Mejoramiento Genetico

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PROCESO DE PRODUCCIÓN CEPAS, LÍNEAS, CLONES GENÉTICA Mutantes Híbridos Recombinantes SELECCIÓN AGENTE BIOLÓGICO Microbianas Vegetales Animales SUSTRATO MEDIO DE CULTIVO ESTERILIZACIÓN PREPARACIÓN DISEÑO Y FORMULACIÓN Naturales (Wild type) Screening, colecciones de cultivo TIPO DE REACTOR MODO DE OPERACIÓN FERMENTACIÓN BIOTRANSFORMACIÓN DOWNSTREAM PROCESSING BIOCATALIZADOR SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN PRODUCTO EFLUENTES

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mejoramiento genetico sobre formaulas de calculaciones

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Page 1: Mejoramiento Genetico

PROCESO DE PRODUCCIÓN

CEPAS, LÍNEAS, CLONES

GENÉTICAMutantes Híbridos

Recombinantes

SELECCIÓN

AGENTE BIOLÓGICO

MicrobianasVegetales Animales

SUSTRATOMEDIO DE CULTIVO

ESTERILIZACIÓN

PREPARACIÓN

DISEÑO Y FORMULACIÓN

Naturales(Wild type)

Screening,colecciones de cultivo

TIPO DE REACTOR

MODO DE OPERACIÓN

FERMENTACIÓN

BIOTRANSFORMACIÓN

DOWNSTREAM PROCESSING BIOCATALIZADOR

SEPARACIÓN YPURIFICACIÓN

PRODUCTO

EFLUENTES

Page 2: Mejoramiento Genetico

• MUTACION Y SELECCION

• HIBRIDIZACION Y RECOMBINACION • TRANSFORMACION,CONJUGACION Y

TRASDUCCION (Bacterias)• CLONADO y EXPRESION DE GENES

• El empleo de MUTANTES es escaso aun en la industria alimentaria

MEJORAMIENTO DE CEPAS DE USO INDUSTRIAL:

METODOS GENETICOS

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objetivos:

• aumentar los rendimientos: debe realizarse en forma PERMANENTE.

• disminuir o eliminar co-metabolitos indeseables (ej. pigmentos, otros productos, facilitar la purificación)

• estimular la utilización de fuentes de carbono o nitrógeno mas baratas (ej. plásticos)

• alterar morfología o funciones para obtener propiedades deseadas (ej. espuma, pellets, etc)

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MODOS DE OBTENCION

1- Mutación espontanea causadas por factores físicos, químicos o biológicos, tales como :Insecticidas, fungicidas, metales, radicales libres, errores en la replicación, trasposones (IS), recombinasas, DNA polimerasas y diversas exonucleasas con función de reparación.

2- Mutacion inducida causada por agentes químicos , físicos o endogenos, tales como:

•Análogos de bases (ej, bromouracilo), Deaminaciones (ácido nitroso)•Agentes alquilantes (NTG, mostazas, ETMS), Radiaciones u.v•Radiaciones ionizantes, Radicales libres, errores en la replicación y en la reparación, etc

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Agentes Mutagenicos fisicos y quimicos y suS

Mecanismos de acción AGENTE ACCION EFECTO

Analogos de bases 5’ bromouracilo se incorpora como T :

a veces aparea con GA-T→ G-CG-C→ A-T

2’ aminopurina se incorpora como A :a veces aparea con C

A-T→ G-CG-C→ A-T

Reaccion con DNA acido nitroso deamina A, C A-T→ G-C

G-C→ A-T hidroxilamina reacciona con C G-C→ A-T

Agentes alquilantes etilmetanosulfonato inserta metilo en G, induce

error de apareamientoG-C→ A-T

mostazas nitrogenadas,NTG

entrecruzamiento de hebras,regiones de escicion

mutaciones puntuales y deleciones

acridinas, bromuro deetidio

colorantes intercalantes cambio del marco de lectura

Radiacionesu.v formacion de dimeros de

pirimidinasreparacion c /s error o delecion

radiaciones ionizantes formacion de radicales librescon ruptura de DNA

reparacion c /s error o delecion

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Condiciones requeridas para la mutación

• 1- Obtención de células o esporas aislados• 2- Considerar el tipo de organismo: haploide, poliploide, multinucleados.• 2- Selección del agente, condición de tratamiento, y tiempo de exposición

en función de:•

• carácter de la mutación (dominancia o recesividad)• numero de eventos mutacionales por célula• frecuencia de la mutación (10 -10 a 10 -4)• estabilidad de la mutación (bajo nivel de reversión)

• - Considerar los sistemas de reparación, sobre todo los que actúan en la oscuridad y en ausencia de replicación para que las lesiones premutacionales puedan convertirse en una mutación directa durante la replicación o en una mutación indirecta por recombinación después de la replicación.

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MECANISMOS DE REPARACION SIN ERRORES

1- Fotoreactivación (ruptura de los dímeros de pirimidinas por acción de una fotoliasa (phr) activada mediante luz visible).

2- Escisión + reparación * Reparación de nucleotidos aislados por lesión u.v: necesita la otra hebra

como templado (hasta 30 bp) Intervienen las endonucleasas uvrA,B,C y la helicasa uvrD * Reparación de bases modificadas (sitiosAP, alquilación o metilación)

Intervienen exoIII (xth), endo IV (nfo) DNA glicosilasa (fpg) y/o DNA glicosilasa I (tag)

3- Reparación post- replicativa * Reparación del apareamiento (“mismatch”): una metilasa reconoce

DNA recientemente replicado (dam) e intervienen las proteínas “mut” (helicasas, etc)

* Reparación por recombinacion (recA, recBCF, sbcB)

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REPARACION POR RECOMBINACION

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MECANISMOS DE REPARACION QUE PRODUCEN ERROR (mutaciones)

Son sistemas inducibles que se activan frente al daño en el DNA (1000 bp) o cuando se inhibe la replicación

S.O.S Las proteinas umu se unen a la DNA pol e impiden su rol corrector

Lex A activo (-) recA, sulA, uvr ABD,

RecA +ssbDNA RecA* umuDC, polB

Lex A inactivo

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Mutagénesis Dirigida

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Aislamiento selectivo de mutantes El objetivo de esta etapa es seleccionar las mutantes mas adecuadas, pero al

mismo tiempo reducir el numero de ensayos que no ofrezcan resultados apreciables.

poblacionmutagenizada

medio minimo+antibiotico

medio rico

enriquecimientoen mutantesauxotrofas

A- METODO DE ENRIQUECIMIENTO PARA SELECCION DE CEPAS AUXOTROFAS

• Crecimiento en medio conteniendo penicilina (para bacterias gram +)• Crecimiento en medio conteniendo estreptomicina (para Pseudomonas)• Crecimiento en medio conteniendo ac. nalidixico (para levaduras y hongos)

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B- AISLAMIENTO DE MUTANTES RESISTENTES

La poblacion mutagenizada se siembra en un medio selectivo que contiene una sustancia toxica que impide el crecimiento de la cepa silvestre. Solamente pueden desarrollar los clones resistentes . De esta forma pueden aislarse mutantes resistentes a antibióticos o a antimetabolitos.

Resistencia a antibioticos: puede ser útil no solo como marcador genético sino ademas por su permeabilidad incrementada , mayor síntesis de proteínas, etc

Resistencia a antimetabolitos: se emplean análogos estructurales del metabolito que ejerce los efectos regulatorios .El crecimiento en presencia de estos antimetabolitos ocasionan la muerte de las celulas normales, ya que por su similitud estructural con los metabolitos normales causan retroinhibición. En cambio los mutantes resistentes a los análogos pueden sobrevivir pues sintetizan los metabolitos en exceso, en algunos casos debido a sus mecanismos regulatorios modificados.

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MEJORAMIENTO DE CEPAS MICROBIANAS

Recuperación encultivo líquido

plaqueo

Fermentación

Ensayo de actividad

Revisar la actividad de las cepas exitosas

Analizar nuevamente las cepas exitosas

(screening secundario)Preservación

Post-test

Scale up

Cultivo sumergido

Reinicio del proceso

Mutagénesis

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SELECCION DE CEPAS SOBREPRODUCTORAS DE PENICILINA

Penicillum notatum (1943) 20 U/ml

Penicillum chrysogenum NRRL (1951)

Wis Q 176 (1200 U/ml) Lab. Wyeth

BL3- D10 Lilly

A partir de 1973 comienza un programa de desarrollo y mejoramiento decepas basado en el conocimiento de la biosintesis de penicilinas: empleo dealtas concentraciones de aminoacidos y precursores, cepas que no formencompuestos relacionados (hidroxi-penicilina), etc.En el año 1990, el nivel de produccion de las cepas empleadas era de 85,000 U/ml (aprox. 50 g/L).

rayos X

screening

U.V.

seleccion de esporos

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Conclusiones

• La técnica de MUTACION Y SELECCIÓN ha sido muy exitosa en la producción de metabolitos microbianos, a diferencia de lo observado en general en organismos superiores.

• Se han logrado rendimientos de 20 g/l para cefalosporinas, tetraciclinas, eritromicina y estreptomicina.

• Tambien se han obtenido mutantes sobreprductoras de ácido cítrico (100 g/l), lisina (70 g/l) vitamina B12 (6 g/l), ácido glutamico (100 g/l), nucleótidos (20-30 g/l) y celulas vegetales con propiedades deseadas como resistencia a pesticidas o mayor contenido de Trp.

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Otros mecanismos geneticos

Recombinación: - sexual (híbridos de levadura)

- parasexual - fusion de hifas fusión nuclear

(1/10-7) haploidization (al azar)

fusion de ProtoplastosBacteria - lysozyme, fungi - glucanasa, chitinasaPEG, Electrofusion

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haploide

diploide

Reproducción

asexual

Reproduccion

asexual

Fusión celularasco

ascosporas

Interacción de celulas de distinto mating type (Sexo)

meiosis

mitosis

mitosis

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- RECOMBINACION GENETICA EN HONGOS y LEVADURAS: CICLO SEXUAL

Recombinacion sexual : incluye una etapa de meiosis luego de la fusion nuclear (cariogamia). Seproduce un nuevo genotipo debido a la combinacion de cromosomas parentales o mediante elentrecruzamiento de segmentos homologos entre cromatides. (RECOMBINACION HOMOLOGA)

Para que la fusion celular se produzca se requiere que los parentales sean haploides y de distinto matingtype (sexo) . En esas condiciones secretan feromonas que facilitan el proceso de fusion.

Generos : Aspergillus, Claviceps, Emericellopsis, Saccharomyces.

Procesos biotecnologicos mejorados por hibridizacion sexual de las cepas

organismo proceso organismo procesoAgaricusbitorquis biomasa

Pleurotus biomasa

Yarrowialipolitica SCP

Saccharomycescerevisiae

biomasa, etanol,aromas,

Agrocybeaegerita biomasa

tolerancia a etanol(vinos)

Clavicepspurpurea alcaloides

Aspergillusnidulans

penicilina

En hongos “champiñones” la segregacion de genes ligados a la fructificacion retrasa la entrada ala esporulacion y se obtiene mayor biomasa.

Otros ejemplos : breeding de plantas (semillas) y animales.

Page 22: Mejoramiento Genetico

n + n

heterokaryon

n

n

haploide

2ndiploide

2n + 1

2n - 1

nuclear fusion

no-disyunción

No-disyunción

haploidisación

PARA-SEXUAL CYCLE

Recombinación mitótica

2n

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Para forzar la fusión nuclear y la formación de heterocariones puede emplearse :

• Forzar la recombinacion con radiaciones ionizantes o mutagenos (fluoruracilo)•Selección nutricional (parentales auxótrofos que se cultivan en un medio mínimo forzandose la recombinación) • Método químico o físico (FUSION DE PROTOPLASTOS / ELECTROFUSION)

METODOS DE FUSION CELULAR : ELECTROFUSION Y FUSION DE PROTOPLASTOS

1 - Obtencion de protoplastos•bacterias gram positivas : lisozima o antibioticos + estabilizador osmotico.•bacterias gram negativas :lisozima+ EDTA + estabilizador osmotico•levaduras y hongos : distintas enzimas : glucanasas, sulfatasas, etc

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2- Fusion celular

•método químico (PEG + Ca 2+) : solo para protoplastos

•método eléctrico (electroforésis + electroporación) que provoca

agregación y luego ruptura reversible de la membrana con formación de

heterocariones.

3- Regeneración de la pared (cultivo en medios gelificados)

4 - Selección de recombinantes

por morfología, contenido de DNA, marcadores mitocondriales de

resistencia, niveles de producción, etc.

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APLICACIONES

ORGANISMO METODO DEFUSION

PROCESO

INTRA-ESPECIECephlosporium acremonium

espontaneo cefalosporina

Aspergillus niger espontaneo acido citricoprotoplastos idemprotoplastos glucoamilasa

Penicillum chrysogenum espontaneo penicilinaPenicillum roqueforti protoplastos alcaloides

Saccharomyces cerevisiae protoplastos etanoluso de H de C (celobiosa) para

etohfactor killer a levaduras de vino

INTER-ESPECIEAsp. Oryzae x Asp. sojae protoplastos salsa de soja y misu

Sac. cerevisiae x Sac. uvarumSac. cerevisiae X Sac. diastat.

protoplastos cervezas dieteticas(no contienen dextrinas )

INTERGENEROSSac. Cerevisae X K. Lactis protoplastos factor killer

Sac. cerevisiae x Zygo. fermenti protoplastos etanol + celobiosaSac. cerevisiae x Candida protoplastos etanol + tolerancia al calor

Page 26: Mejoramiento Genetico

OTROS METODOS DE TRANSFERENCIA DE GENES EN BACTERIAS Y EUCARIOTAS INFERIORES1- Conjugacion : mediada por plásmidos CONJUGATIVOS. A traves de pili y gobernado por sexo transferencia de un fragmento de DNA del donante

Ej. La recombinación natural con plasmidos conjugativos de cepas de Lactococcus se utiliza para construir cepas resistentes a fagos que se emplean como starters. Se diminuye así el enranciamiento y acidificación de leches.

2- Transduccion : mediada por fagos que transmite segmentos de DNA del donante al receptor. La integración del fragmento se realiza por recombinacion sitio especifica ( genes att e hin ) Ej. Patogenicidad

3- Transformación : transferencia de DNA desnudo por células competentes.Ej. adquisición de caracteres diversos en la naturalezaEj. aumento de la fijación de nitrógeno (simbiosis de Rhizobium con leguminosas)

4- Transposición : mediada por transposones (c/s IS ) con recombinación y sin homología

www.life.uiuc.edu/micro/316/topics/plasmids/conjugation-mech.html

Page 27: Mejoramiento Genetico

TRANSFORMACIONTRANSDUCCION

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Page 30: Mejoramiento Genetico

MOLECULAS DE DNA CONSTRUIDAS “IN VITRO” QUE PUEDEN REPLICARSE Y/O EXPRESARSE EN LA CELULA VIVA

USOS

•AISLAR Y CARACTERIZAR GENES

•ALTERARLOS

•AUMENTAR EL NUMERO

•RETORNAR LOS GENES ALTERADOS A CELULAS VIVAS (MICROORGANISMOS, PLANTAS, ANIMALES) PARA EXAMINARLOS O UTILIZAR SU EXPRESION

MEJORAMIENTO GENETICO EMPLEANDO TECNOLOGIA DE DNA RECOMBINANTE

Page 31: Mejoramiento Genetico

EXTRACCION DELDNA FUENTE

VECTOR DE

CLONADO

FRAGMENTACION ENZIMATICA LINEARIZACION

AISLAR CELULAS CON EL GEN

CELULA HUESPED

PROTEINAS CODIFICADAS POR EL GEN CLONADO

PRODUCCION DE PROTEINAS

LIGADO

INTRODUCCION DEL DNA EN EL HUESPED

RECOMBINANTES

Page 32: Mejoramiento Genetico

HERRAMIENTAS BASICAS PARA EL CLONADO DE GENES

• DNA BLANCO O SECUENCIA DE INTERES :– DNA genómico (aislado directamente de células o tejido)– DNA complementario (cDNA) preparado in vitro a partir de un templado de

mRNA empleando transcriptasa reversa.– DNA sintético, a partir de oligonucleótidos, con DNA pol (DS) o con M13

(SS ) o por amplificación de fragmentos por PCR

• ENZIMAS DE ACIDOS NUCLEICOS– DNA polimerasas, – transcriptasa reversa, – DNA ligasas, – endonucleasas de restriccion (clivan el DNA en sitios especificos)

Page 33: Mejoramiento Genetico

VECTOR : molecula de DNA en la que puede insertarse DNA exógeno para

que pueda replicarse en una celula apropiada •Plasmidos, •bacteriofagos• virus de animales y plantas •cromosomas artificiales

HUESPEDES

* BACTERIAS : E.coli y B. subtilis (transformacion, empaquetamiento

“in vitro”)

* LEVADURAS (transformacion, electroporación)

* CELULAS ANIMALES (transfección, electroporación, virus animales,

microinyección en nucleo)

* CELULAS VEGETALES (electroporación, microinyección, T-DNA,

revolver)

Page 34: Mejoramiento Genetico

E.coli

•Es el microorganismo mejor estudiado

• no patógeno

•fácil de cultivar en medios baratos

•crecimiento rápido

Desventajas

las proteínas no son secretadas

contienen endotoxinas

no realizan modificaciones post-traduccionales

posibilidad de plegamiento incorrecto de proteínas

la separación de celulas puede dañar las proteínas

Ventajas

genética bien conocida.

Mecanismos regulatorios conocidos

crecimiento rápido y fácil

medios de cultivo baratos

altos niveles de expresión

Page 35: Mejoramiento Genetico

Levaduras

• eucariotas de crecimiento aislado con paredes

similares a las de plantas

•no son patogenos

•amplio conocimiento de su genetica y fisiologia

•rapido crecimiento en pequeña y gran escala

•Presenta varios promotores fuertes

•Un plasmido natural (2µm) puede ser usado como

vector de expresion endogeno

•Tienen aparato de golgi para realizar

modificaciones post transcripcionales y secreción.

•Secreta pocas proteinas naturales por lo que los

productos recombinantes pueden recobrarse

bastante puros (pocos contaminantes y de facil

separación)

Page 36: Mejoramiento Genetico

Células de mamíferos¨: CHO (de tumor

ovárico de ratones), HeLa (human

cervix) BHK (baby hamster kidney) e

hibridomas.

* los vectores son virus

* se emplean para producir proteínas

intracelulares pero preferentemente

proteínas que requieren modificaciones

postranscripcionales para permitir su

secreción.

* es fundamental testear el tipo y

contenido de virus presentes en estas

celulas ya que pueden acompañar los

procesos de purificación junto con los

fármacos (hepatitis, papiloma, HIV)

Page 37: Mejoramiento Genetico

VECTOR : molecula de DNA en la que puede insertarse DNA exógeno para

que pueda replicarse en una celula apropiada •Plasmidos, •bacteriofagos• virus de animales y plantas •cromosomas artificiales

HUESPEDES

* BACTERIAS : E.coli y B. subtilis (transformacion, empaquetamiento

“in vitro”)

* LEVADURAS (transformacion, electroporación)

* CELULAS ANIMALES (transfección, electroporación, virus animales,

microinyección en nucleo)

* CELULAS VEGETALES (electroporación, microinyección, T-DNA,

revolver)

Page 38: Mejoramiento Genetico

Características: •Son pequeños (miles de pares de bases) •generalmente portan solo uno o algunos genes •son circulares •tienen un único origen de replicacion•no movilizables

Para su utilizacion como vectores de clonado se requiere ademas:• sitios unicos de clivaje para enzimas de restriccion• gran numero de copias (por eliminación de laregion de control)•marcadores que permitan su reconocimiento

VECTORES DE CLONADO

PLASMIDOS: moleculas de DNA que se encuentran en bacterias y se replican en forma independiente del cromosoma

EcoRI

BamHI

HindIII

SalI

Origin of replication

PstI

Apr

TcrpBR322

Ejemplos: pBR322, pUC19

Page 39: Mejoramiento Genetico

EMPLEO DE LOS MICROORGANISMOS EN LA EXPRESIÓN DE GENES

HETEROLOGOS1- Quimosina recombinante: Clonado del gen de la quimosina bovina en una levadura. Se emplea para la coagulacion de la caseina, en la obtencion de quesos.

2- Insulina humana recombinante (Eli Lily and Co) (en E.coli) 51 aminoácidos ; MW =6 Kda,

3- Hormona de crecimiento humana (en E.coli y levaduras) ( Genentech) 4- Vacuna Hepatitis (en levaduras )

5- Interleukina- 2 humana, MW= 15 Kda

6- Interferón (citokina) 165 aminoácidos, MW= 20Kda

Page 40: Mejoramiento Genetico

PROCARIOTASGEN ESTRUCTURAL

DNA

mRNA

TRANSCRIPCION

TRADUCCION

PROTEINA

EUCARIOTASI1 E1 I2 I3 E2 E3 I4 E5 I6 E6 I7

DNA

TRANSCRIPCION

mRNA primario

TRADUCCION

PROCESAMIENTO

E1 E2 E3 E4 E5 E6 MENSAJERO FUNCIONAL

PROTEINA

Page 41: Mejoramiento Genetico

Vector de expresion general de eucariotas

* ORI euk y ORI E : origenes de replicacion.

* Amp y ESM: marcadores de selección

* Cs: sitio de clonado

* P: promotor

* T: señales de terminación y poli-A

Page 42: Mejoramiento Genetico

3- Cromosoma artificial de levadura

Page 43: Mejoramiento Genetico

Sintesis de cDNA a partir de mRNA