Manual_ABCE_Ed2_180812(1)

Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Departamento de Ciencias Biológicas Sección de Ciencias de la Salud Humana Licenciatura en Bioquímica Diagnóstica Clave: 105-39

Agosto, 2012 Edición 2

Manual de Prácticas de Laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales Clave 1635

Autores QFB Martha Patricia Campos Peón QFB René Damián Santos M en C Gloria Leticia Arellano Martínez QFB Beatriz Lucía González Maldonado QFB Luis Antonio Gordillo Reséndiz

Manual de Prácticas de Laboratorio de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales

i

Contenido

Alcance ii

Presentación ii

Vinculación de las prácticas de laboratorio con el

contenido del temario de la asignatura

iii

Objetivo general de la asignatura iv

Objetivo del manual iv

Introducción del manual v

Reglamento de laboratorio vi i

Práctica 1. Elaboración de cartas control 1

Práctica 2 . Obtención de valores de referencia 8

Práctica 3 . Espermatobioscopía directa 12

Práctica 4 . Evaluación del l íquido cefalorraquídeo 22

Práctica 5. Diferenciación de exudados y

trasudados

31

Práctica 6 . Examen coprológico 37

Práctica 7 . Equilibrio hidroelectrolítico y ácido -base 47

Práctica 8. Electrolitos del metabolismo mineral 51

Práctica 8 . Determinación de h ormonas 56

Anexo A 59

Anexo B 60


ii

ALCANCE

El presente manual debe ser utilizado por los profesores asignados al laboratorio de Análisis Bioquímicos

Clínicos Especiales, como fuente de información básica, debido a que contiene las actividades a realizar

en cada una de las prácticas correspondientes a este laboratorio de enseñanza experimental.

Asimismo, los alumnos inscritos en este laboratorio deben utilizar y consultar este manual, como parte de

las actividades cotidianas que se evaluarán en su desempeño dentro del laboratorio.

PRESENTACIÓN

El presente manual consta de las prácticas Elaboración de cartas control, Obtención de valores de

referencia, Espermatobioscopía directa, Evaluación del líquido cefalorraquídeo, Diferenciación de

exudados y trasudados, Examen coprológico, Cuantificación de electrolitos y Determinación de hormonas.

Cada una de las prácticas está redactada bajo el siguiente esquema:

1. la introducción que introduce al estudiante a los conocimientos previos de la práctica; a

continuación, una serie de preguntas, bajo el rubro información complementaria, que el alumno

debe contestar después de haber consultado bibliografía actual, para complementar el marco

teórico;

2. el objetivo (u objetivos) indica los conocimientos o habilidades que el estudiante debe adquirir al

terminar la práctica;

3. los materiales divididos en biológicos, por equipo, por grupo y reactivos, para que el alumno

conozca el material que le será entregado para hacer la práctica;

4. la metodología, donde se describe el fundamento, el significado clínico y la técnica de cada

determinación a realizar durante la práctica;

5. la disposición de residuos, basada en la NOM-087-SEMARNAT-2002.

Para cumplir con los requisitos que indica el Sistema de Gestión de la Calidad Corporativo de la Facultad

de Estudios Superiores Cuautitlán (SGC-C FESC), el manual debe contener espacios para que el alumno

escriba los resultados, la discusión, las conclusiones y las referencias que haya consultado. El grupo

académico de profesores ha observado que es adecuado que el documento se divida en un Manual de

prácticas, que contiene toda la información indicada en los cinco puntos anteriores y que la información

que el alumno obtenga sea registrada en un documento llamado Cuaderno de Prácticas, que complementa

al presente documento.

Los alumnos de la asignatura reciben la versión electrónica en formato PDF (protegido contra cambios) de

este Manual; se les indica que están en libertad de manejarlo en este formato o de imprimirlo, según lo

prefieran. El Cuaderno de prácticas debe imprimirse en hojas de papel bond blanco, dos páginas por hoja

en negro.


iii

VINCULACIÓN DE LAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO CON EL CONTENIDO DEL

TEMARIO DE LA ASIGNATURA

En el siguiente cuadro se indica la vinculación de las prácticas que se desarrollan en la enseñanza

experimental con el temario correspondiente a esta asignatura.

Unidad (número y

nombre)

Práctica con la que se

vincula

Contenido que permite la vinculación

1. Control de calidad

en el laboratorio

clínico

1. Elaboración de

cartas control

En la teoría se abordan los conceptos básicos del

control de calidad interno (CCI) del laboratorio clínico;

en la práctica se elaboran cartas control y se conocen

los principios para la preparación de sueros control,

que son dos elementos que forman parte de la etapa

analítica del CCI.

1. Control de calidad

en el laboratorio clínico

2. Obtención de

valores de

referencia.

Como parte de la calidad que ofrece cada laboratorio,

deben obtenerse los valores de referencia

considerando la población a la que brinda servicio.

2. Estudio de líquido

seminal

3. Espermatobioscopía

directa

En la unidad se aborda la anatomía y fisiología y

patologías relacionadas con el aparato reproductor

masculino; en el laboratorio se realiza una

espermatobioscopía directa, estudio con el que se

inicia la evaluación de la fertilidad del varón.

3. Estudio de líquido

cefalorraquídeo

4. Evaluación del

líquido

cefalorraquídeo

En la teoría se estudia el proceso de formación del

líquido cefalorraquídeo y se resalta la importancia de

su evaluación en patologías relacionadas con el

encéfalo; en el laboratorio se realizan las pruebas

físicas, químicas y microscópicas de este líquido

corporal.

4. Estudio de los

líquidos serosos

5. Diferenciación de

exudados y

trasudados

En la teoría se explica la función de los líquidos

serosos, se conocen los principales sitios de derrame

de estos líquidos corporales; en el laboratorio se

realizan las principales pruebas que permiten

identificar el origen del derrame.

5. Estudio de la

evaluación

gastrointestinal

6. Examen coprológico En la unidad se conocen la anatomía, fisiología y

alteraciones relacionadas con el tracto gastrointestinal;

en la práctica se realiza el estudio de las heces para

detectar indicios de alteración (inflamatoria, de


iv

absorción, de digestión) del sistema digestivo.

6. Evaluación del

equilibrio

hidrolectrolítico

7. Equilibrio

hidroelectrolítico y

ácido-base

8. Electrolitos del

metabolismo

mineral

Tanto en la teoría como en la práctica se describe la

función de los electrolitos; en el laboratorio se realiza

la cuantificación de iones relacionados con el

metabolismo mineral y se explica el fundamento de la

determinación de los electrolitos relacionados con la

polarización de las membranas biológicas.

7. Las hormonas y el

laboratorio

9. Hormonas En la teoría se abordan la función de las hormonas de

importancia diagnóstica; en el laboratorio se discuten,

mediante exposiciones de parte de los alumnos, los

fundamentos de los métodos de determinación de las

hormonas, complementando con el estudio de casos

clínicos de perfiles hormonales, que también dirigen

los alumnos.

OBJETIVO DE LA ASIGNATURA

Conocer y seleccionar las pruebas especiales del laboratorio clínico en patologías específicas, a través de

diferentes metodologías para desarrollar un criterio en la técnica de mayor especificidad al menor costo,

ofreciendo un diagnóstico más exacto y confiable, pero con un alto control de calidad.

OBJETIVO DEL MANUAL

Describir las pruebas y las determinaciones a realizar en cada sesión correspondiente al laboratorio de

Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales, así como también sus fundamentos y utilidad clínica, con la

finalidad de que el alumno tenga información precisa y accesible para desempeñarse satisfactoriamente

durante el desarrollo de la enseñanza experimental.


v

INTRODUCCIÓN DEL MANUAL

La asignatura de Análisis Bioquímicos Clínicos Especiales forma parte del plan de estudios de la carrera

de Licenciado en Bioquímica Diagnóstica, impartida en la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán,

FESC, UNAM.

Se trata de una asignatura primordial en el aprendizaje de los estudiantes de esta carrera, debido a que

describe en su contenido una serie de pruebas y procedimientos realizados en los laboratorios clínicos

como pruebas especiales, es decir, aquellas que no forman parte del trabajo de rutina.

El laboratorio de enseñanza experimental correspondiente a esta asignatura permite que el alumno,

además de conocer los principios, fundamentos y utilidad clínica de las pruebas especiales de laboratorio

clínico en patologías específicas, obtenga las habilidades necesarias para llevarlas a cabo de manera

correcta, de tal manera que en su desempeño profesional pueda aplicarlas oportunamente, apoyando al

diagnóstico de los pacientes.

Asimismo, se adentra al estudiante en el proceso de control de calidad en el laboratorio, para que

reconozca la importancia de realizar adecuadamente los procedimientos con la finalidad de ofrecer un

diagnóstico más exacto y confiable.

Para apoyar a las actividades del laboratorio se cuenta con el presente Manual de prácticas, que cumple

adecuadamente con los requisitos que indica el Sistema de Gestión de Calidad Corporativo de la FESC,

debido a que la enseñanza experimental en los laboratorios de la FESC está en proceso de certificación

bajo la norma ISO-9001-2008.

El presente manual consta de las siguientes prácticas:

1. Elaboración de cartas control, donde se describe el procedimiento para realizar y analizar las cartas

control, que se utilizan en el control de calidad interno de laboratorio; asimismo se conoce el

principio para preparar un suero control, además de los cuidados necesarios en su preparación

cuando se trate de un suero comercial.

2. Obtención de valores de referencia, en esta práctica se describen las características necesarias de

la población y dos métodos para la obtención de valores de referencia.

3. Espermatobioscopía directa, en esta práctica se detalla el estudio del líquido seminal, como prueba

específica para iniciar la evaluación de la infertilidad masculina; también se da a conocer su

importancia en el seguimiento post- vasectomía.

4. Evaluación del líquido cefalorraquídeo, donde se describen los exámenes físico, químico y

microscópico de esta muestra, además de resaltar la importancia de su estudio.

5. Diferenciación de exudados y trasudados, que son derrames de líquido seroso, debido a causas

mecánicas o inflamatorias; la importancia de diferenciar su origen se basa en la finalidad de apoyar

a un adecuado tratamiento.

6. Examen coprológico, se trata de un estudio de las heces con la finalidad de determinar si el

paciente presenta alteraciones en el funcionamiento gastrointestinal.


vi

7. Cuantificación de electrolitos, donde se estudia el fundamento de la determinación de los

electrolitos relacionados con la polarización de las membranas biológicas, sodio y potasio; además

se realiza la determinación de los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral, a través de

métodos espectrofotométricos.

8. Determinación de hormonas, la cual se trata de una práctica teórica donde, por medio de

exposiciones que los alumnos realizan, se explican los fundamentos de los métodos para

determinar hormonas; también se estudian casos clínicos de los perfiles hormonales más

importantes.

Por lo anteriormente descrito, este manual no solamente pretende ser una fuente de información que sirva

de guía para la realización de la práctica, sino además una herramienta de trabajo durante las sesiones

prácticas de este laboratorio.


vii

REGLAMENTO

El presente reglamento es copia fiel del documento Reglamento General para los laboratorios,

perteneciente al Sistema de Gestión de la Calidad Corporativo de la FESC.

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

REGLAMENTO GENERAL

PARA LOS LABORATORIOS

CODIGO: DOC-CB-DEX-01-00

No de REVISIÓN: 01

1) Este reglamento aplicará para personal académico, alumnos y laboratoristas.

2) Para todo trabajo realizado en el laboratorio deberá utilizarse bata blanca con manga larga.

3) La tolerancia para el inicio de la sesión de laboratorio será hasta de 10 minutos a partir de la hora

señalada.

4) Por seguridad, no deben cerrarse las puertas del laboratorio con llave durante las prácticas.

5) En todo momento deberá mostrarse una conducta adecuada en el área de trabajo.

6) Queda prohibido en los laboratorios:

a) Tirar basura fuera del cesto.

b) Ingerir alimentos y/o bebidas.

c) Fumar.

d) Recibir visitas.

e) La entrada a los inter-laboratorios a toda persona ajena a los mismos.

f) Realizar reuniones o convivios en los laboratorios.

g) Salir del laboratorio en el horario asignado para la sesión experimental.

h) Sentarse sobre las mesas de trabajo.

i) Mover el mobiliario de su lugar.

j) Utilizar las gavetas para guardar material que no corresponda a la asignatura.

7) Los residuos peligrosos deben depositarse en los contenedores destinados para tal fin,

entendiendo por residuo peligroso: elementos, sustancias, compuestos, desechos o mezclas de

ellos que en cualquier estado físico representan un riesgo para el ambiente, la salud o los recursos


viii

naturales, por sus características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables o biológico-

infecciosas (Art. 3º de la Ley General del Equilibrio y Protección del Ambiente).

8) Dentro del laboratorio no se permite el uso de teléfonos celulares, reproductores de sonido o

cualquier medio electrónico de entretenimiento. El uso de las computadoras portátiles queda

restringido a temáticas relacionadas con la asignatura.

9) El acceso al laboratorio se permitirá únicamente cuando esté presente un profesor.

10) El uso del laboratorio para trabajo extraordinario, deberá programarse con el profesor responsable

en un horario que no interfiera con aquel destinado para el desarrollo de las prácticas.

11) Para solicitar material y equipo, es requisito indispensable que el alumno llene debidamente el vale

de material (FPE-CB-DEX-01-09) y lo entregue a la persona responsable, dejando como depósito

la credencial vigente de la UNAM.

12) El alumno deberá revisar el material y/o equipo al momento de recibirlo indicando cualquier

anomalía (faltante o material dañado) y será devuelto en las condiciones en que se recibió, de no

hacerlo, se hará acreedor a las sanciones establecidas en cada laboratorio.

13) Es obligación de todos mantener limpio y ordenado el lugar de trabajo y todo el laboratorio.


1

PRÁCTICA No 1.

“ELABORACIÓN DE CARTAS CONTROL”

Beatriz L. González M.

1.1 Introducción

El Laboratorio Clínico es el establecimiento público, social y privado, legalmente establecido,

independiente o ligado a otro establecimiento para la atención médica de pacientes hospitalarios o

ambulatorios, que tenga como finalidad realizar análisis físicos, químicos o biológico de diversos

componentes y productos del cuerpo humano, cuyos resultados coadyuvan en el estudio, prevención,

diagnóstico, resolución y tratamiento de los problemas de salud (NOM-007-SSA3-2011).

El laboratorio clínico debe garantizar que los resultados de estos análisis sean adecuados para el

propósito que se aplican, para esto las actividades que lleva a cabo deben sustentarse en un proceso

documentado llamado control de calidad, que se basa en una serie de parámetros estadísticos que apoyan

a decir que el resultado es lo suficientemente confiable (Aguirre y Lara, 2001).

Debido a lo complejo que resulta mantener la calidad en el laboratorio clínico, los sistemas del

control de calidad se han dividido en dos: el Control de Calidad Interno (CCI) y la evaluación externa de la

calidad (EEC). El CCI se divide en tres etapas: preanalítica, analítica y postanalítica, en cada una de ellas

existen variables que pueden afectar el resultado del proceso que se realice (Sáez y Gómez-Cambronero,

2006). Estas etapas también pueden nombrarse preexamen, examen y postexamen (Sierra, 2006).

En la etapa analítica se utilizan las cartas control, también llamadas gráficas de Levey-Jennings,

que permiten identificar de manera gráfica y estadística los errores cometidos dentro de esta etapa. Se

utiliza una carta control por cada analito o tipo de análisis que se realiza en el laboratorio (Westgard, Barry,

Hunt, 1981; Riu, 2005).

Para elaborar estas cartas se utiliza un suero o material control, que puede ser comercial o

preparado en el laboratorio. Este material debe emplearse durante 30 días en las condiciones cotidianas

de trabajo, de manera que refleje adecuadamente lo que se realiza en la rutina. Los datos obtenidos se

tratan estadísticamente para elaborar la carta control en la que se graficarán los resultados del suero

control (Westgard, Barry, Hunt, 1981).

Las cartas control se evalúan aplicando las multirreglas Westgard, que son criterios que están

basados en métodos estadísticos. La violación de estas reglas debe activar una revisión de los

procedimientos de la determinación de la prueba, el estado actual de los reactivos y la calibración de los

equipos, además del rechazo de los resultados obtenidos con las muestras de los pacientes en la


2

determinación de la prueba realizada. Las causas que llevaron a la aparición del resultado deberán ser

averiguadas para resolverlas y lograr nuevamente resultados confiables (Westgard, Barry, Hunt, 1981).

Siempre que los resultados del suero control no violen las reglas Westgard se garantiza que las

determinaciones realizadas a las muestras de los pacientes son confiables, sólo entonces el laboratorio

clínico cumplirá fehacientemente su función (Sierra, 2006).

1.2 Actividades previas a la práctica

1.2.1 Definir los siguientes conceptos: calidad, control de calidad, sistema de gestión de calidad, control de

calidad interno (CCI), programa de evaluación externa de la calidad (PEEC).

1.2.2 Indicar las diferencias que existen entre normatividad, certificación y acreditación.

1.2.3 Identificar las variables que pueden afectar al resultado en cada una de las etapas del CCI.

1.2.4 Investigar cuáles son los PEEC que hay en México.

1.2.5 Explicar, en un cuadro, las diferencias que existen entre una solución control, una solución blanco y

una solución patrón.

1.3 Objetivos

1.3.1 Conocer el procedimiento para preparar un suero control que se utilice en el área de Química Clínica.

1.3.2 Elaborar una carta control de algún analito del área de Química Clínica, utilizando un suero control

comercial o preparado, según convenga, para poder identificar las variables que afectan al proceso

realizado a través de su evaluación apoyándose en el uso de las Multirreglas Westgard.

1.4 Materiales, equipos y reactivos

1.4.1 Material biológico

1 ml de suero control comercial

1 mL de suero obtenido por sistema al vacío de cada integrante del equipo (Solamente en caso de que no se tenga el

suero control comercial, para prepararlo en el laboratorio).

1.4.2 Material por equipo

- 1 gradilla

- 5 tubos de ensaye

- 1 ligadura

- papel para limpiar celdas (que no deje residuos)

- torundas con alcohol (como mínimo, una por alumno)

- 1 sistema al vacío (tubo tapón rojo, aguja) por alumno

1.4.3 Material por grupo

- espectrofotómetro

- celdas para el espectrofotómetro

- micropipeta (capacidad mínima 10 μL)

- matraz Erlenmeyer de 50 mL

- puntas para micropipeta

- agitador vórtex

- baño maría a 37º C


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1.4.4 Reactivos

Podrá utilizarse cualquier reactivo de Química Clínica que esté disponible y en cantidad suficiente, se

prefieren las determinaciones de glucosa, ácido úrico, colesterol y triglicéridos.

1.5 Procedimiento experimental

1.5.1 Obtención de la muestra biológica

1.5.1.1 Preparar el suero control comercial de acuerdo a las indicaciones del manual de uso (inserto).

1.5.1.2 Para la obtención de la muestra de sangre y separación del suero ver anexo A (solamente si se

requiere preparar el suero control).

1.5.2 Preparación del suero control en el laborator io

1.5.2.1 Principio. Los sueros control preparados por el propio laboratorio consisten en una mezcla de

varios sueros remanentes del trabajo del día, pueden necesitarse diariamente sueros de pacientes sanos

(control normal) o con resultados fuera de valores de referencia (control anormal). Los sueros se guardan y

almacenan en botellas de plástico en el congelador a <20º C. Deben despreciarse las muestras de los

sueros hemolizados, ictéricos, lipémicos y contaminados así como también los sueros de pacientes que se

conozca o sospeche que tengan el virus de la hepatitis C (VHC) o el virus de la inmunodeficiencia humana

(VIH).

1.5.2.2 Técnica.

1.5.2.2.1 Realizar una toma de muestra, con sistema al vacío y tubo de tapón rojo de 7 ml, a un integrante

de cada equipo del grupo.

1.5.2.2.2 Obtener el suero y recolectarlo en un matraz Erlenmeyer de 50 mL y homogenizarlo suavemente

(sin formar burbujas) en vórtex.

1.5.2.2.3 Distribuir a cada integrante de los equipos una porción de la mezcla (aproximadamente 500 μL)

para que realicen la determinación del analito elegido.

1.5.3 Elaboración de la carta control experimental (gráfico de Levey-Jennings)

1.5.3.1 Indicaciones previas . Para realizar la carta control puede utilizarse cualquier analito de Química

Clínica; para fines de enseñanza experimental, se prefieren aquellos cuya técnica sea colorimétrica de

punto final (glucosa, ácido úrico, colesterol, triglicéridos) y que estén disponibles en el laboratorio en

cantidad suficiente. Los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las indicaciones del fabricante, siguiendo

el manual de uso del reactivo (inserto), donde también se pueden consultar los fundamentos de la

determinación y el significado clínico del analito en cuestión. Ver las recomendaciones del Anexo B.


4

1.5.3.2 Técnica

1.5.3.2.1 Determinar al analito elegido siguiendo las indicaciones del manual de uso de reactivo

correspondiente.

1.5.3.2.2 Anotar los resultados en el pizarrón. Los profesores elegirán al menos el 70% de estos datos

para realizar los cálculos que se requieren para la elaboración de la carta control. Los demás

resultados se graficarán en la carta obtenida.

1.5.3.2.3 Calcular el promedio de los resultados elegidos, posteriormente la desviación estándar y el

coeficiente de variación de acuerdo a las siguientes fórmulas:

��…�

CV= σ /

Estos datos también pueden obtenerse utilizando una calculadora que cuente con aplicaciones de

estadística o en el programa de Excel de Microsoft, según convenga. La forma de ingresar los datos y

calcularlos dependerá de la herramienta en cuestión.

1.5.3.2.4 Calcular los rangos de la carta control, con el promedio y las desviaciones estándar obtenidas, de

acuerdo a lo siguiente:

±1S = ( - σ) – ( + σ)

±2S = ( - 2σ) – ( + 2σ)

±3S = ( - 3σ) – ( + 3σ)

Donde ( - σ) es el límite inferior del rango y ( + σ) es el límite superior del rango. Por ejemplo si

queremos calcular el ±1S y se tiene un = 89 y una σ = 12

±1S = (89 – 12) – (89 + 12) = 77 – 101

De esta misma manera se calculan los rangos ±2S y ±3S.

Nota. El símbolo (–) no indica resta, sino el rango que se obtiene.

1.5.3.2.5 Graficar los límites obtenidos como se ilustra en la figura 1.1 (ver página 5). Al momento de

graficar es necesario resaltar en color verde el ±1S pues este rango nos indica el límite aceptable,

el ±2S se delimita de color amarillo porque es el límite de alerta y por último el ±3S de color rojo

pues nos indica que es el límite de acción.

1.5.3.2.6 Graficar en la carta control los resultados que no se utilizaron en los cálculos (ver numeral

1.5.3.2.2).


5

Carta control de ___analito___ Mes _______________ nivel del control __________

Figura 1.1 Muestra de una carta control (Tomada del archivo del autor)

1.5.4 Evaluación de la carta control experimental m ediante las Multirreglas Westgard

1.5.4.1 Evaluar la carta control graficada mediante el diagrama lógico de aplicación de las multirreglas

Westgard (figura 1.2).

Figura 1.2 Diagrama lógico para la aplicación de la técnica de control multirreglas Westgard (Adaptado de

Westgard, Barry, Hunt, 1981)

X

1DE

-1DE

2DE

-2DE

3DE

1 2 5 6

-3DE

3 4Día del mes


6

1.5.4.2 Cuando una corrida está fuera de control, investigar el proceso y corregir el problema, en el

siguiente orden.

1.5.4.3 Determinar el tipo de error que ocurre con base a la regla violada. Un error aleatorio es detectado

usualmente por las reglas 1-3S o R-4S, mientras que un error sistemático es fácilmente indicado

por las reglas 2-2S, 4-1S o 10X.

1.5.4.4 Consultar los manuales de procedimientos para identificar las variables que afectan al proceso

para el tipo de error indicado por la regla de control que ha sido violada.

1.5.4.5 Inspeccionar el proceso de análisis e identificar las causas del problema.

1.5.5 Elaboración de la carta control teórica

1.5.5.1 Identificar en el manual de uso del suero control comercial utilizado, el rango aceptable del analito

que se determinó, éste es el límite ±2S. Algunos insertos indican el promedio y la desviación

estándar.

1.5.5.2 Calcular el promedio, a partir del límite ±2S; ejemplo: si el límite es 240 – 280, el promedio es 260,

es decir el valor medio de este límite.

1.5.5.3 Calcular la desviación estándar, a partir del límite ±2S; de acuerdo con el ejemplo anterior, se

obtiene la diferencia entre el límite superior y el inferior (280 – 240 = 40), este valor se divide entre

cuatro (40/4 = 10). El resultado es la desviación estándar (10).

1.5.5.4 Calcular, utilizando el promedio y la desviación estándar teóricos, los límites ±1S y ±3S, además

del coeficiente de variación. Es recomendable también calcular el límite ±4S.

1.5.5.5 Elaborar la carta control teórica con los límites teóricos calculados, para compararla con la carta

control experimental e identificar el efecto del coeficiente de variación en cada una de ellas.

1.6 Disposición de residuos

1.6.1 Las agujas deben depositarse en el contenedor rígido de residuos peligrosos biológico-infecciosos

(RPBI); su empaque se desecha a la basura municipal.

1.6.2 Las torundas, guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del área

de trabajo deben desecharse en la basura municipal.

1.6.3 En caso de que algún material esté empapado de sangre, depositarlo en la bolsa roja de RPBI.

1.6.4 Los tubos que contengan mezclas reactivas sangre y muestra biológica se depositarán en los

contenedores con cloro dispuestos por el laboratorista para cada fin.

1.6.5 Queda estrictamente prohibido tirar envolturas de alimentos o bebidas en el contenedor de basura

municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse en los botes ubicados fuera del laboratorio.


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1.7 Orientaciones para la elaboración del reporte

En el cuaderno de prácticas debe elaborarse la carta control experimental y teórica; en cada una de estas

se graficarán algunos de los resultados (al finalizar la sesión experimental el profesor responsable de la

práctica indicará los datos a graficar).

Para analizar las cartas control debe calcularse el coeficiente de variación, para conocer el efecto de la de

la variabilidad de los datos; posteriormente, los puntos graficados deben evaluarse de acuerdo a las reglas

Westgard; en caso de que se presente violaciones, indicar si se trató de un error personal o instrumental,

aleatorio o sistemático; además de seguir el procedimiento para conocer las variables que ocasionaron el

error. Es importante que se plantee una posible acción correctiva y una preventiva para evitar que vuelva a

suceder la violación.

Debe resaltarse la importancia de esta herramienta para el control de calidad interno del laboratorio clínico.

1.8 Referencias

- Aguirre, E., Lara, E. (2001) El laboratorio clínico rumbo a la excelencia. LAB-acta 13:17-21

- NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos.

- Riu, J. (2005). Gráficos de control de Shewart. Recuperado de

http://www.quimica.urv.es/quimio/general/grafics_de_control.pdf

- Sáez, S., Gómez-Cambronero, L. (2006). Sistema de mejora continua de la calidad en el

laboratorio clínico. PUV: Valencia

- Sierra, R. (2006). El laboratorio clínico y el control de calidad. Bioquimia 31(002): 39-40

- Westgard, J, Barry, P, Hunt, M (1981) A multi-rule Shewart chart for quality control in clinical

chemistry. Clin Chem 27(3):493-501


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PRÁCTICA No 2.

“OBTENCIÓN DE VALORES DE REFERENCIA”


2.1 Introducción

Además de que el laboratorio clínico cuente con un sistema de CCI que le permita entregar un

resultado oportuno y confiable, debe obtener los valores de referencia propios de la población a la que

ofrece servicio (NOM-007-SSA3-2011). Establecerlos para cada analito es tan importante debido a que el

médico está interesado en determinar si el resultado del paciente es normal o anormal y en qué magnitud,

comparándolo con los valores que se obtienen de la población en la que el paciente se encuentra

(Sánchez-Rodríguez, 2007).

Los valores de referencia son aquellos que se obtienen por una observación o medición de un tipo

particular de magnitud o de un individuo perteneciente a un grupo muestra de referencia; estos valores son

dependientes de la genética, la raza, los estilos de vida y ambientales, y en ocasiones, hasta la edad;

además, el método analítico utilizado y el equipo también pueden afectar.

Los valores de referencia son una guía de los que se podrían considerar pacientes normales, pero

el hecho de encontrarse fuera de ellos no indica una enfermedad, simplemente que el valor obtenido no

está dentro del 95% de la población con la que se calcularon. Debido a lo anterior, se dice que no es válido

utilizar los valores de referencia reportados en los insertos de las casas comerciales, ya que fueron

obtenidos, la mayoría de las veces, de poblaciones muy diferentes a las usuarias del laboratorio (Ceriotti y

Henny, 2008).

El panel de expertos de la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC, por sus siglas en

inglés) desarrolló en 1986, la llamada “teoría de los valores de referencia”, donde describe los lineamientos

para establecerlos, pero hasta la fecha el concepto no es bien comprendido, pues se manejan en forma

indistinta los conceptos valores de referencia, límites de referencia y límites de decisión (Horowitz, 2008).

Para la obtención de estos valores es necesario buscar una población lo más homogénea posible,

respecto a las variables que los afectan, y clínicamente sana, establecer los criterios de inclusión y

exclusión de los individuos, el procedimiento de recolección idóneo de la muestra, el sitio de punción más

recomendable, las condiciones de almacenamiento y transporte de muestras y el método de análisis

óptimo de acuerdo a los parámetros del control de calidad (Winkel y Statland, 1991).

La determinación de valores de referencia implica: obtener datos, ordenarlos, procesarlos

estadísticamente y obtener conclusiones. Cuando la distribución es simétrica (el 95% de los pacientes es

aparentemente sana), se emplea estadística paramétrica; si se trata de distribución asimétrica se usa la

descriptiva, abarcando el percentil 2.5 al 97.5 (Winkel y Statland, 1991).


9

La importancia de la obtención de los valores de referencia no solo radica en hacer una

comparación adecuada de los resultados del paciente con respecto a la población en la que se ubica, sino

que además se cumple con la normatividad oficial en México (NOM-007-SSA3-2011) que indica que el

informe de resultados debe incluir los valores de referencia de cada analito que se determine en el

laboratorio.


2.2.1 Definir los siguientes conceptos: límites de referencia, límites de decisión clínica, límites de corte;

métodos estadísticos paramétricos y no paramétricos; normalidad estadística.

2.2.2 Explicar cómo afectan las diversas variables (relacionadas con el paciente, el equipo y método a

utilizar) en la obtención de valores de referencia.

2.3 Objetivos

2.3.1 Conocer el procedimiento correspondiente para realizar la obtención de valores de referencia en una

población homogénea.

2.3.2 Obtener los valores de referencia en una población de estudiantes (grupo de Análisis Bioquímicos

Clínicos Especiales) de algún analito de Química Clínica, según convenga, mediante el método ±2S

y el método de percentiles, para comparar los resultados obtenidos y determinar cuál es el más

adecuado de acuerdo a la población estudiada.



1 ml de suero obtenido por sistema al vacío de cada integrante del equipo


- 1 gradilla

- 5 tubos de ensaye

- 1 ligadura


- torundas con alcohol (como mínimo una por alumno)

- 1 sistema al vacío (tubo tapón rojo de 4 ml, aguja) por alumno


- espectrofotómetro

- celdas para el espectrofotómetro

- micropipeta (capacidad mínima 10 μL)

- puntas para micropipeta

- agitador vórtex

- baño maría a 37º C

2.4.4 Reactivos

Podrá utilizarse cualquier reactivo de Química Clínica que esté disponible y en cantidad suficiente, se

prefieren las determinaciones de glucosa, ácido úrico, colesterol y triglicéridos.


10


2.5.1 Obtención del material biológico

2.5.1.1 Para la obtención de la muestra y separación del suero ver Anexo A.

Nota. Cada alumno procesará la muestra que obtuvo.

2.5.2 Indicaciones previas . Para calcular los valores de referencia en la población estudiada y para fines

de enseñanza experimental, se prefieren determinar aquellos analitos cuya técnica sea colorimétrica de

punto final (glucosa, ácido úrico, colesterol, triglicéridos) y que estén disponibles en el laboratorio en

cantidad suficiente. Los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las indicaciones del fabricante, siguiendo

el manual de uso del reactivo (inserto), donde también se pueden consultar los fundamentos de la

determinación y el significado clínico del analito en cuestión. Ver las recomendaciones del Anexo B.

2.5.3 Cálculo de valores de referencia: método 2S

2.5.3.1 Procedimiento

2.5.3.1.1 Clasificar los resultados de acuerdo al género (resultados de hombres y resultados de mujeres).

No es necesario realizar esta clasificación en caso que el número de alumnos en el grupo no

permita que la población sea estadísticamente significativa.

2.5.3.1.2 Obtener el promedio y la desviación estándar, como se menciona en el numeral 1.5.3.2.3.

2.5.3.1.3 Calcular el rango ±2S, como se obtiene para las cartas control (ver numeral 1.5.3.2.4). Este

intervalo es el valor de referencia.

2.5.5 Cálculo de valores de referencia: método de p ercentiles 2.5 y 97.5

2.5.5.1 Procedimiento

2.5.5.1.1 Ordenar los resultados del analito utilizado en 1.4.2.1 en forma ascendente.

2.5.5.1.2 Evaluar el primero y el último valor por la fórmula de Dixon, para determinar estadísticamente que

pertenecen a la serie de datos:

D ≤ R/3,

donde D es la diferencia del valor evaluado menos el valor inmediato (considerándose el valor absoluto) y

R es la diferencia entre el último y el primer valor.

2.5.5.1.3 Eliminar el valor evaluado en caso de que no se cumpla la fórmula de Dixon.

2.5.5.1.4 Calcular ((n+1) x 0.025), donde n es el número total de datos. Expresar el resultado sin

décimas.

2.5.5.1.5 Eliminar, al principio y final de cada serie de datos, el número obtenido en el numeral 2.4.5.1.4.

2.5.5.1.6 Los resultados de los extremos son los valores de referencia para esa población.


11




2.6.2 Las torundas, los guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del

área de trabajo deben desecharse en la basura municipal.

2.6.3 En caso de que algún material esté empapado de sangre, depositarlo en la bolsa roja de RPBI.

2.6.4 Los tubos que contengan mezclas reactivas, sangre y muestra biológica se depositarán en los





En el cuaderno de prácticas se realizarán los cálculos pertinentes para obtener los valores de

referencia con los métodos ±2S y percentiles.

Considerar cuál de los dos métodos es el más apropiado para obtener los valores de referencia en la

población utilizada, explicando si se presentaron variables preanalíticas, analíticas y postanalíticas que

pudieran afectar el proceso.

Comparar los valores obtenidos con algunos teóricos, indicando la referencia consultada, verificando

si existe alguna diferencia significativa entre ellos, apoyándose en alguna prueba estadística.

2.8 Referencias

- Ceriotti, F., Henny, J. (2008) “Are my laboratory results normal?” Considerations to be made

concerning reference intervals and decision limits. eJIFCC 19(2) Recuperado de

http://www.ifcc.org/index

- Horowitz, G. (2008) Reference Intervals: practical aspects. eJIFCC 19(2). Recuperado de

http://www.ifcc.org/index

- NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y funcionamiento de los laboratorios clínicos.

- Sánchez-Rodríguez, M. (2007) Valores de referencia o valores de corte clínico: ¿qué criterio tomar

en el laboratorio clínico actual? Bioquimia 32(2):37-38

- Winkel, P., Statland, B. (1991). Interpretación de los resultados de laboratorio: valores de referencia

y toma de decisiones. En Henry, J.B. (Ed) Diagnóstico y tratamiento clínicos por el laboratorio.

Salvat: México.


12

PRÁCTICA No 3.

“ESPERMATOBIOSCOPÍA DIRECTA”

Luis A. Gordillo R.,


3.1 Introducción

El semen es una combinación de espermatozoides suspendidos en las secreciones del testículo y

epidídimo, y las secreciones de la próstata, vesículas seminales y las glándulas bulboureterales que se

mezclan con aquella en el momento de la eyaculación. El producto final es un líquido viscoso denominado

eyaculado (OMS, 2001).

El estudio del líquido seminal, conocido como espermatobioscopía, espermiograma o

espermatograma, es el examen diagnóstico más importante y sencillo para iniciar el estudio de la fertilidad

masculina, es de bajo costo y permite realizar una primera impresión diagnóstica y evaluar los logros de

los tratamientos médicos y quirúrgicos que se llevan a cabo durante el tratamiento. La espermatobioscopía

también tiene aplicaciones en problemas legales, casos de violación, para verificar la eficacia de la

vasectomía (Tapia y Rojas, 2003).

Existen dos tipos de espermatobioscopía: la directa para la cual se obtiene la muestra por

masturbación evitando el uso de condón o lubricantes, y la indirecta, también llamada prueba de Sims-

Huhner, cuya muestra es el fluido que se obtiene después de que la pareja mantuvo coito a término. Esta

última prueba permite evaluar la compatibilidad del líquido seminal con el moco cervical, debido a que

solamente se evalúa la capacidad del espermatozoide para moverse en la secreción vaginal (OMS, 2001).

La espermatobioscopía directa se realiza dividiéndola en dos tipos de examen: macroscópico, en el

que se evalúan el volumen, el pH, licuefacción, viscosidad, olor, color y el examen microscópico, donde se

determina el número de espermatozoides, movilidad, morfología y vitalidad (OMS, 2001).

Debe considerarse que las muestras fluctúan en un rango que varía en función de diferencias

individuales, del tiempo de abstinencia y de detalles finos en la recolección, así como del intervalo

transcurrido entre la obtención y el procesamiento de la muestra; por lo tanto, estos factores pueden hacer

variar los resultados. Nunca se deberá establecer un diagnóstico con la evaluación de una sola muestra.

Son necesarias cuando menos dos o tres más para establecer un diagnóstico certero (Cardona-Maya, et

al, 2008).

Para que una espermatobioscopia sea interpretada correctamente por el médico es necesario

indicarle al paciente una información clara y completa acerca de como recolectar y manipular la muestra

hasta su entrega al laboratorio; también es fundamental que la muestra sea analizada garantizando un

procesamiento correcto, por lo cual se recomienda realizar estos exámenes en un laboratorio de

andrología (OMS, 2001).


13

La OMS (2001) recomienda analizar dos muestras de semen en un lapso no menor a siete días y

no mayor a tres meses, debido a las variaciones normales de la concentración espermática. Debido a esto

no es correcto establecer un diagnóstico de infertilidad con una sola espermatobioscopía anormal, sino

con dos o más pruebas anormales.


3.2.1 Definir los siguientes conceptos: astenozoospermia, poliespermia, oligospermia, teratozoospermia,

hiperespermia, aneyaculación, eyaculación retrógrada, hematospermia.

3.2.2 Indicar las diferencias entre motilidad y movilidad.

3.2.3 Explicar cómo se obtiene el factor para calcular el número de espermatozoides/mL

3.2.4 Explicar cómo se realiza el cálculo para determinar el índice de fertilidad, conocido también como

índice de Hinglais.

3.2.5 Investigar cómo se realiza la espermatobioscopía automatizada.

3.3 Objetivos

3.3.1 Conocer la importancia que tienen las indicaciones que se le dan al paciente para realizar la

recolección y el manejo de la muestra para observar el efecto que tienen en los resultados de

espermatobioscopía.

3.3.2 Conocer las pruebas que se realizan al líquido seminal mediante la realización de una

espermatobioscopía directa para poder apoyar a un diagnóstico adecuado.



Semen humano obtenido por masturbación


-1 gradilla

-1 aplicador de madera

-1 hemocitometro con pipeta de leucocitos

-1 microscopio

-1 tiras de papel pH

-2 tubos de ensaye 12x75

-1 pipeta graduada

3.4.3 Reactivos

- Tren de tinción de Papanicolau -Reactivo de Dacie (formol 1%, citrato de sodio 3%)

- Colorante de Wright y buffer de fosfatos (en caso de que no se cuente con el tren de tinción de Papanicolau


14


3.5.1 Instrucciones para la recolección de la muest ra de semen

3.5.1.1 Abstenerse de tener relaciones sexuales y masturbación por un periodo de entre 2 a 5 días.

3.5.1.2 Obtener la muestra vía masturbación sin usar lubricante ni condones de látex ya que pueden

contener espermicidas.

3.5.1.3 Recolectar la muestra en un contenedor de plástico limpio, estéril y de boca ancha. Es importante

que se recoja la totalidad del eyaculado. En caso contrario, la muestra debe marcarse

“recolección incompleta”.

3.5.1.4 Dentro de la primera hora de recolección de la muestra, llevar el recipiente al laboratorio

manteniéndolo en un bolsillo que esté cerca del cuerpo.

3.5.1.5 Etiquetar el espécimen con: nombre, fecha y hora de recolección

3.5.2 Aspecto y color

3.5.2.1 Significado clínico. El aspecto del líquido seminal es opalescente, el color es gris. La muestra de

semen debe ser examinada inmediatamente después de su licuefacción o dentro de los 60 minutos, por

simple observación a temperatura ambiente. Un aumento o disminución de la turbidez en el aspecto del

semen carecen de importancia clínica excepto cuando es causado por una leucocitosis en procesos

inflamatorios. Puede parecer menos opaca cuando la concentración de espermatozoides es muy baja,

marrón cuando contiene eritrocitos, o amarillenta en el caso de un paciente con ictericia o que consume

algunas vitaminas.

3.5.2.1 Técnica

3.4.2.1.2 Observar la muestra después de la licuefacción, mezclándola suavemente.

3.5.3 Licuefacción

3.5.3.1 Significado clínico. La licuefacción total de la muestra a temperatura ambiente se realiza de 15-60

minutos. El semen se eyacula líquido, pero al poco tiempo se forma un coágulo, que se rompe entre 10 y

20 minutos debido a la acción de enzimas proteolíticas, como la fibrinolisina, posteriomente vuelve a

transformarse en un líquido viscoso. El retraso de la licuefacción por más de 2 horas sugiere una

inflamación de glándulas sexuales accesorias o defectos de enzimas de los productos de secreción de las

glándulas. Una muestra de de semen normal se licúa dentro de los primeros 60 minutos de la eyaculación

a temperatura ambiente aunque esto suele ocurrir dentro de los primeros 15 minutos. En algunos casos, la

licuefacción no es completa a los 60 minutos, lo que puede provocar una inmovilización completa o parcial

de los espermatozoides, inhibiendo su movimiento a través del cérvix del útero.


15

3.5.3.2 Técnica

3.5.3.2.1 Mezclar cuidadosamente la muestra en el recipiente original, evitando agitarla vigorosamente.

3.5.3.2.2 Observar que la muestra se licúe dentro del periodo de tiempo mencionado. No deben

observarse grumos ni hilos. No debe mezclarse continuamente pues se puede acelerar la

licuefacción.

3.5.4 Volumen

3.5.4.1 Significado clínico. El volumen normal del eyaculado es de 2 – 5 mL. Los aumentos de volumen

se relacionan a procesos infecciosos-inflamatorios y a su disminución a procesos obstructivos

acompañados con la alteración en el pH. Los volúmenes reducidos pueden ocasionar una escasa

penetración en el moco cervical por parte de los espermatozoides.

3.5.4.2 Técnica.

3.5.4.2.1 Medir el volumen del eyaculado usando una pipeta de vidrio después de que la muestra esté

totalmente licuada.

3.5.5 Viscosidad

3.5.5.1 Significado clínico. Se dice que una muestra tiene una buena viscosidad cuando la licuefacción

es adecuada. La viscosidad (a menudo denominada “consistencia”) puede interferir con la determinación

de la motilidad y la concentración de espermatozoides y con las pruebas para la detección de anticuerpos

unidos a la superficie de los espermatozoides. También una viscosidad elevada ha demostrado una

invasión excesiva del moco cervical en estudios realizados después del coito.

3.5.5.2 Técnica .

3.5.5.2.1 Aspirar la muestra en una pipeta de 5 mL y permitir la libre caída de las gotas. Observar la

longitud del filamento formado. En una muestra normal se observan gotas pequeñas y bien

definidas.

3.4.5.2.3 Como método alternativo, la muestra puede ser evaluada introduciendo una varilla de vidrio o un

aplicador de madera. La longitud del filamento que se forma no debe exceder los 2 cm de

longitud.

3.5.6 pH

3.5.6.1 Significado clínico. El pH del líquido seminal es de 7.2 - 8.0. Cuando el pH de una muestra es

<7.0 y además presenta azoospermia se debe sospechar de una obstrucción de las vías eyaculatorias o

ausencia bilateral congénita de los vasos deferentes. A valores de pH ácido se produce mortalidad de los

espermatozoides (el pH de la vagina actúa como espermaticida biológico). Cuando existe un pH ácido y un

volumen menor a 2 mL se debe sospechar de una agenesia de vesículas seminales y esta se debe


16

comprobar con una titulación de fructuosa de semen. Los valores de pH en ciertas regiones geográficas

son generalmente iguales o superaciones a 8.0 comparados con valores de 7.2 a 8.0 de otras regiones.

Procesos inflamatorios e infecciones crónicas pueden estar relacionados con alteraciones en el pH.

3.5.6.2 Técnica.

3.5.6.2.1 El pH debe medirse dentro de la primera hora posterior a la eyaculación.

3.5.6.2.2 Distribuir una gota de semen sobre la tira de papel pH.

3.5.6.2.3 Al cabo de 30 segundos el color de la zona impregnada debe ser uniforme; comparar con la

escala de colores de la caja para determinar el pH de la muestra.

3.5.7 Motilidad

NOTA: Esta prueba y la de movilidad son subjetivas, por lo que deben realizarse por duplicado por dos

analistas diferentes y comparar sus resultados. En caso de discordancia es necesaria la participación de

un tercer analista.

3.5.7.1 Significado clínico. La motilidad debe ser mayor al 50% de los espermatozoides con motilidad

grado A, o bien, 25% con motilidad grado A y 25% con motilidad grado B. Si no se cumplen estos criterios

la muestra seminal se califica con diagnóstico de astenozoospermia. El espermatozoide tiene una

estructura flagelar que permite su desplazamiento en el líquido seminal, en la cavidad vaginal, útero y

trompas uterinas. En la evaluación de la capacidad reproductiva o fértil del espermatozoide, la motilidad es

un criterio determinante para su normalidad. La motilidad está disminuida por infecciones de transmisión

sexual, por el varicocele testicular, el frío, muchos días de abstinencia, afectaciones mitocondriales de

origen congénito o adquirido, sustancias adictivas como el cigarrillo y el alcohol. Es una alteración

frecuente en varones con infertilidad. Su tratamiento depende de la causa. En caso de infecciones

(especialmente por Chlamydia) se utilizan antibióticos, cuando hay aumento de la viscosidad del semen se

utilizan los mucolíticos, y si hay sospechas de la deficiencia en la cadena respiratoria mitocondrial se

utilizan vitaminas, aminoácidos, antioxidantes.

3.5.7.2 Técnica.

3.5.7.2.1 Colocar una gota de líquido seminal sobre un portaobjetos limpio y seco.

3.5.7.2.2 Cubrir con un cubreobjetos y montar en el microscopio.

3.5.7.2.3 Enfocar la preparación a 10X y observarla a 40X por lo menos 10 campos.

3.5.7.2.4 Evaluar el porcentaje aproximado de la motilidad de acuerdo a las categorías de la OMS:

Grado A � sus movimientos son rápidos y se desplazan hacia delante

Grado B � son lentos y con desplazamientos no rectilíneos (errantes)

Grado C � cuando no hay desplazamiento del espermatozoide pero si hay movilidad

flagelar (movimiento in situ)

Grado D � cuando el espermatozoide esta inmóvil


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3.5.8 Movilidad

3.5.8.1 Significado clínico. Para la población mexicana es 60% de células móviles. La movilidad

espermática es la capacidad que tiene el espermatozoide para moverse pero sin considerar el

desplazamiento debido a su vitalidad.

3.5.8.2 Técnica

3.5.8.2.1 Evaluar la movilidad de los espermatozoides mientras se realiza la determinación de la motilidad

3.5.9 Morfología

La morfología de los espermatozoides puede observarse en una extensión (frotis) sobre un portaobjetos si

se tiñen con alguna técnica apropiada. En los laboratorios de andrología se utiliza la tinción de

Papanicolau para realizar esta observación, además de que es la técnica que la OMS recomienda. Existen

otros métodos de tinción, tales como la tinción de Shorr, la de Diff-Quick y otros derivados de la tinción de

Romanowsky, sin embargo pueden presentar una tinción de fondo y no tener la misma calidad que la

tinción de Papanicolau. A continuación, se describe los fundamentos de la tinción de Papanicolau y de

Wright, se realizará la segunda en caso de que no se cuente con los reactivos necesarios para la primera

técnica.

3.5.9.1 Fundamentos

3.5.9.1.1 Fundamento de la tinción de Papanicolau . La tinción de Papanicolau es un método de tinción

policrómico, la hematoxilina permite la coloración básica (afinidad por la cromatina, tiñe el núcleo),

mientras que el EA-50 (tiñe el citoplasma de células escasmosas o eosinófilas, además de nucleólos y

cilios) y el naranja G (afinidad por la queratina, penetra rápidamente al citoplasma) logran la tinción ácida ;

los pasos de tinción están entremezclados con soluciones que hidratan, deshidratan y enjuagan las

células, finalizando con un paso de aclaramiento con xilol que produce transparencia celular. El paso final

de montaje permite proteger la muestra contra el secado y la oxidación.

3.5.9.1.2 Fundamento de la tinción de Wright. La extensión de la muestra de líquido seminal (frotis)

permite apreciar mejor la morfología de los espermatozoides, si se tiñen con la técnica de Wright, cuyo

colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñen de color azul las partes ácidas de las células) y

eosina (que tiñe las partes alcalinas) disueltos en metanol (que permite la fijación de las células),

adicionando a la preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la exposición al

metanol). De esta manera, es posible realizar la cuenta diferencial de los espermatozoides normales y

anormales, clasificando en anormalidad de cabeza, de pieza intermedia y flagelo.

3.5.9.2 Significado clínico

Debe haber 80% de formas normales. Las infecciones de transmisión sexual, el estrés, las altas

temperaturas, el varicocele, los tóxicos ambientales, las drogas de adicción (marihuana, ácidos, cocaína


18

etc.), el alcohol, el cigarrillo, antibióticos, agropesticidas, radiaciones han sido asociadas con la

teratozoospermia. También existen factores genéticos, como los casos de la agenesia del acrosoma y la

ausencia de brazos de dineina en el flagelo (síndrome del cilio inmóvil), donde hay inmovilidad de los

espermatozoides.

3.5.9.3 Técnica de la tinción de Papanicolau

3.5.9.3.1 Colocar hacia la orilla un portaobjetos limpio y seco una gota pequeña de la muestra del líquido

seminal.

3.5.9.3.2 Extender la gota hacia el centro del portaobjetos con un aplicador de madera y secar al aire libre.

3.5.9.3.3 Fijar el frotis sumergiéndolo durante un minuto en metanol.

3.5.9.3.4 Las extensiones fijadas se deben teñir de acuerdo al siguiente procedimiento, en cada paso se

retira el excedente de solución

Etanol al 80% 10 inmersiones



Agua destilada 10 inmersiones

Hematoxilina de Harris 3 minutos exactos

Agua corriente 3 a 5 minutos

Etanol acidulado 2 inmersiones

Agua destilada 4 minutos





Naranja G6 2 minutos


EA-50 5 minutos




Etanol al 99.5% 10 inmersiones

Xilol 1 minuto

Xilol 1 minuto

3.5.9.3.5 Montar en resina sintética y observar al microscopio

Nota. Siempre que se cuente con este tren de tinción se preferirá su uso respecto a la tinción de Wright.


19

3.5.9.4 Técnica de la tinción de Wright

3.5.9.4.1 Realizar un frotis como el utilizado en la tinción de Papanicolau

3.5.9.4.2 Teñir el frotis cubriéndolo de manera uniforme con el colorante de Wright por un periodo de 5

minutos.

3.5.9.4.3 Cubrir con solución de buffer de fosfatos por un periodo de 10 minutos, sin decantar el colorante.

3.5.9.4.4 Enjuagar con el chorro de agua corriente y secar al aire libre.

3.5.9.4.5 Montar la preparación en el microscopio, enfocarla a 10X y observarla a 40X.

3.5.9.4.6 Realizar dos conteos de 100 espermatozoides, clasificándolos en espermatozoides normales,

anormales de cabeza, anormales de pieza intermedia y anormalidad de flagelo. Los resultados se

reportan en porcentaje. La figura 3.1 muestra algunas formas anormales de espermatozoides

humanos.

Figura 3.1 Formas anormales del espermatozoide; a, normal, b, cabeza puntiaguda, c, remanente

citoplasmático, d, cabeza de alfiler, e, macrocefál ico, f, microcefálico, g, cabeza estrellada, h, bic efálico, j,

doble flagelo, k, defecto de pieza intermedia (Toma do de Cannon y Henry, 1991).

Con la tinción de Papanicolau, la cabeza aparece teñida de azul claro en la región acrosomal y azul oscuro

en la zona postacrosomal. La pieza media puede mostrarse rojiza, mientras que el flagelo puede ser azul o

rojizo. Las gotas citoplasmáticas, usualmente ubicadas detrás de la cabeza en la pieza media, se tiñen de

verde.

3.5.10 Recuento de espermatozoides: método de la cá mara de Neubauer

3.5.10.1 Fundamento. El líquido de Dacie está compuesto por formol al 1%, que es un espermicida y

citrato de sodio al 3%, que funciona como anticoagulante, este líquido se utiliza para mantener inmóviles a

los espermatozoides y evitar la coagulación de la muestra dentro de la cámara de Neubauer, lo que facilita

su conteo.


20

3.5.10.2 Significado clínico. El valor de referencia es de 20 millones/mL a 150 millones numero total de

espermatozoides. Cuando la cantidad de espermatozoides es inferior a 20 millones/mL o menor a 40

millones en recuento total se denomina oligozoospermia; cuando no hay ningún espermatozoide se

denomina azoospermia. En estos casos, el problema puede ser secretor, es decir, no hay o hay pocos

espermatozoides por daño en el testículo causado por inflamaciones, infecciones, varicocele y otras

causas, o excretor, es decir, se producen espermatozoides pero existe una obstrucción de la vía de

transporte de espermatozoides desde los testículos a la uretra prostática.

Las oligozoospermias o azoospermias pueden ser de origen congénito o adquirido. Es importante

determinar en suero el valor de FSH, la cual está relacionada con el número de espermatogonias. Cuando

FSH está alta, el daño de la espermatogénesis es importante y su pronóstico es reservado; cuando FSH

es baja es posible estimular la espermatogénesis y se espera un resultado favorable. Si FSH está en

valores normales y hay azoospermia, hay que sospechar de un proceso obstructivo.

3.5.10.3 Técnica

3.5.10.3.1 Después de la licuefacción del semen, se realiza una dilución 1:20.

3.5.10.3.2 Posteriormente se lleva hasta la marca de 11 con líquido de Dacie.

3.5.10.3.3 Homogenizar la dilución y proceder al llenado de la cámara de Neubauer.

3.5.10.3.4 Se cuentan 2 cuadros primarios opuestos (aquellos que se utilizan para el conteo de leucocitos,

ver en la figura 3.2 los cuadros marcados con la letra “L”). El conteo se hace por duplicado y se

obtiene el promedio de los conteos.

3.5.10.5 Reportar el número de espermatozoides/mL y el número total de espermatozoides en el

eyaculado de acuedo a las siguientes fórmulas:

Número (no) de espermatozoides (esp)/mL = no de esp X 100000

no total de esp en el eyaculado = no de esp/mL X volumen total de la muestra

Figura 3.2 Posición de los cuadros primarios para e l conteo de espermatozoides en la cámara de Neubaue r

(Adaptado de OMS, 2001)


21


3.6.1 El material utilizado que contenga muestra biológica (pipeta de leucocitos, portaobjetos y

cubreobjetos) se depositará en los contenedores con cloro dispuestos para cada fin.

3.6.2 El sobrante de la muestra biológica contenida en el recipiente recolección, se depositará en la taza

del baño y se accionará la palanca; el recipiente se puede tirar en el bote de la basura del baño.

3.6.3 Los guantes, torundas, papel y demás material desechable contaminados con muestra se

depositarán en el bote de la basura municipal.


municipal del laboratorio. Estas deberán depositarse fuera del laboratorio.


En el cuaderno de prácticas se indicarán los cálculos pertinentes y los resultados de cada determinación

realizada; la discusión debe centrarse en la importancia que tiene la realización de la espematobioscopía

en el diagnóstico de infertilidad, en la donación de esperma en bancos especializados y como seguimiento

a la realización de una vasectomía. Además de considerar la importancia de cada una de las fases del

control de calidad interno en la emisión de resultados confiables.

Los resultados obtenidos deben analizarse integralmente; en caso de que orienten a problemas de

fertilidad dar recomendaciones tales la pertinencia de una nueva evaluación, el uso de otras pruebas para

corroborar los resultados, entre otras.

Para las conclusiones haga referencia si los objetivos planteados fueron alcanzados o no, así como sus

consideraciones sobre el aprendizaje adquirido en su formación profesional.

3.8 Referencias

- Cannon, D., Henry, J.B. (1991) Líquido seminal. En Henry, J.B. (Ed) Diagnóstico y tratamiento

clínicos por el laboratorio. Salvat: México.

- Cardona-Maya, W, Berdugo, J, Cadavid, A. (2008) Comparación de la concentración espermática

usando la cámara de Makler y la cámara de Neubauer. Act Urol Esp 32(4):443-445

- OMS. (2001) Manual de laboratorio de la OMS para el examen del semen humano y la interacción

entre el semen y el moco cervical. 4 ED. Ed Médica Panamericana.

- Tapia, R, Rojas, J. (2003) Semiología del análisis de semen. Bol Col Mex Urol 2:48-52


22

PRÁCTICA No 4.

“EVALUACIÓN DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO”

M. Patricia Campos P.

4.1 Introducción

El liquido cefalorraquídeo (LCR) se forma principalmente en los plexos coroideos ventriculares

mediante una combinación de transporte activo y ultrafiltración del plasma. Una vez formado circula en

sentido ascendente sobre los hemisferios cerebrales, así como en sentido descendente por encima de la

columna vertebral y las raíces nerviosas (Tortora, Derrickson, 2007).

Una característica importante de este líquido es el incremento de sodio, cloruro, magnesio y

glutamina en comparación con el plasma, así mismo se encuentran en menor proporción la glucosa,

potasio, calcio, colesterol, ácido úrico, hierro, tiroxina y zinc (Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, 2003).

El volumen de LCR en un adulto sano es 90 a 150 ml y de 10 a 60 ml en neonatos, este se forma a

un ritmo aproximado de 500 ml al día, lo que equivale de cinco a seis veces el volumen total del líquido de

todo este sistema (Cabrera, 2003).

Las funciones vitales del LCR son:

•••• Amortiguar el encéfalo dentro de la bóveda craneal. Por lo tanto, un golpe en la cabeza

moviliza en forma simultánea todo el encéfalo, lo que hace que ninguna porción de éste sea

contorsionada momentáneamente por el golpe.

•••• Sirve de transporte para los nutrientes que llegan al cerebro y eliminar los desechos.

•••• Fluir entre el cráneo y la médula espinal para compensar los cambios en el volumen de

sangre intracraneal (la cantidad de sangre dentro del cerebro), manteniendo una presión

constante (Tortora, Derrickson, 2007).

La muestra biológica puede obtenerse por medio de punciones realizadas en tres sitios diferentes:

lumbar, cisternal o ventricular (Smith, Kjeldsverg, 2010). Cabe aclarar que su composición varía

dependiendo el sitio de punción, en la zona ventricular hay una mayor cantidad de proteínas respecto a la

zona lumbar (Cabrera, 2003). La punción lumbar es la primera elección en adultos, debe ser realizada por

personal capacitado debido a los riesgos que corre el paciente, los pasos para realizar esta punción son:

• Se coloca al paciente acostado lateralmente con la cabeza y las rodillas flexionadas hacia el

abdomen, con lo que se obtiene una mayor separación de las apófisis espinosas vertebrales

(son prominencias óseas o proyecciones que surgen de la parte posterior de las láminas de

las vértebras).

• Se traza una línea entre ambas crestas ilíacas que pasa, generalmente, entre la tercera y

cuarta apófisis Se elige el espacio más favorable palpando las apófisis espinosas ya sea por

encima o por debajo de la línea trazada. Algunos autores refieren que la punción se puede


23

llevar a cabo entre la 2 y 3 vértebra lumbar sin que existan complicaciones, aunque se

prefiere entre la 3 y 4 debido a que esta zona tiene una mayor zona de trabajo. Se

desinfecta la piel de la región lumbosacra con una solución antiséptica (yodo o alcohol).

• Inyectar 1-2 ml anestésico local (lidocaína 2 %) en el espacio seleccionado.

• La aguja se introduce entre ambas apófisis espinosas atravesando el ligamento

ínterespinoso perpendicularmente a la piel de la línea media. El bisel del trocar se debe

disponer en el sentido de las fibras musculares. En ese momento se desvía la aguja hacia la

cabeza y se introduce hasta 5- 6 cm alcanzándose el espacio subaracnoideo. Se nota una

ligera resistencia cuando se perforan los ligamentos y el saco dural. Se retira el mandril

fluyendo espontáneamente la muestra. Cuando el ligamento ínterespinoso está fibrosado o

es muy resistente es necesario practicar la punción a 1 cm de la línea media moviendo a la

aguja en sentido cefálico y hacia la línea media.

La punción lumbar se indica ante la sospecha de meningitis, aunque también puede aportar

información relevante en enfermedades malignas, hemorragias cerebrales, convulsiones, enfermedades

metabólicas (Smith, Kjeldsverg, 2010). Este tipo de punción está contraindicada en aquellos pacientes que

presentan síntomas o signos de incremento de la presión intracraneal. En estos casos, existe el riesgo de

herniación cerebral, al realizar la extracción. También está contraindicada en los niños con inestabilidad

hemodinámica, coagulopatía o que presenten infección de los tejidos del lugar donde se va a realizar la

extracción (Cabrera, 2003).

El estudio del LCR se divide en el examen físico, evaluándose aspecto, color densidad y pH, el

examen microscópico, donde se determina el número de leucocitos y su cuenta diferencial y el examen

químico, realizándose la determinación de glucosa, cloro y proteínas de forma cuantitativa y cualitativa

(Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, 2003).


4.2.1 ¿Cuándo se utilizan las diferentes zonas de punción para la obtención de LCR?

4.2.2 En una tabla indique la composición bioquímica del LCR, comparándola con la del plasma.

4.2.3 ¿Cómo se distingue una punción traumática de un derrame cerebral cuando el aspecto de la muestra

es sanguinolento?

4.2.4 ¿Qué es la xantocromía? ¿En qué casos se presenta?

4.2.5 ¿Porque es importante el cuidado de la presión durante la obtención del LCR?

4.2.6 Explicar qué son los índices de IgG, de albúmina y de Tourtelotte.

4.2.7 Investigar cómo se utiliza la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el estudio del LCR.

4.3 Objetivos

4.3.1 Conocer los métodos de obtención del LCR y los cuidados al paciente antes, durante y después de la

obtención del mismo.


24

4.3.2 Analizar una muestra de LCR, a través de las diferentes pruebas que se realizan para su estudio

(físicas, químicas, conteo celular y diferencial), y establecer una posible alteración en su composición

que apoye al diagnóstico médico.



Muestra de LCR (proporcionada por los profesores del laboratorio)


- 15 Tubos de ensaye 12x75 mm

- 1Propipeta

- 1 Gradilla

- 1 Microscopio

- 1 pipeta graduada de 1 ml (1/100)

- 2 Portaobjetos

- 1 Aplicador de madera

- 1 Cuadro de papel seda

- 1 Hemocitómetro


- 3 Gradilla

- 1 Centrífuga con balanza

- 1 Agitador vortex

- 1 Baño de incubación a 37º C

- 2 Espectrofotómetro con gradilla

- 10 celdas para espectrofotómetro

- 2 piseta con agua destilada

- 1 bolsa roja para RPBI

- 1 Pipetas graduadas de 1 ml (1/100)

- 3 Pipetas graduadas de 5 ml

- 1 Pipetas graduadas de 2 ml (1/100)

- 2 Vaso de precipitado de 500 ml

- 1 Micropipeta (5 – 50 ul)



- Refractómetro

4.4.4 Reactivos

- Reactivo para la determinación Glucosa

- Reactivo para la determinación Proteínas rojo de pirogalol - Reactivo para la

determinación cloruros

- Hipoclorito de sodio

- Reactivo de Pandy

- Reactivo de None-Apelt

- Colorante de Wright

- Buffer de fosfatos


4.5.1. Obtención de la muestra

La muestra será proporcionada por los profesores del laboratorio.

NOTA. La evaluación de los resultados de las pruebas del examen físico (aspecto, color, densidad y pH)

puede ser subjetiva, por lo que se requerirá de atención de parte de los integrantes del equipo. En caso de

alguna duda se podrá solicitar apoyo a los profesores.


25


4.5.2.1 Significado clínico. El LCR es transparente e incoloro en condiciones normales. Si tiene

apariencia turbia o lechosa, indica un aumento de la concentración de lípidos y proteínas o infección

bacteriana. Una apariencia brumosa nos indica la presencia de leucocitos. Un aspecto sanguinolento nos

habla de una posible hemorragia. La apariencia coagulada nos indica la elevación de proteínas o factores

de coagulación. La presencia de una película en la superficie es un indicio de meningitis bacteriana. La

presencia de color en la muestra se denomina xantocromía. Un color rojizo puede ser causado por la

propia punción y no debe confundirse con la hemorragia, generalmente va disminuyendo conforme sale el

líquido y la centrifugación lo elimina por completo al decantarse los eritrocitos. Un color amarillo procede

de la hemoglobina de procesos hemorrágicos. Aparece excepcionalmente en las ictericias

(bilirrubinorraquia).y en el síndrome de Froin, se observa más típicamente por el bloqueo espinal

(compresión medular tumoral), por otro lado, un color rosa indica una cantidad de oxihemoglobina y un

color anaranjado es indicativo de hemólisis intensa.

4.5.2.2 Técnica

4.5.2.2.1 Homogenizar la muestra por inversión suave.

4.5.2.2.2 Observar la muestra para determinar su aspecto y color

4.5.3 Densidad

4.5.3.1 Significado clínico . La densidad del LCR oscila entre 1.005 y 1.009, debido a que su componente

principal es el agua. La densidad se ve alterada por la presencia de sangre (debido a una punción

incorrecta o hemorragia), elevación de proteínas ó lípidos, entre otras.

4.5.3.2 Técnica

4.5.3.2.1 Calibrar el refractómetro a 1.000 agregando una gota de agua a la cámara y moviendo la perilla

que se encuentra en la parte superior, (si se tienen problemas para visualizar la escala puede

calibrarse con el ocular).

4.5.3.2.2 Limpiar con papel absorbente y agregar gotas de la muestra homogenizada a la cámara y

observar por el ocular.

4.5.3.2.3 Leer la densidad en la escala respectiva, de acuerdo a la línea de separación entre el campo

claro y el oscuro.

4.5.4 pH

4.5.4.1 Significado clínico. El pH del LCR es de 7.3 a 7.4, es ligeramente más alcalino cuando

permanece en reposo, como resultado del desprendimiento de dióxido de carbono. El pH es utilizado como

parte del diagnostico diferencial de las diversas meningitis.


26

4.5.4.2 Técnica

4.5.4.2.1 Introducir una tira de papel pH a la muestra homogenizada.

4.5.4.2.2 Al cabo de 30 segundos comparar con la escala de colores de la caja para determinar el pH de la

muestra.

4.5.5 Conteo celular de leucocitos

4.5.5.1 Significado clínico. En adultos el número debe ser inferior a 5/mm3. El significado de un recuento

entre 5 y 10 células es dudoso, pero por encima de 10 células es inequívocamente patológico. En niños la

cifra de leucocito aumenta hasta 20-30/mm3, sobre todo en los menores de un año.

4.5.5.2 Técnica

4.5.5.2.1 Homogenizar la muestra por inversión suave.

4.5.5.2.2 Llenar la cámara de Neubauer con una pipeta de Thoma o tubo capilar y permitir reposar durante

2 minutos.

4.5.5.2.3 Montar en el microscopio, enfocar con el objetivo de 10X y contar los cuadrantes de leucocitos en

40X.

4.5.5.2.4 En caso de que se dificulte el conteo por el número de células, hacer una dilución con la pipeta

de Thoma y líquido de Turck. El factor por el que se multiplica el número de células se calcula

considerando la dilución, el volumen de la cámara y los cuadrantes contados.

4.5.6 Cuenta diferencial de leucocitos

4.5.6.1 Fundamento. Se utiliza la tinción de Wright, su fundamento está descrito en el numeral 3.5.9.1.2.

4.5.6.2 Significado clínico. En condiciones normales encontramos en el LCR menos de 5 linfocitos/µl,

cuando existe una meningitis purulenta los valores de neutrófilos van de 10-10.000/μl, en el caso de

meningitis viral y tuberculosa los valores son mayores a 100/μl, con un predominio mononuclear.

4.5.6.2 Técnica

4.5.6.2.1. Centrifugar el LCR a 2000 rpm por 5 min, recolectar el sobrenadante en otro tubo y guardarlo

para realizar las pruebas químicas.

4.5.6.2.2 Colocar una gota del sedimento en un portaobjetos y secar a temperatura ambiente.

4.5.6.2.3 Realizar la tinción de Wright de acuerdo a los pasos descritos en 3.5.9.4.2, 3.5.9.4.3 y 3.5.9.4.4.

4.5.6.2.4 Montar la preparación en el microscopio, enfocarla a 10X y observarla a 100X.

4.5.6.2.5 Contar 100 leucocitos diferenciando cada población presente.


27

4.5.7 Determinación de glucosa por el método de glu cosa oxidasa-POD (enzimático colorimétrico)

4.5.7.1 Fundamento . La glucosa oxidasa oxida a la glucosa originando ácido glucónico y H2O2, este

reacciona con un cromógeno (4-aminoantipirina) por la reacción de Trinder, para dar una quinona que

absorbe entre 492 y 550 nm. La intensidad de color producida es directamente proporcional a la

concentración de glucosa.

4.5.7.2 Significado clínico. Los valores normales son de 50-75 y hasta 80 mg/dl en el adulto y en infantes

de 70-90 mg/dl. Al realizar este examen se debe tomar en cuenta si el paciente cursa una hiperglucemia,

de ser así pueden registrarse valores mayores a 60 mg/dl por esta causa. Se puede observar un aumento

de glucosa en encefalitis epidémica (aumento discreto), poliomielitis, meningitis serosas y urémicas e

hipertensión endocraneana. Se observa una disminución de glucosa en estados de hipoglucemia,

meningitis purulentas (acompañando la pleocitosis y la turbidez), meningitis tuberculosa (el descenso es

lento), en casos graves de sífilis meningovascular, carcinomatosis meníngea, síndrome de Reye

(hepatoencefalopatia aguda metavírica), cisticercosis con meningoencefalitis, meningitis reumatoide,

granulomatosa por sarcoidosis y hemorragia aracnoidea.

4.5.7.3 Técnica

4.5.7.3.1 Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda

es 505 nm.

4.5.8 Determinación cualitativa de proteínas por lo s métodos de Nonne-Apelt y Ross Jones

4.5.8.1 Fundamento . La prueba de Nonne Apelt es específica de las globulinas, puesto que precipitan por

el sulfato de amonio a media saturación; no sucede lo mismo con la de Ross Jones pues en el punto de

contacto la concentración del sulfato de amonio es del 85 %, o sea una solución saturada, que precipita no

sólo las globulinas sino también la albúmina.

4.5.8.2 Significado clínico. La presencia de un color claro indica cantidad normal de globulinas. La

presencia de precipitado turbio es indicativo del exceso de globulinas. La formación de un anillo turbio

entre los 2 líquidos se observa en casos patológicos.

4.5.8.3 Técnica para la realización de la prueba de Nonne Apelt .

4.5.8.3.1 Colocar en un tubo de ensaye 0.5 ml de la solución de sulfato de amonio saturado y 0.5 ml de

LCR.


28

Proteína Complejo Rojo

de pirogalol molibdeno

Complejo proteína - Rojo de pirogalol-

molibdeno

4.5.8.3.2 Reposar 3 min y leer los resultados de acuerdo a lo siguiente:

La mezcla no cambia de aspecto, reacción negativa (-).

Opalinidad, reacción positiva (+).

Enturbiamiento, reacción positiva (++).

Enturbiamiento fuerte, reacción positiva (+++).

Enturbiamiento lechoso, reacción positiva (++++).

4.5.8.4 Técnica para la realización de la prueba de Ross Jones .

4.5.8.4.1 Colocar en un tubo de ensaye 1.0 ml de solución saturada de sulfato de amonio y 0.5 ml de LCR,

evitando romper la interfase que se forma.

4.5.8.4.2 Observa sobre fondo oscuro el anillo blanquecino que aparece en el punto de contacto. Si él

anillo no aparece a los 2 minutos la reacción se considera negativa.

4.5.8.4.3 Reportar la intensidad del anillo con cruces (+ a ++++)

4.5.9 Determinación cualitativa de proteínas por el método de Pandy

4.5.9.1 Fundamento. La albúmina y globulina precipitan en una solución de fenol.

4.5.9.2 Significado clínico. Se considera normal si no se observa turbidez alguna. Al igual que las otras

pruebas permite reconocer una inflamación crónica o incipiente. La presencia de una ligera turbidez indica

una presencia anormal de globulina. La reacción es un índice de la fracción globulínica del LCR. Sin

embargo Pandy dice que es una prueba para albúmina y globulinas. En la inmensa mayoría de los casos

un Pandy negativo corresponde a albuminorraquias normales.

4.5.9.3 Técnica

4.5.9.3.1 Agregar una gota de LCR a 0.5 ml de la solución saturada de fenol.

4.5.9.3.2 Observar sobre fondo oscuro para apreciar la opalescencia o la turbidez producidas. Es

aconsejado por algunos autores, la comparación con un LCR normal, lo que facilita la apreciación

de las pequeñas opalescencias.

4.5.9.3.3 La forma de reportar los resultado es igual que en las pruebas anteriores.

4.5.10 Determinación cuantitativa de proteínas por el método de rojo de pirogalol (colorimétrico)

4.5.10.1 Fundamento. Las proteínas presentes en la muestra reaccionan en medio ácido con el rojo de

pirogalol y el molibdato, formando un complejo colorido. La absorbancia a 600 nm debido a la formación

del complejo colorido es directamente proporcional a la concentración de proteína en la reacción.

+


29

4.5.10.2 Significado clínico. Se consideran normales resultados de 15-40 mg/dl por punción lumbar, para

el caso de punción cisternal es de 10-25 mg/dl, y ventricularmente es de 5-15 mg/dl. Debe considerarse

que la presencia de sangre en LCR da lugar a un incremento la concentración. Las proteínas pueden

observarse elevadas cuando existe variación en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica: en

procesos inflamatorios y degenerativos del neuroeje y meninges, daños vasculares del sistema nervioso,

meningitis supuradas, hemorragia cerebral, procesos obstructivos del espacio subaracnoideo y síndrome

de Guillain-Barré.

4.5.10.3 Técnica

4.5.10.3.1 Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de

onda en que se lee es 600 nm.

4.5.11 Determinación de cloro por el método de tioc ianato de mercurio (colorimétrico)

4.5.11.1 Fundamento. Los iones cloruro de la muestra reaccionan con tiocianato de mercurio desplazando

el ión tiocianato. El tiocianato libre en presencia de iones férricos forma un complejo colorido medible

espectrofotométricamente. La intensidad del color, leída entre 440 y 500 nm, es proporcional a la

concentración de iones cloruro presente en la muestra ensayada.

4.5.11.2 Significado clínico: La cifra normal es de 700 a 750 mg/dl. (120-130 mEq/L) expresados en

NaCl. Se observa un aumento en los procesos en que existe una retención de cloruros en sangre, en las

nefritis con insuficiencia renal, deshidrataciones “puras” sin pérdida de electrolitos. Se observa una

disminución en hipocloremias (ocasionado en la neumonía por neumococos), Meningitis tuberculosas y

purulentas y en la enfermedad de Heine-Medin y sífilis nerviosa.

4.5.11.3 Técnica

4.5.11.3.1 Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de

onda es 540 nm.


4.6.1 Los tubos con muestra biológica y los portaobjetos se depositarán en los contenedores con cloro

dispuestos para este fin.

4.6.2 Los guantes, papel y demás materiales desechables empapados con la muestra se depositarán en la

bolsa roja de residuos peligrosos biológicos infecciosos.

2 Cl- + Hg (SCN)2 HgCl2 + 2 SCN-

SCN- + Fe3+ FeSCN2+


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En el cuaderno de prácticas realizar los cálculos necesarios para obtener los resultados de cada prueba

realizada y compararlos con los valores de referencia correspondiente.

Dado que la muestra es proporcionada por los profesores, debe considerarse si la toma de muestra puede

afectar a las determinaciones realizadas explicando cómo sucedería.

Integrar los resultados para verificar si orientan hacia algún diagnóstico; indicar si existen otras pruebas

que puedan complementarlos.

Realizar las recomendaciones necesarias al paciente y al médico, de acuerdo al probable diagnóstico.

Resaltar la importancia del estudio de esta muestra en patologías específicas relacionadas con el sistema

nervioso central.

4.8 Referencias

- Cabrera, C. (2003) Líquido cefalorraquídeo y la punción lumbar en el siglo XXI. Rev Posg VIa

Cáted Medicina 128. Recuperado de http://med.unne.edu.ar/revista/indice.html#128

- Seehusen, D., Reeves, M., Fomin, D. (2003) Cerebrospinal fluid analysis. American Family

Physician. 68 (6): 1103 – 1108

- Smith, G., Kjeldsverg, C. (2010). Líquido cefalorraquídeo, sinovial y líquidos serosos del

organismo. En Henry, J.B. Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marbán: Madrid.

- Tortora, G. Derrickson, B. (2007). El encéfalo y los nervios craneales. En autor Principios de

anatomía y fisiología. Médica Panamericana: México, D.F


31

PRÁCTICA No 5.

“DIFERENCIACIÓN DE EXUDADOS Y TRASUDADOS”

René Damián S.

5.1 Introducción

Los líquidos serosos corporales se derivan del plasma y se encuentran en la cavidad pleural,

pericárdica, peritoneal y articular, en estas cavidades corporales están delimitadas por una membrana

serosa parietal y una visceral que están constituidas por una capa de tejido conjuntivo con abundantes

capilares y vasos linfáticos y una capa superficial de células mesoteliales (Tortora y Derrickson, 2007).

Estos líquidos son un ultrafiltrado del plasma que se derivan de una abundante red capilar de la

membrana serosa. Su formación es similar a la del líquido extravascular y aquí intervienen la presión

hidrostática, la presión coloidosmótica y la permeabilidad capilar (Tortora y Derrickson, 2007).

En condiciones fisiológicas hay una pequeña cantidad de líquido en cada una de estas cavidades

que permite el movimiento de las vísceras en cada uno de estos espacios. Un sistema complejo regula el

volumen de estos líquidos. Cuando se alteran estos mecanismos responsables de la formación o

absorción del líquido se produce un aumento excesivo de estos líquidos, de este modo el líquido se

acumula cuando se aumenta la permeabilidad capilar y la presión hidrostática o cuando disminuye la

presión coloidosmotica o se obstruye el drenaje linfático. La presión hidrostática impulsa la salida del

líquido de los capilares hacia el interior de las cavidades (Strasinger y DiLorenzo, 2008).

Las proteínas plasmáticas son las que producen la presión osmótica y contrarrestan la presión

hidrostática manteniendo el liquido en los capilares, la diferencia de presión osmótica entre el plasma y el

liquido intersticial es proporcional a la concentración de proteínas, principalmente la albumina. Los vasos

linfáticos también desempeñan un papel importante en la absorción de agua, proteínas y otros solutos

desde el espacio extravascular (Strasinger y DiLorenzo, 2008).

Los exudados son líquidos inflamatorios cuya formación depende de un aumento de la

permeabilidad capilar debido a alteraciones que implican directamente a estructuras de la superficie de

determinadas cavidades (mesotelio, vasos linfáticos, capilares y articulaciones). Por ejemplo: tuberculosis,

infecciones bacterianas, tumores, entre otras (Smith, Kjeldsverg, 2010).

Los trasudados son derrames provocados por factores mecánicos que influyen en la formación o

resorción de líquido plasmático, por ejemplo, a causa de la reducción de la albúmina del plasma o

incremento de la presión venosa (presión hidrostática o coloidosmótica). La diferencia entre un trasudado y

exudado se basa en niveles arbitrarios de decisión clínica que han sido determinados empíricamente

(Smith, Kjeldsverg, 2010).

El estudio habitual del derrame pleural y sinovial de etiología desconocida incluye en general la

determinación de su aspecto general, nivel total de proteínas, recuento de eritrocitos recuento de


32

leucocitos, recuento diferencial y estudio microscópico con Wright y Gram, cultivo y estudio citológico

(Smith, Kjeldsverg, 2010; Strasinger y DiLorenzo, 2008).

Otros estudios que resultan de gran utilidad son: la determinación de glucosa, LDH, pH, fosfatasa

alcalina y biopsia (Smith, Kjeldsverg, 2010). También es importante señalar que existen técnicas de

imagen, que son importantes para el diagnóstico de las diversas patologías relacionadas. La radiografía de

tórax permite detectar derrames muy pequeños de hasta 100 ml adoptando diferentes posiciones como el

decúbito lateral. En ocasiones es necesario recurrir a la ecografía para localizar un derrame (Strasinger y

DiLorenzo, 2008).

El estudio de estos líquidos serosos proporcionan información importante sobre la fisiopatología de

los órganos y tejidos donde se generan y es función del laboratorio la selección de magnitud diagnostica

apropiada y con buena capacidad discriminatoria, para que este estudio aporte información decisiva en la

práctica clínica.


5.2.1 Describa en un cuadro las características distintivas de los exudados y trasudados.

5.2.2 Menciona otras pruebas que complementarían la práctica y las situaciones en que se usarían.

5.2.3 ¿Qué enzimas son cuantificadas en el estudio de los exudados y trasudados?

5.2.4 Definir los siguientes conceptos: paracentesis, toracocentesis, artrocentesis, pericardiocentesis.

5.2.5 En un cuadro, indique la composición, la cantidad, las situaciones en las que aumenta y sus hallazgos

de laboratorio de los líquidos peritoneal, sinovial, pericárdico y pleural.

5.3 Objetivos

5.3.1 Determinar si el líquido seroso proporcionado en la práctica es un exudado o un trasudado mediante

la realización de pruebas físicas, químicas y microscópicas para conocer la importancia de su

diferenciación.



Muestra de líquido seroso proporcionada por los profesores del laboratorio


- 3 Cubreobjetos - 1 Pipeta graduada de 1ml

- 1 Cuadros de papel seda - 6 Tubos de ensaye de 13 x 100 mm

- 1 Propipeta - 1 Gradilla

- 3 Portaobjetos - 1 Microscopio


33


- 1 Baño de incubación a 37º C - 1 Centrifuga con balanza

- 1 Micropipeta (5 – 50 ul) - 1 Micropipeta (40 – 200 ul)

- 1 Micropipeta (200 – 1000 ml) - 1 Espectrofotómetro con gradilla

- 5 Frasco gotero con aceite de inmersión - 10 celdas para espectrofotómetro

- Recipientes para desechos (RPBI) - 1 Pinzas para portaobjetos

- 3 pipetas graduadas de 5 ml - 3 gradillas

- 2 Vaso de precipitado de 500 ml - 1 Dispensador de puntas azules

- 1 Dispensador de puntas amarillas

5.4.4 Reactivos

- Reactivo para la determinación Glucosa - Hipoclorito de sodio

- Reactivo para la determinación Proteínas totales (Biuret) - Benzal

- Ácido acético glacial - Buffer de fosfatos

- Reactivos para la tinción Wright - Aceite de inmersión


5.5.1 Obtención de la muestra

La muestra será proporcionada por los profesores.


5.5.2.1 Significado clínico. Los líquidos amarillentos claros, parecidos al suero o a la orina normal,

pueden corresponder a trasudados de congestión. El líquido puede ser de color amarillento transparente,

turbio por su contenido elevado de células, hemático por la presencia de hematíes o quiloso por aumento

de grasas en forma de triglicéridos. Una apariencia lechosa ó fibrinosa puede ser debida a un aumento de

la concentración celular o lipídica. El examen del sobrenadante tras la centrifugación permite su

diferenciación.

5.5.2.2 Técnica

5.5.2.2.1 Homogenizar la muestra por inversión suave y observarla

5.5.2.2.2 En caso de que la muestra presente turbidez se observa después de la centrifugación a 2000

rpm por 5 minutos.

5.5.3 Densidad

5.5.3.1 Significado clínico . El exudado generalmente tiene una densidad superior 1.018 y un trasudado

con una densidad menor a 1.018


34

5.5.3.2 Técnica

5.5.3.2.1 Seguir la técnica descrita en 4.5.3.2.

5.5.4 pH

5.5.4.1 Significado clínico. En los exudados el pH es inferior a 7.30 en trasudados el pH es mayor a 7.30.

El pH es inferior a 7.2 en muchos derrames exudativos de diversa etiología especialmente en empiema

pleural y derrames neoplásicos. Sin embargo en los derrames quilosos y los secundarios a embolismo

pulmonar no desciende por debajo de este límite.

5.5.4.2 Técnica

5.5.4.2.1 Seguir la técnica descrita en 4.5.4.2.

5.5.5 Prueba de Rivalta

5.5.5.1 Fundamento. Se usa para distinguir exudados de trasudados. Los exudados contienen una

proteína que es la “seromusina” esta precipita con ácido acético, la presencia de dicha proteína en una

muestra de liquido filtrado, se revela por una muestra de precipitado o floculación cuando se le adiciona

ácido acético.

5.5.5.2 Técnica

5.5.5.2.1 Colocar en un tubo de ensaye 2 ml de ácido acético diluido.

5.5.5.2.2 Agregar una o dos gotas del líquido de punción analizado.

5.5.5.2.3 Si las gotas se hunden dejando un rastro claramente visible de precipitado blanco se puede

afirmar que es un exudado. Si se disuelven inmediatamente se trata de un trasudado.

5.5.6 Determinación de proteínas por el método de B iuret (colorimétrico)

5.5.6.1 Fundamento . En medio alcalino, los grupos amino terminales de los enlaces peptídicos de las

proteínas se unen al cobre, formando un tetracomplejo (4 amino terminales y un cobre) generando un

intenso color violeta azulado. La intensidad del color formado, leída entre 540 y 560 nm es proporcional a

la concentración de proteína total en la muestra ensayada.

5.5.6.2 Significado clínico. Una cifra mayor a 3 g/dl es significativa de un exudado, por debajo de 3 g/dl

es indicativo de un trasudado. Una ascitis rápida muy rica en proteínas es sospechosa de trombosis

suprahepática. La fibronectina aumenta en la ascitis maligna, por carcinomatosis peritoneal. También en

derrames pleurales tuberculosos o en conectivopatías (son un grupo de enfermedades que se caracterizan

por ser generalmente procesos multisistémicos. Los órganos diana varían en cada proceso lo que les da

una entidad propia a cada una de ellas. En todas ellas se presume una etiopatogenia común, la aparición


35

de autoanticuerpos específicos). La beta-2 microglobulina está presente en los derrames debidos a

procesos hematológicos.

5.5.6.3 Técnica

5.5.6.3.1 Revisar el manual de uso del reactivo. Seguir las indicaciones del Anexo B. La longitud de onda

es 540 nm.

5.5.7 Determinación de glucosa en la muestra contro l por el método de glucosa oxidasa-POD

(enzimático colorimétrico).

5.5.7.1 Fundamento. El fundamento está descrito en el numeral 4.5.7.

5.5.7.2 Significado clínico. La determinación de la glucosa sirve para el diagnóstico diferencial de los

exudados. Cuando la glucosa es menor de 60 mg/dl sugiere derrame pleural paraneumónico, tuberculosis,

neoplasia o artritis reumatoide. Los valores bajos de glucosa se deben al consumo excesivo por parte del

metabolismo celular o bacteriano. En los derrames paraneumónicos complicados valores de glucopleura

inferiores a 40 mg/dl son indicación de drenaje. En neoplasias, la glucosa baja indica gran número de

células neoplásicas y mayor probabilidad de obtener citología positiva. En la artritis reumatoide la

glucopleura baja se debe a un bloqueo del paso de la misma desde la sangre al espacio pleural.

5.5.8 Examen microscópico

5.5.8.1 Fundamento. Se realiza una observación del sedimento sin realizar tinción, bajo el microscopio a

40X, buscando la presencia de células mesoteliales y de la inflamación, además de cristales. En aquellos

casos en que se identifique una cantidad considerable de leucocitos, el sedimento se observará tiñéndolo

con Wright (para el fundamento ver 3.4.9.2 y la técnica ver 3.4.9.4).

5.5.8.2 Significado clínico. El sedimento de los derrames trasudados puede presentar algunas células

mesoteliales de descamación, cuyo único interés estriba en la posible confusión con células atópicas, por

su alteración y degeneración en los derrames crónicos. El conteo celular aumenta en las infecciones

bacterianas. La presencia de cristales de urato en fagocitosis se observa con gota artrítica. En lupus

eritematoso sistemático se observan células LE. Los linfocitos predominan en derrames tuberculosos pero

también los podemos encontrar en neoplásicos. Polinucleares en exudados de origen bacteriano no

tuberculosos por cocos generalmente. Eosinófilos son elevados en enfermedades como periartritis nodosa;

Churg Straus, etc. que también se le llama enfermedad del colágeno, pero también abundan en derrames

parasitarios o alérgicos, incluso en la tuberculosis o cáncer.

5.5.8.3 Técnica

5.5.8.3.1 Centrifugar la muestra a 2000 rpm durante 5 min.


36

5.5.8.3.2 Decantar el sobrenadante en otro tubo.

5.5.8.3.3 Resuspender la pastilla, colectar una gota del líquido con una pipeta Pasteur y colocarla sobre un

portaobjetos, cubrir con cubreobjetos.

5.5.8.3.4 Montar la preparación en el microscopio, enfocar en 10X y observar a 40X.

5.5.8.3.5 Buscar y registrar la presencia de células mesoteliales, leucocitos, bacterias y cristales.

5.5.8.3.6 Reportar la presencia de estas células como negativo, escasos, moderados, abundantes e

incontables.

5.5.8.3.7 En caso que los leucocitos se encuentren de moderados a incontables, realizar un frotis

colocando una gota del sedimento homogenizado, extendiendo suavemente sobre un

portaobjetos. Secar al aire y teñir con Wright (ver 3.5.9.4).


5.6.1 Los tubos y portaobjetos con muestra biológica se depositarán en los contenedores con cloro


5.6.2 Los guantes, papel y demás material desechable contaminado con muestra se depositarán en la

bolsa roja de RPBI.

5.6.3 Los guantes y su envoltura se desecharán en el bote de la basura si no están contaminados.




En el cuaderno de prácticas que entregarán después de haber terminado la parte experimental y con base

a los resultados de las pruebas realizadas al líquido en estudio, se analizará si se trata de un exudado o

trasudado; también es pertinente sugerir pruebas complementarias para la clasificación y para conocer el

origen de la posible patología del líquido seroso. Debe resaltarse la importancia de diferenciar el origen del

líquido, para iniciar un tratamiento, dar un seguimiento y valorar posibles patologías relacionadas con el

derrame.

5.8 Referencias

- Smith, G., Kjeldsverg, C. (2010). Líquido cefalorraquídeo, sinovial y líquidos serosos del

organismo. En Henry, J.B. Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marbán: Madrid.

- Strasinger, S. DiLorenzo, M. (2008). Líquidos serosos. En autor Análisis de orina y de los líquidos

corporales. Médica Panamericana: Buenos Aires

- Tortora, G. Derrickson, B. (2007). Principios de anatomía y fisiología. Médica Panamericana:

México, D.F


37

PRÁCTICA No 6.

“EXÁMEN COPROLÓGICO”

René Damián S.

6.1 Introducción

La eliminación de los productos de desecho de la digestión es indispensable para la salud. Dichos

productos excretados se conocen como excremento o heces. Un adulto excreta entre 100 a 300 gr de

materia fecal por día, la excreción depende de una serie compleja de procesos de absorción, secreción y

fermentación. El examen de estas se realiza con frecuencia en la evaluación de trastornos

gastrointestinales y sus resultados ayudan a descubrir un sinfín de enfermedades como pueden ser,

sangrado y obstrucción gastrointestinal, ictericia obstructiva, enfermedades parasitarias, disentería, colitis

ulcerosa y en los síndromes de mala absorción y mala asimilación (Tortora y Derrickson, 2007).

El intestino delgado mide aproximadamente 7 m de longitud y está divido en duodeno, yeyuno e

ilion; mientras que el intestino grueso mide de 1.2 a 1.5 m. En el intestino delgado se degrada las grasas,

las proteínas y los carbohidratos ingeridos a unidades que sean absorbibles, las secreciones pancreáticas,

gástricas y biliar ayudan a este proceso, para preparar su trasporte activo a través de las mucosa. Otras

sustancias activas que se absorben, son vitaminas liposolubles, hierro y calcio, también se absorbe agua y

electrolitos para posteriormente regresarlo al torrente sanguíneo. El contenido del intestino delgado

(quimo) principia su paso hacia el recto en tan solo 2 a 3 h después de haber comido, pero el proceso no

es completo sino hasta 6 a 9 h después de la comida (Tortora y Derrickson, 2007).

El intestino grueso realiza funciones menos complejas que el intestino delgado. El colon proximal o

recto absorbe la mayor parte del agua restante. La absorción colónica del agua y electrolitos es un proceso

pasivo. Después de comer hay movimientos de mayor actividad propulsiva (peristaltismo). Estas ondas

peristálticas tienen su origen en reflejos gastrocólicos y duodenocólicos, los cuales se inician después de

la comida, se producen al llenarse el duodeno con el alimento proveniente del estomago. Los músculos del

colon están inervados por el sistema nervioso autónomo. El sistema nervioso parasimpático estimula el

movimiento, y el simpático inhibe este movimiento. Varias veces al día se presenta peristaltismo masivo, lo

cual hay distención del recto y se inicia la urgencia de la defecación. En personas con motilidad normal y

con ingestión de una dieta mixta, el tiempo de transito o de paso (desde la ingesta del alimento hasta de

defecación) es de 24 a 48 h. De esta forma, la función normal del colon encierra 3 procesos fisiológicos: 1)

absorción de líquidos y electrolitos; 2) contracción que mezclan que mezclan el contenido, lo exponen a la

mucosa y lo transportan al recto, y 3) defecación (Tortora y Derrickson, 2007; García y López, 2007).

El examen coprológico completo debe incluir el análisis de las propiedades físicas, químicas y

microscópicas de los elementos contenidos en la muestra. También existen otros exámenes como son el

coproparasitoscópico y el coprocultivo, el primero se realiza para la observación de parásitos en sus

diferentes fases del ciclo de vida, en una muestra fresca; el segundo, la muestra se siembra en medios de


38

cultivos selectivos para el desarrollo e identificación de las bacterias entéricas patógenas (Heisig, Threatte,

Henry, 2010; Strasinger y DiLorenzo, 2008).

Para el estudio del examen coprológico el paciente debe realizar un régimen alimenticio durante 3

días antes de la recolección de la muestra; existen diferentes regímenes alimenticios, pero se puede

utilizar el siguiente:

• Desayuno: un tazón de leche con cereal y azúcar, pan blanco ligeramente tostado, untado con

mantequilla.

• Comida: un plato de puré espeso de papas, un bistec de ternera de 150 g. algo crudo por dentro,

un huevo pasado ligeramente por agua en tortilla blanda, un pan blanco con mantequilla, sin

postres de ninguna clase.

• Merienda: en caso de acostumbrarla, igual que el desayuno.

• Cena: igual que la comida, exceptuando la carne (García y López, 2007).

Cuando se recolecte la muestra debe evitarse mezclarla con orina o sangre menstrual, debe llevarse

lo más pronto posible al laboratorio y el clínico la examinará por sí mismo antes de registrarla.

El examen coprológico se indica cuando el paciente padece alteraciones inflamatorias, infecciosas o

fisiológicas en donde se ven comprometidas las funciones de asimilación y la digestión (Heisig, Threatte,

Henry, 2010; Strasinger y DiLorenzo, 2008).

Las pruebas que se realizan a las heces en este examen se dividen en físicas (color, olor, consistencia

y forma), químicas (sangre oculta) y microscópica, donde se evalúa la función gastrointestinal, a través de

la observación de los residuos alimenticios, presencia de bacterias, parásitos o células sanguíneas (Heisig,

Threatte, Henry, 2010).

6.2 Actividades complementarias a la práctica

6.2.1 Esquematizar completo el aparato digestivo.

6.2.2 Mencionar y esquematizar imágenes de los artefactos y de restos de alimentos que se observan en el

examen microscópico de heces.

6.2.3 Definir creatorrea, esteatorrea, melena, esprúe, acolia, aquilia, amilorrea y meconio.

6.2.4 ¿Cómo se recolecta una muestra para la determinación cuantitativa de grasa? ¿Cómo se realiza esta

determinación?

6.2.5 ¿Cómo se determinan el urobilinógeno y pigmentos biliares en las heces?

6.2.6 Indicar el fundamento de la determinación de azúcares reductores. Investigar la utilidad de las tabletas

Clinitest en esta determinación.

6.3 Objetivos


39

6.2.1 Examinar una muestra de heces a través de las pruebas que conforman un examen coprológico para

conocer la importancia de su correcta evaluación en la determinación de alteraciones de los procesos y

órganos involucrados en la digestión.



Muestra de heces (aproximadamente 5 g)


- 3 Tubos de ensaye 13x100

- 1 Gradilla

- 2 Pipetas Pasteur con bulbo

- 1 Abatelenguas

- 1 Microscopio

- 1 Tubo de ensaye 15x150

- 5 Portaobjetos

- 5 Cubreobjetos

- 1 Cuadro de papel seda

- 1 Aplicador de madera

- 1 Tira indicadora de pH


- 1 Gradilla

- 5 Bulbos para Pipeta Pasteur

- 5 Pipetas Pasteur

6.5.4 Reactivos

- Azul de metileno al 0.1%

- Ácido acético al 3%

- Sudán III

- SSF

- Tarjetas Hema screen

- Tabletas reactivas Clinitest

- Lugol

- Benzal

- Hipoclorito de sodio


6.5.1 Obtención de la muestra

6.5.1.2 Como se mencionó anteriormente debe seguirse el régimen de prueba indicado, evitando el

consumo excesivo de carne pues puede afectarse el resultado de la detección de sangre oculta.

6.5.1.2 El paciente debe orinar en la taza del baño.

6.5.1.3 La defecación se realiza en un cómodo ó recipiente escrupulosamente limpios, evitando la

contaminación con sangre (proveniente de fisuras anales o menstruación) u orina.

6.5.1.4 Existen tubos de plástico con tapas que tienen adaptadas unas cucharillas con las que se pueden

recolectar aproximadamente de 5 a 10 g de heces. En caso de no contar con estos tubos, puede

utilizarse un abatelenguas estéril para realizar la recolección. Si se trata de paciente pediátrico, la

muestra se recoge del pañal, pero debe evitarse el uso de talco o pomadas en la piel del bebé.


40

6.5.1.5 Las muestras pueden ser examinadas una hora después de la evacuación, aunque puede ser

posible refrigerarlas el tiempo que sea indispensable hasta su evaluación.

6.5.2 Consistencia, apariencia y color

6.5.2.1 Significado clínico. Normalmente, la deposición debe ser sólida, cilíndrica y consistente para

mantener esta forma después de excretada. El régimen de prueba sin celulosa puede dar lugar a unas

heces algo más blandas, pero normales. Los estreñimientos provocan deposiciones pequeñas, duras y a

menudo en bolas. Las falsas diarreas de los constipados se caracterizan por la deposición mixta,

compacta la primera parte y pastosa al final. En la diarrea son fluidas, pastosas o líquidas. En el cólera se

han comparado con la "sopa de arroz", y en la tifoidea con el "puré de guisantes", pero esta última es

inconstante en su presentación. La deposición de los enfermos con insuficiencia gástrica descompensada

parece una "papilla". En las esteatorreas de origen biliar, pancreático o entérico (esprúe y diarreas

esprueiformes, celiaquía) es cremosa y pegajosa, como "mantequilla". En la dispepsia de fermentación son

generalmente pastosas, esponjadas y espumosas.

Normalmente y con dieta mixta, la deposición es de color pardo o marrón más o menos oscuro en el

adulto, oscureciéndose a medida que pasa el tiempo expuesta al aire. La estercobilina es el pigmento biliar

responsable de este color. Con dieta láctea y en los lactantes es amarillo canario. Con dieta cárnica se

hace marrón oscuro. Una alimentación rica en verduras tiñe las heces de un color verdoso, mientras que si

preponderan las papas y el pan, las heces se aclaran hacia un marrón amarillento. En la acolia de las

ictericias obstructivas y en la fase aguda de las hepáticas son blanco-grisáceas. Las "diarreas de

fermentación" y en las esteatorreas del esprue, insuficiencia pancreática provocan heces amarillentas, con

diferentes matices. El ruibarbo, sen, santonina y otras plantas tiñen de amarillo las deposiciones. En las

diarreas duodenales se observan de color verde, por la biliverdina. Las heces negras suelen indicar

presencia de sangre proveniente de la parte superior del tracto gastrointestinal que abarca el esófago, el

estómago o la primera parte del intestino delgado. La razón es que la sangre presenta una apariencia

típica de alquitrán después de haber estado expuesta a los jugos digestivos del cuerpo. Las heces color

marrón o rojo vivo por lo general sugieren que la sangre proviene de la parte inferior del tracto

gastrointestinal, aunque algunas veces, un sangrado masivo o muy rápido en el estómago causa también

heces de color rojo brillante. La sangre en forma de estrías en la superficie indica hemorroides o

anormalidades anales. También pueden observarse negruzcas después de la ingesta de sangre, moras,

mosto de uva, vino tinto o de tomar preparados de carbón, hierro, bismuto, sales de plata, por lo tanto

deben evitarse 3 a 5 días antes de la recolección de la muestra.

6.5.2.2 Técnica.

6.5.2.2.1 Observar la muestra inmediatamente después que llega al laboratorio.


41

6.5.3 Olor

6.5.3.1 Significado clínico. El olor fecal característico (reportado como sui géneris), varía de acuerdo a la

ingesta, aunque se hace fétido en todos los procesos que cursan con putrefacción de las proteínas

ingeridas o endógenas (lo cual puede ocurrir, aunque no obligadamente, en pacientes con insuficiencia

gástrica, biliar o pancreática, colitis, cáncer, etc.), y sobre todo en las melenas, en el cáncer de colon y en

el absceso abierto en el intestino grueso. En las "diarreas de fermentación" con tránsito rápido a partir del

ciego son de olor rancio, agrio. Durante el tratamiento con antibióticos no emiten olor. Las diarreas

urémicas y en las fístulas rectovesicales provocan un olor amoniacal.

6.5.3.2 Técnica.

6.5.3.2.1 Detectar el olor de las heces en cuanto se abre el frasco donde se recolectaron.

6.5.4 Cantidad

6.5.4.1 Significado clínico. La muestra utilizada en el examen coprológico no es representativa para

determinar la cantidad. Es necesario que el paciente recoja las heces en un periodo de tres días para

calcular los gramos producidos en 24 h. La cantidad depende fundamentalmente de los residuos

alimenticios procedentes de la dieta, según su contenido en verduras y frutas, así como de la existencia de

estreñimiento o diarrea en el enfermo. Con una alimentación corriente, se eliminan normalmente entre 150

y 250 g por día de heces. Con un régimen vegetariano se llega a 370 g, mientras que con un régimen

cárnico se excretan sólo unos 60 g. diarios.

En estados patológicos, como el megacolon o la esteatorrea, pueden excretarse un kilogramo diario, y si

se trata de diarreas agudas graves, pueden eliminarse varios litros diarios. En el estreñimiento y tumores

del intestino grueso y recto disminuye la cantidad y el número de deposiciones diarias.

6.5.5 pH

6.5.5.1 Significado clínico. Los valores normales van de 7.0 – 8.0, aunque depende de múltiples factores,

dietéticos y endógenos, por lo que este dato es de escaso valor clínico. Si es menor a 7.0 puede tratarse

de una dispepsia fermentativa, mientras que en la diarrea e insuficiencia gástrica es mayor a 8.0.

6.5.5.2 Técnica

6.5.5.2.1 Humedecer una tira de papel pH, con agua destilada.

6.5.5.2.2 Poner el papel en contacto con las heces en varios puntos de la superficie y también el interior,

usando solo un lado de la tira de papel.

6.5.5.2.3 Comparar el lado de la tira de papel pH que no estuvo en contacto con las heces con la escala de

colores de la caja de las tiras para determinar.

6.5.6 Detección de sangre oculta por el método del guayaco (HemaScreen)


42

6.5.6.1 Fundamento . La prueba se basa en la oxidación de los compuestos fenólicos presentes en el

guayaco con la producción de quinonas de color azul. Debido a su similitud con los grupos prostéticos de

la peroxidasa, la porción hematina de la molécula de hemoglobina puede funcionar en una manera

pseudoenzimática, catalizando la oxidación del guayaco.

Hemoglobina + Revelador

Oxidación del guaiaco

6.5.6.2 Significado clínico : En condiciones normales este parámetro es negativo. La prueba positiva es

indicativa de sangre oculta y sangrado masivo del tracto gastrointestinal. La sangre en las heces puede

provenir de cualquier parte a lo largo del tracto intestinal desde la boca hasta el ano. Cuando hay

suficiente sangre como para cambiar la apariencia de las heces, el médico particularmente querrá saber el

color exacto con el fin de tratar de estimar el sitio del sangrado (ver 6.5.2.1). En presencia de carcinoma

gástrico o intestinal, la sangre que proviene de los tumores muchas veces es degradada a porfirina, que no

es detectada por las pruebas químicas.

6.5.6.3 Técnica

6.5.6.3.1 Escribir la información requerida en la parte frontal de la tapa de la tarjeta Hema-Screen y abrir la

tapa.

6.5.6.3.2 Con un aplicador de madera tomar con un extremo un poco de muestra superficial y con el otro

de la parte interna.

6.5.6.3.3 Distribuir las muestras en cada una de las ventanas y cerrar la tapa con ayuda de la pestaña.

Secar a temperatura ambiente.

6.5.6.3.4 Abrir la parte trasera de la ventana perforada y agregar 2 gotas de revelador en la parte trasera

de las ventanas. La presencia de sangre provoca la formación de un halo verde-azulado en torno

a las heces.

6.5.7 Determinación de azúcares reductores en heces

6.5.7.1 Fundamento . Esta determinación debe utilizarse en caso de que la muestra sea de paciente

pediátrico y lo más pronto posible después de emitida, pues la glucosa y otros azúcares son consumidos

por bacterias. Se utilizan las tabletas reactivas Clinitest para la determinación cuantitativa de azúcar en

orina de Bayer, con algunos cambios en la técnica. El sulfato de cobre de las tabletas Clinitest reacciona

con los azúcares reductores (glucosa, fructosa, galactosa y pentosa) presentes en la muestra,


43

reduciéndolo a óxido cuproso. El color resultante va desde azul verdoso a naranja, dependiendo de la

cantidad de azúcar presente. El hidróxido de sodio proporciona el medio alcalino necesario para que se

lleve a cabo la reacción. El calor requerido es proporcionado por la reacción del hidróxido de sodio con el

agua y con el ácido cítrico. El carbonato de sodio y el ácido cítrico ayudan a disolver la tableta.

6.5.7.2 Significado clínico. En condiciones normales no deben existir azúcares reductores en la muestra,

pues son digeridos y absorbidos en su totalidad en el intestino. Pueden presentarse en intolerancia a la

lactosa, mala digestión por falta de actividad enzimática, mala absorción o distrofia de la mucosa intestinal.

6.5.7.3 Técnica

6.5.7.3.1 Realizar en el recipiente de la muestra una emulsión con un volumen de agua destilada y una

pequeña cantidad de la muestra.

6.5.7.3.2 Colocar la emulsión en un tubo de ensaye de 13x100 con ayuda de una pipeta Pasteur. Esta

emulsión se utilizará en las observaciones al microscopio.

6.5.7.3.3 Transferir 15 gotas de la emulsión a un tubo 15x150 y adicionar una tableta de Clinitest sin agitar.

6.5.7.3.4 Esperar 15 segundos y agitar suavemente para mezclar el contenido. PRECAUCIÓN: evitar el

contacto con la piel, los ojos, las membranas mucosas y la ropa pues la reacción es exotérmica.

6.5.7.3.5 La lectura se realiza comparando el color del líquido contenido en el tubo con la carta de colores

del manual de uso de las tabletas.

6.5.8 Examen microscópico directo

6.5.8.1 Significado clínico. Si la muestra es observada dentro de la primera hora de la deposición, puede

evidenciarse la presencia de parásitos vivos o bacterias. Los primeros deben ser negativos, mientras que

las bacterias son escasas.

6.5.8.2. Técnica

6.5.8.2.1 En un portaobjetos, colocar una gota de la emulsión (ver 6.5.7.3.1) y colocarle un cubreobjetos,

para después montar la preparación en el microscopio.

6.5.8.2.2 Enfocar a 10X y realizar la observación a 40X, buscando parásitos vivos y evaluando la cantidad

de bacterias como escasas, moderadas o abundantes.

6.5.9 Fibras musculares en heces

6.5.9.1 Fundamento. Las fibras musculares en contacto con el ácido acético se hinchan, lo cual permite

su visualización

6.5.9.2 Significado clínico. Deben ser negativas o escasas. Existe creatorrea en la insuficiencia gástrica

con aquilia, en la insuficiencia pancreática debida a pancreatitis crónica o neoplasias.


44

6.5.9.3 Técnica

6.5.9.3.1 En un portaobjetos colocar una gota de emulsión de realizada (ver 6.5.7.3.1) y agregarle una

gota de ácido acético al 10%, mezclándola con un aplicador de madera.

6.5.9.3.2 Enfocar la preparación a 10X y observar a 40X, buscando fibras musculares rectangulares con

estriación cruzada claramente evidente.

6.5.10 Presencia de grasas neutras en heces

6.5.10.1 Fundamento. Las grasas neutras en heces son detectadas por hidrólisis mezclando una o dos

gotas de Sudán III con la muestra, mientras que los ácidos grasos y jabones se observan con el azul de

metileno. Esta es una prueba cualitativa, para saber la cantidad de grasa en heces debe de hacerse una

cuantificación en una muestra de 72 h. La grasa puede reconocerse macroscópicamente siempre y

cuando la excreción de grasa sea considerable.

6.5.10.2 Significado clínico. La grasa en las heces debe ser negativa o escasa. La esteatorrea en las

deposiciones puede deberse a uno o varios mecanismos como lo son: tránsito acelerado, déficit

enzimático de su digestión, déficit de absorción o hipersecreción endógena. Unas veces predomina la

grasa neutra, sin desdoblar, y en otros casos los ácidos grasos y jabones.

6.5.10.3 Técnica

6.5.10.3.1 En dos portaobjetos colocar una gota de emulsión de realizada en cada uno (ver 6.5.7.3.1) y

agregarle una gota de azul de metileno al primero y de Sudán III al segundo, mezclando las

preparaciones con un aplicador de madera.

6.5.10.3.2 Enfocar a 10X y observar a 40X. En la preparación de azul de metileno se buscan ácidos grasos

o jabones, que se manifiestan como agujas azules. Las grasas neutras se observan en la

preparación de Sudán III como esferas rojas.

6.5.11 Presencia de restos parasitarios

6.5.11.1 Fundamento. El yodo tiñe de amarillo los núcleos de quistes.

6.5.11.2 Significado clínico. La presencia de parásitos debe ser negativa. Entre los protozoarios que

afectan a los humanos se encuentran las amebas, los flagelados del tipo de Giardia lamblia y Chilomastix,

y los ciliados, como el Balantidium coli. Pueden aparecer las formas activas o sus quistes. También puede

evidenciarse la presencia de huevos de helmintos. Estos parásitos pueden ocasionar diarrea o

estreñimiento, comprometiendo la asimilación y la digestión.


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6.5.11.3 Técnica

6.5.11.3.1 En un portaobjetos colocar una gota de emulsión de realizada en cada uno (ver 6.5.7.3.1) y

agregarle una gota de lugol mezclándolas con un aplicador de madera.

6.5.11.3.2 Enfocar la preparación a 10X y observar a 40X, buscando restos parasitarios.

6.5.12 Presencia de almidón

6.5.12.1 Fundamento . El yodo tiñe de café las vacuolas que contienen glucógeno y de azul los grumos de

almidón en presencia de lugol, debido a una adsorción o fijación del yoduro sobre las unidades de glucosa

de la amilasa.

6.5.12.2 Significado clínico . La búsqueda de amilorrea tiene menos interés clínico que el de los demás

pero sirve principalmente para evidenciar un tránsito acelerado a través del colon. Aparece cuando hay

una ingestión excesiva de féculas con o sin defectos de insalivación y masticación. Cuando existe una

Insuficiencia pancreática la coexistencia de esteatorrea y creatorrea en este síndrome global confirma el

diagnóstico. La amilorrea puede faltar en pancreopatías evidentes.

6.5.12.3 Técnica

6.5.12.3.1 Para realizar la búsqueda de vacuolas con glucógeno y restos de almidón, puede utilizarse la

preparación para la búsqueda de parásitos (ver 6.5.11.3.1)


6.6.1 La suspensión debe regresarse al contenedor original de la muestra, que junto con el resto de la

muestra biológica depositará en la taza del baño y se accionará la palanca, el contenedor puede

tirarse en el bote de la basura del baño.

6.6.2 Los guantes, papel y demás material desechable contaminado se depositarán en la bolsa de la

basura municipal.

6.6.3 Las cajas petri y portaobjetos con muestra biológica se depositarán en los contenedores con cloro





En el cuaderno de prácticas que entregarán después de haber realizado la parte experimental, con base a

los resultados obtenidos (de los exámenes físico, químico y microscópico), indicarán si el paciente padece

alguna patología gastrointestinal, relacionada con una malabsorción, malasimilación, maladigestión o de


46

otra índole como, cáncer gástrico, ulcera gástrica etc. Es conveniente que se sugieran otras pruebas que

puedan complementar el probable diagnóstico.

6.8 Referencias

- García, P., López, G. (2007). Evaluación de la absorción y metabolismo intestinal. Nutrición

Hospitalaria 22(Suppl 2): 5-13

- Heisig, D., Threatte, G., Henry, J.B. (2010) Diagnóstico de laboratorio de las alteraciones

gastrointestinales y pancreáticas. En Henry, J.B. Laboratorio en el diagnóstico clínico. Marban:

Madrid

- Strasinger, S. DiLorenzo, M. (2008). Análisis de heces. En autor Análisis de orina y de los líquidos

corporales. Médica Panamericana: Buenos Aires

- Tortora, G. Derrickson, B. (2007). El aparato digestivo. En autor Principios de anatomía y fisiología.

Médica Panamericana: México, D.F


47

PRÁCTICA No 7.

“EQUILIBRIO HIDROELECTROLÍTICO Y ÁCIDO BASE”


Luis A. Gordillo R.

G. Leticia Arellano M.

7.1 Introducción

Los electrolitos son iones que existen en los líquidos corporales; el metabolismo resulta afectado

por las concentraciones absolutas y relativas de estos electrolitos constituyendo importantes factores de la

osmolalidad, los potenciales de membrana el estado de hidratación y del pH de los líquidos intracelular

(LIC) y extracelular (LEC) (Singer y Brenner, 2008).

Los electrolitos de importancia clínica son: sodio (principal catión extracelular), potasio (principal

catión intracelular), cloro (principal anión extracelular), fósforo, magnesio y calcio (iones inorgánicos

relacionados con el metabolismo mineral).

Los análisis para la evaluación del equilibrio hidroelectrolítico y ácido-base son los procedimientos

más comúnmente realizados en los laboratorios de química clínica; en conjunto, estos análisis se agrupan

frecuentemente en un perfil metabólico básico.

De manera que es importante conocer la fisiología de los órganos relacionados con el equilibrio

hidroelectrolítico y ácido-base, riñón y pulmón, para poder interpretar adecuadamente los resultados de los

electrolitos séricos, término bajo el cual se han conjuntado al sodio, cloro y potasio. Estos se relacionan

con el equilibrio hidroelectrolítico, debido a que mantienen la distribución del agua entre los líquidos

extracelulares e intracelulares.

Los desórdenes de electrolitos son comunes en pacientes adultos hospitalizados en terapia

intensiva, con frecuencia, secundarios al tratamiento de diferentes alteraciones comunes, pues los

medicamentos utilizados en estos pacientes pueden alterar su absorción, han sido asociados con

incremento de la morbilidad y mortalidad, la alteración más común es la mielosis pontina, que degenera en

edema cerebral. Estas alteraciones pueden prevenirse si se usa una adecuada administración intravenosa

de fluidos y nutrientes, por ejemplo, si se observa hiponatremia se contraindica el uso de fluidos

intravenosos hipotónicos, mientras que si hay hipernatremia se administra agua (Singer y Brenner, 2008).

Las alteraciones crónicas de los electrolitos, sumadas a la presencia de otras patologías pueden

ocasionar arritmias atriales. Además, los electrolitos cumplen una función primordial en la hidratación, de

tal manera que también deben monitorearse en aquellos pacientes que se someten a ejercicio extenuante,

dado que debido a su pérdida a través del sudor pueden generar alteraciones.

La determinación de sodio, cloro y bicarbonato como electrolitos, además de la evaluación del CO2

y del pH, permiten evaluar al equilibrio ácido-base, con la finalidad de definir el origen, metabólico o

respiratorio, de las alteraciones relacionadas (Heitz y Horne, 2005).


48

El método más utilizado para determinar al sodio, potasio y cloro es el de ion selectivo

(automatizado), que se fundamenta en un método potenciométrico que emplea electrodos "ion-selectivo".

Estos electrodos consisten en membranas permeables a una determinada especie iónica. La diferencia de

potencial que se establece en la interfase de la membrana y la muestra en solución, es directamente

proporcional al logaritmo de la actividad o concentración iónica según lo establecido por la ecuación de

Nernst. Además de este método, se ha utilizado la flamometría, aunque la necesidad de gas propano ha

disminuido su uso (Heitz y Horne, 2005).

La gasometría es el método de elección para evaluar al equilibrio ácido-base, a través de la medición de

bicarbonato, CO2 y del pH. No obstante, su ejecución no forma parte de las pruebas de rutina, como lo

puede ser la determinación de electrolitos séricos; sin embargo, se reconoce su importancia clínica como

apoyo al diagnóstico (Heitz y Horne, 2005).


7.2.1 Explicar qué muestras se utilizan para la determinación de sodio, cloro y potasio.

7.2.2 Investigar el fundamento de la determinación de sodio, cloro y potasio por flamometría.

7.2.3 Investigar ¿qué es la gasometría? ¿para qué se utiliza? ¿cuál es la muestra idónea para realizarla?

7.3 Objetivo

Estudiar el papel de la determinación de electrolitos en las patologías relacionadas con el equilibrio

hidroelectrolítico y ácido-base a través del estudio de los fundamentos de su determinación y de casos

clínicos que permitan valorar la importancia.


Cuaderno de prácticas

Casos clínicos relacionados con alteraciones ácido-base y del equilibrio hidroelectrolítico.


7.5.1 Asignar a los equipos uno de los siguientes temas:

Métodos de cuantificación de electrolitos

- Ion selectivo

- Flamometría

- Gasometría

Casos clínicos

- Deshidratación

- Acidosis tubular renal

- Hiper e hiponatriemia

- Hipovolemia


49

- Cetoacidosis (alcóholica y diabética)

Puede considerarse la opción de asignar un tema por mesa en caso de que el número de equipos y de

sesiones calendarizadas así lo requieran.

7.5.2 Los puntos que deberá contener la presentación son los que se indican en la siguiente tabla:

7.5.3 Al término de cada exposición, los alumnos deben responder las dudas que se hayan generado de

parte de los alumnos y de los profesores del grupo, a fin de complementar y resaltar los puntos

importantes de la exposición.


Debido a que se trata de una práctica teórica no habrá generación de residuos.


Este punto no aplica debido a que la práctica se cumple con presentaciones orales que los alumnos

preparan con antelación.

Método de cuantificación Caso clínico

- Titulo

- Fundamento: anotar reacciones químicas

necesarias.

- Ejemplo de metodología: describir pasos,

hacer diagrama de flujo utilizar los esquemas

necesarios.

- Muestra(s) biológica(s) que se puede(n)

emplear.

- Sensibilidad y especificidad.

- Unidades de reporte

- Ejemplos de electrolitos que se cuantifiquen

por ese método

- Costos

- Titulo

- Introducción

- Características del (los) paciente(s)

- Metodología: describir pasos, hacer

diagrama de flujo, utilizar los

esquemas necesarios

- Resultados

- Discusión (considerando la

importancia de la evaluación de los

electrolitos para estos casos)

- Conclusiones


50

7.8 Referencias

- Buckley, MS, Leblanc, JM, Cawley, MJ. (2010) Electrolyte disturbances associated with commonly

prescribed medications in the intensive care unit. Crit Care Med 38(6 Suppl):S253-64

- Heitz, U., Horne, M. (2005). Fluidos, electrolitos y equilibrio ácido-base. Elsevier Mosby: Madrid

- Sedlacek, M, Schoolwertj, AC, Remillard, BD. (2006) Electrolyte disturbances in the intensive care

unit. 19(6):496-501

- Singer, G., Brenner, B. (2008) Alteraciones de líquidos y electrolitos. En Fauci, A., Braunwald, E.,

Kasper, D., Hauser, S., Longo, D., Jameson, L., Loscalzo, J. Principios de Medicina Interna. Mc

Graw Hill: México.


51

PRÁCTICA NO. 8

“ELECTROLITOS DEL METABOLISMO MINERAL”

Luis A. Gordillo R.

8.1 Introducción

Como la piel, el hueso se forma antes del nacimiento, pero después se renueva en forma continua

(Tortora, 2007), lo que provoca que el esqueleto sea un órgano metabólicamente activo que sufre

remodelación a lo largo de la vida (Hristova, 2010). Para que se produzca el crecimiento del hueso son

necesarias grandes cantidades de calcio (Ca) y fosforo (P) y pequeñas cantidades de flúor (F), magnesio

(Mg), hierro (Fe) y manganeso (Mn) (Tortora, 2007). La remodelación esquelética puede ser estimulada

por la respuesta hormonal a los cambios de Ca y P.

El Ca es el catión de mayor concentración en el cuerpo humano, tiene gran importancia en la

mineralización del hueso, además de ser un componente importante en diversos procesos fisiológicos

como la coagulación sanguínea, la transmisión neuronal, la excitabilidad muscular, por lo cual la

concentración sérica de calcio debe mantenerse entre los 8 mg/dL y los 11 mg/dL. Entre las metodologías

que se emplean para su cuantificación se encuentra el análisis colorimétrico con indicadores

metalocrómicos, el marcado fluorescente en unión con EDTA o EGTA y la espectrometría de absorción

atómica (Hristova, 2010).

El P es el mayor anión intracelular, es esencial en diferentes funciones celulares y fisiológicas,

además de participar en vías metabólicas de carbohidratos, lípidos y proteínas, también es responsable de

la producción y almacenamiento de energía mediante los compuesto fosforilados de alta energía y no

olvidemos que es importante en la estructura ósea, la síntesis de colagena y la homeostasis del Ca (Viana,

2012), cerca del 85% de fosfato en adultos se encuentra como sales de fosfato de calcio, el 15% restante

se encuentra ionizado (Tortora, 2007). Los métodos más empleados en la determinación de fosfato

inorgánico son reacciones de esté con molibdato de amonio para dar un complejo de fosfomolibadato

(Hristova, 2010).

El catión intracelular más abundante, pero el segundo en importancia es el Mg, está involucrado en

aproximadamente 300 reacciones enzimáticas como cofactor metálico (Viana, 2012). Casi el 54% del Mg

forma parte de la matriz ósea como sales de magnesio y el 46% restante se encuentra en forma de iones

Mg2+ en el LEC y el LIC. Es esencial para la actividad neuromuscular, la transmisión sináptica y la función

del miocardio, además de participar en la secreción de PTH (Tortora, 2007). El método de referencia para

la determinación de Mg es la espectrometría de absorción atómica, sin embargo se han utilizado varias

técnicas analíticas (Hristova, 2010).

Los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral (fósforo, magnesio y calcio total) pueden

determinarse mediante métodos espectrofotométricos usando el rango UV-visible del espectro

electromagnético.


52


8.2.1 Explique la diferencia entre el calcio total y el calcio ionizado.

8.2.2 Investigar las interferencias relacionadas con las determinaciones de calcio, fósforo y magnesio.

8.3 Objetivos

8.3.1 Realizar la determinación de los electrolitos relacionados con el metabolismo mineral mediante

métodos espectrofotométricos para conocer los cuidados en el procedimiento, así como su importancia en

el apoyo al diagnóstico.



1 ml de suero obtenido por sistema al vacío de cada integrante del equipo


- 1 gradilla

- 6 tubos de ensaye

- 1 ligadura


- torundas con alcohol (como mínimo, una por alumno)

- 1 sistema al vacío (tubo tapón rojo, aguja, adaptador)


- 2 espectrofotómetro

- 10 celdas para el espectrofotómetro

- 1 micropipeta (capacidad mínima 10 μL)

- 1 agitador vórtex

- 1 baño maría a 37º C

- 1 dispensador de puntas azules para

micropipeta

- 1 dispensador de puntas amarillas para

micropipeta

8.4.4 Reactivos

Equipo para la determinación de:

- Fósforo inorgánico - Magnesio - Cloro

- Calcio total

NOTA: El método a utilizar dependerá de los reactivos disponibles en el laboratorio.


8.5.1 Obtención del material biológico



53

NOTA: Para conocer la técnica, el valor de referencia y las precauciones durante la determinación de cada

electrolito que se realizará, es necesario consultar el manual de uso de los reactivos disponibles en el

laboratorio en el momento de la práctica.

8.5.2 Determinación de fósforo inorgánico

8.5.2.1 Fundamento. Existen dos métodos para la determinación de fósforo inorgánico:

8.5.2.1.1 Método colorimétrico : determina fósforo inorgánico. El fosfato inorgánico reacciona en medio

ácido con el molibdato para dar fosfomolibdato, que es reducido por el ácido ascórbico a azul de

molibdeno, desarrollándose el color en medio arsenito/citrato. El arsenito/citrato se combina con el exceso

de molibdato impidiendo su reacción posterior con el fosfato liberado de los ésteres lábiles. El color

obtenido se mide entre 620 y 650 nm.

8.5.2.1.2 Método UV : El fósforo inorgánico (Pi) reacciona en medio ácido con el molibdato para dar un

complejo fosfomolíbdico que se mide espectrofotométricamente a 340 nm.

8.5.2.2 Significado clínico. El fósforo se encuentra en el organismo formando parte de compuestos

orgánicos (proteínas, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos) o como fosfatos inorgánicos, cumpliendo

diversas funciones (transporte de energía, estructura de los tejidos, mantenimiento del pH de los líquidos

corporales). Los tejidos óseo y muscular lo contienen como constituyente esencial y es notable su

participación en la composición del tejido nervioso. Su concentración en circulación está regulada entre

otros factores por los niveles de vitamina D y las glándulas endocrinas, observándose variaciones

fisiológicas de acuerdo a la edad, ingesta, actividad física, embarazo, etc. Existen situaciones patológicas

en las que se altera este equilibrio, produciéndose anormalidades en la concentración de fósforo

circulante. Niveles elevados de fósforo sérico son atribuidos a la dieta, metástasis de huesos, alteraciones

en el hígado, alcoholismo, diarreas y vómitos, en el hipoparatiroidismo, mientras que el hiperparatiroidismo

conduce a la situación contraria. También puede encontrarse hiperfosfatemia por hipervitaminosis D y

diversos trastornos renales, mientras que la hipofosfatemia se relaciona con deficiencias de vitamina D y

defectos en la reabsorción de fósforo a nivel renal.

8.5.3 Determinación de magnesio (Mg): método colori métrico

8.5.3.1 Fundamento. El Mg, en medio alcalino, reacciona con un cromógeno (xylidyl blue o calmagita)

formando un complejo de color púrpura cuya intensidad es proporcional a la concentración de Mg presente

en la muestra. La incorporación del complejante EGTA al reactivo elimina la interferencia de los iones

calcio.

8.5.3.2 Significado clínico. El Mg es el segundo catión intracelular más abundante en el organismo

humano después del potasio, siendo esencial en gran número de procesos enzimáticos y metabólicos. El


54

60% del Mg del organismo se encuentra en los huesos y el resto está repartido entre músculos y otros

tejidos blandos. El Mg cumple un rol muy importante en la fisiología humana. Participa en el metabolismo

energético a través de la activación del ATP, en la transferencia de fosfatos de alta energía y es el ion

activador de muchas enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos, carbohidratos y proteínas. El Mg

es un mediador en mecanismos de conducción y transporte a través de membranas. Es esencial en la

preservación de estructuras macromoleculares de DNA, RNA y ribosomas y en la formación del hueso y el

mantenimiento de la presión osmótica. La hipomagnesemia está muy asociada a la deficiencia de otros

iones como el P, K y Ca. Las causas de hipomagnesemia son múltiples: diarreas crónicas y agudas,

síndromes de mala absorción, succión nasogástrica prolongada y vómitos, fístulas intestinales y biliares,

deterioro de la conservación renal, diabetes mellitus (acidosis diabética), hipertiroidismo,

hiperaldosteronismo primario, alcoholismo crónico, administración de diuréticos o aminoglucósidos,

hiperparatiroidismo. El exceso de Mg puede darse por incorporación o administración excesiva de sales de

Mg y en general se asocia a falla renal. Otras patologías asociadas a hipermagnesemia son: hipercalcemia

hipocalciúrica, hipotiroidismo, deficiencia de mineralocorticoides, enfermedad de Addison o terapia

intensiva con antiácidos. El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos

y de laboratorio.

8.5.4 Determinación de calcio total

8.5.4.1 Fundamento. Existen dos métodos colorimétricos para la determinación de calcio:

8.5.4.1.1 Método del arsenazo III : El calcio reacciona con arsenazo III (ácido 1,8-dihidroxi-3,6-disulfo-2,7-

naftalenen-bis(azo)-dibenzenarsónico) dando un complejo de color azul que se mide

fotocolorimétricamente a 650 nm.

8.5.4.1.2 Método de o-cresolftaleína . El calcio reacciona con la cresolftaleín complexona (o-CPC) a pH

11, dando un complejo de adición color magenta que se mide fotocolorimétricamente a 570 nm.

8.5.4.2 Significado clínico. El calcio es el mineral más abundante e importante del cuerpo humano, el 99

% se halla en los huesos. Es esencial en la mayoría de las reacciones de la coagulación sanguínea y en la

regulación de la excitabilidad de las fibras musculares. Su concentración en suero y orina está regulada

por la acción de factores tales como niveles de parathormona, vitamina D y fósforo, observándose

fluctuaciones fisiológicas debidas a edad, sexo, embarazo, actividad física, cambios estacionales (por

acción de la luz solar). La hipercalcemia está relacionada con distintas patologías: hiperparatiroidismo,

neoplasias óseas, intoxicaciones con vitamina D, aumento de la retención renal, osteoporosis, sarcoidosis,

tirotoxicosis. La hipocalcemia se asocia con desórdenes tales como hipoparatiroidismo, deficiencia de

vitamina D, malnutrición o malabsorción. Una disminución de los niveles de albúmina causa una

disminución del calcio en suero.


55




8.6.2 Las torundas, los guantes, y los materiales de asepsia y aquellos que se utilicen para limpieza del

área de trabajo deben desecharse en la basura municipal. En caso de que estos materiales estén

empapados de sangre, depositarlos en la bolsa roja de RPBI.

8.6.3 Los tubos que contengan mezclas reactivas, sangre y muestra biológica se depositarán en los





En el cuaderno de prácticas se harán los cálculos necesarios para obtener el resultado de cada analito

determinado; la discusión se basará en el análisis de la influencia que tienen los electrolitos determinados

en el impacto del estudio del tejido óseo principalmente, sin dejar de considerar que cada uno de ellos

también tienen otras funciones que pueden verse alteradas en caso de su aumento o disminución.

Analizar las ventajas y desventajas de los métodos de determinación empleados, haciendo comentarios de

cómo afectarían la calidad en los resultados así como sugerencias para corregir los posibles errores en lo

que se incurrió.

En las conclusiones debe considerarse si los objetivos planteados fueron alcanzados, si la práctica otorgó

aprendizaje significativo y valor agregado a la formación del estudiante.

8.8 Referencias

- Hristova, L.N, Henry, J.B. (2010).Intermediarios metabólicos, iones inorgánicos y marcadores

bioquímicos del metabolismo del hueso. En Henry, J.B, Davey, F. Herman, C. McPherson, R.

Pincus, M. Threatte, G. Woods, G. Laboratorio en el diagnostico clínico. Marbán: Madrid

- Tortora, G. Derrickson, B. (2007). Homeostasis hidroelectrolítica y acido-base. En Tortora, G.

Derrickson, B. Principios de anatomía y fisiología. Médica Panamericana: México, D.F

- Viana, L. Burgos, M.G.P, Silva, R. (2012). Refeeding síndrome: clinical and nutritional relevance.

ABCD. Arquivos Brasileiros de Cirugia Digestiva. 25(1), 56 – 59.

- Gattineni, J. Baum, M. (2012). Genetic disorders of phosphate regulation. Pediatric Nephrology.

27(9): 1477 – 1487. DOI: 10.1007/s00467-012-2103-2


56

PRÁCTICA No 9

“DETERMINACION DE HORMONAS”

G. Leticia Arellano M.

9.1 Introducción

El sistema endocrino comprende parte del sistema de comunicación intra y extracelular encargado

de controlar la reproducción, diferenciación sexual, crecimiento, desarrollo, regulación del metabolismo y

aporte de nutrimentos en un individuo. Este sistema funciona a base de una serie de glándulas

encargadas de elaborar un grupo de mensajeros químicos llamados hormonas, que interactúan con

receptores específicos en las células blanco. Aunque no existe relación anatómica entre las diversas

glándulas endocrinas, existen ciertas relaciones hormonales de interdependencia, por lo que se habla de

ejes hormonales (Kaplan, 2003).

En general la secreción de una hormona depende de su concentración o de la concentración de

algún producto de su acción, en plasma o en el líquido extracelular, es decir, son reguladas por

retroalimentación. La secreción hormonal no tiene lugar de forma continua y uniforme, sino pulsátil, con

períodos de secreción (pulsos) y otros de reposo. Las características de los pulsos pueden variar a lo largo

del día o en diversas circunstancias fisiológicas o patológicas. Cuando la secreción varía ostensiblemente

a lo largo del día se habla del ritmo circadiano (Henry, 2001).

Las anormalidades en la secreción hormonal son generalmente definidas en términos de los niveles

séricos de las mismas (aumento o disminución), o en la demostración de alteración directamente en la

glándula en la que se producen. Excesiva cantidad de hormona pude ser secretada por tumores, que la

retroalimentación no funcione, ingestión deliberada o por indicación terapéutica. En tanto que la

disminución puede resultar de la carencia en su síntesis o daño en la glándula que la produce (Kaplan,

2003).

Una complicación en el estudio de la secreción hormonal es que no se debe exclusivamente al

daño de la glándula productora, sino que como existen ejes de regulación, el daño en alguna parte del eje

tendrá como consecuencia que se dañen los de otra. Es por ello generalmente se evalúan en perfiles o

conjunto de hormonas que regulan una determinada función (Henry, 2001).

El progreso de la endocrinología ha ido ligado al desarrollo de ensayos que permiten medir las

hormonas. La endocrinología clínica está limitada a la medición de la concentración de las hormonas en

suero u otros fluidos tales como la orina o saliva. En los laboratorios clínicos se tiene acceso a una amplia

variedad de ensayos con diferentes grados de sensibilidad y especificidad que ayudan a interpretar la

severidad del daño, la mayoría de estos son inmunoensayos, entre los que se encuentran: el

radioinmunoanálisis (RIA), el análisis inmunorradiométrico (IRMA), el inmunoensayo ligado a enzimas

(ELISA), la quimioluminiscencia (QLM) y el fluoroinmunoanálisis incrementado por la disociación de

lantánidos (DELFIA) (Kaplan, 2003).


57

Para la interpretación de los ensayos deben ser considerados los siguientes factores: el estado

clínico del paciente, la concentración de la variable regulada por la hormona, la concentración de otras

hormonas que participen en el mecanismo de retroalimentación, la naturaleza pulsátil de la secreción

hormonal (anotar la hora del día a la cual se toma la muestra), el estado de estrés del paciente, así como

la naturaleza química de la hormona y su vida media, ya que todos estos factores pueden afectar los

niveles de hormonas (Henry, 2001).

9.2 Actividades complementarias a la práctica

9.2.1 Esquematizar las glándulas que forman parte del sistema endocrino, indicando las hormonas

producidas por cada una de ellas.

9.2.2 Investigar cuál es la naturaleza química de las hormonas, mencionando un ejemplo de cada una.

9.2.3 Describir un ejemplo de la respuesta que una hormona puede desencadenar cuando se une a su

receptor en la célula blanco.

9.3 Objetivos

9.3 Conocer la importancia clínica de la determinación de hormonas a través de la exposición de los

métodos empleados en la cuantificación de las mismas, así como describir sus fundamentos para poder

aplicarlos en el diagnóstico de patologías que involucren alteraciones en la secreción hormonal.


9.4.1 Muestra biológica

1 ml de suero no hemolizado (sólo en caso de que estén disponibles los reactivos necesarios para realizar

las determinaciones en el laboratorio)

9.4.2 Material por equipo y por grupo

Video proyector (para realizar las presentaciones); además del que se pueda requerir para la práctica.

NOTA. Se notificará con una semana de anticipación en caso de contar con reactivos para la práctica.

9.5 Metodología

9.5.1 Obtención de la muestra biológica


9.5.2 Cuantificación de hormonas

La que indique el fabricante, pues dependerá de la disponibilidad de reactivo al momento de la práctica.

9.5.3 Exposiciones por parte de los alumnos

9.5.3.1 Asignar a cada equipo un método de cuantificación o un caso clínico.


58

9.5.3.2 El equipo realizará una exposición oral.

9.5.3.3 Los puntos que deberá contener la presentación son los que se indican en la siguiente tabla:

9.5.3.4 Al término de cada exposición, los alumnos deben responder las dudas que se hayan generado de

parte de los alumnos y de los profesores del grupo, a fin de complementar y resaltar los puntos

importantes de la exposición.


9.6.1 En caso de que se realice la determinación de hormonas, seguir las indicaciones de la práctica 1 (ver

1.6).


Este punto no aplica debido a que la práctica se cumple con presentaciones orales que los alumnos

presentan.

9.8 Referencias

- Henry, J. B. (2001) Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 20th. W.B.

Saunders Co: U.S.A.

- Kaplan, Lawrence A., Pesce, Amadeo J., Kazmierczak, Steven C. (2003). Clinical Chemistry. 4th

Mosby: USA.

Método de cuantificación Caso clínico

- Titulo

- Fundamento: anotar reacciones

químicas necesarias.

- Ejemplo de metodología: describir

pasos, hacer diagrama de flujo utilizar

los esquemas necesarios.

- Muestra(s) biológica(s) que se

puede(n) emplear.

- Sensibilidad y especificidad.

- Unidades de reporte

- Ejemplos de hormonas que se

cuantifiquen por ese método

- Costos

- Titulo

- Introducción

- Características del (los)

paciente(s)

- Metodología: describir pasos,

hacer diagrama de flujo, utilizar

los esquemas necesarios

- Resultados

- Discusión

- Conclusiones


59

Anexo A

Método para la obtención de sangre venosa por siste ma de tubo al vacío

A.1 Lavarse correctamente las manos con jabón líquido (preferentemente) y agua.

A.2 Seleccionar e identificar la vena para realizar la punción:

A.2.1 Vena media basílica

A.2.2 Vena cefálica

A.3 Enroscar la aguja al adaptador del sistema al vacío.

A.4 Preparar el tubo indicado para cada caso:

A.4.1 Tubo con tapón rojo o tapón dorado: Sangre coagulada para obtención de suero

A.4.2 Tubo con tapón lila: Sangre entera anticoagulada con EDTA

A.5 Ligar el brazo a 5 cm aproximadamente del lugar de punción.

A.6 Realizar asepsia con una torunda impregnada con alcohol.

A.7 Introducir la aguja de punción en la vena con una inclinación de 30º C aproximadamente.

A.8 Colocar el tubo, verificar que la sangre comienza a salir y retirar la ligadura.

A.9 Dejar llenar el tubo y retirarlo, sosteniendo con firmeza el adaptador.

A.10 Retirar la aguja y presionar con una torunda impregnada con alcohol el sitio de la punción.

A.11 En caso de que el tubo sea para la obtención de sangre anticoagulada (tapón lila), invertirlo

suavemente 15 veces, para homogenizarla con el anticoagulante.

A.12 Si se trata del tubo de tapón rojo o dorado, debe colocarse durante 10 minutos en baño de agua a 37º

C para coagular la muestra; posteriormente se le quita el tapón cubriéndose con papel parafilm y se

centrifuga a 2500 rpm/10 min para separar el suero.

A.13 Disponer los residuos generados de la siguiente forma

A.13.1 Depositar la aguja de punción en el contenedor rojo rígido

A.13.2 Depositar las torundas con alcohol y los tapones de la aguja en el bote de basura municipal.


60

Anexo B

Indicaciones básicas para realizar las determinacio nes colorimétricas

B.1 Rotular tres tubos de ensayo, cada uno como blanco, estándar y muestra con un marcador de tinta

indeleble, no se recomienda utilizar cinta adhesiva tipo masking tape ya que en el momento de la

incubación puede desprenderse del tubo y ocasionar confusión.

B.2 El tubo marcado como “blanco” lo realizará el primer equipo que lea en el espectrofotómetro y el tubo

marcado como “estándar” será preparado por tres personas del grupo.

B.3 Los tubos se preparan e incuban de acuerdo a la tabla que viene en el manual de uso (inserto) del

reactivo con que se cuente en el momento de la práctica, siguiendo el orden y las cantidades que se

indiquen. Esto se debe a que la forma de preparar los tubos puede cambiar de acuerdo a la marca del

reactivo.

B.4 Ajustar el espectrofotómetro a la longitud de onda indicada en el fundamento y llevar a cero de

absorbancia con el tubo blanco.

B.5 Leer la absorbancia de los 2 tubos restantes (estándar y problema) y realizar el cálculo

correspondiente, de acuerdo a la siguiente fórmula.

�� ó �� . �� ó ��

��. ��

La concentración del estándar se proporcionará en el momento de la realización de la práctica pues

depende de la determinación a realizar y la marca del reactivo que se vaya a utilizar.

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