misma muestra en el tubo de caldo nutritivo. 3) Etiquetar con los datos escolares 4) Levar a la incubadora a 37C durante 24 horas. Colocar los tubos en gradilla de rejilla, de tal manera que se mantengan en posicin vertical para evitar que el lquido se derrame. RESIEMBRA. BIOSEGURIDAD Al inocular las placas, es indispensable el uso de mascarillas as y gorra. Trabajar frente a la flama. 1) Retirar los tubos de la incubadora. 2) Disponer sobre la mesa una serie de medios selectivos (agar EMB, agar SS, agar verde brillante y agar soya tripticaseina) para resembrar el cultivo en caldo de tetrationato. 7

3) Disponer sobre la mesa una serie de los mismos medios selectivos para resembrar el cultivo en caldo nutritivo. 4) Resembrar en cada una de las placas el inculo correspondiente por la tcnica de estrias cruzadas sectoriales. Usar solo una asada para cada placa. 5) Sellar las placas. Etiquetar con los datos escolares 6) Llevar las placas a la incubadora. Colocarlas en posicin invertida. Mantenerlas durante 24 horas. Al da siguiente: 1) Retirar las placas de la incubadora. 2) Efectuar anlisis macroscpico de cada una para valoracin de la prueba presuntiva respecto a la fermentacin de la lactosa, de acuerdo a la siguiente: GUIA DE IDENTIFICACION PRESUNTIVA La prueba de identificacin presuntiva para diferenciacin de los bacilos entricos Gram. negativos se basa en la valoracin de la fermentacin de la lactosa sobre medios de cultivo adicionados con este carbohidrato, como el agar endo o el agar EMB: a) Enterobacilos que producen fermentacin rpida de la lactosa: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae. b) Enterobacilos que producen fermentacin lenta de la lactosa: Edwarsiella, Serratia, Citrabacter, Arizona, Providencia, Erwinia. c) Enterobacilos que no producen fermentacin de la lactosa: Shigella, Salmonella, Proteus, Pseudomonas. La manera de cmo metabolizan este azcar en los diferentes medios de cultivo selectivos se manifiestan por cambios en el color del medio con respecto al que originalmente tena o bien por la coloracin de las colonias, la cual es tpica en algunos de elos, al respecto, se sugiere utilizar la siguiente tabla: BACTERIAS MEDIOS EMB DE MAC CONKEY CULTIVO SSA Opacas parte central negra , periferie transparente HK XLD

SALMONELLA

translucidas incoloras

incoloras transparentes

PROTEUS E. COOL OTRAS COLIFORMES

Translucidas o incoloras Centro oscuro conbrillometalico

centro negro , Translucidas o periferie incoloras transparente Rojas, rosadas Rojas o rosadas rodeadas por poco coloreadas una zona de con centro rosado

Negras si producen Colonias SH2 y rojas verdes si no azuladas producen SH2 Opacas , amarillas (Mirabilis y Vulgaris) Salmn Opacas anaranjado amarillas

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SHIGUELLA

translucidas incoloras translucidas incoloras

bilis precipitada incoloras transparentes translucidas incoloras

PSEUDOMONAS

opacas transparentes Principalmente inhibidas o translucidas incoloras Rojas rosadas , incoloras con el centro rosado

Verde azulado

Rojas A veces colonias rojas Opacas amarillas Colonias opacas y amarillas Colonias rojas con la parte central negra

KLEBSIELLA

Mucosas mas grandes que E. Coli Rosadas y tienden a unirse , mucosas siempre convexas

ENTEROBACTER , SERRATIA

Blancas o Brillo metlico mas Rojas rosadas cremosas opacas grandes que E.coli y mucosas translucidas incoloras Transparentes con brillo verde metlico Incoloras transparentes rojas las LF. Parte central negra y bordes transparentes

ARIZONA

CITROBACTER

LEYENDA EMB : Eosin methilene blue agar SSA : salmonella shiguella agar XLD : xilose lycine desoxicolato agar Mc C : agar Mac Conkey VB : agar verde brillante HK : agar enterico de hektone 3) Efectuar anlisis microscpico por el mtodo de Gram de cada una de las placas para confirmacin de la morfologa de los bacilos entricos gram negativos en los medios selectivos y para bsqueda e identificacin de Entero cocos en los medios de uso general como el agar soya tripticaseina. 4) Seleccionar en los medios selectivos una variedad de colonias consideradas como sospechosas de pertenecer a algn gnero patgeno (segundo grupo en la tabla anterior) y resembrarlas en los medios diferenciales para conocer sus REACCIONES BIOQUMICAS como se indica a continuacin. CONTROL E INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS al termino de la incubacion se seleccionan las colonias sospechosas en las placas de agar SS , VB ,y agar Mac conkey de los caldos senbrados se repican en los mismos medios sealados . se ara enfasis en la busqueda de colonias pequeas no fermentadoras de lactosa con excepcion de E. coli EPI que si fermenta la lactosa y presenta las mismas caracteristicas morfologicas de una E.coli componente normal de la flora intestinal , la 9

unica forma de identificar este m.o . es por serologia , las colonias seleccionadas se suspenden en una gota de suero OB polivalente colocada en un porta obgeto , se homogenisa y se ajita por vaiven ,observar si presenta aglutinacion o no sobre un fondo oscuro . otras colonias sospechosas son seleccionadas para su identificacion bioquimica en los medios de TSI , LIA, citrato de simons , urea ,SIM entre otros . al termino de 24 horas de incuvacion a 37c se efectuan las lecturas utilizando la tabladeidentificacion de enterobacterias . Es indudable que la Salmonella y shiguella son los m.o.que frecuentemente producen cuadros de toxiinfecion , tanto en elhombre como en los animales pudiendo encontrarlos con mayor fasilidad durante los tres primeros dias del cuadro diarreico . para el aislamiento de Salmonella y sgiguella los autores Tailor y Eschelhart Rollender y Coll recomiendan el uso de medio de cultivo XLD , la siembra debe ser directa y lo mas fina posible a fin de obtener colonias aisladas , encanbio cuando se trata de medios altamente selectivos la sienbra por estrias es abundante . El cresimiento de Salmonellas en medio XLD se presenta como colonias rojas, muchas veses con el centro de la misma de color negro . Cuando sequiere aislar Estafilococos patogenos se hace uso demedios furtemente inhibidores de laflora intestinal grm negativa. tal es el caso del medio manitol salado y el agar Baird Parker en elprimero sedesarrollan colonias doradas rodeadas de un alo amarillo por fermentacion del azucar y en el segundo las colonias son pequeas , negras y rodeadas de un alo transparente devido a la ovolisis . La inbestigacion de cocos patogenos no deve ser descartado en la rutina entos se an encontrado en el orden de 15 20 % segun Ginton y Col. Asi mismo de manera obcional se puede investigar Candida albicans ,Mycobacterium tuberculosis y V.cholerae esto inplica disponer de mayor tienpo y los costos aumentan considerablemente , su inbestigacion esta superitado deacuerdo a la nesesidad del clinico tratante . Por lo tanto un examen de materia fecal nos lleva a determinar la existencia de trastornos de la digestion , alteraciones en las paredes gastrointestinales y la existencia de parasitos y m. o.patogenos . prebiamente es nesesario efectuar un examen macroscopico , suspendiendo la muestra en solucion ficiologica y en una placa petri , inclinando esta se podra aprecia si hay moco , restos alimenticios ,pus restos o parasitos adultos ,etc. posteriormente efectuaruna obserbacion microscopica de un preparado en una lamina portaobgeto con nsolucion de lugol y salina , la existencia de polimorfonucleares y piocitos indica una inflamacion o infeccion , encanbio si las heces son ndiarreicas pero que en el examen no seobserban muchos polimorfonucleares ni piocitos ,puede que eltrastorno sea de origen alimenticio y no nesesariamente de origen bacteriano ,esto no libera al microbiologo de prosesar la muestra para su inbestigacion rutinaria . REACCIONES BIOQUMICAS 1) Disponer a la temperatura ambiente en gradilla una serie doble de tubos de cultivo para reacciones bioqumicas. 2) Resembrar del medio de cultivo que contiene las colonias de bacilos Gram. negativos seleccionados como sospechosas a los medios para bioqumicas dejando uno de uno sin sembrar para emplearlo como control negativo. a) En los medios inclinados sembrar por estras. b) En los medios verticales sembrar por picadura. asa c) En los medios lquidos sembrar por emulsin. 3) Etiquetar con los datos escolares. Llevar a la incubadora por 24 horas.

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AL DIA SIGUIENTE: 4) Retirar las series de tubos con las reacciones bioqumicas. 5) Interpretar las reacciones bioqumicas en cada uno de los tubos, de la siguiente manera. AGAR HIERRO DE KLIGLER Es una prueba diferencial y adems se trata de una multiprueba. Se compone de dos hidratos de carbono (Lactosa en un 1% y Glucosa en un 0,1%). La Glucosa se encuentra en menor cantidad para que se consuma antes de las 24 horas de incubacin y necesariamente las bacterias tengan que consumir las peptonas, con lo que se produce amonaco y se alcaliniza el medio. 1. hay 3 formas bsicas de fermentacin en este medio de cultivo: Que solamente se fermente la Glucosa: por principio, todas las enterobacterias fermentan la glucosa. Cuando la glucosa se acaba y la bacteria no es capaz de utilizar la lactosa, se alimentar de las peptonas del medio. Mtodo: la siembra se hace en profundidad (condiciones anaerobias) y en superficie (condiciones aerobias). La muestra debe proceder de un medio de cultivo puro, se tomar una colonia con un hilo de siembra y se har la inoculacin del medio de cultivo primero en profundidad, y segundo, segn sacamos el asa, en superficie. La lectura se realizar tras un tiempo de incubacin de 24 horas (que se ha de cumplir a rajatabla) a 3537C. Resultados: Si se fermenta la Glucosa, se producen unos compuestos que acidifican el medio y, por lo tanto, el medio virar a amarillo. Si adems de la Glucosa utiliza las peptonas, que producen amoniaco, el medio se alcaliniza y en lugar de virar a amarillo virar a rojo intenso. Esto ltimo solo ocurre en la siembra que se ha hecho en la superficie, es decir, que veremos la superficie roja y el fondo amarillo. Esto es as porque los productos metablicos son diferentes si la transformacin es aerbica o anaerbica. Que fermente tanto la Glucosa como la Lactosa: Se observar el medio totalmente amarillo, debido al pH cido. Que no fermente ninguna: se alimenta desde el principio de las peptonas, por lo tanto podremos afirmar que no se trata de una Enterobacteria. Se originarn una serie de productos alcalinos que virarn el medio a rojo tanto en el fondo como en la superficie, siempre y cuando la bacteria sea capaz de consumir las peptonas tanto en medio aerobio como anaerobio. Si la bacteria solo fuera capaz de utilizar las peptonas de forma aerobia, la superficie aparecera roja, mientras que el fondo permanecera sin cambios. 2 Observacin de la produccin de gas (CO2 y H2): Si en el medio se forma alguno de estos gases, se observarn algunos cambios en el medio de cultivo: Aparicin de burbujas. Fracturas en el agar. 1. Desplazamiento del medio de cultivo hacia la boca del mismo debido a una produccin intensa de gas. Observacin de la produccin de Sulfhdrico (SH2). Para que se produzca el SH2 Las condiciones han de ser cidas

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Se necesita una fuente que suministre el azufre (Tiosulfato de Sodio) Se necesita un indicador que nos permita visualizarlo (Sal de hierro Citrato Frrico Amoniacal). Este indicador hace que el SH2 precipite en forma de un precipitado negro. Si la cantidad precipitada es pequea, el precipitado se observar en la superficie del medio de cultivo. Si, por el contrario, la produccin de SH2 es muy intensa, toda la parte profunda del tubo se ver negra. Ahora bien, si todo el fondo se ve negro cmo sabremos el viraje del medio?. Pues bien, como para que se pueda producir el Sulfhdrico es necesario que se den unas condiciones cidas, deberemos suponer que el medio de cultivo habr virado a amarillo en el fondo. En la superficie si podremos diferencias entre el rojo y el amarillo sin ningn problema. PRUEBA DE LA CATALASA Definicin: Es una enzima que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas (a excepcin del Estreptococcus, por eso es una prueba que nos permite diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos). Funcin: Descompone el perxido de hidrgeno (H2O2 o agua oxigenada) que se forma como producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares: 2 H2O2 2 H2O + O2 (gas) Catalasa Tcnica: Consiste en recoger con el asa de siembra una colonia procedente de un cultivo puro, reciente y colocarla sobre un portaobjetos. A continuacin agregamos 1 gota de perxido de hidrgeno al 30%(comercial) sobre el microorganismo con una pipeta Pasteur (no es necesario homogeneizar). Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: se formarn inmediatamente burbujas bien visibles. 2 Si la prueba es NEGATIVA: no se observar burbujeo. Precauciones: es importante que la muestra no tenga su origen en un medio que contenga sangre, ya que podramos obtener falsos positivos. PRUEBA DE LA OXIDASA O CITOCROMOOXIDASA Principio: se basa en determinar la presencia de las enzimas oxidasas, las cuales catalizan la transferencia de electrones desde el sustrato, que es generalmente orgnico, hasta el oxgeno. Tcnica: Se realizar segn las instrucciones de la casa que nos proporcione el producto. Generalmente, en las oxidasas positivas, se produce una reaccin entre la enzima y un sustrato que est en la tira reactiva dando lugar a un producto coloreado que suele ser el azul de indofenol. El reactivo puede variar de una casa comercial a otra, as una prueba oxidasa+ se observar de un color que oscila entre el prpura y el negro. Precauciones: No tomar la muestra de medios coloreados. PRUEBA DEL INDOL Principio: se basa en determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el indol de la molcula de triptfano, que es un aminocido, que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar metabolitos 12

indlicos. A este grupo de enzimas, capaces de desdoblar el triptfano se les denomina triptofanasas. Tcnica: Se utiliza un caldo de triptona o de peptona (a veces tambin se utiliza un medio semislido: medio de S.I.M = Sulfhdrico; Indol; Movilidad). Se disponen 5 mL del medio en cada uno de los tubos que vayamos a utilizar para la prueba, esterilizamos, inoculamos e incubamos (3537C / 24h). Por ltimo, para saber si se ha producido el Indol aadimos 5 gotas del reactivo de Kovacs indol. Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: aparece un anillo rojo en la superficie del medio. 2 Si la prueba es NEGATIVA: permanece un color amarillo, que es el color del reactivo (el reactivo es un aldehdo) PRUEBA DEL CITRATO Principio: consiste en determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono alcalinizando el medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para observar la fermentacin de citrato contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono, utiliza tambin las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Estas sales de amonio se van a desdoblar en amoniaco produciendo la consiguiente alcalinidad. El medio utilizado es el Agar Citrato de Simmons que lleva como indicador el azul de bromotimol (cuando el pH es alcalino vira a azul intenso, mientras que el medio sin inocular tiene un color verde). Tcnica: Se utiliza un tubo inclinado. Hacemos la estra en superficie con un inculo poco denso y lo llevamos a incubar (3537C / 24h) Resultados: 1. Si la prueba es POSITIVA: En la superficie del medio de cultivo se observa un viraje del verde a azul intenso. 2.Si la prueba es NEGATIVA: no se produce viraje, se queda verde. PRUEBA DEL ROJO METILOVOGES PROSKAUER (RMVP) INTRODUCCIN: Para el metabolismo de los Hidratos de Carbono se pueden dar varios procesos: Gluclisis: proceso de hidrlisis por el cual se transforma la glucosa en cido pirvico. Vas alternativas Pentosas fosfato: se puede usar al mismo tiempo que la Gluclisis o de forma independiente. Entner Douduroff: la utilizan algunas Enterobacterias sin necesidad de utilizar la Gluclisis y la va de las pentosas fosfato. El cido pirvico puede usarse mediante: Va aerbica: Respiracin. El aceptor final de electrones es una molcula inorgnica (O2).

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Como productos obtenemos CO2 y H2O Empoacetilo + CoA ciclo de Krebs + cadena transportadora de e Va anaerobia: Fermentacin. El aceptor final de electrones es una molcula orgnica. Es de menor rendimiento energtico que la Gluclisis. Puede ser de tres tipos: Lctica Alcohlica cido mixta o del Grupo Califorme: tiene como productos: cidos mixtos: frmico, actico, succnico, etlico... (RM+) Butilenglicol Butanediol Acetona (RM) ROJO DE METILO (RM) Principio: Es una prueba que mide de forma cualitativa los productos cidos que se originan por el metabolismo de la Glucosa de forma que, cuando estos cidos se producen en cantidad elevada, consiguen superar el sistema amortiguador llevando el pH del medio hasta 4 4,5. Tcnica: Se siembra 1 tubo para la prueba RM y otro para la de VP para cada muestra. Se incuba a 3037C durante 48 horas a 4 das incluso 6 das, y finalizado el perodo de incubacin le aadimos al tubo del RM 0,10,2 mL del reactivo Rojo de Metilo. Resultados: Si la prueba es POSITIVA aparece coloracin roja en la superficie de contacto del reactivo y del medio de cultivo. Si la prueba es NEGATIVA se queda el color del medio (amarillo) Precauciones: Es importante incubar como mnimo 48 horas. Si se observa un color anaranjado hay que continuar con la incubacin hasta 4 das. Si hacemos la lectura antes de las 48 horas todas las enterobacterias darn la prueba positiva, ya que todas fermentan la glucosa. Las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo positivas producen como consecuencia del metabolismo de la glucosa unos productos cidos en gran cantidad y estables. Trascurridas las 48 horas se aade el indicador. En este caso, los cidos habrn superado el sistema amortiguador del tampn (pH = 4 4,5), por el contrario, las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo negativas tambin producen cidos pero se producen en menor cantidad, son menos estables, se produce mayor cantidad de CO2 y, adems, se producen productos como consecuencia de la degradacin de las peptonas, con lo que el pH tiende a la neutralidad, es decir que 14

tiende a alcalinizarse. VOGESPROSKAUER Principio: Es una prueba que pone de manifiesto un producto final neutro que es la Acetona. Tcnica: Se inocula y se incuba durante 24 48 horas. Para poner de manifiesto la acetona se utilizan 0,6 mL de naftol al 5% (intensifica el color) y 0,2 mL de KOH NaOH al 40% (oxida la acetona en diacetilo, que es el producto coloreado junto con el alcali y las peptonas). Es importante que se aadan en este orden y tienen que ser medidas exactas. Resultados: Se realiza la lectura a los 1015 min de la adicin de los reactivos: 1. Si la prueba es POSITIVA se observa un color rojo rosado en la superficie del medio. 2. Si la prueba es NEGATIVA se observa un color amarillo en la superficie del medio Precauciones: Despus de la incubacin del reactivo es importante dejar destapado el tubo con el fin de que el O2 se ponga en contacto con los productos formados, de tal forma que se acelere la reaccin. En la mayora de los casos, las enterobacterias que son RM+ son PV y viceversa. O.N.P.G ORTONITROFENOL DGALACTOPIRANSIDO Principio: Es una prueba que pone de manifiesto la capacidad de un m.o de fermentar la Lactosa, demostrando la presencia ausencia de la enzima galactosidasa cuando se emplea un compuesto orgnico que es el ONPG. Si en la clula bacteriana se encuentran enzimas para metabolizar la lactosa, el reactivo ONPG es hidrolizado, liberando un compuesto amarillo (ortonitrofenol). Estas enzimas son inducidas y estn controladas genticamente. Pueden disminuir o desaparecer despus de varias generaciones si el sustrato no est presente. NOTA: las enzimas inducidas son aquellas que la bacteria produce exclusivamente cuando se encuentra el sustrato sobre el que se va a ejercer su accin. Las enzimas constitutivas son aquellas que son producidas por la bacteria independientemente de que el sustrato se encuentre o no en el medio de cultivo. Para que se produzca la fermentacin de la Lactosa, un microorganismo necesita 2 enzimas: galactosidasa permeasa: Se encuentra en la membrana celular. Transporta la Lactosa al interior celular. D galactosidasa: Hidroliza la Lactosa en el interior celular. En funcin de que la bacteria tenga una, las dos o ninguna de las enzimas, podemos clasificarlas en: Activas: Poseen las dos enzimas. Retardadas: Carecen de la galactosidasa permeasa y poseen la Dgalactosidasa. Tardan ms tiempo en degradas la Lactosa porque tienen que producir la permeasa.

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No fermentadores: No poseen ninguna de las enzimas. Tcnica: Es necesario partir de un cultivo puro, reciente, preferiblemente obtenido a partir de un medio de cultivo de Kligler. Tomaremos una cantidad espesa de inculo para demostrar rpidamente la presencia de la enzima. A partir del cultivo preparamos una suspensin del microorganismo en un tubo de hemlisis con 0,5 mL de agua destilada. Ponemos un disco de ONPG en el tubo y lo incubamos a 37C. Resultados: Si la prueba es POSITIVA: en los 1530 minutos posteriores a la adicin del disco, el medio se habr vuelto amarillo. Si la prueba es NEGATIVA: habr que esperar entre 2,3 o incluso 24 horas para una buena confirmacin. El medio no cambiar de color. PRUEBA DE LAS DESCARBOXILASAS Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad que tiene un microorganismo, mediante la enzima correspondiente, para decarboxilar un aminocido (Lisina, Arginina, Ornitina). Son enzimas inducidas y, generalmente, estas reacciones se producen en condiciones anaerobias. Son capaces de actuar sobre distintos aminocidos, la enzima ataca al grupo carboxilo (COOH) y da lugar a una amina y a CO2. Nosotros slo realizaremos la prueba de la Lisina Carboxilasa. Si esta enzima se encuentra presente se formar Cadaverina y CO2 (alcaliniza). Dependiendo del medio de cultivo que se utilice, una vez inoculado, es necesario sellarlo para obtener las condiciones anaerobias. En este caso del caldo de Lisina no es necesario sellarlo, basta un tapn metlico, preferiblemente de rosca. Tcnica: Inoculamos el medio de cultivo (caldo) con un inculo escaso y lo incubamos durante 24 horas a 37C. En algunos casos es necesario incubar hasta 4 das. Resultados: El medio sin inocular es de color prpura y suele contener glucosa y el aminocido que queremos estudiar. Si la prueba es POSITIVA: el medio tomar un color prpura amarillento o prpura turbio. Primero habr pasado por el color amarillo y luego habr revirado al prpura. Si la prueba es NEGATIVA: el medio tomara un color amarillo brillante. Solo se consume la glucosa. Precauciones: Es conveniente guardar un tubo sin inocular con el fin de comprobar los resultados. Prueba de la Ureasa Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad orgnica de algunas bacterias de desdoblar la urea en dos molculas de amonaco, mediante la accin de la enzima Ureasa, que es una enzima constitutiva. Tcnica: Se pueden utilizar distintos medios de cultivo: Agar base de urea: tiene el inconveniente que hay que prepararlo, esterilizarlo y, antes de que se 16

enfre, hay que aadirle la urea. Se usa de forma inclinada. Caldo de urea: ya lleva incorporada la urea. Directamente se siembra el microorganismo y se incuba. Resultados: Se observa a las 24 o incluso a las 48 horas. Si la prueba es POSITIVA: el medio se observar de un color rosado Si la prueba es NEGATIVA: no se producir ningn cambio de color. Se mantendr el color amarilloanaranjado del medio inicial. Prueba de la Fenilalanina Desaminasa Principio: La prueba pone de manifiesto la capacidad enzimtica de un microorganismo para desaminar la fenilalanina, originndose el cido fenilpirvico. Tcnica: Se utiliza el medio fenilalanina en tubo inclinado. Se siembra un inculo denso, reciente, puro y se incuba durante 24 horas. Resultados: Para poner de manifiesto el producto coloreado se aade Cloruro Frrico al 10% : c. Fenilpirvico + Cloruro Frrico COLOR Dejamos resbalar por la superficie del agar inclinado 56 gotas del reactivo y se mueve el tubo suavemente para extenderlo. 1. Si la prueba es POSITIVA: aparece un color verde sobre la superficie. 2. Si la prueba es NEGATIVA: se queda del color del Cloruro Frrico, es decir, amarillo. CARACTERISTICAS DE BACTERIAS PATOGENAS A continuacin se precisan algunas caractersticas clnicas y de cultivo de las bacterias reconocidas como entero patgenas y se discuten las de alguna cuya etiologa es dudosa. Salmonella : Las ltimas tendencias en taxonoma aceptan el establecimiento de una sola especie de Salmonella. Le Minor, en la ltima edicin de EI Manual de Bergey (1984), propone como nica especie a Salmonella Choleraesuis subdividida en seis subespecies. En el XIV Congreso Internacional de Microbiologa celebrado en Manchester (1986), el Comit Internacional de Sistemtica Bacteriana a travs del Subcomit Internacional de Enterobacteriaceae , ha decidido modificar el nombre de Salmonella Choleraesuis , propuesto por Le Minor, por el de Salmonella enterica , quedando los grmenes conocidos tradicionalmente como S. Enteritidis , S. typhimurium, S. dublin, etc., en la categora de serotipo, biotipo o bioserotipo dentro de su correspondiente subespecie (datos facilitados por el doctor Usera. Majadahonda). De forma general se podra decir que la Salmonella produce dos cuadros clnicos muy diferenciados, y que en ambos casos puede hacerse el diagnstico a partir del coprocultivo.

Estos dos cuadros son la fiebre tifoidea y la salmonelosis gastrointestinal. El primero est producido por Salmonella Typhi y con menos frecuencia por Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B. El segundo est causado por otros serotipos como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Cholerae 17

suis, etc. En contra de esta clara diferenciacin, aceptada por todos, hay autores que sealan que pierde valor cuando se trata de nios, y que en ellos cualquier Salmonella puede producir los dos sndromes. El diagnstico de la fiebre tifoidea puede hacerse por mtodos directos y por mtodos indirectos. Los primeros son aquellos que permiten aislar el microorganismo, como son: el hemocultivo y el coprocultivo. A veces, aunque es raro, se puede aislar tambin el germen de la orina. Los mtodos indirectos son aquellos que ponen de manifiesto la accin del germen sobre el organismo, es decir, demuestran la presencia de anticuerpos especficos contra el agente etiolgico. En este punto se podra cuestionar qu mtodos son mejores? cules ayudan ms a hacer el diagnstico? La respuesta sera que todo depende del momento en que se halle la infeccin, del tiempo transcurrido desde el comienzo de la enfermedad. El hemocultivo presenta un mximo de positividad durante la primera semana. El coprocultivo permite aislar con un 3050 por 100 de posibilidad Salmonella durante todo el transcurso de la enfermedad, siempre y cuando el paciente no est bajo tratamiento, aunque el mximo de positividad se obtiene durante la segunda semana de evolucin. Las tcnicas indirectas, es decir, las serolgicas, y, concretando ms, las de aglutinacin, tienen un mximo de efectividad a partir de las dostres semanas de evolucin. Para aislar Salmonella, las siembras de las heces se efectuarn sobre medios de enriquecimiento (Selenito de Leifson, tetrationato de Kauffman, GN de Hajna, etctera), y al mismo tiempo sobre medios selectivos (SS, Wilson Blair, desoxicolato citrato, Hektoen, etc.), resembrando a las docediecisis horas de incubacin un asa de las primeras en una placa de estos ltimos. Con las colonias sospechosas se realizarn pruebas de identificacin. En el otro sndrome clnico, es decir, la infeccin gastrointestinal, el coprocultivo es a menudo el nico mtodo que permite demostrar la etiologa. El hemocultivo es slo efectivo en algunas ocasiones. Shigella : Existen cuatro grupos de Shigella, representados respectivamente por Sh. dysenteriae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, y Sh. boydii. Hoy en da se est intentando una tipificacin por colicinotipia, es decir, por la susceptibilidad a las colicinas. La Shigella es un germen muy lbil y que resiste muy poco tiempo en las heces del organismo humano, a esto se debe la necesidad de sembrar lo antes posible las muestras sospechosas de contener Shigella. Incluso hay autores que recomiendan hacerlo en la misma habitacin del paciente. El medio de cultivo ms utilizado es el selectivo llamado SS, o SalmonellaShigella, que se siembra con n inculo abundante. La Shigella es productora de la disentera bacteriana, y de muchas colitis en verano. A pesar de ser la responsable de las citadas enfermedades, en la actualidad la tendencia es no tratar las infecciones debidas a este microorganismo. En Espaa no es frecuente la Sh. dysenteriae, siendo la ms comn Sh. sonnei. Muchos autores estn de acuerdo en considerar que la Shigella causante de gastroenteritis bacteriana es eliminada por el efecto de arrastre de la diarrea, y por otro lado, su condicin lbil les hace sensibles al resto de la flora bacteriana intestinal. Estos motivos justifican segn los citados autores, la no utilizacin de antibiticos, que actuaran sobre la mayora de grmenes intestinales, eliminando la competencia, favoreciendo la aparicin de resistencias y alargando el perodo de convalecencia. Esto transformara al paciente en portador crnico. Precisamente fue en una Shigella, donde Watanabe, un investigador japons, descubri el fenmeno de la 18

conjugacin bacteriana, al comprobar la transmisin de trozos de DNA llamados plsmidos, de una bacteria a otra, a travs de un canal protoplasmtico que les conecta. Si en este trozo de cromosoma est codificada la resistencia a un antibitico, o a un determinado grupo de antibiticos, la bacteria receptora se volver, al igual que la donadora, insensible a los citados frmacos. De todas maneras, la cuestin de no establecer tratamiento es difcil para aquellos clnicos que estn en contacto con los pacientes, sobre todo si stos son nios. Segn la misma idea antes aportada, tampoco sera correcto dar antidiarreicos, porque ello evita la expulsin de los grmenes patgenos, los cuales, al quedar retenidos al abrigo intestinal aumentarn cuantitativamente, incrementando su agresividad sobre el tracto intestinal. En este punto es tambin necesario evaluar la necesidad de anteponer al citado efecto infeccioso, el hecho de evitar una deshidratacin en el nio pequeo. Vibrio : Hay varias especies del gnero Vibrio que son responsables de distorsiones intestinales. La ms importante, Vibrio cholerae, produce su efecto gracias a una toxina muy semejante a la del E. coli entero patgeno. En los casos tpicos, las heces presentan un aspecto conocido como agua de arroz, debido a su color blanco y consistencia lquida, con grumos que contienen gran cantidad de pequeos bacilos Gram. negativos ligeramente curvados. El aislamiento de las heces se hace utilizando medios selectivos, como el agua de peptona alcalina (pH 8,4), o el de Nakanishi modificado o TCBS, a base de tiosulfato, citrato, bilis y sacarosa. Otros vibrios semejantes al Vibrio cholerae, como su biotipo El Tor, y los vibrios NAG o no aglutinables, fabrican de igual forma la citada entero toxina, poseyendo estos ltimos tambin un cierto efecto invasor del tejido intestinal. Si los vibrios NAG se encuentran principalmente en aguas dulces, el Vibrio parahaemolyticus vive en el agua del mar, dndose cada vez con mayor frecuencia cuadros de gastroenteritis transmitidos a partir de los llamados frutos del mar (mariscos y pescados poco cocidos). Yersinia : Es otro miembro de la familia Enterobacteriaceae que suele producir trastornos intestinales. De sus tres especies, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudo tuberculosis y Yersinia pestis, slo las dos primeras estn implicadas en los citados procesos, especialmente la inicial. La Yersinia pseudo tuberculosis se incluye, pues ha sido asociada ltimamente en Rusia con cuadros entricos, cuadros que ellos califican como fiebre escarlatinosa del Lejano Oriente. La Yersinia enterocolitica produce gastroenteritis aguda, caracterizada por fiebre, cefaleas, dolores abdominales agudos y diarrea lquida. Tambin se ha implicado con otras afecciones abdominales con dolor, que se localiza en la fosa iliaca derecha, y que hace pensar en una apendicitis. Se trata de la linfoadenitis mesentrica aguda benigna, que no acostumbra a evolucionar con diarrea, y la nica forma de hacer el diagnstico es a partir de los ganglios. La Yersinia enterocolitica crece bien en medios ordinarios como el agar SS o el agar desoxicolato. Aunque las colonias aparecen a las cuarenta y ochosetenta y dos horas, su pequeez y poca proporcin en ocasiones les hace pasar desapercibidas. Para facilitar su aislamiento se utilizan medios selectivo como el Drigalski Norwegian medium, el Oxalate Y mdium, o el Wauters, y como enriquecimiento se usa el enfriamiento a 4 C durante tres semanas en Selenito o BHI. Lgicamente, los diagnsticos hechos con estos procesos de enriquecimiento no son vlidos para implantar un tratamiento clnico, pero s para estudios epidemiolgicos. Hasta ahora no se han comercializado sueros antiYersinia que permitan confirmar la identificacin bioqumica. Los laboratorios que quieran efectuar esta comprobacin, pueden mandar las cepas a laboratorios de referencia. Indirectamente puede hacerse el diagnstico enfrentando suero del paciente con una mezcla polivalente, o, 19

cuando menos, que contenga los serotipos 3 y 9. Ttulos iguales o superiores a 1/160 son significativos. Escherichia coli : Gracias a los trabajos empezados por Kauffmann, y sobre la base de 157 antgenos somticos (0), 93 capsulares (K) y 52 flagelares (H) de los que hay tres variedades (L, A y B), es posible identificar serolgicamente a E. coli. Esta determinacin serolgica, en la prctica diaria de los laboratorios de microbiologa, slo se realiza para la investigacin de una serie de Escherichia coli denominados entero patgenos, y cuya patologa parece reducirse a gastroenteritis infantiles en nios menores de dos aos y medio. Ahora bien, en la actualidad se duda de su verdadera intervencin, pues es posible aislarlos de muchas heces infantiles que no tienen sntomas de gastroenteritis. Nuestra opinin es que slo es valorable en caso de epidemias en las que se asle un solo serotipo. En casos aislados slo podremos imputarle con seguridad la etiologa del proceso si comprobamos su capacidad entero patognica. E. coli entero patgeno puede efectuar de dos maneras su accin intestinal, una produciendo entero toxinas, de las cuales se conocen dos (ST o estable al calor y LT o lbil al calor, que es parecida antignicamente a la entero toxina de V. cholerae ) y otra por la invasin de las clulas epiteliales del intestino, produciendo un cuadro disenteriforme, denominndose respectivamente E. coli enterotoxignico y E. coli enteroinvasivo. La capacidad entero txica por produccin de LT se investiga inoculando extracto bruto del cultivo sobre clulas Vero y observando cambios celulares debidos a alteraciones del contenido en AMP cclico. La capacidad entero txica por ST se demuestra inoculando extracto bruto de su cultivo en ratones lactantes de uno a tres das. La propiedad enteroinvasiva se pone de manifiesto por el test de Anton, inoculando 10 e8 clulas bacterianas en el saco conjuntival de cobayas, y observando, en caso positivo a las veinticuatrocuarenta y ocho horas, la produccin de una inflamacin corneoconjuntival. Como se comprender, estas tcnicas generalmente no estn al alcance de laboratorios pluridisciplinarios, por lo que es aconsejable mandar la cepa a laboratorios especializados para que hagan su estudio, hecho que, por otro lado, no solucionar el problema, ya que cuando se consiga el resultado, el paciente probablemente estar ya curado. Por otro lado es difcil establecer una relacin entre enteropatogenicidad y serotipo de E. Coli, ya que los factores entero patognicos conocidos hasta ahora: capacidad de producir entero toxinas (ST y LT) e invadir la mucosa intestinal, dependen de plsmidos independientes del material gentico que codifica su estructura antignica. En consecuencia, sera necesario estudiar, por un lado, la capacidad entero patognica, por otro lado, el serotipo y, finalmente, la presencia del plsmido ent. Anaerobios esporulados : Los anaerobios esporulados no suelen producir infecciones gastrointestinales, y en la literatura slo se cita con escasa frecuencia la presencia de Clostridium perfringens causante de intoxicaciones alimentarias. Tambin se han mencionado casos de colitis pseudo membranosa debidos a Clostridium difficile. Otros microorganismos que con menor frecuencia se consideran responsables de gastroenteritis son los siguientes: Cndida : sobre todo Cndida albicans, que es aislada mayoritariamente de heces patolgicas de nios pequeos. En ocasiones es posible su hallazgo en el contenido fecal de adultos con trastornos intestinales recin llegados de patses del Medio y Lejano Oriente (Egipto, India, etctera). Pseudomonas : Frecuente en personas tratadas largo tiempo con antibiticos de amplio espectro.

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Staphylococcus aureus : Su presencia es favorecida tambin por terapia con antibiticos de amplio espectro. Adems de este efecto por sobrecrecimiento, son muy frecuentes las intoxicaciones alimentarias por la entero toxina, producida por el microorganismo. Campylobacter : Desde hace algn tiempo se reconoce a Campylobacter jejuni como el patgeno intestinal con mayor morbilidad. Generalmente afecta a nios pequeos, a los que produce diarrea, dolores abdominales, fiebre, nuseas y a veces vmitos. La fuente de infeccin suele ser el agua, o, ms frecuentemente, los alimentos de origen animal. Tambin se encuentra en abundancia en las heces de animales domsticos. El desarrollo de su patologa no est bien definido, ya que mientras que, por un lado, produce manifestaciones enteroinvasivas (con produccin de sangre y leucocitos), por otro, hay constancia de que libera una entero toxina similar a la de Vibrio cholerae y E. coli enterotoxignico. Para el diagnstico microbiolgico, la siembra de las heces debe hacerse muy rpidamente, preferiblemente antes de dos horas. En caso de no ser posible, se incluir la muestra en un medio de transporte adecuado (el mejor es el de CaryBlair). Para el cultivo de Campylobacter se precisan unas condiciones especiales, que son: disponer de un medio selectivo, temperatura de incubacin de 4243 C y atmsfera microaeroflica (reducida de oxgeno) con C02. Hay varios medios de cultivo selectivos apropiados, la mayora de ellos comercializados, como el Skirrow, el Butzler o el Campy BAP, no siendo necesario utilizar ningn medio de enriquecimiento previo. La incubacin a 4243 C se realiza por espacio de cuarenta y ochosetenta y dos horas en una atmsfera que contiene un 5 por 100 de 02, 10 por 100 de C02 y 85 por 100 de N2. Hay casas comerciales que preparan sobres generadores de este tipo de atmsfera. Las placas pueden incluirse dentro de jarras de anaerobiosis, donde se incorporan tambin estos sobres. Con las colonias sospechosas crecidas en los medios antes mencionados, se efecta una identificacin presuntiva, observando su morfologa vacilar Gram. negativa en espiral (es mejor usar como colorante de contraste fucsina fenicada al 0,3 por 100), su movilidad caracterstica y la capacidad de dar positiva la prueba de la oxidasa. Se puede completar la determinacin con una batera de pruebas bioqumicas, de las cuales destacamos la catalasa, la reduccin de nitratos, la produccin de SH2 y la hidrlisis del hipurato. Aeromonas : Aeromonas hydrophila se asla con relativa frecuencia de heces diarreicas, habindose comprobado su capacidad entero txica y enteroinvasiva. Hay autores que tambin implican en estos procesos a Pleciomonas shigelloides. Otros entero patgenos son Edwarsiella, Streptococcus faecalis variedad liquefaciens, que produce toxiinfeccin, y Bacillus cereus, que da lugar a intoxicaciones.

ESTUDIO DELOS DIFERENTES AGENTES PATOGENOS INTESTINALES GENERO : CAMPYLOBACTER Son pequeos bacilos Gram que tienen forma de coma, forma espiral y, en ocasiones, tambin se les puede 21

observar en forma de S. Son microaeroflicos, mviles por un nico flagelo polar y no esporulados. No fermentan carbohidratos y dan positiva la prueba de la Oxidasa y la Catalasa. Campylobacter suele encontrarse en el tracto gastrointestinal de un gran nmero de animales y en el hombre producen infecciones gastrointestinales. Tambin se les asocia, aunque en menor grado a infecciones extraintestinales, sobre todo en pacientes con SIDA. ESPECIES CLNICAS Las ms importantes para el hombre, y que son agentes etiolgicos de la diarrea son: Campylobacter jejuni Campylobacter coli Campylobacter laridis El Campylobacter fetus subespecie fetus produce cuadros de septicemia en pacientes con un sistema inmunitario deficiente. Aislamiento a partir de muestras clnicas Cuando se trata de un aislamiento a partir de heces es recomendable hacer el anlisis lo ms pronto posible. Si se va a retrasar, es necesario usar un medio de transporte: Cary Blair CampyThio, en los cuales se mantiene de 1 a 2 semanas a 4C. Las condiciones bajo las cuales deben realizarse los cultivos son: Utilizar medios de cultivo selectivos para estos microorganismos. Temperatura de incubacin de 41C (porque los ms importantes son termoflicos). Condiciones reducidas de Oxgeno (microaeroflicos). Medios Selectivos Skirrow CampyBAP Butzler Generalmente no se suelen usar medios de enriquecimiento cuando la muestra procede de heces. S es til en aquellos casos en que est disminuido el nmero de bacterias por haber permanecido las heces durante un tiempo a temperatura ambiente. Tambin es importante usar un medio de enriquecimiento cuando la muestra procede de personas que estn en tratamiento o en portadores. Incubacin Se deben incubar a 42C durante unas 72 horas, en el caso de Campylobacter jejuni y C.coli. De esta forma eliminamos la flora acompaante. Para otras especies de Campylobacter: 22

Utilizar medios selectivos sin cefaloesporinas Incubacin a 37C durante 7 das en atmsfera microaeroflica. Mtodos alternativos para el aislamiento de Campylobacter en heces Filtrar las heces (eliminamos coliformes y flora contaminante), diluir y se siembra en un medio NO selectivo. Se incuba a 42C en ambiente microaeroflico. Colocar directamente el filtro sobre la superficie del agar. Echar 1 o 2 gotas de las heces sobre el filtro. Hacer una primera incubacin, retirar el filtro y volver a reincubar. Aislamiento de Campylobacter a partir de muestras de sangre Se aslan en sangre: C. fetus, C. jejuni, C. laridis y otros que generalmente pueden aislarse en sangre como agentes etiolgicos de sepsis en pacientes con el sistema inmunitario deprimido o en enfermos de SIDA. Aunque la mayora crecen bien en medios con sangre, tienen el inconveniente de que tardan hasta 2 semanas en desarrollarse en estos medios. Es preferible realizar un cultivo en medios lquidos y, a partir de estos, realizar subcultivos en medios slidos, en ambiente microaeroflico y a una temperatura de 37C. IDENTIFICACIN La identificacin cuando se sospecha la presencia del Campylobacter consiste en una TINCIN DE GRAM, en la cual se observan como bacilos Gram que pueden adoptar una forma de S, aunque cuando la tincin de Gram se realiza a partir de cultivos viejos pueden perder esta morfologa. Tambin se puede hacer un MONTAJE EN FRESCO para observar la movilidad; las pruebas de la OXIDASA y la CATALASA darn positivas y, para la diferenciacin entre especies se pueden realizar las siguientes pruebas: Crecimiento a distintas temperaturas Sensibilidad que presentan al cido nalidixico y cefalotina Produccin de SH2 en Agar Hierro de Kliger Reduccin de Nitratos Adems de estas pruebas tambin se puede realizar la SEROTIPIFICACIN mediante tcnicas de Hemaglutinacin Indirecta y Tcnicas de Aglutinacin en portaobjetos. PATOGENIA. PATOLOGA El que tiene mayor importancia desde el punto de vista clnico es el C. jejuni: Campylobacter jejuni da lugar a gastroenteritis que se manifiesta con un cuadro diarreico y, en ocasiones puede observarse la presencia de sangre en heces. Este m.o se adquiere generalmente por va oral como consecuencia de la ingesta de alimentos o bebidas contaminadas. Tambin se puede producir por contacto con animales infectados. C. jejuni es un m.o muy sensible al pH cido del estmago por lo que debe ingerirse un elevado nmero de m.o para que se produzca la infeccin.

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Se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamacin. En ocasiones tambin puede pasar al torrente circulatorio y desarrollar un cuadro de fiebre entrica. La diarrea que produce suele acompaarse de dolor abdominal, cefalea y fiebre. Campylobacter coli y Campylobacter laridis producen una infeccin gastrointestinal similar a la producida por C. jejuni. Campylobacter fetus y C. upsaliensis producen cuadros diarreicos en individuos normales y pueden ocasionar bacteriemia en pacientes con el sistema inmunitario deprimido. HELICOBACTER PYLORI Se asla en el estmago de pacientes con lesiones gstricas y lcera gstrica. Es un bacilo Gram con forma espiral y con una gran actividad ureasa. Es un m.o mvil y el inters en l reside en que se le considera como un importante factor de lesiones gstricas. DETECCIN Se pueden realizar MTODOS DIRECTOS dado que este m.o se localiza preferentemente en los pliegues de la mucosa del estmago. Las pruebas ms idneas para el aislamiento del mismo sern las biopsias de las zonas lesionadas (IMP: Las muestras deben proceder de Biopsias, NO de aspirados gstricos). Cuanto mayor sea el nmero de biopsias que se realicen, mas posibilidades habr de conseguir el aislamiento de este m.o. Las muestras procedentes de biopsias deben enviarse directamente al laboratorio para proceder a su cultivo y, si esto no fuese posible, es necesario utilizar un medio de transporte: Solucin glucosada al 20%; Solucin Salina o Caldo Tioglicolato. En estos medios de transporte, el microorganismo se mantiene viable durante aproximadamente 5 horas si la temperatura de conservacin es de 4C. De las biopsias, una parte se utiliza para la realizacin de un frotis (TINCIN DE GRAM GIEMSA). En la tincin de Gram se observan bacilos Gram con forma de espiral o una forma caracterstica denominada forma de U o de Arns de bueyes. El resto de la muestra de la biopsia se trocea o machaca en un mortero estril y posteriormente se siembra. Adems de las tinciones tambin se pueden realizar PRUEBAS BIOQUMICAS como la prueba de Reduccin de Nitratos y la prueba de la Ureasa: Prueba Rpida: se realiza a partir de la muestra de la biopsia que se inocula en un medio para la determinacin de urea, como por ejemplo, Caldo de Urea o Cristensen. Evidencia, cuando es positiva, que puede tratarse de H. Pylori. Prueba de la Urea Respiratoria: el paciente ingiere una urea marcada y tras un perodo determinado de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado. Adems de estos mtodos tambin se utilizan los MTODOS SEROLGICOS que utilizan tcnicas de ELISA con las que pueden ponerse de manifiesto la presencia de IgG e IgA. MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de Campylobacter procedente de estas biopsias son: Agar MuellerHinton con 5% de sangre de carnero 24

Agar Brucella con 1% de almidn soluble Agar sangrechocolateSkirrowThayer Martn, siempre que estn suplementados o bien con suero o bien con almidn. Adems de estos medios se pueden usar medios SELECTIVOS que incorporan antibiticos con el fin de inhibir la flora acompaante: Medio selectivo para Helicobacter pylori Medio Belo Horizonte La temperatura ptima de crecimiento es de 37C, en ambiente microaeroflico, y la incubacin debe mantenerse al menos durante 7 das cuando se trata de aislamiento primario. FACTORES DE PATOGENICIDAD Produccin de Ureasa Crea un ambiente alcalino (CO2 y NH3) que le protege de la acidez gstrica. Proteasas Modifica el pH gstrico de la mucosa. Hemaglutininas Se adhieren a las clulas epiteliales. Citotoxinas (no tienen un papel determinado). PATOLOGA Gastritis aguda lceras ppticas: H. Pylori se ha aislado en el 100% de los enfermos que padecen lcera duodenal y en un 80% de los enfermos que padecen una lcera gstrica. PSEUDOMONAS Las especies de este gnero son bacilos Gram, aerobios estrictos, Oxidasa+ y mviles por un flagelo polar. No fermentan ningn tipo de carbohidrato pero pueden utilizar los azcares por metabolismo oxidativo. Pseudomona aeruginosa Es un m.o que crece bien en la mayor parte de los medio habituales de laboratorio, entre ellos MacConkey y Levine. No fermenta ningn carbohidrato y es capaz de crecer a temperaturas de 42C. En Agar Sangre da lugar a colonias de morfologa variable, en ocasiones hemolticas y con un olor caracterstico a fruta. Elabora pigmentos hidrosolubles que colorean el agar como la piocianina de color azul, pioverdina de color verde y piorrubina de color rojo. Es la nica especie que produce piocianina, caracterstica que se puede utilizar para su identificacin. La produccin de pigmentos se puede potenciar recurriendo a medios especiales como, por ejemplo, el King A y el King B. Adems existen medios selectivos para el aislamiento de P.aeruginosa a partir de muestras contaminadas como heces y esputo como son el Agar Cetrimida y el Agar Irgarsen. IDENTIFICACIN DE LA P.AERUGINOSA Las caractersticas que ayudan a la identificacin de P.aeruginosa son:

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Crecimiento en la mayor parte de los medios de cultivo En Agar Sangre dan colonias azulverdosas con olor afrutado Catalasa y Oxidasa+ Reduccin de Nitratos Crecimiento a 42C En Agar de Kligler produce un crecimiento en superficie sin viraje del medio Oxidacin de Glucosa en un medio de OxidacinFermentacin. Hidrlisis de Arginina No decarboxilan ni Lisina ni Ornitina Tolerancia a la Cetrimida PATOGENICIDAD Y PATOLOGA DE LA P.AERUGINOSA La P.aeruginosa posee un gran nmero de factores de virulencia que se encuentran implicados en los mecanismos de patogenicidad del m.o, entre ellos fimbrias, que permiten su adherencia a clulas epiteliales; cpsula polisacrida, que le protege de la fagocitosis; enzimas extracelulares, como proteasas, hemolisinas y coagulasas; y endo y exotoxinas. Posee adems, la capacidad de sobrevivir en medios con bajo contenido en nutrientes, especialmente en ambientes hmedos, de forma que se ha llegado a aislar en agua destilada y soluciones desinfectantes. P.aeruginosa se haya implicada en un gran nmero de procesos infecciosos aunque siempre como patgeno oportunista y en pacientes con algn tipo de alteracin en su inmunidad. Es causante de infecciones nosocomiales. Puede producir tambin infecciones oculares asociadas al uso de lentes de contacto, otitis media en nadadores y, en ocasiones, puede producir septicemias. Pseudomona mallei y Pseudomona pseudomallei Son las nicas especies del grupo consideradas como verdaderos patgenos. P.mallei es el agente etiolgico del Muermo, enfermedad que se transmite al hombre a travs del ganado equino. A deferencia del resto de las especies del gnero, no habita ni en el agua ni en el suelo, sino que se encuentra perfectamente adaptada al hombre y animales a quien parasita. P.pseudomallei es de vida libre y se encuentra en el agua y en el suelo. Es el agente etiolgico de la Meliovidosis, una infeccin rara en nuestro medio y que se manifiesta de diversas formas, como infeccin pulmonar, abscesos, septicemia, etc. En el laboratorio crece en agar sangre dando colonias umbilicadas, de crecimiento lento y con una zona de hemlisis alrededor. Puede crecer en Agar MacConkey y a temperaturas de 42C. Otras Pseudomonas P.cepaia: produce fibrosis qustica 26

P.fluorescens, P.ptida, P.putrefaciens y P.alcaligenes: se suelen aislar como agentes infecciosos en pacientes cuyas defensas se encuentran comprometidas. GENERO : ACINETOBACTER Este gnero engloba m.o que se encuentran habitualmente en el suelo y en el agua. Se puede hallar presentes en ambientes hospitalarios, donde producen infecciones en pacientes con las defensas disminuidas. Dos especies son las que se aslan con ms frecuencia: A.calcoaceticussubespecie anitratus A.calcoaceticussubespecie Iwoffi Estos m.o se han aislado en pacientes con neumona, infeccin urinaria y sepsis. En el laboratorio crecen en Agar MacConkey y en Agar Sangre donde dan colonias grises rodeadas de una zona de hemlisis. Se diferencian de las Pseudomonas porque dan negativa la prueba de la Oxidasa, son Catalasa+ y no reducen los Nitratos. Al microscopio se observan como bacilos Gram que, en ocasiones, pueden confundirse con las Neisserias. ENERO :BRUCELLA Son CocoBacilos, Gram, inmviles, no esporulados y aerobios estrictos. Algunas especies de Brucellas pueden presentar cpsula. Al microscopio se observan agrupados en parejas o formando cadenas cortas. La temperatura ptima de crecimiento es de 3537C. Son Catalasa+. La mayor parte de las Brucellas dan positiva la prueba de la Oxidasa y reducen los Nitratos a Nitritos. Las especies de Brucellas son parsitos obligados de animales y, algunos de ellos, producen infeccin en el hombre. DIAGNSTICO A PARTIR DE MUESTRAS CLNICAS 1 Examen Directo: El examen de la muestra, previa tincin de Gram, ofrece pocos resultados, debido al escaso numero de m.o que puede contener. La tcnica del Ac fluorescente directo, que emplea Ac antiBrucella marcados con fluorescena, proporciona mejores resultados que la tincin de Gram. Las tinciones ofrecen un diagnstico de presuncin que no es definitivo por lo que siempre hay que realizar el cultivo de las muestras. 2 Aislamiento de la Brucella. Medios de cultivo: realizamos el aislamiento cuando no se puede realizar la identificacin directamente de la muestra clnica. Las Brucellas son m.o intracelulares, por lo que necesitan requerimientos nutricionales complejos. El cultivo se realizar, por lo tanto, en medios enriquecidos, aunque hay Brucellas que se pueden desarrollar en medios generales como Agar Sangre y Agar Chocolate: 27

Medios de cultivo Lquidos: Caldo Brucella. Medios de cultivo Slidos: Agar Brucella complementado con suero o glicerina. Medios de cultivo Selectivos: Medio de Farell; Medio modificado de ThayerMartin. A todos los enfermos sospechosos de infeccin por Brucellas se les debe realizar un hemocultivo. 3 Identificacin de Brucellas Basada en la Morfologa de las colonias: Lisas y transparentes: estn relacionadas con la presencia de cepas virulentas. Presenta tanto la parte lipdica A como la parte polisacrida O. Rugosas: estn relacionadas con cepas avirulentas. Slo poseen la parte lipdica A, y si poseen la parte polisacrida, sta es defectuosa, por lo que no se consideran virulentas otra forma de diferenciar las formas virulentas de las avirulentas es sembrar en un medio Agar Glucosa Glicerol. Una vez incubada la placa inundamos la superficie de la placa con una solucin de cristal violeta y observamos con una luz oblicua. Las colonias lisas se observarn de un azul verdoso, mientras que las colonias rugosas se observarn de un azul rojizo o violeta rojizo. Tincin de Gram: Las Brucellas aparecen como cocobacilos Gram que se tien dbilmente con el colorante de contraste, por lo que es necesario mantener la accin del colorante de contraste (Safranina) por lo menos durante 3 minutos. Es conveniente, antes de hacer la tincin de Gram, que si se sospecha la presencia de Brucellas, hagamos una suspensin de una colonia en una solucin salina fenicada al 1%, para evitar riesgos. Pruebas Bioqumicas: Son Catalasa+, la mayora dan positiva la prueba de la Oxidasa, son Ureasa+, reducen los Nitratos a Nitritos y no fermentan la Glucosa ni la Lactosa. DIAGNSTICO SEROLGICO: (diagnstico indirecto) Prueba de la Rosa de Bengala Aglutinacin en tubo Prueba de antiglobulina para Brucella (Coombs indirecto) La Prueba de la Rosa de Bengala y la aglutinacin en tubo se realizan de la misma forma. Son pruebas de aglutinacin que se realizan con una suspensin de Brucellas a pH = 3,6. Para la prueba se preparan una serie de diluciones: Dilucin 1/2 :100L de suero problema + 100L solucin salina Dilucin 1/4 : 100L dilucin anterior + 100L solucin salina Dilucin 1/8: 100L dilucin anterior + 100L solucin salina

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.etc. Una vez hechas las diluciones, colocamos 50L de las mismas en un porta y le aadimos 1 gota de la suspensin de Brucellas. Primero se detecta la presencia de la Brucella y despus se realiza la cuantificacin de la misma. Para que la prueba se positivice, el paciente debe tener una concentracin de Ac en suero de 25 UI/mL o superior. Para conocer este dato calculamos el ttulo: TTULO = 25 UI/mL x Inversa de la Dilucin Las pruebas se deben repetir a los 15 das despus de la seroconversin: Siempre que aumenta el ttulo de Ac de una fase a otra significa que se encuentra en una fase aguda. Si el ttulo se mantiene, pueden darse dos situaciones: Que se trate de Ac residuales Que se trate de una infeccin crnica La Prueba de la antiglobulina para Brucella Coombs indirecto sirve para detectar Ac bloqueantes (IgA, que se encuentran en las mucosas) Enfrentamos el suero de paciente con la solucin de brucellas e incubamos. El Ac bloqueante se une al Ag, pero no produce la aglutinacin. Para saber si realmente existe el Ac bloqueante o simplemente es que no existe, aadimos la antiglobulina humana o suero de Coombs. Si se produce la aglutinacin significar que en el suero del paciente exista el Ac bloqueante, ya que la antiglobulina humana se ha unido a este Ac y ha aglutinado. Si no se produce la aglutinacin significa que no exista Ac en el suero del paciente. EPIDEMIOLOGA DE LAS BRUCELLAS Las principales especies de Brucella con importancia patolgica son: B. melitensis: produce la mayor parte de los casos de Brucelosis que se producen en Espaa. B. abortus: producen una infeccin ms leve que la melitensis. A veces cursa de forma asintomtica y es la causante de muchos de los abortos espontneos que se dan en los animales. B. suis: suele afectar al ganado porcino pero tiene menos importancia desde el punto de vista clnico. La Brucelosis es una antropozoonosis, es decir, que afecta a los animales de forma primaria y pueden transmitirse al hombre. La infeccin puede producirse tanto por: Contagio Directo: se puede producir como consecuencia de un contacto con animales infectados o bien por inhalacin de aerosoles, o por contacto de productos infectados con las mucosas. Contagio Indirecto: se produce como consecuencia de ingestin de leche y sus derivados que no han sido pasteurizado.

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Es importante destacar el peligro que supone para el personal sanitario la manipulacin de muestras sospechosas de Brucelosis ya que es fcil que pueda producirse el contagio por contacto con piel y mucosas, por inhalacin de aerosoles y por accidentes como consecuencia de la manipulacin de agujas contaminadas en la realizacin de los hemocultivos. PATOGENIA Generalmente, las Brucellas tienen un perodo de incubacin que puede oscilar entre 16 semanas. Durante este perodo, las Brucellas se multiplican en el interior de las clulas del retculo endotelial y, de esta forma, elude la respuesta inmune del husped. Pueden pasar a la sangre y diseminarse en los tejidos. Es frecuente que la infeccin se localice en algn rgano, generalmente hgado y mdula sea. ENTEROBACTERIAS. Son bacilos Gram; Catalasa+; Oxidasa; anaerobios facultativos... Fermentan la glucosa con produccin de cido, con sin gas. La mayor parte reduce los nitratos a nitritos, pueden ser mviles o inmviles. Cuando son mviles, la mayora presenta flagelos pertricos. Estn ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan tanto a plantas como animales y suelo, y en el hombre se encuentran como flora comensal en el intestino. Son responsables de un gran nmero de infecciones, siendo particularmente frecuente su aislamiento a partir de determinadas muestras clnicas. Son responsables del 50% de los casos de septicemia; de 6070% de los casos de enteritis bacteriana aguda y ms del 70% de los casos de infecciones del tracto urinario. ESTRUCTURA ANTIGNICA Ag somtico O: se encuentra en la pared celular y tiene naturaleza polisacrida. Ag capsular K: polisacrido o protena. Ag flagelar H: naturaleza proteica. Endotoxinas. Exotoxinas. Colicitinas: Son bacteriocinas,. Son toxinas contra otras cepas de la misma o distinta especie. AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN Todas aquellas muestras clnicas en las que se sospecha la presencia de Enterobacterias, generalmente procedentes de heridas, lquidos y exudados orgnicos, orina y hemocultivos, deben sembrarse en un medio general (Agar sangre o chocolate) en un medio selectivo. Si la muestra procede de heces o hisopos rectales, se utilizarn medios selectivos diferenciales caldos de enriquecimiento.

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MEDIOS DE CULTIVO En funcin del origen de la muestra, podemos utilizar distintos medios de cultivo. Los que se utilizan ms frecuentemente son: Medios de cultivo poco selectivos: Agar Mc Conkey Agar EMB Levine Caldo de crecimiento: SelenitoSalmonella TetrationatoSalmonellaShigella (Toxoinfecciones alimentarias) Medios de cultivo de Selectividad mediaalta: Agar enterico Hecktren Agar salmonellaShigella Agar verde brillante (para todo tipo de Salmonellas, excepto la S. typhi) Agar bismuto sulfito (selectivo para S. typhi) PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIN DE ENTEROBACTERIACEAS Pruebas Bioqumicas. Sistemas comerciales de identificacin. Identificacin serolgica: permite la identificacin a nivel de gnero y especie. Diagnstico inmunolgico. PRUEBAS BIOQUMICAS AGAR HIERRO DE KLIGLER Es una prueba diferencial y adems se trata de una multiprueba. Se compone de dos hidratos de carbono (Lactosa en un 1% y Glucosa en un 0,1%). La Glucosa se encuentra en menor cantidad para que se consuma antes de las 24 horas de incubacin y necesariamente las bacterias tengan que consumir las peptonas, con lo que se produce amonaco y se alcaliniza el medio. 1. hay 3 formas bsicas de fermentacin en este medio de cultivo: Que solamente se fermente la Glucosa: por principio, todas las enterobacterias fermentan la glucosa. Cuando la glucosa se acaba y la bacteria no es capaz de utilizar la lactosa, se alimentar de las peptonas del medio.

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Mtodo: la siembra se hace en profundidad (condiciones anaerobias) y en superficie (condiciones aerobias). La muestra debe proceder de un medio de cultivo puro, se tomar una colonia con un hilo de siembra y se har la inoculacin del medio de cultivo primero en profundidad, y segundo, segn sacamos el asa, en superficie. La lectura se realizar tras un tiempo de incubacin de 24 horas (que se ha de cumplir a rajatabla) a 3537C. Resultados: Si se fermenta la Glucosa, se producen unos compuestos que acidifican el medio y, por lo tanto, el medio virar a amarillo. Si adems de la Glucosa utiliza las peptonas, que producen amoniaco, el medio se alcaliniza y en lugar de virar a amarillo virar a rojo intenso. Esto ltimo solo ocurre en la siembra que se ha hecho en la superficie, es decir, que veremos la superficie roja y el fondo amarillo. Esto es as porque los productos metablicos son diferentes si la transformacin es aerbica o anaerbica. Que fermente tanto la Glucosa como la Lactosa: Se observar el medio totalmente amarillo, debido al pH cido. Que no fermente ninguna: se alimenta desde el principio de las peptonas, por lo tanto podremos afirmar que no se trata de una Enterobacteria. Se originarn una serie de productos alcalinos que virarn el medio a rojo tanto en el fondo como en la superficie, siempre y cuando la bacteria sea capaz de consumir las peptonas tanto en medio aerobio como anaerobio. Si la bacteria solo fuera capaz de utilizar las peptonas de forma aerobia, la superficie aparecera roja, mientras que el fondo permanecera sin cambios. 2 Observacin de la produccin de gas (CO2 y H2): Si en el medio se forma alguno de estos gases, se observarn algunos cambios en el medio de cultivo: Aparicin de burbujas. Fracturas en el agar. 1. Desplazamiento del medio de cultivo hacia la boca del mismo debido a una produccin intensa de gas. Observacin de la produccin de Sulfhdrico (SH2). Para que se produzca el SH2 Las condiciones han de ser cidas Se necesita una fuente que suministre el azufre (Tiosulfato de Sodio) Se necesita un indicador que nos permita visualizarlo (Sal de hierro Citrato Frrico Amoniacal). Este indicador hace que el SH2 precipite en forma de un precipitado negro. Si la cantidad precipitada es pequea, el precipitado se observar en la superficie del medio de cultivo. Si, por el contrario, la produccin de SH2 es muy intensa, toda la parte profunda del tubo se ver negra. Ahora bien, si todo el fondo se ve negro cmo sabremos el viraje del medio?. Pues bien, como para que se pueda producir el Sulfhdrico es necesario que se den unas condiciones cidas, deberemos suponer que el medio de cultivo habr virado a amarillo en el fondo. En la superficie si podremos diferencias entre el rojo y el amarillo sin ningn problema. PRUEBA DE LA CATALASA Definicin: Es una enzima que se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas (a excepcin del Estreptococcus, por eso es una prueba que nos permite diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos). Funcin: Descompone el perxido de hidrgeno (H2O2 o agua oxigenada) que se forma como producto terminal oxidativo de la descomposicin aerbica de los azcares:

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2 H2O2 2 H2O + O2 (gas) Catalasa Tcnica: Consiste en recoger con el asa de siembra una colonia procedente de un cultivo puro, reciente y colocarla sobre un portaobjetos. A continuacin agregamos 1 gota de perxido de hidrgeno al 30%(comercial) sobre el microorganismo con una pipeta Pasteur (no es necesario homogeneizar). Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: se formarn inmediatamente burbujas bien visibles. 2 Si la prueba es NEGATIVA: no se observar burbujeo. Precauciones: es importante que la muestra no tenga su origen en un medio que contenga sangre, ya que podramos obtener falsos positivos. PRUEBA DE LA OXIDASA O CITOCROMOOXIDASA Principio: se basa en determinar la presencia de las enzimas oxidasas, las cuales catalizan la transferencia de electrones desde el sustrato, que es generalmente orgnico, hasta el oxgeno. Tcnica: Se realizar segn las instrucciones de la casa que nos proporcione el producto. Generalmente, en las oxidasas positivas, se produce una reaccin entre la enzima y un sustrato que est en la tira reactiva dando lugar a un producto coloreado que suele ser el azul de indofenol. El reactivo puede variar de una casa comercial a otra, as una prueba oxidasa+ se observar de un color que oscila entre el prpura y el negro. Precauciones: No tomar la muestra de medios coloreados. PRUEBA DEL INDOL Principio: se basa en determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el indol de la molcula de triptfano, que es un aminocido, que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar metabolitos indlicos. A este grupo de enzimas, capaces de desdoblar el triptfano se les denomina triptofanasas. Tcnica: Se utiliza un caldo de triptona o de peptona (a veces tambin se utiliza un medio semislido: medio de S.I.M = Sulfhdrico; Indol; Movilidad). Se disponen 5 mL del medio en cada uno de los tubos que vayamos a utilizar para la prueba, esterilizamos, inoculamos e incubamos (3537C / 24h). Por ltimo, para saber si se ha producido el Indol aadimos 5 gotas del reactivo de Kovacs indol. Resultados: 1 Si la prueba es POSITIVA: aparece un anillo rojo en la superficie del medio. 2 Si la prueba es NEGATIVA: permanece un color amarillo, que es el color del reactivo (el reactivo es un aldehdo) PRUEBA DEL CITRATO Principio: consiste en determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como nica fuente de carbono alcalinizando el medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para observar la fermentacin de citrato contiene tambin sales de amonio inorgnicas. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como nica 33

fuente de carbono, utiliza tambin las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno. Estas sales de amonio se van a desdoblar en amoniaco produciendo la consiguiente alcalinidad. El medio utilizado es el Agar Citrato de Simmons que lleva como indicador el azul de bromotimol (cuando el pH es alcalino vira a azul intenso, mientras que el medio sin inocular tiene un color verde). Tcnica: Se utiliza un tubo inclinado. Hacemos la estra en superficie con un inculo poco denso y lo llevamos a incubar (3537C / 24h) Resultados: 1. Si la prueba es POSITIVA: En la superficie del medio de cultivo se observa un viraje del verde a azul intenso. 2.Si la prueba es NEGATIVA: no se produce viraje, se queda verde. PRUEBA DEL ROJO METILOVOGES PROSKAUER (RMVP) INTRODUCCIN: Para el metabolismo de los Hidratos de Carbono se pueden dar varios procesos: Gluclisis: proceso de hidrlisis por el cual se transforma la glucosa en cido pirvico. Vas alternativas Pentosas fosfato: se puede usar al mismo tiempo que la Gluclisis o de forma independiente. Entner Douduroff: la utilizan algunas Enterobacterias sin necesidad de utilizar la Gluclisis y la va de las pentosas fosfato. El cido pirvico puede usarse mediante: Va aerbica: Respiracin. El aceptor final de electrones es una molcula inorgnica (O2). Como productos obtenemos CO2 y H2O Empoacetilo + CoA ciclo de Krebs + cadena transportadora de e Va anaerobia: Fermentacin. El aceptor final de electrones es una molcula orgnica. Es de menor rendimiento energtico que la Gluclisis. Puede ser de tres tipos: Lctica Alcohlica cido mixta o del Grupo Califorme: tiene como productos: cidos mixtos: frmico, actico, succnico, etlico... (RM+) 34

Butilenglicol Butanediol Acetona (RM) ROJO DE METILO (RM) Principio: Es una prueba que mide de forma cualitativa los productos cidos que se originan por el metabolismo de la Glucosa de forma que, cuando estos cidos se producen en cantidad elevada, consiguen superar el sistema amortiguador llevando el pH del medio hasta 4 4,5. Tcnica: Se siembra 1 tubo para la prueba RM y otro para la de VP para cada muestra. Se incuba a 3037C durante 48 horas a 4 das incluso 6 das, y finalizado el perodo de incubacin le aadimos al tubo del RM 0,10,2 mL del reactivo Rojo de Metilo. Resultados: Si la prueba es POSITIVA aparece coloracin roja en la superficie de contacto del reactivo y del medio de cultivo. Si la prueba es NEGATIVA se queda el color del medio (amarillo) Precauciones: Es importante incubar como mnimo 48 horas. Si se observa un color anaranjado hay que continuar con la incubacin hasta 4 das. Si hacemos la lectura antes de las 48 horas todas las enterobacterias darn la prueba positiva, ya que todas fermentan la glucosa. Las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo positivas producen como consecuencia del metabolismo de la glucosa unos productos cidos en gran cantidad y estables. Trascurridas las 48 horas se aade el indicador. En este caso, los cidos habrn superado el sistema amortiguador del tampn (pH = 4 4,5), por el contrario, las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo negativas tambin producen cidos pero se producen en menor cantidad, son menos estables, se produce mayor cantidad de CO2 y, adems, se producen productos como consecuencia de la degradacin de las peptonas, con lo que el pH tiende a la neutralidad, es decir que tiende a alcalinizarse. VOGESPROSKAUER Principio: Es una prueba que pone de manifiesto un producto final neutro que es la Acetona. Tcnica: Se inocula y se incuba durante 24 48 horas. Para poner de manifiesto la acetona se utilizan 0,6 mL de naftol al 5% (intensifica el color) y 0,2 mL de KOH NaOH al 40% (oxida la acetona en di