MÉTODOS DE CALIBRACIÓN: REGRESIÓN Y CORRELACIÓN Estadística en el laboratorio.

MÉTODOS DE CALIBRACIÓN:REGRESIÓN Y CORRELACIÓN

Estadística en el laboratorio

Objetivo

• Calibración:– Necesidad dado el creciente uso de métodos

analíticos, en lugar de los métodos tradicionales.• Ejemplo: electrodos pH, conductividad, etc.

– Métodos automatizados para el procesamiento de gran cantidad de muestras.

– Todos sujetos a potenciales errores sistemáticos que deben ser corregidos a tiempo.

Gráficos de calibración• Metodología:

– Se procede a la medición de un analito en tres o más estándares en las mismas condiciones en las que será evaluada la muestra a analizar.

– Se incluye la medición de un blanco (ausencia total del analito de interés).

– Siempre se grafica la señal del analito en el eje y, y la concentración del analito en el eje x (consideración de errores en la medición del analito y no en la concentración del estándar).

– Una vez que el gráfico de calibración ha sido obtenido, el analito puede ser luego evaluado por interpolación.

Gráficos de calibración• Sin embargo:

– ¿El gráfico de calibración muestra una relación lineal?

– Si es curva, ¿Cuál es la forma de la curva?

– Si consideramos que cada medición realizada con los estándares es propensa a errores, ¿Cuál es la mejor línea (o curva) que expresa la relación entre el analito y la señal?

– Asumiendo que la relación es lineal, ¿Cuáles son los errores y los límites de confianza de la pendiente y el intercepto?

– Cuando el gráfico es utilizado para interpolar un valor, ¿Cuál es el error y los límites de confianza para el valor obtenido?

– ¿Cual es la menor concentración del analito que puede ser detectado con un determinado nivel de confianza? (límite de detección)

Gráficos de calibración

• Asunciones importantes:– Al realizar varias mediciones en un estándar, las

mediciones resultantes presentan errores que son distribuidos normalmente.

– La magnitud del error en y es independiente de la cantidad de analito en la muestra.


• Relación lineal:– Responde a la ecuación:• y= mx+b

– Donde:• y = valor de la señal del analito• m= pendiente de la recta (sensibilidad)• x= concentración del analito• b= intercepto (blanco)

Coeficiente de correlación

• Identificando una relación lineal:– Coeficiente de correlación momento-producto (r),

que nos permite evaluar si la relación existente entre las dos variables es lineal.

– No subestimar el poder de un análisis gráfico.


• Interpretando el valor de r:


• Ejemplo:– Una solución acuosa estándar es examinada

mediante espectrometría de fluorescencia. Los siguientes valores son obtenidos:

– Determine el coeficiente de correlación (r)

medición 1 2 3 4 5 6 7

Intensidad 2.1 5.0 9.0 12.6 17.3 21.0 24.7

Concentración 0 2 4 6 8 10 12


xi yi (xi – x) (xi – x)2 (yi – y) (yi – y)2 (xi – x) (yi – y)

Suma


• Considere:• El valor de r podría ser cercano

a uno, y sin embargo la relación entre las variables podría no ser lineal.

• Un r de 0 únicamente nos indica que la relación no se ajusta a un modelo lineal, sin embargo pudiera existir otro modelo de relación.


• ¿Como saber si la relación lineal es significativa?• Uso del estadístico t:

• Donde:• Ho= no hay correlación lineal• Uso de la tabla t para dos colas y (n-2) grados de

libertad.

La línea de la regresión

• Mejor relación• Si tenemos evidencia de una relación lineal significativa, la

siguiente pregunta es cuales son las características (pendiente e intercepto) de esa línea que se ajusta de la mejor manera a todos los datos.

• Estrategia:• Esa línea es estimada mediante la reducción de los errores

entre los valores medidos y los predichos por la función lineal (línea de regresión):

• Minimización de la suma de los cuadrados de los residuos.


• Puede ser demostrado que la mejor “línea” que minimiza los errores esta dada por:


• Ejercicio:• Calcule la pendiente y el intercepto de la línea

de regresión en base a los datos del ejemplo previo.

Errores en la pendiente y el intercepto

Errores en la pendiente y el intercepto• Las lecturas realizadas presentan un cierto error en

la dirección y, que puede ser estimado por el estadístico sy/x para errores aleatorios en y:

Errores en la pendiente y el intercepto• Errores aleatorios en la pendiente (Sb) y el

intercepto (Sa):

Errores en la pendiente y el intercepto• Donde se puede estimar los limites de confianza

para:• Pendiente• b t(n-2)Sb

• Intercepto:• a t(n-2)Sa

Errores en la pendiente y el intercepto• Ejercicio:• Calcule las desviaciones estándar y los límites de

confianza de la pendiente y el intercepto de la línea de regresión elaborada anteriormente.

Calculo de una concentración y su error aleatorio• Una vez obtenida la ecuación de la curva, es fácil

interpolar la concentración del analito (y) en base a la intensidad de la señal (x).

• Debido a que tanto la pendiente, como el intercepto están sujetos a errores, es necesario también estimar el error asociado a la medición.

• Dichos error total (aleatorio y sistemático) es de difícil determinación.

Calculo de una concentración y su error aleatorio• Simplificando:

• Donde • yo es el valor experimental de y a partir del cual

se determinó xo.

• Sxo es la desviación estándar estimada de xo.

Calculo de una concentración y su error aleatorio• En ocasiones, se puede recurrir a realizar m lecturas

para obtener el valor de yo, obteniéndose que sxo sería calculada:

• Donde m es el número de lecturas realizadas para cada medición.

Calculo de una concentración y su error aleatorio• Límites de confianza:• Los límites de confianza para la medición

realizada se calcularán mediante:• xo t(n-2)sxo • (con n-2 grados de libertad).

Calculo de una concentración y su error aleatorio• Ejercicio:• Empleando los datos del ejemplo anterior,

determine los valores de xo, sxo, y los límites de confianza de xo para soluciones con intensidades de fluorescencia de 2.9; 13.5 y 23.0 unidades.

Calculo de una concentración y su error aleatorio• Observe que:• Los límites de confianza

son menores cuando yo se aproxima al valor promedio de y.

• Por tal motivo, la mayor precisión en las mediciones se obtendrán para lecturas que estén cerca al centro de la curva de calibración.

Calculo de una concentración y su error aleatorio• Como mejorar:

• Aumentando el número de puntos de calibración (n).• Realizando más mediciones (m) para la determinación de yo.• Considere que demasiadas mediciones podrían no mejorar

significativamente la precisión.• Considere que un incremento de n acarrea más estándares

que preparar, mientras que un número pequeño de n significa mayores valores de t.

• Se recomienda 6 puntos de calibrado y varias mediciones de yo.

• Si existen restricciones para m y n, entonces la mejor opción (en base a la ecuación anterior) es que m=n.

Calculo de una concentración y su error aleatorio

Sy/x

Sb(pendiente)

Sa(intercepto)

Intercepto

Pendiente

Límites de detección

• Definición:• Aquella concentración que proporciona una señal en el

instrumento (y) significativamente diferente de la señal del “blanco” o “ruido” de fondo.

• Si bien es cierto no existe un consenso en cuanto a cuando es “significativamente diferente”, se suele generalizar que:

• Límite de detección (LOD) = ŷblanco + 3sblanco

• Donde para una calibración univariada sblanco= sy/x


• Ejercicio:• Estime el límite de detección del ejemplo

anterior.

Datos anómalos en la regresión

• Estrategia:• Identificados mediante el análisis de los

residuales (yi-ŷi).• Sin embargo, los residuales no son

independientes pues su suma siempre será igual a cero.

• Por tal razón un test Q no es aplicable.• Necesidad de recurrir a métodos gráficos

Datos anómalos en la regresión

Regresión para comparación de métodos analíticos• Justificación:• Cuando comparamos dos métodos para la

determinación de un analito a varias concentraciones, podemos hacer uso de las técnicas estadísticas anteriores.

• Sin embargo, cuando dicha evaluación se lleva a cabo en un amplio espectro de concentraciones, se debe recurrir a una regresión.

• Logrando identificar presencia de errores sistemáticos.

Regresión para comparación de métodos analíticos

• Ideal:• Pendiente = 1• r = 1• Intercepto = 0

• Sin embargo, imposible debido a errores aleatorios.


• Estrategia:• Contrastar que el origen de la recta difiere

significativamente de cero.• Contrastar que la pendiente difiere

significativamente de uno.• Haciendo uso de mediciones únicas o

promediadas realizadas por ambos métodos.


• Ejercicio:

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