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Manual de Practicas de Laboratorio.Prctica No. 1Tipificacin del sistema ABOObjetivo:Al trmino de la prctica el alumno determinara los cuatro grupos sanguneos en sangre del sistema ABO.Generalidades:En la membrana del glbulo rojo existen complejos qumicos que representan los llamados grupos o factores sanguneos Fu Landsteiner quin realiz en 1900 el importante descubrimiento de que los eritrocitos del hombre pertenecen a varios sistemas Antignicos diferentes, este autor descubri el sistema A B O. La clasificacin del grupo sanguneo est, determinada por la presencia o ausencia de los aglutingenos en el eritrocito y las aglutininas en el suero. Para la identificacin del grupo sanguneo ABO se deben hacer dos investigaciones consecutivas: la primera se llama tipado globular y es la determinacin de los aglutingenos eritrocticos con antisueros o aglutininas conocidas, la segunda se llama tipado srico o contratipado y es la identificacin de las aglutininas utilizando glbulos rojos con antisueros conocidos, los sueros patrones deben ser de alto titulo, estos sueros pueden ser preparados en el laboratorio o en su defecto, se consiguen en las casas comerciales de productos biolgicos. La investigacin de los aglutingenos eritrociticos se deben realizarse por el mtodo de tubo de ensayo. Se utilizan tres reactivos llamados: suero anti A (de sangre b), de color azul y que contiene aglutininas alfa, suero anti B (de sangre a), de color amarillo y que contiene aglutininas beta, existe adems otro suero, el anti AB que contiene las dos aglutininas, alfa y beta.Fundamento: Los antgenos de los hemates son estructuras qumicas que proporcionan propiedades especficas a su superficie y que solo pueden detectarse con anticuerpos que corresponden a esos antgenos la mayora de estas reacciones antgeno-anticuerpo implican la aglutinacin o hemlisis de los hemates.Material y equipo: 1 gradilla 16 tubos 10 x 75 4 tubos 13 x 100 4 pipetas Pasteur con bulbo Centrifuga clnica Centrfugas Serofuge Sueros hemoclasificadores Anti-A, Anti B. Anti-AB Albmina bovina al 22% o 33% Solucin fisiolgica en Pizeta Sangre problemaTipificacin en tubo.Tcnica:1. Se prepara una suspensin de glbulos rojos al 5%, previamente lavado en solucin fisiolgica.2. En una gradilla colocar 4 tubos de ensaye de 10 x 75, marcados con las letras A, B, AB y Control.3. En cada tubo poner una gota de suspensin de glbulos rojos al 5%.4. En el tubo marcado con A poner una gota de suero anti A, en el tubo marcado con B, poner una gota de suero anti B, en el tubo AB una gota de suero anti AB5. Se debe hacer un control agregando a 1 tubo con una gota de albmina bovina al 22 %6. Mezclar perfectamente los tubos y dejar reposar por dos minutos.7. Mezclar nuevamente y se procede a centrifugar a 2,500 r p m durante un minuto8. Se sacan los tubos cuidadosamente de la centrifuga evitando que se mezclen los glbulos rojos que quedan depositados en el fondo de los tubos y para efectuar la lectura se sacuden cuidadosamente el botn del fondo, uno por uno buscando si existe aglutinacin macroscpica.9. Si la aglutinacin tuvo lugar, puede comprobarse en el seno del liquido claro los hematies que nadan y se flotan formando pequeos agrupamientos, si el resultado es negativo los glbulos rojos se distribuyen uniformemente por el lquido.10. El resultado se reporta de acuerdo a la intensidad del grupo y al color del liquido sobre nadante, de una o varias cruces, hasta cuatro.11. Si existe duda en la lectura se podr observar al microscopio una gota o tambin se pueden incubar los tubos a 37 C. durante 30 minutos.Contratipado sanguneo o prueba de WienerObjetivo:Al contrario de las: pruebas anteriormente descritas que emplean sueros testigos, esta prueba utiliza glbulos rojos testigos tipo A, B y AB en suspensin al 5% y suero de la persona a clasificar la prueba puede realizarse en tubo, de acuerdo con las tcnicas antes descritasInterpretacin de resultados:Grupo sanguneo aglutinacin en tuboAnti AAnti-BAnti AB

Grupo APositivoNegativoPositivo

Grupo BNegativoPositivoPositivo

Grupo ABPositivoPositivoPos itivo

Grupo ONegativoNegativoNegativo

Es recomendable que la tipificacin al realizarse, los resultados son ms confiables tubo, ya que la aglutinacin se puede expresar en cruces, de una a cuatro, dependiendo del grado de la misma. 4 cruces; la aglutinacin se presentar como un botn slido con fondo claro y grumos gruesos. 3 cruces; la aglutinacin sern varios grumos grandes con el fondo claro o rosado 2 cruces pocos grumos y muy pequeos, una suspensin uniforme 1 cruz pocos grumos, muy pequeos, el fondo muy rosado. Negativo: Una suspensin uniforme de color rojo.Comentarios:Los principales errores que pueden existir en la clasificacin sangunea, son los siguientes: Error en la preparacin de la suspensin de glbulos rojos as si se ha colocado demasiada sangre (mezcla de color rojo intenso) en exceso de glbulos rojos puede absorver la aglutinina del suero y no evidenciar la aglutinacin. Si se ha colocado poca sangre (La mezcla color rosa muy plido) la escases de glbulos dificultar la lectura macroscpicamente.Con respecto a los sueros hemoclasificadores:a) pueden estar envejecidos, mal preparados y su potencia dbil. contaminado control de calidad se observa turbio y de mal olor.b) con respecto a las sangres: sangres viejas o contaminadas con bacterias.c) con respecto a la manipulacin: rotulacin equivocada de los tubos colocacin erronea de los reactivos equivocacin en los reportes.Practica No 2Tipificacin del subgrupo de A uso de Lectina A1Objetivo:Alterminar la prctica, el alumno al haber encontrado un grupo A determinar si se trata de un subgrupo A1 o A2Generalidades:Los eritrocitos que poseen antgeno A pueden ser subdivididos en Al y A2, las clulas rojas del grupo A que aglutinen con Anti Al lectina, se consideran del subgrupo, aquellas que no aglutinan con Anti A1 lectina, se clasifican como A2. Aproximadamente el 80 %de las clulas, son Al y el restante 20% se consideran A2.Principio:Los procedimientos usados con este reactivo, estn basados en el principio de aglutinacin, las clulas humanas normales, conteniendo antgenos se aglutinan en presencia del anticuerpo del antgeno correspondiente algunos extractos de semillas lectina contienen aglutininas con especificidad de grupos sanguneos humanos, el extracto de la semilla dolichus biflorus es virtualmente especfica para el antgeno Al en clulas rojas humanas contiene un fito hemo aglutinina, la cual como se dijo anteriormente aglutina las clulas rojas de los subgrupos Al o A1B.Material y equipo: 1 gradilla 4 tubos ensaye 10 x 75 2 pipetas Pasteur con bulbo 1 centrifuga clnica o Serofuge Suero Anti-Al lectina Solucin salina en pizeta.Mtodo en tubo.1. Preparar una suspension de glbulos rojos en solucin salina al 5%2. Colocar una gota de Anti A Lectina en un tubo de 10x 753. Con una pipeta Pasteur, agregar una gota de la suspensin de glbulos rojos.4. Mezclar bien y centrifugar a 2500 r.p.m por un minuto.5. Resuspender los glbulos rojos cuidadosamente y examinar el tubo en busca de aglutinacin.Interpretacin.1. Cuando los glbulos rojos son aglutinados la reaccin es positiva e indica la presencia de antgeno A1 y por lo tanto los glbulos rojos son A12. Cuando los glbulos rojos no aglutinan, la reaccin es negativa e indica la ausencia de antgeno A1 y los glbulos rojos son A23. Cuando se investiga en una sangre AB, con Antia Al lectina, si aglutina es AlB, si no aglutina es A2BComentarios:No se requiere preparacin especial del paciente previo a la recoleccin de los especimenes, puede usarse sangre recolectada con o sin Anticoagulantes. Las muestras de sangre deben ser analizadas lo antes posible despus de la obtencin. Si el anlisis tiene que ser retrasado, las muestras deben conservarse bajo refrigeracin entre 2 y 8 C. Los glbulos rojos recolectados y conservados en citrato de sodio, oxalato de amonio; con oxalato de potasio han de mostrado que mantienen su reactividad por 28 das. Los glbulos rojos recolectados y conservados con sangre coagulada o en citrato de sodio u oxalato de sodio, han demostrado su reactividad por lo menos durante 14 das; si los hemates se recolectan sobre EDTA o heparina, stas deben ser analizadas dentro de las 48 horas.Limitaciones del procedimiento: Todas las pruebas usando antisuero hemoagrupadores ABO, deben ser llevadas a cabo a temperatura ambiente y nunca incubarse a temperaturas ms elevadas, El antgeno Al no es totalmente expresado en clulas rojas de recin nacidos y pueden obtenerse falsos negativos Glbulos rojos de ms de 28 das pueden ser probados con este reactivo an cuando las reacciones positivas pueden ser ms dbiles que las obtenidas de glbulos rojos frescos, Contaminacin de los especimenes de sangro o de los materiales suplementarios usados, pueden interferir con los resultados de la prueba.Prctica No 3Tipificacin del sistema Rho.Objetivo:Al trmino de la prctica el alumno clasificar adems del sistema sanguneo ABO el factor Rho.Generalidades: Adems de los Antgenos del sistema ABO, existe otro sistema de mayor importancia que es el factor Rho. Landsteiner y Wiener descubrieron en 1990 la existencia de un aglutingeno en los glbulos rojos humanos que llamaron factor Rho, a fin de recordar con las dos iniciales del mono rhesus. El mecanismo que permiti ponerlo en evidencia fue el inyectar glbulos rojos lavados de dicho animal (macacus rhesus) en conejos, obtenindose de este modo un suero capaz de aglutinar un 85% de los hemates humanos. El suero de conejo preparado en la forma indicada contena la aglutinina correspondiente al factor Rho y se denomin Anti Rho, las personas cuyos glbulos rojos eran aglutinados por el suero Anti Rho se denominaron Rh positivos, y los hemates no eran aglutinados por el suero Anti Rho se denominaron Rh negativos, se comprob que el 85% de las personas de raza blanca son Rh positivos y que el 15% restantes son Rh negativos, posteriormente se descubri que el factor Rh no era el nico, sino que se trataba de un factor muy complejo por tanto existen tres factores principales: El rir(nomenclatura de Wiener) o d (nomenclatura de Fisher race). El rh1 (nomenclatura de Wiener) o c (nomenclatura de Fisher race). El r1r (nomenclatura de Wiener) o e (nomenclatura de Fisher race). Levine y Stetson describieron un caso de inmunizacin materno fetal en el segundo embarazo de una mujer que dio a luz un feto muerto. La presencia del Anticuerpo inmune se comprob al transfundirle sangre del esposo, compatible con el sistema ABO, con la que reaccion violentamente, esto hizo suponer que la madre haba elaborado Anticuerpos contra un Antgeno posedo por el feto, que a su vez haba heredado del padre, esto hizo evidenciar la presencia de otro tipo de Anticuerpo que no tena nada que ver con los del sistema ABO y as descubri el factor Rho- El sistema sanguneo rh-hr est formado por un grupo de antgenos de naturaleza proteica la transfunsin de glbulo rojos con estos factores, a pacientes que no los tengan, pueden dar lugar a la formacin de Anticuerpos especficos estos Anticuerpos pueden ser la causa de reacciones post transfusionales severas o casos de inmunizacin materno fetal produciendo una anemia hemoltica por defectos extra corpusculares ya que los Anticuerpos maternos actan sobre los glbulos rojos normales; adems de los ya descritos, existen otros, pero el ms importante se le llama factor rh factor du.Fundamento: El factor Rho. es un antgeno que se encuentra en la membrana del eritrocito el cual reacciona con su Anticuerpo correspondiente que se encuentra en el suero anti-D que contiene la aglutinina correspondiente al factor Rho, llamado tambin anti Rho, anticuerpos que se detectan, son del tipo de la IgG que poseen la capacidad de cruzar la barrera placentaria por su bajo peso molecular, iniciando por tanto la enfermedad. La presencia del factor Rho se pone de manifiesto mediante una reaccin antgeno-anticuerpo y se observa por aglutinacin y hemlisis.Material y equipo: 1 gradilla 4 tubos 10 x 75 4 tubos 13 x 100 4 pipetas Pasteur con bulbo Centrifuga Serofuge Suero Anti-D Antiglobulina humana Solucin Salina en pizeta Bao maria a 37oCMtodo en tubo:Tcnica: Se prepara una suspensin de glbulos rojos en solucin fisiolgica al 5%1. En un tubo de ensayo 10 x 75, se coloca una gota de suero anti Rho (D) y se le agrega una gota de suspensin de los eritrocitos problema al 5%2. Se homogeniza con un movimiento suave, se centrifuga a 3,500 r.p.m- durante 303. Se realiza la lectura, en busca de aglutinacin, en caso de duda se incuba durante 15 al cabo de este tiempo se efectua lectura, suspende suavemente el sedimento.4. Nuevamente se centrifuga durante 30 a 3,500 r.p.m. se rea liza la lectura5. Se observa aglutinacin con grumos visibles, si hay duda se confirma la lectura mediante observacin microcpica.Interpretacin de resultados. Si la sangre examinada Rho. positiva se nota la formacin grumos facilmente observables a simple vista. En caso de ser Rho. negativo el aspecto es homogno, no existe aglutinacin.Prctica No. 4Determinacin de antgeno DuObjetivo: El alumno investigara la presencia de variante Du que es una expresin dbil o incompleta de un factor del Rho, pero con capacidad antignica.Introduccin:ElDu, es un alelo de D, muy importante pero irregular. No existe suero anti-Du especfico. Algunas sangres Du deben esta caracterstica al hecho de que el factor D normal heredado, de uno de los padres, est enmascarado por el factor C de un cromosoma aparejado dCe (r) heredado de otro progenitor: este tipo se conoce como Du por interaccin gentica. El otro tipo Du hereditario puede atribuirse a transmisin de un D debilitado. Los glbulos de algunos sujetos Du pueden ser aglutinados directamente por casi todos los sueros anti D, estos casos se denominanDu de titulo elevado. Otras sangres Du son aglutinados solamente por unos cuantos sueros anti D; son los Du de ttulo bajo. Lo importante respecto a los glbulos Du, especialmente la variedad titulo bajo, es que probablemente parecern Rho. Negativos al ser mezclados con anti D. Solamente podrn reconocerse mediante: 1) Modificacin enzimtica previa, o sea, ficnizacin2) Exposicin previa al suero anti D incompleto y luego prueba de Coombs. Los glbulos Du dan una prueba de Coombs positiva en estas circunstancias. Se recomienda el segundo mtodo.Otra consideracin todava ms importante respecto al Du, es que todos los que poseen el alelo Du deben considerarse como donadores Rho. Negativos. Esto se debe a que el Du puede producir anti D en un sujeto Rho. Positivos, pero receptores Rho. Negativos. Esto se debe a que el Du puede producir anti D en un sujeto Rho. Negativo, y tambin a que algunos Du producen ellos mismos anti D. Adems los sujetos Du por accin intergentica no deben recibir sangre que contenga el antgeno c, muy potente, en otras palabras, debe recibir sangre del genotipo Dce/dCe o DuCe/dCe esta ltima generalmente corresponde a su propio genotipo.Fundamento:Ciertos eritrocitos Rho.+, alrededor del 1% con mayor frecuencia en la raza negra que en la caucsica, no son aglutinados por el suero anti Rho. (anti D) pero despus de ser expuesto a los anticuerpos Rho. (D), darn una reaccin positiva si se tata con suero de Coombs.Generalidades:Los hematies del grupo D presentan diferencias en cuanto a su reactividad; se acepta que varios de los factores del sistema Rho. en ocasiones se expresan en forma dbil o incompleta los ms importantes son: el Du, el Cw y el Eu en realidad solo el Du tiene importancia en el banco de sangre debe sospecharse de ser Du, las sangres que son difciles de clasificar como Rh positivos o negativos, utilizando solo el suero anti-D El paciente Du positivo debe recibir sangre Du negativa ya que se han reportado casos que por recibir sangre Rho. positiva desarrollan anticuerpos Anti Rho. de especificidad Anti-D, elfactor Du de Stratton, como es dbil no es fcil determinarlo, pero conserva su capacidad antignica. Para investigar este grupo, la tcnica de aglutinacin con el suero Anti-D ha dado resultados dbiles, sin embargo ha servido para que los Anticuerpos se fijen y la prueba de Coombs indirecta nos dar el resultado positivo; observando macroscpicamente el fenmeno de aglutinacin: el Antigeno Du se determina por la aglutinacin de los glbulos rojos en presencia del suero Anti-D y Antiglobulina HumanaMaterial y equipo 1 gradilla 4 tubos 10 x 75 2 pipetas pasteur con bulbo 1 Centrifuga Sarofuge 1 bao maria a 370c Suero Anti-D Suero de Coombs Albmina bovina al 22% Solucin salina en pizetaMtodo en tubo:1. Preparar glbulos Rho. negativos al 5%2. Marcar dos tubos No 1 problema y No 2 control, agregar en cada tubo dos gotas de la suspensin de glbulos rojos.3. Al tubo No 1 agregar una gota de suero Anti-D y una gota de Albmina bovina al 22%, al tubo No 2 dos gotas albmina bovina al 22%4. Mezclar y dejar reposar durante dos minutos5. Centrifugar en busca de aglutinacin6. Lavar por tres ocasiones7. Despues del ltimo lavado, decantar completamente y agregar dos gotas de Antiglobulina humana a cada tubo8. Incubar durante 15 minutos a 37 C9. Centrifugar a 3,500 rpm x 1 minuto10.Leer sobrenadante y despegar el boton del fondo del tubo cuidadosamente en busca de aglutinacin11.Reportar por escritoInterpretacin de resultados En el tubo control no debe encontrarse aglutinacin. Si el tubo problema se observa con aglutinacin se habla de la presencia del factor Du. Si hubiese aglutinacin enlos dos tubos signifia que se trata de glbulos rojos cubiertos o bloqueados, por lo tanto si se trata de donador la sangre ser desechadaPrctica No. 5Dosificacin de HemolisinasObjetivo: Elalumno al finalizar la prctica detectar la presencia de hemolisinas en la sangre de tipo O (donador universal).Generalidades: La hemlisis inmunnolgica debida a la accin conjugada de dos factores, un anticuerpo especfico de los glbulos rojos, el complemento, el anticuerpo correspondiente es denominada hemolisina.El primer paso en la reaccin es la unin del anticuerpo con el antgeno sobre la membrana del eritrocito, la unin con su anticuerpo homlogo inicia entonces la secuencia del complemento que produce la lesin litica. La sensibilidad ptima de un glbulo rojo parece requerir aproximadamente 1000 molcuas de anticuerpo, pero requerimiento mnimo en una sola molcula de IgM o dos moleculas de IgG muy prximas, se ha observado que la cantidad del complemento necesaria para la hemlisis completa de deter minado nmero de clulas, est inversamente relacionada con la cntidad de anticuerpo suministrada. Las isohemolisinas naturales son muy poco frecuentes, se ha sealado en algunos de los sitemas de grupos sanguneos las isohemolisinas inmunes se observan despus de inyectar sangre incompatibl Las autohemolsimas bitermicas se ven en la hemoglobinuria paroxistica por enfriamento; son globulinas anormales del suero, capaces de hemolizar los glbulos rojos del paciente mismo y de otras personas, se combinan los eritrocitos a temperaturas inferiores a los 20C y no lo hacen por arriba de esta temperatura, cuando aumenta a 25C empieza la hemlisis, que es optima a los 40C las autohemolisinas monotrmicas con un margen detemperatura de 15 a 30C, son causa de una destruccin excesiva de hematies, anmias hemolticas, el complemento es termolbil y se destruye a 56C, de 20 a 30 minutos el almacenamiento a 4C significa prdida de sta actividad de 2 a 3 das. Un anticuerpo puede reaccionar primero como hemolisina, pero si se inactiva o fija el complemento, reacciona como aglutinina. La presencia de hemolisinas en el suero de un donante del grupo O indica que esa sangre solo puede ser transfundida a otro paciente del mismo grupo.Fundamento: Se basa en la activacin del complemento por la formacin del complejo antigeno anticuerpo, entre el antgeno de superficie del eritrocito y la hemolisina, poniendo suero problema ante suspensiones de globulos rojos A y B. Se puede determinar el titulo de hemolisinas mediante diluciones del suero problema.Material y equipo 1 gradilla 6 tubos10 x 75 3 pipetas Pasteur c/bulbo 3 pipeta 1/10 1 centrifuga Serofuge Solucin salina normal Suero problema Globulos rojos Ay BTecnica:1. Preparar suspensiones al 5% en solucin salina de Eritrocitos A y B2. Marcar dos tubos con las letras A y B que corresponden al tipo sanguneo3. Depositar 0.1 ml de la suspensin de eritrocitos de cada grupo al tubo que corresponda4. Aadir a cada tubo 0.1 ml de suero problema5. Centrifugar a 2,500 rpm, durante 2 minutos6. Observar si existe hemlisis en el sobrenadante de cada tubo, en caso de duda volver a centrifugar los tubos y reportar por escritoInterpretacion de resultados:1. Si a pesar de la centrifugacin los glbulos rojos no se sedimentan y el liquido del tubo es rojo, indica que los glbulos rojos se han hemolisado2. El suero de un donador O con hemolisinas, solo se aplicar a un receptor del mismo grupo, no se utilizar conpacientes A o B 3. Si el suero de una madre O hemolisa los glbulos rojos de su hijo con eritroblstosis, es el causante de la isosensibilizacin de la madreObservaciones: Las muestras de sangre utilizadas en el estudio del complemento, de preferencia deben manejarse a temperatura ambiente (22C ) debe separarse el suero del coagulo lo ms pronto posible, para prevenir la prdida de actividad del complemento.Prctica No. 6Dosificacion AglutjninasObjetivo: Al concluir la prctica el alumno identificar las aglutininas salinas de titulo elevado, que caracterizan la sangre del llamadodonador universal peligrosoGeneralidades: El sistema ABO es el nico sistema en el que el plasma y suero inactivado, contienen aglutininas que reaccionan con factores sanguineos presentes en los eritrocitos de otras personas. Las isoaglutininas responsables de la aglutinacin en el sistema ABO son del llamado completo, lo cul quiere decir que la adeherencia del Ac al eritrocito que tiene factor sanguneo homlogo, va seguido automaticamente del antgeno. En casos de urgencia o escases del tipo sanguneo necesario para una transfusin se emplear sangre tipo o llamada comunmentedonador universal,por carecer sus eritrocitos de aglutingenos; pero si existen en el plasma aglutininas alfa o beta, que pueden presentar casos de aglutinacin a los receptores, en los casos de ttulos elevados. Hay que tomar precauciones, el riesgo de que las isoaglutininas transfundidas daen a los hemates del receptor, se podrn realizar este tipo de transfusiones sin peligro alguno, si se cumple con las siguientes normas:1. El plasma de la sangre que ha de emplearse no de be contener aglutininas para los hematis del futuro receptor2. El titulo de isoaglutininas reactivas deber ser inferior 1:80 La prueba cruzada menor debe realizarse con el suero neutralizado del donador, solo si esta prueba no da aglutinacin, podr emplearse la sangre sin riesgo. Sangre completa del donador universal, para un receptor de otro grupo sanguneo, los peligros relacionados con transfusiones de sangre de donadores universales, pueden reducirse al mnimo por la extraccin parcial o completa del plasma. En casos de transfusiones de urgencia, en las que es necesario reponer el vlumen sanguneo perdido y no se puede esperar a practicar las pruebas cruzadas, se recomienda el uso de sangre O Rh negativa con ttulos bajos de anti A y anti B y excenta de todos los anticuerpos irregulares.Fundamento:Las aglutininas forman parte de los donadores universales. Para cuantificar el ttulo de isoaglutininas, secuantifica cualquier reaccin de aglutinacin de Anti A y Anti B que persista en una dilucin de 1:80 deber considerarse de titulo elevado, donador universal peligroso.Material y equipo: Gradilla 24 tubos de 10 x 75 3 tubos de 13 x 100 10 pipetas de 0 1 5 pipetas pasteur 2 pipeta 1ml 1 centrifuga Serofuge 1 bao maria 37C Suero o plasma problema Solucin salina normal Globulos rojos A y BTcnica:1. En la gradilla colocar 3 hileras de tubos de 10 x 75, de 8 tubos cada una, marcar los tubos de la primera hilera con: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1320, 1:640 y 1:1280,2. Realizar diluciones del suero o plasma O, poniendo 5 ml, de solucin salina en cada uno de los tubos marcados, agregando 0 5m1, de suero o plasma del grupo O al primer tubo, mezclar y tomar 0,5 ml de esta suspensin y ponerla enel siguiente tubo y as sucesivamente hasta terminar desechando 0.5 ml de la suspensin final3. Preparar supensin de glbulos rojos en solucin salina al 5% de los grupos A y B, en los tubos de ensaye 13 x 1004. Aadir 0.1 ml de la suspensin preparada anteriormente de glbulos rojos del grupo A a los tubos de la segunda hilera y 0.1 ml de la suspensin de glbulos rojos del grupo B a los tubos de la tercera hilera5. Depositar 0.1 ml de suero O diluido a cada uno de los tubos que contienen los glbulos rojos A y B teniendo cuidado de marcar correctamente los tubos con la dilucin que se emplee6. Incubar todos los tubos A y B a 37C por treinta minutos7. Centrifugar a 2500 rpm durante un minuto8. Remover suavemente los glbulos rojos sedimentados, observando si existe aglutinacin macroscpica, reportar la aglutinacin en cruces hasta el ltimo tubo en que se encuentreInterpretacion de resultados: Se anotar la dilucin a la que se ohserv la aglutinacin en las dos hileras de tubos que contienen la sangre A y B Aglutinacin ms de 1:80 se considera de titulo elevado y por lo tanto solo transfundir a paciente con sangre de su mismo tipo o sangre O pero solo concentrado eritrocitario.Determinacion de Formula Roja En el laboratorio del Banco de Sangre, de los exmenes que se practican al donador, se encuentra el que corresponde al estado que guarda su sangre, en la cantidad de hemoglobina que contiene, as como el conocimiento del hematocrito, que nos indica, si se encuentra normal o tiene algn grado de anemia que lo descartara como donador, estos parmetros estan contemplados en la Norma Tcnica que rige a los Bancos de Sangre.Prctica No. 7Cuantificacion de HemoglobinaObjetivo: Determinarlos valores de la hemoglobina en la sangre del disponente.Generalidades:El elemento ms importante en el eritrocito es la hemoglobina, se presenta inicialmente en los eritrocitos en desarrollo (normoblastos), est compuesta por el hem un pigmento con capacidad de transporte de oxgeno y la globina una protena responsable de la especificidad de la especie y del transporte de anhidrido carbnico. En la molcula de hemoglobina hay cuatro subunidades, cada una de las cuales contiene un grupo hem anidado en una grieta hidrfoba de una cadena protenica, la globina. El hem es un anillo tetrapirrlico con un ion de hierro ferroso que se encuentra prximo al exterior del anillo donde con facilidad puede combinarse con el oxgeno. Existen ms de 40 variantes genticas de hemoglobina humana, el recien nacido tiene hemoglobina F (fetal) que posteriormente se transforma en hemoglobina A (adulta),Fundamento: Para conocer la cantidad de hemoglobina, se emplea una solucin de ferrocianuro de potasio y cianuro de sodio para combinarse con una muestra de sangre el ferrocianuro convierte el hierro ferroso de la hemoglobina en frrico para formar metahemoglobina, la cual se combina con el cianuro de sodio, para formar cianometahemoglobina: la densidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de hemoglobina presente en la muestra y se registra en el fotocolormetro.Material y equipo. 2 tubos 13 x 100 1 pipeta volumetrica 5 ml 1 pipeta Sahli c/ boquilla Fotocolorimetro o espectofotmetro 10 ml cianometa o diluyente Drabkin Sangre obtenida con EdtaTecnica:1. Se toman 0.2 ml, de sangre con la pipeta de Sahli y se diluyen en 5 ml de solucin de cianometa2. Se deja reposar por 10 minutos3. La densidad de la solucin se mide fotocolorimetricamente a 540 nm utilizando un blanco de cianometa4. El nivel de hemoglobina se obtiene, interpolando en una curva de calibracin preparada previamente con patrones.Valores de referencia:Hombres de 15 a 18 grms por 100 mlMujeres de 13 a 15 grms por 100 mlInterpretacion de resultados:Se anotar los resultados obtenidos y en aquellos casos, valores menores de 13 grms, se descartan como disponentes.Prctica No 8Determinacion de HematocritoObjetivo:Determinar los valores del hematocrito en la sangre del disponente, por microhematocrito.Generalidades:El hematocrito es el volmen de eritrocitos expresados como un porcentaje del volmen de sangre total, existente despus de centrifugar una muestra de sangre.Fundamento:Se basa en la separacin de los glbulos rojos y el plasma mediante una adecuada duracin y velocidad de centrifugacin capaz de separar el plasma y sedimentar los hematies el volumen del plasma que queda entre la masa globular empaquetada.Material y equipo micrometodo: 1 tubo 13 x 100 2 capilares con heparina 1 mechero de alcohol 1 microcentrifuga 1 lector de microhematocrito Sangre del disponente Antocoagulante de oxalato de amonio y potasioTecnica:1. El tubo de microhematocrito se llena por capilaridad a partir de una muestra de sangre venosa bin mezclada, ocupando dos capilares2. Los tubos capilares deben llenarse dos terceras partes y sellarse con la llama de un mechero, el extremo vacio3. Se centrifuga con el extremo sellado colocado hacia afuera de la centrfuga, equilibrando los tubos4. Centrifugar los tubos a 12,000 rpm por espacio de5minutos5. Leer en el lector de microhematocrito ambos tubosValores de referencia:Hombre de 45 a 50%Mujeres de 42 a 46%Interpretacion de resultados:Los resultados expresados en milimetros por ciento, cantidades menores de los valores de referencia, no son aceptados como disponentes.Practica No 9Investigacion de SeroluesObjetivo:El alumno detectar anticuerpos dirigidos contral el treponema pallidum, anticuerpos no treponmicos por medio de la tcnica adecuada.Generalidades:Sfilis es una de las principales enfermedades de transmisin sexual (ETS), puede transmitirse por la sangre de una transfusin por lo que es indispensable en el estudio del disponente, en ocasiones el donante niega todo antecedente de esta enfermedad y el exmen fsico no revela datos sospechosos, el estudio serolgico de los probables disponentes deben hacerse de rutina, se ha comprobado que la sangre refrigerada a 4Cpor un lapso mayor de 3 das, mata los treponemas que pudiera contener, no transmite la enfermedad pero s las reaginas especficas, por lo que las reacciones serolgicas del receptor de sangre, se vuelven positivas en forma temporal. Las reaginas es el anticuerpo inmune contra la sfilis, apa recen en la sangre y liquido cefaloraquideo de personas que padecen la enfermedad: las reaginas tambin se encuentran en enfermedades producidas por treponemas, como son la lepra y el mal del pinto. La sfilis es producida por una espiroqueta patgena, el treponema pallidum, bacteria gram negativa, anaerobia estricta, que mide de 6 a 15 micras de largo y de 0.1 a 0.2 micras de ancho, es una enfermedad infecciosa que puede presentarse en forma aguda y evolucionar a estados crnicos las manifestaciones clnicas, cuando estn presentes, son diversas; varian dependiendo de la etapa en que se encuentre la infeccin, as como de la respuesta individual del paciente.Procedimientos de laboratorio:Diversos recursos tiene el laboratorio clnico para la investigacin de sfilis: Microscopia en campo obscuro de exudado de lesin, Investigacin de Anticuerpos Antitreponmicos con: Tecnica de inmunofluorescencia indirecta Tecnica de hemaglutinacin indirecta. Tecnica de inmovilizacin de treponemas. Investigacin serolgica de Anticuerpos inespecificos con ensayos no treponmicos VDRL O RPR por su facilidad de adquirir los reactivos y simplicidad en la tcnica, se utilizan rutinariamente en el laboratorio las pruebas no treponmicas, las cuales se hacen positivas alrededor de la cuarta a la sexta semana despues del contacto infectante.Fundamento: Mtodo que emplea antgeno de cardiolipina, derivado del corazn de bovino para la deteccin de Anticuerpos totales denominados reaginas, estos son formados por el organismo en respuesta al material lipdeo, que se libera de las clulas daadas durante la infeccin, as como en contra del lpido presente en la superficie de los treponemas, el antgeno es una suspensin de lecitina colesterol en solucin salina de pH estabilizado, que se aade al suero del paciente inactivado en bao mara a56C por 30 minutos, la reaccin amtigeno anticuerpo se observa por floculacin, que es suficiente para estandarizar su reactividad.Material y equipo: 1 placa de vidrio escavada, 2 pipetas de 1 ml o pipeta automatica de 50 mcl 1 centrifuga clnica 1 bao maria a 56C 1 equipo para prueba de VDRL Suero problema, no hemolizado 1 agitador de placa 1 MicroscopioTecnica:1. El suero probema se inactiva, calentndolo durante 30minutos a 56C en bao maria2. Se prepara el antgeno cuidadosamente como indica el instructivo3. Colocar una gota de suero inactivado en la placa de vidrio escavado y una gota del antgeno preparado4. Agitar durante 4 minutos para procurar una mezcla homoge na5. Observar al microscopio con ocular 100x y objetivo 10xInterpretacion de resultados: Negativo si no presenta grumos. Debilmente positivo si hay grumos pequeos Positivo si los grumos son de tamao mediano y grande Obervacion el banco de sangre, solo utilizar sueros negativos, pero si se presentan resultados dbilmente positivos o positivos, podr realizarse la prueba cuantitativa y enviar al donante con el servicio mdico, para investigacin y tratamiento si es necesario.R. P. R.Generalidades:Llamada prueba rpida de reagina plasmtica, es un mtodo confiahle, si el resultado es negativo, se puede obtener la donacin; si es positivo se necesita un anlisis de comprobacin que puede ser cualquiera de los enunciados anteriormente, los fabricantes presentan en una sola caja el equipo necesario que contiene el reactivo por emplear, tarjetas de cartulina siliconada, popotes de plastico para medir la cantidad adecuada de suero o plasma. El reactivo tiene el VDRL, adicionado de cloruro de colina que sirve para hacer una descomplementacin qumica y un marca dor de carbn en partculas muy finas que dan color negro o rojo, a las reacciones de aglutinacin, las reacciones negativas tienen aspecto uniforme el R P R presenta un reactivo esteril y listo para usarse, los equipos contienen adems sueros control de reactividad especfica: reactivos, debilmente reactivos y no reac tivos.Tecnica:1. Coloque en una tarjeta del equipo una gota del suero o plasma del paciente con el popote de plastico.2. Extienda la muestra por todo el circulo con la ayuda de la punta del popote, sin permitir que el suero se salga de la onlla del circulo3. Sostenga la suspensin del antgeno, coloque el dispositivo goteador en posicin vertical y agrege exactamente una gotade la suspensin al suero o plasma en el area de la prueba4. Coloque la tarjeta en un rotador mecnico durante 8 minutos a velocidad 100 rpm para una mezcla homogneaInterpretacion de resultados Negativo mezcla homogna Positiva aglutinacin acentuada con grumos negros o rojos,Observaciones:Es conveniente montar simultaneamente un control positivo y negativo junto con el problema.Al finalizar cada determinacin, quite la aguja de la suspensin de antgeno, lave con agua destilada, seque al aire, tape el recipiente y refrigere hasta que de nuevo sea empleado.Practica No. 10HepatitisObjetivo:Detectar anticuerpos contra el virus de la hepatitis B en el suero humano.Generalidades:Debido al incremento de la aparicin de la hepatitis, desde el ao de 1972, se ha vuelto obligatorio en el Banco de Sagre, la investigacin en detectar el antgeno de superficie de la hepatitis B en la sangre de los posibles donadores de sangre. Exisen diversos mtodos para la investigacin del antgeno de superficie y se han clasificado segn su sensibilidad, referida refida a un panel de sueros conocidos que contienen antgenos. De estos tenemos las pruebas de primera generacin, las menos sensibles, porque solo detectan sueros de ms potente reactividad como en el caso de difusin en gel simple, las pruebas de segunda generacin, como la contraelectroforesis ya algo ms sensibles y las pruebas de tercera generacin, con sensibilizacin suficiente como para detectar todos los sueros reactivos: actualmente se tienen cuatro tipos de pruebas de tercera generacin.1. Radioinmuno ensayo RIA2. Hemaglutinacin pasiva inversa3. Aglutinacin pasiva inversa con ltex capilar4. Anlisis de inmunoabsorcin enzimtica ELISARadioinmundensayo:En el cual se utilizan esferas de plstico cubiertas con Anti HB, cada suero problema se incuba junto con una de estas esferas durante el tiempo de incubacin si hay HB ag en el suero, el suero problema reacciona con el Anticuerpo y cubre la esfera esta se lava y se aade Anti HB marcado con, si la prueba es positiva, el anticuerpo radiactivo reacciona con el antgeno previamente ligado y midindose el resultado con un contador de radiaciones gamma, este mtodo es muy sensible y especfico. Hay que tomar las precauciones adecuadas para la conservacin de las soluciones radiactivas, los materiales slidos, esferas, placas y tubos contaminados con radiactividad, deben desecharse siguiendo las normas de la Comisin de Energia Atmica.Hemaglutinacion Pasiva Inversa Este mtodo utiliza antgenos ligados al eritrocito la prueba se denomina inversa poeque el anticuerpo se une a eritrocitos estabilizados congelados y desecados la prueba del examen selectivo se lleva a cabo en placas de microtitulacin, las diluciones de cada suero problema y los sueros de control se introducen en pozos en forma de V, una gota de eritrocitos cubiertos con Anti HBS se aade a cada uno de estos, despus de un periodo de incubacin sin agitarlos, se lee la posi tividad o negatividad de los resultados, las cuales dependen de la forma de sedimentacin de los eritrocitos en el pozo si elresultado es positivo, la aglutinacin de los eritrocitos es ms difuso que en las reacciones negativas, todos los sueros positivos deben confirmarse. La prueba es subjetiva, ya que la persona que realiza lalectura debe decidir sobre la positividad o negatividad de los re sultadosAglutinacion Pasiva con Latex. Los sueros se absorben con partculas de ltex cubiertas con globulina gamma de cobayo, los sueros absorbidos se incuban con partculas de ltex cubiertas con antiHBS mientras se hacen rotar las muestras, la lectura es igual para la de hemaglutinacin pasiva inversa.Analisis de Inmunoabsorcion Enzimatica prueba de ELISA: El mtodo de ELISA es similar al RIA pero en vez de utilizar antiHBS marcado con 1125, se emplea un antiHBS marcado con una enzima despus de la incubacin y el lavado se aade un sustrato para inducir un cambio de color si se ha ligado el complejo enzima antiHBS los resultados se leen en un espextrofotmetro para medir la densidad del color. Este mtodo tiene gran sensibilidad y especificidad, adems de que la lectura es objetiva; puede utilizarse un tipo de lectura automatizada para leer e imprimir los resultadosnaturalmente su precio los hace prohibitivos, todos los mtodos de tercera generacin pueden detectar partculas de un ng/ml. En la utilizacin de las tcnicas anteriores, es preciso los cuidados mximos de limpieza y condiciones sanitarias, la zona para las pruebas de hapatitis deben estar separada del resto del banco de sangre y el personal debe utilizar mascarillas, anteojos y guantes desechables, tratar los materiales como si fueran capaces de transmitir agentes infecciosos.Practica No. 11Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida SIDAObjetivo:Busqueda de los antgenos virales o anticuerpos producidos como respuesta a los antgenos, en suero sanguneo de una per sona infectada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) .Generalidades:El sindrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) conocido tambin comoAIDS las iniciales de su nombre en ingles (adquird inmunodeficiency sndrome) es considerado en practicamente todos los paises del mundo como un serio problema de sa lud publica. El agente causal del SIDA es un retrovirus que fu denominado limphadenopaty asociated virus por su primer descubridor, el Dr Luc Montagnier, del instituto Pasteur en Francia, en mayo de 1983. En mayo de 1984 el Dr Robert Gallo del Instituto Nacional del Cancer en U S A, aisla y caracteriza un retrovirus de pacientes con SIDA y lo denomina human ymphotropic virus III desde 1987, por acuerdo internacional se decide nombrar al virus human inmunodeficiency virus (HIV en espaol virus de la inmunodeficiencia humana hasta el momento se han reconocido dos cepas significativamente diferentes, llamandoles VIH I y VIH 2, el virus se transmite por contacto sexual, bucal o anal por la inoculacin o administracin de sangre o hemoderviados contaminados y perinatalmente de madre infectada a hijo; el paso trasplacentario del virus est demostrado y existe la factibilidad de infeccin a travs de la lactancia. No existen evidencias que apoyen la transmisin por contacto casual entre las personas en ambientes escolares, sociales o de trabajo; no existe la evidencia de la transmisin por medio de insectos, ni por tos o estornudos, asi como tampoco a travs de agua o alimentos. Despus de infectarse una persona, puede permanecer asintomtica durante varios aos algunos pacientes pasan por un estado de molestias tempranas con presencia de fiebre, artralgias y malestar general que se presentan al mismo tiempo que la seroconversin, momento a partir del cual es posible detectar anticuerpos contra VIH en el suero del paciente esto ocurre generalmente entre la segunda semana y el tercer mes posterior a la infeccin, a partir de este momento pueden pasar en promedio de 8 a 9 aos para el de sarrollo del SIDA,una vez que la enfermedad se ha desarrollado, la mortalidad es muy elevada, casi del 100%. El virus es capaz de producir el deterioro progresivo y predecible de las funciones inmunologicas, siendo el SIDA una manifes tacin tarda de este proceso, el padecimiento es de naturaleza inmunosupresora y de tipo basicamente celular, la poblacin celular especificamente abatida, es la de los linfocitos T cooperador C4, la perdida de las celulas T4 daa seriamente la habilidad del organismo para contrarrestar a la mayor parte de microorganismos invasores, observando que este dao es particularmente severo, sobre la defensa en contra de virus, hongos, parasitos y ciertas bacteras.Metodos de laboratorio: Una vez que la infeccin ha ocurrido, el individuo podra permanecer totalmente asintomatico durante un lapso que puede fluctuar desde 10 meses hasta 89 aos, un individuo infectado o infectante por el hecho de sentirse bien, continuar su conducta habitual, con el consiguiente riesgo para si y para los demas, dentro de este lapso asintomatico, la unica manera de conocer si una persona est o no infectada, es mediante la busqueda de los antgenos virales a los anticuerpos producidos en respuesta a aquellos, en suero sanguineo o bien el aislamiento del virus a partir de algn tejido, las pruebas de laboratorios que se disponen son las que permiten detectar aticuerpos contra VIH y se dividen en dos categorias:1. Prueba de tamizaje o escrutinio inicial (presuntivas)2. Pruebas confirmatoriasPruehas presuntivas:Actualmente existen varias pruebas para la deteccin de aticuerpos contra VIH estas pruebas difieren en suprincipio funcional, lo cual da lugar a diferencias en tiempo de proceso, necesidad de instrumentacin analtica, necesidad de adies tramiento y experiencias del personal analista, entre otras, ELISA (Eenzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)Fundamento:Se trata de un anlisis inmunoenzimatico heterogneo, existen dos tipos competitivo y no competitivo, emplean una fase slida la cual ha sido recubierta con antgenos de VIH si el suero problema contiene anticuerpos contra VIH, estos reaccionan con el antgeno quedando por lo tanto unidos a la fase slida, el revelado de la presencia de estos anticuerpos unidos se hace medianteun conjugado formado por un anticuerpo Anti IgG o Anti IgM unido a una enzima, la unin del conjugado se pone de manifiesto adicionando el substrato de la enzima, en los ELISA de tipo no competitivo, la produccin de color es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos contra VIH presentes en el suero problema, dentro de ciertos lmites, enlos ELISA de tipo competitivo, la produccin de color es inversamente proporcional.Material requerido: Micropipetas Sistema de lavado de pozos Espectofotmetro para placas de Elisa Tiempo de proceso: Elisa competitivo: Aproximadamente 2, 5 Elisa no competitivo: Aproximadamente 4 Elisa rapido: Aproximadamente 15 minutosAglutinacin:Fundamento:Estos mtodos hace uso de particulas, ya sea de ltex, gelatina o bien hematies, sensibilizados con antgeno de VIH, el contacto con un suero que contenga anticuerpos contra VIH produce la aglutinacin indirecta de las partculas, observable a simple vista.Material:Todo el material viene con el equipo de reactivosTiempo de proceso:Latex 5 minutosGelatina 2 horasHemates 2 a 3 horas.Citoinmunoenzimatica.Fundamento:Este mtodo emplea clulas infectada con VIH, colocadas en un pozo de un porta objetos, al reaccionar con un suero quecontenga anticuerpos contra VIH estos se uniran a los antgenos de VIH presentes en las clulas, dicha unin se pone de manifiesto mediante un conjugado de proteina A estafilococica y el substrato correspondiente, produciendose coloracin de la membrana y citoplasma celular.Material: Micropipetas Microscopio Tiempo de proceso: 2 horasMembrana sensibiltzada.Fundamento:Eeste anlisis hace uso de una membtana porosa sensibilizada con antgenos de VIH, al depositar el suero problema sobre la membrana, la reaccin ocurre instantaneamente, drenandose rpidamente el lquido los anticuerpos unidos se ponen de rnanifiesto mediante un conjugado especial que provoca la aparicin de un punto rojo apreciable a simple vista.Material:ninguno.Tiempo de proceso:5 minutos.De los metodos mencionados, el ms ampliamente utilizado es el ELISA, muy confiable y razonablemente rpido. Los mtodos de aglutinacin, en general pueden ser considerados como una buena alternativa sobre todo aquellos cuyos resultados se obtienen en pocos minutos, sin embargo, todos ellos quedan sujetos a la objetividad de la lectura visual del resultado, particularmente al tratarse de un suero debilmente positivo.En todos los casos de pruebas presuntivas, un primer resulta dopositivo deber verificarse repitiendo el analisis con los mismos reactivos o preferentemente con reactivos de otro tipo. Resultados repetidamente positivos en pruebas de esta calidad, debern calificarse como presuntivamente positivos y procederse a su confirmacin mediante los metodos correspondientes. Existe tambin un ELISA que permite detectar las proteinas constitutivas del VIH (antigenemia) esta prueba es til en la deteccin muy temprana de la infeccin (2-4 semanas despus del contagio), cuando aun no es posible detectar anticuerpos circulantes.Pruebas confirmatorias actualmente en uso son: Western Blot o Inmunoelectrotransferencia Inmunofluorescencia Radio-inmuno-precipitacionWester Bloto o Inmuno electro transferencia. Mtodo que hace uso de tiras de papel, las cuales han sido impregnadas con las diferentes proteinas constitutivas del virus, mediante un proceso previo de inmunoelectrotransferencia. Las proteinas se encuentran distribuidas a lo largo de la tira de papel en orden decreciente de peso molecular, en espacios discretos y bien definidos.La tira asi preparada se coloca en un canal de plastico y se sumerge en una dilucin del suero problema; en caso de existir anticuerpos contra VIH, estos se unirn a la tira de papel en el punto correspondiente a la localizacin de la proteina para la cual sean especificos. Tal unin se pondr de manifiesto mediante un conjugado enzimtico Anti-inmunoglobulnico y el substrato correspondiente, que dar lugar a la aparicin de bandas obscuras sobre la tira. Este mtodo permite detectar la presencia de anticuerpos especificos contra las siguientes proteinas de VIH; gp160, gpl20, p55 p51, gp41, p31, p24 y p217, se han utilizado varios criterios de interpretacin de la lectura de las tiras, los dos ms usuales son: Interpretacion Criterio 1 Criterio 2 Negativo Ausencia total de bandas Indeterminado Presencia de bandas que No cumplen con el criterio de positividad Positivo Al menos 1 banda Aparicin de la Correspondiente a c/uno Banda gp160 y al De los 3 genes principales menos una GAG o de VIH (ENV, GAG,) Atualmente se cuenta con reactivs comercialmente disponibles tanto para VIH 1, como para VIH 2.Inmunofluorescencia Este mtodo consiste en utilizar clulas infectadas por VIH depositadas en pozos de un porta objeto, el suero problema se coloca encima de un pozo con clulas infectadas y de otro con clulas no infectadas, en caso de tener anticuerpos especficos contra el VIH, estos se uniran a las clulas infectadas, mientras que las no infectadas no presentaran unin alguna, la reaccin antigeno-anticuerpo se pone de manifiesto por medio de un Antisuero Anti inmunoglobulnico conjugado con fluoresceina, al ser observado en un microscopio de fluorescencia. El criterio de asignacin de positividad, estar dado por la presencia de un patrn de fluroescencia perifrico (de membrana caracterstico) y ocasionalmente por cierto patrn citoplsmico, si bien este mtodo es considerado de calidad confirmatoria, es menos sensible que el Western Blot, esta tcnica aunque sencilla presenta problemas de interpretacin, por lo que solo puede ser realizada por tcnico altamente capacitados.Recomendaciones para el personal de laboratorio. Por el trabajo que se realize en el laboratorio, el personal que se desempea en el mismo, corre un riesgo al estar en contacto con sangre, secresiones, as como con agujas e instrumentos contaminados con sangre de personas en riesgo de infeccin por SIDA, ya hemos puntualizado que el riesgo de transmisin ocupacional es muy bajo, y ha sucedido que personal que labora en el laboratorio, la exposicin parenteral a sangre contaminada, pocos casos se han reportado y demostrado seroconversin para el VIH.No se ha demostrado la contaminacin en los lugares de trabajo por contacto fortuito a travs de agua o alimentos contaminados, insectos que actuan como vectores o por via aergena el personal de laboratorio, as como los que manejan y atienden a pacientes, se deben tomar y extremar precauciones para evitar el contacto directo con la piel o las mucosas con sangre, hemoderivados, excresiones, secresiones y tejidos de pacientes con SIDA o de personas con infeccin presumible del padecimiento.Todo el personal de salud, incluso estudiantes, que se encuentran dentro de instalaciones hospitalarias, debe conocer la epidemiologia, manifestaciones clnicas, forma de transmisin y precauciones para prevenir la contaminacin de la infeccin del SIDA.Precauciones: Deben aplicarse en los laboratorios clnicos, como los de investigacin; se puntualiza en el personal que efecta estudios con especmenes u otros materiales potencialmente infectados cultivos tisulares inoculados, huevos embrionados o tejidos animales procedente de individuos con sospecha o certeza de VIH. En el laboratorio se utilizarn pipetas mecnicas para el transvase de todos los lquidos no se permitir el pipeteo con la boca. Las agujas y jeringas que se utilicen sern desechables y una vez utilizadas se colocaran en recipientes irrompibles de boca ancha, no deben taparse con su guarda para prevenir pinchazos, ni se doblaran, romperan o desacoplarse de la jeringa, se incinerarel recipiente. Debe usarse bata o uniforme de laboratorio, de manga larga. Se utilizarn guantes para evitar el contacto de la piel con la sangre, muestras que contienen sangre, articulos contaminados con sangre, lquidos corporales, excresiones y secresiones, as como superficies, materiales u objetos expuestos a ellos. El material potencialmente infeccioso debe tratarse y ma nipularse cuidadosamente para reducir al mnimo la formacin de aerosoles. Se recomienda usar cabinas de seguridad biolgica y otros dispositivos de contencin primaria por ejemplo cubierta de seguridad para la centrfuga.Cuando se realizan procedimientos de general aerosoles como en el caso de centrifugacin, mezclas, aplicacin de ultrasonido, mezclas vigorosas y obtencin de tejidos infectados de animales o huevos embrionados. Despus de cualquier salpicadura de material que pueda ser infeccioso y al terminar la jornada, las superficies de trabajo de las mesas de laboratorios, se limpiarn con un desinfectante como la solucin de hipoclorito de sodio (dilucin de 1:1 en agua fria). Ttodos los materiales potencialmente contaminados que seanutilizados en las pruebas de laboratorio se estetilizaran en autoclave, antes de desecharlos o reutilizarlos. El personal no debe tomar alimentos ni fumar dentro del laboratorio. El personal debe lavarse las manos con agua y jabon despus de quitarse los guantes y quitarse la bata antes de salirdel laboratorio. Comentario adicional se recomienda a laboratorios y bancos de sangre, a el personal se le practique, semestralmente investigacin de Hepatitis B y VIHPractica No. 12Investigacin Individuo Secretor.Objetivo Obtener una saliva de individuo secretor.Fundamento:Si a un suero para diagnstico anti A se le agrega saliva secretora tipo A, se neutralizarn sus aglutininas inactivando el reactivo, que ya no podr aglutinar glbulos rojos A o B.Material y equipo: 1 gradilla 4 tubos 10 x 75 6 Tubos 13 x 100 1 pinza para tubo de ensaye 1 vaso de precipitado de 100 ml 1 pipeta graduada 5 ml 4 pipetas Pasteur c/bulbo 1 mechero Bunsen 1 tripie 1 tela de alambre 2 centrifugas Serofuge Solucin salina en pizetas Sueros anti A Suero anti BTcnica:1. Se obtiene saliva de una persona de tiro A conocidas y otra de tipo B colocando una torunda de algodn debajo de la lengua, despus se exprime en un tubo de ensayo colectar 3 ml2 En un vaso de precipitados se calienta la saliva a 56C durante 5 minutos, despus se centrifuga a 2500 r, p m, durante 5 minutos y se cosecha el sobrenadante,3 Para investigar si sta saliva es o no secretora de la sustancia de grupo sanguneo se procede as: En un tubo de ensayo de 10 x 75 se ponen 4 gotas de saliva a estudiar y se agrega una gota de suero anti A , (mezclar, dejar a temperatura ambiente, durante 15 minutos. Preparar un testigo positivo, con cuatro gotas de salina y una gota del mismo suero anti-A. Agregar a cada tubo una gota de glbulos a conocidos, mezdar bien esperar 3 minutos y centrifugar 2500 rpm, buscando aglutinacinInterpretacin de resultados:1 El testigo deber ser aglutinado siempre2 El problema puede comportarse en dos formas:a) Si no presenta aglutinacin es que la saliva estudiada es secretora y por ello ha neutralizado las aglutininasb) Si la saliva estudiada presenta aglutinacin, no es secretoraPractica No. 13Pruebas Cruzadas de Compatibilidad SanguineaObjetivo:El alumno al finalizar la prctica determinar si dos sangres; del donador y del receptor, son compatibles, para practicar la transfusin sangunea.Generalidades:En todo banco de sangre y ante la inminencia de transfundir sangre a un individuo, es obligatorio efectuar la determinacin del tipo sanguneo y el factor Rh del receptor; al seleccionar la sangre a transfundir, deber ser del mismo tipo sanguneo y factor Rh del paciente, cumpliendo con esta premisa, se efectuar en el laboratorio un anlisis que nos permita envitrodetectar si en ellas, tenga un anticuerpo anormal, que pueda causar aglutinacin o hemlisis de los glbulos rojos en la circulacin sangunea del receptor. La identificacin correcta de la sangre elegida para la donacin, la del paciente que ha de recibir la transfusin, la exactitud, velocidad, prevencin y de control de calidad y omisin de errores, son aspectos que al realizar las pruebas cruzadas, revisten gran importancia, pues errores humanos descubiertos despus de iniciada una transfusin son imposibles de corregir y ponen en peligro la vida del paciente.Fundamento: Las pruebas cruzadas deben:a) Detectar anticuerpos IgM de carcter aglutinante o hemolizante que fijan complemento, por lo que se debe trabajar con sangre recin extraidas y coaguladas.b) Investigar Anticuerpos IgG que por su naturaleza no producen aglutinacin y se deben utilizar distintosmediosque permitan demostrar su presencia, produciendo aglutinacin o hemlisis.Material y equipo: 1 gradilla 4 tubos 13x 100 12 tubos 10 x 75 6 pipetas Pasteur con bulbo 2 centrifugas Serofuge Bao mara a 37C Slucion salina en pizetas Albmina bovina al 22% Suero Antiglobulina Humana (Coombs)Tcnica:1. Separar los sueros de los globulos rojos2. Realizar una suspensin de globulos rojos del disponente y del receptor al 5% previamente lavados3. Se colocan 7 tubos en lnea recta y se marcan: 1 2 3 4 5 6 7 E r Sr Ed Sd FM fm C1. A la Fase mayor se le pone una gota de suero del receptor ms una gota de globulos rojos al 5% del disponente2. A la fase menor se le pone una gota de suero del disponente ms una gota de globulos rojos al 5% del receptor3. Al tubo control se le pone una gota de suero del receptor ms una gota de globulos rojos al 5% del receptor4. Se centrifugan a 2500 rpm por 30 y se lee desprendiendo suavemente el sedimento en busca de aglutinacion de no existir aglutinacin, se continuar5. Se agregan dos gotas de Albmina Bovina al 22% y se centrifuga a 2500 rpm por 30 y se lee6. Se incuban a 37C durante 30 minutos, se extrae los tubos10.Se centrifuga a 2500 rpm por 30 y se leen11.Se llenan con solucin salina 3/4 de ambos tubos (fase mayor y menor) se mezclan y se centrifugan a 2500 rpm por 30, se sacan de la centrfuga y se decantan y se vuelve a aplicar solucin salina (sta operacin se repite tres veces) en el ltimo lavado, se decantan completamente el tubo12.Al sedimento residual se le agregan dos gotas de reactivo de Coombs a ambos tubos y se centrifugan a 2500 rpm por 30, se leen cuidadosamente para buscar que no haya hemlisis ni aglutinacin13.Se le agrega a cada tubo una gota de clulas control se centrifuga a 2500 rpm por 30 y se leen en busca de aglutinacin.Conclusin: La prueba mayor, menor y control contienen: Prueba mayor: suero del receptor con globulos rojos del disponente (2 gotas de suero del receptor ms 1 gota de suspencin de eritrocitos del disponente) Prueba menor: suero del disponente con globulos rojos del receptor (2 gotas de suero del disponente ms 1 gota de suspencin de eritrocitos del receptor) Control: suero del recpetor y globulos rojos del receptor (2 gotas del suero del receptor ms 1 gota de suspencin de e ritrocitos del receptor ) Si en todos los pasos no existi aglutinacin o hemlisis, las pruebas son 100% compatibles y la sangre puede transfundirse, en caso de existir aglutinacin o hemlisis, en cualquiera de los pasos se considera incompatibilidad, las pruebas se suspenden y se comienza a investigar otra bolsa de sangre del mismo tipo sanguneo y factor Rh, siguiendo los mismos pasos. Si la incompatibi lidad, se encuentra en los tubos con salina (1 y 2) probablemente se trata de una IgM y hay una equivocacin en el tipo sanguneo, por lo tanto se debe ratificar el tipo del donador. Si la aglutina cin es en el tubo menor en salina se trata de una IgM del donante y es de esperarse, en elCASO DE EMPLEARSEsangre O. Cuandose efectua el cruce con receptores de tipo sanguneo distinto esta sangre puede emplearse, de preferencia el paquete globular. Es de hacerse notar que tanto la aglutinacin como la hemlisis son macroscpicas y que en muy pocos casos es necesario utilizar el microscopio. Este mtodo por los numerosos pasos que hay que efectuar, al parecer es complicado, pero la prctica continua del mismo se vuelve simple y automatizado y en muchas ocasiones de acuerdo con la urgencia se puede reducir la incubacin, con primera lectura a los 20 minutos, si se reporta negativo, enviar la sangre a transfundir, continuando con el mtodo hasta cumplir con los tiempos sealados. Las investigaciones de mtodos ms sencillos y gran confiabilidad, han llevado a buscar que la velocidad de algunas reacciones antgeno anticuerpo de grupos sanguneos, aumentan considerablemente si la incubacin se lleva a cabo en condiciones de ba ja fuerza inica entre sus ventajas, se encuentra el acortamiento de los tiempos de incubacin, la posibilidad de detectar algunos anticuerpos dbiles que no pueden detectarse por otros mtodos y la formacin de aglutinados ms fuertes que los producidos por otras tcnicas en la fase de Antiglobulina, aumentan un tanto las reacciones dbiles, probablemente debido a la unin inespecifica de los componentes del complemento. Los reactivos que han de utilizarse en las tcnicas deben prepararse y controlarse con esmero, y las condiciones de las reacciones deben ser tan precisas para evitar resultados positivos falsos no cabe duda de que los mtodos conLISS,si se efectuan adecuadamente son excelentes, siempre y cuando lo empleen pesonal debidamente entrenados este recurso no es de uso comn y su uso est restringido a muy pocos centros especializados.Interpretacin de Resultados Para el corrector manejo de los resultados se deber anotar despus de cada observacin Aglutinacin en cualquiera de las pruebas mayores no sera necesario proseguir con los siguientes pasos, pus demuestra in compatibilidad Las anotaciones se pueden realizar en tarjetas diseadas exprofeso y de las cuales cada laboratorio contar con un modelo, cualquiera que ste sea debe contener los datos generales, de receptor y donador, cada tarjeta debe ser adherida a la bolsa de sangre correspondiente y al enviarse a la aplicacin del paciente, se guardar en el expediente del mismo.Practica No. 14Prueba de CoombsObjetivo:El alumno conocer los eritrocitos sensibilizados por anticuerpos incompletos, que son capaces de ser aglutinados por la Antiglobulina Humana.Generalidades:El suero de Coombs permite establecer la presencia de globulina y por lo tanto de anticuerpos, ya que son de la mismanaturaleza, los anticuerpos incompletos como son los que producen la eritroblastosis fetal y la anemia hemoltica adquirida, se absorben sobre la superficie del glbulo rojo; pero no los aglutinan, el suero Antiglobulina permite reconocer estos glbulos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulnicos que ya cubren.Es utilreconocer estos globu1os sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulnicos que ya cubren su superficie el suero de coombs es ideal pus tiene anticuerpos contra las globulinas sricas humanas que abarcan cuatro grandes alfa1, alfa2, beta y gamma, y dentro de estos grupos se en cuentran anticuerpos Anti Rh incompletos, Anti-Duffi, Anti Kell el suero de Coombs se obtiene por inyecciones repetidas de sueros humanos del grupo O a conejos el animal sensibilizado de esta manera produce anticuerpos contra la fraccin globulinica de las proteinas sricas y contra anticuerpos incompletos que pueden encontrarse revistiendo a los hemates o bien es suspensin en el plasma, por lo que se llama Antiglobulina Humana, se preparan reactivos de amplio espectro mediante la mezcla de sueros obtenidos de distintos animales. La IgG no produce aglutinacin de los eritrocitos, pero se fijan sobre ellos y permanecen sin soltarse, al agregar el suero de Coombs se forman puentes entre los fragmentos cercanos y es posible ver la aglutinacin, revelando que esos eritrocitos estaban en realidad cubiertos de anticuerpos.Prueba de Coombs Directa.Fundamento: La prueba directa se realiza cuando el Antiuerpo se ha fijado sobre el eritrocitoin vivo, permite establecer la sensibilizaci6n de los glbulos rojos que tuvo lugar en el organismo. Se usa para el diagnstico de eritroblastosis fetal, anemia hemoltica y reacciones hemolticas postrasfusionales por sangre incompatibleMaterial y equipo 1 gradilla 4 tubos de 13 x 100 2 tubos de 10 x 75 2 pipetas Pasteur c/bulbo 1 centrifuga Serofuge 1 bao mara 37C Solucin salina en pizetas Suero de coombs Globulos rojos problema Globulos rojosORh negativosTecnica1. Para identificar los glbulos rojos sensibilizados es necesario remover la totalidad del suero de los eritrocitos, mediante lavadas repetidas con suero salino. Este proceso es importante, pus si se dejan residuos proteicos se neutraliza el suero de Coombs y se obtendrn falsos negativos2. Se prepara una suspensin de glbulos rojos al 5% de lacul se colocan dos gotas en un tubo de ensaye y se procede al lavado por tres ocasiones3. Despus del ltimo lavado se resuspenden los glbulos rojos nuevamente con una gota de solucin salina, agregar dos gotasde suero de coombs y mezclar4. Incubar por 30 minutos a 37C, extraer el tubo cuidadosamente y observar si existe aglutinacin en el fondo del tubo con leves movimientos de inclinacin,5. Se aconseja como testigo utilizar hemates de adulto no sensibilizados del mismo grupo del paciente. El testigo se prepara en un tubo poniendo una gota de sangreORh negativa y cuatro gotas de solucin salina ms una gota de suero anti Rh, incubar media hora, lavar por tres veces estos glbulos y despus se adiciona una gota de suero de CoombsInterpretacion de resultados:1. La aglutinacin en el tubo testigo no debe existir,2. Si el tubo problema presenta aglutinacin, los glbulosrojos estn sensibilizados por algn anticuerpo incompletoPrueba de Coombs IndirectaFundamento:En esta prueba la sensibilizacin se realiza in vitro, en la primera etapa se sensibilizan los glbulos rojos testigos con el anticuerpo que se desea investigar (Rh negativo, factor Kell, Diego, etc.) y en la segunda etapa por medio de reactivo de Coombs se hace visible la sensibilizacin por medio del fenmeno de aglutinacin macroscpica.Tcnica1. En tubo poner cuatro gotas del suero promema y una gotade glbulos rojos sensibilizados, suspendidos en solucin salina al 5%, si se investigan anticuerpos Rh se usan glbulos rojos tipoO Rh positivos2. Se incuba a 37C por una hora, se centrifuga el tubo a baja velocidad 2500 rpm x 1 minuto3. Se lavan los glbulos rojos sensibilizados tres veces con solucin salina, desechando el sobrenadante completamente en el ltimo lavado, dejando solo el boton de eritrocitos en el fondo4. Agregar dos gotas de suero de Coombs, mezclar perfectamente y poner en bao Mara a 37C, durante cinco minutos,5. Centrifugar a baja velocidad 2500 rpm y buscar aglutinacin en el fondo del tuboInterpretacion de resultados.1. Si se encontr aglutinacin despus del paso nmero 2, indica la presencia de aglutininas anti Rh en el suero problema2. Si la prueba es negativa, se puede presumir la existencia de anticuerpos incompletos o bloqueadores, y se comprueba prosiguiendo con la tcnica.3. Se puede realizar diluciones del suero problema para conocer el titulo del aglutininas anti-Rh que existen en el pacientePractica No. 15Investjgacion con Celulas Control de Coombs en la Prueba Cruzada PretransfusionalObjetivo:Que el alumno aprenda a fijar un anticuerpo en la membrana del eritrocito. Al utilizar estos eritrocitos sensibilizados en las pruebas cruzadas que hayan resultado compatibles, convertir una prueba negativa en positiva.Fundamento.En esta prueba se fija sobre el determinante Antignico de eritrocitosO, anticuerpo (anti-D). Estos eritrocitos al encontrarse en un medio con reactivo de Coombs, este forma un puente entre los eritrocitos cercanos, produciendo aglutinacin.Generalidades.Esta prueba fu descrita por primera vez en 1908 por Mc. Reschi y aos ms tarde en 1945 por Coombs, Mourat y Race, aplicndola en la identificacin de aglutininas Rh debiles e incompletas. El suero de coombs es una Antiglobulina Humana, preparada por inmunizacin de animales (conejos o cabras a los que se les inyecta suero humano o las fracciones de ste, los anticuerpos incompletos, entre ellos los que explican la eritroblastosis fetal y la anemia hemoltica adquirida, se adsorbe o se une al antgeno Rh fijos en la membrana del eritrocito, pero no los aglutina, el suero Antiglobulina Humana, permite reconocer estos glbulos sensibilizados, al combinarse con los anticuerpos incompletos que ya cubren en superficie con lo cual se produce la aglutinacin. Puesto que el suero humano contiene anticuerpos que pueden interferir en la prueba y puede neutralizar el suero de Coombs, es necesario eliminar totalmente el suero de la muestra sangunea, mediante lavados repetidos con solucin salina. No se utilizan los sueros de sujetosAoBporque las substancias especficas de estos, tendran suero de Coombs con anticuerpos contra las aglutininas a y b, los anticuerpos recubren con frecuencia los eritrocitos, pero no forman la malla necesaria que produce la aglutinacin; como es el caso de anticuerpos dirigidos a los determinantes Rh sobre los eritrocitos humanos sin embargo la adicicin de un antisuero Antiglobulina producido por una especi heterloga, produce marcada aglutinacin. La prueba de antoglobulina se usa principalmente para identificar cantidades subaglutinantes o no aglutinantes de los anticuerpos antieritrocitos.Material y equipo1 gradilla4 tubos 10 x 752 pipetas Pasteur c/bulbo1 centrifuga Serofuge1 bao maria a 37CSuero de CoombsSuero anti-DSolucin salina en pizetasGlobulos rojos tipo OTecnica1. En un tubo de ensaye, se pqnen dos gotas de globulos rojos O, cuatro gotas de solucin salina y dos gotas de suero anti-D2. Se incuba el tubo a 37C durante 30 minutos,3. Lavar en tres ocasiones con solucin salina a 3, 400 r p m, durante 15 segundos en cada ocasin4. Para probar que los eritrocitos se encuentran sensibilizados, se toma una gota de la mezcla en otro tubo y se le agrega una gota del reactivo de Coombs, se centrfuga a 3400 y si se aglutinan, estan listos para usarse5. Se agrega una gota de los globulos rojos Oo sensilizados a cada uno de los tubos en que se realiz el CCoombs en las pruebascruzadas6. Se centrifugan y se observa si existe aglutinacinInterpretacion de resultados:1. Si las pruebas cruzadas resultaron compatibles y estuvieron correctamente realizadas, al agregar las clulas control de Coombs se observar aglutinacin2. En caso de no encontrar aglutinacin, se proceder a repetir todas las pruebas cruzadas, pues existi un error en la manipulacin o en la agrupacin sangunea.Control de Calidad en el Banco de Sangre. El control de calidad, serie de procedimientos que nos permiten detectar, analizar y minimizar nuestros errores, constatar la calidad de nuestros productos y ver el alcance de nuestras metas. En el control de calidad, participamos todos y unas personas solo recaban los datos para ser procesados poste riormente. Lejos de ser procedimientos complicados y sotisficados, el control de calidad debe emplear tcnicas lo ms sencillas posibles y para realizarse debe de cumplir los siguientes caractersticas:1. Debe hacerse en forma fcil2. Sin sobrecarga de trabajo3. En forma periodica,4. En forma sistemtica5. Libre de prejuicio Los resultados obtenidos de la prctica del control de calidad nos va a permitir: Prevenir, ya que al llevar un control estricto podemos detectar los posibles errores an antes de que se presenten Corregir, cuando el error se presenta, mediante un anlisis podemos ver la naturaleza humana, de instrumentos o de la prctica de un mtodo que nos lleve a ese error y corregirlo Modiflcar si ese error se convierte en sistemtico, se podr modificar parte o todo un proceso que nos conduce a ese error, an si esto implica cambiar un mtodoUn buen control de calidad nos debe reflejar todos los aspectos que intervienen en la buena realizacin de nuestro trahajo, estos aspectos son: Instalaciones Equipo Procedimientos Personal Control de calidad en el area de fraccionamiento, conservacion y distribucion El control de calidad de cada una de las secciones que intervienen en la obtencin, manejo, proceso y salida de la sangre es muy importante, sin embargo si tomamos en cuenta que el final de toda esta cadena, lo representa la seccin de fraccionamiento, conservacin y distribucin, su control de calidad se vuelve doblemente importante, ya que cualquier anomala que en pasos previos haya sido pasada por alto, debe ser detectada en esta seccin.En suma el control de calidad, de esta rea debe su vital importancia al echo de ser la suma de cada uno de los procesos a que la sangre se ve sujeta antes de ser enviada para ser transundida. En forma esquematica podemos dividir para su estudio anuestro control de calidad de esta seccin en tres grandes areas Control de calidad, administrativo Control de calidad del equipo Control de calidad de los productos, Cada una de estas reas implica a su vez, y como anteriormente se mencion, los aspectos de instalaciones, recursos materiales, procedimientos y personal que intervien en su desarrollo.Control de calidad administrativo. Es importante pus a travs de l, podemos hacer un seguimiento de la sangre y los productos que de ella deriven, la procedencia, vigencia, disponibilidad, identificacin y destino. Libreta de registro la base de esto es la libreta de registro, la cual, debe contener los siguientes datos: Fecha de entrada Nombre del disponente No de registro Grupo sanguneo y Rh, Resultados de laboratorio Fecha de sangrado Fecha de caducidad Procedencia Nombre de la persona que recibe Fracciones obtenidas Institucin o servicio a quin se entrega el producto Fecha de entrega Nombre de quien entrega Deben hacerse varios chequeos semanalmente tomando al azar algunos nmeros de registro, comparandolos con los datos de la bolsa madre y sus reportes, verificarse tambin al dar salida a algn producto. Requislciones de salida, verificarlas diariamente tomando alazar varias de ellas, compararlas con la libreta de registro, checar tambin al dar salida y al entregar algn producto, bolsa madre debe contener los siguientes datos. No de registro Nombre del donador Grupo sanguneo y Rh Fecha y hora de sangrado Fecha de caducidad Resultados de laboratorio Institucin que hace la captacin Verificar diariamente los datos y anotar los resultados en la hoja de registro correspondienteProductos debe llevar los siguientes datos: No de registro Grupo sanguneo y Rh Producto Fecha de preparacin Revisar diariamente tomando al azar varios productos y anotando los resultados en la hoja de control correspondiente. Colocacion de los productos verifigar diariamente, que los pro ductos estn en sus respectivos sitios, deben estar agrupados por: Grupo sanguneo y Rh Fecha de caducidad Los productos no liberados por falta de resultados de laboratono deben permanecer aparte hasta su liberacin, en caso de salida de ellos por emergencia, llevarn una nota que diga sin resultados de laboratorio. Diariamente revisarlas fechas de caducidad de los productos y en caso de haber terminado su vigencia apartarlos, para darle elcurso correspondiente de acuerdo a las polticas de la institucin. Control de calidad del equipo, su importancia radica en que su correcto funcionamiento nos permite una adecuada calidad de los productos siempre y cuando se acompae de un buen desarrollo metodolgico y humano.Se consideran tres aspectos:1. El manejo depende del estudio cuidadoso del manual operativo propio de cada aparato, de la correcta informacin del personal que lo utilize y del cuidado que se ponga al llevar a la prctica esta informacin2. La limpieza no solo repercute en la eficacic, sino tambin en la conservacion, si es adecuada, retarda el deterioro de las piezas que lo componen y en consecuencia las descomposturas, la limpieza debe hacerse a diario en forma superficial y semanalmente a fondo3. El mantenimiento se entiende en ocasiones comoreparacin, sin embargo podemos distinguir dos tipos de mantenimiento: Preventivo es la primera opcin a considerar un mantenimiento peridico, conserva al equipo en condiciones de funcionamiento permanente, este tipo de mantenimiento debe darse como mnimo cada seis meses por parte de la fbrica y por etapas semanales, mensuales, etc, por nosotros mismos Correctivo aqu entra la reparacin, es el ltimo recurso a considerar y ser llevado a cabo por el fabricante; al recbir mantenimiento por parte del fabricante, este no debe ser aceptado sin antes verificar que el equipo cumple con el funcionamiento que de l se espera y solo entonces aceptar que el ser vicio recibido es satisfactorioControl de calidad de refrigeradores. Los puntos de temperatura, esto se refiere a la temperatura que se toma diariamente a una hora determinada, su valor es vlido solamente el momento de la toma de temperatura y vuelve a tener validez hasta la siguiente, sin tener control del lapso de tiempo entre una y otra. Su utilidad radica en que podemos verificar el funciqnamiento de los graficadores conectados al refrigerador, dar una idea aproximada del estado de conservacin de los productos y permitir vigilar el funcionamiento del refrigerador mediante grficas desarrolladas con estos puntos, a la vez que prevenir una posible descompostura, se coloca un termmetro certificado dentro de un recipiente de glicerina al 10% y se intro duce al refrigerador, se cierra y se deja 5 minutos al cabo delos cuales se toma la lectura: se anota la lectura en las hojas de registro y se marca en la grfica, la frecuencia del exmen minimo cada 2 horas en todos los turnos. Esto es muy til en los casos en que no se cuenta con refrigerador dotado de graficador, pues al tener el termmetro constantemente dentro del refrigerador y si es posible en cada espacio, nos permite a travs de la puerta si es de cristal, lo que marca el termmetro y registrarlo en la hoja respectiva, in cluso con periodicidad ms frecuente, la temperatura no debe diferir de valor mas menso de 1C, variacin es el seguimiento detallado del cambio de temperatura que sufren nuestros productos en un lapso de tiempo, para su medicin se utiliza un graficador adecuado, de acuerdoa las instrucciones del fabricante y diariamente se observa la grfica, viendo en ella en primer lugar si los productos han estado expuestos a temperaturas que salgan del rango establecido instrumental debe renovarse todos los das.Control de Calidad de Congeladores Su control de calidad es el mismo que para los refrigeradores, la diferencia estriba en que el termmetro utilizado debe ser el adecuado para registrar temperaturas de menos cero grados, debido a que los graficadores tienen un alto costo y en ocasiones no son accesible de ser adquiridos, podemos implementar un mtodo sencillo y a la vez eficaz para ver las variaciones de temperatura que ha sufrico el producto almacenado, esto se basa en que la primera condicin que debe tener el productoes el de estar siempre congelado mientras est almacenado.1. Colocar 1.5 ml de plasma, en tubos de 13 x 100 o 10 x75 y cerrarlos perfectamente.2. Ponerlos en un congelador en posicin vertical hasta congelacin3. Colocar un tubo (de preferencia en cada charola en posicin invertida (de cabeza)4. Observarlos diariamente. Si los productos almacenados han sufrido variacin (es) de temperatura que ocasion su descongelacin (an cuando los encontremos congelados), se ver en los tubos, los cuales presentaran un escurrimiento o descenso del plasma contenido.Control de calidad de termmetrosMaterial: Termometros Bao maria a 37CTcnica:1. Varios termmetros de la misa clase2. Numerarlos y sumergirlos en bao maria por espacio de cinco minutos registrar los resultados3. Se dejan a temperatura ambiente y se registran los resultadosInterpretacin de resultados: El control se har diariamente. El resultado limite ser de mas menos 1C Variaciones mayores a 1C, el termmetro debe desecharseControl Calidad de Rotator.Material: Isopos, rotator, cronmetro,Tcnica:1. Colocar un isopo en una plaza del rotator2. Tomar el tiempo con cronmetro y contar los topes con el dedo3. Registrar el nmero de revoluciones por minuto y marcarlos4. Rotator de una circunferencia de 10 cms.Interpretacin de resultados: Tomar en cuenta el nmero de revoluciones por minuto para cada prueba.Control de calidad de microscopioMaterial: Isopos Agua destilada MicroscopioTcnica:1. Se limpia con un isopo en agua destilada, superficies, lentes y oculares2. La iluminacin se verifica viendo un hexgono encentro de la fuente de luzObservaciones: Mantener en su estuche los microscopios:, cuando no esten en uso El lugar donde se guarden debe ser secoControl de Calidad de Microcentrifuga. Objetivo: obtener el tiempo ptimo de centrifugacin para cada aparato que se mida.Material: Microcentrifuga Capilates Lector de microcentrifuga o regla milimtrica Mechero Sangre con AnticoagulanteTecnica: Mezclar bien una muestra de sangre Llenar seis pares de capilares 3/4 de tubo Centrifugar el primer par por espacio de un minuto, anotando el bematocrito obtenido, colocando el segundo par por espacio de dos minutos y realizar el procedimiento anterior, hace lo mismo con los dems pares, aumentando el tiempo basta seis minutos Registrar los hematocritos obtenidos, record de calibracin, fecba, tiempo ptimo y persona que realiz el control Interpretacin de resultados, el tiempo ptimo de centrifugacin es el valor repetido del bematocrito vrg:1 2 3 4 5 544 43 4240 40 39Control de Calidad de Centrifuga Objetivo: verificar que las revoluciones por minuto que medimos en el aparato sean reales:Material: Centrifuga, Tacmetro 6 tubos de 10 x 75 Albmina Antiglobulina humana Antisueros A, B, AB y Rh Globulos rojos Rh positivos y negativosTecnica:1 Se mide la velocidad con un tacmetro, registrandoen nmero de revoluciones por minuto2 Para obtener el tiempo ptimo de centrifugacin se realiza el siguiente procedimientoMedios:A).-Montar tubos de 10 x 75 agregando los reactivos como se indica en el siguiente cuadro:Medios Anticuerpos Clulas ControlSalino anti A A O o B Albminoso anti D Rh positivasAntiglobulina Coombs SensibilizadasB).-Centrifugar a tiempo y revoluciones variables de 15 a un minuto, y de 1000 a 3500 revolucionesC) Observar los solirenadantes despus de cada centrifugacin anotando la fuerza de aglutinacin, resuspendiendo lentamente el botn de celulas,D).- Observar minuciosamente los controles, que deben ser negativosE).- Observar el tiempo ptimo de centrifugacin para cada medioInterpretacin de resultados: Numerar las centrifugas (con cdigo de inventario) anotando el tiempo y r.p.m. ptimos de centrifugacin para cada aparato.Checado registro de la persona que control.Control de Calidad de la Campana de Extraccion, Lo primero que debe garantizarnos, es que el aire que crcula dentro, est esteril y no contamine los productos preparados en su interior, aunque ya se mencion, la limpieza es fundamental, debe de hacerse la asepsia antes y despus de utilizarla.1 Encender la campana y esperar (de acuerdo al fabricante) el tiempo necesario, generalmente 10 minutos, la campana debe estar tal y como se utiliza durante, el fracci ona miento.2 Introducir dos cajas de Petri, una conteniendo un medio enriquecido para bacterias, gelosa sangre o BHT La otra un medio para desarrollar hongos como Sabburaud, abrir las cajas y esperar 10 minutos antes de cerrarlas, enviarlas a bacteriologia3 Si existe crecimiento en cualquier de los medios es idice de que la campana no debe ser utilizada en fracionamiento por sistemas semicerrados4 La frecuencia para este estudio debe ser mensual como mnimoControl de calidad de espectofotmetroTecnica:1) limpiar los filtros de Didymium2) Prender el aparato 5 minutos antes de su uso3) Colocar la escala en 610 nm4) Observar la fotocelda5) Ajustar el galvanmetro a cero6) Retirar el filtro y ajustar a 100% transmitancia7) colocar el filtro y leer el % de transmitanciaInterpretacin de resultados: El resultado confible es ms o menos de cinco undades Este registro y control se deber realizarse a diario Hay aparatos que tienen su control automatizadoControl de Calidad de los Sueros Hemoclasificadores Objetivo: evidencia las reacciones antigeno-anticuerpo para verificar la conservacin ptima del reactivo. Generalidades: el control de calidad en los antisueros se harn en suspensiones del 2 al 5% de globulos rojos, determinando avidez, especificidad y ttulo; debiendo tener en cuenta las instrucciones que el fabricante proporciona. Avidez es la rapidez de combinacin del anticuerpo con el antgeno. Titulo es la dilucin del antgeno en la ltima aglutinacin observable.Especifidad que el anticuerpo reaccione con el antgeno que le corresponda.Material: 1 gradilla 1 cronmetro 1 placa de vidrio 10 tubos 10 x 75 3 tubos 13 x 100 3 pipetas Pasteur cbulbo Antisueros: A. B. AB y D Sangre: A, B, AB y DTcnica para Avidez:1 Marcar la placa de vidrio con las letras A, B, AB.2 Colocar una gota de solucin de glbulos rojos al 5% de cada grupo donde le corresponda3 Colocar una gota de antisuero con su propio grupo, al mismo tiempo se acciona el cronmetro, ste se detendr cuando se forme la aglutinacin4 Realizar cada grupo por separado5 No se deben diluir los gllos rojos en su propio suero6 Anotar el tiempo de avidez de cada antisuero, visualizando los primeros signos de aglutinacinTecnica para Especificidad: La especificidad se realiza con la tcnica de avidez, pero con el grupo contrario, cuya aglutinacin ser negativa ejemplo: Un antisuero A con clulas B, pero al poner un antisuero A conclula A, aglutina.Tecnica para Titulo de anticuerpo:1 Marcar y montar 10 tubos de ensaye de 10 x 75 con dos gotas de solucin salina en cada tubo2 Al primer tubo agregar dos gotas de antisuero A y mezdar3 Pasar dos gotas al siguiente tubo, mezclar y volver a pasar dos gotas al siguiente y asisucesivamente, teniendo los tubos las diluciones: 2, 4, 8, 16, 32, 6 4, 128, 256, etc.4 Agregar dos gotas de la solucin al 5% de glbulos rojo a a cada tubo, mezclar y observar aglutinacin5 Centrifugar a 2500 r.p.m. por un minuto6 Registrar la dilucin ltima, hasta donde se observ aglutinacin7 Esta misma tcnica se repetir con cada antisueroInterpretacin de resultados:1.- La avidez se reportar en segundos2.- La especificidad con cruces segn la aglutinacin3.- El ttulo se registra mediante la dilucin oliservadaValores normales de avidez, especificidad y ttulo.anti-Alavidez 15aglutinacin 3+Ttulo 256

Anti-A2avidez 30aglutinacin 3+ttulo 128

anti-A1Bavidez 30aglutinacin 3+ttulo 128

anti-A2Bavidez 30aglutinacin 3+ttulo 128

Anti-Bavidez 15aglutinacin 3+ttulo 256

anti-D Rh1avidez 60aglutinacin 2+ttulo 32

Coombs:Clulas sensibilizadas: aglutinacin2+ ttulo 4Control de Calidad en el Lavado de Material de Cristal.Objetivo: Verificar la limpieza y secado de material de uso diarioen el Banco de Sangre.Material: 3 tubos13 x 100 secos 3 tubos10 x 75 recien lavados 1 pipeta de 5 ml 3 pipetas Pasteur c/bulbo 1 placa de vidrio Fenoftaleina al 1%Tecnica:1 El control de clidad se realiza en el primer enjuague2 Agregar una gota de fenoftaleina al 1% sobre las paredes del tubo3 Realizar la misma maniobra en los tubos del segundo enjuage y en los tubos secos.Interpretacin de resultados: Un buen lavado de material no har vire de color Si hay residuos de javn se ver de rosa plido a rosa fuertePor lo tando la limpieza del material, no es el adecuado y se intesificar, del tal manera que todos los tubos no haya vire de color, pues los restos de detergente, puede dar resultados falsamente positivos de cualquier reaccin que se busque en elmaterial.Control de Calidad de Hemoderivados Todos los procesos del control de calidad, van encaminados a obtener productos de buena calidad, esto es que satisfagan las necesidades de las Instituciones que los utilizan y no provoquen riesgos extra a los que cada transfusin por si misma esta sujeta. Cualquier deficiencia en la seleccin del disponente, obtencin, manejo, transporte, fraccionamiento, conservacin y salida de estas sangres se refleja en los productos; el controlde calidad est encaminado a encontrar esas deficiencias.Control de Calidad de Sangre Total Es el punto de partida de nuestro trabajo, es primordial saber en que condiciones la recibimos.Determinacion del volumen extraido Nos referimos a este como volumen neto; esto es la cantidad de sangre extrada a un disponente. Independientemente del problema que podemos ocasionar al disponente, el volmen es irnportante ya que el bajo o nulo, rendiminto de nuestros productos pueden ser ocasionados por un volmen inadecuado.1 Pesar 10 bolsas con anticoagulante de cada uno de los tipos utilizados en la captacin y obtener el promedio de esos pesos, a esto llamamos: Peso de la bolsa.2 Al recibir una unidad pesarla y anotar el resultado, a esto lo llamamos Peso bruto3 Calcular el peso neto o peso de la sangre solamente.4 Peso neto = peso bruto peso de la bolsa5 Conociendo el valor de la densidad de la sangre total =1 058, y de la frmula de la densidad en base a la masa y el volmen, Calcular el volumen: Volumen neto= peso neto entre densida..1 Para bolsas que contienen 75 ml de anticoagulante ACD el volmen neto adecuado es de 500 mas menos 10% (450)2 La frecuencia recomendada es del 1% del total y todas aquellas unidades suceptibles de estar fuera del rango, tendrn que darle destino final.Esterilidad. Para verificar que las bolsas que se encuentran en depsito en el refrigerador, se encuentran esteriles se tendr en cuenta:1 Coloracin muchos grmenes al activar sobre la sangre, la afectan produciendo un cambio de coloracin, lo mas frecuente puede ser; decoloracin, cambio de coloracin a cafe rojizo o color verdoso tanto si este cambio es evidente como si es sugestivo, apartar la unidad y enviarla a control bacteriolgico, antes de desecharla2 Aire: Considerese que las bolsas de sangrado como producto de su fabricacin, contienen aire dentro de ellas y que est estril, en algunas marcas la cntidad es excesiva por lo que su sola presencia en la sangre no es indice de contaminacin.Revisar la presencia de aire en: Tubo colector, este puede observarse totalmente vaco con un llenado intermitente. La bolsa, la cual puede verse con la presencia de burbujas En cualquier caso, apartarla, mantenerla entre 4 y 6C, por tres das, para dar tiempo al crecimiento bacteriano y enviarlas a control bacteriolgico Defectos de la bolsa.-Los defectos tales como bolsas mal selladas, con picaduras, etc. se deben a defectos en la fabricacin o al mal manejo