1. Métodos colorimétricos

Para que se pueda generar el color, deben de existir primero una fuente de luz, una Superficie que se ilumine y un detector que perciba e interprete lo que la muestra refleja (la luz que no fue absorbida por la muestra). En la apreciación visual, el receptor es la retina que manda a analizar las señales al cerebro donde se produce una versión subjetiva sobre la percepción del color. Para evitar esa subjetividad, y poder producir información que sea entendible y reproducible de forma universal, se utilizan tres características físicas que definen al color.

El Tono también llamado Hue se refiere al nombre del color (amarillo, rojo, azul, verde, etc.), este resulta de la suma de estímulos generados en la retina, cuando recibe impulsos con diferentes longitudes de onda. Estos colores pueden tener diferente intensidad, pudiendo ser colores muy intensos o muy débiles en términos de Saturación de color, esto se denomina Croma. Finalmente, la Luminosidad nos indica que tan claro u obscuro es un color.Aun definiendo éstas tres características del color, nos encontramos con el efecto de la subjetividad con que cada persona define estos términos. Por lo tanto, el uso de instrumentos que nos permitan ser objetivos, se convierte en una herramienta extremadamente útil en el laboratorio de calidad de carne.Las técnicas instrumentales para medir color, se definen básicamente en función del proceso con el que se evalúa la luz que se recibe de la muestra. Los colorímetros evalúan la luz mediante el uso de filtros de tres o cuatro colores (longitud de onda específica), mientras que los espectrofotómetros proyectan un haz de luz monocromática sobre la muestra y miden la cantidad de luz que es absorbida en diferentes longitudes de onda, permitiendo incluso generar curvas espectrales ya sea de absorbancia o de transmitancia (la luz absorbida o transmitida).Dado que estos equipos hacen lecturas en función del tipo de luz que se emite sobre la muestra, es un punto muy relevante aclarar el tipo de luz que se va a emitir sobre la muestra. Esta luz que se emite, se describe como iluminante y hay varios tipos siendo los más comunes A (luz de Tugsteno, temperatura de 2854 grados Kelvin), B (4,800 K), C (equivalente a luz de día, 6770 K), D (6,500 K), etc. Según AMSA, lo ideal para evaluar carne, es usar una luz que sea intensa en el espectro de colores rojos (iluminante A). Sin embargo, el iluminante más usado en la literatura científica (Tapp et al., 2011) es el D65, el cual corresponde a la luz promedio del medio día en el norte de Europa.Conjuntamente de la objetividad, otra ventaja del uso de estos equipos colorimétricos, es que permiten realizar mediciones objetivas, rápidas y no destructivas. Además de muchas otras escalas, la mayoría de estos aparatos basan su funcionamiento en las escalas Hunter y CIELAB, las cuales son reconocidas como las más populares para evaluar el color de la carne fresca.El espacio de color Hunter L, a, b se basa en un esquema de vectores que se representan de forma tridimensional, y que están basados en la teoría de los colores opuestos. La integran los parámetros L, a y b. L se refiere a la luminosidad y se ubica verticalmente, tomando valores de 100 (blanco) y 0 (negro); mientras que a y b, ubicados horizontalmente, no tienen límites, pero sí valores positivos o

negativos. La escala de a se mueve de los valores positivos (rojo +) a los negativos (verde -); mientras que la escala de b va del amarillo (+) al azul (-).En 1976, la CIE propuso una modificación a la escala original (Hunter L, a, b), al calcular de forma diferente los valores y paso a nombrarlos L*, a*, b* lo que ahora se conoce como el espacio de color CIEL*a*b*. Este espacio de color, es una transformación matemática de las coordenadas X, Y, Z. En ocasiones, algunos autores prefieren expresar los valores, en términos de Luminosidad (L*), Croma o saturación (c*) y Hue o tono (H*), permite una Manual de Análisis de Calidad en Muestras de Carne descripción numérica del color de manera semejante al que los seres humanos comunican verbalmente el color en términos de luminosidad, tonalidad y saturación, los cuales se calculan a partir de a* y b* de acuerdo a las siguientes ecuaciones (DeMan, 1992): H* = arctang (b*/a*) y c* = (a*2 + b*2 )1/2Aunque similares en organización, un color tendrá valores numéricos diferentes en estos dos espacios (Hunter Lab y CIEL*a*b*), por lo que al momento de realizar la medición deberá indicarse cuál es el la escala y el instrumento que se está utilizando.Como se mencionó, todos los aparatos para medir el color se ubican dentro de las dos siguientes clasificaciones: espectrofotómetros y colorímetros. El espectrofotómetro es el instrumento básico para medir el color que facilita la obtención de resultados completamente objetivos. Sus mediciones dependen sólo de las características de la luz reflejada por la muestra, independientemente de las características del observador. En este tipo de sistema, la muestra se ilumina esencialmente con luz monocromática, y se mide la luz difusa reflejada en cada longitud de onda del espectro visible; la cantidad de luz reflejada por la muestra se expresa como porcentaje de la reflectancia difusa, a la misma longitud de onda, de un estándar de referencia blanco. A diferencia de los colorímetros, con espectrofotómetros, es posible además medir la reflectancia en longitudes de onda específicas, lo que permite por ejemplo, evaluar el grado de rojo en función del radio de la reflectancia a 630 sobre la de 580 nanómetros.Mientras que los llamados colorímetros de filtros triestímulos, sirven para medir el color; en estos equipos la muestra es iluminada por una fuente de luz blanca, y la luz reflejada por la muestra es dirigida a un foto detector que genera una señal eléctrica proporcional a la cantidad de luz que incide en él. Entre la muestra y el foto detector se encuentran los filtros triestímulos (azul, rojo y verde), diseñados para proporcionar la respuesta de acuerdo con el Sistema CIE, y basados en la distribución de la fuente de luz y la respuesta del foto detector en el espectro. Las señales del foto detector son operadas electrónicamente para dar los resultados en algunas de las escalas de color ya mencionadas (Hunter Lab, 2001; CIE, 2004).Independientemente del equipo con el que se cuente, es importante definir el objetivo de la medición, ya que existen varios factores inherentes al equipo que pueden afectar las mediciones. Independientemente del colorímetro tricromático o espectrofotómetro colorímetro que se tenga, se deberán definir las siguientes características: tipo de iluminante; la posición del observador respecto de la muestra, lo que define los grados de Campo de visión del observador estándar, esto es fijo según el equipo, en general, se Recomienda utilizar 10° preferentemente, pero también existe la opción de 2 y de 0°. El tamaño de

apertura del puerto para realizar la medición, estará idealmente relacionado con el tamaño de la muestra donde se realizará la medición. Sin embargo, este factor es fijo para la mayoría de los equipos y generalmente varía en un rango de entre 6 y 50 mm, siendo los puertos más comunes 8 y 25 mm, en general, mientras más grande el puerto de medición, mayor la precisión de la medida.

Consideraciones al evaluar el color de la carneAl realizar la determinación de color en el músculo, el parámetro de L* se correlaciona con el estado físico de la carne, debido al pH final del músculo, a la estructura de las fibras musculares y a la cinética implicada para establecer el rigor mortis; mientras que el tono es determinado por el estado químico del pigmento de mayor concentración en la carne, la mioglobina (Mb, de color rojo púrpura; oximioglobina, MbO2, de color rojo vivo; metamioglobina, MetMb, de color pardo) El tono en la carne fresca está relacionada con los factores post-mortem, mientras que el croma, se relaciona más con la concentración de mioglobina, que influye directamente en la saturación del color del músculo y se relaciona principalmente con los factores ante-mortem (tipo de músculo, edad, alimentación, genética, etc.).De acuerdo con la guía AMSA (1992) y National Pork Board (NPB) (2000), las mediciones de color en la carne cruda son afectadas por la nutrición del animal, la velocidad de enfriamiento de la canal, el tipo de músculo, la orientación de las fibras, el pH del músculo, el tiempo y la temperatura de almacenamiento post-mortem, el tiempo de exposición del músculo al oxígeno, el grado y la distribución del marmoleo, la humedad y brillo de la superficie y la concentración de mioglobina. Por ello, es de gran importancia estandarizar tanto como sea posible las variables en la medición de color de las muestras a ser comparadas, y considerar todos estos factores al momento de procesar las muestras. Siempre se deberá de asociar la medición de color, con la del pH de la carne.Equipo Colorímetro tricromático o espectrofotómetro colorímetro.Materiales Patrones de calibración. Paño suave para limpiar la parte del instrumento que toca la muestra. Cuchillo. Tabla para picar. Plástico emplayador.

Metodología (AMSA, 1992) Retirar toda la grasa exterior del músculo no infiltrada con la ayuda de un

cuchillo. Cortar la muestra con un grosor de cuando menos 1.2 cm (idealmente se

busca tener unos 2 cm de grosor); de no contar con suficiente muestra, y para evitar errores, se puede colocar una muestra de carne debajo de la muestra a medir, o en su defecto, se utilizará una base de preferencia blanca, en la que las muestras se coloquen en el momento de hacer la medición. También se puede medir directo sobre la carne en canal.

Luego de cortar la muestra, esta se deberá de exponer al oxígeno del aire. Dejar reposar la muestra por al menos 30 min para que se oxigene la

mioglobina (blooming). Algunos laboratorios recomiendan estandarizar el tiempo de blooming a 1 hora, teniendo la muestra expuesta al aire y a una temperatura de 3°C.

Seleccionar una área de medición donde no exista alta concentración de grasa intramuscular; de no ser posible, es recomendable considerarla como una variable en el tratamiento estadístico de los datos.

Realizar la medición con el equipo disponible, evitando cualquier presión que distorsione la dirección de las fibras musculares. El número de lecturas que deberá tomarse de cada muestra estará en función de la variación que exista en la muestra (algunos cortes presentan grandes variaciones en color), de ser el caso, se buscará el área de color que sea más representativa dentro de la muestra.

En caso de que el equipo de medición tenga opción a diferentes aperturas, seleccionar la apertura que se adapte mejor al área de la muestra. Superficies de muestreo grandes serán valiosas para determinar el color promedio, sin embargo, áreas pequeñas serán de utilidad en determinar un color específico.

Registrar los valores L*, a* y b*; o L, a y b y el pH en un formato (Cuadro 4), según sea el caso, y simultáneamente registrar los valores de pH de la muestra. También pueden registrarse valores de croma y Hue, ya que existen equipos que Tienen software integrado para obtener estos parámetros.

Tomar idealmente tres diferentes mediciones sobre la muestra.

Determinación del contenido de grasaLos lípidos son considerados como un grupo de compuestos orgánicos insolubles en agua y solubles en solventes orgánicos (como por ejemplo éter y cloroformo), con una estructura química formada por una cadena hidrocarbonada como parte principal de la molécula, y que se encuentran o se derivan de organismos vivos (Kolakowska y Zdsislaw, 2011).Mientras que un ser humano puede sobrevivir sin el consumo de carbohidratos, no lo podría hacer sin el consumo de aminoácidos y de grasas, particularmente de los ácidos grasos esenciales, que son aquellos que el cuerpo no puede producir. A diferencia de lo que mucha gente quisiera, el consumo de grasas es importante para mantener una dieta balanceada, por lo que la mayoría de las recomendaciones nutricionales en el mundo, recomiendan que la energía total consumida, provenga de un número de calorías similares a partir de grasa, proteína y carbohidratos.La forma más eficiente para acumular energía en el organismo, es a partir de grasa, particularmente en forma de triglicéridos. Los triglicéridos están formados por una molécula de glicerol y una, dos o tres moléculas de ácidos grasos, los cuales se pueden identificar como saturados e insaturados dependiendo si existen o no dobles enlaces en su estructura. Los ácidos grasos con una doble ligadura se denominan monoinsaturados y los que tienen más de una doble ligadura en su

cadena, se identifican como poliinsaturados. Dependiendo del número del carbono donde se encuentren las dobles ligaduras (contando a partir del carbono terminal más cercano a la doble ligadura), se denominan omega 3, 6 o 9. Los lípidos complejos, son aquellos que se asocian con otro tipo de compuestos, estos incluyen a los fosfolípidos, los glucolípidos y los sulfolípidos.Los términos lípidos, grasas y aceites en muchas ocasiones son utilizados indistintamente. El término lípidos está asociado a las características de solubilidad, por lo que grasa se utiliza para referirse a lípidos que son sólidos a temperatura ambiente, mientras que aceite se utiliza para describir los lípidos que se encuentran en estado líquido a temperatura ambiente. Debido a la falta de una definición científica de mayor exactitud y para propósitos de etiquetado nutricional, la FDA ha definido como grasas a la suma de ácidos grasos con cadenas de 4 a 24 carbonos (Nielsen, 2010). Comúnmente, para la extracción de grasa en muestras de carne, los éteres se utilizan como solventes orgánicos que disuelven compuestos no polares (por ejemplo, triglicéridos), pero son poco eficientes con los lípidos polares (por ejemplo, fosfolípidos) lo que explica por un lado por qué la extracción con los éteres resulta en una menor cantidad de grasa (presumiblemente, no se extraen todos los fosfolípidos) y también porque, en muestras con mayor cantidad de grasa neutra tienden a ser más eficientes (puesto que extraen una mayor proporción de grasa).Contrario a los éteres, las mezclas de cloroformo-metanol se caracterizan por ser una combinación de un solvente no polar (cloroformo) y uno polar (metanol), lo que permite la extracción de grasas tanto no polares como de aquellas polares (principalmente fosfolípidos asociados a membranas celulares), por lo que su uso, permite colectar mayores cantidades de lípidos en menor tiempo (Mariezcurrena et al., 2010). Algunos de los ácidos grasos presentes en los alimentos se muestran en el Cuadro 7.Los lípidos de la carne se encuentran principalmente en el tejido adiposo y en la grasa intramuscular. En el tejido adiposo se localizan principalmente triglicéridos, mientras que en el tejido intramuscular se encuentran triglicéridos y grasas ligadas a la membrana como fosfolípidos y lipoproteínas (Pegg, 2000). Entre menor es el contenido de grasa intramuscular, mayor es la proporción de fosfolípidos de membrana y menor el de triglicéridos.El contenido de lípidos en la carne fresca en México varía en función de especie, raza, edad, sistema de alimentación, etc. pero podemos considerar que un valor cercano al 2.5% pudiera aplicar para la mayoría de las carnes magras, aunque los valores pueden variar entre 1 y 13 % (USDA, 2008). Interesantemente, se ha encontrado que existe una relación inversamente proporcional entre el contenido de lípidos y el contenido de agua (Callow, 1984). En carne de cerdo, res y cordero se ha relacionado la concentración de ácido esteárico (18:0) con el punto de fusión de la grasa y la firmeza /dureza de la carne (Wood et al., 2004), así mismo en cerdos, la mayor concentración de ácidos omega 6, se relacionan con la presencia de grasa líquida y por ende de menor calidad.Desde el punto de vista de la nutrición humana, no sólo es deseable que las grasas insaturadas predominen en gran cantidad sobre las saturadas, sino también que la proporción entre ácidos grasos omega 6 y omega 3 sea la

adecuada (idealmente, no mayor de 2 a 1). Por ello, es preferible una carne con una mayor proporción de ácidos grasos poliinsaturados y un mayor balance entre los ácidos n-6 y n-3.Al decidir que método utilizar, el investigador deberá considerar si solo le interesa conocer la cantidad total de grasa, o si la grasa recuperada será utilizada posteriormente para otros análisis. En el caso de que la grasa se vaya a analizar posteriormente para determinar el perfil de ácidos grasos, se deberá seguir una metodología de extracción en frío, debido a que las temperaturas elevadas promueven la oxidación de las grasas.A continuación se describe la metodología para la extracción con el uso de calor y solventes, que se deriva de la técnica de extracción tipo Soxhlet (AOAC 991.36).Equipo Equipo manual o semiautomático para extracción (tipo Soxhlet). Estufa de aire. Balanza analítica. Mortero o molino (de preferencia con recirculación de agua para evitar el calentamiento de la muestra). Baño maría. Desecador. Campana de extracción.Materiales Espátula. Vasos recomendados por el fabricante para el sistema de extracción. Dedales de extracción de celulosa. Mortero. Papel filtro.Reactivos Éter etílico o éter de petróleo. Note que las variantes con cloroformo metanol, pueden ser más eficaces, ya que extraen hasta 30% más grasa en un menor tiempo.

Preparación de las muestras Homogenizar las muestras de carne en un mortero o molino. Secarlas a 103-105 °C en estufa de aire forzado y determina el porcentaje

de materia seca (si se quiere reportar los resultados en base seca).Metodología

Moler y pesar porciones de 2 a 5 g de la muestra seca por duplicado. Colocarlas en el dedal de extracción previamente pesado (M). Pesar los vasos para extracción del sistema de extracción utilizado,

previamente secados y tarado a 102-105 °C por 30 min (M1). Adicionar un volumen apropiado de éter etílico o de petróleo, o la mezcla

cloroformo-metanol 2:1 en el vaso, y colocarla en el sistema de extracción. Dependiendo de la eficiencia del equipo y de si se trabajó o no con presión

modificada, el proceso de extracción puede variar desde 40 min, hasta 6 horas en el equipo de extracción (Fotografías 19 y 20), a una velocidad de condensación de 3 a 6 gotas/seg.

Una vez terminada la extracción, eliminar el solvente por evaporación en rotaevaporador o baño maría bajo campana, hasta que no se detecte olor a éter en los vasos que contienen la grasa extraída.

Secar el vaso de extracción con la grasa en estufa a 103+ 2 °C por 20 a 30 min.

Enfriar en desecador y pesar hasta peso constante (M2).CálculosEl porcentaje de grasa cruda se calcula de la siguiente manera:% grasa cruda = [(M2 – M1)/M] x 100Donde:M = peso de la muestraM1= peso del vasoM2= peso del vaso con la grasa extraída

La concentración de grasa también puede expresarse como porcentaje de grasa en base húmeda, para lo cual se realiza el cálculo de acuerdo a lo siguiente:% grasa cruda en base húmeda = [(100 - % humedad) X %grasa cruda] /100% grasa cruda en base seca = % grasa cruda x [100/(100-% humedad)]Los valores obtenidos se promedian para obtener la concentración de la muestra, donde la diferencia de los tres resultados no debe ser superior al 2% respecto al promedio obtenido como resultado.

Determinación del contenido de humedad/materia secaLa carne contiene aproximadamente entre un 70 y 75% de agua, de la cual el 70% es agua libre que se encuentra entre los espacios de los filamentos de actina y miosina, el otro 5% es agua ligada a proteínas. Cuando se hace la determinación de humedad principalmente lo que se mide es el agua libre.El análisis del contenido de humedad o de materia seca, es en el análisis bromatológico probablemente el más frecuentemente realizado, debido a que permite conocer el grado de dilución de los nutrimentos o componentes de la muestra (Bradley, 2003). A diferencia de las determinaciones de capacidad de retención de agua y pérdida por goteo, el análisis de humedad permite conocer el contenido total de agua en la muestra. La determinación de la humedad, se basa en la pérdida del agua por efecto del calentamiento en estufa con condiciones de aire forzado. Para la determinación de materia seca en carne, se utiliza el método oficial de la AOAC 950.46. En caso de muestras altas en grasa debe considerarse el secado previo de la muestra, utilizando de preferencia una estufa con vacío a 70 °C para prevenir un exceso de pérdida de peso debido a la evaporación y oxidación de ácidos grasos (Hui et al., 2001). El método gravimétrico que emplea una estufa, es ampliamente utilizado, sin embargo, existen otros métodos basados en el calentamiento con microondas o rayos infrarrojos. También pueden utilizarse métodos no destructivos y rápidos, como los basados en la espectroscopia de cercano infrarrojo (NIR) y la resonancia magnética nuclear (RMN).Equipo Estufa de aire con convección mecánica, preferentemente que alcance 105 °C. Balanza analítica (precisión 0.1 mg).

Desecador (deshidratante eficaz).Materiales Espátula. Crisoles identificados a peso constante. Pinzas para crisoles.Metodología

Pesar cuidadosamente 10 g de cada muestra, previamente homogeneizada, en los crisoles.

Colocar en una estufa, a una temperatura de 105 ºC durante15 a 18 h. Sacar las muestras de la estufa (Fotografía 15) y colocarlas en un

desecador durante 30 min por lo menos, o hasta que alcancen la temperatura ambiente.

Pesar cada muestra. Registrar su peso en una bitácora y repetir las operaciones de secado hasta

que alcance un peso constante. Se recomienda efectuar al menos tres determinaciones sobre la misma

muestra.La diferencia entre los resultados de las repeticiones no debe ser superior a 0.1 g de agua por 100 g de muestra (0.1%).

CálculosLos porcentajes de materia seca (%MS) o humedad (%H) se calculan por diferencia de pesos, de la siguiente manera:MS = [Peso de la muestra seca (g) / peso de la muestra húmeda (g)] x 100% H = 100 - % MS

3.2 Determinación del contenido de cenizasLa carne es una buena fuente de minerales altamente digestibles y que son relevantes en una dieta balanceada. Por ejemplo, el hierro es un nutriente esencial para la salud, el zinc es esencial para el crecimiento y también contiene cantidades significantes de sodio, potasio y magnesio.Las cenizas son conformadas por los residuos después de incinerar u oxidar completamente la materia orgánica de la carne; tanto el agua como los ácidos volátiles se evaporan, y las sustancias orgánicas se queman en presencia del oxígeno del aire, hasta convertirse en CO2 y óxidos de nitrógeno.La mayoría de los minerales se convierten en óxidos, sulfatos, fosfatos, cloruros y silicatos; sin embargo, elementos como el Fe, Se, Pb y Hg se pueden volatilizar, lo que debe considerarse si se tiene interés en un análisis secuencial para la determinación de estos minerales, para lo cual sería más recomendable un procedimiento de cenizas húmedas. Se considera que para la determinación de la cantidad de cenizas en muestras de carnes con alto contenido de grasa es necesario secar y extraer la grasa antes de realizar el análisis de cenizas (Marshall, 2010).Equipo Balanza analítica (precisión 0.1 mg). Horno mufla (que alcance al menos 800 °C). Estufa.

Desecador (agente deshidratante en óptimas condiciones).Materiales Espátula. Pinzas para crisoles. Crisoles (resistentes a la temperatura de uso y a los cambios de temperatura).

Metodología (AOAC 900.02) Pesar 10 g de muestra húmeda o 1.5 g si es muestra seca y desengrasada,

en crisoles previamente tarados. Colocar los crisoles en una mufla a 550 ºC durante al menos 12 horas (o

hasta observar que las cenizas están completamente de color blanco) (Fotografía 16).

Sacar los crisoles de la mufla e introducirlos en una estufa a 105 ºC por 1 h. Introducir los crisoles con las cenizas en un desecador hasta alcanzar

temperatura ambiente Pesar los crisoles conteniendo las cenizas hasta alcanzar el peso

constante. Se aconseja efectuar al menos dos determinaciones de la misma muestra.

La diferencia entre ambos resultados no deberá ser superior a 0.1 g de ceniza por 100 g de muestra.

Cálculos% cenizas = [Peso de las cenizas (g) / Peso de la muestra fresca o seca (g)] x 100