Universidad Nacional Autónoma de Honduras

Facultad de Ciencias

Escuela de Microbiología

Seminario análisis clínico (MB-215)

Tema del seminario:

“Métodos de laboratorio para estudio de resistencia a antibióticos”

Alumno:

Joel Saamir García

Tegucigalpa MDC, 13 de Febrero del 2014

Las pruebas de susceptibilidad a los

antibióticos, una estrategia para frenar la expansión

de la resistencia bacteriana.

Desde el año de 1995, la Organización Panamericana de la Salud (OPS)

inició un programa que permite realizar la vigilancia de los agentes

bacterianos y su correspondiente prueba de susceptibilidad a los antibioticos

(PSA)

PSA y vigilancia epidemiológica

Según la OMS los métodos para el estudio de la resistencia microbiana se

puede clasificar en tres tipos:

1) In vitro: P ejem: Difusión en disco, dilución en caldo, etc

2) In vivo: P ejem: Vigilancia de la resistencia a los medicamentos antipalúdicos.

3) Moleculares: En base a la genómica/proteómica y se han utilizado para detectar

resistencia genotípica en bacterias.

*No hay un método estandarizado que se use de manera internacional y que

sea único.

Métodos de laboratorio para estudiar resistencia a

antibióticos

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Algunas infecciones se trataban exitosamente en base en la experiencia

clínica pasada de los clínicos (terapia empírica), esto cada vez se vuelve

más difícil y poco práctico.

Resistencia a muchos

antibióticos

Variedad de antibióticos

disponibles

Clínicos más pendientes de los datos de las pruebas de sensibilidad que se

practican in vitro, esto pone en relieve la importancia del laboratorio de

diagnóstico en la práctica clínica.

La prueba de sensibilidad antimicrobiana es una de las tantas armas con

las que contamos en el laboratorio para ayudar a los profesionales en

medicina controlar los procesos infecciosos que se desarrolla en los

pacientes.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

¿Qué principios debe cumplir una metodología para poder ser

utilizada como un ensayo de sensibilidad?

Facilidad de realización

Flexibilidad

Coste

Reproducibilidad

Fiabilidad

Exactitud

Adaptación a los sistemas

automatizados o semiautomatizados

¿Qué directrices o estándares regulan las pruebas de sensibilidad a

los antibióticos y su interpretación?

Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI/NCCLS, EE. UU.)

Sociedad Británica de Quimioterapia Antimicrobiana (BSAC, Reino Unido)

Comité de Antibiogramas de la Sociedad Francesa de Microbiología (CASFM,

Francia)

Instituto Alemán de Normativas (DIN, Alemania), entre otros.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

¿Cuáles son los métodos disponibles para probar la sensibilidad a los

antibióticos?

Métodos de difusión Difusión en disco E-Test

Métodos de dilución Macro dilución en caldo Micro dilución en caldo Dilución en medio sólido

con agar

Otros métodos Métodos moleculares Métodos automatizados

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Método de difusión en disco

Difusión de un antibiótico a una determinada concentración a partir de

discos, que se depositan en un medio de cultivo sólido que ha sido

sembrado con el aislamiento del inóculo seleccionado en cultivo aséptico.

Zona de inhibición del crecimiento es

proporcional a la sensibilidad de la bacteria frente

al antibiótico presente en el disco.

Difusión de un antibiótico en un medio de cultivo

inoculado crea un gradiente de la sustancia

antibiótica.

Diámetro zona de inhibición corresponde a la MIC.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Método de difusión en disco

> zona de inhibición, < es la concentración del antibiótico que se

requiere para inhibir el crecimiento de la bacteria.

Considerar el tamaño de la zona de inhibición.

Sus principales ventajas son:

Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba

cuando así se requiera.

Bajo coste.

Se puede utilizar como una prueba de detección frente a gran número

de aislamientos.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Métodos microbiológicos para la detección de BLEE

Método de sinergia de doble disco. (Recomendado por la NCCLS en 1998).

Discos de CTX (30 μ g), CAZ (30 μ g) y

AMC (20/10 μ g) en una placa de agar

Müeller-Hinton. Las placas se incuban 18-

24 h a 37 C en atmósfera aeróbica.

Ensanchamiento en la zona de inhibición

comprendida entre los discos de CTX o

CAZ y AMC.

Positivo para BLEE

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Método de tiras Épsilon (E test)

Combina la simplicidad y flexibilidad de las

pruebas de disco-difusión con la capacidad para

cuantificar la CIM de las técnicas de dilución.

Tira de plástico no poroso con un gradiente

predefinido.

CMI será el valor obtenido en el punto de

intersección de la elipse de inhibición con la tira.

Técnica fácil de realizar, reproducible y de rápida

interpretación.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Macro dilución en caldo

Cada agente bacteriano se prueba en un

rango de concentraciones que suele

expresarse en ug de fármaco activo/mL de

caldo (ug/mL).

La concentración de prueba para un fármaco

puede variar según la bacteria y las

resistencias asociadas que se intenta detectar

con la prueba.

16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 ug/ml (Rangos típicos de concentraciones).

CMI = Menor concentración de antibiótico que inhibe por completo el

crecimiento bacteriano observable.

Ventajas: Aportan resultados de CMI y CMB

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Micro dilución en caldo

Técnica de dilución en medio

líquido, pero realizada en placas de

poliestireno, con micropocillos en lugar

de tubos.

Los pocillos de cada columna tienen

concentraciones crecientes de un

antibiótico.

Generalmente alrededor de 200 ul de medio por pocillo

(Inóculo).

Se determinar la CIM, como en la macro dilución.

Hay paneles comercializados de ayuda para la interpretación de los

resultados.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Dilución en medio sólido con agar

Concentraciones variadas de antibióticos, en un

medio solidificado con agar, utilizando

generalmente diluciones seriadas dobles.

Los resultados derivados de estos ensayos se

consideran como los más fiables para la

determinación del valor MIC

Las ventajas son:

Capacidad de ensayar simultáneamente varias

bacterias

CIM para N. gonorrhoeae.

Ensayo estandarizado para bacterias difíciles de cultivar.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Métodos moleculares

Detección de los genes de resistencia a los

antibióticos

Predecir los fenotipos de resistencia a los

antibióticos por la vía de la identificación y la

caracterización de los genes conocidos que

codifican los mecanismos de resistencia específicos.

PCR en tiempo real, piro secuenciación de ADN, espectrometría de

masas (MALDI-TOF), micro arreglos de ADN y Bioinformática, son

ejemplos de las nuevas herramientas desarrolladas.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Métodos moleculares

Estos métodos se desarrollan mediante diferentes estrategias:

A) Hibridación ADN-ADN con sonda de ADN marcada con

fluo­rescencia.

B) Amplificación por PCR de un gen específico.

C) Polimorfismos de fragmentos largos de restricción (RFLP)

D) Secuenciación nucleotídica del ADN.

La meta es el diseño de nuevos y mejores fármacos dirigidos a blancos

previos y otros que inhiban de manera específica el crecimiento

bacteriano.

Datos epidemiológicos para la detección rápida de genes en bacterias

multirresistentes.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Métodos automatizados

Información correcta depende de la metodología de trabajo.

Brindan información cuantitativa o semi cuantitativa (concentraciones

indicadoras) dependiendo de la configuración antibiótica del dispositivo y

organismo (por ejemplo CIM: < de 0.5 ug/ml).

Incluyen los puntos de corte de acuerdo a las normas del CLSI o

EUCAST.

En algunos casos, se incorporan los datos de las cepas salvajes (“wild

type”), necesarios para los puntos de corte epidemiológicos.

Los mas utilizados son:

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Métodos automatizados

MicroScan (Siemens). Vitek II (BioMerieux).

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Métodos automatizados

Phoenix (Becton Dickinson Diagnostic System).

Estos equipos Manejan información demográfica de los pacientes y

permiten realizar informes epidemiológicos de gran riqueza.

Estudio laboratorial de la resistencia a

antibióticos

Métodos automatizados

Estos informes permiten:

A) Control de las infecciones intrahospitalarias.

B) Detección de brotes

C) Mecanismos de resistencias inusuales

D) Agentes patógenos emergentes y unirlos a la vigilancia de la resistencia

a los antibióticos.

Todos los fabricantes utilizan metodologías diferentes para el mismo fin.

Brindan información de la identificación bacteriana en tiempos cercanos

a las 4 horas y de PSA (Prueba de Sensibilidad a antibióticos) entre 6 a

16 horas.