LICENCIATURA EN QUMICAProyecto Determinacin ActividadEnzimtica de la InvertaaInte!rante" INTRODUCCIN La invertasa (-D-fructofuranosidasa, -D-fructofuransido fructohidrolasa,C!"#"$"#%&, catali'a la hidrlisis de restos ter(inales no reductores -D-fructofuranos)dicos de fructofuransidos" ntre los sustratos so*re los +ue act,a el(-s si.nificado es, sin duda, la sacarosa, de ah) +ue el en'i(a se desi.ne con elno(*re de sacarasa" La deno(inacin trivial de invertasa, con la +ue ta(*i/n seconoce, hace referencia al hecho de +ue los 0roductos de la reaccin sonconocidos desde anti.uo co(o 1a',car invertido2 3a +ue (ientras la sacarosa esde4trorrotatoria, la (e'cla e+ui(olecular de .lucosa 3 fructosa +ue resulta de suhidrlisis es levorrotatoria, 0or lo +ue en el 0roceso se ori.ina un ca(*io de si.no(de 0ositivo a ne.ativo& del valor de rotacin 0tica" Lainvertasaesunen'i(aa(0lia(entedistri*uido, estando0resentetantoen(icroor.anis(os co(o en ani(ales 3 ve.etales, 5u.ando un 0a0el i(0ortante enel cata*olis(odefructanos3(-ses0ec)fica(enteenel delasacarosa, enes0ecial en a+uellos or.anis(os en los +ue dichos a',cares son utili'ados co(ofuente de car*ono 3 ener.)a" l estudio de la actividad invertasa 0resenta un .raninter/s tanto desde un 0unto de vista acad/(ico co(o de investi.acin a0licada,siendo uno de los en'i(as (-s conocidos" 6 (odo de e5e(0lo 0ode(os referir+ue lainvertasafueel 0ri(eren'i(acu3a cin/ticaseestudien0rofundidad(estudios cl-sicos de 7ichaelis-7enten& 3 +ue fue utili'ado industrial(ente" 8ara la deter(inacin de la actividad invertasa se utili'ar- un ensa3o indirecto enel +ue los 0roductos de reaccin ser-n detectados es0ectrofoto(/trica(ente trassu conversin en derivados coloreados"nconcreto, lae4tensindelahidrlisisen'i(-ticadesacarosa(a',car noreductor& en .lucosa (-s fructosa (a',cares reductores& se valorar- (ediante unodelosdiversos(/todose4istentes0aralaesti(acindea',caresreductores"Nos referi(os e4acta(ente al(/todo del-cido !,9-dinitrosalic)lico (DN:&, elcualse *asa en la reduccin delDN: (de color a(arillo& 0or la .lucosa u otro a',car reductor al -cido !-a(ino-9-nitrosalic)lico (Cha0lin, $;>-$#9 (l 0ara $>> E. de (asaC dicha cantidad 0uede au(entarse si no se 0uede llevar al 0@ 0ti(o (ediante la adicin de -cido c)trico, 0or ra'ones de sa*or"6 veces se a.re.a la invertasa al 0roducto 0revia(ente (e'clado con sorbitol, +ueta(*i/n 0osee un .ran 0oder hi.rost-tico o esta*ili'ador de la hu(edad, en el sentido de retenerla frente a variaciones en la hu(edad a(*iente" 7ientras +ue el sor*itol re*landece de in(ediato 3 su accin contin,a durante el al(acena(iento, la invertasa act,a de 0referencia en el transcurso del al(acena(iento"Otra a0licacin i(0ortante de la invertasa est- en la ela*oracin de a',car invertido a 0artir de sacarosa 0or v)a en'i(-tica, la cual aventa5a a la hidrlisis -cida, 0or ser (-s f-cil de controlar" 6de(-s, el 5ara*e resulta de (a3or concentracin, 0resenta (e5ores caracteres de color 3 sa*or 3 no contiene indiciosde 0roductos secundarios co(o el furfural" Una ve' ela*orado el 5ara*e 0or inversin en'i(-tica, se calienta a ABC 0ara inactivar la en'i(a, teniendo a0licacin en diferentes 0roductos a'ucarados 3 licores"8or otra 0arte, desechos de frutas ricas en sacarosa 0ueden ser hidroli'ados 0or invertasa en .lucosa 3 fructosa 3 /stas fer(entadas 0or levaduras 0ara 0roducir etanol 3Fo 0rote)nas unicelulares (?=, $$&"s interesante +ue la accin cario./nica del a',car invertido es *astante inferior ala causada 0or la sacarosa" La 0ro0iedad de no 0roducir caries es a,n (ucho (-s (anifiesta en el 4ilitol, alcohol 0entavalente, de 0oder edulcorante, se(e5anteal de la sacarosa"Objetivoreali'ar un estudio cin/tico de la actividad invertasa, +ue co(0render-la deter(inacin de velocidades iniciales as) co(o estudios del efecto de los si.uientes factores en la actividad en'i(-ticaG $& concentracin del en'i(aC #& 0@, con esta*leci(iento delran.o de valores de 0@ en el+ue elen'i(a esactivo 3 deter(inacin del 0@ 0ti(o" !& te(0eratura, con esta*leci(iento del ran.o de valores de te(0eratura en el +ueel en'i(a es activo 3 deter(inacin de la te(0eratura 0ti(a"=& concentracin de sustrato, con esta*leci(iento del (odelo cin/tico ((ichaelianoo coo0erativo& 3 deter(inacin de los 0ar-(etros cin/ticos del en'i(a" Justificacin.LaInvertasaesunadelasen'i(asesenciales+uelanaturale'autili'a0araa3udarnos a di.erir a',cares, co(,n(ente hallada en el 0olen de las a*e5as 3 enfuentesdelevadura, lainvertasa5ue.aunrol clavenosloenlos0rocesosdi.estivos, sinota(*i/nenla 0revencinen.eneral delasenfer(edadesenhu(anos, el re5uveneci(iento f)sico 3 los 0rocesos de anti-enve5eci(iento"Confor(e crece(os, tene(os (enos acceso a esta en'i(a natural, lo +ue0rovoca una (enor ha*ilidad 0ara e4traer los nutrientes vitales de los ali(entos+ue co(e(os" Ta(*i/n 0uede aletar.ar nuestro 0roceso di.estivo" 7ientras +ueal.unasfor(asdea',cares3car*ohidratosson*uenas0arael cuer0o, no0ueden a*sor*erse ni di.erirse *ien sin la a3uda de la en'i(a invertasaGMaterial H Ialan'a (sensi*ilidad de $ (.& H Ilo+ue seco o *aJo de a.ua hirviendo H Centr)fu.a 0re0arativa H s0ectrofot(etroFColor)(etro H @o(o.enei'ador H 0@-(etro Reactivos H 6cetato sdico H *uffer fosfatos H Kcido clorh)drico H invertasa en levadura 0olvo H Reactivo de DN: H @idr4ido sdicoObtencin de un extracto crudo de invertasa :us0ender$.de0re0aradodelevaduraen#>>(l deta(0ndee4traccin(ta(0n acetato >,$ 7, 0@ 9,>, en NaCl >,9 7&" 6.itar la (e'cla durante $9 (in,centrifu.ar 3 to(ar el so*renadante co(o e4tracto en'i(-tico" l e4tractoen'i(-tico, cuando no se est/ utili'ando, se .uardar- en fr)o (fri.or)fico&PROCEDIMIENO 8re0arar 9 series de tu*os ($ *lanco 3 # 0ro*le(as 0ara cada serie otie(0o de incu*acin& con las (e'clas de ensa3o indicadas en la Ta*la" Las (e'clas de ensa3o se incu*an a 99 LC durante 9-$9 (inutos" Me!cla de ensa"o est#ndar $ara la deter%inacin de la actividad invertasa. Co(0onentesIlanco (*lanco de sus& 8ro*le(a (4#& :acarosa >,$ 7 ((l& >,>$,> Ta(0n Mosfatos >,$ 7, 0@ 9 ((l& #,>#,> 6.ua destilada ((l& #,>$,> 4tracto en'i(-tico (Nl& $>>,>$>>,> 8asado el 0eriodo de incu*acin se to(a >,$ (l de cada tu*o 3 se le aJade $ (ldel reactivo DN:, colocandose 0osterior(ente a $>> LC durante 9 (inutos" nfriar3deter(inarlaa*sor*anciaa9?>n(dela(e'cla0ro*le(autili'andoco(o*lancola(e'cladeensa3odel *lancodesustrato"6 0artirdelosvaloresdea*sor*ancia 3 tie(0o de incu*acin se 0ueden deter(inar los valores de actividaden'i(-tica" 6lternativa(ente, se 0uede 0re0arar una ,nica serie de tu*os,to(-ndosealos intervalos detie(0oindicados al)cuotas de>,$(l +ueseverter-nso*re$(l dereactivoDN:, 0revia(entedis0ensadoenuntu*odeensa3o de ta0n de rosca, (e'cl-ndose in(ediata(ente 0ara detener la reaccinen'i(-ticaConstruccin de una curva de calibrado60artir deunasolucinstocEde.lucosa=>(730or dilucincona.uadestilada, 0re0arar una .a(a de soluciones del a',car de distinta concentracin,tal 3 co(o se indica en la Ta*la $" @acer las diluciones en tu*os de ensa3o" Unave' hechas las (e'clas, a.itar *ien 0ara ho(o.enei'ar la solucin" Pre$aracin de una &a%a de soluciones de &lucosa de diferente concentracin a $artir de una solucin stoc' () %M. Tu*o Concentracin ((7& 6.ua destilada ((l& Olucosa => (7 ((l& >>9,>>,> $#=,?9>,#9 #==,9>,9 !%=,#9>,?9 =$,> 9$>!,?9$,#9 %#>#,9#,9 ?=>>,>9,> Resultados O*tenidosCurvaTie(0o Concentracion# >">== >"$% >"$?< >"#=$> >"!$#> >"9=> $"$#%0 10 20 30 40 5000.511.5Concentracion miliMolarA#or#anciaDonde PQ(4R*PQ6*sor*ancia 7Q0endienteSQconcentracion IQinterseccion (Q>">#== >"$% >"$?< >"#=$> >"!$#> >"9=> $"$#%0 10 20 30 40 50 600510152025303540Concentracion v Tiem$o Concentracion milimolar ie%$o Concentracion %ili%olar9 ?"$!%$> $#"!"$ 7 3 deter(in la a*sor*ancia a 9?> n( utili'ando co(o *lanco la (e'cla de ensa3o del *lanco del sustrato":e re0iti el (is(o 0rocedi(iento 0ero a.re.ando al final $(l de 8*Cl# de concentracin >"# 70 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 .os in,ibidores co%$etitivos se $ueden unir a /E01 $ero no a /E+0. .a in,ibicin co%$etitiva au%enta el valor de K% /es decir1 el in,ibidor interfiere con la unin del sustrato01 $ero no afecta a la V%ax /el in,ibidor no obstaculi!a la cat#lisis en /E+0 $or2ue no se $uede unir a /E+00 v max=13.161/Km=0.38Km=2.63Ini!i"ore# $#an"o %!Cl2Ini!icion com&etitiva 'm ma(or "e 5.02ConclusionesDurante la 8ractica se tuvo co(o finalidad la esti(acin de la actividadinvertasa,to(andote(0eratura,0@,tie(0o,Concentraciondesustratoo0ti(os 3(odific-ndosecadaunodeestosdurantelasdiversas0rue*asreali'adas, del(/todo descrito en la literatura 0ode(os destacar +ue durante la t/cnica solo se(odifico en una ocasin el *uffer de acetatos 0or fosfatos a un 0h de 9 sin (ostrarca(*io al.uno 3 dando resultados (u3 si(ilares 0or lo +ue co(0ro*a(os +ue lasolucin de fosfatos no afecta la actividad en'i(-tica 3a +ue solo est- a0ortando0rotones al (edio 0ara (antener un 0@ de 9,nlaliteraturalaactividaden'i(-ticasedeter(ina*acona*sor*ancia0eronosotros +uer)a(os co(0ro*ar 3 discutir so*re cuantos (ili(oles se consu()an ose 0roduc)an durante la hidrolisis de sacarosa en .lucosa 3 fructosa, ca*e(encionar +ue la curva 0atrn esta*a diri.ida a concentracin de .lucosa es decir+ue 0ara o*tener datos 3 co(0ro*ar la re0roduci*ilidad de este de*e construirseuna curva de cali*racin con fructosa 0ara co(0arar resultados 3 co(0ro*ar +ueeste (/todo es correcto 3 re0roduci*le en las condiciones descritas" Durante nuestras 0rue*as 0ode(os concluir $"-l sustrato sacarosa tiene .ran afinidad 0or la en'i(a invertasa #"-l 0@ 0ti(o de tra*a5o est- entre 0@ = a %!"-La te(0eratura de tra*a5o est- entre los => a 99 C="-Tie(0o (-4i(o de reaccin es de !9 (in"9"-te(0eratura de Desnaturali'acin de %> a %9 C