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1 Metagenómica: Secuenciando lo desconocido Lara Rodríguez Ribera Genòmica i Proteòmica 2010 UAB Obtención del genoma de un microorganismo: 1- Aislamiento y cultivo 2- Extracción de DNA 3- Secuenciación 4- Ensamblaje 5- Anotación de genes i elementos reguladores. La mayoría de microorganismos: 1- no pueden ser cultivados 2- viven en comunidades Metagenómica: estudio de ADN genómico obtenido de microorganismos sin cultivar. Estudios filogenèticos PCR 16S rRNA

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1

Metagenómica:Secuenciando lo desconocido

Lara Rodríguez Ribera

Genòmica i Proteòmica

2010 UAB

Obtención del genoma de un

microorganismo:

1- Aislamiento y cultivo

2- Extracción de DNA

3- Secuenciación

4- Ensamblaje

5- Anotación de genes i elementos reguladores.

La mayoría de

microorganismos:

1- no pueden ser cultivados

2- viven en comunidades

Metagenómica: estudio de ADN genómico obtenido de

microorganismos sin cultivar.

Estudios filogenèticos

PCR 16S rRNA

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Estudios de metagenómica

Papel de los

microorganismos en la

biosfera.

Como los ecosistemas

microbionos responden a

las perturbaciones

medioambientales.

Como los ecosistemas

microbianos contribuyen a

nuestra salud.

Diversidad ambiental,

evolución de las

poblaciones.

“En la Tierra no vivimos en la Era del Hombre o de los humanos, vivimos hoy,

y siempre, en la Era de la Bacterias”. Stephen Jay Gould (1941-2002).

Environmental shotgun sequencing (ESS)

respectivo tamaño de su

genoma.

Coverage normalmente

incompleto. Peligro de

ensamblar secuencias

de distintas OTUs.

Cobertura

determinada por

la variación en la

abundancia

relativa de cada

miembro de la

comunidad

microbiana y el

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“Targeted" sequencing approach

Screening de clones para detectar un gen

deseado (ex. PCR).

Gen 16S rDNA asignar ADN de un

filotipo específico.

Limitaciones de la PCR

Random sequencing approachResultado: contigs de diferentes tamaños y

fragmentos no ensamblados.

Genomas de “referencia”.

Asignación de contigs a “bins” basandose en

su contenido G+C, uso de codones, coverage

de las secuencias, presencia de pequeños n-

mers (frecuencia nucleotidica), etc. para

classificarlos en grupos que pueden ser vistos

como “especies” (OTUs).

Hay genes que no pueden ser clonados en E.coli (toxicidad).

Nuevos métodos de secuenciación como el 454 de Roche eliminan el paso de clonación (requerido en el método Sanger).

Desventajas: menor tamaño de los fragmentos y falta de paired-end sequencesmayor reto para el ensamblaje y la anotación.

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1.045Gb de secuencia no redundante.

Métodos basados en la similitud de la

secuencia y la búsqueda

computacional de genes Estimas

cualitativas i cuantitativas de la

diversidad genómica.

Criterios de binning:

grado de cobertura, frecuencias de

oligonucleótidos, similitud a genomas

previamente secuenciados.

Filtros de 0.1-3.0µm

Biblioteca genòmica (inserto

2-6Kb).

Pair-end reads

Whole-genome random shotgun.

1800 especies “genómicas” (148

filotipos bacterianos nuevos).

rDNA

(“genomic” species = clustering

of assemblies or unassembled

reads more than 94% identical

on the nucleotide level).

1.2 millones de genes

previamente desconocidos (782

nuevos rhodopsin-like

photoreceptors).

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Conclusiones

Se pueden aplicar whole-genome assambly algorithms a

muestras medioambientales.

Secuenciación shotgun proporciona marcadores

filogenéticos que pueden ser utilizados para evaluar la

diversidad filogenética en una muestra con mayor poder de

lo que permiten los estudios de rDNA basados en PCR.

También permite una mayor identificación de la

diversidad genética en familias génicas particulares.

10-100 trillones de microbios habitan el tracto

gastrointestinal. (100veces más genes que

nuestro genoma).

Sintetizan aminoácidos esenciales y

vitaminas.

Influencian a la maduración del sistema

inmune.

Modulan las respuestas al daño de células

epiteliales.

Afectan al balance energético y procesan

compuestos indigestibles como los

polisacáridos de plantas y los xenobióticos.

Secuenciación del genoma

y del microbioma humano

para entender la condicion

humana.

Revelar la diversidad

genómica y genética

microbiana y identificar

propiedades funcionales

de nuesto microbioma.

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78 millones bp de secuencia única secuenciados.

40% no ensamblado a contigs.

Diversidad entre la muestra:

Comparación shotgun reads y

secuencia del genoma completo.

B. longum 0’70 X coverage.

(80-100% identidad, 52% reads

<95%)

M. .smithii 3.5X coverage.

(99.65%-100% identidad,

89%>95%)

Identificación de filotipos

Análisis de secuencias de 16S rDNA de:

-Ensamblaje aleatorio shotgun de librerias de clones

-Amplificación de 16SrDNA por PCR (2062PCRs)

Shotgun

72 filotipos Bacteria i 1 Archaea

-22.2% nuevos

-83.3% no cultivados

Divisiones Firmicutes i Actinobacteria

No Bacteriodetes.

Metaboloma

Enzimas degradació

polisacaridos de plantas.

Genes centrales de la via

metanogénica.

Genes involucrados en la

sintesis de aá esenciales i

vitaminas.

Diferencias entre individuos

(producción energía,

carbohidratos aá, etc) : bajo

coverage o dieta, genotipo i

estilo de vida.

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Conclusiones

Son necesarios estudios futuros para proporcionar un microbioma con un

mayor grado de cobertura y para evaluar los efectos de la edad, la dieta y

estados patológicos (ej. Enfermedades inflamatorias intestinales, cáncer…) en

el microbioma del colon humano.

El muestreo periódico del microbioma del colon puede proporcionar

conocimientos sobre como los efectos medioambientales cambian nuestra

“microevolución”.

Los resultados pueden proporcionar nuevos biomarcadores para definir

nuestra salud, nuevas maneras de optimizar nuestra nutrición personal, de

predecir la biodisponibilidad de drogas administradas oralmente y de

pronosticar nuestra predisposición a desordenes como infecciones con

patógenos, obesidad, etc.

Aplicaciones

Correlaciones entre datos medioambientales y metadata.

Fertilidad del suelo y seguridad alimentaria

Entender la simbiosis.

Metagenómica y virologia medioambiental (transducción)

Enriquecer familias génicas (ej. Fotoreceptores Mar

Sargasso)

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AplicacionesCorrelaciones entre datos medioambientales y metadata.

Antoni van Leeuwenhoek

Temperatura viabilidad

Distribución de las especies

microbianas

Patogenicidad

Virulencia

Colonización …

Propiedades del hábitat

Temperatura

pH

Salinidad

Contenido de nutrientes…

Metagenómica nos permite estudiar el potencial genómico de una comunidad

y como es afectado por los cambios en el hábitat.

Microbioma ind. Obesos

Enriquecido en genes de enzimas que metabolizan

polisacaridos “indigestibles”.

Firmicutes

AplicacionesCorrelaciones entre datos medioambientales y metadata.

Microbioma ind. delgados

Bacteroidetes

Microbioma ind. Obesos

Enriquecido en genes de enzimas que metabolizan

polisacaridos “indigestibles”

Firmicutes

Perdida de peso en humanos

Firmicutes Bacteroidetes

Las Bacterias juegan un papel directo en

la obesidad humana.

Nueva diana en la lucha contra la

obesidad

Vol 444|21/28 December 2006| doi:10.1038/nature05414

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AplicacionesFertilidad del suelo y seguridad alimentaria

Algunos suelos son mas favorables que otros para el crecimiento de plantas

saludables.

Las comunidades microbianas del suelo favorecen la productividad agrícola

ya que están implicadas en la supresión de patógenos de las plantas y la

descomposición de contaminantes.

La metagenómica del suelo puede ofrecer un diagnóstico de las

comunidades microbianas para una óptima producción agrícola. Se podrían

estimular los procesos microbianos que impulsan el crecimiento de las plantas

añadiendo a los suelos degradados nutrientes para favorecer a los

microorganismos beneficiosos.

La fertilización de suelos con estiércol animal pueden facilitar el

establecimiento de comunidades microbianas en el suelo que son una amenaza

para la seguridad alimentaria ya que sirven de reservorio de patógenos y

facilitan el intercambio de genes de resistencia entre los microorganismos.

AplicacionesEntender la endosimbiosis

Homalodisca coagulata

Baumannia cicadellinicola Sulcia muelleri.

Biosíntesis de

vitaminas y

cofactores

Síntesi de

aminoácidos

esenciales

Codependencia metabólica entre

bacterias no relacionadas y su

insecto huésped.

Modelo simple de coevolución

genómica y la reducción del

genoma.

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AplicacionesVirologia medioambiental i transducción

En ambientes marinos los virus constituyen 94% de todo el ácidonucleico. (5% Biomasa).

Dificultades de la metagenómica de virus.

Profagos

No marcador filogenético

No homologos.

La mayoría de ORFans de la biosfera son debidos a la transferenciagénica lateral de origen vírico.

La transducción es un gran contribuyente a la diversidad genética delos procariotas.

Cassettes fotosintèticos en cianófagos pueden aumentar lafitness de su huésped suplementando y mejorando losfotosistemas existentes de las cianobacterias.

Futuro

Secuenciadores de tercera generación permitiránsecuenciar un cromosoma en un solo paso conningún o pocos fragmentos. Algoritmos deensamblaje. El control de cualidad, la búsqueda degenes y la anotación aún serán necesarios.

Diferenciar citosina y citosina metilada durante lasecuenciación. (metilación = sistema inmunitarioprimitivo en bacterias y control de expresióngénica en eucariotas).

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Conclusions

Els microorganismes tenen una gran influencia sobre lesaltres formes de vida de la terra.

Metagenómica “nova” disciplina que permet l’estudigenòmic de microorganismes mediambientals.

Proporciona informació sobre la diversitat genètica igenòmica de les espècies microbianes, la seva evolució i laseva adaptació a ambients diversos.

Aplicacions diverses.

Bibliografía

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FIN!