Proyecto de investigación – Myrciaria dubia “camu camu”

Estudio de compuestos polifenólicos en cáscaras de Myrciaria dubia “Camu camu” y determinación de su

actividad antioxidante in vitro.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA:

La actividad antioxidante producida por la cantidad de los polifenoles presentes en la cáscara de Myrciaria dubia “camu camu” y la importancia que tiene en beneficio de la salud.

ANTECEDENTES

El camu-camu (Myrciaria dubia (HBK) McVaugh), es una especie nativa de la región amazónica, es un árbol o arbusto pequeño, perteneciente a la familia Myrtaceae, que se encuentra en estado silvestre en Perú, Brasil, Venezuela y Colombia. En su ambiente natural puede alcanzar hasta los cuatro a los ocho metros de altura1, 2.

La importancia de los antioxidantes es crucial para la salud, debido a su capacidad de neutralizar radicales libres, que contienen uno o más electrones desapareados; El antioxidante al colisionar con el RL le cede un electrón oxidándose a su vez y transformándose en un RL débil no tóxico y que en algunos casos como la vitamina E, puede regenerarse a su forma primitiva por la acción de otros antioxidantes3. Por tanto son sustancias que permiten proteger a las moléculas de las células del daño oxidativo producido por las especies reactivas del oxígeno (ROS), como el radical hidroxilo (OH ), superóxido (O2), peroxilo (RO2 ) u óxidos de nitrógeno (NO, NO2). Las células cuentan con mecanismos de protección, pero cuando este sistema falla, se produce un desequilibrio y se produce la generación de especies oxidantes produciendo el estrés oxidativo, proceso donde los ROS atacan los lípidos, inactivan proteínas o dañan el ADN4, 5.

Aunque los radicales libres son de vida muy corta (del orden de una milésima de segundo), son tremendamente reactivos; por ejemplo un radical libre puede dañar un millón de moléculas mediante éste proceso de auto-perpetuación. Los principales antioxidantes naturales son el ácido ascórbico, el -tocoferol, los carotenoides y los compuestos fenólicos, los cuales son encontrados en diferentes fuentes vegetales6, 7.

Los compuestos fenólicos constituyen un amplio grupo de sustancias (más de 8.000) presentes en el reino vegetal, aunque también existen compuestos de carácter sintético, que en su mayoría son potentes antioxidantes. Todos ellos comparten una estructura común, un grupo fenol, al que pueden asociarse núcleos aromáticos con diversos tipos de sustituyentes, predominando los grupos hidroxilos.

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Sus estructuras químicas les permiten donar hidrógeno/electrones a los radicales libres, lo que les confiere el carácter antioxidante. En estudios in vitro se ha demostrado que muchos polifenoles son mejores antioxidantes que las vitaminas C y E. La eficacia de estos antioxidantes depende en gran medida de la especie del radical libre generado, y de la naturaleza del oxidante 8, 9.

Teniendo en cuenta la presencia de compuestos fenólicos en alta concentración, se evaluará su contenido en polifenoles totales, en la cáscara de camu-camu (Myrciaria dubia (H.B.K) McVaugh) realizando la cuantificación de los compuestos fenólicos totales por el método de Folin Ciocalteu9; evaluar la actividad antioxidante usando diferentes tipos de radicales como DPPH en la cáscara seca y relacionar el contenido de polifenoles totales con la actividad antioxidante.

HIPÓTESIS

El fruto de camu camu presenta compuestos fenólicos en su estructura química, las cuales poseen capacidad antioxidante.

OBJETIVOS

Objetivo General: Determinar la actividad antioxidante in vitro de la cáscara de “Camu camu”.

Objetivos específicos:- Determinar la presencia de polifenoles en la cascara de Myrciaria dubia “Camu camu” mediante el método de Folin Ciocalteu y cuantificar estos.- Determinar la actividad antioxidante del camu camu mediante el método de inhibición del radical DPPH.

JUSTIFICACIÓN

Elegimos Myrciaria dubia (camu camu) porque es una fruta nativa que se encuentra en la Amazonia Peruana y que en los últimos años ha ido tomando bastante importancia alrededor del mundo.

La principal razón por la cual el camu camu cada vez toma más importancia es debido a su alto contenido de vitamina c o ácido ascórbico que ninguna otra planta conocida a nivel mundial, la cual es un importante antioxidante que ayuda beneficiando a la salud humana.

Con este proyecto esperamos demostrar que la cáscara de camu camu es una buena fuente de antioxidantes sobre todo de compuestos fenólicos.

APORTES:

Proyecto de investigación – Myrciaria dubia “camu camu”

Con este proyecto demostramos que la cáscara de camu camu es una buena fuente de antioxidantes sobre todo de compuestos fenólicos y cuyo uso podría ser adecuado en la elaboración de productos multivitamínicos, combinándole con otras frutas tropicales.

También podría ingresar al mercado de bebidas nutracéuticas y de productos biológicos como alternativa, sustentada en su excepcional capacidad antioxidativa y agradable sabor.

Demostrando la efectividad de Myrciaria dubia como antioxidante puede ser usada en cremas elaboradas a base de extractos para evitar manchas propias del envejecimiento.

METODOLOGÍA:

Los frutos de camu-camu (maduro, pintón y verde) serán obtenidos del departamento de Amazonas. Luego serán separados de su pulpa, cáscara y semilla, en forma manual con la ayuda de un tamiz. En la pulpa se realizaran medidas de pH, °Brix, y acidez por titulación potenciométrica10, se logrará establecer el índice de madurez (°Brix/%Acidez). El tratamiento de la cáscara será inicialmente secado al vació, (60 Kp.cm-2 y 48 °C ± 2; 72 horas), luego será molido en molino de cuchillas, pasando por una malla de 1 mm, seguidamente será empacado al vacío (presión: 250 mbar) y almacenado a temperatura de congelación, para posteriormente realizar los análisis respectivos.

Preparación de extractos

Las muestras vegetales secas y molidas serán extraídas con una mezcla de etanol y agua destilada (7:3) por 4 días a temperatura ambiente. Luego de la filtración, se procederá a evaporar el solvente en un rotavaporador a temperatura menor de 40 oC. Los extractos hidroalcohólicos que se obtendrán, serán almacenados en la refrigeradora a temperatura menor de 4 oC hasta su uso.

Determinación de compuestos polifenólicos

MÉTODO 1: Se utilizará el método de Folin-Ciocalteu11. Se prepará una curva de calibración de ácido gálico. Los extractos hidroalcohólicos de las 2 muestras vegetales serán evaluados a una concentración de 0,1 mg/mL. A la muestra se le añadirá solución de Folin-Ciocalteu (diluido 1 en 2 con agua milli-Q), luego se le añadirá carbonato de sodio al 20% y 400 µL de agua ultra pura. Se agitará vigorosamente, se cubrirá de la luz y se le llevará a reposo por 90 minutos a temperatura ambiente. Las absorbancias respectivas serán medidas a 760 nm en un espectrofotómetro. Las muestras serán analizadas por triplicado y el contenido de compuestos fenólicos totales será expresado en mg de ácido gálico/g de extracto hidroalcohólico.

MÉTODO 2: Esta prueba se basa en la reducción de los iones Fe3+ a Fe2+, por los polifenoles mostrando una coloración azul, formando el complejo ferrocianuro-ferroso, registrándose

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una máxima absorbancia a 720 nm teniendo como ventaja: a) La rapidez y simplicidad de la prueba debido a la formación del color azul, lo que ofrece sensibilidad y versatilidad para la determinación espectrofotométrica, b) Los resultados son directamente medidos del contenido de polifenoles solubles 11, obteniéndose en el extracto acuoso de la cáscara seca pintón de camu-camu, mayor contenido de polifenoles. Se realizará mediante el método de Azul de Prussian, reportado por 11. Se tomará el extracto acuoso y se adicionará FeCl3 0,1M en HCl 0,1N, y K3Fe(CN)6 y 0,008 M la absorbancia será registrada a 720 nm. Los resultados se expresarán en mg Ac. Gálico.g-1cáscara seca.

Evaluación de la actividad antioxidante en la cáscara seca de camu-camu en tres estados de madurez

Radical 2,2-diphenyl-1-picrilhydrayl (DPPH)Se evaluará mediante el método de inhibición del radical DPPH 12. Se hará reaccionar la muestra con el reactivo DPPH (100 μM) en etanol al 96%, la absorbancia será monitoreada a 515 nm, a intervalos de 30 segundos durante 10 minutos. Para la determinación de la actividad antioxidante, los resultados serán expresados en términos de IC50, K2 y Poder Antirradical 12.

a) Coeficiente de inhibición (IC50)Se determinará mediante un análisis de regresión del porcentaje de remanente versus la concentración necesaria de los extractos, para inhibir el 50% del radical DPPH12.El porcentaje de remanente del radical DPPH será calculado de la siguiente manera:(Ecuación 3)

%DPPHREM(DPPH ) f(DPPH ) i

×100 (3)

Donde (DPPH)f es la absorbancia del radical DPPH al final de la reacción, (DPPH) i es la absorbancia del radical al inicio de la reacción. El valor de IC50, fue expresado en términos de Ácido Ascórbico Equivalente (AAE) 13.

b) Constante de velocidad K2

El valor de K2 es un parámetro que diferencia a los compuestos de acuerdo a la reactividad intrínseca.

Los valores de cinética de absorbancia que se obtendrán por la decoloración del DPPH para cada concentración de las soluciones de trabajo de la cáscara de camu-camu en tres estados de madurez, en estudio, serán analizados mediante el programa STATISTICA/W14.

Para el cálculo del parámetro "b" se usará el siguiente modelo matemático: (Ecuación 4)

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A=(t + 1)ba (4)

Donde: A, es la absorbancia en cualquier tiempo t; a y b, son constantes; t, es el tiempo de reacción.

c) Poder antirradicalEl poder antirradical, referido a la eficiencia de un antioxidante, será evaluado de acuerdo a la metodología descrita 12.Para tener una mejor claridad sobre la capacidad que tiene un antioxidante para inhibir radicales libres, se realizará utilizando el Software de Sistema de Modelamiento Molecular - HyperChem (Vérsion 6,01) determinando el Análisis Conformacional de Mínima Energía 15.

Radical peroxiloSe empleó el método de TRAP (Poder Total de Actividad Reductora). Se tomo 10 μL de los extractos acuosos a diferentes concentraciones de la cáscara seca de camu-camu en diferentes estados de madurez, se hizo reaccionar con 990 μL de la solución stock de radical peroxilo. La disminución de la absorbancia fue registrada a 414 nm a intervalos de 30 segundos durante 10 minutos. La actividad antioxidante fue expresada como IC50, y en términos de Ácido Ascórbico Equivalente (AAE) 13.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOLos datos de absorbancia registrados para los modelos in vitro del radical DPPH°, Catión ABTS+, y radical Peroxilo serán evaluados mediante un Arnol para determinar el IC50 12. Los datos de absorbancia registrados para los modelos in vitro del radical DPPH, catión ABTS+ y radical Peroxilo, serán sometidos a un análisis de regresión lineal para determinar el K2, asimismo los datos de absorbancia de polifenoles totales y ácido ascórbico, para ser expresados en términos de Ac. Gálico Equivalentes (AGE) y Ácido Ascórbico Equivalente (AAE), respectivamente 13,15.Los valores calculados en las pruebas de actividad antioxidante, polifenoles totales, ácido ascórbico y antocianinas serán expresados como promedio ± desviación estándar. Los valores de IC50 y cantidad de ácido ascórbico, antocianinas y polifenoles totales, se evaluarán estadísticamente mediante un Diseño Completamente al Azar (DCA), con tres repeticiones, usando la prueba de t-student, p < 0,0515.

MATERIALES Y EQUIPOS:

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Material biológico:

Cáscara de Myrciaria dubia “camu camu”

Material de laboratorio:

Pipetas Beacker Fiola Embudos de decantación Tubos de ensayo Frascos ámbar

Reactivos:

Reactivo de Folin Ácido gálico Etanol 96% Agua destilada Na2CO3 20 % DPPH FeCl3 0,1M HCl 0,1N K3Fe(CN)6

Equipos:

Estufa Refrigeradora Balanza analítica Molino de cuchillas Rotavapor Espectrofotómetro UV

CRONOGRAMA

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ACTIVIDAD MESESEn Fe Ma Ab Ma Ju Ju

lAg Se Oc No

1. Búsqueda de información bibliográfica

X X

2. Recolección y acondicionamiento de la muestra

X

3. Preparación de extractos X4. Determinación y cuantificación de compuestos fenólicos

X X X

5. Evaluación de la actividad antioxidante

X X

6. Análisis estadístico X

7. Consolidación de datos X

8. Preparación del informe X

PRESUPUESTO

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Descripción Monto (S/.)

Porcentaje %

BienesAlimentos y bebidas para el consumo

Papelería en general, utiles, etc. 50 3.33Aseo, limpieza y tocador. 50 3.33Electricidad, iluminación y electrónica.

Otros (USB,etc.)

Medicamentos

Insumos, intrumental y accesorios médicos, quirúrgicos, odontológicos y de laboratorio

400 26.67Material biológico

Animales para estudio

Productos farmacéuticos de uso animal

Productos Químicos 700 46.67Otros bienes

Libros y textos para biblioteca

ServiciosPasajes y gastos de transporte

Viáticos y asignaciones por comisión de servicio 150 10Otros gastos 100 6.67Servicio de suministro de gas

Servicio de internet

Servicio de impresiones, encuadernación y empastado 50 3.33Servicios diversos

TOTAL 1500 100%

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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1. Moreira M, Ferreira S. Clonación de arbustos arbustos de camu-camucamu-camu y portainjertos arbóreas. II. Rev. Bras. Frutic.2009; 31(4).

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14.PROGRAMA INFORMÁTICO: STATSOFT. Statistica Software for Windows: release 5.0. New York, 1993

15. PROGRAMA INFORMÁTICO: STATSOFT. HyperChem TM Program: release 6.01 for Windows. New York, 2000.