Mejoramiento Genetico
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PROCESO DE PRODUCCIÓN
CEPAS, LÍNEAS, CLONES
GENÉTICAMutantes Híbridos
Recombinantes
SELECCIÓN
AGENTE BIOLÓGICO
MicrobianasVegetales Animales
SUSTRATOMEDIO DE CULTIVO
ESTERILIZACIÓN
PREPARACIÓN
DISEÑO Y FORMULACIÓN
Naturales(Wild type)
Screening,colecciones de cultivo
TIPO DE REACTOR
MODO DE OPERACIÓN
FERMENTACIÓN
BIOTRANSFORMACIÓN
DOWNSTREAM PROCESSING BIOCATALIZADOR
SEPARACIÓN YPURIFICACIÓN
PRODUCTO
EFLUENTES
• MUTACION Y SELECCION
• HIBRIDIZACION Y RECOMBINACION • TRANSFORMACION,CONJUGACION Y
TRASDUCCION (Bacterias)• CLONADO y EXPRESION DE GENES
• El empleo de MUTANTES es escaso aun en la industria alimentaria
MEJORAMIENTO DE CEPAS DE USO INDUSTRIAL:
METODOS GENETICOS
objetivos:
• aumentar los rendimientos: debe realizarse en forma PERMANENTE.
• disminuir o eliminar co-metabolitos indeseables (ej. pigmentos, otros productos, facilitar la purificación)
• estimular la utilización de fuentes de carbono o nitrógeno mas baratas (ej. plásticos)
• alterar morfología o funciones para obtener propiedades deseadas (ej. espuma, pellets, etc)
MODOS DE OBTENCION
1- Mutación espontanea causadas por factores físicos, químicos o biológicos, tales como :Insecticidas, fungicidas, metales, radicales libres, errores en la replicación, trasposones (IS), recombinasas, DNA polimerasas y diversas exonucleasas con función de reparación.
2- Mutacion inducida causada por agentes químicos , físicos o endogenos, tales como:
•Análogos de bases (ej, bromouracilo), Deaminaciones (ácido nitroso)•Agentes alquilantes (NTG, mostazas, ETMS), Radiaciones u.v•Radiaciones ionizantes, Radicales libres, errores en la replicación y en la reparación, etc
Agentes Mutagenicos fisicos y quimicos y suS
Mecanismos de acción AGENTE ACCION EFECTO
Analogos de bases 5’ bromouracilo se incorpora como T :
a veces aparea con GA-T→ G-CG-C→ A-T
2’ aminopurina se incorpora como A :a veces aparea con C
A-T→ G-CG-C→ A-T
Reaccion con DNA acido nitroso deamina A, C A-T→ G-C
G-C→ A-T hidroxilamina reacciona con C G-C→ A-T
Agentes alquilantes etilmetanosulfonato inserta metilo en G, induce
error de apareamientoG-C→ A-T
mostazas nitrogenadas,NTG
entrecruzamiento de hebras,regiones de escicion
mutaciones puntuales y deleciones
acridinas, bromuro deetidio
colorantes intercalantes cambio del marco de lectura
Radiacionesu.v formacion de dimeros de
pirimidinasreparacion c /s error o delecion
radiaciones ionizantes formacion de radicales librescon ruptura de DNA
reparacion c /s error o delecion
Condiciones requeridas para la mutación
• 1- Obtención de células o esporas aislados• 2- Considerar el tipo de organismo: haploide, poliploide, multinucleados.• 2- Selección del agente, condición de tratamiento, y tiempo de exposición
en función de:•
• carácter de la mutación (dominancia o recesividad)• numero de eventos mutacionales por célula• frecuencia de la mutación (10 -10 a 10 -4)• estabilidad de la mutación (bajo nivel de reversión)
• - Considerar los sistemas de reparación, sobre todo los que actúan en la oscuridad y en ausencia de replicación para que las lesiones premutacionales puedan convertirse en una mutación directa durante la replicación o en una mutación indirecta por recombinación después de la replicación.
MECANISMOS DE REPARACION SIN ERRORES
1- Fotoreactivación (ruptura de los dímeros de pirimidinas por acción de una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible).
2- Escisión + reparación * Reparación de nucleotidos aislados por lesión u.v: necesita la otra hebra
como templado (hasta 30 bp) Intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD * Reparación de bases modificadas (sitiosAP, alquilación o metilación)
Intervienen exoIII (xth), endo IV (nfo) DNA glicosilasa (fpg) y/o DNA glicosilasa I (tag)
3- Reparación post- replicativa * Reparación del apareamiento (“mismatch”): una metilasa reconoce
DNA recientemente replicado (dam) e intervienen las proteínas “mut” (helicasas, etc)
* Reparación por recombinacion (recA, recBCF, sbcB)
REPARACION POR RECOMBINACION
MECANISMOS DE REPARACION QUE PRODUCEN ERROR (mutaciones)
Son sistemas inducibles que se activan frente al daño en el DNA (1000 bp) o cuando se inhibe la replicación
S.O.S Las proteinas umu se unen a la DNA pol e impiden su rol corrector
Lex A activo (-) recA, sulA, uvr ABD,
RecA +ssbDNA RecA* umuDC, polB
Lex A inactivo
Mutagénesis Dirigida
Aislamiento selectivo de mutantes El objetivo de esta etapa es seleccionar las mutantes mas adecuadas, pero al
mismo tiempo reducir el numero de ensayos que no ofrezcan resultados apreciables.
poblacionmutagenizada
medio minimo+antibiotico
medio rico
enriquecimientoen mutantesauxotrofas
A- METODO DE ENRIQUECIMIENTO PARA SELECCION DE CEPAS AUXOTROFAS
• Crecimiento en medio conteniendo penicilina (para bacterias gram +)• Crecimiento en medio conteniendo estreptomicina (para Pseudomonas)• Crecimiento en medio conteniendo ac. nalidixico (para levaduras y hongos)
B- AISLAMIENTO DE MUTANTES RESISTENTES
La poblacion mutagenizada se siembra en un medio selectivo que contiene una sustancia toxica que impide el crecimiento de la cepa silvestre. Solamente pueden desarrollar los clones resistentes . De esta forma pueden aislarse mutantes resistentes a antibióticos o a antimetabolitos.
Resistencia a antibioticos: puede ser útil no solo como marcador genético sino ademas por su permeabilidad incrementada , mayor síntesis de proteínas, etc
Resistencia a antimetabolitos: se emplean análogos estructurales del metabolito que ejerce los efectos regulatorios .El crecimiento en presencia de estos antimetabolitos ocasionan la muerte de las celulas normales, ya que por su similitud estructural con los metabolitos normales causan retroinhibición. En cambio los mutantes resistentes a los análogos pueden sobrevivir pues sintetizan los metabolitos en exceso, en algunos casos debido a sus mecanismos regulatorios modificados.
MEJORAMIENTO DE CEPAS MICROBIANAS
Recuperación encultivo líquido
plaqueo
Fermentación
Ensayo de actividad
Revisar la actividad de las cepas exitosas
Analizar nuevamente las cepas exitosas
(screening secundario)Preservación
Post-test
Scale up
Cultivo sumergido
Reinicio del proceso
Mutagénesis
SELECCION DE CEPAS SOBREPRODUCTORAS DE PENICILINA
Penicillum notatum (1943) 20 U/ml
Penicillum chrysogenum NRRL (1951)
Wis Q 176 (1200 U/ml) Lab. Wyeth
BL3- D10 Lilly
A partir de 1973 comienza un programa de desarrollo y mejoramiento decepas basado en el conocimiento de la biosintesis de penicilinas: empleo dealtas concentraciones de aminoacidos y precursores, cepas que no formencompuestos relacionados (hidroxi-penicilina), etc.En el año 1990, el nivel de produccion de las cepas empleadas era de 85,000 U/ml (aprox. 50 g/L).
rayos X
screening
U.V.
seleccion de esporos
Conclusiones
• La técnica de MUTACION Y SELECCIÓN ha sido muy exitosa en la producción de metabolitos microbianos, a diferencia de lo observado en general en organismos superiores.
• Se han logrado rendimientos de 20 g/l para cefalosporinas, tetraciclinas, eritromicina y estreptomicina.
• Tambien se han obtenido mutantes sobreprductoras de ácido cítrico (100 g/l), lisina (70 g/l) vitamina B12 (6 g/l), ácido glutamico (100 g/l), nucleótidos (20-30 g/l) y celulas vegetales con propiedades deseadas como resistencia a pesticidas o mayor contenido de Trp.
Otros mecanismos geneticos
Recombinación: - sexual (híbridos de levadura)
- parasexual - fusion de hifas fusión nuclear
(1/10-7) haploidization (al azar)
fusion de ProtoplastosBacteria - lysozyme, fungi - glucanasa, chitinasaPEG, Electrofusion
haploide
diploide
Reproducción
asexual
Reproduccion
asexual
Fusión celularasco
ascosporas
Interacción de celulas de distinto mating type (Sexo)
meiosis
mitosis
mitosis
- RECOMBINACION GENETICA EN HONGOS y LEVADURAS: CICLO SEXUAL
Recombinacion sexual : incluye una etapa de meiosis luego de la fusion nuclear (cariogamia). Seproduce un nuevo genotipo debido a la combinacion de cromosomas parentales o mediante elentrecruzamiento de segmentos homologos entre cromatides. (RECOMBINACION HOMOLOGA)
Para que la fusion celular se produzca se requiere que los parentales sean haploides y de distinto matingtype (sexo) . En esas condiciones secretan feromonas que facilitan el proceso de fusion.
Generos : Aspergillus, Claviceps, Emericellopsis, Saccharomyces.
Procesos biotecnologicos mejorados por hibridizacion sexual de las cepas
organismo proceso organismo procesoAgaricusbitorquis biomasa
Pleurotus biomasa
Yarrowialipolitica SCP
Saccharomycescerevisiae
biomasa, etanol,aromas,
Agrocybeaegerita biomasa
tolerancia a etanol(vinos)
Clavicepspurpurea alcaloides
Aspergillusnidulans
penicilina
En hongos “champiñones” la segregacion de genes ligados a la fructificacion retrasa la entrada ala esporulacion y se obtiene mayor biomasa.
Otros ejemplos : breeding de plantas (semillas) y animales.
n + n
heterokaryon
n
n
haploide
2ndiploide
2n + 1
2n - 1
nuclear fusion
no-disyunción
No-disyunción
haploidisación
PARA-SEXUAL CYCLE
Recombinación mitótica
2n
Para forzar la fusión nuclear y la formación de heterocariones puede emplearse :
• Forzar la recombinacion con radiaciones ionizantes o mutagenos (fluoruracilo)•Selección nutricional (parentales auxótrofos que se cultivan en un medio mínimo forzandose la recombinación) • Método químico o físico (FUSION DE PROTOPLASTOS / ELECTROFUSION)
METODOS DE FUSION CELULAR : ELECTROFUSION Y FUSION DE PROTOPLASTOS
1 - Obtencion de protoplastos•bacterias gram positivas : lisozima o antibioticos + estabilizador osmotico.•bacterias gram negativas :lisozima+ EDTA + estabilizador osmotico•levaduras y hongos : distintas enzimas : glucanasas, sulfatasas, etc
2- Fusion celular
•método químico (PEG + Ca 2+) : solo para protoplastos
•método eléctrico (electroforésis + electroporación) que provoca
agregación y luego ruptura reversible de la membrana con formación de
heterocariones.
3- Regeneración de la pared (cultivo en medios gelificados)
4 - Selección de recombinantes
por morfología, contenido de DNA, marcadores mitocondriales de
resistencia, niveles de producción, etc.
APLICACIONES
ORGANISMO METODO DEFUSION
PROCESO
INTRA-ESPECIECephlosporium acremonium
espontaneo cefalosporina
Aspergillus niger espontaneo acido citricoprotoplastos idemprotoplastos glucoamilasa
Penicillum chrysogenum espontaneo penicilinaPenicillum roqueforti protoplastos alcaloides
Saccharomyces cerevisiae protoplastos etanoluso de H de C (celobiosa) para
etohfactor killer a levaduras de vino
INTER-ESPECIEAsp. Oryzae x Asp. sojae protoplastos salsa de soja y misu
Sac. cerevisiae x Sac. uvarumSac. cerevisiae X Sac. diastat.
protoplastos cervezas dieteticas(no contienen dextrinas )
INTERGENEROSSac. Cerevisae X K. Lactis protoplastos factor killer
Sac. cerevisiae x Zygo. fermenti protoplastos etanol + celobiosaSac. cerevisiae x Candida protoplastos etanol + tolerancia al calor
OTROS METODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS Y EUCARIOTAS INFERIORES1- Conjugacion : mediada por plásmidos CONJUGATIVOS. A traves de pili y gobernado por sexo transferencia de un fragmento de DNA del donante
Ej. La recombinación natural con plasmidos conjugativos de cepas de Lactococcus se utiliza para construir cepas resistentes a fagos que se emplean como starters. Se diminuye así el enranciamiento y acidificación de leches.
2- Transduccion : mediada por fagos que transmite segmentos de DNA del donante al receptor. La integración del fragmento se realiza por recombinacion sitio especifica ( genes att e hin ) Ej. Patogenicidad
3- Transformación : transferencia de DNA desnudo por células competentes.Ej. adquisición de caracteres diversos en la naturalezaEj. aumento de la fijación de nitrógeno (simbiosis de Rhizobium con leguminosas)
4- Transposición : mediada por transposones (c/s IS ) con recombinación y sin homología
www.life.uiuc.edu/micro/316/topics/plasmids/conjugation-mech.html
TRANSFORMACIONTRANSDUCCION
MOLECULAS DE DNA CONSTRUIDAS “IN VITRO” QUE PUEDEN REPLICARSE Y/O EXPRESARSE EN LA CELULA VIVA
USOS
•AISLAR Y CARACTERIZAR GENES
•ALTERARLOS
•AUMENTAR EL NUMERO
•RETORNAR LOS GENES ALTERADOS A CELULAS VIVAS (MICROORGANISMOS, PLANTAS, ANIMALES) PARA EXAMINARLOS O UTILIZAR SU EXPRESION
MEJORAMIENTO GENETICO EMPLEANDO TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE
EXTRACCION DELDNA FUENTE
VECTOR DE
CLONADO
FRAGMENTACION ENZIMATICA LINEARIZACION
AISLAR CELULAS CON EL GEN
CELULA HUESPED
PROTEINAS CODIFICADAS POR EL GEN CLONADO
PRODUCCION DE PROTEINAS
LIGADO
INTRODUCCION DEL DNA EN EL HUESPED
RECOMBINANTES
HERRAMIENTAS BASICAS PARA EL CLONADO DE GENES
• DNA BLANCO O SECUENCIA DE INTERES :– DNA genómico (aislado directamente de células o tejido)– DNA complementario (cDNA) preparado in vitro a partir de un templado de
mRNA empleando transcriptasa reversa.– DNA sintético, a partir de oligonucleótidos, con DNA pol (DS) o con M13
(SS ) o por amplificación de fragmentos por PCR
• ENZIMAS DE ACIDOS NUCLEICOS– DNA polimerasas, – transcriptasa reversa, – DNA ligasas, – endonucleasas de restriccion (clivan el DNA en sitios especificos)
VECTOR : molecula de DNA en la que puede insertarse DNA exógeno para
que pueda replicarse en una celula apropiada •Plasmidos, •bacteriofagos• virus de animales y plantas •cromosomas artificiales
HUESPEDES
* BACTERIAS : E.coli y B. subtilis (transformacion, empaquetamiento
“in vitro”)
* LEVADURAS (transformacion, electroporación)
* CELULAS ANIMALES (transfección, electroporación, virus animales,
microinyección en nucleo)
* CELULAS VEGETALES (electroporación, microinyección, T-DNA,
revolver)
E.coli
•Es el microorganismo mejor estudiado
• no patógeno
•fácil de cultivar en medios baratos
•crecimiento rápido
Desventajas
las proteínas no son secretadas
contienen endotoxinas
no realizan modificaciones post-traduccionales
posibilidad de plegamiento incorrecto de proteínas
la separación de celulas puede dañar las proteínas
Ventajas
genética bien conocida.
Mecanismos regulatorios conocidos
crecimiento rápido y fácil
medios de cultivo baratos
altos niveles de expresión
Levaduras
• eucariotas de crecimiento aislado con paredes
similares a las de plantas
•no son patogenos
•amplio conocimiento de su genetica y fisiologia
•rapido crecimiento en pequeña y gran escala
•Presenta varios promotores fuertes
•Un plasmido natural (2µm) puede ser usado como
vector de expresion endogeno
•Tienen aparato de golgi para realizar
modificaciones post transcripcionales y secreción.
•Secreta pocas proteinas naturales por lo que los
productos recombinantes pueden recobrarse
bastante puros (pocos contaminantes y de facil
separación)
Células de mamíferos¨: CHO (de tumor
ovárico de ratones), HeLa (human
cervix) BHK (baby hamster kidney) e
hibridomas.
* los vectores son virus
* se emplean para producir proteínas
intracelulares pero preferentemente
proteínas que requieren modificaciones
postranscripcionales para permitir su
secreción.
* es fundamental testear el tipo y
contenido de virus presentes en estas
celulas ya que pueden acompañar los
procesos de purificación junto con los
fármacos (hepatitis, papiloma, HIV)
VECTOR : molecula de DNA en la que puede insertarse DNA exógeno para
que pueda replicarse en una celula apropiada •Plasmidos, •bacteriofagos• virus de animales y plantas •cromosomas artificiales
HUESPEDES
* BACTERIAS : E.coli y B. subtilis (transformacion, empaquetamiento
“in vitro”)
* LEVADURAS (transformacion, electroporación)
* CELULAS ANIMALES (transfección, electroporación, virus animales,
microinyección en nucleo)
* CELULAS VEGETALES (electroporación, microinyección, T-DNA,
revolver)
Características: •Son pequeños (miles de pares de bases) •generalmente portan solo uno o algunos genes •son circulares •tienen un único origen de replicacion•no movilizables
Para su utilizacion como vectores de clonado se requiere ademas:• sitios unicos de clivaje para enzimas de restriccion• gran numero de copias (por eliminación de laregion de control)•marcadores que permitan su reconocimiento
VECTORES DE CLONADO
PLASMIDOS: moleculas de DNA que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma
EcoRI
BamHI
HindIII
SalI
Origin of replication
PstI
Apr
TcrpBR322
Ejemplos: pBR322, pUC19
EMPLEO DE LOS MICROORGANISMOS EN LA EXPRESIÓN DE GENES
HETEROLOGOS1- Quimosina recombinante: Clonado del gen de la quimosina bovina en una levadura. Se emplea para la coagulacion de la caseina, en la obtencion de quesos.
2- Insulina humana recombinante (Eli Lily and Co) (en E.coli) 51 aminoácidos ; MW =6 Kda,
3- Hormona de crecimiento humana (en E.coli y levaduras) ( Genentech) 4- Vacuna Hepatitis (en levaduras )
5- Interleukina- 2 humana, MW= 15 Kda
6- Interferón (citokina) 165 aminoácidos, MW= 20Kda
PROCARIOTASGEN ESTRUCTURAL
DNA
mRNA
TRANSCRIPCION
TRADUCCION
PROTEINA
EUCARIOTASI1 E1 I2 I3 E2 E3 I4 E5 I6 E6 I7
DNA
TRANSCRIPCION
mRNA primario
TRADUCCION
PROCESAMIENTO
E1 E2 E3 E4 E5 E6 MENSAJERO FUNCIONAL
PROTEINA
Vector de expresion general de eucariotas
* ORI euk y ORI E : origenes de replicacion.
* Amp y ESM: marcadores de selección
* Cs: sitio de clonado
* P: promotor
* T: señales de terminación y poli-A
3- Cromosoma artificial de levadura
Sintesis de cDNA a partir de mRNA