Metanobacterias y biometanación

Introducción

Por cerca de medio siglo, la vida fue clasificada al más alto nivel en dos taxones, procariotas y eucariotas, sobre la base de las características fenotípicas celulares que incluyen la presencia o ausencia de membranas nucleares, organelos o paredes celulares (Rasche and Ferry 2005).

Se han publicado varias revisiones sobre la taxonomía de los metanógenos desde finales del siglo pasado, luego del conocimiento de las propiedades bioquímicas y genéticas únicas de estos organismos que llevaron al concepto de Achaebacteria al final de los setenta (Garcia 1990). Sin embargo, no fue sino hasta 1990 que un enfoque molecular, basado en la comparación de las secuencias ribosomales 16S de RNA, reveló que todas las formas de vida se dividen en tres divisiones primarias (dominios) de la vida: la Eucarya, que abarca a todas las eucariotas, las Bacteria (o Eubacteria), incluyendo a las Eubacteria "típicas", y las Archaea (o Archaebacteria). Las Archaea comprenden cuatro reinos: Euryarchaeota, Grenarchaeota, Korarchaeota, y el recientemente descrito Nanoarchaeota. En término evolucionarios, los dos dominios procarióticos son más genéticamente distintos unos de otros que uno de los grupos, los Archaea, a partir de los Eucarya. Los más grandes, diversos, y bien estudiados representantes de los Archaea son los anaerobios productores de metano (methanoarchaea), que proveyeron las primeras pistas que condujeron al descubrimiento del concepto de los tres dominios. Las methanoarchaea son miembros de los Euryarchaeota. La investigación sobre los methanoarchaea durante las pasadas dos décadas han impactado grandemente sobre nuestra comprensión de la ecología, fisiología, y bioquímica de los Archaea (Rasche and Ferry 2005).

El rumen bovino y los metanogénicos

Numerosos investigadores han demostrado que se forma mucho metano en el rumen, sugiriendo que las bacterias metanogénicas (archae metanogénicas) son abundantes en este entorno (Bryant and Boone 1987; Attwood et al. 2011). Los géneros metanogénicos responsables de la producción de CH4 incluyen un gran grupo que carece de representantes cultivados (Attwood et al. 2011). La información sobre su naturaleza fue escasa incluso a mediados del siglo pasado, así como la abundancia de estos organismos. La importancia de las bacterias metanogénicas en el rumen y el hecho de que éstas son los principales componentes bacteriales conocidos que eludieron largo tiempo el cultivo puro, estimuló a los investigadores a aislar los tipos predominantes en cultivos puros (Bryant and Boone 1987).

El hidrógeno y dióxido de carbono son los principales sustratos de la metanogénesis en el rumen. El hidrógeno puede ser liberado a las bacterias metanogénicas por las bacterias hidrogénicas. Se han reportado datos (Vogels, Hoppe, and Stumm 1980) que indican que esta interacción metabólica esta acompañada por una interacción somática entre bacterias metanogénicas y ciliados pertenecientes a la familia Ophryoscolecidae (orden Entodiniomorphida).

El conocimiento de las características de las bacterias metanogénicas del rumen ha requerido de investigaciones que en un primer momento aportaron como características los resultados de la tinción de Gram, características morfológicas, y condiciones de crecimiento (pH, temperatura, sustrato) (Paynter and Hungate 1968).

Por otro lado, y con objeto de reducir las emisiones de CH4 de los rumiantes, se ha señalado (Attwood et al. 2011) que las tecnologías deben tener como objetivo todos los metanogénicos del rumen para prevenir cualquier metanógeno afectado se expanda para ocupar el nicho vacante. Las

intervenciones también deben ser específicas para los metanógenos de modo que otros microbios del rumen puedan continuar las funciones digestivas normales. Ésto requiere un conocimiento detallado de la diversidad y fisiología de los metanógenos del rumen para definir características de conservación que puedan ser objeto de inhibición metanógena. Los proyectos de secuenciación del genoma están en marcha en Nueva Zelanda y Australia (Attwood et al. 2011) sobre muchos grupos metanógenos ruminales, incluyendo representantes del género Methanobrevibacter, Methanobacterium, Methanosphaera, Methanosarcina, y el grupo subcultural, Rumen Cluster C. El genoma completado de Methanobrevibacter ruminantium y los proyectos de secuencias de otras especies metanogénicas del rumen empiezan a permitir la identificación de procesos celulares subyacentes que definen a estos organismos, y esto lleva a una mejor comprensión de sus estilos de vida en el rumen. A pesar de que las investigaciones están principalmente en la etapa explorativa, están surgiendo dos tipos de oportunidades para inhibir los metanógenos, cuando éste es el objetivo, siendo el primero la inactivación de las enzimas conservadoras de los metanógenos por screening de los mismos, y el segundo el diseño de pequeños inhibidores vía enfoque quimiogenómico, e identificando proteínas de superficie comunes a los metanógenos del rumen que pueden ser usados como anticuerpos en vacunas anti-metanógenas.

Las excretas bovinas también ha sido empleado como inóculo en fermentadores de desechos agroindustriales, y la aclimatación de los metanógenos que contiene ha sido estudiada (Goberna et al. 2010), mostrando que Methanosarcina domina en la excreta inicial, y durante la codigestión a 37°C; mientras que el aumento de temperatura (y de presión parcial de gas hidrógeno) genera un crecimiento explosivo de otros metanógenos (Methanobacterium, Methanoculleus, Methanothermobacter, y un grupo de archaea no cultivadas). En todo caso, Methanosarcina fue el metanógeno más versátil, y aún queda por estudiar si hay un vínculo entre el incremento de la diversidad metanogénica y la productividad del reactor.

Metanogénicos en el lodo de biodigestores

Empleando excretas de bovino, se ha obtenido una alta riqueza filogenética en los lodos, con representantes de tres los cuatro órdenes taxonómicos encontrados en digestores (Goberna et al. 2010). Se han aislado también especies de Methanobacterium de biodigestores de aguas residuales domésticas, y establecido sus condiciones de crecimiento (Bryant and Boone 1987).

Durante el crecimiento de Methanobacterium thermoautotrophicum en un fermentador fed-batch, las células se enfrentan a la disminución constante de la concentración del suministro de energía de hidrógeno. Con el objeto de investigar cómo el organismo responde a estos cambios, se examinaron las propiedades metanogénicas de células recolectadas en diferentes fases de crecimiento (Pennings et al. 2000). En el estudio mencionado se determinaron también los niveles celulares de varias isoenzimas metanogénicas y enzimas funcionalmente equivalentes. Se halló cómo las células mantienen las tasas de metanogénesis por disminución de su afinidad por hidrógeno: el KH2m disminuye al pasar de la fase exponencial a la fase estacionaria. Simultáneamente, la tasa máxima específica de producción de metano cambia. Los niveles de H2-dependiente metenil-tetrahidrometanopterin deshidrogenasa (H2-MDH) y la coenzima M reductasa isoenzima II (MCR II) decrecen a la entrada de la fase estacionaria. Las células que crecen en condiciones que favorecen la expresión de MCR II tienen altos niveles de MCR II y H2-MDH, mientras que en las células que crecen en condiciones que favorecen MCR I, los niveles de MCR II y H2-MDH fueron mucho menores y las células tuvieron una incrementada afinidad por el hidrógeno durante todo el ciclo de crecimiento. Se encontró que el uso de tiosulfato como medio reductor tiene un efecto negativo sobre los niveles de MCR II y H2-MDH. De éstos resultados se concluye que M. thermoautotrophicum responde a las variaciones en la disponibilidad de hidrógeno y otras condiciones ambientales (pH, temperatura de crecimiento, medio reductor) mediante la

alteración de su fisiología. La adaptación incluye, entre otros, la expresión diferenciada de las isoenzimas MDH y MCR.

La temperatura de fermentación de un biodigestor, pueden no impedir el aislamiento de metanógenos de diferente comportamiento en el lodo, así, un Methanobacterium autotrófico termofílico (cepa CB12, DSM 3664) fue aislado de un digestor mesofílico de biogas (Zhao et al. 1986). Su temperatura óptima (56°C) fue menor a las de otros miembros termofílicos del género Methanobacterium, también se observó su velocidad específica de crecimiento máxima como de 0,564 h ¹ (tiempo de duplicación de 74 minutos). Otro estudio ⁻ (Patel, Sprott, and Fein 1990) aisló la cepa bacterial GP9T (T = tipo de cepa) de una bacteria metanogénica mesofílica, no móvil, no formadora de esporas, del lodo primario obtenido de las instalaciones de tratamiento de residuos de una gran fábrica de pasta de papel kraft en Canadá. Las células individuales fueron de 6,0 por 0,8 µm y tiñeron como gram positivas. El crecimiento y producción de metano se produjo únicamente con H2-CO2 como sustrato. El acetato , formato, propionato, butirato, piruvato, metanol, o trimetilamina no pudieron servir como única fuente de carbono y energía para el crecimiento. El pH óptimo de crecimiento estuvo entre 5,6 y 6,2; no se observó crecimiento consistente y producción de metano por debajo de pH 4,68. La temperatura óptima de crecimiento fue de 35°C. Por otra parte, el sobrenadante del lodo primario aumentó el crecimiento en cerca de 10%.

Como se mencionó anteriormente, los metanógenos se han empleado en bioremediación. Así un estudio (Cabirol et al. 1998) derivó un consorcio metanogénico y sulfato reductor que desclora y mineraliza altas concentraciones de PCE, a partir de lodo digerido de forma anaerobia de una planta de tratamiento de residuos (Bourg-en-Bresse, Francia).

Búsqueda de metanobacterias en la actualidad

En nuestro siglo se siguen realizando aislamientos de metanógenos en ambientes o ecologías regionales no estudiadas, pero que permiten sospechar su presencia. Tales estudios han realizado pruebas piloto de producción de metano con los géneros hallados, así como determinado métodos para su conservación (Acuña González et al. 2008). Otros, describen las características de cepas específicas de metanobacterias, que pueden diferir en cuanto a condiciones de crecimiento (temperatura, pH) las unas respecto a las otras (Maestrojuán and Boone 1991).

Técnicas como las micrografías electrónicas con tinción negativa han revelado una nueva característica de metanógenos, así, se descubrió que la cepa O1M9704 de Methanosarcina mazei cuenta con vacuolas de gas y una estructura tubular extendida fuera de las células. La estructura tubular y vacuolas de gas, como las mencionadas en el estudio anterior, pueden beneficiar la adaptación de methanoarchaea en entornos de estuarios (M.-C. Lai et al. 2000). Más recientemente, el secuenciado genómico, el desarrollo de sistemas genéticos e investigaciones sobre la biología molecular de los methanoarchaea ha expandido significativamente nuestro conocimiento del dominio Archaea (Rasche and Ferry 2005). Para el nombramiento de las bacterias aisladas, se han empleado métodos como la composición base de ADN, características fisiológicas, tipificación por inmunofluorescencia indirecta, y estudios de hibridación ADN-ADN (Patel, Sprott, and Fein 1990). Los métodos modernos también se vienen empleando en la identificación de cepas aisladas, como se dijo, de nuevos ambientes o ecosistemas (M.-C. Lai et al. 2000), donde ha sido especialmente importante la comparación de las secuencias de 16S rDNA para las comparaciones filogenéticas.

Aplicaciones industriales de las metanobacterias

Importantes factores económicos han colocado a estas bacterias en un primer plano, incluyendo la necesidad de desarrollar formas alternativas de energía, control de la polución xenobiótica, el mejoramiento del rendimiento cárnico en la industria ganadera, la distinción entre la

generación biológica y termocatalítica del petroleo, y la distribución del metano en la atmósfera de la tierra (Garcia 1990).

Las bacterias metanogénicas también se han empleado en bioremediación de materiales peligrosos. El tetracloroetileno (PCE) es un compuesto tóxico esencialmente usado como desengrasante y solvente de limpieza en seco. Un estudio (Cabirol et al. 1998) aisló una bacteria metanogénica, cepa FR, de un consorcio aclimatado en lodos de una planta de tratamiento de residuos. Sobre la base de las características morfológicas y fisiológicas, la cepa FR fue clasificada en el género Methanosarcina. El análisis de filogenia con la secuencia de gen 16S rRNA revela que la cepa FR esta altamente relacionada con Methanosarcina mazei y Methanosarcina frisia (99,6 y 99,5% de identidad, respectivamente). Fueron descloradas completamente altas concentraciones (50-87µM) de PCE por cultivos de la cepa FR a la tasa de 76mM·mg de proteína ¹·día ¹. La⁻ ⁻ descloración de PCE produjo un compuesto no identificado. Los experimentos de rastreo con [¹³C]PCE revelan que el producto fue un no clorado. La decloración de PCE a tricloroetileno era todavía activa en presencia de extracto de células hervidas de la cepa FR. Sin embargo, no se observó una posterior decloración. Este resultado sugiere que un cofactor antes que un sistema enzimático, es responsable de la primera decloración de PCE. Las fracciones de la decloración activa purificadas del extracto de células sobre una columna XAD-4 revelan la presencia de F420, F430 y factores cobamidas. Éste fue el primer reporte del aislamiento de una bacteria metanogénica con la capacidad de declorar altas concentraciones de PCE a un producto no clorado.

Las bacterias metanogénicas obtienen su energía mediante la producción metabólica de gas metano, utilizando sustratos como dióxido de carbono, acetato y sustratos de metilo a través de procesos de hidrólisis y acetogénesis y son esenciales en la degradación anaerobia de la materia orgánica en la naturaleza (Acuña González et al. 2008).

El proceso de metanogénesis

Generalmente se atribuye al físico italiano Alessando Volta el descubrimiento de la producción de metano biológico (gas natural), metanogénesis, hace más de 130 años atrás. En el desempeño del "Experimento Volta", perturbó el sedimento del lago Cono al norte de Italia con un polo que libera las burbujas de metano atrapadas. El encendido del gas produjo una flama que él llamó "aire combustible". La figura 1 muestra un experimento Volta algo más actualizado, en que el gas del sedimento de un estanque de agua dulce es recolectado en un embudo invertido sumergido en la columna de agua y encendido a su liberación por inclinación del embudo (Rasche and Ferry 2005).

El proceso de metanogénesis requiere un consorcio de al menos tres grupos interactuantes metabólicos de microorganismos estrictamente anaerobios (figura 2). El grupo fermentativo descompone la celulosa y otras moléculas complejas a ácidos carboxílicos y gas hidrógeno (Rasche and Ferry 2005). Únicamente el acetato, dióxido de carbono, hidrógeno y formato son los principales sustratos para los methanoarchae (Rasche and Ferry 2005). La producción de metano a partir de acetato es un paso importante en el proceso de digestión anaeróbica, ya que es bien conocido que el acetato es el principal intermediario en la bioconversión de la materia orgánica a metano y dióxido de carbono (Wandrey and Aivasidis 1983), y que cerca del 70% del total de metano producido en digestión anaeróbica se origina a partir del acetato (Fukuzaki, Nishio, and Nagai 1990; Rasche and Ferry 2005); así, el grupo acetogénico productor de hidrógeno es necesario para favorecer la metabolización de butirato y propionato a sustratos para las methanoarchaea (Rasche and Ferry 2005).

El ácido acético ha sido considerado como un sustrato deseable, y se ha ensayado el crecimiento de Methanosarcina barkeri (DSM 804) sobre el mismo (Wandrey and Aivasidis 1983). El ácido acético por sí mismo causa demanda química de oxígeno (COD) en el agua de desecho de importantes procesos industriales, por ejemplo, en la industria del papel y pulpa. Aquí en el

Figura 1: Un experimento Volta contemporáneo

Figura 2: Un esquema que muestra el flujo de carbono a través de los tres principales grupos metabólicos de anaerobios involucrados en la conversión de materia orgánica compleja a metano en ambientes de agua dulce

condensado de la concentración del licor de sulfito agotado, el ácido acético se encuentra como casi la única forma de carbón. Tales aguas de desecho "destiladas" son muy apropiadas para la transferencia de resultados con el modelo de agua de desecho a un caso de importancia práctica (Wandrey and Aivasidis 1983). Además, desde que únicamente pocos microorganismos pueden crecer de forma anaeróbica con ácido acético como única fuente de carbono, tal cultivo es potencialmente autoestéril.

Generalmente el acetato se forma vía fermentación de azúcares y aminoácidos o vía oxidación de ácidos grasos volátiles. Se convierte a metano y dióxido de carbono por metanógenos aceticlásticos, es decir, Methanosarcina spp., y Methanothrix spp. Por lo tanto, en el lodo de digestión, una especie con un uso más efectivo del acetato, dejaría fuera de competencia a las otras por el acetato, dependiendo de la concentración de acetato. Se ha demostrado que los cambios en la composición de la población aceticlástica metanogénica ocurren cuando el tiempo de retención o la velocidad de alimentación se ajusta para mantener la concentración de acetato alta o baja. Así, en el lodo de digestión, una especie con un uso más efectivo del acetato, dejaría fuera de competencia a las otras por el acetato, dependiendo de la concentración de acetato. Se ha demostrado que los cambios en la composición de la población aceticlástica metanogénica ocurren cuando el tiempo de retención o la velocidad de alimentación se ajusta para mantener la concentración de acetato alta o baja (Fukuzaki, Nishio, and Nagai 1990).

Las methanoarchaea emplean dos vías separadas en que el metano se deriva tanto del grupo metil del acetato (reacción 1) o de la reducción del dióxido de carbono con electrones del hidrógeno o formato (reacciones 2a y 2b) (Rasche and Ferry 2005). El H2 es un donante de electrones clave para muchos microorganismos anaeróbicos; por lo tanto, ocurre una fuerte competencia por el H 2

entre los grupos que los utilizan. Se han estudiado los parámetros de la cinética de Monod (Karadagli and Rittmann 2005) dado que proveen información esencial para el análisis cinético de la competencia por H2.

Pasos comunes a las dos principales vías de metanogénesis

Los pasos mostrados en la figura 3 son comunes a las dos principales vías para la producción de metano en la naturaleza, reducción de dióxido de carbono y fermentación de acetato. Las dos vías difieren principalmente en la manera por la que un grupo metil se genera y pasa al cofactor tetrahidrometanopterin (H4MPT) para formar CH3-H4MPT. La conversión de CH3-H4MPT a metano es esencialmente la misma en ambas vías. El paso 1 en la figura 3 es catalizado por N⁵-metiltetrahidrometanopterin: coenzima M metiltransferasa, que ha sido recientemente revisada. La metiltransferasa es un complejo integral unido a la membrana que también funciona generando un gradiente de iones sodio a través de la membrana y acoplado a la reacción de la metil transferasa. La enzima como se caracteriza desde Methanobacter marburgensis y Methanosarcina mazei contiene un cofactor corrinoide, cobalamina (5'-hidroxibenzimidazolil cobamida), que acepta el grupo metil de CH3-H4MPT en la primera de las dos reacciones parciales catalizadas por la enzima. La segunda reacción parcial involucra la transferencia del grupo metilo desde CH3-cobalamina a coenzima M (HS-CoM) produciendo CH3-S-CoM. El complejo metiltransferasa contiene ocho subunidades no identificadas (MtrA-H). MtrA contiene al cofactor cobalamina sobresaliendo en el citoplasma que se somete a la metilacion y desmetilación. Esto propone que la metilación es catalizada por MtrH y la desmetilación por MtrE, que también translocaliza iones sodio. El mecanismo de translocación se cree que involucra cambios conformacionales inducidos en MtrA

por metilación y desmetilación que son transmitidos a MtrE, que impulsa la translocación. El crecimiento de las methanoarchaea utilizando cualquiera de las dos vías es dependiente del sodio, y se propone utilizar gradientes de sodio para las funciones energéticas (Rasche and Ferry 2005).

La metil-coenzima M-reductasa cataliza el paso 2 en la figura 3. El donante de electrones es la coenzima B (CoB) y además de metano se produce el heterodisulfuro CoM-S-S-CoB. Methanothermbacter marburgensis y Methanothermobacter thermoautotrophicus contienen dos isoenzimas (MCRI y MCRII) con masas nativas moleculares de aproximadamente 300 kDa compuestas de tres diferentes subunidades con masas moleculares de 65 (α), 46 (β), y 30-35 (γ) kDa en una configuración α2β2γ2. La estructura cristalina de la isoenzima MCRI de M. marburgensis muestra la coenzima F430 (F430) posicionada al fondo de un canal estrecho en dos sitios activos independientes separados por aproximadamente 50 Å. Los dos sitios activos están formados por residuos de las unidades αα'βγ o α'αβ'γ' indicando que dos trímeros son necesarios para formar los sitios activos. Las estructuras, acomplejadas ya sea con HS-CoM más HS-CoB o CoM-S-S-CoB, han sido las bases para un mecanismo de reacción propuesto. Las posiciones relativas de CoM, CoB, y F430 en la estructura cristalina sugiere un ataque nucleofílico de [F430]Ni(I) sobre CH3-S-CoM que forma el intermediario [F430]Ni(III)-CH3. En el próximo paso, [F430]Ni(III) oxida HS-CoM produciendo el radical thiyl ·S-CoM y [F430]Ni(II)-CH3. En el paso final, la protonólisis de [F430]Ni(II)-CH3 libera metano y el radical thiyl se acopla a S-CoB para formar el⁻ heterodisulfuro (CoB-S-S-CoM) acompañado por una reducción de un electrón de Ni(II) al estado activo redox. La unión de CoM induce cambios específicos conformacionales que aseguran la entrada de CH3-S-CoM adyacente a F430 y antes de la entrada de CoB en el estrecho canal del sitio activo (Rasche and Ferry 2005).

La heterodisulfuro reductasa cataliza el paso final en la figura 3 liberando las formas activas sulfhidrilo de los cofactores. La enzima se compone de dos subunidades (HdrDE). La más pequeña HdrE es un citocromo tipo b conteniendo hemes de bajo y alto spin. HdrE acepta electrones de metanofenacina, un componente de la cadena de transporte de electrone unido a la membrana. HdrE dona electrones a HdrD, que contiene dos centros Fe4-S4, uno de los cuales es el sitio activo propuesto junto con un disulfuro redox-activo de dos cisteínas. De la otra mano, se ha propuesto a partir de experimentos cinéticos con la heterodisulfuro reductasa de Methanosarcina thermophila que el heme de bajo potencial está involucrada en la reducción de heterodisulfuro. En ambas vías, la reducción del heterodisulfuro está unida a la formación de un gradiente electroquímico de protones que lleva a la síntesis de ATP catalizada por una ATP sintetasa tipo A1A0. Existe la hipótesis de que un gradiente de protones es generado a través de la membrana en un mecanismo en que los protones son translocalizados desde la metanofenacina al heterodisulfuro (Rasche and Ferry 2005).

Figura 3: Pasos comunes a las dos principales vías de metanogénesis

Desarrollos en biometanación

A pesar de la creciente importancia de la digestión anaeróbica, se sabia poco sobre los datos cinéticos de los microorganismos importantes. Con objeto de obtener un diseño fiable de los reactores de tratamiento y a fin de identificar factores limitantes, era esencial evaluar tales datos cinéticos por medio de mediciones apropiadas. Tales experimentos debían ser llevados a cabo continuamente en un quimiostato a fin de establecer condiciones reproducibles. Se usaron cultivos puros, de modo que además de las condiciones de reacción, las "condiciones de catálisis" estén también bien definidas (Wandrey and Aivasidis 1983).

Con el propósito anterior, la investigación sobre la cinética de los metanógenos de interés ha sido objeto de varias investigaciones. Un ejemplo es que se han elaborado modelos experimentales (Karadagli and Rittmann 2007) en batch que describen exactamente el consumo de H2, generación de CH4, crecimiento de biomasa, umbrales de sustrato, y estado de sobrevivencia. Se observó que para Methanobacterium bryantii M.o.H la formación de metano se detiene cuando la energía libre de Gibbs es igual a cero, aunque esto no interrumpe la oxidación de H2. El umbral termodinámico para la oxidación de H2 ocurre cuando la energía libre para oxidar H2 y transferir electrones a la biomasa ya no es negativa, a -0,4 nM. Este umbral no es controlado por la ecuación de energía libre de Gibbs para la metanogénesis de H2 + HCO3, como se muestra en una investigación de los mimos autores (Karadagli and Rittmann 2005). Más allá de este umbral, los microorganismos cambian a un metabolismo de bajo mantenimiento llamado "el estado de sobrevivencia" en respuesta a la extendida necesidad de H2, añadiendo la respuesta de necesidad como otra nueva característica del modelo cinético presentado. También por el modelo obtuvieron un límite cinético (Smin), característica natural de la cinética de Monod, a una concentración de H2 cercana a -2400 nM. Smin

es la concentración mínima de sustrato para mantener la concentración en estado estacionario de biomasa. Este tipo de estudios es útil para interpretar resultados de umbrales y diseñar nuevos estudios para comprender los umbrales y sus implicancias ecológicas.

Investigaciones sobre la bioconversión de celulosa en metano (Miller, Currenti, and Wolin 2000) sugieren que manipulando las diferentes fases de la fermentación de celulosa de forma separada, se pueden balancear efectivamente en la fermentación general, el pH y requerimientos iónicos de la fase de producción de ácido con la fase que usa el ácido.

La búsqueda de formas de mejorar el proceso de obtención de metano por digestión se basa sobre todo en los bioprocesos metanogénicos de las bacterias, y en las condiciones del mismo. Un estudio sobre Methanosarcina barkeri DSM 804 (Banik et al. 2006), revela que cuando se la expuso a la radiación de microondas a frecuencias de 13,5 a 36,5 GHz, mostró un rápido crecimiento en comparación con el cultivo bacterial no irradiado. La concentración de metano en el biogas generado por el cultivo irradiado fue más alta que la del cultivo no irradiado, que fue de 76,3% en el día 15 de la incubación a frecuencia de microondas de 31,5 GHz, 10 dbm de poder cuando se irradió por 2 horas. El estudio microscópico del cultivo puro reveló que las células de M. barkeri fueron mayores en número y sus diámetros celulares aumentaron en 20%.

Las especies de Methanosarcina con una alta velocidad específica de crecimiento (µmax) y alto coeficiente de saturación medio (Ks), y especies de Methanosaeta con bajos µmax y Ks, son los únicos metanógenos aceticlásticos. Debido al bajo Ks de Methanosaeta, las bajas concentraciones de acetato en la digestión anaeróbica mesofílica convencional cede el paso a la dominancia de Methanosaeta. Sin embargo, Methanosarcina absorbe los incrementos de acetato más eficientemente y por lo tanto promueve una digestión más estable. Ya una investigación (Conklin, Stensel, and Ferguson 2006) ensayó la hipótesis que disminuyendo las frecuencias de alimentación del digestor, se puede incrementar la predominancia de Methanosarcina. Para ello se establecieron dos reactores alimentados por acetato a un tiempo de retención de sólidos de 17 días. Un reactor fue alimentado cada hora, y otro fue alimentado una vez al día. Se utilizaron métodos microscópicos y

moleculares para verificar el enriquecimiento del reactor alimentado cada hora con Methanosaeta, y el enriquecido cada día por Methanosarcina. Se midieron las cinéticas del crecimiento y consumo de sustrato para cada reactor. Se simularon las condiciones de sobrecarga del digestor, y se encontró que el reactor enriquecido con Methanosarcina se desempeñó mejor que el enriquecido con Methanosaeta. Éstos hallazgos indican que se puede lograr la dominancia de Methanosarcina con alimentaciones infrecuentes, conduciendo a una digestión y metanogénesis más estable.

Inhibición

En estudios donde se evaluó la digestión de desechos agroindustriales, se ha corroborado el efecto inhibidor de algunos compuestos y elementos. El cobre tiene un efecto inhibidor sobre la actividad metanogénica, e impide la digestión (Goberna et al. 2010) de desechos de olivo, dado el alto contenido que presenta de este elemento. Sin embargo, se ha aislado de un área minera de cobre en Michigan un metanógeno resistente al cobre (B.K. Kim et al. 1996) para el cual los MICs CuSO4 fueron ~2- a 36 veces mayores que para aquellos otros metanógenos probados. El metanógeno en forma de varilla usa H2-CO2 o formato, pero no acetato o metanol, como sustrato de crecimiento. El mantener la incubación con medio H2-CO2 o formato, resultó en una superficie de crecimiento similar a una matriz, dependiente de la presencia de hidrógeno. La presencia de 1 mM de sal cúprica resultó en células entrelazadas y de filamentos más largos. La toma de huellas antigénicas, análisis del gen 16S rRNA, morfología, y uso de sustrato sugieren que el nuevo aislado fue una nueva cepa de Methanobacterium bryantii que es capaz de usar el formato.

Los antibióticos también tienen un efecto inhibidor sobre las metanobacterias. La kanamicina y bacitracina fueron severos inhibidores del crecimiento y metanogénesis de Methanobacterium espanolae sp. nov., aislada de lodo de biodigestión de un planta de papel, mientras que 100µM de ácido bromoetanosulfónico causaron 30% de inhibición (Patel, Sprott, and Fein 1990).

Methanobacterium

Como se ha señalado, en muchas revisiones se han indicado diferentes características de metanobacterias (Kotelnikova et al. 1993) y su clasificación taxonómica. Las tablas 1 y 2 muestran algunas características de especies de Methanobacterium, tomadas de una de estas revisiones (Garcia 1990).

Tabla 1: Características morfológicas y de crecimiento de Methanobacterium

Tabla 2: Uso de sustratos y contenido de DNA de Methanobacterium

Algunas especies de Methanobacterium, como Methanobacterium bryantii M.o.H. tienen únicamente al H2 como su donador de electrones. Esta característica (la utilización de un único donador de electrones) fue aprovechada por un estudio (Karadagli and Rittmann 2005), ya que se evitan las complicaciones de las rutas metabólicas alternas. Tal estudio, empleando un conjunto de experimentos en batch diseñados para proveer los mejores estimados para cada parámetro, obtuvieron los valores de máxima velocidad específica de crecimiento (µmax = 0,77/día), máxima velocidad de consumo de sustrato (qmax = 2,36 mol-H2/g células/día), rendimiento real (Y = 0,325 g células/mol H2), fracción de donantes de electrones a la síntesis (fs° = 0,03 e células/e donados),⁻ ⁻ concentración de sustrato para la media velocidad máxima (Ks = 18000 nM = 18 µM H2), y la tasa endógena de descomposición (b = 0,088/día). Estos parámetros indicaron que, cuando el H2 no es limitante, M. bryantii M.o.H es de crecimiento lento (baja µmax) comparado con otros metanógenos oxidantes de H2 y reductores de sulfato, y esto principalmente debido a su bajo Y real, no a una baja qmax. Los relativamente altos valores Ks y b sugieren que M. bryantii tampoco puede ser un fuerte competidor cuando el H2 es limitante. La cinética clásica de Monod, con modificaciones, ha sido aplicada (Karadagli and Rittmann 2007) a datos experimentales de Methanobacterium bryantii M.o.H para describir el consumo de sustrato, teniendo en cuenta sus límites y modo de supervivencia.

Methanococcus

Como se ha señalado, en muchas revisiones se han indicado diferentes características de metanobacterias y su clasificación taxonómica. Las tablas 3 y 4 muestran algunas características de especies de Methanococcus, tomadas de una de estas revisiones (Garcia 1990).

El

reaislamiento, cultivo, y método de preservación de éstas bacterias ha sido objeto de varios estudios. Varios han aislado bacterias del género Methanococcus en fuentes de agua (Acuña

Tabla 3: Características morfológicas y de crecimiento de Methanococcus

Tabla 4: Uso de sustratos y contenido de DNA de Methanococcus

González et al. 2008). En uno de ellos (Jones and Stadtman 1977), se describen tales métodos para Methanococcus vannielii, y también se señala que el crecimiento del organismo sobre el formato es marcadamente estimulado por concentraciones de los metales selenio y tungsteno.

La mayoría de los Methanococcus son H2 oxidantes. Se han estudiado varias de las especies de éste género, como por ejemplo Methanococcus voltae (Whitman and Ankwanda 1982) de quién se estudió su nutrición y metabolismo de carbono. Ésta bacteria tiene un tiempo de duplicación de 1,2 h a su temperatura óptima de 38°C en medios complejos. En medio definidos, el crecimiento óptimo se obtiene con 0,75 mM de isoleucina, 0,75 mM de leucina, 2,5 mM de acetato, 5 mM de NH4Cl, 84 mM de MgSO4, 0,4 M de NaCl, 1 mM de CaCl2, 10 µM de Fe2O3, y 0,2 µM de NiCl2. En adición, el pantotenato, selenato de sodio, y el cobalto estimulan el crecimiento. El crecimiento óptimo se obtiene a pH entre 6,0 y 7,0 con H2 o formato como donante de electrones. Los ácidos grasos volátiles 2-metilbutirato e isovalerato pueden sustituir a la isoleucina y leucina, respectivamente. El carbón celular se deriva del acetato (31%), isoleucina (22%), leucina (25%), y dióxido de carbono (23%). Los aminoácidos y ácidos grasos son incorporados casi exclusivamente en la proteína. Una comparación realizada en el mismo estudio, entre la incorporación de U-¹⁴C-aminoácidos y 1-¹⁴C-ácidos grasos indica que los ácidos grasos son degradados durante la incorporación en proteína celular. La distribución del carbono de los aminoácidos sugiere que la acetil coenzima A no es un intermediario principal en la degradación de estos compuestos. En consecuencia, M. voltae puede convertir la isoleucina y leucina a otros aminoácidos por un único mecanismo. El carbón lipídico se deriva en gran parte del acetato. Así, los lípidos isoprenoides son sintetizados de nuevo del acetato antes que degradados de la leucina. El carbono en los ácidos nucleicos se deriva del dióxido de carbono (45%), el C-1 del acetato (25%), el C-2 del acetato (22%), y de la isoleucina y leucina (7%). Este patrón de etiquetado es consistente con las rutas bioquímicas conocidas.

Otro estudio (Koval and Jarrell 1987) sobre Methanococcus voltae investigó sobre la ultraestructura y composición química de la pared celular de dicha achaebacteria por tinción negativa y grabado-congelación por microscopía electrónica y por electroforesis con gel de sodio docecil sulfato-poliacrilamida. M. voltae posee una única capa de proteína de estructura regular (RS) externa a la membrana plasmática. Las preparaciones de grabado-congelación de las células indicaron que las subunidades de proteína son organizadas hexagonalmente con un espacio de centro-a-centro de aproximadamente 10 nm. Las proteínas de RS extraídas tuvieron un peso molecular de 76000. Éstas estuvieron presentes en sobres preparados por cizallamiento en una prensa francesa, lisis osmótica o sonicación, como indica la electroforesis con gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida. No se requirió de NaCl para la unión de proteína RS a la membrana plasmática subyacente. Se pudo demostrar el arrego hexagonal por sombreado con platino y grabado-congelación de los sobres, pero falló la tinción negativa en ausencia de NaCl para estabilizar la matriz. Las proteínas RS pueden ser solubilizadas por urea, clorhidrato de guanidina, ditiotreitol, y muchos detergentes, incluyendo Nonidet P-40, Triton X-100, y Tween 20. Sin mebargo, la liberación más específica de la proteína de la pared celular de los sobres ocurre luego de un tratamiento térmico en buffer HEPES (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfónico) de 50 a 60°C.

Methanosarcina

Methanosaeta

El proceso y la automatización de la generación de biogás

Hasta ahora la automatización de la generación de biogás ha pasado por realizar las actividades de monitoreo y control de las principales variables manejables industrialmente en una planta de biometanación, empleando componentes de control (por ejemplo PLC) y de supervisión y adquisición de datos (SCADA), como en el trabajo de