MEBRANAS Y OSMOSIS.Emiliano Pérez Asiaín. Biología molecular de la célula 2.

Biología. Facultad de ciencias

Resumen

Realizamos una serie de experimentos para medir los cambios en el tamaño que sufren las células, tanto vegetales como animales. Utilizamos células de epidermis de cebolla además de células de tubércu-lo de papa. Para hacer la evaluación en las células animales, utilizamos eritrocitos de gallo. Realizamos evaluaciones cualita-tivas de todo ellos. De igual manera reali-zamos mediciones de tamaño en las célu-las vegetales y mediciones de absorban-cia para medir la fragilidad osmótica de los eritrocitos.

Introducción

Las membranas biológicas están forma-das por una bicapa lipídica que contiene proteínas integrales y periféricas. Se ca-racterizan por ser semipermeables o se-lectivamente permeables, esto significa que permiten el paso libre de agua y sus-tancias de bajo peso molecular sin carga a través de ellas, más fácilmente que el movimiento de sustancias cargadas y grandes moléculas de soluto. (Denbigh, 1955)

El efecto osmótico en las células se verifi-ca directamente por el fenómeno llama-do "plasmólisis". Esto ocurre cuando una célula viva se introduce en un vaso con agua destilada. A consecuencia de que el

líquido celular consta de una solución acuosa a cuyos solutos disueltos se les impide fluir al exterior, producen una tensión de absorción tal, que ocurre un flujo osmótico a través de la membrana celular, y el agua fluye al interior de la cé-lula; ésta se hincha lentamente hasta lle-gar el momento en que estalla, disper-sando su contenido celular en el agua destilada.

En cambio, si una célula viva, en lugar de ser introducida en agua destilada, se in-troduce en una solución que posee un va-lor de presión osmótica mayor a la dada por el plasma celular (solución hipotóni-ca), la célula disminuye de tamaño, ad-quiriendo aspecto de mórula por el paso del solvente intracelular al exterior. Si la solución en la que se coloca la célula no provoca ningún cambio por el flujo osmó-tico, ya sea interior o exterior a la célula, se le llama solución isotónica.(Del castillo, 1997)

La presión es una fuerza por unidad de área (P=F/A), de tal forma que la presión osmótica generada en la célula resultante de la ósmosis, produce una presión hi-drostática sobre las paredes celulares de-nominada: presión de turgor (Pt). El tur-gor en las plantas da lugar al crecimiento, movimientos y otras respuestas como la apertura de los estomas. Desde que las fuerzas se desarrollan en pares, recor-

dando la Tercera Ley de Acción y Reac-ción de Newton, que dice que las fuerzas reales existen en partes iguales en magni-tud y opuestas en dirección, desde el ex-terior de la célula se ejerce una presión en sentido contrario, pero con la misma magnitud que se llama presión parietal (Pp). Cuando se alcanza la condición de equilibrio, no ocurre difusión neta de agua al interior de la célula y las tres pre-siones se igualan:P0 = Pt= Pp.

Sin embargo en cualquier otra condición que no sea la de equilibrio,Pt= Pp pero ambas serán diferentes a la presión osmótica, P0.

El potencial hídrico permite predecir la dirección de la ósmosis, la que ocurre de un alto a un bajo potencial hídrico. Existe por lo tanto un gradiente con valores al-tos en la zona absorbente de las raíces de la planta y valores bajos en los órganos de la planta que pierden agua por trans-piración (hojas)

La presión osmótica de una solución de-pende de la presencia de solutos disuel-tos. El potencial osmótico de la savia ce-lular puede revelar el grado de hidrata-ción del protoplasma. Sí la concentración de solutos en la vacuola aumenta, su po-tencial osmótico disminuye y el agua se mueve desde el protoplasto hacia la va-cuola, lo que resulta en la deshidratación del protoplasto.

Las células en una fase de crecimiento rá-pido y metabolismo activo, se caracteri-zan por una concentración baja del jugo vacuolar y una alta hidratación del proto-plasma. Las células inactivas y en estado de latencia se caracterizan por una alta concentración de jugo vacuolar y una

baja hidratación del protoplasma, esto se observa en semillas y en los tallos de plantas durante el período de invierno.

La membrana de los eritrocitos es semi-permeable y cuando son colocados en una solución hipotónica el líquido pene-tra osmóticamente a ellos, hasta que al-canza el equilibrio osmótico o hasta que se rompen, dando salida a la hemoglobi-na, la que se lee colorimétricamente. (Lewis & Bain, ,2008)

La capacidad del eritrocito normal para soportar la hipotonicidad se debe a su forma bicóncava, que permite que la cé-lula incremente su volumen en cerca de un 70% antes que la superficie de la membrana se distienda, después de este límite se produce la hemólisis. (Vives-Agui-lar.2006)

Método

La serie de experimentos las dividimos en dos etapas, la primera fue en la que trabajamos con las células vegetales.CebollaPara los experimentos con las células de cebolla, primero tuvimos que hacer dos cortes con navaja, los cortes fueron transversales y dos cortes paralelos de poco más de un centímetro de longitud. En los extremos de estos pedazos de cebolla que resultaron seccionamos longitudinalmente con la navaja, después desechamos las dos primeras hojas y conservamos la que quedó. Posteriormente de la cara interna de la hoja desprendimos una membrana transparente, según las indicaciones no se debe utilizar la capa externa que es mas brillosa.Después colocamos un pequeño

fragmento de esta capa que recibe el nombre de epidermis en un portaobjetos, se colocó una gota de rojo neutro. El siguiente paso fue colocar el portaobjetos y observar en el microscopio. Se dibujó lo observado.lo siguiente que se realizo fue agregarle una gotita de solución salina al 4%, para ello tomamos un poco de solución con una pipeta Pasteur y la depositamos a un lado de la preparación, en el lado opuesto colocamos un pedacito de papel filtro para que este por capilaridad aspire la solución de fosfatos con rojo neutro. Posteriormente dibujamos los cambios que observamos.El siguiente paso consistió en sustituir la solución al 4% por la de 6%, al igual que en los casos anteriores dibujamos los cambios que se observaron.Para finalizar esta parte, se reemplazó la solución de cloruro de sodio al 6% por agua des ionizada utilizando la técnica descrita anteriormente y se dibujaron los cambios observados en el microscopio.

PapaPara la parte del experimento con la papa se le quitó la cascara y posteriormente le tuvimos que hacer 15 cortes utilizando un horadador cilíndrico. Los cortes tenían que ser aproximadamente de 1cm de largo, una vez que obtuvimos las 15 piezas, se midió lo largo y su diámetro y se anoto en una tabla.Lo siguiente que hicimos fue colocar 5 trozos de papa en el sentido de las agujas del reloj dentro de un vaso de precipitados de 100 ml con cada una de las siguientes soluciones. Vaso con 50 ml solución isotónica (NaCl 0.9%). Vas con 50 ml solución hipertónica (NaCl 6%). Vaso con 50 ml solución hipotónica (Agua destilada).

Una ves sumergidos totalmente y acomodados según su orden en la tabla, los dejamos reposar por 30 minutos a temperatura ambiente.Transcurrido el tiempo sacamos los trozos de papa y los secamos con papel absorbente, se volvieron a medir y a pesar como al inicio del experimento, los datos fueron anotados en una tabla. Revisar figura 2.

EritrocitosPara la parte correspondiente a la fragilidad osmótica de eritrocitos comenzamos realizando una evaluación cualitativa de los eritrocitos de la muestra. Para ello colocamos en un portaobjetos un gota de sangre y una gota de solución, primero agua destilada. En otro portaobjetos una gota nueva y solución de cloruro de sodio al 6%.En un último portaobjetos colocamos otra pequeña gota de sangre y una de solución fisiológica. Colocamos sus respectivos cubreobjetos y observamos en el microscopio. Dibujamos todo lo que observamos.La siguiente fase del experimento con eritrocitos consiste en una evaluación cuantitativa de la lisis en las diferentes concentraciones.

Primero se consiguieron 5ml de sangre de gallo en un vacutainer con EDTA como anticoagulante.Se numeraron 7 tubos de ensaye en orden ascendente y se les colocaron las siguientes sustancias por medio de una pipeta.Solución de NaCl 1% pH 7.4, Sin embargo esta fue sustituida por la solución fisiología que utilizamos al comenzar los experimentos. En el primer tubo no se

coloco esta solución, en el segundo fueron .5 ml en el tercero fueron 2ml, en el cuarto se agregaron 2.3ml, en el 5to 2.5ml, al sexto 3 ml y en el ultimo 4.3ml.

El siguiente paso fue agregar agua destilada hasta obtener un mismo volumen en todos los tubos, es decir 5ml. Posteriormente se mezclo por inversión y se agregaron .05 ml de sangre en cada uno de los tubos, echo esto volvimos a mezclar por inversión y dejamos reposando a temperatura ambiente durante 30 minutos.Transcurrido el tiempo de reposo, se volvió a mezclar por inmersión para posteriormente centrifugar a 2000 rpm. Durante 5 minutos.

Figura 1. Lecturas de absorbancia de muestra de sangre.Colocamos la muestra en el

espectrofotómetro y leímos a 540nm utilizando el tubo 7 como blanco. Debido a que nuestra muestra presentaba un color muy opaco, fue necesario hacer una dilución antes de leer en espectrofotómetro. La proporción quedo 19:1. Los datos obtenidos se apuntaron en una tabla. Revisar Figura 1

Resultados

Diámetro(cm) Largo (cm) Masa (gr)inicial final inicial final inicial final

Solución isotónica

1.8 1.8 1.1 1.1 2.73 2.81.8 1.8 1.2 1.2 3.34 3.431.8 1.8 1.3 1.3 3.67 3.24

1.8 1.8 1.1 1.1 3.47 3.57

1.8 1.8 1.3 1.4 3.49 3.59

Solución hipertónica

1.8 1.6 1.2 1.2 3.35 2.781.8 1.6 1.2 1.2 3.61 3.091.8 1.6 1.3 1.3 3.6 3.091.8 1.6 1.1 1.1 2.96 2.511.8 1.6 1.2 1.2 3.37 2.79

Solución hipotónica

1.8 1.8 1.1 1.1 2.92 2.981.8 1.85 1.1 1.15 2.95 3.051.8 1.8 1.1 1.2 2.93 3.031.8 1.8 1.2 1.3 2.7 2.771.8 1.8 1.1 1.1 2.54 2.59

Figura 2. Mediciones de tamaño y masa de trozos de papa.

Tratamientodiámetro (cm) largo (cm) Masa (gr)inicial final inicial final inicial final

Leectura Eritrocitostubo Absorbancia % de NaCl7 0.001 0.866 0.173 0.65 0.176 0.54 0.233 0.463 0.203 0.42 0.135 0.11 0.121 0

Promedio ± DE

Promedio ± DE

Promedio ± DE

Promedio ± DE

Promedio ± DE

Promedio ± DE

Solucion Isotonica1.8 1.8 1.2 1.22 3.34 3.326

solucion Hipertonica1.8 1.6 1.2 1.2 3.378 2.852

solucion Hipotónica1.8 1.81 1.12 1.17 2.808 2.884

Figura 3. Tabla de promedios de los tres tratamientos.

Figura 4Tabla de cambios relativos de los promedios obtenidos en la Figura 3.

Solucio

n Isotonica

solucio

n Hipertonica

solucio

n Hipotónica1.45

1.5

1.55

1.6

1.65

1.7

1.75

1.8

1.85

InicialFinal

Figura 5. Grafica comparativa entre los promedios inicial y final del diámetro de los trozos de papa.

Tratamiento % diámetro % largo % masa Solucion Isotonica

100 98.3606557 100.420926

solucion Hipertonica

112.5 100 118.443198

solucion Hipotónica

99.44751381 95.7264957 97.3647712

Solucio

n Isotonica

solucio

n Hipertonica

solucio

n Hipotónica1.061.08

1.11.121.141.161.18

1.21.221.24

InicialFinal

Figura 6. Grafica comparativa entre los promedios inicial y final del largo de los trozos de papa.

Solucion Isotonica solucion Hipertonica solucion Hipotónica0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

InicialFinal

Figura 7. Grafica comparativa entre los promedios inicial y final del la masa de los trozos de papa.

Para poder graficar (figura 9) los resultados obtenidos de la parte cuantitativa con eritrocitos tuvimos que obtener el porcentaje de hemolisis a partir de la absorbancia registrada en la tabla de la Figura 1.Se utilizó la lectura del espectrofotómetro de cada tubo, dividido entre las unidades de lectura del tubo 1, multiplicado por 100, lo que nos dio como resultado los datos de la siguiente tabla. Figura 8

Figura 8. Tabla de % de hemolisis y % de NaCl

Eritrocitostubo % de hemolisis % de NaCl

7 0.826446281 0.866 142.9752066 0.65 145.4545455 0.54 192.5619835 0.463 167.768595 0.42 111.5702479 0.11 100 0

Figura 9. Grafica de % de hemolisis vs % de NaCl

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

50

100

150

200

250

% Hemolisis vs % NaCl

Series2

% de NaCl

%He

mol

isis

DiscusiónLa serie de experimentos que realizamos para observar la osmosis y el transito del agua en la membrana nos hace plantearnos nuevas preguntas, tales como ¿La concentración en la solución fisiológica que utilizamos para las células de eritrocito, será la misma que se deba utilizar para las células vegetales?

Otra pregunta que sale a flote es si es importante la región de donde se tomen las células vegetales para estos experimentos, puesto que la bibliografía

consultada menciona que las plantas tienen diferente presión osmótica en sus diferentes secciones vasculares, tales como las raíces las hojas o los tallos. Entonces habría de esperarse que los resultados de las células epidermaticas de cebolla, sean un tanto diferentes a los de los tubérculos de papa.

Las células de epidermis de cebolla sufrieron la contracción en el protoplasto que se esperaba. En la preparación con rojo neutro se pudo incluso apreciar la vacuola contraída.

Las células de papa presentaron cambios bastante significativos al ser evaluadas cuantitativamente, las graficas nos permiten contrastar los cambios que ocurrieron en la papa. Los cambios mas significativos ocurrieron en la solución hipertónica, tal como podemos apreciar en la figura 5 ya que esta presenta la diferencia mayor, entre el diámetro inicial y el final. La masa también varió en la concentración hipertónica, sin embargo no fue tan significativo como en el diámetro.

La parte de eritrocitos fue aun más sorprendente, puesto que al observar al microscopio los eritrocitos de la sangre de gallo, observamos una diferencia sustancial con respecto a lo esperado, ya que los eritrocitos de gallo tienen núcleo, no como la mayoría de los mamíferos. Esto nos hace preguntarnos si esta característica influirá en su fragilidad osmótica, ya que el núcleo ocupa un espacio en el citoplasma que bien podría ser utilizado por agua, para tratar de proporcionar un equilibrio osmótico al encontrarse en medios con diferentes concentraciones.

La etapa cualitativa del experimento con eritrocitos, generó datos un tanto confusos, puesto que en la figura 8 encontramos porcentajes de hemolisis superiores al 100 % lo cual no concuerda con la realidad. La grafica que se obtuvo a partir de estos datos tampoco concuerda con la esperada. Puede ser causa de algún error al momento de verter la sangre en la solución. Otra posibilidad es el error al momento de diluir la sangre para que la pudiera leer el espectrofotómetro.

Tampoco hay que descartar la posibilidad de un error al momento de hacer los cálculos, lo que nos arrojaría datos erróneos.ConclusionesSe consiguió observar el cambio en la estructura de la célula, se observo en el microscopio el protoplasto de las células vegetales contraído. Y se pudo medir el cambio que sufrieron los fragmentos de papa en las diferentes soluciones.

Se observaron los cambios en los eritrocitos de gallo, en el microscopio, debido a las diferentes concentraciones agregadas. Sin embargo la parte de cuantificación, por medio de la colorimetría, no se pudo llevar a cabo satisfactoriamente, posiblemente por alguna de las razones expuestas más arriba.

BibliografíaDel Castillo, Luis F. 1997. El fenómeno

mágico de la osmosis. Segunda edición. Fondo de cultura económica. pp37-38

Denbigh, K. G.. 1955.The Principles of Chemical Equilibrium. Cambridge University Press. (Ver secc. II).

Vives-Aguilar.2006 Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematología. 3° Ed.editorial Masson.

Lewis,S. & Bain, B.and Bates,I. 2008 Hematología Práctica. 10°Ed. Editorial Elsevier.

http://www.forest.ula.ve/~rubenhg/relahid/ consultado 11-sep-2010