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UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID

Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de Madrid

MECANISMOS IMPLICADOS EN LAS ETAPAS

INICIALES DE INFECCIÓN EN LA CANCROSIS

DE LOS CÍTRICOS PROVOCADA POR

Xanthomonas citri subsp. citri

Tesis Doctoral

Marta Sena Vélez

Ingeniera Agrónoma

2015

Departamento de Biotecnología

Escuela Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos

Universidad Politécnica de Madrid

Tesis Doctoral

Mecanismos implicados en las etapas iniciales de infección en la cancrosis

de los cítricos provocada por Xanthomonas citri subsp. citri

Autor

Marta Sena Vélez

Ingeniera Agrónoma

Director

Jaime Cubero Dabrio

Dr. en Ciencias Biológicas

Madrid, 2015

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID

iii

(D15)

Tribunal nombrado por el Magfco. y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica

de Madrid el día de de 2015.

Presidente

Secretario

Vocal

Vocal

Vocal

Suplente

Suplente

Realizado el acto de defensa de la tesis el día de de 2015 en la Escuela

Técnica Superior de Ingenieros Agrónomos de Madrid.

Calificación:

El Presidente

El Secretario

Los Vocales

v

A mi familia, amigos y compañeros,

porque me habéis apoyado estos años, y

porque este trabajo también es un poco

vuestro.

Os quiero mucho.

vii

Ἓν οἶδα ὅτι οὐδὲν οἶδα

“Sólo sé que no sé nada”

Sócrates, 470-399 a. C.

Porque cuanto más investigamos y mayor es nuestro

conocimiento, mayor es también nuestra inquietud

por conocer y saber más, y solo así, nos damos

cuenta de todo lo que nos queda por descubrir.

“Por eso, si conoces los planes del enemigo sabrás qué

estrategias serán eficaces y cuáles no”

“Para estar seguro de tomar lo que atacas, ataca en

lugares que el enemigo no defiende. Para estar seguro de

conservar lo que proteges, defiende un lugar donde el

enemigo no ataca”

“Cuando esté unido, divídelo”

Sun Tzu

El Arte de la Guerra, Siglo IV a. C.

ix

Reconocimientos

Este trabajo ha sido realizado en el Departamento de Protección Vegetal del Instituto

Nacional de Investigaciones Agrarias y Agroalimentarias (INIA), bajo la dirección del

Dr. Jaime Cubero Dabrio.

Algunos de los estudios han sido realizados en el Citrus Research and Education Center

(CREC) y el Emerging Pathogens Institute (EPI) ambos pertenecientes a La

Universidad de Florida, con la ayuda de los Doctores James H. Graham y Jorge A.

Girón.

En este trabajo han colaborado las siguientes personas:

Dr. Jaime Cubero Dabrio, INIA

Dr. James H. Graham, CREC

Elisa Ferragud Capó, INIA

Dra. Cristina Redondo Casero, INIA

Dr. Jorge A. Girón, EPI

Dr. Pablo Rodríguez Palenzuela, CBGP-ETSIA

Dr. Evan Johnson CREC

Durante la realización de este trabajo he disfrutado de una beca FPI-INIA del Ministerio

de Ciencia e Innovación que, además, me ha permitido realizar dos estancias en el

CREC y EPI de La Universidad de Florida.

Este trabajo ha sido financiado con los siguientes proyectos nacionales e

internacionales: CRDF546/UF12170 (Citrus Advance Technology Program), FCPRAC-

NAS85 (Florida Department of Citrus-University of Florida), RTA2008-0048 (INIA) y

RTA2006-00149 (INIA).

xi

Agradecimientos

“Wi th a l i t t l e he lp o f my f r i ends”

Con la defensa de este trabajo se cierra una etapa de mi vida, mi última etapa de

estudiante, aunque creo que nunca dejaré de aprender. Durante todo este tiempo he

aprendido muchas cosas, no todas relacionadas con el laboratorio ni con Xanthomonas,

y aunque a veces se ha hecho cuesta arriba, la mayoría de los momentos han sido

buenos, muy buenos, es por ello que os agradezco a todos vuestra ayuda durante este

tiempo.

En primer lugar me gustaría dar las gracias a Jaime por haberme permitido realizar este

trabajo en su grupo y por tener siempre, la puerta de su despacho abierta. Por haber

escuchado pacientemente mis dudas y contestado siempre a mis múltiples preguntas.

Por escuchar mis ideas, que a veces eran demasiadas, por habérmelas razonado y

enseñarme a mí a razonarlas y valorarlas, a ser crítica. Por la libertad, por los pruébalo o

demuéstramelo… Algunas cosas han salido, otras no, otras necesitan todavía algún

reajuste y otras están pendientes, pero con todas he aprendido, si no las hubiéramos

probado no habríamos ganado nada. Por las estancias en el extranjero y por preocuparte

de que todo me fuera bien allí. Por los ánimos en los últimos momentos y por hacer que

siempre contemos todos en el laboratorio y que colaboremos entre nosotros. En

resumen, por ser tan buen guía en este camino que es llegar a ser doctor.

A mis compañeros de laboratorio, por todo, por las risas, los llantos, por los desayunos,

las comidas y los desayunos de los viernes que se han convertido en tradición. Porque

como dice Pilar, con vosotros venir a trabajar no es trabajo, y la verdad es que tiene

razón, sois los mejores. Por ser como sois cada uno de vosotros, y haber ocupado un

huequito de mi corazón. A Elisa porque no creo que con otra persona hubiera sido capaz

de compartir una cabina de flujo de un metro durante tantas horas y no haber muerto en

el intento. Por todas las horas de trabajo juntas y nuestras charlas para amenizar el rato.

Por compartir un poquito de ti conmigo todos los días y porque aunque no he llegado a

tu nivel soy bastante más organizada que antes. Por tu alegría, tus lágrimas y tus

abrazos, pero también por los conciertos y lo loca que estás, o mejor dicho estamos

(Como un día nos vea Jaime…). A Jerson, por su ayuda y sus ideas, pero también por su

compañía y por los ratos que salíamos a fumar. Porque es un buen amigo y siempre está

dispuesto a escuchar y a discutir cualquier idea. Por todas las pruebas que hemos hecho,

alguna en secreto, aunque no hayan salido, porque al fin y al cabo, a veces, esto es un poco

xii

como jugar, un reto, y eso lo hace divertido. Muchas gracias por hacer este camino

conmigo. A Cristina por decir las cosas como son, porque de ella he aprendido a

organizar y analizar los resultados, por preocuparse siempre por todos nosotros y estar

disponible con cualquier duda o ayuda que necesitáramos, por ser un apoyo durante

estos años. A Pilar porque también me ha enseñado un montón de cosas y me ha

apoyado y ayudado. Por ser peleona, que con algo de eso me he quedado y por

ayudarme a convencer a Jaime para hacer algunos ensayos. A Iray porque además de

ayudarme y enseñarme siempre estaba animando el laboratorio, ya sea con sustos o con

su buen humor. A Bea, Gema y Carlos que han compartido los estreses de la tesis

conmigo, por todos los ratos juntos y las tardes en el INIA que no se acababan nunca,

por vuestra amistad y vuestra alegría, y porque me habéis enseñado muchas cosas que

me han hecho ser mejor persona y científica. Aunque seáis fúngicos, os quiero también

un montón. A los Frikis en su conjunto por las cañas, los viajes y todos los ratos juntos.

A Fernando, Maite y Javiera, porque si podían ayudarme con lo que fuera siempre lo

han hecho, por vuestra alegría y buen humor y por compartir los buenos y los malos

ratos que hemos tenido en el laboratorio. A Javier y Gerardo, porque nos han dejado

ocupar su laboratorio y ayudarnos siempre que han podido, sin poner pega alguna,

muchas gracias a vosotros también.

I would like to thank Jim for his help throughout the all thesis and for inviting me either

to his laboratory at the CREC or his home. For being so critical with our work and

always show us different points of view. For making me everything so easy during my

stay in Lake Alfred, and allow full microscopes access to me. It was very nice to have

your support all these years. I have learnt many things from you, so thank you very

much. To Susan and Laura for taking care of me when I was in US. To Jim`s group for

helping me in everything I needed there, to Marta, Evan, Diane, Alma and Swapna, and

also to CREC workers.

To Diann Achor for teach me how to use the microscopes and how to treat the samples

for microscopy. To let me work in her lab and with the microscopes anytime even

without her supervision, thank you for trusting me.

A Jorge, por permitirme trabajar en su laboratorio y colaborar con nosotros, por

enseñarme a trabajar con proteínas y a usar el microscopio de transmisión. Gracias por

tu paciencia, buen humor y por quedarte hasta las mil en el laboratorio para acabar las

extracciones y los geles.

xiii

A Pablo y Emilia, por estar siempre dispuestos a colaborar y ayudar siempre que lo

hemos necesitado. Por todo lo que me aprendí de vosotros trabajando en el Labo X, y

que me ha servido mucho durante estos años.

A Ethel, Isabel y Mariel, porque aunque vinieron a nuestro laboratorio para aprender, a

mí me enseñaron mucho más. Gracias por los ratos que pasasteis con nosotros en

Madrid.

A la pandilla de Lake Alfred por acogerme en su grupo como a uno más y ofrecerme su

amistad, por las cenas, los cines, la fiesta, los bailes y thanksgiving. Sin vosotros mi

estancia en Lake Alfred no hubiera sido lo mismo. En especial a Raquel y Rubén que

además de ayudarme a conocer el laboratorio, me acogieron en su casa unos días y se

preocupaban porque siempre tuviera algo que hacer. Pero también a Evan, Megan,

Pedro, Raquel y otros cuyos nombres no recuerdo, gracias.

A Elisabeth y Angélica por ser las mejores compañeras de piso, también a Gaudi que

me hizo mucha compañía. Me alegro mucho de haberos conocido y haber pasado una

temporada en Gainesville con vosotras.

También me gustaría agradecer a Feli y Gloria, por todas las tardes que me han hecho

un poco de compañía, por su alegría y por preocuparse y preguntar siempre por

nosotros.

A mis amigos, a todos, los Agrónomos y los no agrónomos, por preocuparos por mí y

por mi trabajo todo este tiempo. Porque desde hace años habéis aguantado mis

quebraderos de cabeza, da igual donde estuvierais, siempre he sentido vuestro apoyo.

Por las quedadas y las cañas improvisadas que a veces se nos van de las manos, por los

viajes, las cenas y Gandía. Siempre es un placer con todos vosotros, os quiero un

montón.

A mi familia, de la que Edu forma ahora también parte, porque siempre me han estado

apoyando y dando fuerza para continuar, en los buenos y en los malos ratos. Por

quererme y aguantarme incluso cuando estaba de mal humor. Por darme todos los

abrazos que he necesitado e incluso más. Por ayudarme, aconsejarme, y a veces hasta

leeros algún trabajo para revisarlo. Sin vosotros, este trabajo no habría sido posible.

Muchas gracias, os quiero.

Principales abreviaturas

xv

Principales Abreviaturas

ADN: Ácido Desoxirribonucleico

ANOVA: análisis de la varianza

APHIS: Animal and Plant Health Inspection Service

ARN: Ácido Ribonucleico

cGMP: GMP cíclico

CLSM: Confocal Laser Scanning Microscopy. Microscopía de barrido láser confocal

CV: Cristal Violet. Cristal violeta

DSF: Diffusible Signal Factors. Factores de señalización difusibles

EFSA: European Food Safety Authority

FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations

EPPO: European and Mediterranean Plant Protection Organization

HAP: Hook Associated Protein. Proteína asociada al gancho o garfio

Hrp: hypersensitive response and pathogenicity

Hrc: hypersensitive response and conserved

GFP: Green Fluorescence Protein. Proteína verde fluorescente

IPPC: International Plant Protection Convention

ISR: Induced Systemic Response. Resistencia sistémica inducida

LB: Luria Bertani medium. Medio Luria Bertani

LPS: Lipopolisacárido

Mpb: Mega pares de bases

MCP: Methyl Accepting Chemotaxis Protein. Proteínas aceptoras de grupos Metilo

MLVA: Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis

MMA: Minimal Medium A. Medio mínimo A


xvi

PAMP: Pathogen Associated Molecular Pattern. Patrones moleculares asociados a

patógenos

PCR: Polymerase chain reaction. Reacción en cadena de la polimerasa

PNPs: Péptidos Natriuréticos de Plantas

PYM: Peptone, Yeast, Malt medium. Medio peptona, levadura y malta.

RFLP: Restriction Fragment Length. Polymorphism. Polimorfismos en la longitud de

los fragmentos de restricción

Rpf: regulation of pathogenicity factor

SAR: Systemic Adquired Resistance-Respuesta Sistémica Adquirida

SDS: dodecil sulfato sódico

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SDW: Sterile Distilled Water. Agua destilada estéril

SEM: Scanning Electron Microscopy. Microscopía electrónica de barrido

SNK: Student Newmans-Keuls

SST2: Sistema de Secreción Tipo II

SST3: Sistema de Secreción Tipo III

SST4: Sistema de Secreción Tipo IV

SST5: Sistema de Secreción Tipo V

SOPP: Sodium Ortophenylphenate. Ortofenilfenato de sodio

STCR: Sensors of Two-Component Regulatory System. Sensores de los sistemas de

regulación de dos componentes

TBDT: TonB dependent transporters. Transportadores dependientes de TonB

TEM: Transmission Electron Microscopy. Microscopía electrónica de transmisión

TEMED: Tetramethylethylendiamina


xvii

ufc: unidades formadoras de colonias

USDA: United States Department of Agriculture

VBNC: Viable y no cultivable

Xac: Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis

Xc: Xanthomonas campestris

Xcc: Xanthomonas citri subsp. citri

Xfa: Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii

Índice

xix

Índice

Reconocimientos ............................................................................................................. ix

Agradecimientos .............................................................................................................. xi

Principales Abreviaturas ................................................................................................. xv

Índice ............................................................................................................................. xix

Resumen ....................................................................................................................... xxv

Abstract ....................................................................................................................... xxvii

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN ................................................................................... 1

1. El género Xanthomonas ............................................................................................ 3

2. Cancrosis o Chancro de los Cítricos ......................................................................... 7

2.1. Tipos de cancrosis o chancros descritos ................................................................ 7

Chancro o cancrosis tipo A (Asiatic Citrus Canker) ......................................... 9 2.1.1.

El Chancro tipo B ............................................................................................ 10 2.1.2.

El Chancro tipo C ............................................................................................ 11 2.1.3.

Chancros tipo D y E ......................................................................................... 11 2.1.4.

2.2. Descripción de la enfermedad ............................................................................. 12

Síntomas ........................................................................................................... 12 2.2.1.

Ciclo de la enfermedad y epidemiología ......................................................... 16 2.2.2.

2.3. Diagnóstico y detección....................................................................................... 20

2.4. Control ................................................................................................................. 24

Prevención ....................................................................................................... 24 2.4.1.

Control químico ............................................................................................... 28 2.4.2.

Prácticas culturales .......................................................................................... 30 2.4.3.

Control biológico ............................................................................................. 31 2.4.4.

Métodos barrera: cortavientos ......................................................................... 32 2.4.5.

Uso de variedades resistentes y mejora de cítricos .......................................... 34 2.4.6.

Control integrado ............................................................................................. 35 2.4.7.

3. Xanthomonas citri subsp. citri ................................................................................ 35

4. Factores de Virulencia de Xanthomonas citri subsp. citri ...................................... 40

4.1. Sistema de Secreción Tipo III ............................................................................. 41

4.2. Exopolisacárido: goma xanthana ......................................................................... 44

4.3. Regulación tipo quorum sensing ......................................................................... 45

4.4. Enzimas Pectolíticas ............................................................................................ 46

Índice

xx

4.5. Lipopolisacáridos ................................................................................................ 47

4.6. Motilidad ............................................................................................................. 48

4.7. Hemaglutinina filamentosa y Sistema de Secreción Tipo V ............................... 48

4.8. Sistema de secreción tipo II ................................................................................. 49

4.9. Presencia de Péptido Natriurético ....................................................................... 51

4.10. Presencia del enzima fosfoglucosa isomerasa ................................................. 53

4.11. Resistencia a especies reactivas de oxígeno .................................................... 53

4.12. Proteína LOV ................................................................................................... 53

5. Motilidad y quimiotaxis .......................................................................................... 54

5.1. Motilidad dependiente del flagelo ....................................................................... 56

Motilidad tipo swimming ................................................................................. 64 5.1.1.

Motilidad tipo swarming .................................................................................. 64 5.1.2.

5.2. Motilidad tipo sliding .......................................................................................... 67

5.3. Movimiento tipo twitching .................................................................................. 68

5.4. Quimiotaxis ......................................................................................................... 70

Sistema de transducción de señales que dirige a una respuesta quimiotáctica 71 5.4.1.

Proteínas aceptoras de grupos metilo ............................................................... 74 5.4.2.

6. Formación de Biopelículas ...................................................................................... 77

6.1. Etapas en la formación de biopelículas ............................................................... 78

6.2. Factores que determinan la formación y dispersión de biopelículas ................... 81

Señales del medio en el que se encuentran las bacterias ................................. 81 6.2.1.

Mensajeros secundarios y cadenas de proteínas .............................................. 83 6.2.2.

6.3. Composición de la matriz de las biopelículas ..................................................... 86

Polisacáridos .................................................................................................... 87 6.3.1.

ADN extracelular ............................................................................................. 87 6.3.2.

Lípidos ............................................................................................................. 92 6.3.3.

Proteínas extracelulares ................................................................................... 93 6.3.4.

6.4. Biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri ................................................... 94

Etapas en la formación de biopelícula en Xcc ................................................. 94 6.4.1.

Factores implicados en la formación de biopelículas en Xcc .......................... 96 6.4.2.

Regulación en biopelículas formadas por Xcc ................................................. 98 6.4.3.

7. Fimbrias y pili ....................................................................................................... 100

Índice

xxi

7.1. Ensamblados mediante ruta de ujier-chaperona ................................................ 100

7.2. Pili tipo Curli ..................................................................................................... 102

7.3. Familia Pilus CS1 .............................................................................................. 103

7.4. Pili tipo IV ......................................................................................................... 104

Funciones del pili tipo IV .............................................................................. 107 7.4.1.

CAPÍTULO 2: OBJETIVOS ........................................................................................ 111

CAPÍTULO 3: MOTILIDAD Y QUIMIOTAXIS EN Xanthomonas citri subsp. citri

CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................................................................... 115

1. Abstract ................................................................................................................. 117

2. Introduction ........................................................................................................... 118

3. Results ................................................................................................................... 120

3.1. Carbon source utilization by Xanthomonas strains ........................................... 120

3.2. Chemotactic response of Xanthomonas strains to carbon compounds .............. 123

3.3. Chemotactic response of Xanthomonas strains to leaf fractions ....................... 126

CAPÍTULO 4: PROTEÍNAS ACEPTORAS DE GRUPOS METILO EN Xanthomonas

Y SU RELACIÓN CON LA GAMA DE HUÉSPED .................................................. 133

1. Abstract ................................................................................................................. 135

2. Background ........................................................................................................... 136

3. Experimental procedures ....................................................................................... 136

3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions ..................................... 136

3.2. Detection of methyl accepting chemotaxis proteins in silico ............................ 138

3.3. MCP detection by conventional PCR ................................................................ 138

4. Results ................................................................................................................... 139

4.1. Detection of Methyl accepting chemotaxis proteins in silico............................ 139

4.2. Presence of MCPs in non-sequenced Xanthomonas strains .............................. 142

5. Discussion ............................................................................................................. 145

CAPÍTULO 5: FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas citri subsp. citri

CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................................................................... 147

1. Abstract ................................................................................................................. 149

2. Introduction ........................................................................................................... 150

3. Material and methods ............................................................................................ 151

3.1. Bacterial strains and growth conditions ............................................................ 151

3.2. Adhesion assays on an inert surface .................................................................. 152

3.3. Adhesion to plant surfaces ................................................................................. 153

Índice

xxii

3.4. Swimming motility ............................................................................................ 153

4. Results ................................................................................................................... 154

4.1. Adhesion and biofilm formation on an inert surface ......................................... 154

4.2. Adhesion and biofilm formation on plant surfaces ........................................... 155

4.3. Swimming motility ............................................................................................ 161

5. Discussion ............................................................................................................. 163

CAPÍTULO 6: PRESENCIA DE ADN EXTRACELULAR DURANTE LA

FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas DE CÍTRICOS Y

CRUCÍFERAS ............................................................................................................. 167

1. Summary ............................................................................................................... 169

2. Background ........................................................................................................... 170

3. Methods ................................................................................................................. 172

3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions ..................................... 172

3.2. Determination of eDNA in biofilms .................................................................. 172

3.3. eDNA staining ................................................................................................... 173

4. Results ................................................................................................................... 174

4.1. Importance of eDNA in Xanthomonas biofilms ................................................ 174

4.2. Importance of eDNA in preformed biofilm ....................................................... 175

4.3. Detection of eDNA in Xanthomonas strains ..................................................... 176

5. Discussion ............................................................................................................. 180

CAPÍTULO 7: CARACTERIZACIÓN DE LA MATRIZ EXTRACELULAR

PRODUCIDA DURANTE LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS EN CEPAS DE

Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA GAMA DE HUÉSPED .................. 185

1. Abstract ................................................................................................................. 187

2. Introduction ........................................................................................................... 188

3. Materials and methods .......................................................................................... 189

3.1. Bacterial strains and growth conditions ............................................................ 189

3.2. Extracellular protein purification....................................................................... 190

3.3. Evaluation of extracellular structures in Biofilm vs. Planktonic stages ............ 191

3.4. Extracellular structures characterization by microscopic approaches ............... 191

3.5. Surface motility ................................................................................................. 192

3.6. RNA purification ............................................................................................... 193

3.7. Primers and probes design and qPCR conditions .............................................. 193

4. Results ................................................................................................................... 195

Índice

xxiii

4.1. Visualization of extracellular structures produced by Xanthomonas citri subsp.

citri ........................................................................................................................... 195

Plate growth ................................................................................................... 195 4.1.1.

Early stages of biofilm formation .................................................................. 196 4.1.2.

Surface motility .............................................................................................. 197 4.1.3.

4.2. Extracellular protein purification and characterization ..................................... 198

4.3. Microscopy of Xanthomonas citri subsp. citri; biofilm formation and planktonic

growth ........................................................................................................................ 199

4.4. Gene transcription during biofilm formation .................................................... 203

4.5. Surface motility in Xanthomonas strains ........................................................... 208

5. Discussion ............................................................................................................. 210

CAPÍTULO 8: CONCLUSIONES ............................................................................... 217

BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 223

Resumen

xxv

Resumen

La cancrosis o chancro bacteriano de los cítricos (CBC) causada por Xanthomonas citri

subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii, afecta a un gran número de especies

dentro de la familia de las rutáceas, especialmente cítricos. Esta enfermedad produce

graves pérdidas económicas allí donde está presente, principalmente porque la

comercialización de cítricos desde las zonas afectadas hacía zonas libres de cancrosis,

está sujeta a fuertes medidas cuarentenarias. La cancrosis se encuentra distribuida a

nivel mundial pero no se ha localizado ni en la Unión Europea ni en ningún área del

Mediterráneo.

Se han descrito tres tipos de cancrosis en función de la gama de huésped y de las

características fenotípicas y genotípicas de las bacterias que las producen. La más

extendida es la cancrosis tipo A producida por Xcc, dentro de la cual se distinguen los

subtipos Aw y A*, originarios de Florida y Sudeste Asiático, respectivamente, que de

forma natural solo son capaces de producir enfermedad en lima mejicana.

En este trabajo se presentan estudios sobre mecanismos implicados en las primeras

etapas de la infección, como la quimiotaxis y formación de biopelículas, en la cancrosis

de los cítricos.

La quimiotaxis es el proceso por el cual las bacterias se dirigen hacia zonas favorables

para su supervivencia y desarrollo. Los perfiles quimiotácticos obtenidos frente a

distintas fuentes de carbono, así como los estudios en relación al contenido de proteínas

aceptoras de grupos metilo (MCPs), permitieron agrupar a las cepas de Xanthomonas

estudiadas en este trabajo, de acuerdo a la enfermedad producida y a su gama de

huésped. Todas las cepas mostraron quimiotaxis positiva frente a extractos de hoja y

apoplasto de diferentes especies, sin embargo, Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis

(Xac) y X. campestris pv. campestris (Xc) manifestaron respuestas más específicas

frente a extractos de apoplasto de hojas de naranjo dulce, lima y col china,

respectivamente. Dicho resultado nos permite asociar el mecanismo de quimiotaxis con

la capacidad de las cepas de Xanthomonas para colonizar estos huéspedes de forma

específica.

Resumen

xxvi

Las cepas estudiadas fueron capaces de realizar movimiento tipo swimming, twitching y

sliding en distintos medios, siendo el movimiento swimming el único en el que se

encontraron diferencias entre las cepas de Xcc con distinta gama de huésped.

En este trabajo se ha estudiado además la formación de biopelículas en superficies

bióticas y abióticas, un mecanismo importante tanto para la supervivencia en superficie

vegetal como para el desarrollo de la infección. Las cepas de Xanthomonas estudiadas

fueron capaces de formar biopelículas in vitro, siendo mayor en un medio que simula el

apoplasto y que contiene una baja concentración de nutrientes en comparación con

medios que contenían alta concentración de nutrientes. La formación de biopelículas en

superficie vegetal se encontró relacionada, en las cepas patógenas de cítricos, con la

capacidad para infectar un tejido o huésped determinado.

Se han caracterizado algunos de los componentes de la matriz extracelular producida

por Xcc, que compone hasta un 90% de las bipoelículas. Entre ellos destaca el ADN

extracelular, que tiene un papel como adhesina en las primeras etapas de formación de

biopelículas y estructural en biopelículas maduras. Además, se han identificado el pilus

tipo IV como componente importante en las biopelículas, que también participa en

motilidad.

Finalmente, se han realizado estudios sobre la expresión de genes implicados en

motilidad bacteriana y formación de biopelículas que han confirmado las diferencias

existentes entre cepas de Xcc de amplia y limitada gama de huésped, así como el papel

que juegan elementos como el pilus tipo IV o el flagelo en estos procesos.

Abstract

xxvii

Abstract

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and X. fuscans subsp. aurantifolii are the causal

agents of Citrus Bacterial Canker (CBC) which is one of the most important citrus

diseases. CBC affects all Citrus species as well as other species from Rutaceae family.

CBC produces strong economic losses; furthermore the commercialization of plants and

fruits is restricted from infested to citrus canker free areas. The disease is worldwide

distributed in tropical and subtropical areas, however it is not present in the European

Union.

Three types of CBC have been described according to the host range and phenotypic

and genotypic characteristics. CBC type A caused by Xcc is he widest distributed.

Within CBC A type two subtypes Aw and A* were described from Florida and Iran

respectively, both infecting only Mexican lime.

Herein mechanisms connected to early events in the citrus bacterial canker disease such

as chemotaxis and biofilm formation, were studied.

Chemotaxis allows bacteria to move towards the more suitable environments for its

survival, host colonization and infection. Studies performed on citrus pathogenic

Xanthomonas and X. campestris pv. campestris (Xc), a crucifer pathogen, have shown

different chemotactic profiles towards carbon compound as well as different MCPs

profile, which clustered strains according to host range and disease caused. Every strain

showed positive chemotaxis toward leaf extracts and apoplastic fluids from sweet

orange, Mexican lime and Chinese cabbage leaves. However, a more specific response

was found for strains Xcc 306, X. alfalfae subsp. citrumelonis and Xc towards sweet

orange, Mexican lime and Chinese cabbage apoplastic fluids, respectively. These results

relate chemotaxis with the higher ability of those strains to specifically colonize their

proper host.

Xanthomonas strains studied were able to perform swimming, sliding and twitching

motilities. The ability to swim was variable among CBC strains and seemed related to

host range.

Biofilm formation is an important virulence factor for Xcc because it allows a better

survival onto the plant surface as well as facilitates the infection process. The studied

Xanthomonas strains were able to form biofilm in vitro, on both nutrient rich and

Abstract

xxviii

apoplast mimicking media, furthermore the biofilm formation by all the strains was

higher in the apoplast mimicking media. The ability to form biofilm in planta by Xcc

and Xac strains was dependent of the host and the tissue colonized. The wide host range

CBC strain was able to form biofilm onto several citrus leaves and fruits, however the

limited host range CBC strain produced biofilm solely onto Mexican lime leaves and

fruits. Furthermore Xac strain, which solely infects leaves of young plants, was not able

to develop biofilms on fruits.

Some components of the extracellular matrix produced by Xcc strains have been

characterized. Extracellular DNA acted as an adhesin at the very early stages of biofilm

formation and as structural component of mature biofilm for citrus pathogenic

Xanthomonas. Furthermore type IV pilus has been identified as a component of the

extracellular matrix in biofilm and motility.

Transcriptional studies of genes related with biofilm formation and motility have

confirmed the differential behavior found among wide and limited host range CBC

strains as well as the role of type IV pili and flagellum on those processes.

1

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

Introducción

3

1. El género Xanthomonas

El nombre de Xanthomonas viene del griego “xanthos” que significa amarillo y

“monas” que significa entidad. Es uno de los géneros más importantes dentro de las

bacterias Gram negativas y sus componentes siempre se encuentran asociados a plantas,

ya sea como patógenos o como endófitos. Además es el género de bacterias

fitopatógenas que mayor gama de plantas huésped posee, al menos 68 familias y más de

240 géneros (124 especies monocotiledóneas y 268 dicotiledóneas) (Figura 1). Es un

género de bacterias muy interesante en los estudios de interacción de la bacteria con el

huésped por presentar una alta especificidad, cada género, especie o cepa está

practicamente restringida a un grupo específico de plantas huésped, pudiendo incluso

ser específicas de un tejido determinado (Brunings y Gabriel, 2003; Ryan et al., 2011).

En general son patógenos hemibiótrofos, en un principio se nutren del tejido vivo pero

según la enfermedad va avanzando producen muerte celular en planta (Büttner y Bonas,

2010). No se ha descrito, hasta el momento, la capacidad para colonizar el suelo o el

agua en ninguna de las especies existentes (Mhedbi-Hajri et al., 2013).

Figura 1. Bacterias fitopatógenas modelo del género Xanthomonas, partes de la planta que afectan y

plantas huésped. Xcc: Xanthomonas campestris pv. campestris; Xoo: X. oryzae pv. oryzae; Xac: X. citri

subsp. citri; Xcv: X. campestris pv. vesicatoria; Xoc: X. oryzae pv. oryzicola. Modificación de Büttner y

Bonnas 2010.

Introducción

4

La especialización de los patógenos vegetales parece que comenzó a tener lugar con la

domesticación de las plantas y fue evolucionando de forma conjunta al desarrollo de la

agricultura. En el caso de X. axonopodis, dentro de la que se incluía, hasta hace poco a

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), anteriormente X, axonopodis pv. citri y otras

especies patógenas de cítricos, pudo tener lugar en dos pasos. Se postula la aparicion de

un patógeno generalista hace aproximadamente 25.000 años, produciéndose la

especialización de estas Xanthomonas hace aproximadamente 10.000 años. Dicha

especialización tuvo lugar hacia el nicho ecológico de cada planta huésped, en su

mayoría fueron plantas monocotiledóneas. Con la llegada de la agricultura intensiva

comenzó la divergencia en patovares, debido a la especialización de las bacterias a los

cultivos intensivos, altamente homogéneos genéticamente, dando lugar a la aparición de

cepas muy eficientes en colonización y muy agresivas, pero cuya supervivencia estaba

restringida a un huésped. La globalización y el comercio de plantas, frutos y semillas

permitieron que varios de estos grupos entraran en contacto, lo que favoreció el

intercambio de material genético y la aparición de nuevos patotipos. Un ejemplo muy

claro es el de las Xanthomonas patógenas de cítricos, X. alfalfae subsp. citrumelonis se

separó de las causantes de chancros aproximadamente hace 23.000 años y las dos

especies causantes de chancros (Xcc y X. fuscans subsp. aurantifolii) hace unos 8.000

años, sin embargo todas son patógenas de cítricos e incluso producen lesiones similares

(Figura 2) (Mhedbi-Hajri et al., 2013).

La especificidad de huésped dentro de este género, parece ser debida a leves variaciones

en algunos genes relacionados con patogénesis, pudiendo ser estas variaciones en genes

codificantes para proteínas de secreción o dianas de regulación (Lu et al., 2008).

Además existen otros mecanismos implicados en las etapas tempranas de la infección

como son la quimiotaxis, sensores de variaciones ambientales y adhesión a superficies

cuya evolución ha podido producir procesos de adaptación al huésped en las distintas

Xanthomonas (Mhedbi-Hajri et al., 2011a).

Introducción

5

Figura 2. Estructura genética de X. axonopodis. Modificado de Mhebdi-Hajri y col. 2013.

El genoma de las especies pertenecientes al género Xanthomonas, de forma general, está

compuesto por un único cromosoma circular de 4,8 a 5,3 Mpb, con un contenido en GC

(Guanina-Citosina) de más del 60% y presencia de plásmidos, que pueden comprender

desde un plásmido para X. arboricola pv. pruni (Garita-Cambronero et al., 2014) a

cuatro para X. axonopodis pv. vesicatoria. El porcentaje del genoma cubierto por

marcos de lectura abierto varía entre el 83,9% en X. oryzae pv. oryzae al 90,3% en Xcc

(Ryan et al., 2011).

En los genomas secuenciados de Xanthomonas se han identificado aproximadamente el

mismo número de genes (entre 4.600 y 5.800) que en las alfaproteobacterias,

betaproteobacterias y gammaproteobacterias así como dos operones para ARN

ribosomal. Poseen además, elementos posiblemente procedentes de los Reinos Archaea,

Eukarya y Virus. Se han descrito variaciones adicionales en en los plásmidos de algunas

cepas que varían entre 2 y 138 kb y que contienen genes que codifican para efectores

del Sistema de Secreción tipo III (SST3) y el Sistema de Secreción tipo IV (SST4) entre

otros (Comas et al., 2006; Lima et al., 2008; Lu et al., 2008; Ryan et al., 2011).

Existen dos clúster relacionados con patogénesis comunes en el genoma de todas las

Xanthomonas secuenciadas, el clúster xps, que codifica para el Sistema de Secreción

Introducción

6

tipo II (SST2) y el clúster rpf (regulation of pathogenicity factors), de regulación de

factores de patogenicidad (Ryan et al., 2011). El SST2 está encargado del transporte de

enzimas degradadoras de la pared celular, está presente en todas las Xanthomonas, en

Xylella fastidiosa y el género Stenotrophomonas. Además Xanthomonas campestris pv.

campestris, Xanthomonas citri subsp. citri y Xanthomonas euvesicatoria poseen un

segundo SST2 cuya función no parece estar relacionada con virulencia. El sustrato de

este sistema de secreción es variable en función de la especie, por lo que es posible que

también influya en los procesos que determinan la especificidad de huésped. Otros dos

elementos relacionados con virulencia comunes a todas las Xanthomonas, menos a X.

albineans, son el SST3 que tiene como función inyectar efectores de virulencia en las

células del huésped y los genes gum, encargados de la producción del exopolisacárido

característico de este género, la denominada goma xanthana.

Se han identificado en el género Xanthomonas hasta 53 efectores de virulencia. Algunos

de estos efectores poseen un papel determinante en virulencia o avirulencia y pueden ser

responsables de restringir la gama de huésped a unas especies vegetales o incluso a

variedades dentro de una misma especie vegetal. Todas las Xanthomonas estudiadas, a

excepción de X. campestris pv. armoraciae con solo seis efectores y X. albineans sin

efectores descritos, poseen nueve efectores comunes (xopR, xopK, xopL, xopN, xopP,

xopQ, xopX, xopZ y avrBs2). Además se han descrito cuatro efectores conservados tanto

en X. axonopodis, como en aquellas especies denominadas como tal en el pasado:

xopF1, xofE2, avrXacE3 y pthA. Otros efectores de virulencia descritos se han

relacionado con una única especie bacteriana en un huésped determinado, como es el

caso de varios genes xop presentes en X. campestris causantes de enfermedad en

crucíferas o los genes xopA1 y xopE3, localizados en islas de patogenicidad (o

genómicas) en X. citri subsp citri o X. fuscans subsp. aurantifolii ambos patógenos de

cítricos y X. arboricola pv. pruni patógena de frutales de hueso (Garita-Cambronero et

al., 2014; Moreira et al., 2010b; Ryan et al., 2011).

Otros elementos relacionados con patogénesis y asociados a la especificidad de huésped

o tejido son los distintos tipos de adhesinas, tanto fimbriales como no fimbriales (Ryan

et al., 2011), los sensores ambientales tales como las proteínas aceptoras de grupos

metilo (MCPs: Methyl Accepting Chemotaxis Proteins), los sensores de los sistemas de

regulación de dos componentes (STCR: Sensors of Two-Component Regulatory System)

y los transportadores dependientes de TonB (TBDT: TonB-Dependent Transporters). Se

Introducción

7

ha descrito que la mayoría de los patovares pertenecientes al género Xanthomonas

poseen patrones distintos de las proteínas anteriores, siendo X. citri subsp. citri el que

posee el mayor número de patrones distintos. Además se ha demostrado que muchos de

esos genes se encuentran bajo selección positiva en la planta huésped (Mhedbi-Hajri et

al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al., 2011b; Ryan et al., 2011).

2. Cancrosis o Chancro de los Cítricos

La cancrosis o chancro de los cítricos está causada por las especies Xanthomonas citri

subsp. citri (Xcc) y X. fuscans subsp. aurantifolii (Xfa), es una enfermedad distribuida

en zonas tropicales y subtropicales productoras de cítricos (Figura 3, pág. 8). En la

actualidad se encuentra distribuida en más de 30 países pertenecientes a Asia, África,

América y Oceanía.

La primera detección de la enfermedad tuvo lugar en el siglo XIX, en la India,

considerándose esta zona como el centro de origen de la enfermedad (Bitancourt, 1957;

Civerolo, 1984; Civerolo, 1985; Mohammadi et al., 2001). Hoy en día el chancro de los

cítricos es una de las enfermedades de cítricos que ha causado mayores pérdidas

económicas en la producción de cítricos a nivel mundial (Stall y Civerolo, 1991).

Las Xanthomonas causantes de chancros en cítricos son catalogadas como patógenos de

cuarentena en las zonas productoras de cítricos donde no está presente. En la Unión

Europea (UE) están consideradas como organismos de cuarentena y se encuentran

reguladas por la Directiva de la comunidad europea 2000/29/EC (Diario Oficial de las

Comunidades Europeas, 2000). Además se encuentra en la lista de patógenos de

cuarentena de la Organización Europea y Mediterránea para la Protección Vegetal

(EPPO, 2005), en la Organización de Protección Vegetal Norteamericana (North

American Plant Protection Organization, NAPPO), la Comisión Fitosanitaria Inter-

Africana (Inter-African Phytosanitary Commission, IAPSC), y el Board of the

Cartegena Agreement (JUNAC).

2.1. Tipos de cancrosis o chancros descritos

Existen distintos tipos de chancros de los cítricos en función de las cepas bacterianas

que los producen. Todas ellas, dan lugar a síntomas muy similares, aunque muestran

diferente gama de huésped (Stall y Civerolo, 1991) (Figura 4). Además, las cepas

Introducción

8

responsables se han podido separar y caracterizar en función de la sensibilidad a fagos,

características serológicas, patrones de RFLPs (Restriction fragment length

polymorphism) y también es posible separarlas mediante PCR (Polymerase chain

reaction) y la utilización de distintos cebadores, entre otros (Gottwald et al., 2002a).

Figura 3. Distribución a nivel mundial de Xanthomonas citri subsp. citri (EPPO, 2005).

Figura 4. Tipos de chancros descritos y su virulencia en plantas huéspedes con distinta

susceptibilidad a la enfermedad (Brunings y Gabriel, 2003).

Introducción

9

Chancro o cancrosis tipo A (Asiatic Citrus Canker) 2.1.1.

El chancro tipo A está causado por Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (anteriormente

como Xanthomonas axonopodis pv. citri) (Schaad et al., 2005) es originario del

continente asiático.y es el que tiene mayor importancia económica por encontrarse

distribuido a nivel mundial, e incluso haber desplazado a los tipos B y C allí donde

estaban presentes (Stall y Civerolo, 1991). El chancro tipo A es el más agresivo y es

capaz de producir enfermedad en la mayoría de las especies de cítricos, además de en

otros géneros pertenecientes a las Rutaceae, como por ejemplo el naranjo espinoso o

trifoliado (Poncirus trifoliata). Los cítricos más susceptibles son pomelo (Citrus

paradisi), naranjo dulce (Citrus sinensis), lima mejicana (Citrus aurantifolia) y algunos

híbridos utilizados como píes en los injertos. Entre los menos susceptibles se encuentran

el mandarino (Citrus x tangerina) y el kumquat (Fortunella margarita) (Graham et al.,

2004). Está descrito que la resistencia en kumquat se debe a la activación de genes

relacionados con la muerte celular programada y la respuesta hipersensible: degradación

de proteínas, producción de especies reactivas de oxígeno y regulación de la fotosíntesis

(Abeer A Khalaf et al., 2011). Estudios comparativos de los transcriptomas del kumquat

(tolerante al chancro) y del naranjo dulce (susceptible) han mostrado que, durante la

infección, ambas especies activan genes relacionados con defensa, entre ellos quitinasas

y glucanasas En el kumquat se activan un mayor número de genes de este tipo, mientras

que en el naranjo dulce se reprimen, muchos de ellos relacionados con fotosíntesis (Fu

et al., 2012).

Dentro del chancro tipo A están descritos varios subgrupos de CBC. El primero de ellos

se ha denominado tipo A* (Vernière et al., 1998), inicialmente identificado en Oman,

Arabia Saudí, Irán e India. Tiene un impacto importante en los cultivos de lima

mejicana en Asia y África (Derso et al., 2009; Ngoc et al., 2007). Las cepas de Xcc tipo

A* poseen una limitada gama de huésped, pudiendo únicamente producir lesiones

típicas de la enfermedad en lima mejicana aunque son capaces de dar lugar a manchas

acuosas en otros cítricos y de aumentar su población en hojas de pomelo al mismo nivel

que Xcc tipo A (Escalon et al., 2013; Rybak et al., 2009; Vernière et al., 1998). Las

cepas tipo A* poseen características similares a las de los chancros tipo B y C respecto a

la gama de huésped sin embargo las pruebas de hibridación de ADN, amplificación por

PCR con cebadores específicos , perfil de RFLPs y otras pruebas fenotípicas las

clasifican claramente dentro del grupo de las Xcc A. Comparten además con Xcc A el

Introducción

10

patrón de asimilación descrito para el tipo A en las placas de Biolog® GN para L-

fucosa, D-galactosa y alaninamida (Vernière et al., 1993), aunque no reacciona con el

anticuerpo altamente específico MAb A1 ni con el antisuero policlonal para la cepa

modelo Xcc 62 (tipo A) (Vernière et al., 1998).

La cepa Xcc Aw fue descrita en el Sur de Florida (EEUU) en el año 2000 en lima

mejicana y Citrus macrophylla (Sun et al., 2004), aunque parece ser originaria de la

India (Bui Thi Ngoc et al., 2009; Schubert et al., 2001). Al igual que las cepas tipo A*,

posee una limitada gama de huésped pero es capaz de producir respuesta hipersensible

en pomelo Duncan cuando es inoculado por infiltración. Presenta un perfil similar en las

placas de Biolog® GN que las cepas tipo Xcc A y A*, además de las mismas

características génicas, sin embargo al igual que Xcc A* no reacciona con el anticuerpo

MAb A1 lo que permite distinguirlas de las cepas de amplia gama de huésped (Cubero y

Graham, 2002; Sun et al., 2004).

Se han descrito otros tipos de cepas de CBC en Taiwán que también pertenecen al

chancro tipo A, pero que son consideradas subgrupos distintos (Af, A

r y A

p). El

subgrupo Af es capaz de producir infección en lima mejicana, siendo solo capaz de

producir lesiones necróticas en otros hospedadores, al igual que sucede con los

subgrupos Aw y A*. El subgrupo A

r parece tener amplia gama de huésped produciendo

lesiones típicas de chancro que carecen del halo acuoso alrededor de la lesión,

posiblemente debido a una mutación en el gen que codifica para la pectina Pel1 (Lin et

al., 2010). El subtipo del chancro tipo A descrito como Ap, únicamente es capaz de

producir lesiones necróticas planas con halo clorótico y mancha acuosa en todos los

huéspedes. Estas cepas originarias de Taiwán comparten con Xcc las características

bioquímicas y fisiológicas descritas para esta subespecie, diferenciándose de las cepas

de limitada gama de huésped en los análisis ERIC-PCR, amplificación por PCR

convencional con primers específicos para Xanthomonas asociadas a cítricos,

secuencias del gen lrp, y actividad pectolítica que diferencia el grupo Ar del resto de las

Xcc descritas (Lin et al., 2005; Lin et al., 2008).

El Chancro tipo B 2.1.2.

El chancro tipo B está causado por Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii

(anteriormente Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii) y fue descrito en Argentina en

1923 (Civerolo, 1984). Las cepas de este tipo de chancro producen enfermedad en

Introducción

11

limonero, lima mejicana, naranjo amargo y pomelo. El chancro tipo B se distingue del

chancro tipo A a pesar de ser igual de virulento en un huésped altamente sensible como

el limonero (Gottwald y Timmer, 1995). Las cepas del tipo B se distinguen de las del

chancro tipo A en la utilización de lactosa y maltosa, la susceptibilidad al fago CP3 y en

algunas características serológicas y moleculares (Gottwald et al., 2001; Graham et al.,

2004; Stall y Civerolo, 1991).

El Chancro tipo C 2.1.3.

Al igual que el chancro tipo B, está causado por Xanthomonas fuscans subsp.

aurantifolii, fue descrito en lima mejicana en el año 1963 en el Estado de San Paulo en

Brasil. Las cepas de este chancro producen enfermedad tanto en lima mejicana como en

naranjo amargo. Estas cepas se distinguen de las de los chancros anteriores por su

resistencia a los fagos CP1 y CP2 y por otras características serológicas y moleculares

(Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991).

Chancros tipo D y E 2.1.4.

Otras enfermedades causadas por bacterias y hongos fueron descritas como chancros de

los cítricos, pero posteriormente se determinó que eran enfermedades distintas, es el

caso de los chancros tipo D y E. El primero se describió en Méjico en 1981, la

enfermedad cumplía con las características típicas de los chancros tipo A, pero producía

un reducido número de lesiones en hojas y tallo de cítricos. Fue denominado bacteriosis

de los cítricos. Posteriormente, se determinó que dicha enfermedad era producida por

Alternaria limicola y la enfermedad se denominó mancha de los cítricos (Graham et al.,

2004; Stall y Civerolo, 1991). El segundo de ellos denominado actualmente mancha

bacteriana de los cítricos (en adelante CBS, del inglés “Citrus Bacterial Spot”), está

causado por X. alfalfae subsp. citrumelonis y es un problema menor en plantas de

vivero. Esta enfermedad se caracteriza por la aparición de lesiones planas de color pardo

con mancha acuosa alrededor en hojas y tallos en diversas variedades de cítricos

(Graham et al., 2004; Stall y Civerolo, 1991). La aparición de CBS en Florida y la

confusión inicial en la identificación y caracterización de las cepas bacterianas

causantes, dio lugar a un programa de erradicación que supuso un altísimo coste para el

estado y los productores. Aún hoy en día es frecuente el error cuando el diagnóstico de

la enfermedad se basa únicamente en la observación de síntomas (Graham et al., 2004).

Introducción

12

2.2. Descripción de la enfermedad

Toda la parte aérea de la planta es susceptible a la infección por el chancro de los

cítricos, aunque cuando las hojas y frutos se encuentran completamente desarrollados

son menos susceptibles a la enfermedad (Graham et al., 2004).

En el medio natural la infección óptima tiene lugar con un inóculo de 104-10

5 cfu/ml

cuando se inoculan estomas y entre 102 y 10

3 si se inocula por herida, a pesar de esto,

los síntomas pueden producirse por la presencia de un número muy limitado de

bacterias (Gottwald y Graham, 1992).

Síntomas 2.2.1.

En hojas las infecciones se producen por la entrada del patógeno a través de estomas o

heridas (Graham et al., 1992a; Graham et al., 1992b; Koizumi y Kuhara, 1980; Pruvost

et al., 2002). Los primeros síntomas comienzan a aparecer aproximadamente a los

nueve días de la inoculación como pequeños abultamientos en la superficie foliar.

Según va avanzando la enfermedad, las lesiones adquieren un tono marrón rodeado de

un halo clorótico y aparecen manchas acuosas que desaparecen con el tiempo. El centro

de la lesión se eleva sobre la superficie de la hoja adquiriendo una textura esponjosa y

acorchada que normalmente adopta forma de cráter (Figura 5 A, B, D, E y F, pág. 13).

Cuando la enfermedad se hace más acusada puede producir caída tanto de hojas como

de frutos provocando una disminución en la producción (Schubert et al., 2001).

En frutos los síntomas son similares a los de las hojas; lesiones elevadas de textura

acorchada rodeadas de halos acuosos (Figura 5 C, pág. 13). Son variables en tamaño y

únicamente tiene lugar en la parte más externa de la piel (Civerolo, 1984). Cuando el

fruto tiene un tamaño comprendido entre 20 y 40 mm las lesiones aumentan durante un

periodo de 106 días aproximadamente (Graham et al., 1992b).

Introducción

13

Figura 5. Síntomas producidos por Xanthomonas citri subsp. citri en hojas de lima mejicana (A, E y F) (E

y F: microscopía electrónica de barrido de las lesiones) y en campo de hojas y frutos de pomelo (B, C y

D). En la imagen C se puede ver el exudado proveniente de las lesiones. Fotos realizadas por Marta Sena

Vélez.

Las lesiones en los brotes y ramas son similares a las observadas en hojas y frutos, pero

no producen halo clorótico. Además, perpetúan el inóculo prolongando la vida del

patógeno que puede ser el origen para las nuevas infecciones (Graham et al., 2004).

Figura 6. Lesiones de Xcc producidas en ramas (Gottwald et al., 2002a).

Introducción

14

La aparición de síntomas y la severidad de los mismos pueden depender de varios

factores, como la edad del tejido, la temperatura y la humedad.

La edad o estado de desarrollo del tejido es uno de los factores que más afecta a la

formación de manchas acuosas, penetración de la bacteria y desarrollo de los síntomas

(Graham et al., 1992b). Además, es un factor importarte en inoculaciones de la bacteria

mediante pulverización en hojas y frutos, siendo este método el que mejor simula el

proceso natural de infección. La sensibilidad de las hojas jóvenes se debe a su mayor

capacidad para acumular agua en su superficie y a la menor abundancia de ceras que

puedan dificultar la entrada del patógeno (Figura 7). Sin embargo, el tamaño y número

de estomas en la superficie foliar no varía con la edad de la hoja por lo que la diferencia

en la susceptibilidad de las hojas jóvenes no está relacionada con este hecho (Gottwald

y Graham, 1992; Graham et al., 1992a).

Figura 7. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la cara abaxial de hojas de pomelo (Citrus

paradisi) en distintos estados de desarrollo de la hoja (A) 50% de la expansión, la cutícula todavía no se

ha formado sobre la pared celular. (B) 75% de la expansión, la cutícula es un 15% del grosor final. (C)

hoja desarrollada y cutícula completamente formada. Graham et al. 2004

Introducción

15

El periodo de mayor susceptibilidad de la hoja tiene lugar cuando éstas se encuentran

entre un 50 y un 75 % del desarrollo total (Gottwald y Graham, 1992).

El periodo de mayor susceptibilidad de los frutos comprende desde la caída de los

pétalos de la flor hasta el completo desarrollo, siendo especialmente sensibles cuando

tiene lugar la formación de los estomas (Graham et al., 1992b). Los frutos muy jóvenes,

con menos de 20 mm de diámetro, presentan una susceptibilidad menor debido a que los

estomas no se han formado todavía. Si la infección tiene lugar cuando éstos se

encuentran en una etapa temprana del desarrollo se produce mayor sintomatología y se

llegan a producir roturas y malformaciones del fruto (Vernière et al., 2003). Cuando se

inoculan frutos de forma artificial, bien produciendo heridas o por pulverización,

aquellos que tienen un menor tamaño (entre 15 y 20 mm) muestran una mayor

sensibilidad a la enfermedad. Esta sensibilidad disminuye durante la maduración del

fruto como consecuencia de la secreción de ceras y el desarrollo estomático que hacen

que el fruto retenga menos cantidad de agua en superficie (Gottwald y Graham, 1992;

Graham et al., 1992b; Vernière et al., 2003). A pesar de que los frutos maduros son muy

poco susceptibles a la infección pueden contener bacterias en su superficie y

especialmente en heridas que suponen reservorios y fuente de inóculo de nuevas

infecciones (Gottwald et al., 2009).

Los brotes y los tallos también son susceptibles de ser infectados, generalmente

mediante heridas naturales o producidas durante el manejo del cultivo y, sobre todo, se

producen en tejidos poco lignificados. Son importantes porque, pueden servir de

reservorio de inóculo por periodos más prolongados de tiempo que las hojas o los frutos

(Vernière et al., 2003).

La temperatura óptima para el desarrollo de síntomas se encuentra entre 20ºC y 30ºC

con un máximo de 35ºC (Christiano et al., 2009; Dalla Pria et al., 2006; Graham et al.,

2004). Pocas veces se observan lesiones a temperatura mayores de 42ºC o menores de

10ºC. Además, el número, tamaño y densidad de las lesiones aumenta con la

temperatura desde los 15 a los 35ºC (Figura 8). Para que se produzcan síntomas las

plantas requieren un mínimo de humedad, que tiene un especial efecto en el número,

tamaño y densidad de las lesiones, especialmente a temperaturas mayores de 30ºC

(Dalla Pria et al., 2006; Christiano et al., 2009).

Introducción

16

Figura 8. Efecto combinado de la temperatura y la humedad en el desarrollo

del chancro de los cítricos en lima de Tahití en plantas de 25 cm de altura en

cámaras de cultivo (Christiano et al., 2009). En la gráfica A se ve el efecto de

estos factores en el área debajo de la curva, B la densidad de lesiones, C el

tamaño de la lesión y D la severidad.

La enfermedad se ve favorecida por climas en los que la temperatura y la lluvia

ascienden y desciende al mismo tiempo, haciéndose por lo tanto más severo en áreas

cálidas y húmedas como son las zonas tropicales o subtropicales (Das, 2003). En zonas

como Argentina o Japón donde existen inviernos fríos, la población bacteriana

disminuye a causa de las bajas temperaturas que tienen lugar en esa época del año

(Koizumi, 1977; Stall et al., 1980). Sin embargo en zonas tropicales como la Isla

Reunión la población permanece constante durante todo el año (Pruvost et al., 2002).

Ciclo de la enfermedad y epidemiología 2.2.2.

Como se ha mencionado anteriormente Xcc es capaz de multiplicarse en todas las partes

aéreas de la planta, tanto hojas y frutos, como ramas y brotes. Desde la cavidad

subestomática y en presencia de agua en superficie las bacterias son capaces de salir al

exterior a través de los estomas pudiendo propagarse y producir nuevas infecciones

Introducción

17

(Figura 9A). El número de bacterias que se libera al exterior es solo una parte de la

población bacteriana, que se ha calculado aproximadamente en unas 100 unidades

formadoras de colonia (ufc, en adelante) por mililitro (mL) en lesiones jóvenes de entre

4 y 6 meses. Si las lesiones son más antiguas, la liberación de bacterias es menor y va

disminuyendo con el tiempo (Timmer et al., 1991). El agua de lluvia recogida de hojas

con lesiones puede contener alrededor de 100 ufc mL-1

.

El mejor agente de dispersión de Xcc es el viento, aunque ésta también tiene lugar por la

arena transportada en él o la maquinaria y enmiendas agrícolas. La dispersión se ve

favorecida por daños mecánicos y actividades humanas como el movimiento de

variedades de una zona geográfica a otra (Gottwald et al., 2002a; Irey et al., 2006).

Figura 9. A: bacterias saliendo de un estoma a las 48 horas de la inoculación; B: heridas producidas por el

movimiento del viento y las espinas de la planta infectadas con Xcc; C: Phyllocnistis citrella Stainton,

minador de los cítricos en estadio adulto y larva en la hoja; D: dispersión del patógeno en hoja causada

por el minador de los cítricos. Gottwald et al. 2002.

Introducción

18

No se ha podido probar la diseminación de Xcc a través de insectos, sin embargo el

minador de los cítricos Phyllocnistis citrella (Stainton) favorece el desarrollo de la

enfermedad, tanto en hojas como tallos jóvenes (Figura 9-C y D) y en algunos casos

frutos de pequeño tamaño (Graham et al., 2004). El daño causado por este insecto es

debido a la formación de galerías producidas por la alimentación y el movimiento del

insecto que favorece la proliferación de Xcc en el espacio subcuticular parenquimático.

La formación de galerías y la degradación del tejido vegetal producen un aumento en el

número de lesiones y la infección causada por el chancro de los cítricos (Heppner,

1993). Las galerías hacen que el tejido sea más susceptible durante un periodo

comprendido entre 7 y 14 días, mientras que las causadas por espinas o poda solo lo son

durante 24 horas (Das, 2003). Cuando se inoculan plantas con el segundo y tercer

estadío larvario o con la pupa del minador, los daños causados por el chancro son entre

el 95 y 100% de hojas infectadas porcentaje similar al producido por heridas mecánicas

(Chagas et al., 2001).

Cuando la superficie foliar de los cítricos infectados con Xcc se recubre de agua, las

bacterias se liberan al exterior de la planta, sirviendo de inóculo para nuevas

infecciones. La cantidad de agua mínima necesaria para que se liberen las bacterias es

de 8 mm h-1

. El número de bacterias que se libera de los estomas disminuye con la

duración de la lluvia como consecuencia de una disminución en el inóculo disponible

(Timmer et al., 1991) y está relacionado con la población en el interior de la hoja

(Pruvost et al., 2002). El número de lesiones disminuye en ausenciade lluvia puesto que

las hojas viejas se caen y los nuevos tejidos no son infectados (Gottwald y Timmer,

1995).

El viento se ha descrito como la forma de dispersión más importante, tanto el seco como

aquel que contiene gotas de agua en las que la bacteria está presente (Gottwald y Irey,

2007; Irey et al., 2006). El viento fuerte hace que las hojas y lesiones sean fuentes de

inóculo más eficientes (Bock et al., 2010a; Bock et al., 2010b) y de hecho el uso de

barreras de viento para proteger los huertos se ha revelado como un método eficaz para

el control de la enfermedad (Gottwald y Timmer, 1995).

Se ha demostrado que en condiciones de calma o viento suave, las hojas y gotas de agua

que contienen el inóculo se depositan en zonas cercanas o directamente en el suelo. Con

el aumento de la velocidad del viento, alrededor de 8 m sg-1

, se produce un aumento de

la cantidad de inóculo que puede ser desplazado a distancias mayores, lo que produce

Introducción

19

nuevos focos de infección en el campo. Además, las condiciones de viento turbulento

favorecen la dispersión del patógeno dentro de la misma planta, así como la entrada del

mismo al interior celular lo que produce un aumento en la severidad de la enfermedad

(Bock et al., 2010a; Bock et al., 2012; Pruvost et al., 2002).

Figura 10. Ciclo del chancro de los cítricos (Sena-Vélez et al., 2015a).

Una vez se encuentran en la superficie vegetal, las bacterias causantes de chancros en

cítricos entran por estomas o heridas al apoplasto donde son capaces de crecer y

multiplicarse. La bacteria es capaz de sobrevivir siempre que esté relacionada con la

planta huésped, ya sea en los márgenes de las lesiones de hojas y frutos en el árbol o en

el suelo hasta que se descomponen, además pueden sobrevivir en las ramas infectadas

durante varios años (Gottwald et al., 2002a).

Establecida la infección la población bacteriana disminuye significativamente con el

tiempo. Las lesiones de 1 a 6 meses tienen una población mayor que las lesiones de 8 a

18 meses. Alrededor de los 8 y 10 meses la población disminuye una unidad logarítmica

y a los 18 meses 1,5 unidades logarítmicas. En la superficie foliar el número de

bacterias detectadas está comprendido entre 102 y 10

3 cfu por gramo de hoja (Pruvost et

al., 2002).

Introducción

20

2.3. Diagnóstico y detección

En general no existen tratamientos químicos efectivos para el control de bacterias

fitopatógenas, por lo que la mejor medida de control para las bacteriosis es la

prevención (López et al., 2009). Esta medida es especialmente importante en el caso de

enfermedades de cuarentena como el chancro o cancrosis de los cítricos en la Unión

Europea (Diario Oficial de las Comunidades Europeas, 2000). La utilización de técnicas

precisas y eficientes de detección e identificación es fundamental para prevenir la

propagación de un patógeno y especialmente para el control del material vegetal. Los

síntomas causados por Xcc pueden confundirse con los producidos por otras

enfermedades como la sarna de los cítricos causada por Elsinoe fawcettii en naranjo

dulce y limonero, la antracnosis causada Glomerella cingulata o la melanosis causada

por Diaporthe citri, con lo cual la observación visual no es suficiente para el

diagnóstico correcto de la enfermedad (EPPO, 2005). Además, es conocida la existencia

de cepas de Xanthomonas saprófitas en cítricos que no son Xcc, por lo que una correcta

identificación de las cepas es imprescindible para evitar errores que puedan llevar

pérdidas innecesarias como las producidas en Florida en el caso de la mancha bacteriana

de los cítricos (EFSA Panel on Plant Health, 2014; Graham et al., 2004).

Para el diagnóstico y detección de Xcc existen un gran número de metodologías que han

ido mejorando a medida que han avanzado las técnicas de biología molecular y su

aplicación a la patología vegetal. Oficialmente a nivel europeo no existe ningún

protocolo para la detección del patógeno, sin embargo la EPPO (European and

Mediterranean Plant Protection Organization) desarrolló un protocolo (PM 7/44(1)) en

el año 2005 que se usa en varios laboratorios de la Unión Europea (EPPO, 2005). En

agosto de 2014, se publicó un protocolo por parte de la IPPC-FAO (International Plant

Protection Convention) que ha sido coordinado por investigadores de Brasil, Uruguay y

España, donde se describen protocolos para la detección de este patógeno en plantas

tanto sintomáticas como asintomáticas (Figura 11) (IPPC-FAO, 2014). En ambos

protocolos se describen técnicas similares.

Introducción

21

Figura 11. Protocolo IPPC para la detección de Xcc en plantas (IPPC-FAO, 2014).

Introducción

22

El primer paso en el diagnóstico de la cancrosis de los cítricos es la observación de los

síntomas en planta y en fruto y el aislamiento del patógeno. Para el aislamiento es

preferible la utilización de material fresco, aunque puede almacenarse entre 4 y 8ºC. Los

extractos vegetales se cultivan en placas de medio semiselectivo a los que,

preferiblemente, se les añade cefalexina o kasugamicina para evitar el crecimiento de

saprófitos (IPPC-FAO, 2014). Sin embargo la visualización de síntomas y el

aislamiento de patógeno no permiten diagnosticar con certeza la enfermedad, es por

ellos que se han desarrollado otras metodologías.

La realización de test de patogenicidad permite completar el diagnóstico de la

enfermedad mediante aislamiento e inoculación de plantas huésped. Para la

identificación de Xcc y poder distinguir los tipos de chancros se han descrito plantas

indicadoras, que además indican la gama de huésped de las posibles Xathomonas

(Pomelo Duncan, naranjo dulce var. Valencia y lima mejicana) (EPPO, 2005; IPPC-

FAO, 2014; Rybak et al., 2009).

Las técnicas serológicas pueden usarse para la detección del patógeno desde un cultivo

puro o en planta. Se basan en el reconocimiento de un antígeno correspondiente al

patógeno a través de anticuerpos y no distingue entre bacterias vivas o muertas. Para

detección e identificación del patógeno se pueden usar inmunofluorescencia, ELISA

(Enzyme-Linked Inmunosorbent Assay), DAS-ELISA o ELISA indirecto (Alvarez et al.,

1991; Alvarez, 2004; Civerolo, 1984; IPPC-FAO, 2014).

Las características bioquímicas del género Xanthomonas son muy similares entre sí, por

lo que es difícil distinguir mediante estas a las distintas Xanthomonas causantes de

chancros (tipos A, B y C) y de X. alfalfae subsp. citrumelonis. Algunas de estas

técnicas, basadas en el análisis enzimático y la utilización de distintos compuestos de

carbono, se han usado sin embargo para la identificación y caracterización de cepas

causantes de cancrosis (EPPO, 2005; IPPC-FAO, 2014; Vernière et al., 1993; Vernière

et al., 1998).

Las técnicas moleculares permiten la detección e identificación del patógeno, así como

el diagnóstico de la enfermedad en plantas sintomáticas y asintomáticas. La ventaja de

estas técnicas frente a los métodos de inoculación y pruebas de patogenicidad es la

duración del protocolo, que se reduce considerablemente. Entre las más utilizadas se

encuentran las técnicas de PCR tanto convencional como en tiempo real, el análisis

Introducción

23

multilocus, el estudio de secuencias de ADN repetidas y NASBA (Nucleic Acid

Sequence Based Amplification).

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR con cebadores específicos se recomienda

como método eficiente y rápido para la detección de Xcc y Xfa (EPPO, 2005; Henson y

French, 1993; Mavrodieva et al., 2004). Se han descrito distintas parejas de cebadores

para la detección por PCR convencional de las cepas de CBC tipo A (incluyendo los A*

y Aw), B y C basados en distintas secuencias de diferentes partes de los genomas. Las

parejas de cebadores diseñadas por Hartung y col. en 1993 y Cubero y Graham en 2002

han sido las seleccionados por los protocolos de la EPPO y de IPPC-FAO (Cubero y

Graham, 2002; EPPO, 2005; Hartung et al., 1993; IPPC-FAO, 2014) para la detección

de patógenos causantes del chancro bacteriano de los cítricos, recomendándose, en

algunos casos el uso de ambas parejas de cebadores. Mediante PCR convencional,

también es posible identificar el tipo de cepa que está causando la enfermedad,

aspectoimportante sobre todo cuando hay en marcha un programa de erradicación. Si la

enfermedad es causada por Xcc tipos A* o Aw las medidas se aplican únicamente a sus

plantas huésped, generalmente lima mejicana; sin embargo si es causada por el chancro

tipo A, todos los cítricos de un área determinada deben ser eliminados (Cubero y

Graham, 2005; Sun et al., 2004). Para realizar la identificación se usan cultivos puros de

los patógenos aislados de la planta y dos parejas de cebadores (IPPC-FAO, 2014), los

descritos anteriormente J-pth1/2 ó J-Rxg/Rxc2, basados en la secuencia de la región

intergénica ITS (Internal Transcribed Spacer) (Cubero y Graham, 2002) junto con

Xac01/02 que corresponden con secuencias de los genes rpf (regulation of

pathogenicity factors) (Coletta-Filho et al., 2006) o XACF/R basados en la secuencia

del gen hrpW (Suk Park et al., 2006).

La PCR en tiempo real se considera el método más efectivo para la detección del

patógeno en material vegetal, sobre todo cuando se utilizan sondas Taq-Man que

aumentan la especificidad del método (Cubero y Graham, 2005; Golmohammadi et al.,

2007). Permite la detección de hasta 10 ufc mL-1

tanto en planta como en fruto

(Golmohammadi et al., 2007; Mavrodieva et al., 2004). Además, permite identificar las

distintas cepas pertenecientes a Xcc A, A* y Aw mediante discriminación alélica del gen

lrp (del inglés leucine-responsive regulatory protein) (Cubero y Graham, 2004; Cubero

y Graham, 2005).

Introducción

24

El análisis multilocus, basado en la secuenciación de entre 4 y 8 genes de

mantenimiento celular o housekeeping (IPPC-FAO, 2014) o 12 genes(Pruvost et al.,

2014b), que se concatenan en una única secuencia (multilocus), es uno de los

procedimientos utilizados en la identificación de las cepas de Xanthomonas. La

secuencia concatenada se compara con la de otras de bacterias ya conocidas disponibles

en bases de datos generales o más específicas como la Plant Associated Microbes

Database (PAMDB) determinando así el patógeno hasta nivel de patovar o gama de

huésped (Bui Thi Ngoc et al., 2010; Young et al., 2008b).

Las secuencias de ADN repetidas tales como las secuencias extragénicas palindrómicas

repetitivas (rep del inglés repetitive extragenic palindromic), las secuencias BOX y las

ERIC (enterobacterial repetitive consensus) han permitido la identificación del

patógeno hasta nivel de patotipo (Cubero y Graham, 2002; Koupaei et al., 2013; Louws

et al., 1994).

La técnica denominada NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), ha

permitido la detección de Xcc desde material vegetal realizando una extracción de ARN

total a partir de la planta infectada. Esta técnica se basa en la amplificación de

ARNmque sirve como buen marcador de células viables al ser este ácido nucleico

inestable y sufrir una rápida degradación una vez sintetizado. El límite de detección de

esta técnica es de 104 cfu mL

-1 (Golmohammadi et al., 2012; Scuderi et al., 2010).

2.4. Control

La cancrosis de los cítricos está presente en más de 30 países. Para evitar su avance es

importante disponer de eficaces métodos de detección y control, y en los casos en los

que aún sea posible proceder a la erradicación con el fin de mantener zonas libres de

chancro, reduciendo asimismo, el impacto económico en los mercados (Golmohammadi

et al., 2007).

Prevención 2.4.1.

En la actualidad todavía no se ha encontrado ningún método efectivo para controlar la

enfermedad en campo (EFSA Panel on Plant Health, 2014), por lo que se recomienda

como primera medida de control prevenir la entrada del patógeno a zonas libres del

mismo (Civerolo, 1984; Graham et al., 2004).

Introducción

25

La Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA en adelante del inglés

European Food Safety Authority), ha realizado un informe sobre el riesgo de entrada de

las distintas especies que causan chancro en cítricos en la Unión Europea y sus

consecuencias. Se considera que la probabilidad de entrada y establecimiento de esta

enfermedad es entre probable y moderadamente probable, dadas las prácticas culturales

que se dan en el cultivo de cítricos en la Unión Europea, la importación de material

vegetal y el clima entre otros factores (EFSA Panel on Plant Health, 2014).

Figura 12. Zonas de cultivo de cítricos en la Unión Europea (las zonas de Chipre y Malta no han sido

incluidas). Los colores determinan el riesgo de establecimiento de la enfermedad tanto en zonas

productoras como no productoras (EFSA Panel on Plant Health, 2014).

En la Figura 12 se muestra un mapa con el riesgo potencial de la entrada del chancro en

países de la Unión Europea, incluyendo áreas de cultivo y no cultivo. La introducción

de esta enfermedad en la Unión Europea tendría un alto impacto en el cultivo y la

economía de las zonas productoras; se estima que la introducción de la cancrosis o

chancro tendría graves consecuencias sociales, debido a las pérdidas directas en campo

y a aquellas indirectas consecuencia de las limitaciones que se producirían en relación a

las exportaciones de fruta a países libres de la enfermedad. Además, se produciría una

reducción en el mercado de plantas y pérdidas económicas derivadas del de la necesidad

Introducción

26

de uso de tratamientos químicos con el consiguiente impacto ambiental resultante de la

utilización de productos principalmente cúpricos.

Tabla 1. Probabilidad de entrada mediante distintos medios del chancro de los cítricos a través de material

vegetal en la Unión Europea (EFSA Panel on Plant Health, 2014).

Producto

Probabilidad de

entrada en la UE

derivada de la

presencia del patógeno

en origen

Probabilidad de

supervivencia

durante el

transporte

Probabilidad de

supervivencia tras

tratamientos

fitosanitarios

Probabilidad de

transmisión a otras

plantas huésped

Prob. Certeza Prob. Certeza Prob. Certeza Prob. Certeza

Fruta

Actividades

comerciales Probable Media Muy

probable Baja Muy

probable Baja Improbable Alta

Viajeros

De

probable a

muy probable

Media Muy

probable Baja

Muy

probable Baja Improbable Alta

Plantas para

producción

Actividades

comerciales Probable Media Muy

probable Baja Muy

probable Baja Muy

probable Baja

Viajeros Probable Media Muy

probable

Baja Muy

probable

Baja Muy

probable

Baja

Cítricos y

otras

rutáceas

para

ornamentales

Actividades

comerciales

Probable

para huéspedes

naturales

Moderada

para

posibles huéspedes

Baja para huéspedes

naturales

Alta para

posibles

huéspedes

Muy

probable Baja

Muy

probable Baja

Muy

probable Baja

Viajeros

Probable

para

huéspedes

naturales

Moderada

para posibles

huéspedes

Baja para

huéspedes

naturales

Alta para

posibles huéspedes

Muy

probable Baja

Muy

probable Baja

Muy

probable Alta

Hojas y

brotes

Actividades

comerciales

y viajeros

Probable Media Muy

probable Baja

Muy probable

Baja Muy

probable Alta

En España se cultivan 314.908 hectáreas de cítricos en todo el territorio, siendo el

mayor exportador de fruta de calidad a nivel mundial, además se realizan exportaciones

de material vegetativo libre de enfermedad a otros países. El sureste de España presenta

un clima relativamente favorable para el desarrollo y dispersión de la enfermedad,

puesto que en invierno las temperaturas no son muy bajas y en determinadas situaciones

se producen abundantes precipitaciones con altas temperaturas (EFSA Panel on Plant

Health, 2014). Debido al riesgo de entrada de los agentes causales de chancro en la

Unión Europea y las graves consecuencias que tendría en países mediterráneos, esta

enfermedad es objeto de preocupación por parte de la Unión Europea. Como

Introducción

27

consecuencia de ello se aplican fuertes medidas de cuarentena e incluso las cepas

pertenecientes a Xcc han sido consideradas como potenciales armas biológicas

(directiva 394/2006 EC) (Young et al., 2008a).

En la Unión Europea los agentes causales del chancro bacteriano de los cítricos (CBC)

se encuentran regulados por la Directiva 2000/29/CE. Todo el material que sea

importado y esté dentro de esa lista debe pasar controles y cumplir los requisitos

establecidos para poder ser introducido en la Unión Europea, entre ellos plantas o frutos

susceptibles de estar infectados por esta enfermedad. Todos los cítricos que entren en la

Unión Europea, deberán llevar un certificado fitosanitario y demostrar que están libres

de enfermedad en destino. Además, las plantas que sean introducidas se someterán a

controles cuarentenarios para comprobar que se encuentran libres de CBC. En el caso de

que algunos de los protocolos establecidos no se cumpla, o se detecte el patógeno, se

negará la entrada a dichos productos en la Unión Europea. Los países que detecten estos

problemas, deberán comunicárselo a los otros estados miembros

(http://ec.europa.eu/food/plant/organisms/imports/inspection_es.htm).

La cancrosis de los cítricos se ha descrito como una enfermedad susceptible de ser

erradicada dado que infecta un cultivo que es de un alto valor económico y alimentario,

posee una tasa moderada de dispersión y no existe un vector que transmita la

enfermedad, además la supervivencia de Xanthomonas en ausencia de planta huésped es

muy reducida. Los síntomas producidos por este patógeno son relativamente fáciles de

reconocer y su gama de huésped se encuentra restringida a la familia Rutaceae. Por

último, las medidas de control de Xcc son poco eficientes y de alto coste económico

(Barkley et al., 2014; Graham et al., 2004). En algunas zonas se han llevado a cabo

costosos programas de erradicación, que aunque han sido positivos en el control del

avance de la enfermedad no han conseguido eliminar completamente la bacteria en la

zona (Barkley et al., 2014; Gottwald et al., 2002b).

En los programas de erradicación tras realizar la eliminación de árboles, se deben hacer

controles periódicos para comprobar que no hay más introducciones, y pasado un

tiempo determinado la zona se puede declarar libre de enfermedad. Los protocolos a

realizar para la erradicación son variables en cada país (Barkley et al., 2014).

http://ec.europa.eu/food/plant/organisms/imports/inspection_es.htm

Introducción

28

Control químico 2.4.2.

Los tratamientos químicos más eficientes y más utilizados para el control de la

cancrosis de los cítricos son aquellos basados en derivados del cobre, como el caldo

bordelés, sulfato de cobre o hidróxido de cobre. Estos tratamientos disminuyen la

población de bacteria en el árbol y reducen la cantidad de inóculo y la probabilidad de

dispersión. El tipo de tratamiento y su efectividad, así como los tiempos y número de

aplicaciones dependen de la susceptibilidad, edad y fisiología de la planta, así como de

las condiciones climáticas de la zona y de los métodos control utilizados para otras

enfermedades (Behlau et al., 2010; Civerolo, 1984; EFSA Panel on Plant Health, 2014).

Los compuestos derivados del cobre son bactericidas de tipo protector, que deben de ser

aplicados antes de la llegada del patógeno, ya que una vez éste está establecido en el

interior de la planta ven reducida su eficacia. El cobre queda adherido a la superficie de

la planta, por lo tanto cuando las hojas o los frutos aumentan de tamaño el área no

cubierta por el producto es susceptible de ser infectada (Agrios, 2005; Dewdney et al.,

2012). No se conoce en profundidad el modo de acción, sin embargo se ha sugerido que

los iones de cobre producen rotura de la membrana celular, además parece que inducen

la formación de especies reactivas de oxígeno, lo que aumenta el estrés oxidativo (Grass

et al., 2011). En Xcc los tratamientos con cobre inducen el estado viable y no cultivable

(VBNC), un estado reversible en el cual las bacterias son incapaces de crecer en un

medio de cultivo, pero presentan actividad metabólica e incluso pueden mantener su

capacidad infectiva. El estado VBNC se considera como un estado de latencia de la

bacteria que puede prolongarse durante meses, y que constituye un mecanismo de

resistencia para la bacteria en condiciones de estrés (Del Campo et al., 2009;

Golmohammadi et al., 2013).

El tratamiento con cobre se considera bastante efectivo para evitar la infección de

frutos, sobre todo al inicio del desarrollo de los mismos, mientras que que en hojas

presentan una efectividad menor (Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham,

2013). El principal problema de los tratamientos con cobre es su limitación en el

tiempo, que obliga a realizar varias aplicaciones. Además tiene otros inconvenientes

como su carácter contaminante y su efecto fitotóxico, puesto que en suelos con alta

concentración de cobre el acceso a la planta de determinados nutrientes como el hierro

se reduce (Dewdney et al., 2012; Francis et al., 2008).

Introducción

29

Para el control del chancro de los cítricos en Florida, la Universidad de Florida ha

elaborado guías donde se describen los distintos métodos de control para la enfermedad.

En zonas donde la enfermedad es endémica, se recomienda la aplicación de cinco

tratamientos con base de cobre a partir del mes de abril, lo que se considera suficiente

para evitar el daño en naranjo variedad Valencia. Para otras variedades se recomienda

un mayor número de tratamientos dado el momento de recogida del fruto y la variedad,

que como hemos mencionado antes son factores importantes a tener en cuenta para

obtener un efectivo control del chancro. Además existe una página web perteneciente a

la Universidad de Florida para los citricultores donde se describe el tratamiento y el

momento de la aplicación en función de la meteorología y las variedad cultivada

(Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham, 2013; Dewdney et al., 2012).

Los tratamientos continuados con cobre pueden desembocar en la generación de

resistencias, en Xcc se describió por primera vez la aparición de cepas resistentes a

cobre en 1994 en Argentina. Además se ha demostrado la presencia de especies

bacterianas epífitas resistentes a cobre en cítricos. Se piensa que la transmisión de los

genes de resistencia a cobre, operón copLAB, pudo y puede darse en la fase epifita de la

bacteria especialmente cuando éstas forman agregados organizados tipo biopelícula. En

biopelículas, los fenómenos de intercambio génico se han demostrado en un gran

número de especies bacterianas (Behlau et al., 2011; Behlau et al., 2012a; Behlau et al.,

2012b). Un estudio realizado por nuestro grupo ha mostrado que concentraciones

subletales de bactericidas, entre ellos el sulfato de cobre, incrementan la formación de

biopelículas tanto in vitro como in planta, lo que aumenta la resistencia de las bacterias

a los tratamientos, además de favorecer el intercambio de material genético y la

aparición de resistencia a dichos agentes (Redondo, C. et al. Enviado).

En la actualidad se están ensayando otros compuestos químicos para el control del

chancro bacteriano de los cítricos que no tengan consecuencias para el medio ambiente.

Se están probando tanto compuestos antimicrobianos que reducen el crecimiento y el

desarrollo en planta de la bacteria, como compuestos que inducen resistencia en plantas.

Algunos de ellos se describen a continuación.

Los tratamientos dirigidos a inducir respuesta sistémica adquirida (SAR) con

Imidacloprid, Thiamethoxam, y Acibenzolar-S-Methyl o la respuesta sistémica inducida

(ISR), como la proteína harpina denominada Messenger, en hojas se han mostrado

eficientes en el control del chancro. El Imidacloprid, además, se ha mostrado muy

Introducción

30

eficiente para el control de psílidos y el minador de los cítricos (Francis et al., 2008;

Graham y Leite, 2004; Graham y Myers, 2011; Graham y Myers, 2013; Sétamou et al.,

2010).

Los alkil-galatos son inhibidores de la división celular, han mostrado ser capaces de

inhibir la colonización bacteriana y de disminuir la producción de chancros en planta,

así como reducir la dispersión de la bacteria desde los chancros a otras partes de la

planta. Sin embargo, todavía no se ha comprobado la eficiencia de estos productos en

campo (Silva et al., 2013).

Un estudio reciente ha descrito como método de control diversas sustancias inhibidoras

de la formación de biopelículas in vitro como la D-leucina y los indoles. Se ha

demostrado que estos compuestos son capaces de reducir el número de lesiones en

plantas de invernadero cuando son combinados con tratamientos de cobre, aunque su

eficiencia todavía no ha sido tampoco probada en campo (Li y Wang, 2014).

En post-cosecha los tratamientos se realizan principalmente para eliminar

completamente Xcc de la superficie del fruto y así poder exportarlos a zonas libres de

chancro. Los principales tratamientos que se dan a los cítricos son clorinas y orto-fenil-

fenato sódico (SOPP del inglés sodium orto-phenyl-phenate), normalmente de forma

combinada (Gottwald et al., 2009). Sin embargo, aunque estos tratamientos disminuyen

o eliminan la población del patógeno en fruto, en algunos casos se ha detectado Xcc a

concentraciones mayores de 103 ufc mL

-1. No obstante, el USDA y la APHIS afirman

que el riesgo de transmisión de la bacteria a partir de frutos infectados a material vegetal

en las zonas libres de chancro es muy bajo o nulo, ya que su supervivencia en almacén

tras los tratamientos es prácticamente inexistente. En Estados Unidos, en la actualidad,

no se aplican generalmente medidas de cuarentena respecto al transporte de frutos entre

estados donde el chancro es endémico y estados libres de la enfermedad; además en la

Unión Europea la detección de Xcc en los frutos importados desde Estados Unidos es

prácticamente nula (EFSA, 2013; Gottwald et al., 2009; Shiotani et al., 2009).

Prácticas culturales 2.4.3.

La realización de unas buenas prácticas culturales en el campo de cultivo ayuda a

reducir la dispersión del inóculo a otros árboles, o de unas áreas a otras y posibilita la

reducción de la agresividad de la enfermedad. La selección de variedades certificadas

libres de chancro es primordial para el control de la enfermedad así como un control

Introducción

31

apropiado de la densidad poblacional de Xcc en el campo en aquellas zonas donde la

enfermedad está presente. La correcta desinfección de la maquinaria y del personal de

trabajo también son indispensables para evitar la dispersión del patógeno (Dewdney y

Graham, 2011; EFSA Panel on Plant Health, 2014). Además hay que tener en cuenta el

método de riego; el riego por aspersión favorece la salida del patógeno a través de los

estomas y ayuda a disolver los exudados de las lesiones, contribuyendo a una mejor

diseminación de la bacteria. El riego por inundación o el micro-riego en los que el agua

se aplica directamente al suelo presenta un impacto menor para la dispersión del

patógeno (EFSA Panel on Plant Health, 2014).

Xcc no es un patógeno sistémico y no es capaz de desplazarse a través de la planta, por

lo que la eliminación de las hojas o ramas infectadas puede reducir el nivel de inóculo y

disminuir la aparición posterior de lesiones. La poda de los árboles o defoliación de los

mismos debe realizarse antes de la floración de forma cuidadosa, teniendo en cuenta que

las nuevas hojas van a ser altamente sensibles a la bacteria por lo que se recomienda

aplicar tratamientos con base de cobre a los nuevos brotes foliares. La defoliación de los

árboles se realiza aplicando al árbol altas concentraciones de cobre o fertilizantes ya que

actualmente no existe ningún defoliante comercial autorizado. La eliminación de

árboles infectados con el patógeno solo está recomendado en casos en los que la

infección esté muy localizada, además se deberá realizar una inspección de los árboles

colindantes (Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham, 2013; EFSA Panel on

Plant Health, 2014; Gottwald et al., 2002b; Graham et al., 2004).

Control biológico 2.4.4.

Se han descrito diferentes agentes de biocontrol para Xcc, muchos de ellos son cepas o

aislados bacterianos obtenidos de la superficie foliar o del suelo con posibles efectos

para el biocontrol de Xcc (Kalita et al., 1996; Dong et al., 2012). Entre ellos se

encuentran bacterias de los géneros Pseudomonas, Erwinia, Bacillus, Streptomyces y

Burkholderia (de Oliveira et al., 2011; Dong et al., 2012; Kalita et al., 1996).

Burkholderia cepacia es capaz de reducir el daño causado por Xcc hasta en un 60%,

además se ha demostrado capaz de controlar en invernadero otros patógenos de cítricos;

sin embargo, aunque este producto está registrado como agente de biocontrol, su uso no

está permitido por la posibilidad de que cause enfermedad en personas

inmunodeprimidas (XiaoYan et al., 2007). Se han probado diversas cepas de Bacillus

Introducción

32

subtillis, como agentes de biocontrol frente a Xcc, mostrando efecto en reducción de

biopelículas y virulencia de Xcc (Huang et al., 2012). El exudado obtenido de

Pseudomonas spp., es capaz de reducir el crecimiento bacteriano in vitro así como la

incidencia del chancro de los cítricos en plantas de invernadero al aplicarse con fines

preventivos o curativos. Parece afectar a la producción de exopolisacárido y a la

viabilidad bacteriana (de Oliveira et al., 2011). De manera similar los metabolitos

secundarios obtenidos de P. aeruginosa, son capaces de reducir la formación de

biopelículas de Xcc, así como de reducir la virulencia tanto de Xcc en naranjo como de

X. axonopodis pv. malvacearum en el algodón (Spago et al., 2014).

En el caso del chancro de los cítricos, también se ha probado como estrategia de control

el uso de bacteriófagos que son capaces de infectar un gran número de bacterias

patógenas de plantas. Las principales dificultades que tiene el uso de bacteriófagos son

su amplia gama de huésped, el desarrollo de resistencias y su baja persistencia en planta

(Balogh et al., 2010). El fago filamentoso XacF1 es capaz de reducir la virulencia de

Xcc en limonero al afectar a la producción de exopolisacárido, y motilidad, aunque se

producen lesiones cuando la inoculación se realiza por infiltración, (Ahmad et al.,

2014a). Además se están caracterizando los fagos CP1 y CP2 que se habían utilizado

para la identificación de los distintos tipos de Xcc y que han mostrado afectar al

desarrollo del patógeno (Ahmad et al., 2014b). Finalmente también se están

caracterizando otros fagos aislados de Xcc procedentes de Argentina y Florida que

presentan características similares a CP1 y CP2 (Balogh et al., 2013).

Métodos barrera: cortavientos 2.4.5.

Como se ha mencionado en apartados anteriores el principal método de dispersión de

Xcc es el viento que arrastra las gotas de agua con la bacteria a árboles, hojas, ramas y

fruto sanos. La presencia de barreras cortavientos disminuye este flujo y minimiza el

riesgo de aparición de nuevos focos de infección (Figura 13). Los cortavientos son

efectivos para el control de la dispersión del patógeno, reduciendo además la severidad

de la enfermedad en zonas donde es endémica, especialmente cuando son combinados

con tratamientos de cobre (Figura 14). La dispersión de Xcc se ve afectada de distinta

forma en función de la longitud y altura de los cortavientos, pero no parece estar

relacionada con su densidad. En cualquier caso, la utilización de este método de control

no siempre es efectiva, especialmente cuando la enfermedad está muy extendida o

Introducción

33

cuando los cortavientos no tienen la altura apropiada (Behlau et al., 2008; Behlau et al.,

2010; Dewdney y Graham, 2011; Dewdney y Graham, 2013).

Figura 13. Uso de árboles del género Grevellia (al fondo) como cortavientos para evitar la dispersión y

controlar el número de lesiones causadas por el chancro de los cítricos en Brasil (Gottwald et al., 2002a).

Figura 14. Gradientes de enfermedad en cultivos de pomelo Duncan bajo distintos tratamientos para el

control del chancro de los cítricos (Gottwald y Timmer, 1995). La combinación de los tratamientos con

cobre junto con los cortavientos presenta una mayor reducción de la enfermedad que el uso aislado de

cada uno de ellos. Imagen tomada de la página web de la Universidad de Florida.

Introducción

34

Uso de variedades resistentes y mejora de cítricos 2.4.6.

La utilización de especies y variedades lo menos susceptibles posible al chancro de los

cítricos es otra de las estrategias encaminadas al control del a enfermedad,

especialmente en aquellos lugares donde la enfermedad está presente. Se han realizado

numerosos estudios dirigidos a determinar la sensibilidad de diferentes variedades de

cítricos en campo, aunque ninguna de ellas ha mostrado una resistencia total (Carvalho

et al., 2015; Gottwald et al., 2002a; Gottwald et al., 2002b; Graham et al., 2004).

Para la obtención de variedades resistentes al chancro de los cítricos se han seguido

tanto estrategias de mejora genética tradicional, como el desarrollo de plantas

transgénicas. En el caso de los cítricos la mejora tradicional presenta el problema de la

poliembrionía, que dificulta el desarrollo del embrión sexual. Además, algunas

variedades de gran importancia económica presentan esterilidad del polen o de los

megaesporofitos, a lo que hay que sumar el alto grado de heterocigosis de los cítricos

que obliga a analizar un alto número de híbridos (Donmez et al., 2013; Navarro y

Juárez). Por otro lado, aunque existen variedades poco susceptibles en campo al

chancro, como la mandarina var. Cleopatra, mandarina var. Sunkin, tres variedades de

calamondín (Citrus madurensis Lour.), kumquats (Fortunella margarita), limequats (C.

aurantiifolia × F. margarita) vars. Eustis y Lake (Reddy, 1997), el cruzamiento de éstas

con variedades comerciales ha dado como resultado productos de escaso valor

comercial. Un ejemplo es el limequat, una variedad supuestamente resistente al chancro

obtenida por cruzamiento entre lima y kumquat cuyos frutos son comestibles pero de

pequeño tamaño. Cruzamientos de éste con otros cítricos como el naranjo dulce han

dado lugar a líneas con mayor o menor resistencia al chancro considerándose por ello

como un buen progenitor para futuros cruzamientos (Viloria et al., 2004).

Debido a la falta de resistencias naturales con las que se puedan realizar mejora genética

tradicional para la obtención de variedades económicamente viables, se están realizando

diversos estudios con variedades transgénicas. La ventaja de la transformación genética,

es la posibilidad de introducir nuevos caracteres sin alterar el fondo genético de la

planta (Donmez et al., 2013). Sin embargo debido a las altas restricciones existentes

respecto al cultivo y consumo de plantas genéticamente modificadas, en especial en

zonas como la Unión europea, en la actualidad es difícil que variedades transgénicas

lleguen a cultivarse y a comercializarse.

Introducción

35

Aun así, diversos estudios han desarrollado plantas modificadas genéticamente

resistentes al chancro de los cítricos, por ejemplo mediante la transformación y

expresión de péptidos antimicrobianos como la atacina A o la dermaseptina (Cardoso et

al., 2010; Furman et al., 2013). Se han creado también cítricos que son capaces de

producir respuesta hipersensible en presencia de cualquiera de los agentes causantes de

chancro (Jones et al., 2014). Asimismo se han introducido genes de resistencia de otras

especies vegetales, entre ellos el gen Bs2 proveniente de plantas de pepino, que confiere

resistencia a variedades sensibles a X. campestris pv. vesicatoria de tomate y pepino o el

gen Xa-21 que confiere resistencia a X. oryzae pv. oryzae a plantas de arroz, ambos

genes cuando han sido introducidos en cítricos han sido capaces de inducir una

disminución del daño producido por Xcc (Mendes et al., 2010; Sendín et al., 2012). Por

último, en un estudio reciente se han transformado varios cítricos susceptibles al

chancro con el gen rpfF de Xylella fastidiosa. Este gen está relacionado con la

producción de factores de señalización difusibles (DSF del inglés Difusible signal

factor), que es el sistema de quórum sensing en Xanthomonas. La expresión de este gen

en la planta disminuye la incidencia de la enfermedad afectando probablemente a la

motilidad, formación de biofilm y otros factores de virulencia en el patógeno (Caserta et

al., 2014).

Control integrado 2.4.7.

En áreas donde el chancro de los cítricos es endémico se recomienda el control

integrado de la enfermedad (Graham et al., 2004). Esta estrategia incorpora varios de los

métodos de control descritos en apartados anteriores y que se resumen en el uso de

variedades resistentes a la enfermedad, producción de las plantas en invernaderos libres

de chancros, establecimiento de cortavientos en campo, defoliación y poda para reducir

el inóculo, realizar tratamientos preventivos tanto para el chancro como para el minador

de los cítricos y control y desinfección tanto de la maquinaria como del personal que

accede al campo. Además se recomienda la realización de inspecciones de los frutos

para evitar que se propague a otras áreas o países libres de la enfermedad.

3. Xanthomonas citri subsp. citri

Xcc al igual que otras Xanthomonas es una bacteria aeróbica Gram negativa, con un

único flagelo polar y forma de bacilo que mide entre 0,4 y 0,7 µm de ancho y 0,7 y 1,8

Introducción

36

µm de largo. Es una bacteria de crecimiento lento y parásito obligado puesto que no

puede sobrevivir en ausencia de su planta huésped. En placa de cultivo produce colonias

convexas de color amarillo cuya mucosidad depende del medio en el que se cultive y la

cepa o aislado, su temperatura óptima de cultivo es entre 25 y 30 ºC (Figura 15)

(Graham et al., 2004).

Figura 15. Imágenes de Xcc. A, microscopía electrónica de transmisión de Xcc teñidas con ácido

fosfotúnsgtico donde se ve la presencia del único flagelo polar; B, estructura convexa de una colonia de

Xcc transformada con el plásmido estable que contiene el gen que codifica para la GFP, PUFZ75; C:

crecimiento en placa de Xcc. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez y Jaime Cubero.

Como se ha mencionado antes dentro de Xcc existen varias cepas que producen distintos

tipos de chancros, la principal diferencia entre estas cepas es la gama de huésped. Las

cepas pertenecientes al chancro tipo A producen enfermedad en un gran número de

rutáceas y sin embargo las cepas A* y Aw, en campo, únicamente producen infección en

lima mejicana y en su patrón de injerto. Aunque infecciones producidas in vitro, en su

mayoría mediante infiltración, han mostrado que pueden producir respuesta

hipersensible en algunos huéspedes como el pomelo, naranjo dulce o mandarino y

lesiones menos severas que las de tipo A en otras especies de cítricos. Se ha demostrado

que una de las diferencias existentes entre los distintos tipos de cepas es la presencia del

gen AvrGf1/XopAG, de localización cromosómica, que no está presente en los chancros

tipo A, B o C ni en las cepas de A* originarias de Irán. En ausencia de este gen Xcc Aw

es capaz de producir lesiones tipo chancro en pomelo a un nivel menor que Xcc tipo A,

lo que indica que otros procesos relacionados con virulencia están implicados en el

desarrollo de la enfermedad (Escalon et al., 2013; Rybak et al., 2009; Sun et al., 2004).

Se ha descrito que todas las cepas de Xcc independientemente de su gama de huésped

presentan un crecimiento poblacional similar en lima mejicana cuando son inoculadas

Introducción

37

por infiltración, sin embargo cuando son inoculadas en hojas de pomelo o naranjo dulce,

en las mismas condiciones, el crecimiento es menor en las cepas tipo Xcc A* y Xcc Aw

(limitada gama de huésped) comparado con Xcc A. Estas diferencias son menores o

incluso inexistentes a altas concentraciones del patógeno (Escalon et al., 2013; Rybak et

al., 2009; Sun et al., 2004).

Inicialmente se describió que las cepas de Xcc presentaban una alta homología a nivel

genético (Shiotani et al., 2000), a lo largo del tiempo se han realizado gran cantidad de

estudios dirigidos a relacionar los contenidos genéticos y fenotípicos de Xcc con la

gama de huésped (Bui Thi Ngoc et al., 2009; Cubero y Graham, 2002; Cubero y

Graham, 2004; Cubero y Graham, 2005; Graham et al., 2004; Jalan et al., 2013a; Li et

al., 2007a; Pruvost et al., 2014b; Vernière et al., 1998). Los primeros estudios realizados

se basaron en la identificación y caracterización de las cepas mediante técnicas

serológicas, y posteriormente en la amplificación por PCR y secuenciación del gen de

virulencia pthA, sin embargo estos estudios no consiguieron ni tan siquiera diferenciar

las cepas de amplia y limitada gama de huésped. A partir de perfiles de bandas

generadas por rep-PCR se pudieron separar las cepas de tipo A de amplia y limitada

gama de huésped, además de situar claramente en un grupo diferente a las cepas

causantes de chancros tipo B y C (Cubero y Graham, 2002). Posteriormente, el análisis

de la secuencia de un gen regulador dependiente de leucina, lrp, permitió distinguir

entre cepas de amplia y limitada gama de huésped, sugiriéndose además que la

variación en este gen puede estar relacionada con la adaptación del patógeno al huésped

(Cubero y Graham, 2005).

Un estudio reciente basado en el análisis multilocus de secuencias repetidas en tándem

(MLVA, Multilocus Variable number of tandem repeat Analysis) ha conseguido

establecer una mejor separación entre las cepas pertenecientes a Xcc con distinta gama

de huésped y diferente localización geográfica estableciéndose 4 grupos (Figura 16).

Los grupos 1 y 2 corresponden a cepas de amplia gama de huésped, dentro de estos

grupos el subgrupo más numeroso es el 1.1, que contiene cepas procedentes de varias

zonas geográficas; los subgrupos 1.2 y 1.3 provienen de las Islas Maldivas y Paquistán

respectivamente, el grupo 2 contiene cepas provenientes de Asia Occidental. El grupo3

contiene las cepas pertenecientes al chancro tipo Aw procedentes de Florida e India y el

grupo 4 contiene las cepas pertenecientes al tipo A* y se subdivide a su vez en varios

subgrupos: el subgrupo 4.1 incluye cepas procedentes de Irán y Arabia Saudí, el

Introducción

38

subgrupo 4.2, aquellas aisladas en Omán y Arabia Saudí y por último el subgrupo 4.3

que contiene cepas originarias de Camboya y Tailandia. Los resultados de este estudio

sugieren que no fue hasta el siglo XIX cuando se produjo la dispersión del patógeno a

nivel mundial, al transportarse plantas que podían estar infectadas por el patógeno, por

ello la mayoría de las cepas de amplia gama de huésped con diversos orígenes

geográficos se agrupan en un mismo grupo, es decir, son más similares entre sí que con

otros grupos incluso si se aislaron de zonas geográficas similares (Pruvost et al., 2014).

Figura 16. Árbol categórico de mínima expansión con datos obtenidos a partir de

un análisis MLVA-31 (129 cepas y 72 haplotipos). Este árbol muestra la

variabilidad genética en relación con la gama de huésped en cepas de Xcc con

diversos orígenes geográficos. Las cepas de amplia gama de huésped están

marcadas en color rojo, las cepas pertenecientes al CBC tipo A* en azul y las del

tipo Aw en verde (Pruvost et al., 2014).

Los genomas de tres Xcc están disponibles en las bases de datos; las cepas Xcc 306

procedente de Brasil, l Xcc 12879 Aw aislada en Florida (Jalan et al., 2013b) y Xac29_1

aislada en China cuyo genoma no ha sido publicado (Ye et al., 2013). Las propiedades

de los genomas pertenecientes a las cepas Xcc 306 y Xcc Aw 12879 se muestran en la

Tabla 2.

Introducción

39

Tabla 2: resumen de las propiedades de los dos genomas secuenciados y publicados de Xcc (da Silva et

al., 2002; Jalan et al., 2013a; Jalan et al., 2013b).

Cepa/Propiedades Xcc 306 Xcc 12879 Aw

Tamaño del genoma (pb) 5.175.554 5.320.000

Plásmidos pXAC33-pXAC64 pXacw19-pXacw58

Contenido en G+C 64,7% 64,71%

Genes codificantes 4.603 4.760

Con función asignada 2.710 3.457

Proteínas hipotéticas conservadas 1.272 -

Proteínas hipotéticas 331 -

ARN de transferencia 54 54

Operones ARN ribosomal 2 2

Elementos de secuencias insertadas 87

Proteínas ortólogas 4.428

Proteínas única para cada cepa 175 332

A pesar de que los genomas de las cepas Xcc 306 y Xcc Aw 12879 son muy similares

(aunque presentan varias translocaciones y reinserciones), las diferencias existentes

tanto en el cromosoma como en los plásmidos sugieren que algunos de sus elementos

genómicos proviene de distintas especies, posiblemente debido a su distinto origen

geográfico y como consecuencia de la exposición a diferentes comunidades bacterianas

con las que han estado en contacto (Jalan et al., 2013a).

Una de las principales diferencias entre estas dos cepas se encuentra a nivel plasmídico,

la cepa Xcc Aw 12879 contiene dos plásmidos denominados pXacw19 y pXacw58, el

primero de ellos no posee homología de secuencia con ninguno de los plásmidos de Xcc

306, siendo la similitud del segundo únicamente del 35% con pXAC64. En el plásmido

pXacw58 se encuentra el gen pthAw2 que codifica para el efector de virulencia similar

al gen pthA4 que es el causante de los síntomas del chancro, pero no contiene el sistema

de secreción tipo 4 presente en el plásmido pXAC64 de Xcc 306. Otras diferencias en el

genoma están relacionadas con el origen de determinadas zonas en la cepa Xcc Aw

12879, como sucede en la zona que codifica para el lipolisacárido (LPS), que contiene

genes similares a X. oryzae pv. oryzicola, y genes homólogos a 306. El LPS es un factor

importante en adhesión en Xanthomonas por lo que la variación de este clúster podría

estar relacionada con la gama de huésped del patógeno. La cepa Xcc Aw 12879 posee

una zona del genoma que presenta alta sintenia con la cepa 8004 de X. campestris pv.

campestris, esta región contiene tres reguladores transcripcionales, un sistema de dos

componentes y un regulador de la respuesta. Además entre estas cepas existe variación

Introducción

40

en varios sensores ambientales y en el contenido de proteínas aceptoras de grupos

metilo o MCPs (Jalan et al., 2013a; Mhedbi-Hajri et al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al.,

2011b).

Estudios transcriptómicos comparativos entre la cepas Xcc 306 y Xcc Aw 12879, han

mostrado diferencias en la expresión de determinados genes en función del medio en el

que se encuentren. En medio de cultivo XVM2, que simula condiciones de apoplasto de

la planta se sobreexpresan, en ambas cepas, los genes relacionados con el Sistema de

Secreción Tipo III (SST3), sin embargo hay diferencias en algunos de los efectores

expresados, en Xcc 306 se sobreexpresan de forma diferencial pthA1, pthA2, avrXacE3

y xopK en Xcc Aw 12879 xopL, xopR, xopAI, xopAK, xopAF y xopAG. Mayores

diferencias se han observado en la expresión de genes relacionados con el Sistema de

Secreción Tipo II (SST2) que parece reprimido en medio XVM2 cuando se compara

con medio general NB en la cepa Xcc Aw 12879. Sin embargo en Xcc 306 no hay

diferencias de expresión en ambos medios, existiendo también diferencias de expresión

en genes que codifican para sustratos del SST2. Los genes relacionados con motilidad y

quimiotaxis se encuentran reprimidos en medio XVM2 en ambas cepas, al igual que los

genes relacionados con la producción de LPS, sin embargo los genes relacionados con

la producción de exopolisacárido se sobreexpresan en medio XVM2. Además en la cepa

Xcc 306 se observó mayor expresión de genes relacionados con virulencia en

comparación con la cepa de limitada gama de huésped. Se encontraron diferennias

notables en genes de respuesta a especies reactivas de oxígeno, falta de nutrientes,

adherencia, quimiotaxis y transportadores de membrana entre otros, sugiriendo una

mayor adaptación de la cepa de amplia gama de huésped a las condiciones de estrés

impuestas por la planta (Jalan et al., 2013a).

4. Factores de Virulencia de Xanthomonas citri subsp. citri

Las bacterias fitopatógenas son en su mayoría colonizadores del apoplasto vegetal. El

apoplasto está constituido por un sistema continuo que comprende las paredes y los

espacios intercelulares existentes en los tejidos vegetales (Grignon y Sentenac, 1991;

Taiz y Zeiger, 1991), es decir, se puede considerar apoplasto todo el tejido vegetal a

excepción del contenido de las células vegetales (protoplasto).

Introducción

41

Para colonizar el apoplasto y salir adelante en este medio inicialmente hostil, las

bacterias han de tener capacidad para superar los mecanismos de defensa desarrollados

por la planta dirigidos a evitar la infección. Estos mecanismos pueden ser constitutivos,

como la cutícula y factores químicos pre-existentes o inducibles, que se activan una vez

el patógeno ha conseguido penetrar en la planta, y que comprenden desde las

producción de especies reactivas de oxígeno (Levine et al., 1994), cambios en la

estructura de la pared celular (Hammerschmidt y Kuc, 1982), síntesis de antibióticos de

bajo peso molecular como las fitoalexinas (Dixon, 1986), producción de péptidos

antimicrobianos (Molina y García-Olmedo, 1993), producción de proteínas de defensa

(Loon, 1985), o incluso la muerte celular relacionada con la respuesta hipersensible

(Dixon et al., 1994).

Los patógenos vegetales han desarrollado sistemas para superar las barreras vegetales y

para facilitar la colonización del apoplasto y la posterior muerte celular para poder

adquirir nutrientes e incrementar su población. A continuación se describen algunos de

estos factores de virulencia en Xcc.

4.1. Sistema de Secreción Tipo III

Uno de los factores de virulencia más importantes tanto en patógenos de plantas como

de animales es el Sistema de Secreción Tipo III (SST3) (Ghosh, 2004), se encarga de la

secreción de proteínas de virulencia (proteínas Avr/Pth) y otros efectores de

patogenicidad al interior de las células vegetales o animales. La inyección por parte del

patógeno de estas proteínas en el tejido vegetal conduce al desarrollo de la enfermedad

en plantas huésped, o a la producción de respuesta hipersensible (HR) en plantas no

huésped, además participa en otros procesos celulares como la adhesión y formación de

agregados (Lahaye y Bonas, 2001).

En las bacterias patógenas de plantas el SST3 es codificado por los genes hrp

(Hypersensitive response and pathogenicity) y hrc (Hypersensitive response and

conserved) los últimos se denominan así debido a que se encuentran altamente

conservados entre los distintos géneros bacterianos ya sean patógenos de animales como

de plantas; además presentan similitudes con genes del flagelo. Por esta razón su

estructura es similar, con forma de pelo de 100-200 nm (Figura 17B) orientado hacia el

exterior celular. Los genes hrp y hrc no se suelen expresar en medios de crecimiento

Introducción

42

ricos, pero sí que se expresan en medios mínimos con pH ácido cuya composición sea

similar a los compuestos presentes en el apoplasto vegetal (Alfano y Collmer, 1997).

Figura 17. Representación esquemática del SST3 en Xcc (Gottig et al., 2010).

En las bacterias patógenas de plantas el SST3 es codificado por los genes hrp

(Hypersensitive response and pathogenicity) y hrc (Hypersensitive response and

conserved) los últimos se denominan así debido a que se encuentran altamente

conservados entre los distintos géneros bacterianos ya sean patógenos de animales como

de plantas; además presentan similitudes con genes del flagelo. Por esta razón su

estructura es similar, con forma de pelo de 100-200 nm (Figura 17) orientado hacia el

exterior celular. Los genes hrp y hrc no se suelen expresar en medios de crecimiento

ricos, pero sí que se expresan en medios mínimos con pH ácido cuya composición sea

similar a los compuestos presentes en el apoplasto vegetal (Alfano y Collmer, 1997).

En Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) el SST3 es codificado por un clúster de genes

de respuesta hipersensible y patogenicidad (hrp). La expresión de estos genes está

controlada por las proteínas HrpX y HrpG, mutantes en los genes que codifican para

estas proteínas han mostrado pérdida de patogenicidad. Estas proteínas regulan la

expresión de genes relacionados con diversas funciones celulares, como son

supervivencia en la planta, resistencia frente a las defensas vegetales, sustratos del

sistema de secreción tipo 2 (SST2) que incluyen enzimas de degradación de la pared

Introducción

43

celular, y hasta 21 genes relacionados con regulación en Xcc y un factor sigma (rpoE)

entre otros. HrpG controla de forma negativa la expresión de reguladores tales como

rpfG que está relacionado con quorum sensing (Guo et al., 2011).

La proteína de mayor importancia en Xcc secretada por este sistema es la proteína PthA,

y sus homólogos en otras Xanthomonas causantes de chancro en cítricos. PthA,

pertenece a la familia AvrBs3/PthA de reguladores transcripcionales y modula la

regulación génica de la planta; en cítricos induce división celular que deriva en

hiperplasia y posterior necrosis del tejido vegetal. Este mecanismo libera nutrientes al

apoplasto que son asimilados por el patógeno permitiendo el crecimiento de la

población bacteriana en el interior de la planta y su posterior dispersión. Mutantes de

Xcc en este gen o sus homólogos no son capaces de inducir lesiones ni de aumentar su

población en el tejido vegetal. X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac) agente causal de la

mancha bacteriana de los cítricos, que carece de esta proteína, es capaz de inducir

lesiones tipo chancro cuando PthA es expresada de forma artificial, al igual que sucede

en Eschericha coli o incluso si está proteína es expresada en plantas de cítricos hay

aparición de lesiones tipo chancro en la zona transformada. La proteína PthA además

induce necrosis en las células epidérmicas cercanas a la zona de infección lo que

permite a las células salir y crear nuevas infecciones en la planta.

A pesar de la existencia de distintos genes pth en las distintas Xanthomonas causantes

de chancro, ninguno de ellos ha demostrado estar relacionado con la especificidad de

huésped que existe en los distintos patotipos de esta enfermedad (Escalon et al., 2013).

Está descrito que mutantes en pthA de Xcc que no son capaces de producir síntomas en

cítricos cuando son transformados con los genes pthAw y pthA* procedentes de cepas de

limitada gama de huésped producen síntomas tanto en lima mejicana como en pomelo

Duncan. En el caso de Xcc tipo Aw y en todas las cepas de Xcc de tipo A*, menos las

procedentes de Irán, el gen avrGf/XopAG es el causante de la respuesta hipersensible

que tiene lugar en hojas pomelo cuando son inoculadas por infiltración (Rybak et al.,

2009; Escalon et al., 2013). Un fenómeno similar se ha comprobado en X. fuscans

subsp. aurantifolia (Xfa) tipo C, el gen xopAG de la familia avrGf1 restringe la gama de

huésped este patógeno a lima mejicana, Xfa tipo B posee también este gen, pero en este

caso está truncado por un transposón. Las cepas A* aisladas en Irán carecen de este gen

y sin embargo ninguna de ellas produce lesiones en naranjo dulce o pomelo, por lo que

se piensa que deben existir otros efectores de virulencia u otros procesos relacionados

Introducción

44

con el avance de la enfermedad cuya implicación en la gama de huésped se desconoce

actualmente (Moreira et al., 2010; Escalon et al., 2013).

Xcc posee 26 efectores de virulencia, siendo 19 los comunes a todas las especies

productoras de chancros, independientemente de la zona geográfica y el rango de

huésped. Existen dos efectores de virulencia que solo están presentes en las cepas de

limitada gama de huésped, el efector XopAG mencionado anteriormente y del que

existen ortólogos en cepas de X. campestris, Xfa (chancros tipo B y C) y X. citri pv.

bilvae, que además produce respuesta hipersensible en naranjo dulce y pomelo, y el

efector XopC1 presente únicamente en las cepas tipo A* que presenta alta homología

con el mismo efector de X. euvesicatoria. La delección de este gen sin embargo, no

presenta un efecto significativo en la evolución de la cepa A* en planta, además

tampoco presenta ningún efecto en virulencia (Escalon et al., 2013). En la cepa Aw

parece que el gen xopAF es importante para el crecimiento del patógeno en plantas tanto

huésped como no huésped (Jalan et al., 2013a).

Un estudio reciente ha mostrado la importancia del SST3 en la formación de

biopelículas, así como en la colonización de la filosfera y como ya se había descrito

antes en virulencia. El SST3 no parece influir en las primeras etapas de adhesión a

planta, sin embargo las biopelículas formadas por los mutantes en el operón hrpB son

más estrechas y menos estructuradas. Además parece influir en el crecimiento en planta

y la expresión de un gran número de procesos relacionados con virulencia como la

motilidad o la producción de exopolisacárido (Zimaro et al., 2014).

4.2. Exopolisacárido: goma xanthana

Los exopolisacáridos son secretados como un material licuoso o encapsulado y parecen

contribuir a la enfermedad a través de la retención de agua en los espacios

intercelulares, protegiendo a la bacteria de compuestos antimicrobianos o de señales

activadoras de las defensas de las plantas (Denny, 1995). Además en X. campestris

participan en la formación de biopelículas (Dow et al., 2003) y juegan un papel el la

supresión de las defensas de las plantas impidiendo la deposición de callosa (Yun et al.,

2006).

El exopolisacárido secretado por el género Xanthomonas es la goma xanthana o

xanthano, un polímero formado por unidades repetidas de pentasacáridos con estructura

manosa-(β-1,4)-ácido glucurónico-(β-1,2)-manosa-(α-1,3)-celobiosa (Jansson et al.,

Introducción

45

1975). Se caracteriza por ser altamente higroscópico permitiendo a la bacteria conservar

la humedad y superar los estreses abióticos a los que está sometida en la superficie

vegetal. Es necesario para la supervivencia y multiplicación en planta participando en la

formación de biopelículas (Rigano et al., 2007). Existen varios genes implicados en la

producción de exopolisacáridos, entre ellos los genes gum y galU. Mutantes en el gen

que codifica para la proteína que polimeriza los pentasacáridos (gumB) no eran capaces

de producir biofilm en hojas de limón. Además, al contrario que la cepa silvestre, que

era capaz de aumentar su población en dos unidades logarítmicas tras 24 horas de la

inoculación, la población del mutante gumB en Xcc decrecía con el tiempo (Rigano et

al., 2007). Sin embargo el gen gumD, que participa en la síntesis de exopolisacáridos,

no parece estar implicado en virulencia, aunque sí en supervivencia en la superficie

vegetal (Dunger et al., 2007). Otro gen relacionado con la producción de

exopolisacáridos es galU que está implicado en la síntesis de exopolisacáridos,

crecimiento en planta y producción de síntomas en pomelo.

El clúster de los genes gum posee características de isla de patogénesis puesto que posee

un contenido en G+C que difiere del resto y además a pesar de que las secuencias

colindantes sean similares a Stenotrophomonas malthophila, incluido el gen que

codifica para el ARN de transferencia, esta bacteria carece del clúster gum por lo que es

posible que sean el resultado de una adaptación a la planta (Lima et al., 2008; Lu et al.,

2008).

Los genes gum parecen estar relacionados con su virulencia en limonero (Citrus limon)

(Rigano et al., 2007), pero no en naranjo (Citrus sinensis) (Dunger et al., 2007; Laia et

al., 2009).

4.3. Regulación tipo quorum sensing

El quorum sensing es un mecanismo de regulación de la expresión génica dependiente

de la densidad de bacterias. El aumento de la población bacteriana supone la activación

o represión de la expresión de determinados genes, por ejemplo de aquellos

relacionados con patogénesis como es el caso de la goma xanthana. El sistema quorum

sensing en Xanthomonas está mediado por proteínas DSF (Difussible signal factor)

expresados por genes rpf. Este sistema regula de forma positiva la producción de

exopolisacáridos, de enzimas extracelulares como proteasas, endoglucanasas y también

Introducción

46

de otros genes relacionados con virulencia (Dow et al., 2003; Dow et al., 2000a; He et

al., 2006).

En Xanthomonas campestris está descrito que los altos niveles de DSF se producen en

las fases exponencial tardía y estacionaria del crecimiento (Dow et al., 2000a). Los DSF

son secretados como autoinductores del quorum sensing y se unen de forma directa o

indirecta al dominio N-terminal de RpfC. Esta unión produce la autofosforilación del

dominio histidín kinasa de RpfC. El grupo fosfato liberado podrá unirse a RpfG

modulando la actividad del dominio HD-GYP que conlleva a la activación de genes

relacionados con la actividad endoglucanasa, proteasa y la producción de

exopolisacárido (Andrade et al., 2006). Xcc posee todos los genes necesarios para la

regulación por quorum sensing, además se ha demostrado que son importantes para la

formación de biopelículas tanto en planta como in vitro así como para la virulencia del

patógeno (da Silva et al., 2002; Guo et al., 2012; Huang et al., 2013). De hecho plantas

de naranjo dulce y carrizo cintrange (Citrus sinensis 'Washington' x Poncirus trifoliata)

transformadas con el gen rpfF de Xylella fastidiosa mostraron una disminución de

síntomas cuando fueron inoculadas con Xcc (Caserta et al., 2014).

4.4. Enzimas Pectolíticas

Las enzimas pectolíticas presentan gran importancia en virulencia para muchos

patógenos vegetales puesto que son las causantes de la muerte celular y la maceración

del tejido vegetal. Los productos de degradación de la pared vegetal son capaces de

inducir los mecanismos de defensa de la planta, por lo tanto estas enzimas participan en

otros procesos relacionados con la interacción planta-patógeno (Collmer y Keen, 1986;

Esquerré-Tugayé et al., 2000).

Xcc posee tres pectato liasas, seis celulasas, cinco xilanasas, dos poligalacturonasas y

una endoglucanasa que son secretadas a través del SST2, también posee una permeasa

que le permite importar al interior pectinas degradadas (da Silva et al., 2002; Brunings y

Gabriel, 2003). La actividad pectato liasa de la cepa Xcc 306 es mayor que la de la cepa

Xcc Aw

12879, lo que puede influir en su virulencia (Jalan et al., 2013a). Sin embargo

estas enzimas no son suficientes para degradar el tejido vegetal, siendo necesaria una

previa secreción de PthA que induzca necrosis celular en la planta para que las células

puedan multiplicarse en el espacio intercelular (Brunings y Gabriel, 2003).

Introducción

47

Por otro lado la presencia de algunas enzimas pectolíticas en Xcc como Pel1,

conservadas en el género Xanthomonas (similitud de secuencia del 80%) parece estar

relacionada con la formación de manchas de agua durante la infección. Otras enzimas

pectolíticas (Pel2 y Pel3) o poligalacturanasas (Peh1 y Peh2) no parecen realizar

actividad pectolítica en esta especie (Lin et al., 2010).

4.5. Lipopolisacáridos

El lipopolisacárido (LPS) es una molécula anfipática que forma parte de la superficie

más externa de las bacterias Gram (-). Se encuentra dividida en tres partes, el lípido A,

la región central y el antígeno O, que es el componente inmunodominante de la

superficie bacteriana. El LPS es importante para la interacción de la bacteria con el

huésped tanto en plantas como animales, habiendo sido identificado como PAMP

(pathogen-associated molecular pattern). El LPS obtenido de Xcc produce la

deposición de callosa, activación de especies reactivas de oxígeno y el cierre de los

estomas en hojas de naranjo, además induce la expresión de genes relacionados defensa

de plantas (Casabuono et al., 2011).

La estructura del LPS presente en Xcc muestra grandes variaciones cuando es

comparada con la estructura de otras Xanthomonas, además existen diferencias en el

clúster que codifica para la formación del LPS entre Xcc 306 y Xcc Aw 12879,

presentando ésta última similitud del 50% con Xcc 306 y el otro 50% con X. oryzae pv.

oryzicola (Jalan et al., 2013a). Estas variaciones pueden ser importantes a la hora del

establecimiento la infección, por ejemplo, diferencias en los ácidos grasos pueden

permitir que el patógeno supere las defensas del hospedador (Casabuono et al., 2011;

Dow et al., 2000b). Xcc 306 posee un clúster formado por 16 genes que se han descrito

como implicados en la síntesis de LPS (da Silva et al., 2002; Yan et al., 2012). Dentro

de este clúster el gen nlxA parece codificar para una rhamnoltransferasa, el gen wtz

codifica para la proteína de unión de ATP en transportadores ABC, wxacO es una

proteína transmembrana encargada del ensamblaje y secreción de exopolisacáridos,

rfbC parece ser un glicosil-transferasa que participa en la síntesis de exopolisacáridos.

Estos y otros genes pertenecientes al clúster de genes relacionados con biosíntesis de

lipolisacáridos participan en la virulencia de Xcc posiblemente por la implicación del

LPS en motilidad, formación de biopelículas, producción de exopolisacáridos y

supervivencia (resistencia a compuestos fenólicos y peróxido de hidrógeno) (Casabuono

et al., 2011; Laia et al., 2009; Li y Wang, 2011a; Petrocelli et al., 2012; Yan et al.,

Introducción

48

2012). La producción de LPS protege al patógeno de radiación ultravioleta, variación de

la temperatura, desecación, presencia de compuestos detergentes, compuesto químicos

entre los que se encuentran dodecyl sulfato sódico (SDS), poliximina-B, peróxido de

hidrógeno, fenol, sulfato de cobre, y sulfato de zinc y de estrés osmótico, térmico y

oxidativo. Mutantes deficientes en producción de LPS no son capaces de sobrevivir en

la superficie vegetal siendo únicamente capaces de producir síntomas cuando son

inoculados por infiltración (Yan et al., 2012). En las Xanthomonas causantes de los

chancros tipo B y C (X. fuscans subsp. aurantifolii), que son menos virulentas que Xcc,

el gen wtz carece del extremo C-terminal de la proteína siendo probable que ésta sea una

de las causas de su reducida virulencia (Moreira et al., 2010b; Petrocelli et al., 2012).

4.6. Motilidad

Xcc produce movimiento tipo swimming y es capaz de moverse en placas con 0,7% de

agar en superficie, existiendo discrepancia entre los autores sobre si este movimiento es

swarming o sliding. Está descrito que mutantes de Xcc carentes de flagelina, que ven

disminuida su habilidad en swimming no presentan variaciones en virulencia; en cambio

mutantes en flgE que codifica para el gancho del flagelo sí que ven disminuida su

virulencia, además de su capacidad para hacer swimming. Lo que sí que está demostrado

es la implicación del flagelo en la formación de agregados y biofilm, tanto en

superficies inertes como en planta (Malamud et al., 2011).

4.7. Hemaglutinina filamentosa y Sistema de Secreción Tipo V

El Sistema de secreción tipo V (SST5) transporta proteínas de gran tamaño o dominios

proteicos, en su mayoría adhesinas y hemolisinas, que median la adhesión bacteriana y

que poseen una estructura primaria similar. Existen diversos tipos de SST5, el

autotransportador,tipo 5a, el transportador de dos componentes, tipo 5b y el tipo 5c. Las

hemaglutininas son secretadas por el transportador de dos componentes en el que

participan la proteína transportada y la transportadora. En un primer paso la proteína es

transportada al periplasma mediante el sistema de secreción Sec pasando posteriormente

a través del transportador que modifica la proteína permitiendo su plegamiento y

activación. La activación consiste en la pérdida del dominio C-terminal mediante

proteólisis, la energía requerida para el transporte de la proteína se cree que proviene de

la energía emitida durante el plegamiento de la misma (Gottig et al., 2010; Henderson et

al., 2004).

Introducción

49

En Xcc la hemaglutinina es codificada por el gen fhaB, que es secretada mediante el

sistema de transporte de dos componentes (SST5b) que comprende la proteína FhaC;

además posee otros dos marcos de lectura abiertos a continuación de fhaB y fhaC que

por similitud de secuencias han sido descritos como hemaglutininas, pero que carecen

de la secuencia en el extremo N-terminal y no son funcionales. Este mismo fenómeno

también se ha observado en X. campestris pv. vesicatoria (da Silva et al., 2002; Gottig

et al., 2009; Mhedbi-Hajri et al., 2011a). La hemaglutinina FhaB posee un papel

importante en virulencia en las primeras etapas de la infección puesto que media la

adhesión entre la bacteria y el tejido vegetal y está relacionada con la supervivencia en

el interior del apoplasto. Esta hemaglutinina es secretada por la porina FhaC, aunque es

posible que exista un mecanismo alternativo de secreción puesto que los mutantes en

FhaC presentan un fenotipo intermedio para adherencia o fitness en planta o superficies

abióticas, e infección mediante pulverización. Estos mutantes se comportan de forma

similar al de la cepa silvestre respecto a la motilidad tipo swarming, inoculación por

infiltración, formación de biopelículas y crecimiento en planta (Gottig et al., 2009).

4.8. Sistema de secreción tipo II

El sistema de secreción tipo II (SST2) se descubrió por primera vez en Klebsiella

pneumoniae en 1987 como pululanasas y lipoproteínas hidrolizadoras de almidón

(d'Enfert et al., 1987). Realiza el transporte de proteínas desde el citoplasma al espacio

extracelular en dos etapas; en un primer paso las proteínas pasan al periplasma mediante

sistemas de secreción dependientes de Sec o mediante la ruta Tat (twin–arginine

traslocation) en función de la secuencia del péptido señal. Desde el espacio

periplasmático las proteínas, tras perder la zona correspondiente al péptido señal, pasan

a través del SST2 al exterior celular (Jha et al., 2005). En la mayoría de las bacterias

patógenas de plantas, entre ellas los géneros Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas,

Xylella y Ralstonia, realiza el transporte de toxinas y enzimas hidrolíticas entre las que

se encuentra celulasas, poligalacturonasas, xilanasas y proteasas, proteínas encargadas

de la degradación de la pared celular de las plantas (Jha et al., 2005; Johnson et al.,

2006).

Posee una estructura similar al pilus tipo IV, puesto que es capaz de formar un

pseudopili que suele permanecer en el espacio periplasmático, posiblemente debido a la

falta de estabilidad de las pseudopilinas que lo conforman. Este aspecto las diferencia

del pilus tipo IV, cuyas pilinas se estabilizan mediante puentes disulfuro mientras que

Introducción

50

las pseudopilinas del SST2 lo hacen con iones Ca2+

(Cisneros et al., 2012). El SST2

consta de tres partes esenciales para el proceso de secreción (Figura 18), la primera de

ellas es la secretina, que junto con otras proteínas determina la especificidad del sustrato

a secretar. En la membrana externa el SST2 posee un complejo formado por varias

copias de una misma proteína que permite el paso del sustrato a secretar, por último el

pseudopilus funciona a modo de pistón impulsando las proteínas desde el periplasma al

exterior celular a través del complejo de la membrana externa (Johnson et al., 2006;

Reichow et al., 2011).

Figura 18. Modelo de secreción a través del SST2 de Vibrio cholerae, en la

imagen la tóxina del cólera AB5 está siendo secretada por este sistema

(Johnson et al., 2006).

En la formación y función de este sistema de secreción y pseudopilus participan entre

12 y 16 genes que generalmente se encuentran en un único clúster de genes presente en

el género Xanthomonas. X. campestris pv. vesicatoria (Xcv), Xc y Xcc poseen dos

clústeres de genes denominados xps y xcs que codifican para dos sistemas de secreción

distintos (da Silva et al., 2002; Lu et al., 2008) que no parecen ser parálogos entre sí, es

decir, han sido adquiridos de forma distinta sin que haya habido un mecanismo de

duplicación, pero sí que son ortólogos entre las cepas mencionadas anteriormente. El

clúster xcs está formado por una única unidad transcripcional con 13 marcos de lectura

abiertos y parece haber sido adquirido de forma horizontal. El clúster xps consiste en 12

genes pertenecientes a dos unidades transcripcionales (Brunings y Gabriel, 2003). Los

Introducción

51

dos SST2 de P. aeruginosa transportan distintos tipos de compuestos, lo que le confiere

una mayor adaptación a distintos ambientes. Es posible que las Xanthomonas que

poseen dos SST2 muestren una mejor adaptación al medio (Jha et al., 2005).

Se ha descrito que el SST2 de algunas Xanthomonas es capaz de traslocar amilasas,

proteasas, xilanasas y poligalacturonasas, existiendo cierta especificidad por el sustrato,

puesto que los SST2 de algunas Xanthomonas, como X. campestris pv. vesicatoria no

secretan determinadas proteínas (Chen et al., 2005; Ray et al., 2000; Szczesny et al.,

2010; Wang et al., 2008; Yamazaki et al., 2008).

En Xcc, mutantes en el gen xpsD, que codifica para las proteínas del complejo de la

membrana externa del SST2, se describió que carecían de actividad celulasa y eran

únicamente capaces de desarrollar síntomas de forma tardía al compararse con la cepa

silvestre, disminuyendo además su crecimiento en planta. Estas variaciones fueron

producidas por una disminución en la secreción de enzimas degradadoras de la pared

celular (Baptista et al., 2010).

4.9. Presencia de Péptido Natriurético

Los péptidos natriuréticos están presentes en animales y plantas, son moléculas que

presentan actividad biológica a concentraciones muy bajas. En animales están

relacionados con el balance de agua y sales de los órganos (Gottig et al., 2010), mientras

que en planta favorecen la apertura de estomas y por lo tanto el intercambio de gases, el

aumento de los niveles de cGMP en las células, y la modulación en los niveles de los

iones potasio, sodio y protones. Además los péptidos natriuréticos de planta (PNPs)

están relacionados con la regulación homeostática en tejidos vegetales y crecimiento

(Nembaware et al., 2004).

En planta, esta proteína se expresa en condiciones de estrés osmótico y carencia de

potasio. Se ha encontrado tanto en el proteoma del apoplasto como del xilema (Gottig et

al., 2010). El limonero rugoso (Citrus jambhiri) expresa PNPs cuando está afectado por

la enfermedad del decaimiento de los cítricos, que afecta a la homeostasis de la planta

produciendo marchitez en los brotes. La expresión de esta proteína tiene lugar en los

primeros momentos de la interacción, disminuyendo la disponibilidad de agua y

nutrientes para el patógeno (Nembaware et al., 2004).

Introducción

52

Xcc contiene un gen que codifica para un péptido natriurético que se expresa durante el

proceso infectivo. La transcripción de este gen parece comenzar a las 24 horas de la

inoculación y se incrementa a lo largo del tiempo (Garavaglia et al., 2010a; Nembaware

et al., 2004). No se ha observado la presencia de este gen en otras especies del género

Xanthomonas. Los estudios bioinformáticos que se han realizado para comparar esta

proteína con el péptido natriurético de Arabidopsis thaliana AtPNP-A muestran que

ambas tienen un péptido señal en el extremo N-terminal de la proteína que dirige el

péptido al espacio extracelular. Además presentan una zona altamente conservada entre

los aminoácidos 33 y 66 que corresponde al dominio relacionado con homeostasis. La

comparación de la estructura terciaria de ambas proteínas también ha mostrado un

plegamiento similar en el dominio N-terminal. Estas similitudes sugieren que ambas

proteínas tienen la misma función biológica. Se piensa que la adquisición de este gen

tuvo lugar de forma horizontal después de que esta proteína divergiera de la familia

proteica de las extensinas (Nembaware et al., 2004).

El mecanismo de acción de este péptido en Xcc está basado en la modificación de

parámetros fotosintéticos y del proteoma de la planta. Cuando el péptido se infiltra en

hojas de cítricos actúa sobre la hidratación del tejido disminuyendo el potencial hídrico

de la hoja y mejorando el transporte de electrones a través del fotosistema II.

Normalmente al disminuir el potencial hídrico en las hojas disminuye también el

rendimiento del fotosistema II. Además induce en planta la expresión de proteínas como

el activador de la Rubisco, ATP sintasas, la maturasa K y las α y β tubulinas

(Garavaglia et al., 2010a; Garavaglia et al., 2010b; Gottig et al., 2008). Cuando se

inocula la planta con mutantes de la bacteria carentes del péptido natriurético la

expresión de genes relacionados con fotosíntesis se reduce (Garavaglia et al., 2010a) de

lo que se deduce que éste péptido permite mantener el rendimiento metabólico de la

planta.

Mutantes en el gen que codifica para el péptido natriurético en Xcc mostraron el mismo

número y tamaño de lesiones que la cepa silvestre cuando fueron inoculadas por

infiltración en hojas de naranjo, sin embargo el tejido infectado presentaba mayor nivel

de necrosis que la cepa silvestre produciendo una disminución en la población del

patógeno. Este fenómeno se revertía al complementar el mutante tanto con el péptido de

Xcc como con el de A. thaliana AtPNP-A, confirmando que tanto la proteína de Xcc

como la de arabidopsis cumplen funciones similares (Gottig et al., 2008).

Introducción

53

Xcc es un patógeno biótrofo que, como se ha mencionado anteriormente, necesita estar

en contacto con la planta hospedadora para sobrevivir (Graham et al., 2004) y para ello

tiene que evitar los mecanismos de defensa de ésta tales como la inducción de muerte

celular programada (Garavaglia et al., 2010a). La secreción del péptido natriurético de

Xcc permite que el tejido infectado se mantenga vivo lo cual posibilita la supervivencia

del patógeno.

4.10. Presencia del enzima fosfoglucosa isomerasa

La fosfoglucosa isomerasa es un enzima que cataliza de forma reversible la

isomerización de la glucosa-6-fosfato y la fructosa-6-fosfato. Se ha descrito que

mutantes en Xcc muestran perdida de virulencia en hojas de limonero siendo incapaces

de crecer en medios mínimos con fructosa y glicerol como única fuente de carbono

(Tung y Kuo, 1999).

4.11. Resistencia a especies reactivas de oxígeno

Al igual que muchos patógenos vegetales Xcc tiene que hacer frente a las defensas de

las plantas para establecer la infección, la producción de especies reactivas de oxígeno

(ROS, en adelante) es una de ellas. Las bacterias poseen diversas enzimas que se

encargan de la detoxificación de estos compuestos, entre ellas se encuentran las

catalasas que transforman el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno. Los niveles de la

actividad catalasa en Xcc se duplican cuando el cultivo pasa a fase estacionaria

manteniéndose constantes al menos hasta 48 horas. En naranjo dulce (Citrus sinensis cv.

Valencia) mutantes en la catalasa monofuncional KatE, que manifestaron sensibilidad a

ROS, mostraron un número reducido de lesiones posiblemente debido a la baja

supervivencia del patógeno en el apoplasto (Tondo et al., 2010). Por otro lado se ha

descrito la presencia de una ferredoxina-NADP+ reductasa, que se acumula en presencia

de ROS cuyo papel en virulencia no se ha demostrado todavía (Tondo et al., 2011).

4.12. Proteína LOV

Las bacterias son capaces de captar señales del medio en el que viven y reaccionar ante

ellas. Una de estas señales es la luz, muchas especies bacterianas poseen fotorreceptores

capaces de percibir longitudes de onda en los rangos del rojo y rojo lejano que utilizan

para regular su metabolismo. Además perciben longitudes de onda en el rango de

ultravioleta y el ultravioleta lejano que inducen la producción de pigmentos con el fin de

Introducción

54

evitar las modificaciones en el ADN causadas por esta radiación o favoreciendo la

reparación del mismo. También son capaces de percibir longitudes de onda en el rango

del azul a través de dos fotorreceptores denominados BLUF (del inglés blue ligth

sensing using FAD) y LOV (de luz, oxígeno y potencial o voltaje, del inglés ligth,

oxygen or voltaje), este último regula varios procesos en muchas especies bacterianas,

entre ellos adhesión celular, respuesta a estrés, síntesis de di-GMP cíclico y virulencia

(Herrou y Crosson, 2011).

Xcc posee tres posibles fotorreceptores de luz azul, dos que presentan similitud con

proteínas BLUF y uno con la proteína LOV (da Silva et al., 2002; Van Sluys et al.,

2002). En esta especie bacteriana la proteína LOV parece estar implicada en diferentes

procesos como la motilidad, la producción de exopolisacáridos, la adhesión y la

formación de biopelículas y virulencia. La luz juega un papel importante en formación

de biopelículas favoreciendo la formación de agregados y en virulencia, puesto que en

oscuridad el tejido inoculado se necrosa al igual que sucede con el mutante en la

proteína LOV en condiciones de luz y oscuridad. Respecto al resto de los procesos

celulares no parece haber diferencia de fenotipo en presencia o ausencia de luz

(Kraiselburd et al., 2012).

5. Motilidad y quimiotaxis

Las bacterias fitopatógenas han evolucionado de forma que aprovechan el contenido de

las células vegetales, el protoplasto, para su desarrollo y supervivencia. Para poder

acceder a estas fuentes de nutrientes primero deben colonizar el interior del tejido

vegetal, puesto que las células presentes en la superficie de la planta están protegidas

por celulosa en las raíces y ceras y cutícula en las de las partes aéreas. Las principales

vías de entrada de los patógenos al apoplasto, son los estomas y las heridas, aunque

también puede tener lugar a través de hiátodos, como sucede en X. campestris pv.

campestris (Hugouvieux et al., 1998) y lenticelas. Existen bacterias, como Xylella

fastidiosa que penetran en la planta a través de las heridas causadas por el insecto que

las transporta (Chatterjee et al., 2008), sin embargo la mayoría de las bacterias

fitopatógenas tiene que hacerlo a través de heridas o estomas en procesos en los que

juega un papel importante la motilidad tipo swimming (Agrios, 2005). El movimiento

que tiene lugar hacia las entradas de la planta normalmente es mediado por quimiotaxis,

Introducción

55

que permite a las bacterias dirigirse hacia los ambientes más favorables para su

desarrollo y alejarse de aquellos que sean nocivos para ellas (Adler, 1966).

La superficie foliar no es homogénea, existen zonas con mayor cantidad de nutrientes

que otras, o con mayor exposición a agentes deletéreos que pueden influir en el

comportamiento y desarrollo de las bacterias en su superficie (Monier y Lindow, 2003).

De esta manera, se ha descrito que Xcc en superficie vegetal no se distribuye de forma

aleatoria sino que se dirige hacia nichos determinados que favorecen su supervivencia y

la entrada al interior de la planta (Figura 19) (Cubero et al., 2011).

Figura 19. Imágenes en microscopía con focal de Xcc inoculada en mandarina a distintos tiempos

marcadas con la proteína GFP estable (plásmido PUFZ75) y la proteína GFP inestable (LVA,

plásmido PUFZLVA). En las distintas imágenes se puede observar la distribución de las bacterias

en la superficie del fruto a distintos tiempos, mostrando que Xcc no se distribuye de forma

aleatoria, sino que se dirige hacia zonas determinadas (Cubero et al., 2011).

Los fenómenos de quimiotaxis y motilidad se han estudiado en varias especies

bacterianas tanto patógenas como no patógenas de plantas, siendo un factor importante

para la colonización. Ralstonia solanacearum coloniza las raíces de sus plantas huésped

mediante procesos de motilidad dependiente del flagelo mediados por quimiotaxis. Sin

embargo una vez ha colonizado la raíz y comienza a distribuirse a través del xilema la

motilidad no es importante para que se produzca la infección (Yao y Allen, 2006; Yao y

Allen, 2007). Dickeya dadantii necesita la presencia de un flagelo mótil y de

quimiotaxis para producir infección en hojas de endibia. En este patógeno se ha

Introducción

56

demostrado que la entrada a través de heridas es dependiente del ácido jasmónico que

funciona como quimioatrayente, habiéndose descrito las proteínas sensoras para este

compuesto (Antunez-Lamas et al., 2009a; Antunez-Lamas et al., 2009b; Río-Álvarez et

al., 2014).

La alta expresión génica de genes relacionados con motilidad y quimiotaxis que tiene

lugar cuando P. syringae se desarrolla de forma epífita en la superficie de hoja de judía,

y la represión de dichos genes cuando esta bacteria ha colonizado el apoplasto, sugiere

la necesidad de la bacteria de moverse en la superficie foliar en busca de nutrientes y

condiciones más óptimas para su supervivencia y de llegar al estoma para colonizar el

apoplasto (Yu et al., 2013).

Las bacterias son capaces de moverse en distintos medios, normalmente sus

movimientos son dirigidos hacia zonas apropiadas para su desarrollo a través de los

sistemas de quimiotaxis. En función del medio en el que se encuentren, las bacterias

realizan distintos tipos de movimiento, que pueden ser dependientes del flagelo comolos

movimientos swimming y swarming, o ser dependientes de otras estructuras diferente al

flagelo como el pilus tipo IV que posibilitan los movimentos el twitching y gliding,

además existen otros tipos de movimiento como sliding o darting (Henrichsen, 1972).

5.1. Motilidad dependiente del flagelo

El flagelo es la estructura que más se ha relacionado con motilidad y quimiotaxis en

bacterias, además está implicado en virulencia, adhesión a superficies y posterior

formación y dispersión de biopelículas (Soutourina y Bertin, 2003). Posee una

estructura helicoidal anclado a la membrana bacteriana mediante el cuerpo basal y unido

al motor que permite su movimiento (Figura 20) y puede tener una longitud de hasta 15

µm y un diámetro de 0,02 µm (Jarrell y McBride, 2008; Rossez et al., 2015). Posee una

estructura altamente compleja formada por un gran número de proteínas distintas, cuya

expresión se encuentra altamente regulada dado el alto requerimiento energético

necesario para su síntesis (Jarrell y McBride, 2008). La homología entre los distintos

grupos de proteínas que la componen y su similitud con el SST3 sugieren que esta

estructura ha surgido mediante la duplicación y diferenciación de sus genes, siendo el

producto de miles de años de evolución (Evans et al., 2014; Pallen y Matzke, 2006). La

estructura del flagelo se ha estudiado ampliamente tanto en Salmonella como en E. coli,

siendo bastante similar a la de la mayoría de las bacterias salvo por pequeñas

Introducción

57

modificaciones. Además hay géneros bacterianos que poseen más de un sistema flagelar

como es el caso de Aeromonas o Vibrio entre otros (McCarter, 2004). Estas bacterias

poseen un flagelo polar similar al del resto de las bacterias y flagelos laterales cuyas

secuencias difieren de la del flagelo polar y son codificadas por los genes laf. Los

flagelos laterales participan en swarming, pero no en swimming, participando además en

colonización y formación de biopelículas. Este sistema está relacionado con la adhesión

a células animales en Aeromonas causantes de diarrea y a las cubiertas de quitina

presentes en los crustáceos en Vibrio (Kirov et al., 2002; Kirov et al., 2004; McCarter,

2001; McCarter, 2004).

Figura 20. Visualización de flagelos en Xcc Aw

12879. A y B, microscopía electrónica de

transmisión de bacterias incubadas en placas de LB durante 48h. C y D, microscopía

óptica de bacterias en biopelículas de 72 h, teñidas mediante tinción de flagelos, C

magnificación 1000x y D ampliación digital de la imagen con magnificación 1000x. En

ambas imágenes se puede observar la presencia de un único flagelo polar que tiene forma

helicoidal y puede ser de longitud variable, llegando a ser casi 10 veces el tamaño de la

bacteria. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez.

El filamento del flagelo es una estructura helicoidal que funciona como propulsor de la

bacteria y está formado por varias subunidades iguales de flagelina (FliC), a razón de

Introducción

58

once unidades por cada dos vueltas de la hélice, que componen los once profilamentos.

En algunos casos puede tener otras subunidades menores presentes. Además en el

extremo terminal del filamento se encuentra la proteína HAP2 (Proteína asociada al

gancho del inglés Hook Associated Protein) que forma la cubierta del mismo y es

necesaria para una correcta formación del filamento (Galkin et al., 2008; McCarter,

2001; Rossez et al., 2015; Vonderviszt et al., 1995). El filamento tiene una estructura

rígida cuya forma depende de la secuencia aminoacídica, el pH, la fuerza iónica y la

torsión del mismo que puede ser rizada cuando el motor gira en sentido opuesto a las

agujas del reloj o semienroscada si gira en el sentido de las agujas del reloj (Berg,

2003).

El gancho o garfio es una estructura corta, curva, más o menos flexible que une el

filamento al cuerpo basal de flagelo. Está formado por alrededor de 120 copias de una

proteína única denominada FlgE y dos proteínas asociadas HAP1 y HAP3, que unen el

filamento con el gancho y sirven de adaptadores tanto estructurales como mecánicos. El

filamento presenta una estructura más o menos rígida y el garfio posee una estructura

más flexible que le permite transmitir el movimiento desde el motor al filamento y

funcionar además, junto con el cuerpo basal, como exportador de componentes

estructurales y reguladores como el factor anti-σ-FlgM (McCarter, 2001; Samatey et al.,

2004). El ensamblaje tanto del filamento como del gancho tiene lugar de forma similar,

a partir de once protofilamentos, sin embargo las subunidades de flagelina que

conforman el filamento presentan en su mayoría estructuras de α-hélice, mientras que

las subunidades del gancho lo hacen en láminas-β. Esta variación confiere mayor

flexibilidad al gancho y una mayor rigidez al filamento que le permite funcionar como

propulsor (Vonderviszt et al., 1995; Samatey et al., 2004).

El cuerpo basal consiste en una estructura central con complejos protéicos en forma de

anillo, se encuentra embebido en la membrana bacteriana (DePamphilis y Adler, 1971;

Jarrell y McBride, 2008). Esta estructura se encarga de la exportación de los

componentes del flagelo como las proteínas del eje central y el gancho a traves de las

membrana interna y externa (Minamino y Macnab, 1999) y contiene el motor flagelar

(Berg, 2003).

Introducción

59

Figura 21. Estructura del flagelo de E. coli y S. enterica y diversidad de algunos de

los genes implicados en su formación y estructura (Pallen et al., 2005).

Los anillos que posee esta estructura se encuentran en las distintas zonas de la

membrama bacteriana, el anillo L se encuentra embebido en el lipolisacárido presente

en la membrana externa, y parece estar relacionado con el transporte de los

componentes del gancho y el filamento, el anillo P se encuentra en la capa de

peptidoglicano. Estos dos anillos solo están presentes en bacterias Gram negativas dada

la estructura de su membrana (Figura 22) (DePamphilis y Adler, 1971; Jarrell y

McBride, 2008; Minamino y Macnab, 1999).

El anillo MS se localiza entre la membrana citoplasmática y el espacio periplasmático y

el anillo C en el citoplasma, ambos anillos participan en la secreción de todos los

sustratos relacionados con la formación del flagelo y en la rotación del mismo. Las

Introducción

60

proteínas presentes en el anillo C activan y controlan la dirección de giro del flagelo

(Berg, 2003; Minamino et al., 2008).

Figura 22. Microscopía electrónica de transmisión de los flagelos purificados de E. coli (A) y B. subtilis

(B). En las imágenes se pueden ver las diferentes estructuras de los cuerpos basales, modificado de

(DePamphilis y Adler, 1971). (C) Modelo del sistema de exportación de las proteínas del flagelo a través

del cuerpo basal (Minamino y Macnab, 1999).

El motor flagelar mide alrededor de 50 nm de diámetro, está compuesto por varios tipos

de proteínas, es capaz de girar a unas 100.000 rpms cuando la energía se obtiene a

través de protones y a 18.000 rpms cuando utiliza iones sodio (Minamino et al., 2008;

Jarrell y McBride, 2008). Posee cuatro partes principales, el rotor formado por los

anillos MS y C, el eje de accionamiento que corresponderá con el eje central del cuerpo

basal y el cojinete que está formado por los anillos L y P (Minamino et al., 2008). El

estátor se compone de once o doce complejos MotA y MotB que son proteínas

transmembrana que permiten el paso de protones hasta el citoplasma. La energía

producida con el paso de los iones genera una fuerza electrostática que se transmite al

rotor, se produce un cambio conformacional en MotA y activa el giro del rotor a través

de la proteína FliG del anillo C produciendo un par de torsión que producirá el giro del

flagelo (Minamino et al., 2008; Thormann y Paulick, 2010). Además de las proteínas

MotA y MotB existen otras proteínas relacionadas con la generación de energía para el

giro. En algunas especies de Vibrio o Aeromonas la energía se genera a través del paso

de iones sodio, siendo las proteínas que permiten el paso PomA y PomB, que parecen

actuar junto con MotC y MotD para favorecer la interacción. En Vibrio además la

energía para el giro de los flagelos laterales proviene del paso de protones (McCarter,

2001; Thormann y Paulick, 2010). En el caso de P. aeruginosa existen dos tipos de

Introducción

61

estátores, cualquiera de los dos es válido para el movimiento tipo swimming, sin

embargo no son redundantes para el movimiento tipo swarming, siendo más importante

el estátor MotCD, además parecen influir en el twitching y en la adhesión a superficies

(Toutain et al., 2005; Toutain et al., 2007). En P. syringae pv. tabaci el comportamiento

parece ser distinto puesto que el estátor MotCD parece influir más en swimming,

swarming y adhesión a superficies (Kanda et al., 2011). En Xcc y X. campestris pv.

campestris existen los genes correspondientes a los dos tipos de estátores, sin embargo

no se ha descrito su papel en motilidad o adhesión (da Silva et al., 2002; Thormann y

Paulick, 2010).

El ensamblaje tiene lugar mediante el paso de las distintas proteínas a través del cuerpo

basal que posee una estructura similar al SST3. Las primeras proteínas que se

ensamblan son los anillos MS y C que forman el canal que atraviesan el resto de las

proteínas. Las distintas subunidades recién sintetizadas se transportan hacia la entrada

donde se linearizan y se estabilizan con chaperonas específicas para cada subunidad,

posteriormente atraviesan en esta forma todo el canal hasta el lugar donde se tienen que

ensamblar. El ensamblaje tiene lugar desde dentro hacia afuera, primero el eje

transversal, el gancho, la cubierta del filamento o HAP2 y finalmente el filamento desde

la zona distal hasta las subunidades más cercanas a la membrana. La traslocación de las

diferentes subunidades a través de la membrana requiere hidrólisis de ATP y fuerza

protomotriz (Evans et al., 2014).

La complejidad del flagelo y el gran número de proteínas que participan en su

formación hacen que sea un proceso altamente regulado. Los genes que codifican para

las distintas proteínas se encuentran regulados en forma de cascada, de manera que

primero se activan los genes que regulan la formación del flagelo, posteriormente los

que componen el cuerpo basal, el sistema de secreción, el gancho y los genes que

activan la transcripción de las flagelinas, finalmente los genes relacionados con

quimiotaxis y el motor flagelar. Aunque en esencia la regulación del flagelo sigue unas

pautas similares para todas las especies bacterianas existen variaciones en el tipo de

reguladores y determinadas proteínas en función del tipo de flagelación que presente la

bacteria, perítrica o polar (Soutourina y Bertin, 2003). La regulación del flagelo se ha

descrito para X. campestris pv. campestris cuyo proceso se puede ver en la Figura 23

(Yang et al., 2009), la describiremos a continuación y posteriormente la compararemos

con otros sistemas de regulación.

Introducción

62

Figura 23. Modelo de la cascada de regulación para la formación del flagelo en Xc. Modificado de Yang

et al. 2009.

En X. campestris la regulación del flagelo tiene lugar en forma de cascada (Figura 23).

Los primeros genes dentro de esta cascada son los dependientes de RpoN/FleQ, que

regulan la expresión de genes relacionados con el sistema de secreción flagelar

(fliEFGHIJ, fliLMNOP y fliQR), el eje central (flgBCDEF), el gancho (flgGHIJKL) y

los reguladores fliA (factor σ28

), fleN y flhF. Estos dos últimos genes están relacionados

en P. aeruginosa con la cantidad y distribución de flagelos en la bacteria (Dasgupta et

al., 2000). Además parece regular también la expresión de las proteínas FlhA y FlhB

que forman parte del sistema de secreción, entrando en contacto con las histonas que

estabilizan las distintas subunidades del flagelo (Evans et al., 2014). Mutantes en los

genes para estas dos proteínas ven reducida la transcripción de la flagelina y de fliA

(únicamente FlhB). Es posible que al no estar formado el sistema de secreción haya

acumulación de la proteína FlgM que se une a FliA impidiendo la regulación de los

genes de la flagelina. FlgM pertenece también a la Clase I de reguladores junto con

RpoN y FleQ, permanece unido a FliA hasta que es secretada a través del sistema de

secreción flagelar. Los genes que se activan en último lugar son dependientes de FliA,

esta proteína activa 21 genes, entre los que se encuentran la flagelina, y otros genes

relacionados con el motor flagelar y quimiotaxis. Además regula de forma positiva

cinco proteínas con dominio GGDEF y una con dominio HD-GYP, que están

relacionadas con la síntesis y degradación de diGMPc pudiendo regular la motilidad a

través de este sistema (He y Zhang, 2008; Mole et al., 2007; Yang et al., 2009).

Introducción

63

En P. aeruginosa la cascada de regulación posee cuatro niveles, a diferencia que en X.

campestris pv. campestris la transcripción de los genes relacionados con la formación

del gancho tiene lugar en un paso posterior. Al igual que en Xanthomonas en la clase I

se encuentran FleQ y RpoN, además de FliA cuya transcripción parece ser

independiente de los reguladores de clase I y II. Al igual que en Xc la regulación de los

genes dependientes de FliA se activa con la secreción de FlgM. En esta especie un

sistema de regulación de dos componentes, FleSR parece regular la transcripción de los

genes del gancho (Figura 24) (Dasgupta et al., 2003).

Figura 24. Modelo de regulación de la formación del flagelo en P. aeruginosa. Los símbolos (+)

significan regulación positiva y los (-) regulación negativa. (Dasgupta et al., 2003)

La principal diferencia entre la flagelación perítrica y la polar es la presencia de los

reguladores FleN/FlhG que controlan la activación de los genes dependientes de FleQ

evitando la formación de nuevos flagelos, además la posición del flagelo es controlada

por FlhF (Dasgupta et al., 2000; Kazmierczak y Hendrixson, 2013), tanto E. coli como

Salmonella carecen de estos genes que controlan el número y posición de flagelos

(McCarter, 2001).

Los movimientos realizados por las bacterias dependientes del flagelo son el swimming

y el swarming:

Introducción

64

Motilidad tipo swimming 5.1.1.

El swimming es el movimiento realizado por las bacterias en medio líquido o medio

semisólido (agar a una concentración de 0,3% o menor). La velocidad que pueden

alcanzar las bacterias en este medio puede llegar hasta 160 µm s-1

, aunque E. coli se

suele mover a una velocidad de entre 25 y 35 µm s-1

, la velocidad puede variar en

presencia de un compuesto quimioatrayente. Durante el swimming las bacterias realizan

dos tipos de movimientos, desplazamientos en línea recta denominados carreras y

cambios de dirección que se realizan mediante volteretas o tumbos. En un medio neutro

las carreras y tumbos son realizados de forma aleatoria, sin embargo en presencia de un

compuesto o estímulo atrayente las bacterias alargan sus carreras en la dirección de éste

orientándose mediante tumbos, si el estímulo fuera repelente, en vez de acercarse se

alejarían (Berg y Brown, 1972; Deepika et al., 2014; Jarrell y McBride, 2008; Larsen et

al., 1974). Larsen en 1974 describió que el flagelo giraba en sentido contrario a las

agujas del reloj cuando se dirigía hacia un compuesto atrayente y en sentido de las

agujas del reloj cuando el compuesto era repelente. Estudios posteriores mostraron que

cuando la bacteria se mueve en línea recta el giro del flagelo se realiza en el sentido

contrario a las agujas del reloj y cuando el sentido de uno o más flagelos cambia se

produce un tumbo y un redireccionamiento de la carrera. Normalmente los cambios en

el sentido del giro del flagelo son aleatorios, sin embargo en presencia de compuestos

determinados se activa el sistema de quimiotaxis que mediante una cadena de

fosforilación desde las MCPs y a través de las proteínas Che hacen que se produzca el

cambio en el giro del motor flagelar (Berg, 2003).

La motilidad tipo swimming es importante en la virulencia de muchas bacterias

patógenas o no de plantas y animales. Para colonizar las raíces de tomate y poder

penetrar en el interior de las mismas R. solanacearum requiere motilidad tipo

swimming, sin embargo una vez ha colonizado el xilema la motilidad dependiente del

flagelo no es necesaria (Tans-Kersten et al., 2001; Yao y Allen, 2006).

Motilidad tipo swarming 5.1.2.

El swarming se ha descrito como la translocación bacteriana que tiene lugar rápida y

coordinadamente en una superficie semisólida (Kearns, 2010; Tremblay y Deziel,

2010). Este tipo de movimiento permite a una población bacteriana colonizar nuevos

nichos rápidamente, activando genes relacionados con virulencia tanto en patógenos

Introducción

65

animales como vegetales así como en bacterias beneficiosas para las plantas (Pearson et

al., 2010; Verstraeten et al., 2008; Xu et al., 2012). La morfología más característica de

las colonias de swarming es el patrón dendrítico, sin embargo existen diversos patrones

que pueden realizar las bacterias en función de su especie, y las características del

medio, como la cantidad de nutrientes, el porcentaje de agar o la humedad del medio

(Figura 25).

Figura 25. Patrones descritos para la motilidad tipo swarming. A: B. subtilis. Este

patrón se produce cuando las células se dispersan de forma continua en la placa, es

difícil de ver a simple vista; B: Proteus mirabilis. En este tipo de patrón se

produce un crecimiento discontinuo de la colonia que está marcado por los

diferentes halos de crecimiento; C: P. aeruginosa. Se produce por la secreción de

distintos agentes surfactantes que interaccionan entre sí dando este patrón; D:

Paenibacillus vortex. Este patrón se caracteriza por el desplazamiento de grupos

de bacterias de forma circular, puede ser debido a la morfología curva de esta

bacteria; E: mutante de B. subtilis que ha perdido la capacidad de hacer swarming.

En este caso se produce el crecimiento de una colonia en el lugar de inoculación y

movimiento tipo sliding; F: mutante supresor de B. subtilis incapaz de hacer

swarming que presenta un crecimiento en la placa provocado por células que ha

conseguido recuperar el fenotipo del swarming (Kearns, 2010).

Las células swarmer en general se caracterizan por ser hiperflageladas, llegando a

doblar el número de flagelos en su superficie, por presentar aumento de tamaño y

multinucleación. En Proteus mirabilis el tamaño de la célula swarmer puede llegar a ser

hasta 40 veces mayor que la célula vegetativa, además se produce la secreción de

Introducción

66

agentes surfactantes que favorecen el desplazamiento en la superficie y regulación tipo

quorum sensing, puesto que el swarming es un comportamiento poblacional

(Verstraeten et al., 2008). Sin embargo P. aeruginosa no produce flagelos laterales,

únicamente produce dos flagelos polares (Köhler et al., 2000; Rashid y Kornberg,

2000), además es capaz de realizar swarming en medios con altas concentraciones de

agar en ausencia de flagelo y pili tipo IV, siendo por lo tanto uno de los factores más

importantes la producción de rhamnolípidos (Takahashi et al., 2008). Sin embargo en P.

syringae pv. tabaci el pilus tipo IV parece ser esencial para este movimiento (NGUYEN

et al., 2012). Los géneros Vibrio y Aeromonas poseen un flagelo polar necesario para la

motilidad tipo swimming y flagelos laterales que son utilizados en el movimiento tipo

swarming (Kirov et al., 2002; McCarter, 2004; Kirov et al., 2004).

El cambio de estado vegetativo a célula swarmer parece estar relacionado con el sistema

de transducción de señales de quimiotaxis a través del motor flagelar y con otros

sensores de superficie que son similares a las MCPs. Además el reconocimiento de

superficies puede tener lugar por variaciones en el lipopolisacárido de la membrana

bacteriana. En S. typhimurium el flagelo, además, es un sensor de la humedad presente

en el medio activando el paso a célula swarmer. Esta transición requiere un tiempo de

adaptación en la bacteria denominado “swarm lag” que es variable en función de la

especie bacteriana y posiblemente el medio. Hay casos en los que este tiempo es tan

largo que para inducir swarming en placa, las bacterias necesitan ser repicadas de una

placa de swarming y ser inoculadas en una nueva (Anderson et al., 2010; Belas, 2014;

Burkart et al., 1998; Kearns, 2010).

Durante las primeras etapas del swarming se incrementa la transcripción de los

reguladores iniciales de la formación del flagelo como flhDC en P. mirabilis o lafK o el

operón scrABC para la síntesis de flagelos laterales en V. parahaemolyticus, sin

embargo en algunas especies no parece observarse diferencias en la transcripción de los

genes relacionados con el flagelo sugiriéndose además una regulación post-

transcripcional para E. coli o Salmonella (Kearns, 2010; Patrick y Kearns, 2012;

Verstraeten et al., 2008). Durante la fase lag se produce también el aumento de tamaño

en la célula, en Proteus y Vibrio se ha observado que en esta etapa se inhibe la

expresión de genes relacionados con la formación del septum, lo que da lugar a células

multinucleadas. Además se activan genes que se han relacionado con la organización de

las membranas lipídicas y el peptidoglicano (Pearson et al., 2010). Otra característica

Introducción

67

importante para el movimiento tipo swarming es la producción de agentes surfactantes

que en muchos casos es dependiente del sistema de quorum sensing, por lo que para

poder realizar este movimiento se requiere una densidad poblacional alta, también se ha

descrito que en P. syringae es dependiente de FleQ, el regulador inicial del flagelo. Los

agentes biosurfactantes o surfactantes en general son moléculas anfipáticas como

lípidos, glicolípidos o lipopéptidos que facilitan el desplazamiento en superficie

disminuyendo la tensión superficial entre el medio y la bacteria. Entre los surfactantes

descritos en bacterias se encuentran los rhamnolípidos en P. aeruginosa, la

syringafactina en P. syringae y el HAA (3-(3-hidroxialcanoiloxi) ácido alcanóico) en

ambas especies, además se ha descrito la serrawetina para S. liquifaciens o surfactina en

B. subtilis (Kearns, 2010; Köhler et al., 2000; Verstraeten et al., 2008; Xu et al., 2012).

5.2. Motilidad tipo sliding

El sliding se describe como la translocación en superficie como resultado de las fuerzas

expansivas que tienen lugar durante el crecimiento de una colonia bacteriana en un

cultivo semisólido en combinación con propiedades específicas de la superficie celular

que reducen la fricción entre el medio y la bacteria (Henrichsen, 1972). Este tipo de

movimiento se ha descrito en varias especies bacterianas como las mycobacterias, o

Alcaligenes odorans y en mutantes carentes de flagelo y pili tipo IV de Pseudomonas

cuya translocación no se puede relacionar con swarming o twitching (Henrichsen, 1972;

Martínez et al., 1999; Murray y Kazmierczak, 2008).

Durante el sliding, las bacterias se encuentran unidas mediante fibras que no se han

relacionado con fimbrias o pili. Mycobacterium suele formar pseudofilamentos, aunque

las células también se encuentran unidas de forma lateral. Las bacterias del frente de

avance parecen no encontrarse unidas por fibras y son empujadas por aquellas que se

encuentran en la zona colonizada, que presentan un grado mayor de agregación

(Martínez et al., 1999). El desplazamiento en la superficie es facilitado por la presencia

de compuestos anfipáticos en la cubierta celular, en el caso de Mycobacterium existen

componentes específicos en su membrana que facilitan este proceso. Además las

células, durante este movimiento, parecen estar cubiertas por una masa mucosa cuya

composición es desconocida. En el caso de los mutantes en flagelo y pili tipo IV de P.

aeruginosa la producción de agentes surfactantes es esencial para este tipo de

movimiento, siendo también necesario para Serratia y Bacillus. Un artículo reciente

describe en mutantes no flagelados de S. enterica un desplazamiento distinto del sliding

Introducción

68

porque no hay producción de agentes surfactantes, y demuestran que es dependiente de

la concentración de magnesio, del sistema de dos componentes PhoP/PhoQ y de la

proteína PagM (Martínez et al., 1999; Murray y Kazmierczak, 2008; Park et al., 2015).

En P. aeruginosa el sliding parece estar reprimido en presencia de pili tipo IV, puesto

que este favorece la agregación celular. Además al igual que el swarming parece ser

dependiente de los niveles de diGMPc y de otros sistemas como GacA/GacS y RetS

(Murray y Kazmierczak, 2008). Mutantes en fleQ de P. fluorescens realizan un

movimiento en superficie de carácter dendrítico no dependiente del flagelo y en

presencia de pili tipo IV, este movimiento se ha considerado sliding por ser dependiente

de la viscosina, el surfactante de esta bacteria promotora del crecimiento en plantas

(Alsohim et al., 2014).

5.3. Movimiento tipo twitching

El movimiento tipo twitching es dependiente de pili tipo IV y de su capacidad de

elongación y retracción. El mecanismo por el que se produce el twitching está basado en

la unión no específica del pilus a una zona del tejido y la posterior retracción del mismo,

lo cual permite el desplazamiento de la bacteria hasta la zona donde el pilus se ancló

previamente (Craig et al., 2004). Este movimiento permite una rápida colonización del

huésped o de nichos determinados, favoreciendo al virulencia en muchos patógenos, así

como la formación de biopelículas o agregados y los cuerpos fructíferos de géneros

como Myxococcus (Mattick, 2002).

El movimiento tipo twitching puede tener lugar en superficies tanto orgánicas como

inorgánicas y aunque para efectuarlo la bacteria necesita alta concentración de

nutrientes, sus requerimientos de humedad son más bajos que los de los movimientos

descritos anteriormente (Mattick, 2002). Normalmente las bacterias se mueven en

grupos unidas a lo largo de su eje longitudinal, sin embargo hay casos en los que puede

haber desplazamientos realizados por bacterias individuales (Burrows, 2012). Se ha

descrito que cepas de Ralstonia solanacearum que presentan movimiento tipo twitching,

son capaces de migrar en placas de agar a las 20 horas de la inoculación cuando las

colonias no son todavía visibles (Figura 26). Las estructuras que se forman son similares

a zarcillos y varían en función de la cepa ensayada. Cuando la colonia es visible el

twitching no se puede observar debido al crecimiento celular y la producción de

exopolisacárido que lo enmascara. Este hecho no sucede en P. aeruginosa PAO1 donde

Introducción

69

las colonias siguen expandiéndose y la formación típica de twitching no se ve

enmascarada (Liu et al., 2001).

Figura 26. Evolución de una colonia en R. solanacearum, que presenta movimiento tipo twitching a

distintas horas del cultivo. Barra 2 mm (Liu et al., 2001).

El papel del twitching en virulencia puede verse enmascarado por otros factores como la

adhesión y formación de biopelículas en los que participa el pilus tipo IV. En algunos

casos la importancia de este movimiento es más clara, como en Dichelobacter nodosus,

donde mutantes que codifican para la ATPsa relacionada con este movimiento

mostraron una reducción de su virulencia (Burrows, 2012). En P. syringae pv. tabaci

6605 se ha demostrado que este movimiento es también importante para la virulencia.

En este patógeno para que tenga lugar el twitching es necesario que los pili se

encuentren glicosilados, sin embargo para adhesión y formación de biopelículas los pili

tipo IV no necesitan estar glicosilados. Cuando se inocula por inmersión hojas de tabaco

con el mutante en la glicosiltransferasa no hay desarrollo de la enfermedad, sin embargo

cuando es infiltrado si hay producción de síntomas (Nguyen et al., 2012).

X. citri subsp. citri es capaz de realizar este tipo de movimiento en medios nutritivos al

1% de agar, comprobándose que son dependientes de la presencia de pili tipo IV, sin

embargo hasta ahora no se ha demostrado su relación con la virulencia (Dunger et al.,

2014).

Otros movimientos en superficie dependientes del pili tipo IV son el denominado

walking descrito como aquél en el que la bacteria se mueve de forma perpendicular a la

superficie con baja persistencia direccional y a alta velocidad para explorar

microambientes, y el llamado crawling descrito como movimiento longitudinal de la

bacteria en una misma dirección (Conrad et al., 2011). Además existe un movimiento

similar al twitching realizado por myxobacterias, cianobacterias, Cytophaga,

Flavobacterium y micoplasmas, que es variable en función del grupo bacteriano que lo

Introducción

70

realice y se denomina gliding y solo en algunos casos es dependiente de pili tipo IV.

Aunque este movimiento en principio pueda considerarse similar al twitching, en

Myxococcus se ha dividido en dos tipos que se realizan de forma conjunta, un

movimiento social, que es dependiente de pili tipo IV y un movimiento individual en

superficies poco húmedas, que parece basarse en la propulsión producida por la

secreción de exopolisacárido. En el caso de Flavobacterium el movimiento parece

generarse a través de motores situados en la membrana bacteriana que desplazan

adhesinas a lo largo de la superficie (Jarrell y McBride, 2008; McBride, 2001).

5.4. Quimiotaxis

La supervivencia de las bacterias está determinada por su capacidad para adaptarse y

colonizar nuevos nichos. Poder reconocer un nicho determinado adaptando su desarrollo

a ese medio confiere ventaja ecológica frente a otros microorganismos que no poseen

esa cualidad, incluso aunque tengan los medios apropiados para poder sobrevivir en

tales condiciones. Como hemos mencionado antes, en muchas bacterias el motor

flagelar sirve como sensor de superficies, lo que conduce a activar los mecanismos de

movimiento en superficie o adhesión a dicha superficie. La carencia de este mecanismo

impide la adaptación de la bacteria a su nuevo modo de vida y los cambios necesarios

para su supervivencia haciéndola menos competitiva en ese medio. X. alfalfae subsp.

citrumelonis es un patógeno de cítricos que únicamente produce síntomas en hojas de

plantas jóvenes, siendo incapaz de infectar frutos. Estudios realizados en nuestro

laboratorio han mostrado que a pesar de ser capaz de pasar a un modo de vida sésil en

hojas formando biopelículas, en fruto no se ha observado ningún tipo de agregación por

parte de este patógeno. Este patógeno no es capaz de reconocer el huésped en el que se

encuentra y no pone los medios apropiados para asegurar su supervivencia (Sena-Vélez

et al., 2014).

La quimiotaxis es el mecanismo de percepción de señales del ambiente que permite a la

bacteria adoptar el comportamiento adecuado, generalmente una respuesta mótil, a las

variaciones producidas en el medio en el que se encuentra. Los procesos de quimiotaxis

permiten a las bacterias dirigirse hacia zonas o compuestos más adecuados para su

desarrollo, evitando compuestos repelentes o dañinos para ellas. Este comportamiento

fue descrito por primera vez a finales del siglo XIX, cuando Engelmann observó

mediante microscopía que las bacterias tendían a dirigirse y acumularse en zonas con

altas concentraciones de oxígeno como las burbujas o algas, además observó que en

Introducción

71

presencia de compuestos deletéreos para ellas, las bacterias huían y colonizaban las

zonas con menos acumulación de dicho químico (Miller et al., 2009). Dado que las

bacterias, por su tamaño, no pueden percibir gradientes, producen desplazamientos

aleatorios en el medio en el que se encuentran hasta percibir variaciones en la

concentración de uno o varios compuestos además otras características como el pH o la

osmolaridad. En presencia de un compuesto quimioatrayente las carreras que tienen

lugar durante el movimiento tipo swimming se alargan en dirección al compuesto,

disminuyéndose el número de tumbos que se realizan. En presencia de un repelente el

número de cambios de dirección es mayor aunque las carreras son más largas a medida

que se alejan del compuesto. En la naturaleza las bacterias están expuestas a una gran

cantidad de estímulos y eso implica que no solo influye la concentración de un solo

atrayente o repelente sino el balance de factores que puedan afectar a su supervivencia

(Miller et al., 2009; Porter et al., 2011).

La quimiotaxis es un factor importante en la virulencia de muchos patógenos tanto

vegetales como animales, así como en bacterias beneficiosas para las plantas (Porter et

al., 2011). Recientemente en Xcc se ha descrito mediante la mutación de distintos genes,

que la quimiotaxis juega un papel importante para el establecimiento de la infección.

Yaryura y colaboradores describieron que el mutante en el regulador XbmR veía

disminuida su capacidad infecciosa respecto a la cepa silvestre, además este mutante se

encontraba afectado en motilidad tipo swimming, formación de biopelículas y

quimiotaxis frente a extractos de hoja de pomelo. En este artículo, sin embargo se

discute si tanto la formación de biopelículas como la quimiotaxis podía ser un efecto

secundario de la falta de motilidad tipo swimming (Malamud et al., 2011; Yaryura et al.,

2015).

Sistema de transducción de señales que dirige a una respuesta quimiotáctica 5.4.1.

La percepción de un compuesto o quimioefector por parte de las bacterias da lugar a un

sistema de transducción de señales basado en el paso de fosfatos a través de las

proteínas Che, que producen un cambio en el sentido de giro del flagelo y un cambio en

la dirección de la bacteria mediante un tumbo. El sistema de quimiotaxis más estudiado

hasta ahora es el de E. coli, y aunque se encuentra bastante conservado en todos los

grupos bacterianos existen algunas excepciones. Por ejemplo, B. subtilis posee proteínas

accesorias no encontradas en E. coli, algunas de las cuales están también presentes en

los genomas de Xanthomonas. Además se ha descrito en diversas especies bacterianas

Introducción

72

sistemas de quimiotaxis alternativos que regulan la formación de biopelículas y

estructuras de resistencia como los quistes formados por Myxococcus, Azospirillum o

Azotobacter, motilidad basada en los pili tipo IV y producción de exopolisacárido entre

otros. Hasta la fecha sólo unos pocos han sido estudiados. En P. aeruginosa existen

cuatro rutas de quimiotaxis que regulan la respuesta quimiotáctica perse, el swarming,

el twitching, la virulencia y la formación de biopelículas, cada uno de estos sistemas

posee sus propios sensores que son homólogos a las MCPs (Tabla 3) (da Silva et al.,

2002; He y Bauer, 2014; Miller et al., 2009; Porter et al., 2011).

Tabla 3. Proteínas relacionadas con quimiotaxis en Xanthomonas patógenas de cítricos comparadas con

Pseudomonas y E. coli.

Organismo MCP CheW CheA CheR CheB CheV CheD CheZ Total

X. axnopodis pv. citri 306 22 5 4 3 5 1 1 1 42

X. axnopodis pv. citri 29_1 25 6 4 3 5 1 1 1 46

X. citri subsp. citri 12879 Aw

25 6 4 3 6 1 1 1 47

X. alfalfae subsp. citrumelonis 24 6 4 3 5 1 1 1 45

P. aeruginosa PAO1 26 7 4 4 4 1 1 1 48

P. putida KT2440 27 6 3 3 3 3 0 1 46

Escherichia coli 55989 5 1 1 1 1 0 0 1 10

Como se ha descrito anteriormente, el número de MCPs y sistemas de transducción de señales es menor

en E. coli que en el resto de las bacterias, además se observan diferencias incluso entre cepas

correspondientes a la misma especie, como es el caso de las X. citri subsp. citri. Los datos han sido

obtenidos de la base de datos MiST2 Database (Ulrich y Zhulin, 2010). La totalidad de los genes que

codifican para las proteínas de la tabla están presentes en el genoma.

Dado que es el sistema de transducción de señales más estudiado y que es común a la

mayoría de las especies bacterianas, describiremos como modelo el sistema de E. coli.

En esta especie la señal proviene de las proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs),

que en general poseen dominios sensores periplásmicos y dominios señalizadores en el

citoplasma. Normalmente se encuentran formando dímeros de la misma MCP asociados

en grupos de tres MCPs distintas en los polos de la bacteria (Figura 27). Estos conjuntos

de MCPs se encuentran unidos a una única proteína de unión CheW y a CheA que es

una histidín quinasa. Cuando los sensores unen un ligando o quimioefector se produce

Introducción

73

un cambio conformacional que se transmite al espacio citoplásmatico. Las interacciones

alostéricas que tienen lugar en este conjunto de proteínas producen una ampliación de la

señal de quimiotaxis, lo que permite a la bacteria percibir variaciones muy pequeñas en

la concentración del quimioefector. La histidín quinasa CheA produce la fosforilación

de CheY y CheB, la proteína CheY fosforilada (en la figura CheY-P) se desplaza hasta

el motor flagelar donde se une a las proteínas que controlan la dirección de giro del

flagelo (FliM y FliN) cambiando la dirección de giro del mismo y provocando un tumbo

y un cambio de dirección en la trayectoria de la bacteria. Finalmente la proteína CheY

es desfosforilada mediante la fosfatasa CheZ, siendo susceptible de recibir nuevamente

la señal de la MCP. Las proteínas CheR y CheB producen la metilación y desmetilación

del receptor MCP respectivamente. CheR que se encuentra activa de forma constitutiva,

añade grupos metilo a los dominios de metilación conservados en los quimiorreceptores

desde una S-adenosilmetionina.

Figura 27. Sistema de transducción de señales quimiotácticas

en E. coli. Modificado de (Bi y Lai, 2015).

Por otro lado cuando la proteína CheB recibe el grupo fosfato de CheA produce la

desmetilación del quimiorreceptor. Este proceso de metilación-desmetilación tiene una

fase de latencia que le confiere a la bacteria memoria a corto plazo, esta memoria le

Introducción

74

permite comparar la concentración del quimioefector en el área donde se encuentra con

la percibida anteriormente (Baker et al., 2006; Bi y Lai, 2015; He y Bauer, 2014; Miller

et al., 2009; Porter et al., 2011).

Proteínas aceptoras de grupos metilo 5.4.2.

Las proteínas aceptoras de grupo metilo o MCPs son sensores de moléculas o

compuestos químicos entre los que se encuentran aminoácidos, azúcares e incluso

metales pesados como el níquel o el cobre en bacterias y arqueas. Las MCPs están

altamente relacionadas con el movimiento de la bacteria puesto que son capaces de

inducir cambios el sentido de giro del flagelo y en la dirección de la carrera de la

bacteria.

Figura 28. Estructura de ensamblaje de las unidades sensoras en bacterias. Modificado de (Bi y Lai, 2015)

Las MCPs poseen un dominio de unión a ligandos cuya estructura es variable, que se

encuentra generalmente en el espacio periplasmático, un dominio transmembrana que

transforma la señal con un dominio HAMP, y un dominio de señalización que se

encuentra en el citoplasma que es el que controla la fosforilación. Este dominio se

subdivide en la zona de metilación, un dominio flexible y una zona de contacto de

proteínas. Los quimiorreceptores se agrupan en trímeros formados por tres MCPs

distintas con dos subunidades de una misma MCP (Figura 27), cada trímero va unido a

una proteína CheW y CheA. La agrupación de estos complejos tiene lugar de forma que

las proteínas CheA y CheW forman hexámeros mediante interacciones hidrofóbicas.

Los hexámeros a su vez se encuentran unidos a los trímeros de MCPs formando una

unidad funcional. Las unidades funcionales se unen entre sí formando una red que

Introducción

75

compone el sistema sensorial de la bacteria, localizado en los polos de la misma (Figura

28) (Bi y Lai, 2015).

El número de MCPs en las bacterias es variable y es dependiente del medio en el que se

encuentran y el tamaño del genoma de las mismas (Lacal et al., 2010b). Las arqueas

poseen de media 6,7 MCPs y las bacterias una media de 13,9 MCPs por genoma.

Magnetospirillum magnetotacticum posee 64 MCPs, mientras que E. coli únicamente 4

MCPs. Especies bacterianas como E. coli, cuyo nicho es muy específico o son

patógenos estrictos, tienen un bajo número de MCPs, y sin embargo bacterias del suelo,

agua o rizosfera poseen mayor número, debido a la variabilidad y complejidad tanto

física como química que poseen los medios que colonizan (Alexandre et al., 2004;

Miller et al., 2009).

Figura 29. Clasificación de MCPs en seis grupos descrita por Lacal y col en 2010 (Lacal et al., 2010b) y

abundancia de los distintos grupo en bacterias. LBR indica la región de unión a ligandos (del inglés

ligand binding residues) y MA significa zona de metilación.

La topología de las distintas MCPs es variada y ha llevado a establecer una clasificación

en 6 grupos que se muestran en la Figura 29. En estas proteínas la región de unión a

ligandos puede estar presente o ausente y dentro o fuera de la membrana bacteriana.

Como se puede ver en la figura, el modelo más abundante es el Ia en el que la región de

unión a ligandos está en el espacio periplásmico flanqueada por dos hélices

Introducción

76

transmembrana. La función de las MCPs o receptores que son completamente

citoplasmáticos puede estar relacionada con la monitorización de los niveles energéticos

en la bacteria (Alexandre, 2010; Lacal et al., 2010b; Bi y Lai, 2015).

Los quimiorreceptores están compuestos de una región de unión a ligandos (LBR del

inglés ligand binding residues) y un dominio señalizador. La región de unión a ligandos

es variable en tamaño, clasificándose en Clúster I aquellas LBR que tienen un tamaño

entre 120 y 210 aminoácidos, y en el Clúster II aquellas LBR cuyo tamaño esté

comprendido entre 220 y 300 aminoácidos. Estas últimas pueden tener dos módulos

estructurales que reconocen distintos tipos de ligandos (Lacal et al., 2010b), como

sucede en la proteína McpS de Pseudomonas putida KT2440, que une compuestos

intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Lacal et al., 2010a) y acetato

(Pineda-Molina et al., 2012). Además los distintos módulos pueden unir su ligando sin

que la unión a uno de los módulos impida la unión del ligando al otro (Pineda-Molina et

al., 2012).

Se han descrito diferentes estrategias de percepción de señales por parte de las MCPs y

no todas ellas se basan en el reconocimiento directo del ligando. Existen mecanismos

descritos en los que tiene lugar la unión de distintas moléculas, ya sea con más de una

región de unión de ligandos o mediante la unión del complejo formado por el ligando y

una proteína secretada (Pineda-Molina et al., 2012).

La quimiotaxis y el reconocimiento de una señal no se encuentran siempre asociado al

consumo de los quimioefectores por parte de la bacteria. En muchos casos la señal

percibida por la bacteria es simplemente un indicativo de de la existencia de un nicho

apropiado para su desarrollo (Alexandre y Zhulin, 2001). D. dadantii, presenta

quimioatracción frente al ácido jasmónico, siendo esta sustancia únicamente un

indicativo de que hay una herida en la planta por la que puede penetrar y producir

infección (Antunez-Lamas et al., 2009b; Río-Álvarez et al., 2014). De hecho, el primer

tipo de quimiotaxis descrito fue el independiente del metabolismo, que es aquel en el

que el quimioefector no es metabolizado por la bacteria. Este tipo de quimiotaxis

cumple las pautas descritas por Adler para la quimiotaxis, análogos no metabolizables

de quimioatrayentes metabolizables son también atrayentes y la mutación de genes

implicados en el metabolismo del compuesto no suele alterar la quimiotaxis hacia dicho

compuesto. Por último los quimioefectores son atrayentes en presencia de otros

compuestos metabolizables. Se ha comprobado, sin embargo, que estos postulados no

Introducción

77

siempre se cumplen, hay casos en los que los quimioefectores han de ser metabolizados

para producir una respuesta, siendo los subproductos de este metabolismo los que

realmente producen dicha respuesta.

El reconocimiento de un quimioefector y su gradiente puede tener lugar mediante las

variaciones energéticas que se producen en la célula en presencia del compuesto. Este

proceso es mediado por el sistema de transporte de electrones y se le denomina taxis

energética, o en inglés energy taxis. En este tipo de taxis el nicho óptimo para las

bacterias es aquel en el que el rendimiento metabólico de las mismas es mayor. Las

variaciones energéticas no son solo debidas al metabolismo de compuesto químicos,

sino que pueden tener lugar además por la presencia de luz, aceptores finales de

electrones, o compuestos con actividad redox, considerándose además la aerotaxis como

un tipo de taxis energética (Alexandre, 2010; Alexandre y Zhulin, 2001).

6. Formación de Biopelículas

Las bacterias en su medio natural pueden encontrarse en forma libre o planctónica, o

estar asociadas en agregados formando una comunidad organizada. Se puede describir

biopelícula o biofilm como un conjunto de comunidades bacterianas sésiles adheridas a

superficies y con estructura más o menos tridimensional. Como grupo de bacterias

coordinadas entre sí presentan un comportamiento similar a un organismo multicelular

con altas tasas de transmisión génica, cooperación y estratificación. Las biopelículas

confieren a las bacterias múltiples ventajas frente al modo de vida planctónico,

favoreciendo la supervivencia de la población. Cuando las bacterias se encuentran

organizadas en biopelículas pueden llegar a ser hasta mil veces más resistentes a

antibióticos y condiciones deletéreas del medio. La formación de agregados organizados

permite a las bacterias colonizar un nicho o huésped apropiado para su desarrollo

(Busscher y van der Mei, 2012; Petrova y Sauer, 2012).

Xcc es capaz de agregarse y formar biopelículas tanto en superficies bióticas como

abióticas, esta estructura protege a las bacterias de las distintas condiciones adversas

que se pueden producir en la superficie vegetal como son la desecación, la presencia de

compuestos antimicrobianos y otros mecanismos de defensa de la planta, además

favorece la comunicación intercelular, el crecimiento en medios poco nutritivos o en la

hoja o fruto (Rigano et al., 2007), favoreciendo a su vez la generación de diversidad

Introducción

78

dentro de las población de la biopelícula (Boles et al., 2004). El proceso de infección

está directamente relacionado con el tamaño de la población en la superficie, y la

formación de lesiones puede depender de la efectividad de la bacteria para adherirse y

formar de biopelículas en la superficie vegetal (Rigano et al., 2007; Cubero et al., 2011).

6.1. Etapas en la formación de biopelículas

En un primer paso las bacterias se adhieren únicamente al tejido, lo que algunos autores

denominan biopelículas monocapa (Figura 30). Posteriormente, en función de las

condiciones ambientales, pueden pasar a un estado de adhesión irreversible y a

continuación formar una biopelícula compleja dando lugar en muchos casos a la

formación de estructuras similares a setas, columnas o agregados separados por canales

que los conectan. Entre las estructuras bacterianas que participan en las primeras etapas

de la formación se encuentra el flagelo y los pili. Durante el desarrollo de la biopelícula

se sintetizan diferentes tipos de adhesinas. Algunas de ellas promueven la fijación

irreversible de la bacteria a cualquier superficie y otras que lo hacen de forma específica

a determinados materiales (Karatan y Watnick, 2009; Petrova y Sauer, 2012).

Figura 30. Etapas en la formación de biopelículas (Molin y Tolker-Nielsen, 2003).

La primera etapa en la formación de biopelículas es la adhesión reversible que comienza

con una serie de interacciones entre la superficie del tejido y de la bacteria en las que

participan fuerzas atractivas de Van der Waals, fuerzas electrostáticas que pueden ser de

atracción o repulsión, la formación de puentes de hidrógeno y el movimiento

Browniano. A medida que la bacteria se va acercando a la superficie surgen fuerzas

repulsivas, debido principalmente a que tanto la carga de la membrana bacteriana y el

Introducción

79

tejido, animal o vegetal, son negativas. A pesar de existir fuerzas repulsivas entre las

superficies, la presencia de estructuras filamentosas como los pili o flagelos permiten la

adhesión superando las fuerzas de repulsión entre la bacteria y el tejido (Busscher y van

der Mei, 2012; Proft y Baker, 2009). Durante la etapa de adhesión reversible las

bacterias permanecen unidas a la superficie de forma polar a través del flagelo. En este

momento las bacterias pueden realizar diversos tipos de movimientos, además del

Browniano aleatorio de la bacteria, pueden vibrar, hacer twitching mediante los pili tipo

IV, desplazarse por la superficie o girar sobre sí mismas, spinning, este último tipo de

movimiento es indicativo de la unión de la bacteria al tejido mediante el flagelo.

En cuanto las bacterias entran en contacto con la superficie comienza a variar la

expresión génica de las mismas favoreciendo el modo de vida sésil (Kostakioti et al.,

2013). La adhesión irreversible es dependiente del sistema de regulación mediante

quorum sensing y de los niveles de di-GMPc en la bacteria. Los niveles de di-GMPc

regulan el swarming, la producción de exopolisacáridos y la modulación del flagelo. En

P. aeruginosa, la regulación del swarming y de la formación de biopelículas es

inversamente proporcional, altos niveles de di-GMPc favorecen la formación de

biopelículas y producción de exopolisacáridos mientras que bajos niveles de di-GMPc

favorecen el movimiento tipo swarming y no la formación de biopelículas (Kuchma et

al., 2007; Merritt et al., 2007a). En P. fluorescens y P. putida el paso a estado

irreversible tiene lugar mediante la localización de la proteína de adhesión LapA que es

regulada de forma post-traduccional por di-GMPc, los niveles de di-GMPc dependen

además de la presencia de fosfato inorgánico a través del regulón pho. Este sistema de

regulación de biopelículas se ha observado únicamente en Pseudomonas presentes en el

suelo y no parece estar relacionado con el movimiento en superficie ni la producción de

exopolisacáridos. En otros microorganismos el paso a estado no reversible depende de

la producción de determinadas estructuras de adhesión que impiden la rotación del

flagelo lo que produce variación en la regulación general de la bacteria y secreción de

exopolisacáridos (Gjermansen et al., 2005; Hinsa et al., 2003; Petrova y Sauer, 2012).

La estructura de las biopelículas es variable, las hay con una estructura tridimensional,

formando columnas o setas que abarcan una superficie pequeña, o aquellas que se

extienden a lo largo de una superficie a modo de lámina. La estructura de las

biopelículas depende tanto del medio donde se encuentran las bacterias como de

características propias de la misma incluyendo su capacidad para producir agentes

Introducción

80

surfactantes y agregarse o moverse, estando estos procesos asociados en su mayoría a

sistemas de regulación tipo quorum sensing (Karatan y Watnick, 2009). Además se

produce diferenciación celular en función de la posición que las células ocupen dentro

del agregado, dependiendo ésta de la disponibilidad de nutrientes, oxígeno y residuos

entre otros y llegándose a producir variantes fenotípicas y genotípicas dentro de la

biopelícula (McDougald et al., 2012).

Asimismo, la dispersión de las biopelículas tiene lugar cuando se dan determinadas

condiciones en el medio relacionadas con la concentración de nutrientes, la

concentración de oxígeno, la presencia de residuos en la biopelícula o una densidad

poblacional determinada (McDougald et al., 2012). Para que tenga lugar la dispersión se

tienen que activar genes relacionados con dispersión en gran parte del agregado

posiblemente mediante moléculas de pequeño tamaño que al final conducen a la ruptura

de la matriz (Oppenheimer-Shaanan et al., 2013). La ruptura de la matriz se produce por

la degradación del exopolisacárido, las adhesinas tanto fimbrilares como no fimbrilares

o el ADN extracelular (McDougald et al., 2012). En X. campestris la dispersión de la

biopelícula se produce al menos parcialmente al sintetizarse un manasa regulada

mediante quorum sensing (Dow et al., 2003). También se ha descrito el papel de

DNAsas extracelulares en la degradación de la matriz extracelular que en P. aeruginosa

puede estar relacionada con la reversión al estado planctónico (Mulcahy et al., 2010). La

ruptura y dispersión de las biopelículas puede también tener lugar por la presencia de

bacteriófagos, cuyos genomas están incluidos en un 60-70% de las bacterias. Los

bacteriófagos producen lisis bacteriana que deriva en la rotura del agregado, además

producen enzimas que disgregan la matriz extracelular favoreciendo este proceso. En P.

aeruginosa se ha comprobado que hay expresión de genes relacionados con profagos en

las etapas más tardías de la biopelícula, así como la presencia de los mismos

(McDougald et al., 2012). La lisis celular produce una gran cantidad de nutrientes que

pueden ser asimilados por las células que posteriormente se dispersan y así obtener la

energía suficiente para colonizar nuevos nichos (Karatan y Watnick, 2009). Cuando las

biopelículas han alcanzado un tamaño determinado, algunas de las células parecen

comenzar a expresar genes relacionados con la formación del flagelo y motilidad

pasando a estado planctónico, mientras las células de otras partes del agregado

permanecen sésiles, este proceso parece además ser dependiente de quorum sensing en

P. aeruginosa y Xc (Dow et al., 2003; Karatan y Watnick, 2009).

Introducción

81

6.2. Factores que determinan la formación y dispersión de biopelículas

La formación de biopelículas está regulada por varios factores, cuya implicación varía

en función de la especie o incluso de la cepa bacteriana. Esta variación posiblemente sea

debida a la adaptación de las diferentes bacterias a las distintas condiciones del medio.

Señales del medio en el que se encuentran las bacterias 6.2.1.

Para la formación de biopelículas es necesaria la presencia de una superficie, ya sea

viva o inerte y unas condiciones y señales en el ambiente que varían en función de la

bacteria. La formación de biopelículas requiere un gasto alto de energía, por lo que es

importante para las bacterias poseer un sistema preciso de regulación en relación al

ambiente (Busscher y van der Mei, 2012). Los mecanismos de quimiotaxis permiten a

las bacterias reconocer el medio en el que se encuentran y adoptar o no la conformación

de biopelícula, tal como se ha comprobado en P. aeruginosa (Hickman et al., 2005;

Kostakioti et al., 2013)

El reconocimiento de las superficies tiene lugar a través del flagelo. La disminución en

la velocidad del giro del flagelo cuando éste se encuentra en una superficie, parece ser

transmitida a través del motor de flagelo permitiendo así el paso a vida sésil. Está

descrito en varias especies bacterianas que mutantes que carecían de flagelo eran

capaces de adherirse a una superficie, pero mutantes que poseían flagelo y no era mótil,

debido a una mutación en el motor del mismo, no eran capaces de adherirse,

posiblemente porque no reconocían la superficie. Por ejemplo en P. aeruginosa

mutaciones en cualquiera de los dos motores flagelares (Sistemas MotAB o MotCD)

inhiben o dificultan la adhesión. El motor flagelar actúa como sensor mecánico

activando genes relacionados con la producción de exopolisacáridos que favorece la

formación de agregados. Además, se han descrito otros sensores de superficie cuya

señal es por ahora desconocida pero que estarían relacionados con el contacto de la

bacteria a la superficie. El funcionamiento de este tipo de sistema denominado Wsp en

P. aeruginosa es similar al de las MCPs y la cadena de transducción de señales en

quimiotaxis, parece participar en el proceso de adhesión y reconocimiento de superficies

(Belas, 2014; Busscher y van der Mei, 2012; Karatan y Watnick, 2009; Petrova y Sauer,

2012; Toutain et al., 2005; Toutain et al., 2007).

También existen señales nutricionales y metabólicas, que participan en la inducción de

los procesos de agragación bacteriana. La formación de agregados y biopelículas en la

Introducción

82

mayoría de las especies bacterianas, se ve favorecida en condiciones de limitación

nutricional, ya sean fuentes de carbono, nitrógeno o fosfatos. Sin embargo algunas

bacterias como E. coli K12 requieren fuentes de carbono que participen en rutas

metabólicas relacionadas con el acetato, indicándole a la bacteria que se encuentra en un

ambiente favorable para la formación de biopelículas. V. cholerae precisa la presencia

de monosacáridos, necesarios para la producción de exopolisacáridos y adhesinas, en el

ambiente para iniciar el proceso de agregación (Petrova y Sauer, 2012). P. putida es

capaz disgregar la biopelícula en ausencia de nutrientes o cuando se elimina el citrato

del medio (Gjermansen et al., 2005). Sin embargo otras especies bacterianas pasan a

estado planctónico en presencia de determinados nutrientes como citrato o glucosa

(Karatan y Watnick, 2009). La formación de biopelículas y agregados en Xcc se ve

favorecida en medios mínimos que mimetizan el apoplasto, además en medios ricos

como el PYM (Peptona, levadura y malta más glucosa) o LB no hay formación de

biopelículas complejas (Gottig et al., 2009; Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al.,

2014). El hierro, nutriente esencial para las bacterias, tiene un efecto en la formación de

biopelículas en función de la especie bacteriana. La falta de hierro dificulta la formación

de biopelículas en P. aeruginosa, y sin embargo bajas concentraciones de hierro

favorecen la formación de biopelículas en otros géneros como Actinomyces o

Staphylococcus. Los niveles de fosfato inorgánico son importantes también para la

formación de biopelículas, el sistema de regulación pho se activa a bajos niveles de

fosfato, lo que hace disminuir los niveles de diGMPc inhibiendo la formación de

adhesinas que son requeridas para la formación de biopelículas en Pseudomonas. Sin

embargo parece favorecer la formación de agregados en Agrobacterium (Danhorn y

Fuqua, 2007; Karatan y Watnick, 2009).

Otro factor que afecta la agragación es la osmolaridad, que regula la formación de

biopelículas en función del osmolito y de la especie bacteriana. Por ejemplo, el cloruro

sódico y la sacarosa inhiben la formación de biopelículas en Pseudomonas y Salmonella

y sin embargo en E. coli el cloruro sódico la regula de forma negativa y la sacarosa de

forma positiva. En Xcc se ha comprobado que concentraciones subletales de cloruro

sódico favorecen la formación de biopelículas (Redondo, C. et al., enviado; Karatan y

Watnick, 2009).

Las bacterias responden también a señales del hospedador mediante la formación de

agregados o biopelículas. Las plantas producen determinados compuestos para

Introducción

83

defenderse de agentes patógenos, o como en el caso de la interacción Rhizobium-

leguminosa para establecer la simbiosis. Muchos de estos compuestos son reconocidos

por las bacterias favoreciendo la formación de biopelículas (Danhorn y Fuqua, 2007).

Además las bacterias responden a la presencia de compuestos antimicrobianos, que a

concentraciones subletales o subinhibitorias pueden favorecer la formación de

biopelículas en un intento por aislarse lo más posible de compuestos dañinos. En P.

aeruginosa concentraciones bajas de tobramicina favorecen la formación de

biopelículas al igual que determinados biocidas lo hacen en Xcc (Redondo, C. et al.,

enviado; Karatan y Watnick, 2009).

La concentración de oxígeno y óxido nítrico intervienen en los procesos de agregación y

formación de biopelículas. Conforme la biopelícula se va desarrollando y aumentando

de tamaño la cantidad de oxígeno que es capaz de penetrar a las zonas más profundas de

la misma va disminuyendo, a la vez aumentan los compuestos que se producen en

condiciones de anaerobiosis como el óxido nítrico. Esta condiciones conducen a la

dispersión de las biopelículas (Karatan y Watnick, 2009).

Finalmente cabe destacar que los procesos de agregación bacteriana y formación de

biopelículas suelen estar relacionados con mecanismos de respuesta poblacional o

quorum sensing. Este tipo de mecanismos se activan por la secreción bacteriana de

moléculas como las acil-homoseril lactonas presentes en muchas proteobacterias,

gammabutirolactonas en el género Streptomyces, los factores de señalización difusibles

encontrados en los géneros Xanthomonas y Xylella y los oligopéptidos en bacterias

Gram positivas. Está probado que en varios patógenos vegetales se requiere la

activación del mecanismo de quorum sensing para la formación de biopelículas, como

Pseudomonas, Agrobacterium, Xanthomonas o Xylella (Danhorn y Fuqua, 2007;

Karatan y Watnick, 2009).

Mensajeros secundarios y cadenas de proteínas 6.2.2.

El di-GMP cíclico (diGMPc) es una molécula que regula de forma general un gran

número de procesos en las bacterias a nivel transcripcional, traduccional y post-

traduccional (Krasteva et al., 2012). En bacterias Gram negativas es el regulador central

en la formación de biopelículas actuando en el paso del estado sésil y a la adhesión

irreversible, además se encuentra relacionado con mecanismos de adaptación al medio

(Figura 31) (Karatan y Watnick, 2009).

Introducción

84

El diGMPc es sintetizado a partir de dos moléculas de guanosín trifosfato o GTP

mediante la acción de las diguanilato ciclasas, que son proteínas que contienen el

dominio GGDEF. La ruptura de esta molécula tiene lugar mediante la acción de

enzimas fosfodiesterasas que se caracterizan por tener domios HD-GYP o EAL. Si las

proteínas contienen un dominio EAL se formará una molécula de di-GMP lineal y si

contienen un dominio HD-GYP en dos GMP (Figura 31 B).

Figura 31. Resumen de la señalización por diGMPc. A: Formación

de biopelículas; B: Señalización del diGMPc. Modificado de

Krasteva et al., 2012.

Los dominios GGDEF y EAL están presentes en un gran número de especies

bacterianas y en muchos casos una misma proteína puede tener los dos dominios y

realizar las dos funciones en función de los sustratos presentes en el medio. Sin

embargo el dominio HD-GYP es menos común. Las bacterias que pueden estar

presentes en un gran número de nichos ambientales, por ejemplo los oportunistas,

poseen un gran número de proteínas con estos dominios. Sin embargo la mutación en

una de las proteínas que contiene un dominio GGDEF o EAL produce un cambio

importante en el fenotipo de la bacteria, por lo que estas proteínas deben de ser muy

específicas de un mecanismo determinado (Karatan y Watnick, 2009; Krasteva et al.,

2012).

Introducción

85

En el género Xanthomonas se ha confirmado la conexión entre el sistema de quorum

sensing y el diGMPc a través del sistema de dos componentes RpfC/RpfG y su relación

con la formación y dispersión de las biopelículas. Además el diGMPc regula otros

factores relacionados con funciones celulares esenciales, sistemas de detoxificación, el

SST3, la polimerización y despolimerización del pilus tipo IV y la síntesis de

lipopolisacáridos entre otros. Este sistema responde a señales extracelulares

relacionadas con quorum sensing activándose los dominios GGDEF y HD-GYP

presentes en estas proteínas, lo que produce una variación de los niveles de diGMPc. En

Xanthomonas, al igual que en otras bacterias Gram negativas, altos niveles de diGMPc

favorecen la formación de biopelículas y bajos niveles de este mensajero secundario

favorecen la producción de factores de virulencia y la dispersión de la biopelícula, como

se puede ver en la Figura 31B (Andrade et al., 2006; Guzzo et al., 2013; Mole et al.,

2007; Ryan et al., 2006).

Los sistemas de regulación de dos componentes en procariotas perciben las señales del

ambiente y transmiten la señal a través de la transferencia de grupos fosfato entre sus

componentes. Estos sistemas poseen un sensor histidín quinasa que es el responsable de

detectar la señal ambiental de forma directa o indirecta y un regulador de la respuesta

que modificará los niveles de transcripción en la bacteria produciendo una respuesta

determinada, siendo una de ellas el paso a vida sésil y la formación de biopelículas

(Karatan y Watnick, 2009). En el género Xanthomonas existen entre 92 y 121 genes que

codifican para sistemas de regulación de dos componentes, esta cantidad de reguladores

se atribuye a la capacidad de este género para vivir en distintos nichos (Qian et al.,

2008). Se ha mencionado anteriormente el sistema RpfG/RpfC que regula la formación

y dispersión de biopelículas en función de los niveles de DSF presentes en el medio

(Crossman y Dow, 2004; Ryan et al., 2006). En X. citri subsp. citri se han descrito

varios sistemas de regulación de dos componentes relacionados con la formación de

biopelículas además de RpfG/RpfC, entre ellos se encuentran BfdS/BfdR que además

regula la transcripción de rpfF de forma positiva (Huang et al., 2013), ColR/ColS que

regula varios factores de virulencia (Yan y Wang, 2011).

Existen además otros reguladores que controlan la formación de biopelículas en

bacterias. En X. campestris pv. campestris se ha descrito el regulador post-

transcripcional RsmA. Este regulador al igual que el homólogo CsrA en algunas

enterobacterias regula la formación de biopelículas a través del diGMPc; en X.

Introducción

86

campestris la mutación de este regulador produce agregación en cultivo líquido y una

alta adhesión a superficies en cultivos estáticos (Lu et al., 2012).

6.3. Composición de la matriz de las biopelículas

La matriz que forma parte de las biopelículas ocupa un volumen aproximado del 90%

de las mismas, a pesar de eso únicamente ha sido estudiada en un grupo pequeño de

especies bacterianas (Flemming y Wingender, 2010). Además de contener y proteger a

las bacterias, confiere estructura al agregado a modo de esqueleto, atrapa nutrientes y

moléculas de señalización como aquellas relacionadas con comunicación bacteriana y

contiene enzimas que son capaces de digerir sustancias presentes en la misma matriz,

haciendo estos compuestos disponibles para todas las células que forman el agregado.

Figura 32. Biopelícula teñida con tintes específicos para unas

estructuras determinadas; A: SyproOrange que tiñe proteínas; B:

Syto-9 que de une a ADN; C: Rojo Nilo que tiñe lípidos. En la

imagen D se muestra la superposición de las tres imágenes

anteriores viéndose en color azul los lípidos hidrofóbicos, en rojo las

proteínas y en verde los ácidos nucleicos. Las flechas indican; a:

proteína y ADN; b: proteína y lípido; c: lípidos (Lawrence et al.,

2003).

Debido a la alta capacidad higroscópica de la matriz, siendo el agua el componente

mayoritario de la misma, las células se encuentran protegidas de la desecación y son

capaces de desplazarse permitiendo el avance del agregado o colonia. Los principales

Introducción

87

componentes de la matriz son exopolisacaridos, lípidos, proteínas y ADN extracelular

(Figura 32). La mayoría de ellas pueden ser visualizadas mediante microscopía y el uso

de diferentes tinciones y sondas o anticuerpos marcados con tintes fluorescentes u oro

(Flemming y Wingender, 2010; Lawrence et al., 2003; Lindow y Brandl, 2003;

McDougald et al., 2012; Strelkova et al., 2013; Verstraeten et al., 2008).

Polisacáridos 6.3.1.

Los exopolisacáridos tienen un papel muy importante tanto en la formación de

agregados como en supervivencia de las bacterias. Comprenden el mayor volumen de la

matriz extracelular protegiendo a la bacteria de las fluctuaciones hídricas que tienen

lugar en la superficie foliar, además de la radiación ultravioleta y especies reactivas de

oxigeno (Lindow y Brandl, 2003).

En un gran número de especies bacterianas la presencia de exopolisacáridos es crucial

para la formación de biopelículas. De hecho, mutantes en los genes que codifican para

la producción de exopolisacárido tienen reducida esta capacidad o únicamente son

capaces de formar biopelículas sencillas (Karatan y Watnick, 2009; Flemming y

Wingender, 2010). Sin embargo, no todos los polisacáridos parecen tener un papel

importante en las primeras etapas de la formación de biopelículas, incluso en algunas

especies parecen ser contraproducentes como sucede en Vibrio vulnificus y el

polisacárido capsular del grupo 1, o en locus putativo CPS del antígeno O en V.

parahaemolyticus. Por otro lado, cepas no productoras de exopolisacárido sí que pueden

agregarse en biopelículas mixtas con otras especies productoras (Flemming y

Wingender, 2010; Petrova y Sauer, 2012).

En el género Xanthomonas la producción de goma xanthana se ha asociado a la

formación de biopelículas tanto en superficies bióticas como abióticas y con la

virulencia en X. campestris o X. oryzae pv. oryzae. Sin embargo en X. citri subsp. citri,a

pesar de ser un factor determinante para la formación de biopelículas y supervivencia en

superficie vegetal, no parece afectar altamente a la virulencia (Dunger et al., 2007;

Mhedbi-Hajri et al., 2011b; Qian et al., 2005; Rigano et al., 2007).

ADN extracelular 6.3.2.

El ADN extracelular (ADNe), presente en la matriz extracelular fue descrito por

primera vez en 1956 por Catlin (Catlin, 1956). Sin embargo la importancia de esta

Introducción

88

molécula en la estabilidad de la biopelícula no fue demostrada hasta 2002 cuando

Whitchurch estudió el efecto de la DNAsaI en la formación y degradación de

biopelículas en P. aeruginosa. Los resultados de estos trabajos mostraron que la

DNAsaI al ser añadida en las primeras etapas de adhesión a la superficie provocaba una

disminución en la cantidad de biopelícula. Cuando la DNAsa se añadía en etapas más

tardías no se producía ninguna variación, por lo tanto se confirmó que para la cepa de P.

aeruginosa PAO1 el ADNe tiene un papel importante en las primeras etapas de

adhesión a superficies (Whitchurch et al., 2002). Estudios posteriores en aislados

clínicos de esta misma especie mostraron que a diferencia de la cepa PAO1, el ADNe

parecía tener un efecto más importante en las etapas tardías y en la estructura final de la

biopelícula (Nemoto et al., 2003), por lo tanto el papel de ADNe en la formación de

biopelículas varía no solo en función de la especie bacteriana, sino a nivel de cepa. La

importancia de esta molécula en la formación de biopelículas y agregados es tal que se

usan tratamientos con DNAsa recombinante humana (Dornasa α) para combatir P.

aeruginosa en pacientes con fibrosis quística (Fuchs et al., 1994). El tratamiento tanto

con DNAsa como con Dornasa α de esputos en pacientes afectados con fibrosis quística,

disuelve completamente el esputo y elimina las estructuras formadas por ADN

(Manzenreiter et al., 2012). Al romper los agregados, las bacterias son más vulnerables

a otros tratamientos.

Posteriormente se ha descrito la importancia del ADNe en biopelículas para otras

bacterias tanto Gram positivas como Gram negativas, habiéndose detectado incluso en

arqueas, (Figura 33) (Chimileski et al., 2014; Conover et al., 2011; Das et al., 2010;

Hall-Stoodley et al., 2008; Nemoto et al., 2003; Vilain et al., 2009; Whitchurch et al.,

2002). A pesar de que se han realizado varios estudios en especies patógenas de

animales y presentes en el agua, el mar o en depuradoras, todavía no se ha estudiado su

importancia en especies bacterianas fitopatógenas. En algunos géneros patógeno como

Bortedella (Conover et al., 2011) una vez que la biopelícula ha madurado, es posible

que el ADNe no sea tan importante en su estabilidad, debido a la presencia de otros

compuestos en la matriz o a la presencia de exoenzimas que desactiven las DNAsas

(Whitchurch et al., 2002), sin embargo la adición de DNAsaI al medio únicamente

mostró reducción en la formación de biopelículas de más de 6 horas (Conover et al.,

2011).

Introducción

89

Figura 33. ADNe producido por; a: Bacillus cereus; b: Shewanella

oneidensis; c: E. coli; d: Listeria monocytogenes. En esta imagen el ADN

fue teñido con el marcador TOTO-1 (verde) y las bacterias con SYTO-60

(rojo). La escala es de 10 µm. Obtenido de (Okshevsky y Meyer, 2013).

El papel de ADNe puede ser estructural, dando estabilidad y consistencia a la

biopelícula o participando en la adhesión a superficies y la agregación celular. La

función del ADNe en adhesión a superficies se ha estudiado en distintas especies del

género Staphylococcus en bacterias adheridas a superficies tanto hidrofílicas como

hidrofóbicas, además se ha demostrado que el número y tamaño de los agregados se

alteraba después de tratamientos con DNAsaI. Las fuerzas de Lifshitz-Van der Waals no

están afectadas por la ausencia de ADNe ni el tipo de superficie, ya sea hidrofílica o

hidrofóbica, tanto en adhesión como en agregación. Sin embargo, la interacción acido-

base desaparece en superficies hidrofílicas en ausencia de ADNe; en superficies

hidrofóbicas únicamente se pierde la interacción acido-base entre las células, pero no

con la superficie. El ADNe en Staphylococcus parece formar una capa altamente

hidrofóbica alrededor de la bacteria que hace que tenga mayor facilidad para adherirse a

superficies de este tipo (Das et al., 2010). Las moléculas hidrofílicas de ADNe se unen a

los residuos hidrofílicos de la superficie celular de P. aeruginosa dejando expuestos

únicamente los residuos hidrofóbicos, lo que permite la adhesión a este tipo se sustratos

favoreciendo también la formación de agregados (Das et al., 2014). En Bacillus cereus

Introducción

90

el ADNe también actúa como adhesina revistiendo la superficie a la que se une

posteriormente (Vilain et al., 2009). El papel estructural del ADNe se ha confirmado en

varias especies bacterianas, puesto que el tratamiento con DNAsa es capaz de disgregar

las biopelículas, incluso aquellas formadas por hongos como Candida albicans o

Aspergillus fumigatus. Sin embargo hay bacterias que poseen ADNe en sus agregados

que no se dispersan en presencia de DNAsa, pero si se reducen (Jakubovics et al.,

2013). En S. aureus el ADNe se une a la toxina-β produciendo un complejo

nucleoproteico insoluble que da consistencia a la matriz (Montanaro et al., 2011) y en S.

mutants parece unirse a exopolisacárido y a fibras amiloides (Liao et al., 2014). Se ha

descrito también la unión a otros componentes de la matriz extracelular en bacterias

como Myxococcus xanthus, S. pneumonmiae, o N. meningitidis (Jakubovics et al.,

2013).

Figura 34. Representación esquemática del tipo de uniones que

tienen lugar en agregados de P. aeruginosa en presencia de

ADNe. A: agregación bacteriana; B: tipos de enlaces mediante

el ion Ca2+

e interacción ácido-base (AB), y en ausencia de

ADNe tras un tratamiento DNAsa; C: no hay agregación

bacteriana; D: en ausencia de ADNe no hay unión a los iones

calcio por lo tanto no se produce agregación) (Das et al., 2014).

EL ión Ca2+

se une a las moléculas de ADN que poseen carga negativa y es capaz de

unir varias hebras de ADNe (Figura 34) o unir ADNe a otras moléculas que también

unen estos iones, lo que aumenta la estabilidad del agregado. Se ha demostrado en

varias especies bacterianas que en presencia de ADNe y Ca2+

se produce una mayor

agregación (Das et al., 2014).

Introducción

91

En P. aeruginosa el ADNe se localiza al igual que en B. cereus en la superficie del

sustrato y además en el sombrero de la estructura de seta que se forma cuando la

biopelícula ha madurado, en la unión entre el tallo y el sombrero, y en la parte externa

del tallo (Allesen-Holm et al., 2006). Sin embargo en Neisseria gonorhoeae se

encuentra en el interior de la estructura con forma de seta (Zweig et al., 2014). La

presencia de ADNe favorece en P. aeruginosa la formación de agregados y el

movimiento hacia zonas da mayor concentración de ADNe, que es donde se asienta la

bacteria. En presencia de DNAsa al no haber ADNe, las bacterias muestran

movimientos desorganizados que impiden la agregación y la construcción de una

estructura organizada (Gloag et al., 2013). Además la DNAsa NucB es capaz de

dispersar biopelículas formadas por E. coli, B. subtilis, Mixococcus luteus, y de un gran

número de bacterias aisladas de pacientes con rhinosinusitis crónica (Jakubovics et al.,

2013; Shields et al., 2013), lo que confirma el papel del ADNe en la estructura final de

las biopelículas.

El ADNe protege a la bacteria de agentes antimicrobianos, dodecil sulfato sódico (SDS)

o sonicación. La adición de ADN a biopelículas formadas por P. aeruginosa aumenta su

resistencia frente a péptidos antimicrobianos y antibióticos como tobramicina y

gentamicina (Jakubovics et al., 2013). Por otro lado sirve como reservorio nutricional a

las células que forman parte de la biopelícula. En el fondo marino el ADN presente

comprende el 50% del fósforo disponible para los microorganismos siendo de una

cantidad de 0,45 gigatoneladas de ADN (Jakubovics et al., 2013). En las biopelículas

tienen lugar fenómenos de intercambio génico entre los microorganismos que las

componen, el ADNe es un reservorio génico en estas estructuras favoreciendo la

transferencia horizontal. En Streptococcus pneumonia este fenómeno además se

relaciona con mecanismos de competencia que es estimulada mediante la producción de

un péptido. A concentraciones determinadas del péptido se produce lisis de cierto

número de bacterias, siendo el ADN liberado en el medio adquirido por el resto de la

población.La presencia de este péptido favorece e incrementa la formación de

biopelículas (Montanaro et al., 2011).

La producción o secreción de ADNe puede tener lugar de diversas formas dependiendo

de la especie, aunque la lisis celular provocada por la muerte de las bacterias de forma

natural es una fuente de ADNe a nivel basal. En algunos casos, como en P. aeruginosa,

la lisis celular está regulada mediante quorum sensing. A determinadas concentraciones

Introducción

92

de acil-homoseril lactonas y quinolonas, una parte de la población se autolisa

favoreciendo la supervivencia del resto y la formación de agregados (Allesen-Holm et

al., 2006; Montanaro et al., 2011). En otros casos, la lisis celular es provocada por otras

bacterias de la misma población, lo que se denomina fratricidio, en este caso se produce

una diferenciación celular entre atacantes y presas. Las células atacantes producen una

serie de factores a los que ellas son resistentes que producen la muerte de las células

presas, sensibles a dichos factores. Este último fenómeno se ha descrito en

Enterococcus. faecalis, B. subtilis y S. pneumoniae en el primero está regulado por

quorum sensing (Montanaro et al., 2011; Jakubovics et al., 2013).

Otro método de secreción de ADNe tiene lugar mediante vesículas, este fenómeno se ha

descrito en P. aeruginosa y S. mutants, siendo la producción de vesículas importante

para la formación de biopelículas (Montanaro et al., 2011; Liao et al., 2014). En el caso

de Neisseria gonorrhoeae la secreción de ADNe se produce a través de un sistema de

secreción tipo IV que no necesita de otra bacteria para exportar ADN, sino que lo hace

directamente al medio y que además en algunos casos es de hebra sencilla. Mutaciones

en ocho de los genes que codifican para la formación de este pilus producen

disminución en la producción de ADNe (Hamilton et al., 2005). El ADN secretado está

próximo a zonas con un origen de transferencia oriT (Salgado-Pabón et al., 2007).

Lípidos 6.3.3.

Los lípidos se suelen encontrar en la matriz extracelular en forma de lipopolisacáridos,

normalmente formados por un exopolisacárido con un grupo metilo o acetilo y se ha

comprobado que actúan como factores de virulencia en Xcc además de en otras especies

bacterianas. Tienen propiedades hidrofóbicas y en muchos casos se asocian a la

adhesión a superficies de esta naturaleza como son las ceras que cubren la superficie

foliar; también puede disgregar sustancias hidrofóbicas presentes en el medio

haciéndolas accesibles a las bacterias que conforman la biopelícula. Algunos lípidos

descritos son la serrawetina de Serratia marcescens o los rhamnolípidos de

Pseudomonas. En varios géneros bacterianos se han relacionado con la adhesión a

superficies, por ejemplo en X. campestris se ha relacionado un tipo de lipopolisacárido

con la colonización a través de los hiátodos y la adhesión a los mismos, la formación de

microcolonias, de la estructura tipo seta y la dispersión. Además, en muchos casos estas

moléculas favorecen la motilidad en superficie, la producción de los pili tipo I y el

Introducción

93

sistema de secreción tipo III (Flemming y Wingender, 2010; Mhedbi-Hajri et al.,

2011b).

Proteínas extracelulares 6.3.4.

Las proteínas que forman parte de la matriz extracelular de las biopelículas son tanto

proteínas estructurales tales como los pili y las fimbrias o enzimas que se han

relacionado con la degradación de biopolímeros y otras sustancias (Karatan y Watnick,

2009; Flemming y Wingender, 2010).

Las proteínas estructurales se han relacionado con la adhesión y la formación y

estabilización de las bacterias y del agregado. Existen determinadas proteínas que se

unen y dan estabilidad al exopolisacárido como las lectinas de P. aeruginosa, o

proteínas asociadas a la superficie bacteriana, como las fibras amiloides que se unen a

superficies y a las células del huésped pudiendo, además funcionar como agentes

citotóxicos siendo descritas en algunos casos como curli (Dueholm et al., 2010;

Dueholm et al., 2012; Flemming y Wingender, 2010). Además las fimbrias, el pilus tipo

IV y otras adhesinas no fimbrilares presentan un papel importante en la formación de

biopelículas en el género Xanthomonas y en otros géneros bacterianos (Mhedbi-Hajri et

al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al., 2011b; Dunger et al., 2014).

Las enzimas secretadas al exterior celular durante la formación de biopelículas están

relacionadas con la degradación de determinadas sustancias, entre ellas polímeros

solubles en agua como exopolisacáridos, ácidos nucleicos y ciertas proteínas y

polímeros no solubles en agua como la celulosa, quitina y lípidos, además de moléculas

orgánicas que entran en contacto con la matriz extracelular. Su presencia y contención

en la matriz extracelular se debe a la unión a los componentes de la matriz mediante

enlaces que requieren poca energía. La lipasa A de P. aeruginosa se une al alginato

mediante este tipo de enlaces. Estas enzimas juegan un papel en la rotura de estas

macromoléculas para hacerlas accesibles a los microorganismos que componen la

biopelícula, y participan en la rotura de la biopelícula permitiendo la dispersión de las

bacterias a otro nichos. Además algunas de las enzimas secretadas a la matriz

extracelular pueden actuar como factores de virulencia o incluso romper la matriz de

biopelículas formadas por otras especies bacterianas (Flemming y Wingender, 2010).

Introducción

94

6.4. Biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri

Xcc es capaz de formar biopelículas tanto en superficies bióticas como abióticas (Figura

35). En este patógeno la formación de biopelículas es un importante factor de virulencia

puesto que mutantes que ven disminuida su capacidad para formar agregados y

biopelículas además tienen alterada su virulencia (Cubero et al., 2011; Gottig et al.,

2009; Li y Wang, 2011b; Malamud et al., 2011; Rigano et al., 2007; Sgro et al., 2012).

La formación de biopelículas parece estar favorecida por la presencia de medios poco

nutritivos, como se ha mencionado anteriormente y ser dependiente de la gama de

huésped de la cepa (Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al., 2014).

Figura 35. Biopelículas producidas por Xcc en superficie foliar. A y B: Xcc

MI a las 24 hpi en superficie de Swingle citrumelo. La imagen B es un zoom

de la A, permitiendo ver las estructuras extracelulares producidas por el

patógeno. C y D: imágenes tomadas del interior de una lesión en hoja de lima

mejicana producida por Xcc MI. Dado que estas imágenes fueron tomadas en

la lesión es probable que las células se estén desprendiendo de los agregados

para producir nuevas infecciones. Fotos realizadas por Marta Sena Vélez.

Etapas en la formación de biopelícula en Xcc 6.4.1.

En presencia de una superficie y en condiciones que favorezcan la agregación, las

bacterias se dirigen hacia el nicho más apropiado para su desarrollo utilizando para ello

motilidad dependiente del flagelo y quimiotaxis (Figura 36).

Introducción

95

Al igual que sucede en otras especies bacterianas el primer contacto de Xcc con la

superficie tiene lugar de forma polar, posiblemente mediante el flagelo o la adhesina

FhaB, la adhesión mediante fibras laterales y el pili tipo IV en planta, ya que esta

estructura no parece ser importante en adhesión a superficies abióticas (Malamud et al.,

2011; Li y Wang, 2011b; Dunger et al., 2014). Con suficiente concentración de

nutrientes y oxígeno en el medio en el que se han establecido, las bacterias comienzan a

adaptarse y diferenciarse para pasar a formar la biopelícula, además se produce división

celular y crecimiento del agregado. Posteriormente, las bacterias comienzan a

desplazarse en la superficie para colonizar un área mayor generando una biopelícula

monocapa. A medida que la población va creciendo se va formando una microcolonia

encontrándose las bacterias más cercanas a la superficie en condiciones de carencia de

oxígeno y nutrientes. A baja concentración de oxígeno parece que aumenta la

producción de exopolisacárido que junto con el lipopolisacárido, el ADNe y el pili tipo

IV favorecen el desarrollo vertical y la formación de columnas lo que se denomina

biopelícula madura, en este estado la diferenciación celular dentro del agregado llega a

su máximo nivel. En determinadas condiciones y mediante el sistema de regulación de

quorum sensing se activa la dispersión de las bacterias a partir del sombrero de la

estructura de seta que se abre permitiendo la liberación de las bacterias planctónicas

(Dunger et al., 2014; Li y Wang, 2011b; Malamud et al., 2013).

Figura 36. Formación de biopelículas en Xcc. Este modelo representa las diferentes etapas que tienen

lugar para la formación de una biopelícula madura y algunos de los factores implicados en cada una de las

etapas (Li y Wang, 2011b).

Introducción

96

Las bacterias que están presentes en el agregado parecen tener bajos requerimientos

energéticos, puesto que las proteínas relacionadas con metabolismo y energía están

reprimidas en este proceso comparado con el estado planctónico. Sin embargo están

activados mecanismos dirigidos al mantenimiento de la estructura y del flujo de

nutrientes y desechos dentro de la biopelícula (Zimaro et al., 2013).

Factores implicados en la formación de biopelículas en Xcc 6.4.2.

Se han descritos varios factores determinantes para la formación de biopelículas en Xcc,

muchos de ellos han sido descritos también como factores de virulencia y se han

mencionado anteriormente pero posiblemente su implicación en virulencia esté más

relacionada con la formación de agregados que con la virulencia de forma directa, entre

ellos encontramos la síntesis de exopolisacárido, presencia del flagelo y la síntesis de

adhesinas.

La presencia del flagelo favorece la adhesión y desarrollo de biopelículas. Mutantes en

los genes que codifican para la flagelina (fliC) y el garfio del flagelo (flgE) han

mostrado una reducción en la formación de biopelículas tanto in vitro como in planta,

aunque en las primeras etapas de adhesión no había alteración del fenotipo, el área

colonizada era menor (Malamud et al., 2011).

El exopolisacárido influye tanto en la formación de microcolonias como en el desarrollo

de la biopelícula madura. Los mutantes en gumB solo mostraron diferencias a partir de

las 3 horas de la formación de la biopelícula en superficie abiótica y 15 horas en planta,

por lo que su papel principal parece estar relacionado únicamente con el desarrollo de la

biopelícula (Li y Wang, 2012; Rigano et al., 2007).

Mutaciones en los genes wxacO, rfbC y nlxA que codifican para enzimas relacionadas

con la síntesis de lipopolisacárido, producen variaciones en esta molécula que

disminuye la formación de biopelículas (Li y Wang, 2011a; Yan et al., 2012).

Se ha descrito que la hemoglutinina filamentosa FhaB, que Xcc expresa en planta entre

los 3 y 4 días después de la inoculación, es esencial para la formación de biopelículas en

superficies abióticas y en superficie vegetal. Además tiene un papel importante en

agregación, puesto que mutantes en este gen no son capaces de agregarse en cultivo

estático, siendo sus biopelículas tanto en planta como in vitro desorganizadas y con

Introducción

97

grandes canales (Gottig et al., 2009). Además otras adhesinas no fimbrilares son

expresadas durante este proceso (Zimaro et al., 2013).

El SST3 es necesario para la formación de biopelículas en superficies tanto bióticas

como abióticas, sin embargo no parece participar de forma importante en la adhesión a

superficies vegetales. La mutación en algunos genes relacionados con el SST3 produce

alteraciones en la membrana externa de la bacteria que afectan a la interacción de la

célula con la superficie y que desemboca en una expresión génica similar a la que tiene

lugar durante el modo de vida planctónico (Zimaro et al., 2013; Zimaro et al., 2014).

El papel del pili tipo IV en la formación de biopelículas se ha descrito recientemente, y

parece ser esencial para el desarrollo de estructuras tipo seta y la maduración de la

biopelícula, así como para la dispersión de las células planctónicas y la adhesión a

planta. Sin embargo no parece afectar al crecimiento de la bacteria en la planta ni a la

producción de síntomas cuando el patógeno se inocula por infiltración (Dunger et al.,

2014).

Los transportadores dependientes de TonB, descritos como sensores en Xcc (Mhedbi-

Hajri et al., 2011a), transportan al espacio periplásmico complejos de hierro, sideróforos

y cobalamina, que parecen expresarse además en ambientes con baja concentración de

hierro, aunque es probable que también transporten moléculas vegetales. En el interior

de las biopelículas Xcc expresa un gran número de estos transportadores relacionándose

con la adaptación de la bacteria al estado sésil, al transporte de compuestos de carbono,

y a la percepción y transducción de señales (Li y Wang, 2011b; Zimaro et al., 2013).

Varios genes relacionados con la formación de biopelículas han sido descritos además

mediante el estudio de mutatecas de Xcc 306. El estudio de Malamud y colaboradores

en 2013 describió que mutantes afectados en motilidad y quimiotaxis hacia extractos de

pomelo también veían afectada su capacidad formadora de biopelículas (Malamud et al.,

2013), sin embargo en los resultados que muestran no hay descritos genes relacionados

con la estructura del flagelo o MCPs ni con otros sensores presentes en Xcc (Mhedbi-

Hajri et al., 2011a). Los genes descritos en este estudio poseen funciones relacionadas

con la producción de xanthano, síntesis de aminoácidos, metabolismo energético,

replicación de ADN, transcripción, transporte de membranas y transducción de señales.

Además se identificó el papel de dos genes relacionados con el SST2 en biopelículas

que mostraron baja actividad amilasa. Las estructuras formadas por los mutantes en

Introducción

98

estos genes eran compactas y no poseían canales (Malamud et al., 2013). El estudio

realizado por Li y Wang en 2011 se determinó la importancia en formación de

biopelículas de una posible DNAsa que participa en reparación, recombinación y

replicación de ADN, y otras proteínas hipotéticas que participan en metabolismo de

carbohidratos además de genes relacionados con exopolisacárido, lipopolisacárido, pili

tipo IV, motilidad y quimiotaxis. Además en un trabajo publicado en 2011 se sugiere la

participación de ADNe y las proteínas extracelulares en la formación de biopelículas (Li

y Wang, 2011b). Estudios proteómicos han mostrado sobreexpresión en biopelículas de

porinas que permiten el transporte de nutrientes, moléculas de desecho, señales

químicas y agua a través de la membrana bacteriana. Entre las porinas sobreexpresadas

se encuentra RpfN que puede regular el paso de hidratos de carbono como la fructosa.

Además se sobreexpresan otras proteínas que se han relacionado con la síntesis de

xanthano, y detoxificación (Zimaro et al., 2013).

Regulación en biopelículas formadas por Xcc 6.4.3.

La formación de biopelículas es un proceso que se encuentra altamente regulado en

bacterias, incluyendo Xcc (Figura 37). Para la formación de biopelículas en Xcc es

esencial la presencia de una superficie en la que las bacterias se puedan agregar.

Solamente en casos aislados se ha observado estructura en la interfase líquido/aire, pero

nunca a los niveles que tienen lugar en bacterias como B. subtilis (Romero et al., 2010).

En Xcc existen varios sistemas de regulación descritos que participan en la formación de

biopelículas que se muestran en la Figura 37. En muchos de ellos la regulación tiene

lugar a través del diGMPc que es el regulador central en Xanthomonas (Mole et al.,

2007), pero hay otros reguladores que lo realizan de forma independiente.

El sistema RpfC/RpfG en Xcc es el encargado de sensar los factores de señalización

difusibles (DSF) y de transmitir la señal, regulando la síntesis de DSF a través RpfF y

los niveles de diGMPc. Además activa el regulador de la respuesta del sistema

NtrB/NtrC que a través de RpoN (factor σ54

) regula la formación de biopelículas,

motilidad y quimiotaxis. Por otro lado al igual que en X. campestris pv. campestris (Xc)

podría regular la dispersión de la biopelícula. La mutación de estos genes y de otros

dentro de este sistema como rpfC y rpfF afecta a la adhesión y posterior formación de

biopelículas alterando además a la expresión de un gran número de genes (Andrade et

al., 2006; Dow et al., 2003; Guo et al., 2012; Li y Wang, 2011b). BfdS/BfdR regula de

Introducción

99

forma positiva rpfF en medio XVM2 y además es importante para la adhesión a

superficies bióticas y abióticas, sin embargo no afecta a motilidad (Huang et al., 2013).

Figura 37. Regulación de la formación de biopelículas en Xcc. En la figura se muestran las principales

vías de regulación descritas, siendo el regulador central el di-GMPc explicado anteriormente. En este

esquema las flechas de color negro indican regulación positiva, y las flechas en azul regulación negativa.

Las flechas discontinuas muestran procesos hipotéticos que no han sido comprobados experimentalmente

(Li y Wang, 2011b).

El sistema de regulación de dos componentes RbfS/RbfR reconoce señales tanto

extracelulares como intracelulares. La proteína RbfR posee dominios REC y GGDEF

N-terminales y un dominio EAL en el extremo C-terminal. Afecta a los niveles de

diGMPc, aunque es posible que también regule la producción de lipopolisacárido de

forma directa (Li y Wang, 2011b). El sistema RavS/RavR en X. campestris pv.

campestris parece ser un sensor de los niveles de oxígeno en el medio y regula la

formación de biopelículas a través del diGMPc en ambas especies, posiblemente

mediante la producción de exopolisacárido, la motilidad y la quimiotaxis (He. et al.,

2009; Li y Wang, 2011b). ColS/ColR también regula la formación de biopelículas en

Xcc, este sistema participa en la regulación de bastantes procesos celulares y en el

mantenimiento de la integridad y funcionalidad de la membrana externa. La regulación

en biopelículas tiene lugar por el efecto en la formación de SST3, y la producción de

lipopolisacárido (Li y Wang, 2011b; Yan y Wang, 2011). El regulador XbmR pertenece

a la familia de proteínas NtrC que poseen actividad ATPasa, está asociada a un gran

Introducción

100

número de procesos celulares, y regula el metabolismo de la bacteria, mediante el

diGMPc. La mutación de este gen afecta a la motilidad, quimiotaxis y formación de

biopelículas, sin embargo es posible que los dos últimos procesos se vean afectados

porque son dependientes de la motilidad dependiente del flagelo. Es posible que esta

proteína se una a RpoN2 para regular de forma positiva la formación del flagelo aunque

también es posible que los regule mediante diGMPc a través del FliA (Yaryura et al.,

2015). El regulador XRE y los sensores PKC y MASE1 participan en la formación de

biopelículas posiblemente mediante la regulación del exopolisacárido (Figura 37).

7. Fimbrias y pili

La mayoría de las bacterias patógenas tanto de animales como de plantas se adhieren a

la superficie del hospedador como paso previo a la infección para sobrevivir y colonizar

el tejido. El proceso de adhesión está mediado por varias estructuras de la superficie

bacteriana. Las estructuras filamentosas como los pili o las fimbrias permiten una mejor

adhesión y reconocimiento del huésped porque evitan las fuerzas repulsivas entre la

bacteria y la superficie del huésped que tiene lugar debido a la carga negativa tanto de la

superficie del tejido a colonizar como la de la bacteria. El pili permite a la adhesina

unirse al huésped (Proft y Baker, 2009). En bacterias Gram negativas se descubrieron en

1940 como receptores de bacteriófagos. Basándose en su estrategia de ensamblaje se

clasifican en 4 tipos:

7.1. Ensamblados mediante ruta de ujier-chaperona

Dentro de este grupo se encuentran los pili tipo I de enterobacterias, pili P de E. coli

uropatogénicas, y algunas adhesinas no fimbrilares, Chaperona/ujier (CU pili). En E.

coli uropatogénicas la presencia de esta estructura permite la adhesión al tejido del

tracto urinario y la colonización del mismo evitando que sean arrastradas por la orina

por lo que están implicadas en colonización y virulencia (Proft y Baker, 2009).

La estructura del filamento consiste una barra rígida con una única proteína adhesina en

la punta del filamento que se une de forma específica a hidratos de carbono presentes en

la superficie del tejido del hospedador.

Para el ensamblaje de esta estructura, las pilinas o subunidades estructurales del pilus,

son transportadas al espacio periplasmático mediante el sistema de secreción general

Introducción

101

donde se unen a una chaperona específica que participa en el plegamiento de las

subunidades y en el pre-ensamblaje de las mismas. Este complejo chaperona/pilina pasa

a la membrana externa uniéndose a una proteína ujier (usher) formando la base del

filamento. El ujier se encargará de abrir un poro en la membrana externa permitiendo el

paso de las subunidades de pilina (Proft y Baker, 2009).

Este tipo de pilus fue por primera vez descrito en Xanthomonadaceae en Xylella

fastidiosa, agente causal de varias enfermedades en plantas como la enfermedad de

Pierce en vid o la clorosis variegada de los cítricos. Tienen un tamaño comprendido

entre 0,4 y 1 µm de largo localizados en uno de los polos de la bacteria (Figura 38).

Figura 38. Pili y fimbrias en Xylella fastidiosa. A: microscopía de barrido de

las bacterias unidas a la superficie de forma polar mediante pili. B y C:

microscopía de transmisión de X. fastidiosa, los filamentos más largos

corresponden al Pili tipo IV y los cortos con el Pili tipo I. Modificado de

Meng et al. 2005.

Estas estructuras parecen estar implicadas en procesos de agregación y formación de

biopelículas ya que mutantes en genes relacionados con la formación de este pilus

mostraron menor adhesión y formación de biopelícula in vitro y mayor velocidad de

desplazamiento mediante twitching tanto in vitro como in planta, mostrando además

reducción significativa en su virulencia. Por otro lado su importancia en adhesión a

superficies es mucho mayor y más fuerte que la producida por los pili tipo IV y en

agregación intercelular. Sin embargo, los pili tipo I en Xylella, presentan baja similitud

Introducción

102

de secuencia con proteínas homólogas pertenecientes al género Xanthomonas (menos

del 25%) por lo que es posible que su función o su importancia en agregación sea

distinta (Li et al., 2007b; Meng et al., 2005; Mhedbi-Hajri et al., 2011b).

7.2. Pili tipo Curli

Se describió por primera vez en 1989 (Proft y Baker, 2009), es un polímero de proteínas

con estructura fibrilar en la que los monómeros se encuentran plegados de forma que las

láminas-β estén orientadas perpendicularmente a la dirección del pilus (Figura 39)

(Dueholm et al., 2012). Están presentes en E. coli y Salmonella spp donde se

describieron inicialmente (Proft y Baker, 2009). Estudios in silico han mostrado la

presencia de proteínas homólogas en un gran número de bacterias, la mayoría de ellos

en Proteobacterias en las subdivisiones α y γ-proteobacteria. Parecen, por tanto, estar

más extendidos de lo que en un principio se pensaba, una de las razones puede ser que

algunas de las secuencias proteicas que se ha descrito in silico como fibras amiloideas

de bacterias no enterobacterias comparten entre un 9 y un 33% de homología con la

curlina (CsgA) de E. coli (Dueholm et al., 2012).

Figura 39. Pili tipo Curli de cepas de E. coli enterohemorrágicas y

enteropatogénicas. Las barras miden 250µm (Saldaña et al., 2009).

El curli está formado por subunidades de curlina (CsgA), que poseen una estructura

característica y diferente de otras pilinas. La estructura de este pili se caracteriza por ser

un filamento no ramificado rico en láminas-β resistente a la digestión con proteasas y al

dodecyl sulfato de sodio (SDS) al 1%, lo que hace que requiera un tratamiento con

ácido fórmico para su separación en geles de SDS (Saldaña et al., 2009; Romero et al.,

2010). Además comparte características bioquímicas con las fibras amiloides de origen

eucariota encontradas en enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer y el

Introducción

103

Parkinson (Proft y Baker, 2009) y pueden ser detectados mediante la tinción con rojo

Congo.

El curli es ensamblado mediante nucleación/precipitación extracelular. Según este

modelo las subunidad CsgA, que es soluble, es secretada junto CsgB al exterior celular

mediante una lipoproteína de la membrana externa (CsgG) y dos proteínas accesorias

denominadas CsgE y CsgF que contribuyen además al ensamblaje. Una vez en el

exterior celular la curlina es nucleada formando una fibra mediante la proteína CsgB

(Proft y Baker, 2009).

Se ha caracterizado como PAMP (Pathogen-associated molecular pattern) activando la

respuesta inmune del hospedador (Proft y Baker, 2009), además su estructura favorece

la adhesión a superficies vivas y formación de biopelículas, pudiendo estar implicado en

virulencia de E. coli y Salmonella, además es probable que participe en la interacción

simbiótica entre Rhizobiales y leguminosas promoviendo la adhesión al tejido vegetal

(Saldaña et al., 2009; Dueholm et al., 2012). En Bacillus subtilis es un componente

mayoritario junto con los exopolisacáridos de la matriz que se forma en biopelículas

(Romero et al., 2010).

7.3. Familia Pilus CS1

Pilus CS1 es una familia serológicamente distinta de pili, asociada inicialmente con E.

coli enterotoxigénicas, se ha encontrado también en el género Salmonella que además

incluyen los pili CFA/I, CS2, CS4, CS14, CS17 y CS19 de E. coli enterotoxigénicas

patógenas de humanos (Folkesson et al., 1999; Proft y Baker, 2009; Sakellaris y Scott,

1998). En E. coli los genes encargados de la estructura y ensamblaje de este pilus

(cooBACD) parecen haber sido adquiridos recientemente, considerándose una isla de

patogenicidad (Sakellaris y Scott, 1998). El gen cooA codifica para la subunidad mayor

de esta pilina, siendo cooD la subunidad menor localizada en la parte distal del pilus,

cooB y cooC participan en el ensamblaje del pilus.

La subunidad mayor CooA tiene un tamaño inicial de 16k Da que pasa a 15,2 kDa

cuando está procesada (Sakellaris y Scott, 1998) y carece de homología de secuencia

con otras pilinas descritas, además de carecer de dos los residuos cisteína en el dominio

C-terminal que poseen los pilinas tipo IV y aquellas que son ensambladas mediante

chaperonas y ujier (Proft y Baker, 2009). Esta proteína junto con CooD son las proteínas

estructurales del pilus que participan en adhesión al huésped en un proceso aún

Introducción

104

desconocido. Aunque comparta únicamente un 13% de similitud con la subunidad

mayor, ambas proteínas comparten una secuencia conservada en el extremo C-terminal

común a las proteínas pertenecientes a esta familia A–G–x–Y–x–G–(x)6–T. CooD se

encuentra en la punta del pilus, en una proporción 1:8000 respecto a CooA por lo que

parece haber una subunidad de CooD por pilus. Es una proteína de 38kDa y es necesaria

para el ensamblaje del pilus (Sakellaris y Scott, 1998). CooC es una proteína ujier que

se encuentra en la membrana externa y que permite el paso de las subunidades de pilina

del espacio periplásmico al exterior celular. CooB es una proteína estabilizadora, forma

complejos con CooA, C y D evitando su proteólisis en el espacio periplásmico

facilitando además un correcto plegamiento y polimerización de las proteínas. Su

función es similar a la de las chaperonas, aunque no comparte secuencia con ninguna de

las chaperonas periplásmicas descritas (Sakellaris y Scott, 1998).

El mecanismo de ensamblaje se ha descrito como de ujier-chaperona alternativo (Proft y

Baker, 2009). Las pilinas son transportadas al periplasma a través del sistema de

secreción Sec donde se unen a CooB, el complejo CooD-CooB se une al

ujier/transportador CooC que también es estabilizado con CooB, una vez CooD se ha

unido a CooC el estabilizador se libera para transportar otras subunidades de pilina.

Parece que la unión de CooD con CooC modifica la estructura de la última permitiendo

la unión de la subunidad mayor CooA que permitirá la elongación del pilus (Sakellaris y

Scott, 1998).

7.4. Pili tipo IV

El término Pili tipo IV fue usado por primera vez por Ottow en 1975. Se encuentran

presentes en varias especies bacterianas tanto Gram negativas, E. coli, Pseudomonas

aeruginosa, Salmonella enterica, Vibrio cholereae, etc, como Gram positivas en los

géneros Clostridia y Ruminococcus, incluso también en cianobacterias (Proft y Baker,

2009).

Posee una estructura filamentosa formada por polímeros de uno o varios tipos de pilinas

de entre 15 y 20 kDa. Su tamaño comprende entre 50 y 80 Armstrong (Å) y varias

micras de largo que son capaces de unirse longitudinalmente pudiendo soportar fuerzas

de más de 100 pN (picoNewtons) (Figura 40) (Craig et al., 2004; Proft y Baker, 2009).

Introducción

105

Figura 40: extensión y retracción de pili tipo IV en Neisseria gonorrhoeae. Modificado de Alexey J

Merza y Katrina T Forest (Merz y Forest, 2002).

Las subunidades o pilinas que forman el pili tipo IV o el pseudopili tipo II tienen forma

de cucharón y poseen tres partes estructurales características que son las α-hélices en el

dominio N-terminal de la proteína, el dominio globular C-terminal y los bucles que

unen distintas estructuras en la proteína. El dominio N-terminal contiene el péptido

señal que está muy conservado dado que variaciones pequeñas incluso de un único

residuo pueden impedir el ensamblaje del pilus y la funcionalidad del mismo. Este

dominio, posee dos subdominios; el α1N-terminal que sobresale del dominio globular

C-terminal y sirve de anclaje de la pilina en la membrana interna, y el espacio

citoplasmático durante la formación y retracción del pilus, además es posible que sea un

dominio regulador. El otro dominio α1C se encuentra embebido en el dominio globular

C-terminal y es de naturaleza anfipática. En función de la longitud del péptido señal y la

secuencia modificada se han clasificado en pili tipo IVa y IVb. Los primeros se

encuentran en un gran número de bacterias con distinta gama de huésped (plantas,

animales y hongos) entre ellas P. aeruginosa, Neisseria spp. y Azoarcus spp., los

segundos parecen ser exclusivos de bacterias colonizadoras del intestino Vibrio

cholerae, Salmonella enterica y Escherichia coli (Craig et al., 2004; Craig y Li, 2008;

Giltner et al., 2012). La comparación de las estructuras tipo IVa y IVb muestra que la α-

hélice N-terminal y la estructura de ensamblaje están conservadas en ambos grupos,

pero presentan estructuras y secuencias diferentes en su superficie además de diferentes

plegamientos (Craig et al., 2004). El dominio globular C-terminal (head domain) está

formado hebras-β antiparelas. La mayor diversidad de las pilinas tiene lugar en los

bucles que conectan las distintas estructuras de las pilinas y son importantes en el

ensamblaje y estabilidad del pilus. Parece que pueden tener un papel en la interacción

Introducción

106

entre las subunidades que comprende el pilus. Además los bucles que se encuentran en

la parte superficial del pilus forman cavidades y pliegues que pueden servir de sitios de

unión para otras moléculas como el ADN en el caso del pilus o elastasas y secretinas en

el caso del pseudopilus. Existen tres tipos de bucles presentes en todas las pilinas; el

bucle que conecta la α-hélice N-terminal con el resto de la proteína, denominada bucle-

αβ, este bucle además puede presentar estructuras como hélices-α y hebras-β en pilinas.

El segundo bucle es el que conecta las hebras-β que forman la lámina-β y por último el

bucle C-terminal denominado región D, presente en la subunidades mayores y en

algunas de las menores de pilina que formarán el pilus. Este último se caracteriza por la

presencia de residuos de cisteína que forman puentes disulfuro y unen el extremo de la

proteína con la lámina-β. Esta parte es muy variable en secuencia y longitud siendo

además un epítopo importante (Giltner et al., 2012).

Las prepilinas son sintetizadas en el citosol e insertadas en la membrana citoplasmática

a través del sistema Sec (Giltner et al., 2012). Con el dominio C-terminal en la parte

externa de la membrana citoplasmática. Estas pilinas permanecen ancladas a la

membrana interna por la hélice en el dominio N-terminal donde es metilada. El dominio

globular de la pilina pasa al espacio periplásmico y los puentes disulfuro son catalizados

por una oxireductasa (Craig y Li, 2008).

Figura 41. Modelo e interpretación de la retracción del pili tipo IV propuesta por G. Oster

(Kaiser, 2000).

Para la extensión y retracción del pilus se necesita degradación de ATP a través de dos

ATPasas distintas pertenecientes a la superfamilia de NTPasas de secreción tipo II/IV

(Craig y Li, 2008).

Introducción

107

Está descrito en P. aeruginosa y en otras especies bacterianas que la regulación

transcripcional del pilus tipo IV tiene lugar a través de un factor σ54

(RpoN) que forma

un complejo con la RNA polimerasa y el ADN. Para que la transcripción tenga lugar es

requerida la presencia del regulador de la respuesta en forma fosforilada PilR

perteneciente al sistema de regulación de dos componentes (PilR-PilS). En este sistema

PilS es el sensor histidín-quinasa que es capaz de autofosforilarse al recibir una señal

que por ahora es desconocida, pasando el grupo fosfato a PilR y permitiendo por lo

tanto la expresión de la subunidad mayor de la pilina. Además de los factores

ambientales que controlan la expresión de PilA, ésta es además autorregulada por el

número de pilinas presentes en la membrana citoplasmática, a través de PilS

interacciona con el dominio N-terminal de las pilinas inhibiendo su transcripción

cuando hay muchas pilinas ancladas en la membrana y favoreciéndola cuando el

número de pilinas es menor (Giltner et al., 2012).

Todas las especies secuenciadas del género Xanthomonas poseen genes relacionados

con los pili tipo IV (Mhedbi-Hajri et al., 2011b; van Doorn et al., 2001). En algunas

especies, como en X. campestris pv. vesicatoria se han descrito dos genes que codifican

para los pili tipo IV, aunque parece haber predominancia en la expresión de uno sobre el

otro. Se han observado duplicaciones de los genes que codifican para la subunidad

principal del pilus en X. campestris pv. campestris cepas 8004 y ATTCC33913 y en Xcc

aunque su función todavía es desconocida (da Silva et al., 2002; Dunger et al., 2014;

Jalan et al., 2013b; Ojanen-Reuhs et al., 1997; Qian et al., 2005). Ralstonia

solanacearum también posee una duplicación pilA, el gen plpA con una similitud del

50% que no es necesario para la síntesis y ensamblaje del pilus tipo IV (Kang et al.,

2002). Además se ha descrito la participación de los pili tipo IV de X. hyacinthi en

virulencia, utilizándose esta estructura para la detección y diagnóstico de la enfermedad

mediante PCR (van Doorn J et al., 1994). En Xcc se ha investigado el papel del pili tipo

IV en unión a fagos, siendo además importante en el movimiento tipo twitching y en la

formación de biopelículas estructuradas y adhesión al huésped sin embargo, no parece

tener un papel importante en virulencia (Dunger et al., 2014; Su et al., 1999; Yang et al.,

2004).

Funciones del pili tipo IV 7.4.1.

Los pili tipo IV son capaces de realizar diversas funciones relacionadas con la secuencia

de la proteína, a veces un único residuo pueden afectar a la función del pili (Giltner et

Introducción

108

al., 2012). Por otro lado la función de esta estructura puede variar en los distintos

microorganismos que la poseen (Craig et al., 2004).

El pilus tipo IV posee un papel importante en la formación de agregados en X.

campestris pv. vesicatoria tanto in vitro como in planta. Mutantes en el gen que codifica

para pili tipo IV fueron incapaces de adherirse a los tricomas de la hoja y no mostraron

diferencias en infección cuando fueron inoculados por infiltración (Ojanen-Reuhs et al.,

1997). Los pili tipo IV de X. hyacinthi, agente causal del amarilleamiento del Jacinto,

parecen estar relacionados con adhesión a los estomas de la planta sugiriendo un papel

en las primeras etapas del desarrollo de la enfermedad (van Doorn J et al., 1994). En X.

fastidiosa parece tener un efecto contrario puesto que mutantes que carecen del pili tipo

IV muestran una mayor capacidad para agregarse, que podría deberse a una mayor

capacidad para hacer twitching y a la presencia de los pili tipo I, que como se ha

mencionado antes parecen tener un papel importante en la formación de agregados

(Meng et al., 2005). En Xcc 306 el pilus tipo IV parece estar relacionado con la

formación de biopelículas maduras y con la adhesión a superficies vegetales, sin

embargo su papel en virulencia no parece ser relevante cuando el patógeno se inocula

por infiltración (Dunger et al. 2014).

La naturaleza retráctil del pilus tipo IV es lo que permite el movimiento tipo twitching,

puesto que mutantes que carecen de PilT, la ATPasa encargada de la retracción del pilus

no son capaces de moverse. Sin embargo el hecho de que las bacterias posean pili tipo

IV retráctiles no implica que haya motilidad tipo twitching (Giltner et al., 2012). Se han

descrito en P. aureginosa movimientos tipo walking (andando) y crawling (gateando)

que también son dependientes del pili tipo IV y que se han comentado en el apartado de

motilidad.

Además del movimiento tipo twitching, el pilus tipo IV parece estar implicado en otros

movimientos en superficie. Mutantes en P. syringae pv. tabaci 6605 de genes que

codifican para la subunidad principal del pili (pilA), dos subunidades menores (fimU y

fimT) y pilO, mostraron fenotipos más lentos en el movimiento tipo swimming en medio

semisólido, pero no en medio líquido y también en swarming (Taguchi y Ichinose,

2011). Mutantes de R. solanacearun, patógeno del suelo que produce marchitez en un

gran número de especies vegetales, en pilQ, que codifica la proteína de la membrana

externa encargada de secretar al exterior el pilus tipo IV, y en pilA que codifica para la

subunidad mayor del pilus, vieron reducida su capacidad para hacer twitching, además

Introducción

109

de su capacidad de agregación y virulencia en plantas de tomate (Liu et al., 2001; Kang

et al., 2002). Por otro lado mutantes en X. fastidiosa en pilQ también vieron reducida su

capacidad mótil in vitro (Meng et al., 2005; Li et al., 2007b). Mutantes en la subunidad

mayor del pilus de Xcc 306 no fueron capaces de realizar twitching (Dunger et al.

2014).

En Neisseria gonorrhoeae la propia estructura del pilus y el ensamblaje de las

subunidades de pilina produce unas zonas, a modo de surcos, que recorren el pilus con

carga positiva a las que se une ADN. El ADN se introduce al interior de la bacteria

cuando el pilus se retrae (Craig y Li, 2008). Este fenómeno también se ha escrito que

tiene lugar en R. solanacearum (Kang et al., 2002).

Varias proteínas son secretadas a través del pilus tipo IV, entre ellas el factor de

colonización TcpF de V. cholerae, proteasas de D. nodosus y varios efectores (factores)

de virulencia en Fransciella tularensis (Giltner et al., 2012).

Como se ha mencionado anteriormente los pili tipo IV son capaces de unir el fago

filamentoso cf, puesto que mutantes de Xcc en una de las pilinas no muestran

susceptibilidad a este tipo de fago (Su et al., 1999). La unión a fagos mediante este pilus

se ha descrito también en otras bacterias Gram negativas como Neisseria gonorrheae,

N. meningiditis y P. aeruginosa.

111

CAPÍTULO 2: OBJETIVOS

CAPÌTULO 2: Objetivos

113

Objetivos de la tesis

El objetivo general de este trabajo era profundizar en el conocimiento de algunos

mecanismos que forman parte de los primeros estadíos de infección en la cancrosis

o chancro bacteriano de los cítricos: quimiotaxis, motilidad y formación de

biopelículas.

Este objetivo general se ha abordado siguiendo los siguientes objetivos parciales

1. Estudiar mecanismos de quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri en

comparación con otras Xanthomonas patógenas o no de cítricos

1.1. Determinar sustancias que inducen quimiotaxis en las diferentes especies

de Xanthomonas estudiadas

1.2. Determinar fracciones de plantas de diferentes especies que inducen

quimiotaxis en las distintas cepas de Xanthomonas estudiadas

1.3. Localizar y estudiar sensores de quimitaxis tipo MCPs en las diferentes

especies y cepas de Xanthomonas estudiadas

1.4. Asociar los perfiles resultantes del análisis de sustancias quimioefectoras,

fracciones de plantas y perfiles de MCPs al rango de huésped de las especiesde

Xanthomonas estudiadas

2. Estudiar la formación de biopelículas o biofilms en Xanthomonas citri subsp.

citri en comparación con otras especies de Xanthomonas y caracterizar algunos

de los componentes de la matriz de las mismas

2.1. Estudiar la formación de biopelículas en condiciones bióticas y abióticas

en especies de Xanthomonas patógenas de cítricos

2.2. Determinar diferencias en la formación de biopelículas entre cepas

perternecientes a la especie Xanthomonas citri subsp. citri con diferente gama

de huésped y con otras Xanthomonas patógenas o no de cítricos

2.3. Estudiar la composición de las matrices de biopelículas y determinar

posibles diferencias entre las diferentes cepas de Xanthomonas estudiadas

CAPÌTULO 2: Objetivos

114

3. Estudiar la expresión de genes implicados en motilidad y formación de

biopelículas y determinar las posibles diferencias entre cepas de amplia y

limitada gama de huésped de Xanthomonas citri subsp. citri

115

CAPÍTULO 3: MOTILIDAD Y QUIMIOTAXIS EN

Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA

GAMA DE HUÉSPED

Enviado a Environmental Microbiology Reports

Differential Chemotaxis and Motility of Xanthomonas citri subsp. citri

strains with different host range

Sena-Vélez, M., 1 Ferragud. E.

1, Graham, J.H.

2, Redondo, C.

1, Cubero, J

1.

1Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA), Ctra de

La Coruña Km 7,5 (Madrid), Spain. 2University of Florida, Citrus Research and

Education Center (CREC) 700 Experiment Station Road. Lake Alfred, FL 33850-2299,

USA.

CAPÍTULO 3. Motilidad y quimiotaxis en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped

117

1. Abstract

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) A strain is the causal agent of citrus bacterial

canker (CBC) on most Citrus sp. and close relatives. Two narrow host range strains of

Xcc, Aw and A*, from Florida and Southwest Asia, respectively, infect Mexican lime

(Citrus aurantifolia) and alemow (C. macrophylla). In the initial stage of host infection,

these xanthomonads enter via stomata to reach the apoplast. Herein, we investigated the

differences in chemotactic responses for wide and narrow host range strains of Xcc A,

X. alfalfae subsp. citrumelonis, the causal agent of citrus bacterial spot, and X.

campestris pv. campestris, the crucifer black rot pathogen. These strains of

Xanthomonas were compared for carbon source utilization, the chemotactic responses

toward carbon compounds, and responses to leaf extracts or apoplastic fluids. Different

chemotactic responses occurred for carbon sources, leaf extracts and apoplastic fluids

depending on the Xanthomonas strain and the host plant from which the leaf fractions

were derived. Differential chemotactic responses to carbon sources and leaf fractions

suggest that these Xanthomonas strains sense host specific signals that facilitate their

location and entry of stomatal openings or wounds.


118

2. Introduction

Citrus bacterial canker (CBC) is one of the most important bacterial diseases for citrus

in tropical and subtropical areas of the world. CBC is characterized by necrotic,

erumpent lesion on leaves, fruit and stems which when severe may cause premature

defoliation and fruit drop on Citrus species and close citrus relatives in the family

Rutaceae (Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004). Distinct types of CBC have been

described caused by different bacteria within the genus Xanthomonas. Symptoms of

these canker diseases are generally similar and initially all the causal bacterial strains

were classified within the same species of the genus (Gottwald et al., 2001; Graham et

al., 2004; Schaad et al., 2005; Schaad et al., 2006; Vauterin et al., 1995; Vauterin et al.,

2000). Currently two species of Xanthomonas are described as causal agents of CBC.

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), formerly X. axonopodis pv. citri, is by far the most

widespread and causes CBC A type on the broadest host range. X. fuscans subsp.

aurantifolii (formerly X. axonopodis pv. aurantifolii) causes CBC B and C types which

were described on lemon (C. limon) and Mexican or Key lime (C. aurantifolia) in

Argentina and Brazil, respectively (Gottwald et al., 2001; Graham et al., 2004). In

addition, two strain groups of Xcc A strain, A* and Aw, have been characterized as

genetically distinct from the Xcc A (Vernière et al., 1998; Sun et al., 2004). A* and Aw

strains occur in Southwest Asia and Florida, respectively, and have a narrow host range

that includes Mexican lime (C. aurantifolia) and alemow (C. macrophylla). Although in

field these strains only cause disease on lime, when they are infiltrated into leaves of

other citrus species they produce atypical lesions, slightly raised with no rupture of the

epidermis (Vernière et al., 1998; Sun et al., 2004). Furthermore, Xcc Aw strain is able to

cause hypersensitive response on Duncan grapefruit (C. paradisi) when infiltrated into

leaves (Sun et al., 2004).

Chemotaxis is the mechanism which enables bacteria to sense stimuli such as nutrients,

light and temperature, that attract them to the site that is optimally suited for host

colonization and infection (Adler, 1966). For example, jasmonate is a plant signal that

attracts Dickeya dadantii to wounds facilitating entry of the host and enhancing the

infection process (Antúnez-Lamas et al., 2009a). Moreover, Ralstonia solanacearum

strains isolated from different host and geographic areas show specific chemotactic

responses to a diversity of sugars and are more attracted by host root exudates than non-

host root exudates (Yao & Allen, 2006). Furthermore, mutations in the chemotaxis


119

pathway of R. solanacearum reduce infection (Yao & Allen, 2006). Detection of some

environmental signals is mediated by methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs)

which have been characterized for several plant pathogenic xanthomonads including

Xcc (Mhedbi-Hajri et al., 2011a).

Xcc is dispersed by wind and rain. Wind speed increases the infection by facilitating

bacterial entry into the leaves via stomata or wounds (Graham et al., 2004; Bock et al.,

2010b). However, Xcc infection is also produced at low wind speed or in the absence of

wind (Bock et al., 2010b) which suggests the existence of other mechanisms allowing

bacteria to reach the apoplast. If there is water on the leaf surface, bacterial movement

and entry into stomata or wounds may be mediated by chemotaxis. This hypothesis is

supported by confocal laser scanning microscopy (CLSM) of Xcc A which showed

bacteria congregate at the edge of the stomata immediately after the spray-inoculation of

leaves (Cubero et al., 2011). In addition, strains Xcc MI (A type, wide host range) and

X. alfalfae subsp. citrumelonis F1 (Xac) were detected in the apoplast of Swingle

citrumelo leaves, while a non-host strain of Xcc 12879 (Aw type) was not present. In

contrast, all of these citrus strains were found to extensively colonize the apoplast of

Mexican lime leaves (Sena-Vélez et al., 2014). Similarly, Xc mutants in the flagellar

synthesis cascade (flhA) impaired in swimming motility were reduced in virulence on

cabbage plants (Yang et al., 2009), which indicates a putative role for motility in the

infection process. Furthermore, D. dadantii 3937 moved to wounds on chicory

(Cichorium intybus) leaves in response to jasmonate which increased infection

(Antúnez-Lamas et al., 2009a). Additionally, in a recent study of Pseudomonas

syringae B728a, chemotaxis and motility related genes were overexpressed during the

epiphytic stage of the interaction on bean leaves, but not after reaching the apoplast (Yu

et al., 2013). These events suggest the requirement for active bacterial motility and

chemotaxis on the plant surface to locate and colonize the apoplastic site.

Studies have elucidated the pathogenesis mechanisms that are responsible for the

differences in host range of Xcc strains (Al-Saadi et al., 2007; Rybak et al., 2009), but

they did not address early events in the infection process including motility mediated by

chemotaxis. Furthermore, a study suggests that environmental sensors in Xanthomonas

have evolved according to the adaptation of the bacterial species to the host (Mhedbi-

Hajri et al., 2011a). In this study, we characterized the chemotactic responses of Xcc A

and A* or Aw strains and compared their behavior with X. alfalfae subsp. citrumelonis


120

(Xac), the causal agent of citrus bacterial spot (CBS), a disease of citrus nursery plants

and X. campestris pv. campestris (Xc), the cause of crucifer black rot (CBR). Our aim

was to identify profiles of compounds that act as attractants or repellents for

Xanthomonas strains, and to relate these profiles to their host range and carbon source

utilization. In addition, we evaluated the chemotactic response to apoplastic fluids and

extracts from citrus and non-citrus hosts to determine if the chemotaxis signals explain

host specificity of Xanthomonas strains at an early stage of infection.

3. Results

3.1. Carbon source utilization by Xanthomonas strains

Carbon source utilization was analysed for bacterial strains listed in Table 1 with Biolog

GN2 Microplate TM

(Biolog Inc. Hayward, CA, USA) following manufacturer

instructions.

Table 1. Strains and hosts of Xanthomonas spp. used in the study

Strain Taxon, or disease and CBC type Natural Host

Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBCa A Citrus spp.

Xcc 62 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Citrus spp.

Xcc Iran2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Citrus aurantifolia

Xcc Iran10 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Citrus aurantifolia

Xcc 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC Aw Citrus aurantifolia

Xac F1 Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis, CBS Citrus spp.

Xc 1609 Xanthomonas campestris pv. campestris, CBRc Brassica spp.

aCitrus bacterial canker (CBC)

bCitrus bacterial spot (CBS)

cCrucifer black rot (CBR)

Readings were made at 0 and 24 h post inoculation (hpi) to detect the earliest metabolic

response. Carbon sources utilized by all strains were: Tween 40, N-acetyl-D-

glucosamine, D-cellobiose, D-fructose, D-galactose, gentiobiose, α-D-glucose, maltose,

D-mannose, D-psicose, D-trehalose, pyruvic acid methyl-ester, α-keto glutaric acid,

succinic acid, bromosuccinic acid, L-glutamic acid, L-proline, L-serine, L-threonine and


121

glycerol. Differentially utilized carbon sources by Xanthomonas strains are presented in

Table 2. Citrus strains were able to utilize Cis-aconitic acid, L-alaninamide, L-alanyl-

glycine and glycil-L-glutamic acid, while Xc 1609 utilized Tween 80, D-saccharic acid

and uridine. Among the citrus strains, only Xcc Iran10 responded to uridine. Xcc A, A*

and Aw strains responded to sucrose while Xac did not. Xcc 306 was atypical compared

with all other Xcc A strains in that no activity was detected for dextrin, L-fucose,

lactulose and α-keto butyric acid. Utilization of glycyl-L-aspartic acid, propionic acid,

D-alanine and L-alanine differentiated the narrow host range strains A* and Aw, which

were able to metabolize these carbon sources, from the wide host range strains that did

not. Xcc A* strains were the only ones that responded to α-D-lactose, turanose and L-

aspartic acid. In addition, Xcc A* strains responded the same as Xac and Xc strains to D-

melobiose, α-hydroxybutiric acid, DL-lactic acid and DL- α-glycerol phosphate.

To study the relatedness of the metabolic response among Xanthomonas strains, cluster

analysis was performed by transforming the data to binary form (uninformative carbon

sources were dropped from the analysis). Cluster analysis demonstrated that citrus

pathogenic strains were grouped in the same cluster and Xcc A strains were grouped

according to host range i.e., Xcc A* and Aw

strains were clustered together and were not

close to the Xc strain causing cabbage black rot (Fig. 1A).

These results are consistent with previous findings wherein Xcc A strains showed a

common carbon source utilization profile (Vernière et al., 1993; Vernière et al., 1998;

Sun et al., 2004). In addition, among Xcc strains studied, those with a wide citrus range

were distinct from narrow host range strains Xcc, A* and Aw strains or Xac causing

citrus bacterial spot. These results are consistent with those of Vernière et al. (1998)

who reported that only 4.3% of Xcc A* strains were identified as Xcc A using Biolog.

These findings suggest for these strains that there is a relationship between host range

and carbon source utilization.


122

Table 2. Biolog activity of carbon sources for species and strains of Xanthomonas pathogenic on citrus

and crucifersa.

Strains/additive Xcc

306

Xcc

62

Xcc Aw

12879

Xcc

Iran2

Xcc

Iran10

Xac

F1

Xc

1609

Dextrin - c + + + + + +

Glycogen + b + NI + + + NI

Tween 80 - - - - - - +

L-Arabinose - - - - NI NI -

D-Arabitol - - - - - NI -

L-Fucose NId

+ + + + + +

α-D-Lactose - - - + + NI -

Lactulose NI + + + + + +

D-Melobiose - NI - + + + +

D-Raffinose - - - NI NI NI NI

Sucrose + + + + + NI +

Turanose - - - + + NI NI

Succinic Acid Mono-

Methyl-Ester NI + + + + + +

Cis-Aconitic Acid + + + + + + -

D-Gluconic Acid - - - - NI - -

α-Hidroxybutyric Acid - - NI + + + +

β-Hidroxybutyric Acid - - - - NI NI NI

α-Keto Butyric Acid - + + + + + +

D,L-Lactic Acid - - NI + + + +

Malonic Acid NI NI + + + + +

Propionic Acid - - + + + - +

D-Saccharic Acid - - - - - - +

Succinamic Acid NI + + + + + NI

L-Alaninamide + + + + + + NI

D-Alanine - - + + + + -

L-Alanine NI - + + + + NI

L-Alanyl-Glicine + + + + + + -

L-Asparagine - - NI - NI - -

L-Aspartic Acid - - NI + + - NI

Glycyl-L-Aspartic Acid - - + + + - -

Glycyl-L-Glutamic Acid + + + + + + NI

Hydroxy-L-Proline - - - - NI - NI

Urocanic Acid - - - - NI - -

Uridine - - - - + - +

D.L-α-Glycerol Phophate - - NI + + + -

α-D-Glucose-1

-Phosphate - NI - + + NI -

D-Glucose-6-Phosphate - - - + + + - aCarbon source utilization was calculated by subtracting the time 0 absorbance from each well reading.

Substrate well readings were further adjusted against the substrate blank well and each activity value was


123

the average of three assays with two replicates per assay. Wells with ≥160% of activity at 24h compared

to the blank were considered positive (+)b and ≤130% were considered negative (-)

c. Values from 130 to

160% were considered non-informative and dropped from further analysis (NI)d.

3.2. Chemotactic response of Xanthomonas strains to carbon compounds

In order to define the chemotactic profile for Xanthomonas strains, a novel chemotaxis

assay was developed. In this assay, the quantity of bacteria entering into a tip containing

the carbon source assessed the chemotactic response independently of bacterial growth.

The assay is similar to those described previously (Feng and Kuo, 1975; Han and

Cooney, 1993; Palleroni, 1976) with the additional capability to assess several

compounds simultaneously. This assay was validated with D. dadantii 3937 and the

results matched those previously reported; 10 mM cysteine was repellent, and 10 mM

sodium citrate, 10 mM glucose and 1 and 200 mM serine were attractants (Antúnez-

Lamas et al., 2009a; Antúnez-Lamas et al., 2009b).

All Xanthomonas strains responded to 10 mM cysteine as a repellent and 0.2% glycerol,

200 mM serine and 10 mM sucrose as attractants (Table 3). Sucrose was previously

reported as an attractant for other Xanthomonas such as Xc (Kamoun and Kado, 1990)

and X. oryzae (Feng & Kuo, 1975) which also validates the assay and suggests that

sucrose is a conserved chemoattractant for xanthomonads. The responses that

differentiated Xcc A strains from Xac F1 and Xc 1609 were 150 mM leucine, 0.2%

mannitol, 10 mM xylose and 10 mM serine. Furthermore, Xc 1609 was differentiated

from the citrus pathogenic strains for the following carbon sources: 10 mM alanine and

10 mM leucine as repellents, and 10 mM glucuronic acid as an attractant. Within the

Xcc A strains different chemotactic responses were observed, as reported for R.

solanacearum (Yao & Allen, 2006). Xcc 306 and Xcc 62 were uniquely attracted to 10

mM galacturonic acid and Xcc 62 to 10 mM arginine. Cluster analysis, performed as

explained above, was based on attractants identified from the chemotactic profiles

(Table 3). This analysis grouped Xcc A strains together and the narrow host range Xcc

Iran2 (A*) and Xcc 12879 (Aw) within a subgroup. Xcc A 62 was more closely grouped

with narrow host range strains than Xcc A 306 (Fig. 1B).


124

Figure 1. Dendrograms showing relationships among Xanthomonas strains based on data from: A, Biolog

GN2 activity; B, chemotactic assay. Data were converted to binary form and similarity coefficients for

pairs of strains were calculated with the program NTSYS, version 2.1 (Exeter Software, Setauket, N.Y.)

using SIMQUAL with Jaccard coefficient and subjected to unweighted pair group method (UPGMA).

Similarities were calculated by using Jaccard coefficient and clustering was achieved by UPGMA using

program NTSYS, version 2.1 (Exeter Software, Setauket, N.Y.). r, refers to the cophenetic correlation

index.

Chemotactic responses were similar for narrow host range strains while responses of the

wide host range strains were variable between the two strains tested. Based on cluster

analysis of carbon source utilization and chemotaxis assays, groupings of Xcc A strains

were similar to those obtained with markers from MLSA and AFLP assays (Bui Thi

Ngoc et al., 2010), i.e., narrow host range A strains were more closely related to each

other than to wide host range strains (Fig. 1A & B). Strain Xcc 306, although

metabolically similar to Xcc 62, showed the most unique chemotactic profile among Xcc

strains.


125

Table 3. Chemotactic response for species and strains of Xanthomonas pathogenic on citrus and crucifers.

a The assay was performed as follows; pipette tips containing 5 µL of the carbon source were inserted into

48 wells of a microtiter plate each filled with 200 µL of a 108

cfu mL-1

bacterial suspension. To measure

chemotaxis, the number of bacteria that entered the tip in one hour was estimated by means of serial

dilutions of the contents in the tip. The carbon source was considered a chemoattractant (+)b or

chemorepellent (-)d when the average number of bacteria that entered the tip in 6 replicates from at least 2

assays was significantly (P<0.05) higher or lower than the control with 10 mM MgCl2. When P>0.05 no

response was considered (0)c. Data were subjected to analysis of variance using Student-Newman-Keuls

method to determine significant differences between the means of the values for the carbon source

amended medium and the negative control. Statistical analyses were performed using STATGRAPHICS

Plus, version 5.1 (Copyright Manugistics Inc.).

Additive Xcc 306 Xcc 62 Xcc Iran2

A*

Xcc Aw2879 Xac F1 Xc 1609

Sodium Citrate 10mM +b

0c + + 0 0

Fructose 10mM 0 + 0 + -d 0

Galactose 10mM 0 + 0 + 0 +

Glucose10mM 0 0 0 + - 0

Maltose 10mM 0 + + + 0 +

Sucrose 10mM + + + + + +

Xylose 10mM 0 0 0 0 - -

Arginine 10mM 0 + 0 0 0 0

Arginine 100mM 0 + + + + +

Alanine 10mM 0 + + 0 0 -

Alanine 250mM + + + + 0 +

Cysteine 10mM - - - - - -

Leucine 10mM + 0 0 0 0 -

Leucine 150mM + + + + - 0

Serine 10mM 0 0 0 0 - -

Serine 200mM + + + + + +

Glycerol 0,2% + + + + + +

Mannitol 0,2% + + + + - 0

Galacturonic Acid 10mM + + 0 0 + 0

Glucuronic Acid 10mM 0 0 0 0 0 +

Citric Acid 10mM - 0 0 - 0 0

Succinic Acid 10mM 0 + + 0 + 0

Cumaric Acid 10mM 0 + 0 + + 0


126

Biofilm formation has been reported as important factor for Xcc to establish the

infection and to survive on the plant surface (Cubero et al., 2011; Rigano et al., 2007).

Furthermore, a recent study reported that Xcc biofilm formation in planta varies

according the host range and the host, i. e., narrow Xcc host range strain Aw produces

less biofilm on non-host than host leaves (Sena-Vélez et al., 2014). Several studies have

reported that chemotaxis plays a key role in both bacterial attachment and biofilm

development possibly in response to the environment for several bacterial species

including Xcc (Kostakioti et al., 2013; Merritt et al., 2007b; Moreira et al., 2014;

Schmidt et al., 2011; Yaryura et al., 2015). Therefore, the variation in the chemotactic

profile of Xcc as observed for biofilm formation (Sena-Vélez et al., 2014) may also play

a role at early stage of the infection and on host range (Yaryura et al., 2015; Moreira et

al., 2014).

3.3. Chemotactic response of Xanthomonas strains to leaf fractions

To confirm the role of chemotaxis at an early stage of leaf infection and its relation to

host range, the strains were tested for response to leaf fractions from different plant

species. Chemotaxis was tested as described above for whole leaf extracts and

apoplastic fluid from sweet orange (C. sinensis) var. ‘Valencia Late’, Mexican lime and

Chinese cabbage (Brassica pekinensis) var. Kasumi F1. To obtain whole leaf extracts,

leaves were ground in liquid nitrogen, suspended in sterile distilled water and then

centrifuged to pellet the leaf tissue. Apoplastic fluid was extracted as previously

described for Solanum lycopersicum (Rico and Preston, 2008). All fractions were

sterilized by passing them through a 0.2 µm filter. To evaluate the effect of extracts and

apoplastic fluids, chemotaxis assays were performed with fractions of 200, 100, 50,

12.5, 6.3 and 3.1 mg of leaf per mL of sterile distilled water.

The relationship between apoplastic fluid or leaf extract concentration and the

proportion of the bacteria entering to the tip was expressed as the log cfu bacteria per

extract fraction divided by the log cfu bacteria for sterile distilled water (DW). Data

were subjected to two different statistical analyses. General linearized models (GLM)

procedure was used to test the broad response to all leaf fractions, different

concentrations, and to compare the response among the strains. Analysis of variance and

Student-Newman-Keuls test was used to compare the response to each leaf fraction

concentration for each strain, in order to determine the threshold concentration for

attractants.


127

Figure 2. Chemotactic response of Xanthomonas strains to apoplastic fluids from sweet orange (A),

Mexican Lime (B) or Chinese cabbage (C) leaves. In order to compare the chemotactic response among

strains and apoplastic fluids the amount of bacteria entering into the tip with each apoplastic fluid was

normalized with the amount of bacteria entering in the tip in which no chemotactic stimulus was present.

The y-axis in the graphs is the log cfu of bacteria in the tip containing the apoplastic fluid divided by the

log cfu in the tip containing distilled water (DW) at different apoplastic fluid concentrations (x-axis). The

lines are linear regressions for each strain/leaf concentration combination.


128

Figure 3. Chemotactic response of different Xanthomonas strains to leaf extracts from sweet orange (A),

Mexican lime (B) or Chinese cabbage (C) leaves. . In order to compare the chemotactic response among

strains and leaf extracts the amount of bacteria entering into the tip with each leaf extract was normalized

with the amount of bacteria entering in the DW tip. The y-axis in the graphs is the log cfu of bacteria in

the tip containing the plant extract divided by the log cfu in the tip containing distilled water (DW) at

different plant extract concentrations (x-axis). The lines are linear regressions for each strain/leaf

concentration combination.


129

All strains evaluated showed attraction (P<0.05) to the leaf extracts and apoplastic

fluids from sweet orange, Mexican lime or Chinese cabbage at concentrations from 50

to 200 (mg leaf mL-1

). Although the strain Xcc 306 showed positive response for those

concentrations of sweet orange and Chinese cabbage leaf fractions, this strain only gave

a positive response at 200 mg leaf mL-1

for Mexican lime leaf extract and apoplastic

fluid. Furthermore, Xcc 306 response to apoplastic fluid from sweet orange was

significantly different from the response to cabbage or Mexican lime (Figs. 2 & 3). The

strongest response to sweet orange apoplastic fluid was observed for Xcc 306 compared

with the other strains tested. In addition, regression lines were obtained and compared

for the number of bacteria that entered into apoplastic fluid or leaf extract from leaf

concentrations in an interval from 0 to 50 mg mL-1

. Differences among the slopes for

the different strains after exposure to the leaf fractions from the different plant species

were evaluated. Regression and statistical analysis were performed using

STATGRAPHICS Plus, version 5.1.The slopes of the regression lines obtained from 0

to 50 mg mL-1

were significantly different (P<0.05) between Xcc 306 and the other

strains. Moreover, the response of Xcc 306 to apoplastic fluid was significantly different

(P<0.05) from the leaf extract. Similar differences were detected for Xc 1609 and

cabbage fractions, which produced a strong chemotactic response that increased with

extract concentration. The response of Xc 1609 to cabbage apoplastic fluid was

significantly greater (P<0.05) than the citrus strains response to this host apoplastic

fluids, which coincides with Xc 1609, Xac F1 and Xcc host range (crucifers and citrus,

respectively). In most cases, cabbage apoplastic fluid produced a significantly greater

response (P<0.05) compared to leaf extracts except for Xcc 62 which responded weakly

to both apoplastic fluid and leaf extracts. Mexican lime apoplastic fluid or leaf extract

produced a weak chemotactic response for all strains except Xac F1, the only strain that

significantly responded to increasing concentration of Mexican lime apoplastic fluid. In

addition, Xac F1 was the only strain that responded differentially to apoplastic fluid and

leaf extract from Mexican lime. The results showed that most citrus pathogenic strains

were attracted toward both citrus leaf and apoplastic fluid extracts. However, strain Xcc

306 showed stronger attraction towards sweet orange apoplastic fluid than leaf extract,

comparable to Xac F1 for Mexican lime and Xc 1609 for Chinese cabbage.

Similar chemotactic responses were observed for most of the citrus pathogenic strains

and leaf and apoplastic fluid extracts, however a chemotactic response was observed for


130

Xc 1609 and Chinese cabbage extracts which confirms the host range of this strain and

its ability for colonizing the apoplastic site as a requisite for this pathogen’s infection

process (Yang et al., 2009). Recent studies of Xcc suggest that chemotaxis is necessary

to establish the infection since mutants impaired in chemotaxis towards grapefruit leaf

extract were reduced in ability to cause canker lesions on grapefruit leaves (Yaryura et

al., 2015) but not when grown in nutrient broth or XAM1 medium (Moreira et al.,

2014). As mentioned above, a lower number of narrow host range bacterial cells were

observed in the apoplast of Swingle citrumelo than in Mexican lime leaves, whereas the

wide host range strain was present in apoplastic sites of both citrus varieties (Sena-

Vélez et al., 2014). These evaluations were made in absence of wind force which

confirms that bacterial entry is mediated by active motility and chemotaxis in relation to

host range. Apoplastic fluids exuding from stomatal openings or leaf wounds are most

likely to be the chemotactic sources on the leaf surface. Response of Xcc 306, Xc 1609

and Xac F1 strains to apoplastic fluids from sweet orange, Chinese cabbage and

Mexican lime leaves, respectively, was generally host specific with a few exceptions.

These results are consistent with findings that R. solanacearum K60 is more attracted to

host root exudates than to non-host exudates (Yao & Allen, 2006), and that X. oryzae is

attracted towards root exudates based on susceptibility of rice cultivar (Feng & Kuo,

1975).

Comparing chemotaxis of citrus xanthomonads to sweet orange and Mexican lime

apoplastic fluids, the response to sweet orange was consistent among citrus strains but

response to Mexican lime was variable. Our hypothesis is that Mexican lime leaves

contain non-specific signals. Consistent with the host’s universal susceptibility to citrus

pathogenic xanthomonads (Brunings & Gabriel, 2003; Gottwald et al., 2001; Gottwald

et al., 2002b; Graham et al., 2004). Interestingly those strains which showed a variable

response towards the apoplastic fluid also exhibited a unique chemotactic profile among

the strains studied. Xcc 306 showed the most different chemotactic profile among Xcc

strains and also responded differentially toward sweet orange and Mexican lime leaf

fractions.

Xc 1609 showed strong attraction towards Chinese cabbage apoplastic fluids compared

with Chinese cabbage leaf extract and citrus extracts. This suggests Xc 1609 is a better

colonizer of its host apoplast, than citrus xanthomonads which responded less to

Chinese cabbage extracts. This result confirms the specificity of chemotactic profiles for


131

xanthomonads from citrus and crucifers as well as the behaviour of Xcc 306, Xac F1 and

Xc 1609 toward apoplastic fluid from sweet orange, Mexican lime and Chinese cabbage

leaves, respectively. Our results along with those of Yaryura et al. 2015 and Moreira et

al. 2014 support the role of chemotaxis in the plant-bacteria interaction and

Xanthomonas host range.

To conclude, this is the first report of the link between the host range of the

Xanthomonas strains and the profile of carbon source utilization, chemotaxis response

to carbon sources and leaf apoplastic fluids. These results indicate there is a host

specific role of leaf apoplastic exudates in chemotaxis at the early stages of the bacterial

infection process.

Acknowledgements

This work was kindly supported by Citrus Advance Technology Program, project

CRDF546 as well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y

Alimentaria (INIA) project RTA2008-00048. Marta Sena held a PhD fellowship from

INIA. We also thank Dra. María Milagros López, Dr. Rui Pereira Leite and Pablo

Rodriguez-Palenzuela for supplying some of the bacterial strains and Carmen Martínez

and Ana Redondo for supplying some of the plant material used in the study.

133

CAPÍTULO 4: PROTEÍNAS ACEPTORAS DE

GRUPOS METILO EN Xanthomonas Y SU

RELACIÓN CON LA GAMA DE HUÉSPED

Methyl accepting chemotaxis proteins in Xanthomonas and its relation

with host range

M. Sena-Vélez1, E. Ferragud

1, J.H. Graham

2, P. Rodríguez-Palenzuela

3, C. Redondo

1, J.

Cubero1.




USA. 3 University of Florida, Emerging Pathogen Institute. Gainesville, FL USA.

Capítulo 4. Proteínas aceptoras de grupos metilo en Xanthomonas y su relación con la gama de huésped

135

1. Abstract

Methyl accepting chemotaxis proteins (MCPs) are environmental sensors present in

bacteria able to sense chemical compounds or energy gradients. MCPs lead to a motile

response towards the more suitable environment for bacterial survival and growth. In

plant pathogenic bacteria some MCPs have been related with plant specific compounds

such as jasmonic acid which directs bacteria towards plant wounds facilitating the

entrance to the apoplastic site and produce the infection. In the genus Xanthomonas,

MCPs as well as other environmental sensors, have evolved according to the pathogen

adaption to the host.

In this study we have identified and compared the MCPs present in citrus bacterial

canker xanthomonads, X. alfalfae subsp. citrumelonis and X. campestris. Our results

showed which MCPs were conserved among the Xanthomonas studied and which were

related to host range or disease caused. Furthermore the analysis performed based on

presence or absence of MCPs clustered the studied bacteria according to host range and

disease produced.


136

2. Background

Methyl accepting chemotaxis proteins (MCPs) are the best characterized environmental

sensors in bacteria. MCPs are normally composed of a periplasmic or cytosolic ligand

binding region (LBR), a methyl accepting domain which contains the kinase control

module and the signal conversion module characterised by the presence of a HAMP

domain (present in histidine kinases, adenyl cyclases, methyl-accepting proteins and

phosphatases) which enhances the chemotactic signal (Bi and Lai, 2015; Lacal et al.,

2010b). MCPs are able to sense several chemical compounds as well as pH and oxygen

variation among other stimuli. A single MCP is able to sense several molecules, but

different MCPs can also bind the same ligand. The role of each MCP is therefore

complex and not so easy to totally determine (Armitage, 1999; Lacal et al., 2010a;

Lazova et al., 2012; Pineda-Molina et al., 2012; Río-Álvarez et al., 2014). Bacterial

adaptation to host has been related with sensing in the genus Xanthomonas where

several MCPs have been identified (Mhedbi-Hajri et al., 2011a). Herein, MCPs present

in citrus xanthomonads and Xanthomonas campestris pv. campestris were recognized

by analysis of complete genome or PCR detection based on those former studies when

no genome was available. Moreover, MCP content of these xanthomonads was related

to the host range and the chemotaxis behaviour.

3. Experimental procedures

3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions

Bacterial strains used in this study and their geographic origins are listed in Table 1.

Wide host range strains (A type) of Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) and three

narrow host range strains (A* and Aw) from different geographic areas were evaluated

along with X. fuscans subsp. auranttifolii (Xfa) (CBC types B & C), X. alfalfae subsp.

citrumelonis and X. campestris pv. campestris (Xc), a non-citrus pathogen. Bacterial

strains were routinely grown on Luria Bertani broth (LB) (10 g tryptone, 5 g L-1

yeast

extract and 85.5 mM of sodium chloride) or on LB plates (1.5% bacteriological agar) at

27ºC for 48 h.


137

Genomic DNA from Xanthomonas was extracted by using QIAamp DNA Mini Kit

following manufacturer´s instruction (Qiagen). Purified DNA samples were used for

PCR reactions or store a t -20ºC until further use.

Table 1: Strains of Xanthomonas spp. used in the study

Strain/Isolate Taxon, or disease and CBC type Origin Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil Xcc 62 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Japan

Xcc MI Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Florida (USA) 2766-107-1-2col2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2800-1Z Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2800-2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2807-8-1 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2807-10-2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2889col1 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 2889col3 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina R2880-1a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina R2880-2a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 3047-3a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Argentina 3046-6 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3011-3a Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3011-4b Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3024-5col7 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3024-5col4 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3026-1col8 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3026-1col9 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3023-2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3222-6col18 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3222-19col25 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3365-13col1 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 3365-14col5 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Uruguay 8946 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 8947 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12712 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12714 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12758 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12917 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12970 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 12971 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 13013 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil 14082 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Brazil Xcc Iran 2

Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Iran Xcc Iran 10 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* Iran Xcc 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A

w Florida (USA)

Xfa 69 Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii, CBC B Brazil Xfa 341 Xanthomonas fuscasn subsp. aurantifolii, CBC C Brazil Xac F1 Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis, CBS Florida (USA) Xc 1609 Xanthomonas campestris pv. campestris, CBR

c Spain

aCitrus bacterial canker (CBC);

bCitrus bacterial spot (CBS);

cCrucifer black rot (CBR).


138

3.2. Detection of methyl accepting chemotaxis proteins in silico

Methyl accepting chemotaxis proteins (MCPs) were detected by using an ad hoc Perl

script, which enabled the automatically search for proteins containing the MCP signal

domain (PF00015) by using Hidden Markov Models implemented in the HMMER 2.3.2

package (Eddy, 1998). The script was applied to the genomes of citrus xanthomonads

and Xc for which the complete genome sequence was available. MCP sequences from

the genomes of Xcc 306 (NC_003919) (CBC A strain) (da Silva et al., 2002), Xac F1

(NC_016010) (Jalan et al., 2011), Xc ATCC_33913 (NC_003902) (da Silva et al.,

2002), and Xc 8004 (NC_007086) (Qian et al., 2005) were predicted. Furthermore,

MCPs from the draft genomes of Xfa 11122 (Bioproject: PRJNA47351), Xfa 10535

(Bioproject: PRJNA47495) (CBC B and C strains respectively) (Moreira et al., 2010a),

Xac 29_1 (NC_020800.1) (CBC A strain) (Ye et al., 2013) and Xcc 12879

(NC_020815.1) (CBC Aw strain) (Jalan et al., 2013b) were predicted by using Blast-P

from the protein sequence of one member of each group, usually Xcc 306. The protein

sequences were analysed, aligned using ClustalW and clustered by Neighbour-Joining

after p-distance analysis using Mega 5.0 software (Tamura et al., 2011). In order to

search for homologies to MCP sequences or those of other sensor proteins, BlastP was

performed using the putative ligand binding domain amino acid sequence of MCPs.

Transmembrane helix from the predicted MCPs were detected using TMHMM Server v.

2.0 (Center for biological sequence analysis, Denmark) (Krogh et al., 2001), "DAS"

Transmembrane Prediction server (Miklos Cserzo et al., 1997) and HMMTOP (Tusnády

et al., 2001).

3.3. MCP detection by conventional PCR

MCP sequences were validated by conventional PCR using a selected set of primers

described by (Mhedbi-Hajri et al., 2011a) which correspond with the following groups

in the phylogenetic tree in Fig. 1: group 2, primers corresponding to gene XCV1939;

group 3, XCV3261; group 5, XCV1942; group 6, XCV1944; group 8, XCV1954; group

9, XCV1955; group 11, XCV1702; group 12, XAC3768; group 14, XCV1947; group

16, XCV1951; group 21, XCC0324; group 22, XCV1778; and XAC3271 which is not

reflected in the phylogenetic tree. Primers for group 17, MSV_XCAW2504F

(ATGCTGTCGGAAATGCAGGA) and MSV_XCAW2504R

(AGGTGCTTGATCTCCTTGGC) and for group 19 MSV_XCAW02508F

(GCGTCGCTCAATAACGTCAC) and MSV_XCAW02508R


139

(GATGCTGCTTTCGTACTGCG) were designed in this study. PCR reactions were

carried out in a final volume of 25 µL containing 2 mM of MgCl2, 0.2 mM of dNTPs

(each), 2 units of DNA-polymerase (Biotools, Madrid, Spain) and 0.2 mM of each

primer. For fragments longer than 1000 bp, FastStart Taq-DNA polymerase from Roche

(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) was used to a final volume of 25 µL

containing 2 mM of MgCl2, 0.1 mM of dNTPs (each), 2 units of FastStart Taq-DNA

polymerase and 0.2 mM of each primer. The amplifications conditions consisted of

94ºC for 1 minute, annealing temperatures described by Mhedbi-Hajri (Mhedbi-Hajri et

al., 2011a) and 57ºC for XCAW2504 and XCAW2508 for 1 minute and 72ºC for 1

minute for 40 cycles plus an initial step of 95ºC for 10 minutes and a final step of 72ºC

for 10 minutes. 10µL of the PCR products were run in 1-1.5% (w/v) agarose gels

stained with ethidium bromide and visualized under UV transilluminator. Presence or

absence of PCR product for each MCP were converted to binary form and similarity

coefficients for pairs of strains were calculated as described above.

4. Results

4.1. Detection of Methyl accepting chemotaxis proteins in silico

Several putative MCPs from the Xanthomonas analysed were identified by

bioinformatics approaches. Xcc 306 (CBC type A) had 21 predicted MCPs; Xac 29_1

(CBC type A) had 24 predicted MCPs; Xcc 12879 (CBC type Aw) had 24 predicted

MCPs; Xac F1 (CBS) had 24 predicted MCPs; Xc ATCC_33913 and Xc 8004 (CBR)

had 20 predicted MCPs respectively; Xfa 11122 and Xfa 10535 (CBC types B & C) had

20 and 18 predicted MCPs, respectively. MCPs were clustered in twenty seven

phylogenetic groups (Fig. 1), fifteen of these groups included MCPs found in every

strain studied, and therefore, were considered to be conserved in Xanthomonas. Twelve

groups were more confined to certain strains, those groups were of interest due to their

possible link with the unique chemotactic profile for strains associated with host range

described previously. Two MCPs were specific of CBC type A and Aw (groups 2 & 6)

and one of CBC (group 12), four MCPs were present in citrus pathogenic strains but not

in Xc (groups 3, 5, 9 & 18), two MCPs for Xc and finally one MCP was present on Xac

F1 and Xc (group 8). In the group 3, two MCPs (Xac_2_346724201 and

Xac_22_346725933) from Xac F1, were clustered in the same group but the amino acid


140

sequence of Xac_2_346724201 was considered specific for this specie, because it

showed less than 70% of identity with the other citrus pathogenic strains contained in

this group. Furthermore, in several groups the major difference among CBR and citrus

pathogenic strains corresponded with the protein size, i.e., in group 15, Xc strains lacked

the putative ligand binding residues which correspond to a 153 aa sequence in citrus

strains flanked by two transmembrane helix. Minor variations were observed in the

putative ligand binding domain as amino acid modifications, and were more pronounced

between CBR and citrus pathogenic strains. However some MCPs were highly

conserved since the percentage of identity between citrus and crucifers was higher than

96%.


141


142

Figure 1. Neighbor-Joining dendrogram depicting phylogenetic relationships among the different MCPs

detected from the complete genome from several Xanthomonas strains. The dendrogram was constructed

using Neighbour-joining method and using p-distance parameter to calculate pairwise distance. Bootstrap

values (1000 replicates) are indicated at branch points. Each MCP was named with the name of the strain

they belong following of an ordering number and finally de GI number.

4.2. Presence of MCPs in non-sequenced Xanthomonas strains

In order to determine presence or absence of MCPs for the strains whose genomes were

not sequenced, a set of conventional PCR amplifications were performed using primers

and conditions described in Experimental Procedures. PCR results confirmed the

presence of MCPs for the sequenced strains, Xcc 306, Xcc 12879 Aw and Xac F1 (Table

2) and for CBC B and C types and Xc strains, which were not the same strains as those

already sequenced. Differences in the presence of specific MCPs were related to host

plant (citrus vs crucifers) and citrus pathogenic species (Xac vs Xcc strains) as was

shown by the in silico study (Fig. 1). From the 35 wide host range CBC strains tested,

82% showed identical MCP profile to that observed for CBC Aw and A* strains. Strains

306 and 12917, both of them from Brazil, lacked XCCAW2504, XCCAW2508 and

XCV1939 shown in all the other citrus pathogenic Xanthomonas tested, including CBS

strain. Three Xcc strains, from Brazil, Argentina and Uruguay lacked MCP XCV1947

and strain 12970 from Brazil lacked MCPs XCV1947 and XCV1955. Xfa 341, a type C

strain, did not show amplification for XAC3271 and XAC3768 and Xfa 69, a type B

strain, for gene XAC3271, in accordance to the data from the whole genome available

in database for strains Xfa 10535 and Xfa 11222 (C and B strains types, respectively).

Cluster analysis of the data obtained from PCR amplification of the MCPs (Fig. 2)

grouped citrus pathogenic strains apart from Xc 1609, and citrus pathogenic strains were

separated according to disease and host range. CBC strains were clustered together, but

type A strains were separated from types B and C. As expected most of CBC A type

strains were identical and clustered separately from those which showed a varied MCP

profile.


143

Tabla 4. PCR amplification of some xanthomonads MCPs using primers described by Mhedbi-Hajri in

2011 and those designed in this study

Primers/Strains

XA

C3271

XA

C3768

XC

CA

W2504

XC

CA

W2508

XC

V1702

XC

V1778

XC

V1939

XC

V1942

XC

V1944

XC

V1947

XC

V1951

XC

V1954

XC

V1955

XC

V3261

XC

C0324

CBC A type

Xcc 306 Xcc MI Xcc 62

2766-107-1-2col2 2800-1Z 2800-2

2807-8-1 2807-10-2 2889col1 2889col3 R2880-1a R2880-2a

3046-6 3047-3a 3011-3a 3011-4b

3024-5col7 3024-5col4 3026-1col8 3026-1col9

3023-2 3222-6col18 3222-19col25

8946 8947 12712 12714 12758 12917 12970 12971 13013 14082

3365-13col1 3365-14col5

CBC Aw type Xcc A

w

CBCA*type Xcc Iran2 Xcc Iran10

CBC B type Xfa 69 CBC C type Xfa 341

CBS Xac F1 CBR Xc 1609


144

Figure 2: Dendrogram showing relationships among Xanthomonas

strains based on data from PCR performed to detect different MCPs.

Similarities were calculated by using Jaccard coefficient using program

NTSYS, version 2.1 (Exeter Software, Setauket, N.Y.) and clustering

was achieved by Neighbor-Joining using MEGA 5 program (Tamura et

al., 2011).

13013

3365-13col1

12971

12758

12714

12712

8947

8946

3222-19col25

3222-6col18

3023-2

3026-1col9

3026-1col8

3024-5col7

3011-4b

3011-3a

3047-3a

3046-6

R2880-2a

R2880-1a

2889col3

2807-10-2

2807-8-1

2800-2

2800-1Z

2766-107-1-2col2

XccIran10

XccIran2

XccAw

Xcc62

XccMI

3365-14col5

Xcc306

12917

12970

2889col1

3024-5col4

14082

Xfa69

Xfa341

XacF1

Xc1609

0.05


145

5. Discussion

MCPs from the sequenced citrus pathogenic Xanthomonas strain as well as two

sequenced strains of Xc have been clustered in 27 phylogenetic groups. The tree showed

that most of the Xanthomonas MCPs were common for citrus and crucifers pathogens,

however analysis based on the MCPs protein sequence of those groups showed variation

in the ligand binding residues (LBR). These differences were encountered mostly

between citrus and crucifers Xanthomonas strains which is in agreement with the

Xanthomonas sensor adaptation to host described previously (Mhedbi-Hajri et al.,

2011a). These analysis also showed that CBC A type strains Xcc 306, 29_1 and 12879

(Aw type) showed a high MCP similarity at protein level (average % of identity among

MCPs from all groups is 99.75 with a standard deviation of 0.93), however strain Xcc

29_1 (wide host range CBC) MCPs were more similar to strain 12879 (limited host

range CBC) than to Xcc 306. The most conserved MCPs within each group were those

containing strains infecting the same host. Some MCPs showed high protein identity ,

those MCPs were also present in X. axonopodis pv. vesicatoria (Xav) strain 85-10 and

other Xanthomonas species (Mhedbi-Hajri et al., 2011a), so they were possibly

conserved within the genus Xanthomonas.

The results of conventional PCR amplification correlated to those obtained in silico,

which confirms the accuracy of the primers and PCR conditions. The tree built from the

presence or absence of MCPs grouped strains according to its host, disease and CBC

type. When compared the tree based on the chemotactic profile (showed in Chapter III)

and the MCP profile (Fig. 2) the strain clustering was similar, Xcc 62 was more related

to limited host range CBC strains than Xcc 306. Although strain Xcc 306 was

metabolically similar to Xcc 62 (Chapter III), it showed the most unique chemotactic

and MCP profile among CBC type A strains. Xcc 306 strain (as strain 12917) lacked 3

MCPs present in most citrus strains. However strains Xcc 62, 12879 and Iran 2 which

had an identical MCP profile showed a variable chemotaxis response. This maybe

explained because chemotaxis is mediated by several mechanisms besides MCPs, like

metabolism which is also variable among CBC strains with different host range

(Chapter III) (Alexandre, 2010; Alexandre and Zhulin, 2001; Egbert et al., 2010).The

metabolic response analyzed by using Biolog plates revealed variation in the metabolic

response among strain 62 and narrow host range strains. Furthermore slightly

differences were shown within narrow host range strains even if they were isolated from


146

the same geographic area (Iran 2 and Iran 10). Thus, the MCPs content is not the only

factor affecting chemotaxis but it is also related to the metabolic activity of each strain

resulting in a variable chemotactic response which is independent of the number of

MCPs. On the other hand differences in the MCP protein sequence might vary the

chemotactic response and that factor was not fully investigated here.

In addition Xanthomonas response toward apoplastic fluids (Chapter III) of strains

which showed different MCP profile, Xcc 306, Xac F1 and Xc 1609 showed a unique

response towards orange, Mexican lime and Chinese cabbage leaves apoplastic fluids

respectively which differed from the response of the other strains tested as well as from

its whole leaf extracts. However strains Xcc 62, 12879 and Iran2 which responded

similarly to apoplastic fluids and leaf extracts showed the same MCP profile. This

suggests a relationship between MCPs and the chemotaxis interaction with apoplastic

fluid. Therefore, specific MCPs may determine the chemotactic response that results in

colonization of the apoplast.

Blast-P analysis of the MCPs was performed to find homologies to previously described

MCPs, but due to the lack of information about the ligand binding residues of the

MCPs, we were unable to relate a specific chemotactic response to a particular MCP.

Unique MCPs may sense several chemicals and contain more than one ligand binding

site (Kondoh et al., 1979; Lacal et al., 2010b; Nishiyama et al., 2012; Pham and

Parkinson, 2011; Pineda-Molina et al., 2012). Further studies are required to elucidate

chemotaxis mechanism and the role for specific MCPs in xanthomonads.

The correlation between MCPs and chemotactic profiles of CBC strains as well as the

behaviour of Xcc 306, Xac F1 and Xc toward apoplastic fluid from sweet orange,

Mexican lime and Chinese cabbage leaves, supports the role of these components in the

plant-bacteria chemotaxis interaction.

147

CAPÍTULO 5: FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS

EN Xanthomonas citri subsp. citri CON DISTINTA

GAMA DE HUÉSPED

Publicado en Plant Pathology 2014

Differential biofilm formation among strains of Xanthomonas citri

subsp. citri with different host range

Sena-Vélez, M., Redondo, C., Gell, I., Ferragud, E., Johnson, E., Graham, J.H., Cubero,

J.




USA.

Capítulo 5. Formación de biopelículas en Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped

149

1. Abstract

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) A strain is the causal agent of citrus bacterial

canker (CBC) on most Citrus spp. and close relatives. Two restricted host range strains

of CBC, Aw and A*, from Florida and Southwest Asia, respectively, infect Mexican

lime. Several studies have linked biofilm formation by Xcc to bacterial colonization

prior to and after plant ingress, but none have evaluated biofilm formation in connection

with the behavior of the different strains of Xcc on citrus hosts and non-hosts. In this

study biofilm formation and swimming motility was evaluated for citrus pathogenic

xanthomonads including wide and restricted host range strains of Xcc, X. alfalfae subsp.

citrumelonis (Xac), the causal agent of citrus bacterial spot, compared to X. campestris

pv. campestris (Xc). Differential biofilm formation was observed in vitro and in planta

among the Xanthomonas strains assayed. Minimal medium XVM2 increased biofilm

formation, especially for those strains with a host range restricted to Mexican lime. In

planta, strains produced more biofilm on leaves or fruits of their host than on non-hosts.

Scanning electron microscopy of biofilms on leaf and fruit surfaces revealed differences

in structure of bacterial aggregates with respect to the strain’s host range. In addition,

swimming motility varied widely depending on host range of the strain.

Biofilm formation in vitro and in planta for strains of Xcc and Xac was related to their

host range, as these processes affect colonization at the early stages of the infection

process.


2. Introduction

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (formerly X. axonopodis pv. citri) and X. fuscans

subsp. aurantifolii (Xfa) (formerly X. axonopodis pv. aurantifolii) cause citrus bacterial

canker (CBC), one of the most serious diseases on Citrus spp. (Graham et al.,

2004;Schaad et al., 2005). Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis is the cause of

citrus bacterial spot (CBS), a minor foliar disease of young citrus plants in nurseries.

CBC is characterized by necrotic lesions on leaves, twigs and fruits that reduce fruit

quality and restrict commercialization of plants and fruits in markets free of CBC

(Graham et al., 2004). Xcc A strain is the causal agent of citrus canker A which is by far

the most damaging and widespread CBC pathogen that affects the widest range of citrus

species. Within Xcc A strains, host range variants have been identified. Xcc A* and Aw

are strains from Southwest Asia and Florida, respectively, with a host range restricted to

Citrus aurantifolia (Mexican lime) and C. macrophylla (Alemow). A recent analysis of

the genome sequence of Xcc Aw 12879 revealed differences among A strains in plasmid

profiles and genes for virulence effectors (Cubero & Graham, 2002; Jalan et al., 2013a;

Jalan et al., 2013b; Sun et al., 2004; Vernière et al., 1998). Wide (Xcc A) and restricted

(Xcc A*, Aw) host range strains have been extensively studied to elucidate the genetic

determinants for their different host range (Escalon et al., 2013; Jalan et al., 2013a;

Rybak et al., 2009). None of the studies of host strain interactions have evaluated the

early stages of host colonization and infection.

Initial studies of Xcc A strains on plant tissues demonstrated limited bacterial viability

on leaf and fruit surfaces (Gottwald et al., 2009; Graham et al., 2004; J.H.Graham et al.,

1987; Pruvost et al., 2002). However, as found for other plant pathogenic bacteria,

aggregation and biofilm formation have been confirmed as important in host plant

colonization by Xcc (Cubero et al., 2011; Danhorn & Fuqua, 2007; Lindow & Brandl,

2003; Rigano et al., 2007). Biofilms are composed of polysaccharides, proteins and

nucleic acids that function in attachment and protection of the bacterium from biotic and

abiotic agents. In plant pathogenic bacteria, biofilms may act as a virulence factor in

early stages of colonization and infection (Flemming and Wingender, 2010; Guttenplan

and Kearns, 2013). After ingress, formation of biofilm allows the bacterium to maintain

a critical mass of cells within the plant tissues (Danhorn & Fuqua, 2007). Innumerable

factors including bacterium genotype and host, temperature, moisture, pH, and

exogenous nutrients influence biofilm formation. There is a sequence of steps that


151

begins by contact of the bacterium with the plant surface that requires active motility,

adsorption to the surface, cell replication, production of cell to cell signaling molecules,

and eventually, release of planktonic bacteria from the biofilm (Danhorn & Fuqua,

2007; Karatan & Watnick, 2009). Mechanisms involved in biofilm formation and

especially the first steps of attachment and adherence to the plant surface are highly

specific. Attachment involves binding between bacterial and host polysaccharides and

proteins (Busscher & van der Mei, 2012; Proft & Baker, 2009). Biochemical stimuli

mediate motility so the bacterium can locate the optimum site for attachment and

aggregation on the plant surface (Mhedbi-Hajri et al., 2011a).

Herein, we have studied biofilm formation and motility of Xanthomonas strains with

varying citrus host range. Initially, aggregation was assayed on an inert surface, and

thereafter, evaluated on leaf and fruit surfaces. Bacterial motility, associated with first

stages of biofilm formation, was also compared among the strains.

3. Material and methods

3.1. Bacterial strains and growth conditions

Bacterial strains used in this study are described in Table 1. Three wide host range

strains of X. citri subsp. citri (Xcc), and three restricted host range strains (XccA* and

XccAw), were compared with one strain each of X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac)

and X. campestris pv. campestris (Xc). All strains were grown at 27ºC for 48 h in Luria

Bertani (LB) broth (10 g L-1

tryptone, 5 g L-1

yeast extract and 5 g L-1

sodium chloride)

used as a common nutritional medium or on agar plates of LB (1.5% agar) or XVM2

(20 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.16 mM KH2PO4, 0.32

mM K2HPO4, 0.01 mM FeSO4, 10 mM fructose, 10 mM sucrose, 0.03% casamino acid)

culture medium to simulate apoplastic conditions (Astua-Monge et al., 2005; Wengelnik

et al., 1996). Xcc strains MIpUFJLVA, 12879pUFZLVA and 306pUFZLVA, and Xac

strain F1pUFZJLVA, expressing labile green fluorescent protein (GFP) (Cubero et al.,

2011; Zhang et al., 2009) were included to evaluate the location and viability of Xcc in

aggregates. MIpUFJLVA and F1pUFZJLVA were obtained in previous studies and

12879pUFZLVA and 306pUFZLVA were obtained in this work as previously described

(Cubero et al., 2011). All Xcc GFP strains were maintained on LB agar supplemented

with kanamycin at 50 µg mL-1

.


Table 1. Bacterial strains used in this study

Strain Species Origin Host Characteristics

306 aXcc Brazil Citrus spp. Citrus canker type A

62 Xcc Japan Citrus spp. Citrus canker type A

MI Xcc Florida Citrus spp. Citrus canker type A

Iran 2, Xcc Iran Key Lime Citrus canker type A*

Iran 10 Xcc Iran Key Lime Citrus canker type A*

12879 Xcc Florida Key Lime Citrus canker type Aw

F1 bXac

Florida Citrus spp. Citrus bacterial spot

1609 cXc

Spain Cabbage Crucifer black rot

306pUFZJLVA Xcc A 306 dUnstable GFP

MIpUFZJLVA Xcc A MI Unstable GFP

12879pUFZJLVA Xcc Aw 12879 Unstable GFP

F1pUFZJLVA Xac F1 Unstable GFP aXanthomonas citri subsp. citri,

bX. alfalfae subsp. citrumelonis,

cX. campestris pv. campestris.

dStrains

that express unstable green fluorescent protein (GFP) contain the pUFZJLVA plasmid.

3.2. Adhesion assays on an inert surface

Bacterial adhesion to an inert surface was measured by a polypropylene 96-well plate

assay as previously described (O'Toole et al., 1999). Adhesion to the well surface was

estimated after static bacterial growth in LB and XVM2 media for 72 h at 27ºC. After

removal of the medium using a micropipette, bacteria were incubated for an additional

72 h. Biofilm formation was measured after rinsing the plates with sterile distilled water

(SDW) and staining with 0.3 % crystal violet (CV) for 15 minutes. Excess stain was

removed by rinsing the plates with SDW. Residual CV was solubilized by the addition

of 200µL of 20:80 acetone:ethanol to each well and absorption quantified using a

microplate reader set at A570 nm wavelength. Absorption values for each strain are the

means of three readings of five wells from three assays. The means were compared by

analysis of variance (ANOVA) and separated by Student-Newman-Keuls (SNK)

multiple range test using Statgraphics Plus for Windows 4.1 (Statistical Graphics,

Rockville, MD).

Viability of the bacteria in aggregates was confirmed by assay of strain Xcc

306pUFZJLVA which fluoresces only when cells are viable (Cubero et al., 2011).

Aggregates were visualized by confocal laser scanning microscopy (CLSM).


153

3.3. Adhesion to plant surfaces

For the assessment of adhesion to plant surfaces, bacteria cultured overnight in LB broth

were diluted to 108

cfu mL-1

and spray-inoculated onto young plants of Mexican lime

(C. aurantifolia) and Swingle citrumelo (Poncirus trifoliata × C. paradisi) or Mexican

lime and grapefruit (C. paradisi) fruits. After inoculation, plants and fruits were

incubated in a growth chamber using a light/dark photoperiod of 16 and 8 hours

respectively for 20 days at 27ºC. Xcc MIpUFZJLVA (type A), Xcc 12879pUFZJLVA

(type Aw) and F1pUFZJLVA strains were used to evaluate biofilm formation and

bacterial viability on leaf and fruit surfaces. Inoculated leaves were examined at 24, 72,

216 h post inoculation (hpi) and inoculated fruit at 24 and 96 hpi by scanning electron

microscopy (SEM) and CLSM. For SEM, the leaves were fixed with 3% of

glutaraldehyde in 1M KPO4 buffer, then post fixed in 2% of OsO4 in 1M KPO4 buffer.

After washing in SDW, samples were dehydrated in an ethanol series and critical-point

dried with CO2. The samples were mounted on metal stubs and coated in

gold/palladium. SEM observations were made with a Hitachi S530 microscope. For

CLSM a small piece of the leaf or the fruit rind was mounted on a glass slide and

visualized under a Leica TCS-SL confocal microscope.

3.4. Swimming motility

To evaluate swimming motility, bacteria were grown in LB broth to the log phase.

Bacterial cells were harvested by washing twice with 10 mM MgCl2, then resuspended

in 1 mL of 10mM MgCl2 and centrifuged at 6350 g for 15 minutes. The supernatant was

removed and the pellet was inoculated with a toothpick in the centre point of plates of

XVM2 medium made with agar 3 g L-1

, or Minimal Medium A (MMA) (40 mM

K2HPO4, 22 mM KH2PO4, 0.4 mM Mg2SO4•7H2O, 7.5 mM (NH4)2SO4, 1.7 mM

sodium citrate, and 3 g agar L-1

SDW), LB (0.3% agar ) or peptone-yeast-malt extract

(PYM) medium (5 g L-1

peptone, 3 g L-1

yeast extract, 3 g L-1

malt extract, 10 glucose

and 3 g agar L-1

SDW). The plates were incubated at 27ºC at 100% relative humidity for

7 d. Colony diameter was measured at 1, 4 and 7 dpi. The increase in diameter of the

colony between 1 and 4 dpi for three replicates from at least three assays was compared

among Xanthomonas strains by ANOVA and SNK multiple range test as described

above.


4. Results

4.1. Adhesion and biofilm formation on an inert surface

Xanthomonas strains formed differing amounts of biofilm on an inundated

polypropylene surface depending on whether they were cultured in LB, a nutrient rich

broth, or XVM2 broth that simulates apoplast conditions (Figure 1). Viability of the

bacterial strains expressing a labile GFP in the biofilms was confirmed by CLSM

(Figure 2). Fluorescence of cells was detected after 6 days of desiccation in the adhesion

assay, confirming that the aggregates were bacterial biofilms and not artifacts.

When propagated in LB medium, the wide host range strain Xcc A formed significantly

(P<0.05) more biofilm than restricted host range strains Xcc Aw and Xcc A*(Figure 1).

Compared with Xcc strains, Xac produced an intermediate amount of biofilm.

Production of biofilm by the non-citrus strain Xc was similar to Xcc Aw and Xcc A*. All

bacterial strains formed significantly (P<0.05) more biofilm when grown in XVM2

medium than in LB medium. The highest biofilm formation response in XVM2

compared LB was measured for Xcc A*.

Figure 1. Biofilm formation by Xanthomonas strains [X. citri subsp. citri strains: 306

(XccA), 12879 (XccAw), Iran2 (XccA*); Xc1609 of X. campestris pv. campestris (Xc)

and F11 of X. alfalfae subsp. citrumelonis (CBS)] on polypropylene surface quantified

by absorbance of crystal violet stain. Values are means of three assays. Error bar

represents the standard deviation (SD) from the mean of three measurements from five

different wells. Bars labelled with different letters are significantly different according

to Student-Newman-Keuls multiple range test (P<0.05). Lower case letters refer to

differences among the strains grown in LB medium, upper case letters refer to

differences among the strains grown in XVM2 medium.


155

Figure 2. Confocal Laser scanning microscopy of viable aggregates of

Xanthomonas citri subsp. citri strain 306pUFZJLVA expressing

unstable GFP protein. The image represents an average projection of a

series of pictures from single section inside the aggregates.

4.2. Adhesion and biofilm formation on plant surfaces

Bacterial aggregation was demonstrated to occur on Mexican lime or Swingle citrumelo

leaves for all citrus Xanthomonas strains. However, differences in the amount and

structure of the biofilm varied among the strains depending on the host. Variation in the

quantity and viability of the aggregates on the leaf surface were confirmed by CLSM

using the unstable GFP expressing strains (Figure 3). For Swingle citrumelo inoculated

with Xcc A and Xac, viable aggregates were detected on the leaf surface one day post

inoculation (dpi) (Figure 3a & c), whereas no viable aggregates of Xcc Aw strain were

detected (Figure 3b). At 9 dpi, Xcc A and Xac were found in the intercellular spaces of

Swingle citrumelo leaves (Figure 3d & f). By comparison at 9 dpi, almost no Xcc Aw

aggregates were detected on the surface or inside the leaves of non-host Swingle

citrumelo (Figure 3e).


Figure 3. CLSM of aggregates formed on leaf surfaces by Xanthomonas citri subsp. citri type A (a, d, g,

j) or type Aw (b, e, h, k) and Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (c, f, i, l) on Swingle citrumelo (a,

b, c, d, e, f) or Mexican Lime (g, h, i, j, k, l) and 1 (a, b, c, g, h, i) or 9 (d, e, f, j, k, l) days after leaf

inoculation. Main images represent a single section of a part of the leaf surface. Two lateral views (x-z

and y-z planes) corresponding to cross sections of image series are shown below and on the right of the

main image.

Contrasting strain interactions were observed for Mexican lime which is susceptible to

all the citrus Xanthomonas strains. At one dpi, i.e. almost no viable Aw bacteria were

detected on leaves (Figure 3h), whereas a few viable cells of Xcc A strain were found

(Figure 3g). In contrast, a high concentration of Xac strain was detected on Mexican

lime leaves (Figure 3i). At 9 dpi, a few viable aggregates of Xcc A were detected on the

surface of Mexican lime leaves (Figure 3j) while extensive viable aggregates of Xac

were observed (Figure 3l). Viable cells of all the three citrus Xanthomonas strains were

found extensively in the intracellular space of Mexican lime leaves (Figure 3j, k & l).


157

Figure 4. CLSM of fruit infections by Xanthomonas citri subsp. citri type A (a, b) or type Aw (c, d) or

Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis (e, f) on grapefruit fruit (a, c, e) or Mexican Lime (b, d, f) at 1

day post inoculation. Main images represent a single section of a part of the leaf surface. Two lateral

views (x-z and y-z planes) corresponding to cross sections of image series are shown below and on the

right of the main image.


Similar host strain interactions were shown when citrus xanthomonads were spray-

inoculated on fruit of Mexican lime and grapefruit (Figure 4). Aggregates of Xcc A or

Xcc Aw were detected at one dpi of Mexican lime fruit (Figure 4b & d), and of Xcc A on

grapefruit (Figure 4a) whereas on grapefruit only a few viable aggregates of Xcc Aw

were detected (Figure 4c). Xac also formed few viable aggregates on fruit surfaces of

Mexican lime and grapefruit (Figure 4e & f).

When inoculated leaves and fruits were observed at one dpi with SEM (Figure 5 &

Figure 6) and CLSM (Figure 7), Xcc A had developed interwoven fibers around the

cells (Figure 5a, d, & S2) and Xcc Aw formed linear fibers of less intricate structure

compared to those produced by Xcc A (Figure 5b & e). Xac displayed an intermediate

phenotype, i.e. linear structures, more complex than those formed by Aw strains (Figure

5c & f). No aggregates were formed by Xac on fruit of either grapefruit or Mexican lime

(Figure 6e & f) and by Xcc Aw on grapefruit (Figure 6c), but numerous aggregates were

observed for the wide host range Xcc on both fruit (Figure 6a & b) and for Xcc Aw on

Mexican lime fruit (Figure 6d). After 20 d, linear structures were observed by SEM on

Mexican lime leaf for Xcc Aw but not Xcc A (Figure 8).

Figure 5. Scanning electron microscopy of leaf infections by Xanthomonas citri subsp. citri type A (a, d)

compared with type Aw (b, e) or X. alfalfae subsp. citrumelonis (c, f) on Mexican Lime (a, b, c) and

Swingle citrumelo (d, e, f) at 24 h post inoculation.


159

Figure 6. Scanning electron microscopy of fruit infections by citrus xanthomonads on fruit of grapefruit

(a, c, e) or Mexican lime (b, d, f) at 4 d post inoculation. a and b.Biofilm developed by 4 d post

inoculation for wide host range Xcc A strain on grapefruit or Mexican lime (a, b) or for the restricted host

range Xcc Aw strain inoculated on Mexican lime (d), compared with patchy development for the restricted

host range Xcc A strain on grapefruit (c) and lack of biofilm formation for Xac strain on grapefruit and

Mexican lime (e, f).


Figure 7. CLSM of infections by Xanthomonas citri subsp. citri type A

(MIpUFZJLVA) on Mexican lime fruit surface at 24 h post inoculation. The image

shows the maximum projection of a series of pictures from single sections of the

inoculated fruit.

Figure 8. Scanning electron microscopy of stomatal infections by Xanthomonas citri

subsp. citri Aw on Mexican lime leaf 20 d post inoculation.


161

4.3. Swimming motility

Motility of citrus xanthomonads and Xc was assayed in both minimal and rich semisolid

agar media plates over a 7 d period. Swimming occurred in minimal media (MMA and

XVM2) (Figure 9), but was restricted in rich media (PYM or LB) that promoted rapid

growth of large colonies on the agar surface. Analysis of swimming motility on MMA

and XVM2 revealed significant differences (P<0.05) among the Xanthomonas strains

(Figure 9).

Figure 9. Swimming motility of Xanthomonas spp. on MMA medium plates at 96 h post inoculation. Five

strains from citrus: a. Xcc A 306, b. Xcc A 62, c. Xcc A* Iran 2, d. Xcc Aw 12879, e. Xac F11 and one

strain from cabbage f. Xc 1609.The graph shows the mean diameter of colonies formed by Xanthomonas

strains: X. citri subsp. citri strains (Xcc A): 306 and 62, 12879 (Xcc Aw), Iran2 and Iran10 (Xcc A*)

causing citrus bacterial canker (CBC), Xac F11 causing citrus bacterial spot (CBS) and Xc 1609 causing

crucifer black rot (CBR) on minimal medium A (MMA) and XVM2 medium. Error bar represents the

standard deviation (SD) of mean of three different assays with three replicates in each assay. Student-

Newman-Keuls multiple range test (P<0.05). Lower case letters refer to differences among the strains in

MMA medium, capital letters refer to differences among the strains in XVM2 medium.


In XVM2 medium Xcc Aw and Xcc A* displayed greater swimming motility than the

other xanthomonads. Xac and Xc produced an intermediate swimming phenotype

between wide and restricted citrus host range strains of Xcc A. Xcc A produced satellite

colonies at the edge of the swimming halo whereas Xcc Aw and Xcc A* did not. This

colony phenotype was also observed for the Xcc A strain expressing GFP (Figure 10).

Figure 10. Swimming motility on MMA medium 0,3 agar plates at 96 hpi

of Xcc 306 expressing GFP in the stable plasmid PUFZ75. Microcolonies

are shown at the edge of the swimming halo. Magnification: 40X.


163

5. Discussion

Biofilm functions as an important virulence factor in Xcc A (Huang et al., 2013;

Malamud et al., 2011; Malamud et al., 2013; Rigano et al., 2007; Torres et al., 2007).

Moreover, Xcc A establishment on leaf and fruit surfaces is dependent on biofilm

formation (Cubero et al., 2011; Favaro et al., 2014; Li and Wang, 2011b; Malamud et

al., 2011; Rigano et al., 2007; Zimaro et al., 2014). The present study identified

differences in biofilm production by wide and restricted host range strains of Xcc and

other xanthomonads depending on culture nutritional conditions and citrus host. Our

finding that greater biofilm formation occurred on minimal than rich media confirms a

previous report by Rigano et al. (2007). Less biofilm formation after growth in LB

medium may be a response to abundant nutrients and absence of stress (Petrova &

Sauer, 2012). Moreover, the biofilm response of restricted host range strains Xcc Aw and

A* in XVM2 medium, that simulates the apoplast, was more varied than for the wide

host range Xcc A. The apoplast is a nutrient-limited environment where the bacterium is

stressed by not only nutrient limitation, but also plant defense agents (Rico et al., 2009).

Greater biofilm production response of the restricted host range strains is maybe

indicative of less tolerance of biotic and abiotic stresses compared to wide host range

strains.

Biofilm formation on leaves and fruits by the three citrus xanthomonads, Xcc A, Xcc

Aw, and Xac, demonstrated a specific ability to produce viable biofilm on citrus hosts

versus non-hosts. Lower ability or inability of Aw to form biofilm, and therefore to

survive, on Swingle citrumelo leaves and on grapefruit fruit and of Xac strain on fruits

is consistent with the non-host status of these strains (Graham et al., 1992; Sun et al.,

2004). CBC resistance of ‘Okitsu’ mandarin has been partially explained by the reduced

ability of Xcc to produce biofilm on the leaf surface (Favaro et al., 2014). After artificial

inoculation of Duncan grapefruit by infiltration, Xcc Aw colonized the apoplast and

produced a hypersensitive response (Vernière et al., 1998; Sun et al., 2004).

Furthermore, the filamentous aggregates formed by Xcc Aw might not be as protective

as the more complex biofilm structures produced by Xcc A, perhaps a sign of

incompatibility of Aw with grapefruit.

Attachment to surfaces is dependent on the tissue surface conditions as well as the

bacterial genotype (Petrova & Sauer, 2012). In Xanthomonas, adhesive structures may


have evolved as an adaptation to the host environment the bacterium colonizes

(Mhedbi-Hajri et al., 2011a). Factors produced by the compatible host Mexican lime

may activate biofilm formation in citrus xanthomonads as all are able to colonize both

outside and inside the host tissue. Differences in transcription of genes possibly linked

to biofilm formation have been described when these strains are cultured in apoplast

simulating XVM2 medium (Jalan et al., 2013a; Jalan et al., 2013b). Regarding Xac

compared to Xcc 306, some variation has been identified in lipopolysaccharide and the

type IV pilus (Jalan et al., 2011) which participate in biofilm formation in Xanthomonas

and other plant pathogens (Mhedbi-Hajri et al., 2011b). Genomic and transcriptomic

variation could explain differences in adhesion, biofilm formation in vivo and in vitro

and bacterial motility.

Bacterial motility promotes entry into stomata or wounds. Flagellar dependent motility

allows bacteria to locate specific sites for adhesion and functions in biofilm formation,

initial attachment, maturation and dispersal (Danhorn & Fuqua, 2007). Differential

swimming ability among strains was observed in both XVM2 and MMA media. Higher

swimming motility was observed for restricted host range CBC strains. Meanwhile,

wide host range CBC strains showed more limited swimming ability with the

production of satellite colonies described before for motility mutants in Aeromonas

hydrophila AH-3 (Wilhelms et al., 2011). A relationship between swimming ability in

XVM2 media and biofilm formation was found. Narrow host range citrus Xanthomonas

strains that formed more biofilm also showed greater swimming ability in XVM2. This

relationship is supported by previous work wherein mutants lacking flagellin and

flagellar hook proteins were unable to swim, and produced less biofilm than the wild

type Xcc (Malamud et al., 2011). XVM2 has also been demonstrated to upregulate

several virulence related genes in xanthomonads (Astua-Monge et al., 2005; Jalan et al.,

2013a; Schulte and Bonas, 1992).

Our hypothesis is that although biofilm formation is not an essential step in the disease

cycle, it facilitates the bacterial entry and establishment in the substomatal chamber.

This may explain in part the ability of wide host range CBC strains to infect several

citrus species. On the other hand, restricted host range Xcc strains, which require a more

specific niche than the wide host range strains for infection, have higher swimming

ability to enable location of the colonization site in the substomatal chamber. Although

host range cannot be entirely explained by the different motility and biofilm formation


165

by citrus Xanthomonas strains, our results support the putative role of biofilm formation

in the initial steps of the infection process. Aggregation formation and structure appear

to be specific for the interaction between Xanthomonas strains and their compatible

host.

Acknowledgements


CRDF546 as well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraría y


INIA.

167

CAPÍTULO 6: PRESENCIA DE ADN

EXTRACELULAR DURANTE LA FORMACIÓN

DE BIOPELÍCULAS EN Xanthomonas DE

CÍTRICOS Y CRUCÍFERAS

Enviado a Microbiology

Presence of extracellular DNA during biofilm formation in

Xanthomonas strains from citrus and cabbage

Marta Sena-Vélez1, Cristina Redondo

1, James H. Graham

2 and Jaime Cubero

1


La Coruña Km 7.5 (Madrid), Spain. 2University of Florida, Citrus Research and

Education Center (CREC), 700 Experiment Station Road, Lake Alfred, FL 33850, USA

Capítulo 6. Presencia de ADN extracelular durante la formación de biopelículas en Xanthomonas de

cítricos y crucíferas

169

1. Summary

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) A strain causes citrus bacterial canker, a serious

leaf, fruit and stem spotting disease of several Citrus species, X. alfalfae subsp.

citrumelonis (Xac) is the cause of citrus bacterial spot, a minor disease of citrus nursery

plants, and X. campestris pv. campestris (Xc), is a systemic pathogen that causes black

rot of cabbage. Xanthomonas spp. form biofilms in planta that facilitate the host

infection process. Herein, the role of extracellular DNA (eDNA) was evaluated in the

formation and stabilization of the biofilm matrix. The presence of eDNA in biofilm was

confirmed for several Xcc strains and Xac. DNAse treatments of Xcc strains and Xac

reduced biofilm formation at the initial stage of development as well as disrupted

preformed biofilm. The DNAse effect on formation or disruption varied among Xcc

strains and Xanthomonas species and indicates differing roles for eDNA. Differences in

fiber structures containing eDNA in biofilms, bacterial cultures, and in twitching

motility assays were detected by SYTO-9 staining and fluorescence microscopy. The

proposed roles for eDNA in the early stages of biofilm formation are as an adhesin and

in mature biofilms as a structural component.



170

2. Background

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (formerly X. axonopodis pv. citri) is the causal

agent of Asiatic citrus bacterial canker (CBC), a serious disease of many citrus species

(Graham et al., 2004; Schaad et al., 2006). X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac) is the

cause of citrus bacterial spot (CBS), a minor foliar disease of young citrus plants in

nurseries (Graham and Gottwald, 1990). Xcc produces necrotic lesions on leaves, twigs

and fruits that reduces fruit quality and marketability and restrict commercialization of

plants and fruits in markets free of CBC (Graham et al., 2004). Xcc A strain is by far the

most severe and widespread CBC pathogen and affects the widest range of Citrus

species. Within Xcc A strains, two limited host range variants have been described, Xcc

A* and Aw from Southwest Asia and Florida, respectively, that cause CBC on Mexican

lime (Citrus aurantifolia) (Cubero & Graham, 2002; Jalan et al., 2013a; Jalan et al.,

2013b; Sun et al., 2004; Verniere et al., 1998). X. campestris pv. campestris (Xc) is the

causal agent of black rot, one of the most important diseases of crucifers worldwide.

Black rot is a systemic vascular disease that causes symptoms including marginal leaf

chlorosis, necrosis, and darkening of leaf veins and vascular tissue within the stem

(Hayward, 1993; Vicente and Holub, 2013).

Biofilms adhere bacteria to surfaces within a tridimensional structure that protects the

bacterium against antibiotics and abiotic stresses (Busscher and van der Mei, 2012;

Costerton et al., 1999; Cubero et al., 2011; Petrova and Sauer, 2012). Biofilms are

composed of 10% bacteria and 90% extracellular polymeric matrix (Flemming &

Wingender, 2010). The extracellular matrix provides resistance to temperature, pH and

other deleterious conditions and also confers mechanical stability. The extracellular

matrix is composed of water, proteins, extracellular DNA (eDNA), exopolysaccharide,

lipopolysaccharide, lipids and surfactants (Flemming & Wingender, 2010; Strelkova et

al., 2013).

Xcc produces biofilm to facilitate the infection process (Cubero et al., 2011; Rigano et

al., 2007). Several mechanisms in Xcc contribute to biofilm formation during the host-

pathogen interaction: adhesins, type III secretion system, lipopolysaccharide,

exopolysaccharide, type IV pili and chemotaxis (Dunger et al., 2014; Gottig et al.,

2009; Li & Wang, 2011; Malamud et al., 2010; Malamud et al., 2013; Moreira et al.,

2014; Rigano et al., 2007; Sgro et al., 2012; Yaryura et al., 2015; Zimaro et al., 2014).



171

Furthermore, biofilm formation in planta is related to the different host range of Xcc

strains (Sena-Vélez et al., 2014).

eDNA is an important component of the extracellular matrix in biofilms for several

Gram-positive, Gram-negative bacteria (Conover et al., 2011; Das et al., 2010; Hall-

Stoodley et al., 2008; Nemoto K. et al., 2003; Vilain et al., 2009; Whitchurch et al.,

2002) and archaea (Chimileski et al., 2014). The presence of eDNA in the extracellular

matrix was described in 1956 (Catlin, 1956). The importance of eDNA in biofilm

formation was first demonstrated for Pseudomonas aeruginosa in the early stages of

bacterial adhesion (Whitchurch et al., 2002). In clinical isolates of the same species,

eDNA was also found to be important for stability of the biofilm (Nemoto K. et al.,

2003). In P. aeruginosa biofilms eDNA coats the surface like a net in which bacteria are

attached, and may also form a mushroom-like cap over the outer surface of the

aggregate (Allesen-Holm et al., 2006). Besides biofilm formation, eDNA contributes to

bacterial resistance to antibiotics, e.g., a Bacillus cereus mutant, that did not produce

eDNA, was more susceptible to actinomycin D than the wild type (Vilain et al., 2009).

eDNA has been demonstrated to be a nutrient source of phosphorus, nitrogen and

carbon. DNAse in P. aeruginosa secreted via Type II Secretion System is related with

nutrient acquisition, biofilm dispersal and horizontal gene transfer (Bakkali, 2013;

Jakubovics et al., 2013; Mulcahy et al., 2010). At high concentrations, eDNA produces

antimicrobial activity by chelating cations and destabilizing the bacterial outer

membrane through lipopolysaccharide modification (Mulcahy et al., 2008). These

findings identify eDNA as an important component of the extracellular matrix that plays

a role in several processes related to bacterial colonization and virulence.

The roles that eDNA play in attachment and biofilm formation are not well

characterized for plant-bacterial pathogen interactions. Presence of eDNA in the

extracellular matrix and in the different phases of biofilm formation have not been

extensively studied for Xanthomonas spp. Herein, we report on the contribution of

eDNA to biofilm formation for several pathogenic strains of Xanthomonas from citrus

and one from cabbage. In these studies, eDNA was visualized by fluorescence staining

of bacterial cultures, biofilms and motile bacteria.



172

3. Methods

3.1. Bacterial strains, culture media and growth conditions

Bacterial strains used in this study and their natural hosts are listed in Table 1. Two

wide host range strains of Xcc A, and two narrow host range strains, A* and Aw, were

evaluated along with X. alfalfae subsp. citrumelonis and X. campestris pv. campestris.

Bacterial strains were routinely grown in Luria Bertani (LB) broth (10 g tryptone, 5 g

yeast extract and 5 g sodium chloride per litre) or on LB plates (1.5% bacteriological

agar) at 27ºC for 48 h.

Table 1. Strains of Xanthomonas spp. used in the study

‡Citrus Bacterial Canker (CBC),

†Citrus Bacterial Spot (CBS) and

ǁCrucifer Black Rot (CBR).

3.2. Determination of eDNA in biofilms

To confirm the presence of eDNA in xanthomonads biofilm, DNAse

(Deoxyribonuclease I from bovine pancreas; Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA)

was added at different concentrations to static cultures of Xanthomonas strains at

different times. To evaluate biofilm formation, bacterial cultures in log growth phase

were washed twice with 10mM MgCl2 and suspended at 108 cfu mL

-1 in XVM2

medium (20 mM NaCl, 10 mM (NH4)2SO4, 5 mM MgSO4, 1 mM CaCl2, 0.16 mM

KH2PO4, 0.32 mM K2HPO4, 0.01 mM FeSO4, 10 mM fructose, 10 mM sucrose, 0.03%

casamino acid) (Wengelnik et al., 1996; Astua-Monge et al., 2005). Microtiter plate

wells were filled with 200 µL of the bacterial culture and incubated without shaking for

72 h at 27ºC. After removing the medium, bacteria were incubated for an additional 72

h. Biofilm formation was measured after rinsing the plates with sterile distilled water

(SDW) and staining with 0.3 % crystal violet (CV) for 15 min. Excess stain was

removed by rinsing the plates with SDW. Residual CV in each well was solubilized in

Strain Taxon, or disease and CBC type Natural Host

Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC‡ A Citrus spp.

Xcc 62 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Citrus spp.

Xcc Iran 2 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A* C. aurantifolia

Xcc Aw 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A

w C. aurantifolia

Xac F1 Xanthomonas alfalfae subsp. citrumelonis, CBS† Citrus spp.

Xc 1609 Xanthomonas campestris pv. campestris CBRǁ

Cabbage



173

200µL of an acetone (20%), ethanol (80%) mixture and the absorption of the extract

measured in a microtiter plate reader set at A570 nm wavelength. Absorption values for

each strain and treatment were calculated as the mean of readings from three wells from

at least three different assays. The means were compared by analysis of variance

(ANOVA) and separated by Student-Newman-Keuls (SNK) multiple range test using

Statgraphics Plus for Windows 4.1 (Statistical Graphics, Rockville, MD).

For the different treatments, DNAse I was suspended in 0.15 M of NaCl and then in

DNAse I reaction buffer (10mM of MgCl2 and 50% of glycerol suspended in 10mM of

Tris-HCl at pH 7.5) as previously described (Conover et al., 2011). DNAse I was added

at concentrations of 20 or 40 Kunitz mL-1

at 0, 24, 48 and 72 h post bacterial seeded

(hps) to evaluate eDNA effect on biofilm development or on preformed biofilm. In

order to determine if variation in biofilm was affected by the reaction buffer, a control

treatment with the buffer without DNAse I was included.

3.3. eDNA staining

To detect eDNA, samples were stained with SYTO-9 from the Live/Dead Bacterial

viability kit (Molecular Probes Europe BV; Leiden, The Netherlands) and observed with

fluorescence microscopy. CV staining was also performed to visualize extracellular

structures as previously described for flagella staining of Xcc (Kraiselburd et al., 2012).

Biofilm formation was assayed as described above. In the assay, 25 mL of the bacterial

culture in XVM2 and LB media was incubated without shaking at 27ºC in a 50 mL

borosilicate flask. After 72 h, bacteria growing on the bottom of the flask were collected

and stained either with SYTO-9 for 20 min in the dark or with CV. For mature biofilm,

the liquid medium was decanted and the flasks were incubated an additional 72 h. To

stain mature biofilm, bacteria were collected by adding 50µL of SDW and scraping

them from the bottom of the flask followed by the staining procedures described above.

To evaluate twitching motility, bacteria in log growth phase were washed twice with

10mM MgCl2 and suspended in 1.0 mL of MgCl2 in a 1.5 mL centrifuge tube. Bacteria

were then centrifuged at 10,000 g for 10 min and the supernatant was discarded.

Bacteria were inoculated with a toothpick in PYM agar medium (Peptone 0.5%, Yeast

extract 0.3%, Malt extract 0.3% and bacteriological agar 1%) supplemented with 2%

glucose. Plates were incubated at 27ºC for 7 d. To stain twitching bacteria, the medium

was removed and the bacterial colony present on the bottom plate stained with SYTO-9



174

or CV. After 20 min of staining, plates were washed with SDW and observed under the

light and fluorescence microscope.

4. Results

4.1. Importance of eDNA in Xanthomonas biofilms

The role of eDNA in biofilm formation by Xanthomonas strains was estimated by

measuring biofilm formation after DNAse I treatment at 0, 24, 48 or 72 hps. Biofilm

formation was compared in XVM2 medium, XVM2 medium plus buffer, and XVM2

medium plus buffer and DNAse I at 20 or 40 Kunitz mL-1

. In most cases, reduction of

biofilm formation was dependent on the timing of DNAse I treatment (Fig. 1).

Figure 1. Biofilm formation after treatment with DNAse I at different times after bacterial seeded with

different Xanthomonas species and strains (see Table 1). (a) DNAse added at 0 h post seeded (hps), (b)

DNAse added at 24 hps, (c) DNAse added at 48 hps, and (d) DNAse added at 72 hps. The absorbance

values were normalized to the control XVM2 plus buffer in order to compare the response for different

strains. Error bars represent the standard deviation. Graphs are a representative assay of at least three

assays with three replicates per assay. Statistical analyses were performed using STATGRAPHICS Plus,

version 5.1 (Copyright Manugistics Inc.).



175

Reduction of biofilm was significant (p<0.05) for citrus Xanthomonas strains and

DNAse I application time. In contrast, DNAse I reduction of biofilm formation by Xc

1609 strain was inconsistent. Citrus Xanthomonas strains varied widely in response to

DNAse I; at 0 hpi, DNAse I significantly (p>0.05) reduced biofilm production by all

citrus strains and no differences were observed between DNAse concentrations, Fig.

1(a); at 24 and 48 hpi, DNAse I did not reduce biofilm formation by wide host range

Xcc strains but reduced production by narrow host range Xcc strains and Xac, Figs. 1(b)

& (c); at 72 hpi, DNAse I only reduced biofilm production by the Iran 2 strain, Fig.

1(d).

4.2. Importance of eDNA in preformed biofilm

To evaluate the role of eDNA in mature biofilms, DNAse I treatments for 1 h or

overnight were performed. Biofilm disruption was observed after both incubation

periods but overnight treatment had greater effect, Fig. 2. DNAse I treatment for 1 h did

not produce a significant (p>0.05) effect for strains Xcc 306 and Xc 1609, but

significantly (p<0.05) reduced biofilm for strains Xcc 62, 12789, Iran 2 and Xac F1,

Fig. 2(a). Overnight treatment of citrus Xanthomonas strains with DNAse I reduced

biofilm up to 80-90%, Fig. 2(b). Similar treatment did not significantly (p>0.05) reduce

biofilm of Xc 1609 compared to the buffer control. Reduction of biofilm was greater for

Xcc strains than Xac F1 or Xc 1609.

Figure 2. Effect of DNAse treatment on preformed biofilms. (a) DNAse treatment of 1 hour of duration.

(b) DNAse treatment for an overnight period. The absorbance values were normalized to the control

XVM2 plus buffer in order to compare the response for different strains. Error bars represents the

standard deviation. Graphs are a representative assay of at least three assays with three replicates per

assay.



176

4.3. Detection of eDNA in Xanthomonas strains

Presence of eDNA in Xanthomonas biofilms was confirmed by SYTO-9 and CV

staining of static bacterial cultures at different stages of biofilm formation, Figs. 3 & 4.

SYTO-9 penetrated bacterial membranes and stained eDNA as previously reported

(Böckelmann et al., 2006; Lawrence et al., 2003). Furthermore, eDNA was observed in

bacterial cultures in the exponential growth phase, Figs. 5 & 6, and in twitching motility

assays, Fig. 7.

eDNA in Xanthomonas strains appeared as long fibers of variable thickness and as an

amorphous mass surrounding bacterial cells, Figs. 3, 4, 5, 6 & 7. Fibers of eDNA were

observed in static cultures after 72 h (early stage of biofilm formation) as well as in

biofilms, Figs. 3 & 4 respectively. For strains Xcc 306, Figs. 3 & 4(a), (b), (c) & (d) and

12879, Figs. 3 & 4(e), (f), (g) & (h), on LB and XVM2 media, the fibers appeared to

interconnect cells in the aggregates. The fibers shown after staining with CV, Figs. 3 &

4(a), (c), (e) & (g) were similar to those observed after staining with SYTO9, Figs. 3 &

4(b), (d), (f) & (h), suggesting the fibers were high in eDNA content. Similar results

were observed in the twitching motility assay, Fig. 7. eDNA fibers produced by the

limited host range strains Xcc 12879 and Iran 2, Figs. 7(c), (d), (e) & (f) were longer

than the fibers produced by Xcc 306, Figs. 7(a) & (b). Differences in the development of

eDNA fibers were also observed between Xcc 306, Fig. 5(a) and 12879, Fig. 5(b), in log

growth phase in LB media.



177

Figure 3. Light (a), (c), (e) & (g) and fluorescence (b), (d), (f) & (h) microscopy (1000X magnification) of

72 h static cultures on LB (a), (b), (e) & (f) or XVM2 (c), (d), (g) & (h) media. Strains Xcc 306 (a), (b),

(c) & (d) and Xcc 12879 Aw (e), (f), (g) & (g) stained with crystal violet (CV) at the early stages of

biofilm formation of Xcc visualized in LB medium as fibers interconnecting cells at different stages of

aggregation, from one to several cells (a) & (e). SYTO-9 staining revealed similar fiber structures (b) &

(f). In XVM2 medium, fibers were thicker and more consistent after staining with CV (c) & (g) and

SYTO-9 (d) & (h). eDNA in XVM2 medium appeared to cover the surface like a sheet rather than as

individual fibers (c) & (d).



178

Figure 4. Light (a), (c), (e) & (g) and fluorescence (b), (d), (f) & (h) microscopy (1000X magnification)

of mature biofilms on LB (a), (b), (e) & (f) or XVM2 (c), (d), (g) & (h) media. Strains Xcc 306 (a), (b),

(c) & (d) and Xcc 12879 Aw (e), (f), (g) & (h) were more aggregated in XVM2 than LB. A high level of

aggregation for strain 12879 in XVM2 made it difficult to observe eDNA fibers in aggregates (g) & (h).

In XVM2, strain 306 (c) & (d) was less aggregated and crystal violet (CV) and SYTO-9 staining revealed

eDNA surrounding the cells (c) & (d). In LB, CV (a) & (e) and SYTO-9 (b) & (f) staining of strains

revealed long fibers interconnecting aggregates. Strain 306 fibers had a lattice structure (a) & (b), while

strain 12879 strain had parallel fibers (e) & (f).



179

Figure 5. Fluorescence microscopy (1000X magnification) of Xcc 306 (a) and Xcc Aw 12879 (b) in LB

broth at exponential growth phase stained with SYTO-9. A high level of eDNA fibers was produced by

both strains. Fibers appeared to connect cells over a long distance (b). Xcc Aw 12879 fibers were well

developed while strain 306 fibers were more diffuse.

Figure 6. Flourescence microscopy (1000X magnification) of a pelleted culture of Xcc Aw

12879 at exponential phase in LB broth stained with SYTO-9. The bacterial aggregate

appeared to be breaking due to the forces between the slide and the coverslide, and the eDNA

fibers connecting the sides of the rupture. Abundant fibers appeared to stabilize aggregates.



180

Figure 7. Light (400X magnification) and fluorescence microscopy (1000X magnification) of

Xcc twitching motility in PYM agar medium. Cultures were stained with crystal violet (CV)

(a), (c), & (e) or SYTO-9 (b), (d) & (f). Twitching motility was observed between the plate

surface and the medium. CV and SYTO-9 staining of strains Xcc 306 (a) & (b), Xcc Aw

12879 (c) & (d) and Xcc Iran 2 (e) & (f) revealed similar twitching structures. Fibers

observed after CV staining appeared to have a high eDNA content. Twitching structures were

longer for Xcc Aw 12879 than for Xcc 306.

5. Discussion

Extracellular DNA (eDNA) is an important component of the biofilm matrix in several

bacteria, playing roles in adhesion, aggregate stability, nutrition, protection and gene

exchange (Bakkali, 2013; Jakubovics et al., 2013; Mulcahy et al., 2008; Mulcahy et al.,

2010; Vilain et al., 2009; Whitchurch et al., 2002). In this study, eDNA was detected at



181

different stages of biofilm formation for Xanthomonas strains from different host plants.

In many cases, DNAse treatment reduced or disrupted biofilm depending on the strain

and the biofilm stage. DNAse did not cause mortality or reduce bacterial growth rate,

but was limited to the effect on biofilm formation. When DNAse treatment terminated,

bacterial attachment to the surfaces and aggregation resumed thereafter.

eDNA has been described as an adhesin in B. cereus (Vilain et al., 2009),

Staphylococcus epidermis, S. aureus, S. mutants (Das et al., 2010) and P. aeruginosa

(Whitchurch et al., 2002). Herein, similar eDNA properties were demonstrated for

citrus strains of Xanthomonas. eDNA appeared to be important for the early stages of

attachment by wide host range Xcc strains, whereas narrow host range strains required

eDNA for biofilm development over an extended period. This difference may be related

to biofilm formation in vitro and in planta for these two host range types. In planta, at

24 hpi, wide host range Xcc strains produced more complex structures in biofilms than

the narrow host range Xcc strains and Xac strain which aggregated by producing long

fibers (Sena-Vélez et al., 2014). The less interconnected fibers of the narrow host range

Xcc strains and Xac strain may have rendered them more susceptible to DNAse

disruption of aggregated cells. Other extracellular structures such as fimbria or flagella

could influence biofilm formation and those structures may possibly be associated with

eDNA since most of the fibers observed with CV stain were also stained with SYTO-9.

The role of eDNA in the stability of biofilms is important for bacteria including

Escherichia coli, B. subtilis (Shields et al., 2013), S. mutants (Liao et al., 2014), some

strains of P. aeruginosa (Nemoto K. et al., 2003) and, as this study reports, strains of

Xcc and Xac. Mature biofilms of citrus strains, but not the crucifer strain Xc 1609, were

disrupted when exposed to DNAse. This observation suggests that the systemic

pathogen Xc has a low dependence on eDNA for biofilm formation, surface attachment

and stability of the biofilm. Our hypothesis is that as Xc moves systemically,

aggregation would not be occurring at the initial stage of the plant colonization, as

bacterial release from biofilms produces infection (Dow et al., 2003). Hence, the role of

eDNA depends on the structure and function of biofilm in plant colonization and

process depends on the xanthomonad-host interaction.

Biofilm has been described as major factor for Xcc virulence and survival in citrus

(Cubero et al., 2011; Rigano et al., 2007). Several factors influence biofilm for wide

host range Xcc strains. Mutants in the type IV pili produced biofilm but less structured



182

than that produced by the wild type strain (Dunger et al., 2014). Non-fimbrilar adhesins

have been described in the initial attachment of Xcc to abiotic surfaces (Gottig et al.,

2009). Our findings indicate that eDNA acts as an adhesin in conjunction with other

adhesins.

SYTO-9 staining and fluorescence microscopy detected eDNA in Xanthomonas

biofilms, cell cultures, and twitching motility assays as fibers interconnecting bacterial

cells. Fiber structure was confirmed by CV staining and indicates a high eDNA content

in the biofilm of citrus xanthomonads. Amorphous eDNA was also observed which is

possibly eDNA that has been recently secreted, but not processed into fibers.

Microscopic observation of a high eDNA content in biofilms is consistent with DNAse

disruption of preformed biofilm. These findings confirm the role of eDNA in

maintaining the structural integrity of xanthomonad biofilm.

Fibers were observed during biofilm formation in LB and XVM2 media. However the

fibers formed in XVM2 appeared to be thicker and more uniform than those in LB

medium, which is consistent with previous reports of higher biofilm formation in

XVM2 medium (Rigano et al., 2007;Sena-Vélez et al., 2014). In XVM2, a culture

medium that mimics apoplast conditions, several pathogenicity factors are expressed for

Xcc strains (Astua-Monge et al., 2005; Jalan et al., 2013a) and among them, eDNA

could be considered important for biofilm formation during plant infection. We also

found that eDNA is produced in the exponential growth phase as fibers interconnecting

cells, Figure 5, and furthermore, that bacterial aggregates appear to be stabilized by

eDNA fibers, Figure 6.

In P. aeruginosa, eDNA is a factor associated with twitching motility (Gloag et al.,

2013). Twitching is enabled through the extension and retraction of type IV pili

(Mattick, 2002) which bind to DNA (Cehovin et al., 2013; van Schaik et al., 2005).

SYTO-9 staining of twitching assay plates revealed the presence of fibers containing

eDNA that corresponded with the fibers observed when the twitching halo was stained

with CV. Twitching structures varied among limited and wide host range Xcc strains as

also observed for biofilm formation on plant surfaces (Sena-Vélez et al., 2014).

Twitching motility has recently been described for Xcc (Dunger et al., 2014; Sena-Vélez

et al., 2012). Twitching fibers of limited host range strains were longer than those of the

wide host range strains which had more interconnecting fibers. Interestingly Xcc cells



183

were always connected to eDNA fibers. In P. aeruginosa, eDNA along with surfactants

were secreted onto the surface as the bacterium was undergoing motility (Gloag et al.,

2013). Xcc appear to track the eDNA possibly through the type IV pilus since no

surfactant activity was confirmed for Xcc in our assays (results not shown). Our

hypothesis is that eDNA is secreted as fibers onto the surface as the bacterium initially

colonizes. This enables bacteria to twitch across the surface by binding the type IV pilus

with eDNA fibers deposited on the surface.

Many studies describe the disruption of eDNA in animal bacterial pathogens, for

examples, use of recombinant DNAse as a treatment against P. aeruginosa for cystic

fibrosis patients (Fuchs et al., 1994) and extracellular DNAse (NucB) from B.

licheniformis to inhibit and break bacterial biofilms (Nijland et al., 2010). Although

biofilm formation and motility are well-described virulence factors for many plant

pathogenic bacteria, occurrence and function of eDNA in plant pathogens is less well

known. The determination of roles of eDNA in plant pathogenesis will lead to a better

understanding of the plant-pathogen interaction and perhaps the development of tactics

to disrupt eDNA to effect bacterial disease control.

Acknowledgements


CRDF546 as well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraría y


INIA.

185

CAPÍTULO 7: CARACTERIZACIÓN DE LA

MATRIZ EXTRACELULAR PRODUCIDA

DURANTE LA FORMACIÓN DE BIOPELÍCULAS

EN CEPAS DE Xanthomonas citri subsp. citri CON

DISTINTA GAMA DE HUÉSPED

Characterization of extracellular matrix during biofilm formation and

surface motility for Xanthomonas citri subsp. citri strains with different

host range

Sena-Vélez, M.1,

Graham, J.H.2, Girón, J.A.

3, Redondo, C.

1, Cubero, J

1.




USA. 3 University of Florida, Emerging Pathogen Institute. Gainesville, FL USA.

Capítulo 7. Caracterización de la matriz extracelular producida durante la formación de biopelículas en

cepas de Xanthomonas citri subsp. citri con distinta gama de huésped

187

1. Abstract

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) causes citrus bacterial canker (CBC) on several

citrus species. Xcc requires bacterial aggregation and biofilm formation to survive on

plant surfaces. Those biofilms are dependent on the environment situation, and their

structures have been observed different according to the host range type of the Xcc

strain.

Herein, we have reported the variable extracellular structures produced by Xcc strains

with different host range at the early stage of biofilm formation, in mature biofilms or

during planktonic growth. Moreover, the presence of these structures was related to the

transcription of quorum sensing, flagellar and fimbrial related genes. In addition,

surface translocation was characterized for Xcc strains by transmission electron

microscopy and transcriptional analysis. Our results showed that the variation in Xcc

biofilm formation and surface motility found in different Xcc strains was associated

with the expression of fimbrial and flagellar genes which in some cases are dependent

of quorum sensing system.



188

2. Introduction

Citrus bacterial canker (CBC) is caused by Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) (CBC

type A) and X. fuscans subsp. aurantifolii (CBC types B and C). CBC is worldwide

distributed along tropical and subtropical areas restricting plants and fruits

commercialization from infested to non-infested citrus producing areas (Graham et al.,

2004). CBC is characterized by the appearance of circular water soaked lesions that

become slightly raised, brown coloured with a corky appearance (Brunings and Gabriel,

2003). CBC A type affects many Citrus species and cultivars, being considered the most

aggressive disease variant (Stall and Civerolo, 1991). Within CBC type A, two subtypes

are described, Aw and A* from Florida and Southwest Asia respectively (Sun et al.,

2004; Vernière et al., 1998). These subtypes show a narrow host range, infecting in the

field only Mexican lime (Citrus aurantifolia), although both of them are able to produce

non-canker lesions and increase bacterial population in other Citrus species.

Furthermore, CBC Aw type produce hypersensitive response in Duncan grapefruit (C.

paradisi) when infiltrated (Escalon et al., 2013; Rybak et al., 2009; Sun et al., 2004;

Vernière et al., 1998) .

Biofilms are described as bacterial communities attached to surfaces which provides

resistance against deleterious conditions to the bacterial population (Costerton et al.,

1999; Petrova and Sauer, 2012). In addition, biofilms have been described as important

for plant colonization and infection in several plant pathogenic bacteria including Xcc

(Cubero et al., 2011; Danhorn and Fuqua, 2007; Rigano et al., 2007).

The extracellular matrix is a large component of the bacterial biofilms (90%) which

consists of exopolysaccharide, lipopolysaccharide, proteins and extracellular DNA

(Flemming and Wingender, 2010; Petrova and Sauer, 2012). The importance of the

extracellular matrix relies on the biofilm structure, bacterial protection and contributes

in processes involved in nutrient acquisition, enzyme production and bacterial signaling

(Flemming and Wingender, 2010). Most of biofilm formation studies on CBC have

been focused on wide host range strains, mainly in strain Xcc 306 which was the first

citrus pathogenic Xanthomonas sequenced (da Silva et al., 2002). However few studies

have been performed on narrow host range strain types Aw and A*. Studies on A*

strains have been more related with its biochemical description, genetic

characterization, variability and worldwide distribution (Derso et al., 2009; Ngoc et al.,



189

2007; Pruvost et al., 2014a; Pruvost et al., 2015; Vernière et al., 1998; Vernière et al.,

2014). Strain type Aw has recently become higher importance since its complete

genome sequence was published in 2013 (Jalan et al., 2013b) and some transcriptomic

studies have been performed to compare it with Xcc 306 strain (Jalan et al., 2013a). Up

to date, solely studies related with its description and molecular characterization had

been published (Sun et al., 2004).

A study has been published comparing the effector repertoires of the different CBC

strains types and their role in host range (Escalon et al., 2013). This study suggests that

other bacterial mechanisms, not related directly with effectors, might be involved in the

host range of Xcc strains. In addition a recent study showed differences in biofilm

formation, both on abiotic and plant surfaces, between narrow and wide host range

strains of Xcc (Sena-Vélez et al., 2014).

Flagella and type IV pili have been described to participate in biofilm formation in Xcc

in studies with bacterial mutants (Dunger et al., 2014; Malamud et al., 2011). In

addition other components of the matrix have been described such as eDNA and

exopolysaccharide (Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al., submitted). Herein, the

bacterial extracellular appendages, that conformed the three dimensional structure of the

biofilm, were identified and visualized in two CBC strains with different host range. As

well, we provided a transcriptional analysis of several biofilm related genes, associating

their transcription with the extracellular structures visualized during processes such as

the biofilm formation and surface motility for wide and limited host range strains of

CBC A in order to explain the structures observed both in vitro and in vivo for both

strains (Sena-Vélez et al., 2014).

3. Materials and methods

3.1. Bacterial strains and growth conditions

Xanthomonas strains used in this study are listed in Table 1. Two wide host range

strains of CBC A type, Xanthomonas citri subsp. citri 306 and Xcc MI, and a limited

host range CBC strains Xcc 12879 (CBC Aw), were used. Bacterial strains were

routinely grown on Luria Bertani broth (LB) (10 g tryptone, 5 g L-1

yeast extract and



190

85.5 mM of sodium chloride) or on LB plates (1.5% bacteriological agar) at 27ºC for 48

h.

Table 1. Xanthomonas used in this study.

a Citrus Bacterial Canker

3.2. Extracellular protein purification

In order to evaluate the extracellular structures produced by Xcc, strains Xcc MI and Xcc

12879 were cultured on LB and XVM2 media (20 mm NaCl, 10 mm (NH4)2SO4, 5 mm

MgSO4, 1 mm CaCl2, 0.16 mm KH2PO4, 0.32 mm K2HPO4, 0.01 mm FeSO4, 10 mm

fructose, 10 mm sucrose, 0.03% casamino acid) (Astua-Monge et al., 2005; Wengelnik

et al., 1996) plates (1.5% agar) for 48 hours at 27ºC.

Bacteria were recovered from 20 plates and suspended in 50 mL of sterile distilled

water (SDW). To separate the extracellular structures from the cells, bacterial

suspensions were manually shaken for 5 minutes and centrifuged at 10,000 g and 4ºC

for 20 minutes to precipitate all bacteria from the suspension. In order to completely

remove bacteria and flagella, the supernatant was centrifuged again at 20,000 g and 4ºC

for 20 minutes and finally at 274,000 g and 4ºC for 2 hours to pellet all pili and fimbria

which finally were suspended in 500 µL of phosphate buffer (PBS, 40 mM NaH2PO4

and 25 mM KH2PO4). For further purification the extracellular structures were

precipitated with a 50% (NH4)2SO4 in SDW. All the proteins were recovered after 10

minutes centrifugation at 5,000 g at 4ºC and pellet suspension in 500 µL PBS. In order

to monitor the purification in each step of the protocol, a sample was stained with 1%

phosphotungstic acid for one minute and observed by transmission electron microscopy

(TEM).

Extracellular proteins were separated in 14% polyacrylamide SDS-PAGE gel

[Resolving gel: 12.25 mL of 40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 (Bio-Rad

Laboratories, Hercules, CA, USA), 0.37 M Tris-HCl at 8.8 pH (resolving gel buffer),

Strain Taxon, or disease and CBC type Natural Host Origin

Xcc 306 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC a

A Citrus spp. Brazil

Xcc MI Xanthomonas citri subsp. citri, CBC A Citrus spp. Florida

Xcc 12879 Xanthomonas citri subsp. citri, CBC Aw Citrus aurantifolia Florida



191

0.1% SDS (Sodium Dodecyl Sulphate), 0.4% NaCl, 0.03 % (NH4)2S2O8, and 18 µL

Tetramethylethylenediamine (TEMED) in a final volume of 35 mL (4 gels). Stacking

gel: 1.7 mL 40% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1, 0.25 M Tris-HCl at 6.8 pH (stacking

gel buffer), 0.1% SDS, 0.03% (NH4)2S2O8 and 45 µL TEMED to a final volume of 15

mL] at 100 V for 3.5 hours. Gels were stained by using a coomassie based staining

solution InstantBlueTM

(Expedeon Ltd., Harston, UK) for 1 hour and washed with

SDW. Before gel separation, the samples were denatured in 25% SDS reducing sample

buffer (0.06 M Tris-HCl, 26% glycerol, 2% SDS, 0.01 bromophenol blue and 5% β-

mercaptoethanol) and boiled for 5 minutes. The selected bands were cut from the gel,

introduced into a 1.5 mL centrifuged tube and sent to the sequencing service of the

Emerging Pathogen Institute (Gainesville FL., USA).

3.3. Evaluation of extracellular structures in Biofilm vs. Planktonic stages

Extracellular structures were analysed in biofilm and planktonic cells after culture onto

50 mL borosilicate flask amended with 25 mL of media. Bacteria in exponential growth

phase after 24 hours post inoculation (hpi) were washed twice with 10 mM MgCl2,

added to the flask to achieve a final concentration of 108 cfu (colony forming units) mL

-

1 and cultured at 27ºC. For biofilms, bacterial cultures were statically grown for 72

hours, at this time culture media were removed and the cells attached to the flask (early

stage of the biofilm on inundated surface) incubated for additional 72 hours at 27ºC in

dried conditions (mature biofilm). To evaluate extracellular structures in planktonic

cells, bacteria were cultured for 72 hours on a rotary shaker (150 rpms) at 27ºC.

Samples from early stage of the biofilm after 72 hours static growth, from mature

biofilm and from planktonic cells collected at stationary growth phase at 24 and 72 hpi

were taken and analysed by microscopy and qPCR as described below.

3.4. Extracellular structures characterization by microscopic approaches

In order to characterized the extracellular structures produced by Xcc strains, bacterial

samples were taking during bacterial growth, biofilm formation and surface motility and

observed by transmission electron microscopy (TEM) and light or fluorescence

microscopy.

Samples taken for TEM were diluted when necessary and 5 µL were deposited onto a

400 mesh copper grid and stained with 1% phosphotungstinc acid or 5% uranyl acetate



192

for 1 minute. After staining, grids were washed with SDW dried and stored or observed

at the microscope.

Samples from biofilm formation in flasks were deposited onto a slide (60 µL), stained

with Cristal Violet (CV) as described for Xanthomonas (Kraiselburd et al., 2012) and

visualized in a Leica DMRE microscope.

To characterize extracellular structures in biofilms, without breaking the aggregates,

biofilm was induced onto borosilicate glass slides. Briefly, bacterial cultures in

logarithmic growth phase were washed and diluted at a concentration of 108 cfu mL

-1,

100 µL of this bacterial suspension were seeded on a glass slide and incubated for 72

hours at 27ºC into a petri dish. After 72 hours the medium was carefully removed and

the aggregate stained with CV as described above.

In order to determine the presence of DNA (eDNA) in the extracellular matrix of Xcc

formed during surface motility, samples obtained from the advancing edge of the

bacterial colony were deposited onto glass slides and stained with SYTO-9 from

Live/Dead Bacterial viability kit (Molecular Probes Europe BV; Leiden, The

Netherlands) for 20 minutes and dark and observed in fluorescence Leica DMRE

microscope.

3.5. Surface motility

Surface bacterial motility was analysed on PYM medium plates (0.5% peptone, 0.3%

yeast and 0.3% malt extract) amended with 2% of glucose and agar at 0.7%. Bacteria

cultured in LB at logarithmic phase were washed twice with 10mM MgCl2, suspended

in 1 mL of MgCl2 and centrifuged to pellet all bacteria. Bacterial pellets were inoculated

in the centre of a petri dish with a toothpick and incubated at 27ºC for four days. The

diameter of the colony was measured at 24 and 96 hpi and the colony growth from three

plates and at least three assays was compared among the Xanthomonas studied. Means

were compared by analysis of variance (ANOVA) and separated by Student-Newman-

Keuls (SNK) multiple range test using Statgraphics Plus for Windows 4.1 (Statistical

Graphics, Rockville, MD).

Samples for RNA purification for strains Xcc 12879 and Xcc 306 were taken at 96 hpi

from the colonized area in the plate centre, and in the advancing edge. TEM samples



193

were taken for strains Xcc MI and Xcc 12879 at 96 hpi from the colonized area close to

the advancing edge.

3.6. RNA purification

Gene transcription analysis was performed on different biofilm formation stages, on

planktonic cells, in both LB and XVM2 media, and during surface motility, in order to

compare the bacterial behaviour of strains Xcc 306 and Xcc 12879 Aw.

RNA sample preparation was performed using TRIzol® Reagent following

manufacturer’s instructions (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Bacterial samples

from static or shaking liquid cultures were centrifuged at 5,000 g for 5 minutes and 4ºC,

then the bacterial pellet was suspended in 1 mL TriZol Reagent. To purify RNA from

mature biofilms, bacteria adhered to the flask were suspended in 1 mL of TRIzol

reagent. To recover RNA from the surface motility colony samples from the colonized

area and the advancing edge were recovered by using a loop and suspended in 1 mL of

TriZol.

Bacterial suspensions in TriZol were incubated at room temperature (RT) for 5 minutes.

After incubation 0.2 mL of chloroform were added to each tube and manually shaken,

then incubated at RT for 3 minutes and centrifuged at 12,000 g for 15 minutes and 4ºC.

The upper aqueous phase was recovered and 0.5 mL of isopropyl alcohol was added.

After an incubation of 10 minutes at RT, tubes were centrifuged at 12,000 g for 10

minutes at 4ºC. The pellet obtained was washed with 1 mL of 75% ethanol and

centrifuged at 7,500 g for 5 minutes at 4ºC. Finally, pellets were dried and suspended in

40 µL of Diethylpyrocarbonate treated water (DEPC).

After RNA purification, samples were treated with Turbo DNA-freeTM

(Ambion,

Austin, TX, USA) following manufacture’s instruction in order to remove any residue

of DNA from the sample. Total RNA concentrations were measured using NanoDrop

2000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE, USA).

3.7. Primers and probes design and qPCR conditions

Primers and TaqMan probes, shown in table 2, were designed using Primer Express

software (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

RNA samples were lead to a concentration of 0.02 µg µL-1

and reverse transcribed into

cDNA by using PrimeScriptTM

RT reagent kit from Takara Bio Inc. (Otsu, Shiga,



194

Japan), 12 µL of 5x PrimeScript Buffer, 3 µL of enzyme mix, 2.5 µM Oligo dT Primer

and 20 µM of random hexamers in a final volume of 60 µL. Reverse transcription was

performed at 37ºC for 15 minutes and the enzyme inactivation step of 85ºC for 5

seconds.

Table 2. Primers and probes used for qRT-PCR designed for this study1

1Primers and probes were designed based on the sequence of Xanthomonas citri subsp. citri strain 306.

2rpfB and rpfF genes codify for the enzymes related with the production of Diffusible Signal factors

(DSF) the quorum sensing molecule in the genus Xanthomonas (da Silva et al., 2002; Dow et al., 2003);

fimA 3241 codified for the major subunit of type IV pili (da Silva et al., 2002; Dunger et al., 2014); fimA

3240 codified for the major subunit of type IV pili (da Silva et al., 2002); pilA gene was previously

described to be the major subunit of type IV pili (da Silva et al., 2002); fleN is along with flhF a positive

regulator of FleQ and RpoN2 in Xc (Yang et al., 2009); fliC codifies for flagellin and in Xcc is required

for swimming motility and biofilm formation, but is not for surface translocation (Malamud et al., 2011);

motA codified along with motB for the flagellar motor (da Silva et al., 2002)

Quantitative Real Time PCR was used to analyze gene expression. For fimA 3240, fimA

3241, pilA, fleN, fliC and motA, qPCR reactions were assembled in a 20 µl volume

containing 10 µL of 2x GoTaq Probe qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA),

0.8 mM of each forward and reverse primers and 0.4 mM of TaqMan probe. rpfB and

rpfF genes amplification was performed by using FastStart Universal SYBR Green

Master (Rox) (Roche Applied Science, Mannhein, Germany), reaction mixture in 20 µl

volume containing 10 µL of reaction mix and 0.2 mM of both forward and reverse

primers. For ribosomal 16S RNA qPCR reactions were assembled in a 20 µl volume

containing 10 µL of 2x GoTaq Probe qPCR Master Mix, 0.2 mM of both forward and

Gene2 Forward Reverse Taq-man Probe (Fam-Tamra)

Rib16S GGGACAGAGGGCTGCAAA ATCCGGACTGAGATAGGGTTTCT CCGCGAGGGCAAGCCAATCC

rpfF GCCAGCAAAAGCGCATTT GAACCGACTGCGCCAGATT -

rpfB CCAACCTGACCGCCTACAA TTGGTTTTCGGCAACTCCTT -

fimA 3241 TGCCAAGTCGCAGGTCACT CAAAAGAGTTTCGTATTGCGTTTTAC CTGGCCGAGCTGAGCCCG

fimA 3240 CCGGCTTGGCCGAAGT TCGCTGTCATTGACCAAAATCT AGCCCCGGGAAGACGCGCTAC

pilA CGAGTTGGCGGCATTGA GGCCTTCACTGGCCAGAA CCGCAGATCACCGA

fleN GCGCGCTGCCGATAAG ATTCACGCGACTGCATGGT CCTGTACTCCGGAGCAC

fliC GCGCTGAACTCGGAAGTCA CGAACCGTCCAGCAGCTT CCTCTGAAATCGACCGCGTTG

motA GGCTACAACCCGAAGATTGC AGCTCGGACGCACATTGG AATTCGCGCGCAAGACCCTGC



195

reverse primers and 0.4 mM of TaqMan probe. 2 µL of the retrotranscribed cDNA were

added to the reaction for each of the genes analyzed. For 16S rRNA samples, the cDNA

obtained was diluted 1:1000 before been added to the qPCR reaction.

qPCR reactions were performed in a 7500 Fast RealTime PCR System (Applied

Biosystems) using the Standard 7500 run mode consisting of 40 cycles of 95ºC for 15

seconds and 60ºC for 1 minute after an initial denaturation DNA and Taq Polymerase

activation step of 95ºC for 10 minutes. For SYBR Green reactions, melting curve

analysis was performed at the end of the amplification cycles to verify the presence of a

unique PCR product.

Data analysis was performed following the 2-ΔΔC

T method (Livak and Schmittgen,

2001). Expression levels were normalized to the control gen for ribosomal 16S RNA.

The means of the relative expression of each gene for each strain in the different

conditions tested were compared by analysis of variance (ANOVA) and separated by

Student-Newman-Keuls method. All statistical analyses were performed using

STATGRAPHICS Plus, version 5.1 (Copyright Manugistics Inc.).

4. Results

4.1. Visualization of extracellular structures produced by Xanthomonas citri subsp.

citri

TEM was performed in order to observe the presence of extracellular structures of citrus

pathogenic Xanthomonas under several conditions which include growth onto agar

plates, surface motility and biofilm formation.

Plate growth 4.1.1.

Xcc grown on petri dishes for 48 hours showed different extracellular structures

depending on the media. While on LB medium strain Xcc MI produced lots of thin

intertwined fibrils which became thick fibres when coiled (Fig. 1A), XVM2 medium

promotes the production of semi-rigid filaments which mislead to flagella, however

those filaments were made of fibres as ropes (Fig. 1B). Xcc 12879 in LB medium

produced flagella and very few fibrils (Fig. 1C), whereas in XVM2 medium (Fig. 1D)

fibres similar to those produced by Xcc MI strain were shown.



196

Figure 2. Transmission electron microscopy of bacterial cultures incubated for 48 hours

on LB (A & C) or XVM2 (B & D) agar plates of Xcc MI (A & B) and Xcc 12879 (C &

D), stained with phosphotungstic acid. A, B & D images showed lots of extracellular

fibers surrounding the cells which seemed to be built from thin intertwined fibrils. Image

C showed narrow host range strain in LB medium and the presence of flagella and just a

few other extracellular structures.

Early stages of biofilm formation 4.1.2.

After 72 hours of static growth, cells deposited at the bottom of the flask showed several

extracellular structures (Fig. 2) which were more difficult to be observed in XVM2

medium for both strains due to the high density of the extracellular matrix (Figs. 2B &

D). However, in LB media variation regarding the strain was observed; while Xcc 306

strain produced lots of extracellular fibres which connect the aggregates (Fig. 2A), the

narrow host range strain Xcc 12879 showed less aggregation and less connections

among cells (Fig. 2C).



197

Figure 2. Xcc strains with different host range at the early stages of biofilm formation (72

hours of static growth) in LB (A & C) or XVM2 (B & D) media. Wide host range strain

Xcc 306 is shown in images A & C and the limited host range strain Xcc 12879 in C & D.

Several extracellular structures were observed for both strains and media, however the

high density of the matrix observed in XVM2 medium (B & D), possibly produced by

high extracellular polysaccharide production impedes the visualization of filaments

interconnecting cells in the aggregates. In LB medium it is possible to observe for strain

Xcc 306 several extracellular filaments produced by bacteria connecting bacterial

aggregates. Strain Xcc 12879 (narrow host range) did not produce as much extracellular

structures and cell connections seemed to be produced by a single or few filaments (C).

Surface motility 4.1.3.

At 96 hpi on the colonized area close to the advancing edge, both strains were longer

(Figs. 2A & B) than those observed on plate growth (Fig. 1) and showed the presence of

one polar flagellum. Strain Xcc MI showed several pili like structures at the opposite

flagellar cell pole (Fig. 3A) which could be related with type IV pilus. The narrow host

range strain Xcc 12879 did not show any other extracellular structure but flagellum (Fig.

3B). SYTO-9 staining showed the presence of eDNA in the advancing edge of the

colony for both strains (Figs. 3C & D), as was described previously for biofilm

formation and twitching motility (Sena-Vélez et al., submitted).



198

Figure 3. Microscopy of Xcc strains with different host range during surface motility on

PYM plates at 0.7% agar. A & B, transmission electron microscopy of Xcc MI and Xcc

12879 strains respectively. The presence of polar flagella have been observed on both

strains, however type IV pili like structures were solely observed for Xcc MI at the

opposite pole from the flagella (A). C & D, fluorescence microscopy of cells stained with

SYTO-9 DNA stain of Xcc 306 and Xcc 12879 strains respectively. The filaments

observed in images showed high extracellular DNA content, as reported previously for

Xcc (Sena-Vélez et al. submitted).

4.2. Extracellular protein purification and characterization

Extracellular protein purification was performed in order to determine variation among

strains in the extracellular protein profile and to identify and characterize them.

Extracellular protein extracts of strains Xcc MI and Xcc 12879 were compared in both

LB and XVM2 media. The same protein profile was observed for both strains and

media (Fig. 4A); however the amount of protein was higher in LB than XVM2 medium,

possibly due to the higher bacterial growth in this media. Several bands were observed

and identified in the SDS-PAGE protein gels. The slight bands probably corresponded

with soluble proteins, proteins bands around 60 kDa corresponded with leftover

flagellin after the purification. The band around 20 kDa was sequenced and

corresponded with a hypothetical protein, locus tag was XAC 0223, which is present in



199

the Xcc strains sequenced. BLAST-P analysis revealed an identity of 93% and a query

coverage of 89% (E-value=7e-118

) with the Xanthomonas oryzae pv. oryzicola BLS256

activator of XA21-mediated immunity Ax21 (Locus Tag XOC 0319) (Lee et al., 2009).

Figure 4. Extracellular proteins of Xcc strains. A; 14% Acrylamide SDS-PAGE gel, lanes 1st & 2

nd

corresponded with molecular weight markers, the 3rd

and 4th

lanes show the extracellular protein profile

of Xcc MI and Xcc 12879 in LB medium which showed a similar protein profile. The highlighted band

(around 20 kDa) corresponded with XAC0223 protein from Xcc 306. The XAC 3241 protein is not

showed in the gel because it could not be denaturalized after the treatment performed and was found in

the gel well; B & C, show the extracellular proteins after ammonium sulphate precipitation of MI and Xcc

12879 strains in LB medium, which mainly precipitate pili.

This protein showed a signal peptide identified by using Signal-P program which is in

agreement with its extracellular location, furthermore this protein was possibly related

with quorum sensing in Xanthomonas (Han et al., 2011; Han et al., 2013). A band

which did not run into the gel was also selected and sequenced because some

extracellular proteins required further treatment to be denaturalized; interestingly that

band was identified as the major subunit of the type IV pilus (XAC 3241). This protein

has four cysteine residues which can produce disulphide bond which requires urea

treatment to denaturalize the protein.

4.3. Microscopy of Xanthomonas citri subsp. citri; biofilm formation and

planktonic growth

Microscopic studies were performed in order to visualize the extracellular structures

produced by Xcc strains during biofilm formation and planktonic growth. Furthermore,

extracellular structures were compared between the strains studied and the media

assayed. Bacteria were collected from both LB and XVM2 broth from planktonic

cultures after 72 hours shaking growth, bacteria deposited onto the flask bottom after 72



200

hours of static growth (early stages of biofilm formation) and from mature biofilms. In

addition biofilm was also performed on microscope glass slides. Images of both strains

in LB medium are shown in Fig. 4 and in XVM2 medium in Fig. 5.

Figure 5. Optical microscope images of biofilm formation and planktonic cells in LB media

stained with CV (1000x). A, C & E: strain Xcc 306; B, D & F: strain Xcc 12879 Aw. Figures A &

B shows bacteria after 72 hour of incubation at 180 rpm, planktonic cells in which few

extracellular structures were observed. C & D, bacteria deposited at the flask`s bottom after 72

hours of static culture, semirigid filaments were observed which were longer for Xcc 12879

strain (D) and more connected for Xcc 306 strain (C). These bacteria are starting the biofilm

formation. E & F, mature biofilm, while Xcc 306 strain showed lots of thick fibres (E), Xcc

12879 showed thinner and longer fibres than Xcc 306 (F).



201

Figure 6. Optical microscope images of biofilm formation and planktonic cells in XVM2 media

stained with CV (1000x). A, C & E: strain Xcc 306; B, D & F: strain Xcc 12879 Aw. Figures A &

B shows bacteria after 72 hour of incubation at 180 rpm, planktonic cells, no aggregation was

observed however some fibrils seemed to connect cells. C & D, bacteria deposited at the flask`s

bottom after 72 hours of static culture showed aggregation and fibres connecting the aggregates.

E& F, mature biofilm, higher aggregates were formed by Xcc 12879 strain (F).

Bacteria incubated for 72 hours and shaking (Figs. 5A & B, 6A & B) showed little

aggregation on both media, however some interconnecting fibres were observed

between cells. The presence of extracellular structures was higher in LB than XVM2

media. After 72 hours of static growth (Figs. 5C & D, 6C & D), the cells deposited onto

the flask showed higher bacterial aggregation compared with shaking growth (Figs. 5A

& B, 6A & B) as well as the presence of numerous fibres of variable thickness. In LB

medium lots of stiff fibres were observed for both strains, however in this medium



202

strain Xcc 306 (Fig. 5C) showed great fibre density and more complex than strain Xcc

12879 (Fig. 5D). XVM2 medium did not show the long and stiff fibres observed in LB

media, however higher bacterial aggregates were observed being more complex than LB

(Figs. 6C & D). Structures observed in biofilms (Figs. 5E & F, 6E & F) were similar to

those observed after 72 hours of static growth but showing further aggregation and

structure thickness. In LB medium clear differences were observed among strains, while

Xcc 306 showed lots of thick fibres (Fig. 5E), the fibres in Xcc 12879 were less

interconnecting and thick (Fig. 5F). XVM2 medium aggregates were more complex

than those in LB, showing higher bacterial aggregation (Figs. 6E & F). Structures which

stabilize the biofilm were possibly hidden by the high cell density.

Biofilms formed on glass slides (Fig. 7) showed similar results as above, but on those it

was easier to observe the structure without disrupting the biofilm. Bacterial aggregates

were observed for all strains and media; however aggregation seemed to be higher in

Xcc 306 as compared to Xcc 12879 strain. Furthermore, aggregates in XVM2 medium

were higher and more consistent than those observed in LB, although the area covered

in LB was wider. In LB medium, at the edge of the biofilm, several structures similar to

those observed in twitching motility (Sena-Vélez et al., submitted) were observed as

long filaments with bacteria associated to them (Fig. 7A.2). Besides, flagella were

observed as well in cells close to the aggregates (Fig. 7A.3). In XVM2 media strain Xcc

306 showed a net interconnecting the aggregates made of thin fibres (Figs. 7B.2 & B.3).

Strain Xcc 12879 in XVM2 medium also produce a lattice net made of fibres which in

some cases become a wide thin layer onto the glass surface (Figs. 7D.1 & D.2).

The microscopic observations of Xcc strains at different stages of biofilm formation and

media revealed that the aggregation and biofilm response is more similar between

strains in XVM2 medium than in LB.



203

Figure 7. Optical microscopy images of 72 hours post inoculation biofilms stained with crystal violet

flagellar stain described by Kraiselburd in 2012. Three images are shown for each strain a medium used

in order to demonstrate the different extracellular structures produced by the bacteria and the variable

aggregation. Row A, Xcc 306 biofilm in LB medium; row B, Xcc 306 in XVM2 medium; row C, Xcc

12879 in LB medium & row D, Xcc 12879 in XVM2 medium.

4.4. Gene transcription during biofilm formation

The gene transcription levels for quorum sensing, flagellar and fimbrial genes during

biofilm formation have been evaluated in CBC strains with different host range in order

to compare their variable response in LB or XVM2 media. Differences were observed

among both strains for some of the genes studied mainly in those related with fimbrial



204

structures. Moreover, variation between LB and XVM2 media in the different biofilm

formation stages has been observed.

quorum sensing gene transcription analysis is shown in Fig. 8. For rpfB (Fig 8A) and

XVM2 medium, both strains, Xcc 306 and Xcc 12879 showed a similar transcription

pattern with relative stable transcription levels during planktonic growth and at the early

stages of biofilm formation. The levels of transcription of those genes in both strains

increased on mature biofilm. However the transcription levels on Xcc 306 were several

times higher than in Xcc 12879.

Figure 8. Transcription levels of quorum sensing genes rpfB (A) and rpfF

(B). Dark grey bars show the mRNA relative levels for the wide host range

strain Xcc 306 and light grey bars the narrow host range CBC strain Xcc

12879. Bar labels marked with different letters represents a significantly

different means according to Student Newman-Keuls multiple range test (P <

0.05) for each medium and strain analyzed separately, lower case letters

refers to XVM2 medium, and capital letters refers to LB medium. Bold

letters refers to Xcc 12879 strain. Graphs are a representative assay of five

assays.

In LB medium the transcription pattern varied among strains. Planktonic cells of Xcc

306 showed a stable profile during planktonic growth, however in Xcc 12879 an



205

increase on transcription from those genes under bacterial growth was shown. After 72

hour of static growth the transcription levels observed were the lowest for both strains,

being higher in Xcc 306 as compared to Xcc 12879. The mRNA relative levels increased

on mature biofilm for both strains. The transcription level of rpfF gene is shown on Fig.

8B. In XVM2 and for Xcc 306 strain the transcription level was quite stable in the

samples analysed but the highest transcription was found after 24 hour of shaking

culture and the lower at the early stages of biofilm formation. However in Xcc 12879

strain a higher transcription in mature biofilms was shown as compared to the other

samples analysed. In LB medium, Xcc 306 and Xcc 12879 showed an increase of rpfF

gene transcription during planktonic growth being the lowest level observed at the early

stages of biofilm formation and the highest in mature biofilms or after 72 hours of

shaking or planktonic culture.

Transcription of flagellum related genes fliC, fleN and motA are shown in Fig. 9. The

transcription pattern for fliC (Fig. 9A) in XVM2 was similar for both strains; the

transcription level of this gene was similar for planktonic or static growth after 72

hours, being higher for Xcc 12879 than Xcc 306. The transcription for both strains

increased in biofilms. In LB medium, during planktonic growth, the mRNA levels of

fliC decreased in stationary growth phase for Xcc 306 but increased in Xcc 12879 strain.

At the early stages of biofilm formation the transcription level of fliC was the lowest for

both strains, however in Xcc 306 was higher than in Xcc 12879. In mature biofilms the

transcription of fliC increased at similar level for both strains. The transcription pattern

of fleN gene (Fig. 9B) for both strains and media was similar to fliC gene, uniquely in

XVM2 medium, planktonic growth, and early stages of biofilm formation, the

transcription was higher for Xcc 306 than for Xcc 12879. motA gene transcription in

XVM2 for strain Xcc 306 was similar for all the samples, the highest transcription was

observed at 24 hours of planktonic growth and the lowest in mature biofilms. Strain Xcc

12879 motA transcription was the same after 72 hours both static and shaking culture

growth, and higher after 24 hours or in mature biofilm stage, this last stage showed the

highest transcription level for motA gene. In LB medium the transcription pattern was

similar to those observed for fliC and fleN genes.



206

Figure 9. Transcription levels of genes related with flagella formation and

structure fliC (A), fleN (B) and motA (C). Dark grey bars show the mRNA

relative levels for the wide host range strain Xcc 306 and light grey bars the

narrow host range CBC strain Xcc 12879. Bar labels marked with different

letters represents a significantly different means according to Student

Newman-Keuls multiple range test (P < 0.05) for each medium and strain

analyzed separately, lower case letters refers to XVM2 medium, and capital

letters refers to LB medium. Bold letters refers to Xcc 12879 strain. Graphs

are a representative assay of five assays.

Fimbrial genes fimA 3241, fimA 3240 and pilA transcriptions are shown in Fig. 10. fimA

3241 gene (Fig. 10A) showed higher transcription level in XVM2 than LB medium for

both strains in any of the samples, being similar for those media on mature biofilm. In

XVM2 medium the pattern was similar for both strains, the highest level was observed

after 24 hour of shaking growth and at early stages of the biofilm formation. The



207

transcription level decreased after 72 hours shaking growth, being higher for Xcc 12879

than for Xcc 306 strain. The lowest level was observed on mature biofilm.

Figure 10. Relative transcription levels of fimbrial related proteins fimA 3241

(A), fimA 3240 (B) and pilA (C). Dark grey bars show the mRNA relative

levels for the wide host range strain Xcc 306 and light grey bars the narrow

host range CBC strain Xcc 12879. Bar labels marked with different letters

represents a significantly different means according to Student Newman-

Keuls multiple range test (P < 0.05) for each medium and strain analyzed

separately, lower case letters refers to XVM2 medium, and capital letters

refers to LB medium. Bold letters refers to Xcc 12879 strain. Graphs are a

representative assay of five assays.

In LB medium and strain Xcc 306 clear differences were observed between planktonic

vs. sessile growth, higher transcription level was observed at early stages of biofilm

formation and mature biofilm as compared to planktonic growth. However, the strain



208

Xcc 12879 showed in LB and planktonic growth an increased transcription of fimA 3241

along the time and lower transcription at the early stages of biofilm formation than in

mature biofilm. In XVM2 and for the second gene codifying for the major type IV pili

subunit, fimA 3240 (Fig. 10B), the transcription was similar for both strains during

planktonic growth, being higher after 24 hours as compared to 72 hours of culture

shaking. Xcc 306 showed higher transcription at the early stages of biofilm than in the

mature biofilm and the opposite for Xcc 12879 where the transcription was higher in

mature biofilm as compared to the early stage of the biofilm formation. Furthermore in

biofilms the transcription was higher in Xcc 12879 than in Xcc 306. No big differences

were observed for this gene in LB medium for strain Xcc 306 during planktonic growth,

however for strain Xcc 12879 the transcription clearly increased in stationary growth

phase. Both strains showed less transcription at the early stages of biofilm formation

compared to the mature biofilm. pilA gene (Fig. 10C) in XVM2 medium was more

transcribed in biofilms than during planktonic growth and on mature biofilms as

compared to early stages in its formation. In LB medium strain Xcc 306 showed the

highest transcription at the 24 hours of planktonic growth and decreased at 72 hours

showing the same level than in mature biofilm. Strain Xcc 12879 transcription level, in

LB, increased during planktonic growth, as happened for strain Xcc 306 the lowest

transcription level was shown at the early stages of biofilm formation, increasing in

mature biofilms.

4.5. Surface motility in Xanthomonas strains

Xanthomonas motility onto a surface was performed in 0.7% agar PYM plates

supplemented with glucose at 2%. As shown in Fig. 11 differences were shown among

strains, Xcc 12879 was able to cover more area of the plate than Xcc 306 and both

strains showed a circular colony pattern.

In order to further characterized this type of motility the transcription levels of type IV

pili major subunit fimA 3241 and fimA 3240, flagellin fliC and fimbrial protein pilA

were compared between both strains. For such purpose, samples were taken from the

colonized area and in the advancing edge of the colony.



209

Figure 11. Surface motility plates of Xanthomonas strains with different host

range on PYM medium and 0.7% of agar. The graphic shows the colony growth

among the 24 and 96 hours post inoculation. Letter represents a significantly

different means according to Student Newman-Keuls multiple range test (P <

0.05) from three assays with three replicates per assay. Plates represent the

motility colony after 96 hours post inoculation for the wide host range CBC

strain Xcc 306 and the narrow host range strain Xcc 12879.

Variable behaviour was observed among the Xcc strains which possibly explain the

different colonized area during surface motility (Fig. 12). Type IV pilus major subunit

fimA 3241 showed for Xcc 306 strain higher transcription level in the advancing edge

than in the colonized area, however de transcription was the opposite for strain Xcc

12879. fimA 3240 showed higher transcription in the colonized area than the advancing

edge for both strains, and same transcription pattern was shown for pilA gene. The

transcription of flagellin gene (fliC) was higher in the colonized area for Xcc 306 strain

meanwhile Xcc 12879 strain showed higher transcription in the advancing edge. For

fimA 3241, fimA 3240 and fliC genes, the transcription shown in the colonized area and

the advancing edge in Xcc 306 was always higher than in Xcc 12879 levels. Finally,

transcription level of pilA gene was more similar for both strains in the advancing edge

and higher in the colonized area for Xcc 306 as compared to Xcc 12879 (Fig. 12).



210

Figure 12: Transcription levels of genes related with extracellular appendages

(fimA 3241, fimA 3240, pilA & fliC) produced by Xcc strains with different host

range 306 and Xcc 12879 during motility onto a surface. Dark grey bars show the

mRNA relative levels for the wide host range strain 306 and light grey bars the

narrow host range CBC strain Xcc 12879. Bar labels marked with different

letters represents a significantly different means according to Student Newman-

Keuls multiple range test (P < 0.05) for each strain and gene analyzed

separately. Capital letter refers to Xcc 306, and lower case letters to Xcc 12879.

5. Discussion

Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) is able to produce biofilm on both biotic and

abiotic surfaces and the aggregation process is dependent of the medium and the host

(Malamud et al., 2011; Rigano et al., 2007; Sena-Vélez et al., 2014; Sendín et al., 2012).

Furthermore this structure is important for bacterial surface survival (Cubero et al.,

2011) and disease development (Rigano et al., 2007). Xcc is also able to perform

swimming and twitching motilities and a surface motility which have been described as

swarming or sliding (Dunger et al., 2014; Malamud et al., 2011). Fimbrial and flagellar

genes have been described in several bacteria including Xcc as important at the early

stages of biofilm formation, and have been related with the surface adhesion

phenomena, as well as the establishment of a mature biofilm (Dunger et al., 2014;

Karatan and Watnick, 2009; Malamud et al., 2011; Petrova and Sauer, 2012).

Previous studies described different biofilm formation in vitro for several strains of Xcc,

furthermore electron microscopy studies of biofilms in planta showed clear differences



211

in the aggregate structures between wide and narrow host range CBC strains (Sena-

Vélez et al., 2014). Herein, no variation has been observed in the extracellular protein

profile of those strains, although distinct extracellular structures were observed

according to the media and the strains analyzed in the microscopy assays. Therefore

variation in extracellular proteins could be possibly attributed to a differential

expression of the genes involved in this process. The main extracellular proteins

purified and identified from the bacterial cultures associated to filaments corresponded

to FimA 3241, the major subunit of the type IV pilus whose importance in biofilm

formation was previously reported (Dunger et al. 2014). Another identified protein was

XAC 0223, a hypothetical secreted protein that possess a domain corresponded the

activator of AX21 dependent immunity in X. oryzae pv. oryzicola and has been

described in Xanthomonas genus as PAMP (Pathogen associated molecular pattern).

This protein is conserved among the Xanthomonas genus and other related genera like

Xylella or Stenotrophomonas (Lee et al., 2009; Ronald, 2011). Transgenic lines of

several Citrus sinensis cultivars expressing the rice resistance gene Xa21 showed

greater resistance than the non-transgenic lines (Mendes et al., 2010). AX21 protein has

been described as well as a quorum sensing factor, which regulates de expression of

several genes related with different bacterial process which included biofilm and

virulence (Han et al., 2011; Han et al., 2013). Further studies are required in order to

characterize this protein and its role in CBC disease.

Wide host range strain produced several intertwined, semirigid and coiled fibres when

grow in either high nutrient content medium such LB medium, or low nutrient content

apoplast mimic XVM2 medium. However in narrow host range strain those thick fibres

were observed exclusively in XVM2 medium. Similar observations have been

completed during biofilm formation and stationary growth phase. In LB medium narrow

host range strain showed fewer filamentous structures than wide host range strain which

showed a huge production of thick and rigid fibers stabilizing the aggregates. Although

narrow host range strains showed higher fiber production during biofilm formation it

was not as profuse as in wide host range strains. This reduction of extracellular fibers

would mean less adhesion to surfaces and less expansion of the biofilm (Li and Wang,

2011b), which would be in concordance with our previous results (Sena-Vélez et al.,

2014). In XVM2 medium robust aggregates were shown, those aggregates showed a

three-dimensional structure which made them difficult to be observed under the



212

microscope. TEM studies, at the early stages of biofilm, showed in XVM2 medium high

extracellular matrix production surrounding the cells for both strains. On a glass slide

further filamentous structures were observed in XVM2 compared to LB media, mostly

in narrow host range strain whose fibers intertwined to produce a lattice net similar to a

sheet. Biofilms on glass slide for wide host range strain showed in LB medium

structures similar to those described for twitching motility (Dunger et al., 2014), and

also showed flagella on both media. Structures similar to flagella were not been

observed at the beginning of biofilm formation in LB medium for narrow host range

strain. These results correlate with the relative mRNA levels at the early stages of

biofilm formation in LB medium; wide host range strain showed higher fimA 3241,

fimA 3240 and fliC transcription than limited host range strain where no twitching-like

structures were observed. Type IV pili and flagella have been described in Xcc as

important for bacterial attachment to surface as well as biofilm formation (Dunger et al.,

2014; Li and Wang, 2011b; Malamud et al., 2011). The higher transcription levels

observed in strain Xcc 306 compared to Xcc 12879 for fimA 3241, fimA 3240 and fliC

and the varied extracellular structures observed could explain the differential biofilm

formation in LB medium for those strains. However in XVM2 medium transcription

levels of fimA 3241 and fimA 3240 were similar for both strains. It would be possible

that higher flagellin expression together with other extracellular components like pili or

eDNA would lead to the sheet-like structures observed in XVM2 medium for Xcc

12879.

Quorum sensing genes rpfB and rpfF codify for enzymes which build DSF (Diffusible

Signal Factors) producing proteins, rpfB codifies for a long-chain enoyl-CoA ligase

which produced DSF precursor and rpfF which codifies for an enoyl-CoA hydratase

finally produced the DSF. At low bacterial concentration RpfF protein was bind to DSF

receptor RpfC and DSF was slightly produced by the cell mainly by the action of RpfB

protein. At high bacterial and DSF concentration RpfF unbind RpfC and increase the

cell DSF production (Andrade et al., 2006; Dow et al., 2003). In Xcc the quorum

sensing signal lead to C-di-GMP and favors biofilm formation and other processes such

as flagellar motility, chemotaxis and exopolysaccharide production (Andrade et al.,

2006; Guo et al., 2012; Li and Wang, 2011b). Herein, we have shown that the relative

transcription levels of both rpf genes vary according to culture media; transcription of

rpfF (Fig. 8B) during bacterial planktonic growth increased in time in LB due to the



213

increase of bacterial population, however under static conditions, a very low

transcription in LB was observed possibly because of the bacterial density onto the

flask. In XVM2 media less bacterial growth was observed and slight differences

between planktonic growth times and static growth were shown. Similar response was

observed for rpfB gene, however for this gene variation in transcription was observed

between strains. The transcription of rpfF gene is positively regulated in XVM2 by the

two component regulation system BfdS/BdfR which also regulates biofilm formation

and virulence (Huang et al., 2013). Although both rpfB and rpfF are important for DSF

production they seemed to be transcribed in a different manner. It is possible that rpfB

transcription was dependent of other regulators which responded to specific

environmental signals which can also vary among wide and narrow host range CBC

strains.

Transcription profiles of flagellar genes during biofilm formation for both types of

strains in LB and XVM2 media were in agreement to the results described previously

for strain Xcc 306 (Guo et al., 2012; Malamud et al., 2011). Flagellar genes transcription

pattern was similar to that of rpfB and rpfF genes. In apoplast mimic medium which is

XVM2, type IV pili or fimbria were described as independent of rpf regulon for wide

host range strain (Guo et al., 2012), and so occurred in our studies for both strains

assayed. Similar transcription pattern to rpf genes have been observed in LB medium

for fimA 3240 gene for both strains and for strain Xcc 12879 for fimA 3241 and pilA

genes in LB medium, however the transcription of the last gene seemed to be different

for strain Xcc 306. Therefore in high nutrient content medium other regulation systems

may influence the transcription of those genes and improved biofilm formation for

strain Xcc 306.

Interestingly variation for fimbrial genes transcription was observed after 72 hours of

static growth between XVM2 and LB media, transcription levels of the type IV pili

major subunits was higher in XVM2 as compared to LB medium and in LB medium

higher for wide as compared to narrow host range strain. These results suggest that 72

hours in our assays was a crucial time for biofilm formation, since the variation of fimA

3241 gene transcription was related with the ability to perform a mature biofilm

(Dunger et al., 2014). After 72 hours of static growth, bacteria have been deposited on

the surface, attached as a monolayer, and the type IV pili activated the transition to

mature biofilm (Dunger et al., 2014; Li and Wang, 2011b). Thereafter the low



214

transcription levels of narrow host range strain in LB media for fimbrial and flagellar

related genes would not allow the establishment of a mature biofilm, explaining

therefore the low CV staining of LB biofilms assays described (Sena-Vélez et al., 2014),

and also the lack of more complex extracellular structures shown under the microscope.

However, the transcription rate of those genes increased after 72 hours of incubation

without liquid medium possibly because biofilm formation of this strain was delayed

and the dried and low nutrient conditions accelerated the mature biofilm stage. In

mature biofilms, for both strains and media, rpf, pilA and flagellar genes and fimA 3241

for narrow host range strain in LB, showed high transcription level several times higher

than at the beginning of biofilm formation. However the mRNA level from fimA 3241

of both strains in XVM2 medium was lower and no variation was observed for wide

host range strain and LB. Furthermore, the transcription levels of fliC or fleN were even

higher that those observed on planktonic growth for XVM2 medium. These results

suggest that cells from the biofilm would return to a planktonic state in response to a

variation of DSF in the biofilm as reported in other studies (Dow et al., 2003; He et al.,

2006; Li and Wang, 2011b). Quorum sensing induced flagellar motility allowing

bacterial release, possibly favored by type IV pili dependent motility of the cells inside

the biofilm.

Our results showed that the response in XVM2 apoplast mimicking media is more

conserved among wide and narrow CBC strains than in LB. Therefore is possible that

once Xcc reach the Citrus apoplastic site, its behavior was similar for any strain,

however the survival onto the plant surface was different regarding the host plant. This

hypothesis would confirm the appearance canker-like symptoms or hypersensitive

response caused by narrow host range strains on non-host Citrus when bacteria are

infiltrated.

Differential surface motility has been observed for the Xanthomonas strains tested, this

variation however was not related with the host range of the strain nor the disease

caused contrary to swimming motility (Sena-Vélez et al., 2014).

Wide host range strain showed in the close-advancing edge of the colony extracellular

appendages similar to type IV pili on the flagellum opposite cell pole and cell

elongation, while narrow host range strain only produced flagella and no other

extracellular structures. Furthermore, eDNA has been observed in the extracellular



215

matrix of cells isolated from the advancing edge of the colony, as was described for Xcc

biofilms and twitching colonies (Sena-Vélez et al., submitted).

The transcription levels of the gene coding for the major subunit of type IV pili seemed

to be indirectly proportional to colony size. Wide host range strain Xcc 306 showed the

lowest colonized area and also showed the highest fimA 3241 transcription, meanwhile,

the wide host range strain MI showed structures similar to type IV pili, which confirms

the expression of this gene. Mutants in Xcc 306 unable to produce type IV pili (fimA

3241 gene) showed higher surface motility (Dunger et al., 2014; Guzzo et al., 2009) and

the same response was observed for P. aeruginosa ATCC 15692 (Anyan et al., 2014).

Furthermore, it was also described that type IV pili controlled the direction of bacterial

movements leading bacteria away of deleterious niches (Anyan et al., 2014). Flagellin

did not influence this kind motility (Dunger et al., 2014; Malamud et al., 2011), which

agrees with the slight variation observed in the mRNA relative levels of fliC among the

different areas of the colony for any of the strains.

The surface translocation performed by Xcc does not match with the description of

swarming motility, mainly because of the lowest motility rate and the lack of surfactant

production (Kearns, 2010; Tremblay and Deziel, 2010). A clear example of swarming

motility in Xanthomonas have been described in X. arboricola pv. pruni which

colonized the plate in 15 h showing a swarming dendritic pattern and surfactant

production (Garita-Cambronero et al. submitted). Sliding motility is more in agreement

with the translocation observed in Xcc. Our hypothesis is that the low displacement

observed in surface motility by Xcc strains, and the type IV pili transcription would lead

to biofilm formation onto the semisolid plate. This statement is supported by the fact

that in both LB (at the early stages of biofilm formation) and PYM media transcription

level of fimbrial and flagellin genes were higher in Xcc 306 strain than in Xcc 12879.

PYM is a nutrient rich medium which possibly influences negatively the biofilm

formation in narrow host range CBC strain as occurs in LB medium allowing therefore,

better bacterial displacement onto the PYM plate surface.

In this study we have reported the different extracellular structures produced by Xcc

during broth and plate growth, biofilm formation, and surface motility. Furthermore the

expression of type IV pili major subunit FimA 3241 was confirmed by extracellular

protein purification and protein identification. mRNA relative transcription levels at

different stages of biofilm formation and growth or surface motility, confirms the



216

variable extracellular structures produced by two types of Xcc that differ in host range.

Besides the variable transcription observed by both strains on LB media showed a

variable response under same conditions, which induces variable biofilm formation.

Both, wide and limited Xcc strains, have the ability and the structural components to

produce a mature biofilm, however variation have been observed regarding the

environment in where bacteria were cultured (Jalan et al., 2013a; Jalan et al., 2013b;

Sena-Vélez et al., 2014). In Xcc 306 several sensor and regulation pathways induce the

transition from planktonic to sessile lifestyle and from monolayer to mature biofilms (Li

and Wang, 2011b). Therefore is possible that the less biofilm formation observed for the

narrow host range CBC strain in vitro and in planta was caused by variation in bacterial

sensors which have been described to evolve according to Xanthomonas host’s

adaptation (Mhedbi-Hajri et al., 2011a; Mhedbi-Hajri et al., 2013). Xanthomonas strains

assayed were able to translocate over surfaces; our results showed that type IV pili

transcription diminish this kind of motility in Xcc strains assayed and that the lower

relative mRNA expression levels are, the higher colony growth is observed. All these

results could partially explain the variable behavior observed among wide and limited

host range strains of CBC on biofilm formation and surface motility leading to a better

understanding of bacterial mechanisms related with the plant-host interaction and early

stages of the infection process.

Acknowledgements

This work was supported by Citrus Advance Technology Program, project CRDF546 as

well as through Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria

(INIA) project RTA2008-00048. Marta had a PhD fellowship from INIA.

217

CAPÍTULO 8: CONCLUSIONES

Conclusiones

219

Conclusiones de la tesis

1. El estudio de utilización de compuestos de carbono realizado con las cepas causantes

de cancrosis en cítricos Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc), la mancha bacteriana de

los cítricos X. alfalfae subsp. citrumelonis (Xac), y el agente causal de la

podredumbre negra en crucíferas X. campestris pv. campestris (Xc) mostró perfiles

de utilización de compuestos de carbono distintos. Dichos perfiles agruparon las

distintas cepas en función de su huésped, y la enfermedad producida.

2. Se ha desarrollado un nuevo método para el estudio de quimiotaxis en bacterias en el

que la respuesta quimiotáctica se analiza de forma independiente al crecimiento

celular. Este método permite el análisis de un gran número de muestras en un mismo

ensayo y un elevado número de réplicas por ensayo, cepa, y compuesto o extracto a

evaluar.

3. Se ha demostrado que la respuesta quimiotáctica de las Xanthomonas ensayadas está

relacionada con la gama de huésped y el tipo de enfermedad producida. Dentro de las

cepas causantes de cancrosis en cítricos la cepa modelo Xcc 306 mostró un perfil

quimiotáctico diferente al resto de las cepas estudiadas, mientras que las cepas de

limitada gama de huésped mostraron un perfiles más homogéneos entre ellas.

4. La cepa causante de cancrosis tipo A, Xcc 306 mostró una respuesta quimiotáctica

mayor frente a apoplasto de naranjo dulce, mientras que la causante de la mancha

bacteriana de los cítricos Xac F1 lo hizo frente a lima y la causante de la

podredumbre de las crucíferas, Xc 1609, frente a apoplasto de col china. La respuesta

de todas ellas fue siempre mayor frente a apoplasto que la obtenida frente a extractos

totales de hoja de las mismas plantas. Estos resultados sugieren el papel que juega el

contenido del apoplasto como señalizador en los procesos de colonización del

interior del tejido vegetal.

5. A partir de genomas completos disponibles se han identificado y clasificado las

proteínas aceptoras de grupos metilo (MCPs), sensoras de quimiotaxis en

Xanthomonas causantes de los distintos tipos de cancrosis de los cítricos, Xac y Xc.

Dichas MCPs se clasificaron en 27 grupos filogenéticos permitiendo definir aquellas

que son específicas de cada enfermedad.

Conclusiones

220

6. Los estudios por PCR para MCPs en 35 cepas de Xanthomonas causantes de

cancrosis tipo A mostraron que la mayoría de las cepas estudiadas presentaban un

perfil idéntico de MCPs independientemente de su gama de huésped y su origen

geográfico. Sin embargo seis cepas, entre las que se encontraba la cepa modelo Xcc

306, mostraban un perfil distinto. El árbol construido mediante Neighbor-Joinning

agrupaba en el mismo clúster las cepas causantes de chancro tipo A separadas de las

causantes de cancrosis tipo B y C, y Xac F1 o Xc 1609.

7. La relación entre la presencia de MCPs, el perfil quimiotáctico y la respuesta frente a

distintos extractos de plantas, sugieren el papel de la quimiotaxis en la colonización y

selección del huésped por parte de la bacteria.

8. Las cepas estudiadas tanto patógenas de cítricos como de crucíferas fueron capaces

de formar biopelículas en superficies abióticas, tanto en medios de cultivo con alta

concentración de nutrientes como en un medio que simula las condiciones del

apoplasto en el que además se observa mayor agregación bacteriana.

9. Los estudios de microscopía realizados en plantas con dos cepas causantes de

cancrosis tipo A en cítricos y la cepa causante de la mancha bacteriana de los

cítricos, han mostrado que la capacidad de formar biopelículas en hojas y frutos es

dependiente de la gama de huésped así como del tejido susceptible de ser infectado

por el patógeno.

10. Los estudios de microscopía electrónica de barrido en superficie vegetal de cítricos

han mostrado diferencias en la estructura de las biopelículas entre cepas causantes de

cancrosis de amplia y restringida gama de huésped, así como con la cepa causante de

la mancha bacteriana de los cítricos. Mientras que la cepa de amplia gama de

huésped era capaz de formar biopelículas complejas con un gran número de fibras

interconectando agregados, las cepas de limitada gama de huésped y de la mancha

bacteriana se agregaban formando filamentos simples.

11. Se ha demostrado que las cepas de Xanthomonas estudiadas son capaces de realizar

movimiento tipo swimming en medios con baja concentración de nutrientes. En

medios con alta concentración de nutrientes, sin embargo se vio favorecido el

movimiento en superficie. Además las cepas de Xcc de limitada gama de huésped

presentaron mayor movimiento tipo swimming que las cepas de amplia gama de

huésped.

Conclusiones

221

12. Se ha determinado la presencia de ADN extracelular (ADNe) en las cepas estudiadas

patógenas de cítricos y crucíferas en cultivos tanto líquidos como sólidos, formación

de biopelículas, movimiento tipo twitching y desplazamiento en superficie. Se ha

demostrado que el ADNe es un componente mayoritario en las estructuras

extracelulares de estos patógenos, que se presenta formando filamentos de longitud

variable en función de la cepa y el medio.

13. Los tratamientos con DNAsa en las primeras etapas de la formación de biopelículas

han confirmado la importancia de esta molécula en los procesos de iniciales de

adhesión a superficies, siendo más importante en las cepas de Xcc de limitada que en

las de amplia gama de huésped y la mancha bacteriana de los cítricos. Sin embargo el

papel del ADNe en Xc 1609 como adhesina no parece ser relevante.

14. Los tratamientos de las biopelículas con DNAsa en las Xanthomonas estudiadas

produjeron una ruptura de las mismas en las cepas patógenas de cítricos. La ruptura

llegó a ser mayor del 80% en las cepas de Xcc independientemente de su gama de

huésped. Sin embargo la cepa de Xanthomonas causante de la podredumbre de las

crucíferas no presentó rupturas estadísticamente significativas en los agregados a

ninguna de las concentraciones de DNAsa ensayadas.

15. El análisis de las proteínas extracelulares secretadas por dos cepas causantes de

cancrosis en cítricos con distinta gama de huésped no ha mostrado diferencias

cualitativas entre las dos cepas. En la matriz extracelular producida por estas cepas se

ha identificado la flagelina, la subunidad mayor del pilus tipo IV y una proteína

posiblemente relacionada con inmunidad en plantas y quorum sensing.

16. Los estudios de microscopía realizados en cultivos de las Xanthomonas estudiadas

durante la formación de biopelículas, han revelado la presencia de una gran cantidad

de estructuras filamentosas de grosores variables y distintas del flagelo. Estas

estructuras se producen en mayor cantidad durante la formación de biopelículas que

durante el crecimiento planctónico. Además en medio con alta concentración de

nutrientes se observaron menos estructuras en la cepa de causante de cancrosis de

limitada frente a la de amplia gama de huésped, lo que se relaciona con la baja

formación de biofilm por parte de esta cepa en dicho medio.

17. El análisis transcriptómico de genes relacionados con quorum sensing, flagelo y pili

tipo IV en medios con alta concentración de nutrientes, o simulando condiciones del

Conclusiones

222

apoplasto, confirmaron tanto la variación en la producción de estructuras

extracelulares entre las diferentes cepas como en la formación de biopelículas en

distintos medios. Dentro de los genes estudiados destaca el que codifica para la

subunidad mayor de los pili tipo IV, cuyo papel en las primeras etapas de formación

de biopelículas parece ser determinante para la completa producción de la misma.

18. Las cepas causantes de cancrosis de los cítricos han mostrado ser capaces de

desplazarse en superficie posiblemente mediante movimiento tipo sliding. La cepa de

limitada gama de huésped fue más eficiente en la colonización de la superficie que la

cepa de amplia gama de huésped. Los estudios de microscopía y transcriptómicos

realizados durante este tipo de movimiento, han mostrado que la presencia de

estructuras relacionadas con los pili tipo IV limitan la capacidad de moverse en la

superficie en las cepas de amplia gama de huésped, sin embargo los bajos niveles de

expresión de genes relacionados con el pili tipo IV en la cepa de limitada gama de

huésped así como la menor presencia de estas estructuras, confirmada mediante

microscopía, favorece el mayor desplazamiento en superficie.

19. Los resultados mostrados en este trabajo indican que tanto la formación de

biopelículas como la motilidad y quimiotaxis son factores implicados en las primeras

etapas de la infección causada por el chancro o cancrosis de los cítricos. La variación

observada en estos procesos entre las distintas cepas de las Xanthomonas estudiadas

confirman además el papel que juegan en la selección de las cepas por el huésped.

223

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