Lecciones de Biología Celular y Molecular Hugo González Figueroa

METODOS DE ESTUDIO DE LA BIOLOGIA CELULAR y MOLECULAR

Tamaño y biología

Tamaños de células, virus, y otras cosas pequeñas

La biología es un área muy rica visualmente. Sin embargo muchas de las estructuras y eventos biológicos más interesantes son más pequeñas de lo que el ojo humano puede ver sin ayuda. En realidad el ojo humano tiene una resolución de cerca de 100 µm. En el cuadro de abajo note que de todas las estructuras listadas, solamente la célula vegetal está escasamente dentro de nuestra resolución

Desde hace unos 25 años el perfeccionamiento de varios métodos ha facilitado un conocimiento mejor de la estructura y función de los componentes del sistema celular.

Métodos de preparación de células y tejidos para observar estructura, actividad fisiológica, comportamiento y ultra estructura.

Estos métodos requieren de aparatos que prolonguen el poder de resolución del ojo humano a magnitudes muy pequeñas.

El poder de resolución de todo aparato óptico es la capacidad de resolver dos puntos situados uno cerca de otro. Todo aparato óptico tiene una distancia mínima de resolución, que se denomina límite de resolución. Dimensiones que pueden ser discriminadas por:

• ojo humano: de 100 metros a 0,1 milímetro • microscopio óptico: de 0,1 mm a 0,25µm (micras) • microscopio electrónico: de10µm a 0,1 nm (nanómetro)

28

La microscopía óptica utiliza como fuente de poder la luz visible (natural o artificial).

El microscopio óptico tiene un límite resolución de cerca de 200 nm (0.2 µm). Este límite se debe a la longitud de onda de la luz (0.4-0.7 µm ). Las células observadas bajo el microscopio óptico pueden estar vivas o fijadas y teñidas.

Imagen cortesía de WebPath (wwwmedlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html)

La microscopía electrónica utiliza como fuente de poder el flujo de electrones en vacío.

El Microscopio Electrónico de Transmisión (MET) El microscopio electrónico de transmisión (MET) tiene un límite de resolución de cerca de 2 nm. Esto es debido a limitaciones del lente usado para enfocar electrones hacia la muestra. Un MET mira a replicas de células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Los electrones son dispersados cuando pasan a trabes de una fina sección del espécimen, y luego detectados y proyectados hacia una imagen sobre una pantalla fluorescente.

Imagen cortesía de WebPath (www-med.utah.edu/WebPath/webpath.html)

29

El Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) El microscopio electrónico de barrido (MEB) también tiene un límite de 2nm. Al igual que el MET, el MEB permite mirar a células muertas, después de haber sido fijadas y teñidas con iones de metales pesados. Con esta técnica los electrones son reflectados sobre la superficie del espécimen.

Imagen cortesía de WebPath (wwwmedlib.med.utah.edu/WebPath/webpath.html)

Para ambos microscopios son indispensables:

I. Un sistema de condensación para iluminar el objeto. II. Lentes del objetivo que proyectan la imagen agrandada del objeto sobre el plano de la

primera imagen (en el microscopio electrónico se emplean lentes magnéticas). III. Lentes de proyección que proyectan el plano de la imagen sobre el plano de la

segunda imagen.

En el microscopio óptico las lentes de proyección pueden ser la combinación de un ocular y el ojo humano o la lente de una cámara, en cambio en el microscopio electrónico las lentes de proyección sólo pueden combinarse con una cámara. La observación directa de la muestra se hace a través de una pantalla fluorescente.

En la práctica los microscopios ópticos tienen lentes que permiten obtener una gran apertura, alta resolución y disminución de las aberraciones cromáticas. El poder de resolución en los microscopios compuestos resulta de las amplificaciones obtenidas con las lentes y del objetivo de las lentes de proyección. Las amplificaciones de utilidad máxima de ambos microscopios están limitadas por la difracción y alcanzan valores de 200 000X para el electrónico y 2000X para el óptico.

En la microscopía óptica la luz es desviada por medio de materiales de diferentes índices de refracción, y es posible enfocar cambiando la distancia entre el objetivo y el objeto.

La microscopía confocal examina un punto de difracción limitada de luz, casi siempre generada por un rayo láser, a través de la muestra. La luz emitida, reflejada o trasmitida de la muestra pasa por un objetivo de apertura muy fina. Por esta apertura pasa sólo la luz del plano focal de la muestra. Debido a que el plano focal es muy estrecho, el microscopio genera secciones ópticas de la muestra, casi siempre se forman muchas capas de la muestra lo que permite observarla en tres Dimensiones. La ventaja de la microscopía confocal radica en la palabra capacidad de discriminar la muestra que se encuentra en el plano focal, porqué elimina la Iluminación que está fuera de este plano. En la Microscopía confocal sí banking colorantes fluorescentes.

En la microscopía electrónica, un haz de electrones es desviado por lentes magnéticas cuya fuerza de campo magnético y su longitud focal pueden cambiarse continuamente alterando la corriente eléctrica en la bobina del magneto.

El contraste : para que un objeto sea visible debe ser diferente del medio que lo rodea. La diferencia de intensidad entre la imagen y el medio que la rodea se denomina contraste.

Más técnicas de contraste utilizadas:

• Tinción: usando colorantes que son absorbidos de manera diferencial por diferentes estructuras biológicas, la absorción de la luz variara cuando incida sobre el colorante y la intensidad de la imagen variará entre las diversas partes.

• Fluorescencia: con la fluorescencia el objeto se hace luminoso. Al iluminarse el objeto con luz de longitud de onda de 365 nm, el material de estudio podrá servicios visto por la luz fluorescente que emite. Las proteínas, ácidos nucléicos son débilmente fluorescente, pero es posibles observarlos en placas fotográficas, cuando se acopladan a grupos fluorescentes (anticuerpos fluorescentes).

• Cambio de Fase de la onda de luz: Permite obtener un contraste natural, sin necesidad de usar colorantes para observar una estructura biológica.

• Luz Polarizada: permite observar regiones asimétricas dentro de estructuras moleculares. • Luz Ultravioleta: permite mostrar contraste sin ninguna tinción especial, debido a los coeficientes de absorción de los componentes celulares como ácidos nucléicos y proteínas.

MICROSCOPIO OPTICO: PARTES y FORMACION DE LA IMAGEN (Tomadas de: Darnell J., Lodish H & Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da. Edición.Scientific American Books. New York)

32

33

MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION(Tomado de: Darnell J., Lodish H & Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da. Edición.Scientific American Books. New York)

ULTRAMICROTOMO y GRILLA (Preparación de muestras para microscopía electrónica de transmisión

34

(Tomado de: Darnell J., Lodish H & Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da. Edición.Scientific American Books. New York)

Métodos de separación de células en sus partes

Citometría de flujo

Este método sirve para identificar las células a partir de una mezcla de células. Un instrumento llamado separador de células activadas por fluorescencia (FACS) puede seleccionar células simples de un grupo de muchas células. Las células una vez teñidas con colorantes fluorescentes son unidas a un anticuerpo específico para una molécula de superficie de membrana. En el FACS, un flujo de células pasa por una fuente de laser y la correcta longitud de onda de la luz causa que las células que contienen el complejo anticuerpo-fluorcromo, emitan fluorescencia.

El FACS puede separar una célula que muestra un marcador específico de superficie de cientos que no lo tienen, entonces las células seleccionadas pueden crecer en cultivos in vitro.

El FACS puede medir el contenido y la determinación de la forma y tamaño del ADN y ARN de la célula. En estudios de ciclo celular puede diferenciar muy bien los núcleos interfásicos de G0, G1 S y G2

35

Fraccionamiento celular

Las técnicas de fraccionamiento permiten romper células enteras de una forma controlada. Las diferentes partículas se separan posteriormente para su ulterior análisis estructural o funcional.

Esto se consigue centrifugando a alta velocidad las células rotas en soluciones especiales de densidad conocida. De esta forma, se puede obtener preparaciones relativamente puras de núcleos, mitocondrias, retículo endoplasmático (microsomas), entre otros subcomponentes celulares.

ULTRACENTRIFUGA y POBLACIONES DE ORGANELAS OBTENIDAS POR FRACCIONAMIENTO CELULAR

(Tomado de: Darnell J., Lodish H & Baltimore D. 1990. Molecular Cell Biology. 2da. Edición.Scientific American Books. New York)

Cultivo de células y tejidos Las células pueden crecer en medios artificiales, lo cual ha facilitado el conocimiento de sus características estructurales y funcionales.

36

• Los medios químicos definidos permiten identificar factores de crecimiento específicos.

• Las líneas celulares se mantienen indefinidamente: Por ejemplo células de humanos con alguna enfermedad que le causa la muerte, pueden ser mantenidas en estos sistemas de cultivo.

La uniformidad de la línea celular puede incrementarse por la clonación. Un clon es una población de células derivadas de una sola célula antecesora. Uno de los usos más importantes de la clonación ha sido el aislamiento de líneas celulares mutantes con defectos en genes específicos

Ejemplos:

Línea celular Tipo celular y origen

HeLa células epiteliales (humana) SP 2 célula plasmática (ratón) 3T3 fibroblasto (ratón)

• Las células pueden fusionarse para formar células híbridas o heterocariones: este es un método específico para asignar genes a cromosomas específicos.

Cromatografía y electroforesis

Técnicas que permiten separar macromoléculas de preferencia proteínas y ácidos nucléicos.

La cromatografía es uno de los métodos más usados para el fraccionamiento de proteínas. Hay diversas formas de cromatografía:

Cromatografía en papel Cromatografía en capa fina Cromatografía en columna:

o Columna de intercambio iónico o Columna de filtración-gel o Columnas de afinidad

La electroforesis permite separar proteínas en función a las cargas eléctricas positivas y negativas de estas moléculas biológicas. Esta técnica permite separar mezclas de proteínas. El tamaño y la composición de los aminoácidos de una proteína son determinados con relativa facilidad usando la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. La electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional permite separar más de 1000 proteínas en un simple gel.

37

TECNICAS DE CROMATOGRAFIA y ELECTROFORESIS PARA SEPARAR MOLECULAS BIOLOGICAS

(Tomadas de Alberts et al., 1986)

38

Ingeniería genética

La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes en el genoma de un individuo que carece de ellos. Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar" el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha formado al intercalar un segmento de ADN extraño a un ADN receptor. Por ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular. La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre las que destacan:

• La tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en otro.

• La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.

• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN, por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.

• Las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética.

Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre, entre los que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del crecimiento, interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el propio planeta.

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten manipular el genoma de un ser vivo.

Tecnología del ADN recombinante

Esta tecnología nos permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos diferenciar cuatro etapas básicas:

39

Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares". Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios: Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN. Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos, porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de restricción. En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.

40

En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima derestricción.Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosospor donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especiediferente.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar los distintos trozos según eI fragmentado, en varios trozos, o bien un trozo puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.

Inserción de fragmentos

Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse.

Inserción de los fragmentos de ADN.

Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras dentro de las células hospedadoras. Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus de introducirlos en las células hospedadoras. 41

• Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación

Figura A. En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido. En la figura a tenemos un gen (color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

En la Figura B, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

42

Figura CLa unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

• Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo (figura f). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

Cósmidos . Son plásmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremocos) y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el cósmido uniendo los tres elementos génicos, y el resultado final es poder introducir en la célula receptora fragmentos largos de ADN.

43

44

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia.

Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.

Genes de luminiscencia. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.

En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.

La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En la siguiente animación puede verse el proceso.

45

Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus. En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar cómo lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.

46

Muchos usos comunes de la tecnología del ADN recombinante incluye los siguientes pasos:

1. Producción de una biblioteca del ADN: conjunto completo de todo el ADN de un organismo en particular, generalmente clonado en plásmidos usando enzimas de restricción. Se usan dos tipos de ADN recombinante:

Clones genómicos: contienen un fragmento del ADN genómico. Clones de ADN complementario (cADN), contiene un fragmento del ADN

complementario copiado de un ARNm.

En ambos casos se dejan "extremos de unión "de hebras únicas a cada lado del corte.

2. Identificación del gen seleccionado: se pueden identificar mediante diversas técnicas

3. Producción de copias del gen seleccionado: pueden producirse en bacterias a partir de la biblioteca del ADN cuando se cultivan las bacterias con el gen seleccionado.

4. Inserción y regulación del gen en mecanismos específicos. Los usos de los genes clonados incluyen:

La producción de grandes cantidades de proteínas específicas La síntesis de vacunas El diagnóstico de enfermedades genéticas La modificación del ADN en organismos intactos que pueden ser bacterias, plantas o

animales La modificación del ADN de las células de órganos específicos en seres humanos para

corregir defectos genéticos.

47