Marcaje de anticuerpos

Marcaje de anticuerpos Inmunologa Tcnicas InmunoqumicasDentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se basan en la unin Ag-Ac.

AfinidadEspecificidadEstabilidad

Sitios de modificacin Los anticuerpos pueden ser fcilmente modificados para contener las etiquetas tales como biotina, etiquetas fluorescentes o enzimas.La comprensin de los grupos funcionales disponibles en un anticuerpo es la clave para elegir el mtodo adecuado para su modificacin. Por ejemplo:Las aminas primarias (-NH2 ).Los grupos sulfhidrilo (-SH.Residuos de hidratos de carbono que contienen cis-dioles se pueden oxidar (-CHO) para crear aldehdos activos

Las aminas primarias (-NH2 ) Se encuentran en los residuos de lisina y los N-terminal. Estos son abundantes y distribuidos sobre el anticuerpo entero.Los grupos sulfhidrilo (-SH) se encuentran en los residuos de cistena y se forman mediante la reduccin de los enlaces disulfuro selectivamente en la bisagra regin del anticuerpo.Residuos de hidratos de carbono que contienen cis-dioles se pueden oxidar (-CHO) para crear aldehdos activos. Estos estn localizados la regin Fc de anticuerpos y son ms abundantes en anticuerpos policlonales.

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Principales mtodos analticos basados en la reaccin Ag-Ac.Se requiere poder visualizar estas unionesMarcaje con radioistoposEn estas tcnicas al anticuerpo se une un istopo radiactivo los mas utilizados son: 3H, 14C, 13C, 32P, 33P, 35S , 125I, 131I, 24Na.Cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad emitida.

Marcaje con radioistopos

Se construye una curva de calibrado que relacione la medida de radioactividad (cpm) con la concentracin de antgeno no marcado en la muestra. Para as poder determinar la concentracin de un antgeno no marcado.7Marcaje con cromgenos El Ac es unido a un compuesto fluorocromo. Ej. Fluorescena, Rodamina, Texas Red, Cy3 y Cy5 El Ac se une su Ag. Luz UVLa unin es detectada por fluorescencia emitida

CromgenosMarcaje con enzimasSe utilizan enzimas como marcadores inmunoqumicos, que permiten detectar las uniones primarias antigeno-anticuerpo. Actan como un sistema indicador de la presencia de inmunocomplejos al combinarse con sustratos de diversos tipos: cromognicos.Los marcadores enzimticos ms populares incluyen peroxidasa de rbano picante ( HRP ) , fosfatasa alcalina ( AP ) , oxidasa de glucosa y - galactosidasa . Sustratos especficos estn disponibles para cada enzima que genera seales de salida colorimtricos , quimioluminiscente o fluoresente

10Marcaje con biotinaLa biotina se une a las protenas avidina, estreptavidina o NeutrAvidin. Este tipo de interaccin es una de los ms fuertes interacciones no covalentes entre las interacciones protena-ligando. Adems, el pequeo tamao de la molcula representa menos interferencia con la funcin de anticuerpos.La biotinilacin se refiere a protenas marcadas con biotina: puede ser realizado por el mtodo enzimtico y qumico.

Marcaje con biotina Los reactivos de biotinilacin comparten las mismas caractersticas: que comprenden el grupo biotinilo, un brazo espaciador y un grupo reactivo responsable de vincular biotina a los grupos funcionales en las protenas diana.Grupos reactivos comunes y sus respectivos objetivos en las protenas incluyen:N-hidroxisuccinimida (NHS) y sulfo-NHS - aminas primarias, Grupos yodoacetilo Maleimida o disulfuros de piridilo sulfhidrilos. Las aminas primarias en combinacin con EDC carboxilos, Hidracinas y alcoxiaminas glicoprotenas.