Metilación de ADN y respuesta ambiental en especies forestales

Enrique Sáez LagunaDpto. de Ecología y Genética Forestal

I Maratón Científico CIFOR-INIA

Extinción

Cambio climático

• Aumento de las temperaturas medias globales con periodos de sequía más largos y duros.

• Cambio rápido en términos histórico-evolutivos

Adaptación necesaria para

sobrevivir

Posibilidades en la respuesta adaptativa de las especies forestales

Migración

Variabilidad genética + plasticidad

fenotípica

DEMASIADO

DRÁSTICO

DEMASIADO

LENTO

¿Para qué sirve?Mecanismo epigenético de regulación de la expresión génica asociado a silenciamiento génico por cambios en la estructura de la cromatina. Interviene en procesos como:- Regulación de la transcripción- Impronta genética- Poliploidización- Control de elementos móviles- Silenciamiento de transgenes

Citosina 5-metil-Citosina

Metiltransferasas(MET1, CMT, DRM)

¿Qué es?Modificación química covalente consistente en la adicción de grupos metilo a nucleótidos de citosina. Es llevada a cabo por enzimas metiltransferasas.

Metilación de ADN

Epigénesis:Mecanismo que controla el desarrollo y la respuesta de la planta al medioambiente.

Estudio de la metilación en especies forestales

Fagus sylvatica L.: distribución euroasiática. Dos poblaciones con respuestas diferentes a estrés hídrico:

- Población española (Hayedo de Montejo), límite sur de la distribución de la especie- Población sueca (sur de Suecia), limite norte de la distribución

Diseño experimental: plantas control (humedad sustrato al 30%) frente a plantas sometidas a sequía (humedad sustrato al 13% , 45 días)

Pinus pinea L.: distribución mediterránea. Especie caracterizada por una variabilidad genética prácticamente nula y una elevadaplasticidad fenotípica.Material: Cinco poblaciones representativas de la distribución de esta especie en España:

- Poblaciones costeras: Doñana, Palafrugell y Bihar- Poblaciones de interior: Tordesillas y Borraga

Empleo de material propagado vegetativamente en el ensayo.

Estudio de la metilación en especies forestales

Palafrugell

Bihar

Bogarra

Doñana

Tordesillas

Método de estudio: análisis de la variabilidad y de los patrones de metilación

Técnica: Polimorfismos de amplificación sensitivos a metilación (M-SAP). Conceptualmente similar a

la técnica de AFLPs.

-Digestión de ADN utilizando enzimas cuyo corte esta condicionado por el estado de metilación de las secuencias diana

EcoRI HpaII

5’mCCGGGGCCm5’

5’CmCG GG GCmC5’

Metilacióncompleta

5’mCCGGGGCC5’

5’CmCGGG GCC5’

hemimetilación

Fragmentos de restricción

Adaptador de EcoRI

Adaptador deHpaII/MspI

Ligación de adaptadoresPrimers de preselección

Preamplificación

Productos de preamplificación

Primers selectivos marcados

Amplificaciciónselectiva

Productos de PCR finales

EcoRI MspI

5’mCCGGGGCCm5’

5’ mCCGGGGCC

C externametilada

5’CmCG GG GCmC5’

5’CmCGGG GCC5’

C internametilada

5’ GAATTCCTTAAG 5’

5’ GAATTCCTTAAG 5’

Separación por PAGE y visualización

-unión de adaptadores para posibilitar la amplificación.

- uso de primers con nucleótidos de selección (reducción del número de fragmentos amplificados) y marcados con un fluorocromo.

- visualización de fragmentos en analizador LiCor.

- análisis de fragmentos

Estudio de la metilación en especies forestales

- Identificación de MSAPsasociados con población y con respuesta a sequía.

Fagus sylvatica L.

- Diferencia significativa de los patrones de metilación entre las poblaciones (Fst=0,16).

-No hay diferencia significativa entre los niveles de metilación de los dos tratamientos.

Suecia España

Diana de restricción CCGG Sequía Irrigación Sequía Irrigación

Citosinas internas metiladas

30.5 ± 3.2% 31.0 ± 2.8% 30.8 ± 2.5% 30.1 ± 2,1%

Citosinas externas hemi-metiladas

1.4 ± 1.0 % 1.6 ± 1.0% 1.2 ± 1.1% 2.4 ± 1.7%

Total 31.9 ± 3.0% 32.6 ± 3.0% 32.0 ± 2.7% 32.5 ± 2.6%

AMOVA Locus a Locus

Locus % Variación

entre poblaciones

% Variación entre

tratamientos

120 -14.93 31.10

127 -11.41 17.80

12 -14.63 22.98

100 -4.52 41.83

20 -0.28 15.38

26 67.08 -2.59

50 67.08 -2.59

87 57.83 -3.51

29 52.31 -1.67

126 46.42 -0.56

79b 43.37 11.66

42 42.44 -4.54

1 5 6 7 10 11 13 14 15 19 8 20 21 23 26 27 33 34 36 38 39 40 41 42 44 47 48 49 1 2 5 9 11 12 14 16 17 18 19 20 21 24 25 26 33 35 37 38 40 41 42 43 46 49 50

Combinación de primers

EcoRI-AAC HpaII-AAT

EcoRI-AAC HpaII-ATC

EcoRI-AAC HpaII-ACT

EcoRI-ACG HpaII-ACT

Totales

Nº total de fragmentos MSAP 48 60 64 63 235

Nº de fragmentos analizados 30 54 45 59 188Polimorfismos insensibles a metilación (genéticos) 2 16 1 10 29

Marcadores sensibles a metilación

Polimórficos 21 26 29 29 105

Monomórficos 0 0 0 4 4

Marcadores monomórficos 7 12 15 16 50

EcoRI/MspI EcoRI/HpaIISweeden Spain Sweeden Spain

- 55% de MSAPs polimórficos frente al < 1% AFLPs polimórficos.

- Identificación de marcadores específicos de individuos!

Pinus pinea L.

M-SAP Combinaciones de primers

EcoRI-AAC HpaII-AAT

EcoRI-ACA HpaII-AAT

Totales

Nº MSAPs totales 123 86 209

Nº MSAPs analizados 69 66 135

Nº MSAPs polimórficos 41 34 75

Nº MSAPs monomórficos 28 32 60

% Polimorfismo 59.42% 55.55% 55.55%

AFLP Combinaciones de primers

EcoRI-ACC MseI-CAT

EcoRI-ACC MseI-CCA

EcoRI-ACG MseI-CCA

Total

Nº AFLPs totales 33 34 40 107

Nº AFLPs analizados 33 34 40 107

Nº AFLPs polymórphicos 0 1 0 1

Nº AFLPs monomórficos 33 33 40 106

% Polimorfismo 0 2,9% 0 0.93%

EcoRI-ACA HpaII-AAT EcoRI-ACG HpaII-CCA

¡Muchas gracias!

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