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MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGA Y MICOLOGA VETERINARIA ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA-UABJO

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Presentacin .. 2

Reglas de laboratorio . 3

practica 1 Tcnicas de esterilizacin en bacteriologa .5

Practica 2 Principales medios de cultivo y su preparacin. 9

Prctica 3 Tcnicas de aislamiento bacteriano.12

Prctica 4 Preparacin de frotis y tinciones .. 20

Prctica 5 Toma y envo de muestras. . .24

Prctica 6 Cocos y bacilos gram positivos aerobios..28

Practica 7 Enterobacterias 31

Prctica 8 Bacilos gram negativos no fermentadores33

Prctica 9 Bacilos gram positivos esporulados35

Prctica 10 Prueba de sensibilidad antimicrobiana. 37

Prctica 11 Observacion y cultivo de hongos dermatofitos40

Bibliografia. 43

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Presentacin: La microbiologa es una ciencia relativamente reciente comparado con otras ciencias; El estudio de los microorganismos se inici a partir de que Antonie van Leeuwenhoek en 1670 invent el microscopio y que partir de estudios de Luis Pasteur en 1876, se logr el desarrollo y reconocimiento de los microorganismos como actores de una gran variedad de procesos. Durante mucho tiempo, estos organismos causaron graves problemas de enfermedades en plantas, animales y humanos; sin embargo tambin se han utilizado en diferentes procesos industriales desde la antigedad como en la produccin de quesos, vino, pan y cerveza. Actualmente se reconoce su importancia en diversas reas de la investigacin bsica, en la industria de alimentos, ambiental y farmacutica. La materia de bacteriologa y micologa se encuentra ubicada en el 3er semestre de la carrera de Medicina Veterinaria y Zootecnia, ubicada dentro de las materias intermedias o mdicas. Este manual est dirigido a fortalecer el conocimiento que adquieras durante la formacin terica como estudiante de Medicina Veterinaria en el rea de bacteriologa. El propsito de este manual es proporcionar una gua general para el trabajo de laboratorio mediante una serie de prcticas que contemplan la forma adecuada de tomar y enviar muestras al laboratorio de bacteriologa que favorezcan al xito de su diagnstico clnico, hasta las tcnicas bsicas y principios generales de diagnstico. Este Manual contiene 10 prcticas, diseadas para que te familiarices gradualmente con los procedimientos de cultivo y observacin de bacterias. En cada prctica se presenta el propsito de la realizacin del ejercicio y una breve introduccin para facilitar la compresin de los mismos, despus se indican los materiales necesarios y procedimientos a realizarse

Competencias profesionales: Al trmino del curso sers competente para: Colectar y conservar muestras de problemas clnicos de animales utilizando los diferentes mtodos de toma de muestra en forma adecuada, a partir de los diferentes procesos patolgicos para enviar al laboratorio de bacteriologa. Aprender que la coordinacin de una adecuada toma y envo de muestra repercute en la integracin del diagnstico clnico. Procesar las muestras recibidas en el laboratorio de diagnstico de bacteriologa para determinar la presencia de bacterias a partir de casos clnicos de diferentes sistemas del animal, adems de determinar cuales podran ser de flora normal y cuales de un proceso patolgico. Identificar los gneros y especies a partir de evaluacin del metabolismo bacteriano por el uso de pruebas bioqumicas. Integrar el diagnstico clnico en base al resultado obtenido en el estudio bacteriolgico. Seleccionar el tratamiento adecuado por el uso de antibiticos cuando hayas evaluado diferentes drogas contra el agente etiolgico causante de la enfermedad. Prevenir la resistencia a los antimicrobianos cuando seleccione adecuadamente la droga que usaras para el tratamiento de los animales enfermos. Apoyar con calidad, en forma tica y responsable la promocin en salud, la prevencin de la enfermedad, diagnstico y

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vigilancia epidemiolgica, contribuyendo as a la solucin de la problemtica de salud a nivel local, regional y nacional. Se recomienda realizar visitas a laboratorios de bacteriologa en otras escuelas o facultades para conocer las metodologas de trabajo, y evitar la endogamia acadmica. Este manual se actualizara de acuerdo a los recursos adquiridos y necesidades propias de la escuela.

Reglas del laboratorio: 1. Durante las sesiones, siempre debers usar una bata de laboratorio bien abotonada, que debers quitarte antes de abandonar el laboratorio.

2. No debers sacar del laboratorio ningn equipo, medios o cultivos microbianos.

3. Evitaras acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la prctica del laboratorio.

4. Colocars todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor.

5. No debers ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.

6. Se prohbe fumar, tocarse la cara con las manos o algn otro objeto.

7. Debers lavar meticulosamente las manos con jabn y agua antes de salir del laboratorio, aun sea por breves periodos.

8. No se permitirn visitar personales que distraigan la atencin y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo que se realiza.

Procedimiento del laboratorio: 1. Antes y despus de cada sesin prctica, debers limpiar las mesas de trabajo con el desinfectante que se te proporcionar para este fin.

2. Cuando utilices mechero, este deber colocarse alejado del microscopio y otros equipos as como de tus cuadernos o prendar de vestir.

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3. Al concluir cada sesin debers asegurarte de que los materiales de desecho u objetos contaminados los hayas colocado en los recipientes especficos para ello.

4. Debers dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados.

5. En caso de producirse un incidente, debers notificar al profesor de inmediato.

6. En el caso de derrame de algn cultivo o rotura de recipientes, debers conservar la calma, notificar al profesor y realizar el siguiente procedimiento: a) Colocar toallas de papel sobre el material derramado para evitar dispersin; b) Poner abundante solucin de desinfeccin sobre el rea contaminada y c) Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptculos destinado para la eliminacin de material contaminado.

Materiales indispensables para cada sesin de laboratorio: 1. Bata de laboratorio limpia y con botones.

2. El protocolo de la prctica.

3. Un pedazo de tela absorbente sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeas.

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PRCTICA No. 1

TCNICAS DE ESTERILIZACIN EN BACTERIOLOGA

INTRODUCCIN Existen diversos mtodos fsicos de esterilizacin y de inhibicin del crecimiento microbiano, como pueden ser el calor, la filtracin y la radiacin, pero el ms ampliamente usado es el calor, ya sea hmedo seco, los cuales tienen diferente penetrabilidad. El calor, de cualquier forma, es utilizado extensamente como un agente letal bacteriano y se puede aplicar a numerosos instrumentos, materiales y substancias, con el propsito de matar a las bacterias que ellos contengan. Este proceso se llama Esterilizacin y al material, cultivo medio de cultivo sometido a ste, se le denomina entonces Estril, es decir, desprovisto de toda forma viviente. Cuando se efecta experimentalmente la esterilizacin de una poblacin microbiana, contenida en un medio de cultivo en todo el material utilizado en bacteriologa es de suma importancia conocer los diversos mtodos de esterilizacin los cuales se dividen en: 1).Mtodos fsicos tales como: calor, rayos ultravioleta, filtracin, etc. 2).Mtodos qumicos, en donde se utilizan substancias bactericidas o bacteriostticos como son alcoholes, fenoles, halgenos, detergentes, entre otros. La eleccin del mtodo de esterilizacin depende del tipo de material a esterilizar, as como la finalidad que se persiga. La esterilizacin por calor es uno de los mtodos ms comnmente utilizados en el laboratorio, es muy til para la cristalera, los medios de cultivo y para la esterilizacin de los medios despus de su utilizacin y este puede ser: a) Calor Hmedo b) Calor Seco c) Calor Directo

a) Calor Hmedo Se utiliza para esterilizar medios de cultivo, la esterilizacin se hace por el vapor a presin en una autoclave (Chamberland) u olla de presin.

b) Calor Seco La esterilizacin se hace por medio de un horno que permite alcanzar temperaturas ms elevadas (150- 180C) que no puede n soportar los medios de cultivo y el material de goma plstico, se utiliza ms para la esterilizacin del material de vidrio (matraces, pipetas, cajas de petri, etc.) y en los instrumentos.

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c) Calor Directo Se utiliza en asas bacteriolgicas y agujas de inoculacin. La esterilizacin se efecta directamente en la flama del mechero.

La esterilizacin adecuada del material es importante para obtener los resultados esperados.

OBJETIVO 1. Conocer y aplicar las tcnicas de esterilizacin utilizadas en bacteriologa, as como comprender la importancia de este proceso.

MATERIALES - Medios de cultivo: SIM, caldo nutritivo, agar sangre, agar nutritivo, etc. - Alcohol fenol - Cajas de petri - Tubos de ensaye - Pipetas - Matraz Erlenmeyer - Asas y aguja de siembra -portacajas petri para esterilizar -Pipeteros para esterilizar.

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- Autoclave u olla de presin - Horno de esterilizacin - Papel estrasa blanco o papel kraft - Algodn plizado y rollo de gasa -cinta testigo

METODOLOGA a) TCNICA DE ESTERILIZACIN DE CALOR HMEDO Se utiliza principalmente la autoclave la olla de presin, es til para medios de cultivo. AUTOCLAVE 1.- Lavar el material de vidrio (matraces) hasta dejarlos perfectamente limpios y libres de sales, para lo cual se lavan y despus se les da un enjuague final con agua destilada. 2.- Colocar el los medios de cultivo ya preparados (de acuerdo a las indicaciones del frasco) en los matraces tubos de ensaye antes de su esterilizacin. 3.- Tapar el material de vidrio ya sea con sus tapaderas o fabricarlas con algodn gasa. 4.- Depositar el material en la cubeta de la autoclave, cuidando de colocar un capuchn de papel aluminio en el cuello del material. 5.- Vaciar el agua destilada en la autoclave hasta donde indica la marca del nivel. 6.- Cerrar la tapa cuidando de apretar los pernos como lo indique el instructor. 7.- Encender y girar el restato (botn) en la posicin alto. 8.- Cuando el agua contenida dentro de la autoclave hierve, el vapor elimina el aire de la autoclave, el escape del vapor por la espitia (que estar abierta) es irregular. Un chorro continuo indica la eliminacin completa del aire, con lo que se procede a cerrar la espitia, la temperatura y la presin suben enseguida. 9.- Cuando se ha obtenido la temperatura deseada de 121C que corresponde a 1 Kg. de presin, girar el botn en la posicin de medio lo cual nos permite conservar la temperatura y la presin deseada por un tiempo determinado de 121C por 15 minutos a 1 Kg. de presin. 10.- Trascurridos los 15 minutos se coloca el restato en la posicin de OFF (apagado), el manmetro indicar un descenso en la presin. 11.- Cuando la presin es nula, se abre la espitia de escape de vapor, penetrando el aire al aparato. Solamente entonces puede abrirse la tapadera y retirar los objetos hmedos ya esterilizados.

b) TCNICA DE ESTERILIZACIN CON CALOR SECO 1.- El material de vidrio debe encontrarse limpio y libre de sales.

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2.- Se procede a tapar el material ya sea con sus tapaderas fabricarlas con algodn gasa. 3.- Envolver en papel y llevarlo al horno (evitando el contacto con las paredes del horno), las extremidades de los objetos que llevan algodn papel deben colocarse hacia arriba. 4.- Encender y controlar la calidad de la flama si el calentamiento es con gas. 5.- Para tubos de vidrio, pipetas (por separado) y cristalera en general, utilizar 170C por espacio de 1 hora. 6.- Transcurrido el tiempo de esterilizacin se apaga el horno y se deja enfriar para sacar el material. NOTA: Los pipeteros requieren de un tiempo de 2 horas.

c) TCNICA DE ESTERILIZACIN CON CALOR DIRECTO Se utiliza para asas bacteriolgicas y agujas de inoculacin. 1.- Estas se deben esterilizar antes y despus de llevar acabo la siembra de cualquier tipo de bacteria. 2.- Poner el asa o aguja directamente en la parte azul de la flama durante algunos segundos. 3.- Cuando el metal se torna de color rojo, se retira y se enfra en las paredes inferiores del recipiente de cultivo.

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PRCTICA No. 2

PRINCIPALES MEDIOS DE CULTIVO Y SU PREPARACIN

INTRODUCCIN El estudio adecuado de las bacterias, exige como requisito previo, poder cultivarlas en condiciones de laboratorio. Para lograr esto, es preciso conocer, los elementos nutritivos para la obtencin de energa que ser empleada para la biosntesis y la reproduccin celular y las condiciones fsicas. Las exigencias nutritivas de las bacterias se han establecido despus de dilatadas investigaciones, cuyos resultados han sido el desarrollo de numerosos medios de cultivo artificiales, estas necesidades nutritivas son muy diversas, debido a ello existen grandes diferencias. Los medios de cultivo ms comunes utilizados son los que estn constituidos con peptonas, extractos de carne o carne parcialmente digerida y extractos de levadura llamados tambin medios bsales. Cuando hay que utilizar medios slidos, se agregan agar a los medios lquidos, como agente coagulante o solidificante. La preparacin de los medios de cultivo, ha sido reemplazada en gran medida por el uso de medios de cultivo deshidratados a los cuales se les agrega agua destilada, tales medios son estables y bien estandarizados con respecto a pH y concentracin de materiales. Segn el propsito para lo que son fabricados los medios de cultivo se pueden clasificar en: a) Medios bsales, bsicos o generales: Son medios simples que contienen en general los nutrientes esenciales para promover el desarrollo de microorganismos poco exigentes nutricionalmente in vitro, ejemplo: agar nutritivo (A.N.), caldo nutritivo (C.N.), agar soya triptosa (T.A.S.), caldo soya tripticasa (T.C.S.) y caldo cerebro corazn (B.H.I.).

b) Medios enriquecidos: Son medios que han sido complementados con otros nutrientes que proporcionan factores de crecimiento y cuya finalidad es promover el desarrollo de microorganismos de requerimiento nutricional ms exigentes, ejemplo: gelosa sangre (G.S.), gelosa chocolate (G.CH.).

c) Medios selectivos o inhibitorios: Cuando una muestra contiene gran cantidad de microorganismos, su crecimiento puede ser excesivo por lo que es necesario suprimir su desarrollo y al mismo tiempo promover y/o seleccionar el crecimiento de los microorganismos de inters que pudieran encontrarse en dicha muestra, ejemplo: agar verde brillante (A.V.B.), agar salmonella shigella (S.S).

d) Medios diferenciales, ejemplo: pruebas bioqumicas.

e) Medios de enriquecimiento utilizados en bacteriologa del tracto intestinal son: caldo selenito, etc.

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f) Medios de transporte, sirve para mantener varios microorganismos por un lapso corto de tiempo, ejemplo: cary-blair, Stuart.

OBJETIVO 1. Conocer y preparar los medios de cultivo ms comunes empleados en bacteriologa

MATERIALES - Agar nutritivo - Caldo nutritivo - E.M.B. - Agar(S-110) - Medio SIM - medio Mc Conkey -agar sangre -Agua destilada - Cajas de Petri esterilizadas - Tubos de ensaye - Matraces Erlenmeyer - Probetas. - Balanza granataria - papel aluminio -Algodn gasa estril - Marcador permanente -cerillos -cinta testigo -papel estrasa - sangre de bovino o borrego estril -bolsa para unidad de sangre 250 ml

METODOLOGA 1.- Preparar 75 ml. o lo que indique su instructor o de agar nutritivo como lo seala el frasco, esterilizar a 121C por 15 min en autocl ave u olla de presin. Vaciar el medio en cajas de petri esterilizadas, dejar solidificar. Marcar las cajas con lpiz graso. 2.- Preparar 70 ml. de agar (S-110) como lo indica el frasco, vaciar en cajas de Petri estriles marcadas. 3.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de E.M.B. segn especificaciones del frasco, esterilizar, dejar enfriar un poco, vaciar en cajas de petri estriles y marcar las cajas. 4.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de medio SIM segn especificaciones del frasco, esterilizar y vaciar en tubos de ensaye.

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5.- Preparar 50 ml. de caldo nutritivo como lo indica el frasco, distribuirlo en tubos de ensaye (3 ml. c/u) esterilizar a 121 C por 15 m inutos. 6.- Preparar la cantidad en mililitros que indique el instructor de medio Agar nutritivo segn especificaciones del frasco, distribuirlo en tubos de ensaye (6 ml cada uno), esterilizar y dejarlos enfriar en superficie inclinada. 7. preparar 75 ml de agar sangre como lo seala el frasco,, esterilizar a 121C, por 15 min en autoclave. Enfriar el medio a 45 0C y agregar el 10% de sangre, y vaciar en cajas de Petri esterilizadas y dejar solidificar.

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PRCTICA No 3

TCNICAS DE AISLAMIENTO BACTERIANO

INTRODUCCIN Una tcnica muy comn en el laboratorio de microbiologa es la transferencia de microbios de un ambiente a otro con el propsito de cultivarlos. Es necesario tomar las debidas precauciones para evitar la contaminacin de los cultivos. Para el estudio e identificacin de microorganismos stos deben aislarse o separarse a partir de un cultivo mixto o de poblaciones que se encuentran en la naturaleza. Existen varias tcnicas para el aislamiento de microorganismos y la obtencin de cultivos puros, dentro de las ms utilizadas se encuentran: a) Siembra por estras en caja de Petri o tubo de ensaye. b) Vaciado en placa donde se obtienen colonias tanto en la superficie como en partes profundas del medio inoculado. c) Cultivo por dilucin y agitacin. d) Aislamiento de bacterias con una varilla angular de vidrio. e) Aislamiento de microbios extrados con un aplicador de algodn. f) Siembra por picadura, etc.

Despus de que una poblacin de microorganismos ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo de ensaye o caja de Petri, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo para que pueda continuar su crecimiento y supervivencia. OBJETIVO 1. Aprender las tcnicas fundamentales empleadas para la transferencia y aislamiento de microorganismos. MATERIALES -Tubos de ensaye con caldo nutritivo -Tubos de ensaye con agar nutritivo (superficie inclinada) - Cajas de Petri con agar EMB -Tubos de ensaye con medio SIM (superficie horizontal) -Cajas de Petri con agar nutritivo -Tubos de ensaye con S-110 -Asa y aguja de inocular -Mechero -Algodn -cinta testigo -Kleen pack -Muestra mixta

Cultivos: -Bacillus subtilis -Escherichia coli -Staphylococcus aureus -Pseudomonas aeruginosa -Proteus vulgaris

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Tcnica asptica: 1.-Limpiar perfectamente la mesa de trabajo con alcohol, flamearla con el mechero. 2.- Lavarse las manos con jabn y despus frotrselas con un algodn con alcohol. 3.-Colocar los tubos y dems material en una posicin adecuada en la que se puedan alcanzar sin dificultad y sin peligro de quemarse. 4.- Trabajar siempre junto al mechero, ya que este proporciona una zona de esterilidad de aproximadamente 20 cm. de radio. 5.- Antes de realizar cualquier siembra, esterilizar el asa o aguja a fuego directo hasta el rojo vivo, enfriar cerca del mechero, sembrar y volver a esterilizar. 6.- Durante la siembra, deben permanecer cerradas las puertas y ventanas y no se debe hablar.

Tcnicas de sembrado. 1.- Inoculacin de medios lquidos: a) Tomar con una mano el tubo que contenga el cultivo y otro con caldo nutritivo estril. b) Con la otra mano, tomar el asa y esterilizarla hasta el rojo vivo. Quitar los tapones de los tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, tener cuidado de no acercarlo demasiado al mechero. c) Flamear los bordes de ambos tubos, introducir el asa al cultivo y tomar una pequea muestra sin rasgar el medio. d) Introducir el inculo dentro del tubo con el caldo y agitar el asa. e) Retirar el asa, flamear nuevamente los bordes de los tubos y colocar los tapones. f) Esterilizar el asa. g) Etiquetar el tubo inoculado (medio de cultivo empleado, microorganismo inoculado, nmero de equipo, seccin y fecha) h) Guardar a temperatura ambiente.

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Mtodo correcto de la inoculacin con el asa en medio lquido.

2.-Inoculacin en medio inclinado a) Tomar un tubo que contenga el cultivo y otro con el medio inclinado.

b) Sujetar los tubos, remover los tapones y realizar los pasos aspticos como se explic anteriormente.

c) Esterilizar el asa y tomar un inculo del medio de cultivo.

d) Introducir el asa hasta el fondo del tubo y deslizarla a manera de estras sobre la superficie del medio hasta el extremo externo, sin repetir la operacin.

e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.

f) Esterilizar el asa.

g) Etiquetar el tubo inoculado.

h) Incubar.

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Siembra en medio slido inclinado

3. Cultivo por picadura: a) Tomar el tubo que contenga el cultivo y otro con medio de cultivo SIM.

b) Realizar los pasos de flameado y remocin de tapones.

c) Esterilizar la aguja y tomar una muestra de cultivo

d) Introducir la aguja en el medio sin llegar al fondo del tubo, sacarla por el mismo trayecto de la entrada sin repetir la operacin.

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e) Flamear los bordes de los tubos y taparlos.

f) Esterilizar la aguja. g) Etiquetar el tubo. h) Incubar.

4. Siembra por estras en caja de Petri Aislamiento primario de bacterias: Todo el proceso se realizar en zona estril, junto al mechero y abriendo la caja slo que sea necesario. Los pasos son los siguientes: a) Esterilizar el asa de siembra y tomar una asada de la muestra mixta.

b) Tomar la caja de Petri, reposarla sobre la palma de la mano, abrir la tapa con el pulgar y el dedo medio.

c) Colocar el inculo en el borde del agar y hacer una estra inicial sin despegar el asa, presionando, pero sin perforar el agar, hasta cubrir aproximadamente una cuarta parte de la caja como se indica en la figura 12.

d) Bajar la tapa de la caja y esterilizar el asa.

e) Girar la caja de petri un cuarto de vuelta, levantar la tapa, enfriar el asa tocando la superficie de agar, lejos de la estra recin hecha.

f) Tocar una vez ms la superficie de la estra recin hecha con el asa y hacer un segundo grupo de estras. Tener cuidado de no cruzar ninguna de las estras originales.

g) Tapar la caja y repetir los paso d, e y f

h) Sellar la caja con kleen pack

i) Marcar con lpiz graso la caja (medio de cultivo utilizado, muestra empleada, No. de equipo, seccin y fecha)

j) Incubar la caja de manera invertida. Si se trata de un cultivo puro, se puede sembrar por estras en un tubo de ensaye con superficie inclinada o bien en una caja de petri realizando nicamente una estra en toda la superficie.

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Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa. Para obtener un cultivo axnico: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero, (b) introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas. (e) Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa.

Algunos de los diseos que se pueden dibujar sobre el agar al inocular una caja de petri

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Caractersticas de los cultivos de bacterias

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5.- Aislamiento de microbios extrados con un aplicador de algodn a) Introducir el aplicador de algodn a un cultivo mixto.

b) Trazar con el algodn unas lneas inoculando una pequea zona en el borde de una caja de Petri con agar nutritivo.

c) Cubrir la caja, sumergir el aplicador en solucin desinfectante, para posteriormente esterilizarlo.

d) Esterilizar el asa y pasarla al sector inoculado con el algodn, realizando estras por cuadrantes.

e) Esterilizar el asa, invertir la caja e incubar.

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PRCTICA No. 4

PREPARACIN DE FROTIS Y TINCIONES

INTRODUCCIN Dado que por lo general las bacterias no tienen pigmentos y son incoloras en estado natural en su forma real. Algunos investigadores como Robert Koch, Paul Erlich y otros vencieron esta dificultad usando mtodos de fijacin (preparacin de frotis) y tincin de bacterias ya que es necesario teirlas para poder observar su morfologa as como tambin poner de manifiesto algunas caractersticas de su estructura. Los mtodos de tincin pueden ser simples o diferenciales. a) Tinciones Simples: son aquellas en las que solo se utiliza un colorante ya que muchas bacterias tienen material cido (RNA o DNA) distribuido en su clula, por lo que se colorea intensamente con colorantes bsicos estos son colorantes nucleares ejemplo: fucsina bsica, cristal violeta, azul de metileno entre otras.

b) Las tinciones diferenciales son aquellas en las que se utilizan dos o ms colorantes que ponen de manifiesto alguna(s) estructura (s) o un tipo de clulas se tien de un color y el resto de otro.

El mtodo de tincin ms utilizado es el de la tincin del Gram., ya que es la coloracin ms importante para bacterias fue ideada por Hans Cristian Gram en 1884, permiti distinguir entre varias especies de bacterias que pueden presentar morfologa colonial similar. Cuando las bacterias retienen la combinacin cristal violeta-iodo y se tie de violeta, son bacterias gram (+), las bacterias que se tian de rojo por la safranina son gram negativas. Las clulas bacterianas gram (+) se les adhiere el cristal violeta, porque hay disminucin de la permeabilidad de la pared celular causada por el efecto deshidratante del alcohol, mientras que las gram (-) el complejo sale por el aumento de la permeabilidad causada por la solubilidad de los lpidos de la pared celular al alcohol. Existen tambin bacterias gram variables (Nisseria spp) y bacterias gram no reactivas (Mycobacterium spp) otros ejemplos de tinciones diferenciales son: la tincin cido-alcohol-resistente (utilizada para diferenciar bacterias del gnero Mycobacterium de otros tipos) y la tincin de endosporas.

OBJETIVOS 1. Aprender a realizar frotis y preparaciones fijas de bacterias. 2. Conocer los mtodos de tinciones, aprender a realizar la tcnica de tincin simple usada en bacteriologa.

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3. Conocer y distinguir que es tincin diferencial as como aplicar la tcnica de Tincin de Gram.

MATERIALES - Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis - Azul de metileno - Cristal violeta 0.1% en solucin acuosa - Yodo lugol - Alcohol-cetona (1:1) - Safranina - Aplicador estril (s el instructor lo cree necesario). - Agua destilada - Aceite de inmersin - Papel seda - Asa bacteriolgica - Marcador permanente - Alcohol y algodn para limpiar su mesa - Goteros y micro pipeta - Mecheros - Portaobjetos - Microscopio compuesto - solucion de cloro(desinfectante) KOH al 3%

a) Preparacin de Frotis y Fijado 1. - limpiar con alcohol el portaobjetos donde se realizar el frotis, dejarlo secar, una vez seco pasarlo por el mechero 2 o 3 veces. 2.- Cuando este fri, marcar la cara donde se har el frotis. 3.- Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo 4.-. Tomar el cultivo del que se har el frotis y flamear la boca de este. Tomar la porcin de la muestra que se va a examinar por medio de un asa o escobilln. 5.- Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado ***Si la muestra se encuentra en un medio lquido, basta con colocar una pequea gota con el asa estril sobre el portaobjetos. ***Si la muestra est en un medio slido, colocar una gotita de solucin salina o agua destilada estril sobre el portaobjetos y con el asa estril se transfiere una pequea muestra de bacterias en la gotita. 6.- Trazar con la muestra una espiral del centro a la periferia. Extienda con el asa la gotita para obtener un frotis delgado y uniforme. Secar al aire. 7.- Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.

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8.- Dejar secar el frotis cerca del mechero encendido durante 10 min o hasta que seque completamente. 9.- Fijar el frotis con calor suave sobre la flama del mechero, pasndolo tres veces a travs de la llama con la muestra hacia arriba, de tal forma que pueda tolerarlo sobre el dorso de la mano.

b) Tincin Simple 1.- Cubra el frotis (B. subtilis) con la solucin de azul de metileno durante 2 minutos.

a) Lave el portaobjetos, con una corriente suave de agua, de manera que el agua no incida directamente sobre la preparacin hasta que ya no escurra colorante. b) Deje secar el frotis al aire. c) Observar al microscopio con el objetivo de 100X.

A) Tincin de Gram. Consta de cuatro reactivos diferentes: el cristal violeta es el primer colorante o colorante primario que imparte color a todos los microorganismos del frotis. Enseguida se utiliza una solucin del yodo (lugol), la que acta como mordente (que aumenta o refuerza la unin, entre un colorante y un sustrato ), el tercer reactivo es un decolorante que disuelve y arrastra el colorante primario, los organismos que resisten la decoloracin y conserva una tonalidad azul son Gram (7), el cuarto reactivo es el colorante de contraste la safranina que se aplica como contra tincin ya que los organismos se destieron con el decolorante, ahora toman el color rojo de la safranina denominndose gram (-).

PASOS A SEGUIR EN LA TCNICA DE GRAM 1.- Preparar los frotis como en la tcnica de tinciones simples. Y preparacin de frotis y fijado. 2.- Preparar los frotis con cultivos de S. epidermis, E. coli. 3.- Cubrir los frotis con cristal violeta durante un minuto. 4.- Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua. 5.- Cubrir los frotis con yodo lugol durante 1 minuto. 6.- Lavar como se indic en el paso (4). 7.- Decolorar con alcohol-acetona hasta que no escurra lquido azul. 8.- Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4). 9.- Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto. 10.- Lavar como en el paso (4).

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11.- Observar al microscopio a inmersin. OB (100 X). Ver figura Tincin Gram

Al finalizar el proceso de Tincin de Gram, las bacterias gram-positivas se tien de color prpura-violeta y las bacterias gram-negativas se tien de color rojizo-rosado

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PRACTICA No 5

Toma y envo de muestras

Introduccin: La bacteriologa y micologa diagnstica es el estudio de las muestras tomadas a partir de pacientes de los cuales se sospecha de una infeccin que involucre a estos agentes. El laboratorio puede apoyar al clnico de la siguiente manera: Confirmando el diagnstico presuntivo, sugiriendo la quimioterapia de la enfermedad y colaborando en el conocimiento epidemiolgico de la enfermedad. Los resultados y rapidez del anlisis bacteriolgico, no solo dependen de los mtodos del laboratorio; en gran medida dependen de la forma de coleccin, conservacin y envo de la muestra. Los resultados pueden ser influenciados por la presencia de microorganismos que son parte de la flora normal, por la migracin bacteriana pos-mortem o por la aplicacin de antimicrobianos antes del envo de la muestra. El MVZ clnico, debe de considerar estos factores para interpretar los resultados emitidos por el laboratorio.

Los problemas ms frecuentes para la identificacin bacteriana y micolgica son: 1. Falta de una historia clnica completa y de un diagnstico presuntivo.

2. Envo de muestras no representativas de la lesin.

3. Toma de muestra en condiciones no aspticas.

4. Muestras inadecuadas como sangre hemolizada, suero turbio contaminado, orina de mas de 4 horas de haber sido tomada, hisopos son medio de transporte, muestras no refrigeradas, etc.

Propsito especfico de la prctica: Con el desarrollo de esta prctica obtendrs la capacidad para colectar, conservar y enviar muestras clnicas al laboratorio para el aislamiento e identificacin de bacterias y hongos.

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Desarrollo de la prctica: 1. Recopilars los datos mas importantes para realizar la historia clnica.

2. Tomars muestras de exudado, leche sangre, heces, orina, rganos y pelo de animales que presenten problemas clnicos.

3. Rotulars la muestra tomada con marcador indeleble.

4. Conservars y llevars las muestras al laboratorio de bacteriolgico para su anlisis.

Para el desarrollo de la prctica es necesario que siempre uses material y equipo para salvaguardar tu seguridad sanitaria, por lo que no debes de olvidad usar overol, botas y guantes cada vez que trabajes con animales. Para tener una adecuada forma de tomar la muestra se debe apegas a ciertas normas como: 1. Tomar la muestra del sitio anatmico ms representativo del problema, de preferencia en la etapa aguada de la enfermedad.

2. Las muestras obtenidas a partir de animales muertos debern de tomarse dentro de las primeras tres horas de ocurrida la muerte o el sacrificio.

3. Las muestras deben colectarse bajo estrictas condiciones de antisepsia, como limpiar la piel con alcohol al 70% y aplicar yodo al 1% por 1 minuto.

4. El material de coleccin y el recipiente donde se trasportar la muestra debe ser estril.

5. Las muestras colectadas no deben de estar en contacto con desinfectantes.

6. Las muestras deben estar identificadas con los siguientes datos: especie, raza, edad, sexo, arete o nombre del animal; direccin, telfono y nombre del propietario del animal.

7. Una vez colectadas la muestras deben de enviarse dentro de las siguientes 4 24 horas al laboratorio en condiciones de refrigeracin (4C); esto se logra usando hielo o refrigerantes en cajas de poliuretano.

8. En el caso de uso de hisopos para la toma demuestras de exudados, debern de enviarse en medio de transporte como el Stuart, Carry-Blair, etc. Que contienen componentes como pptidos, azcares, aminocidos, etc. Que permiten perseverar las bacterias pero evitando su multiplicacin.

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9. Debe de anexarse una historia clnica pertinente que incluya el nmero de animales afectados, si la muestra proviene de un animal tratado con antimicrobianos, cuales y durante cuanto tiempo y un diagnstico presuntivo con base a signos clnicos y epidemiolgicos.

10. Es importante hacer notar que el manejo de las muestras clnicas deben de realizarse con precaucin debido a que algunos agentes involucrados en las enfermedades infecciosas de animales constituyen un riesgo de zoonosis para la salud del clnico y del bacterilogo. NOTA: Si no se toman en consideracin estas normas, el laboratorio podr rechazar la muestra para el anlisis bacteriolgico y micolgico. Si continuas con estas recomendaciones, al trmino de la sesin de prcticas sers competente para tomar muestras de procesos patolgicos de casos clnicos de diferentes sistemas del animal, adems de conocer el manejo adecuado al remitir la muestra al laboratorio. Con las habilidades adquiridas en esta sesin, estars capacitado para tener un apoyo en tu diagnstico de campo. Aprenders que la coordinacin de una adecuada toma de muestra repercute en la integracin de tu diagnstico clnico.

Recursos: Material necesario

Torundas del algodn al 70%

Torundas de Yodo al 2%

Un tubo de medio de transporte por equipo

Un hisopo estril por equipo

Dos frascos estriles por equipo

reactivo de california

*Overol y botas

*Un guante de palpacin por persona

* Guante quirrgico *

Tres tubos de vacutainer (tapn morado) por persona *Tres bolsas de plstico pequeas por equipo

*Un sobre de papel nuevo y pinzas por equipo.

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*Un lazo de media pulgada y 5 m por equipo. *

Una hielera con refrigerantes por equipo

. NOTA: * Este material debe ser trado por el alumno.

La prctica se realizar en los ranchos y comunidades circundantes a la escuela.

Recursos:

Material necesario

1. Muestra trada por el estudiante

2. Agar sangre

3. Agar Mac Conkey

4. Agar de Tripticasa Soya

5. Asa microbiolgica

6. Reactivos para tincin de Gram

7. Porta objetos 8. Mechero

9. estufa bacteriolgica

El desarrollo de la prctica ser impartido por personal capacitado en el rea

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PRACTICA No 6

Cocos y bacilos Gram positivos aerobios

Introduccin: En la microbiologa el examen microscpico es generalmente el primer paso que se da para la identificacin de un organismo desconocido; pero el tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resulta difcil ver con el microscopio ptico, principalmente por la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, por lo que se procede a hacer tinciones especiales para su observacin como la de Gram. Muchos de los gneros de cocos y bacilos Gram positivos estn involucrados en diferentes procesos pigenos en animales y el hombre. Dentro de los cocos Gram positivos que de inters veterinario estn los Staphylococcus y Streptococcus. El gnero Staphylococcus comprende microorganismos que estn presentes en la mucosa y en la piel de los animales. Los especies que se asocian con ms frecuencia a las enfermedades son Staphylococcus aureus, S.epidermidis, S. saprophticus, S. capitis y S. haemolyticus. Los estafilococos crecen fcilmente sobre casi todos los medios bacteriolgicos, en condiciones aerbicas se da el mejor crecimiento. Su mayor velocidad de crecimiento es a 5 - 25 C. Adems, producen catalasa, lo que los diferencia de los estreptococos. El gnero Streptococcus pertenece a este grupo de los cocos Gram positivos; Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada divisin celular ocurre a lo largo de un eje. Los Streptococci son oxidasa y catalasa negativo. Las especies de estreptococus que producen enfermedades en animales son: Streptococcus pyogenes, S. agalactiae, S. pneumoniae, S. zooepidemicus, S. equisimilis, S. equi, S. faecalis, S. dysgalactiae, S. uberis. Dentro de los bacilos pigenos podemos mencionar al gnero Corynebacterium; es inmvil, anaerobio facultativos, catalasa positiva. Las corinebacterias estn ampliamente distribuidas en la naturaleza encontrndose en el suelo, el agua, productos alimenticios y tambin en la mucosa y piel de animales y del hombre. Entre las especies de importancia veterinaria podemos citar a C. pyogenes, C. renale, C. pseudotuberculosis, C. pillosum, C. suis, C. equi.

Propsito especfico de la prctica: Conocers las caractersticas morfolgicas de cultivo y bioqumicas mas relevantes de los gneros Staphylococcus spp, Streptococcus spp y Corynebacterium spp, asociados a los diferentes procesos patolgicos en los animales domsticos. Comprenders que las pruebas bioqumicas dan evidencias de la actividad metablica que puedes monitorear en forma indirecta.

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Desarrollo de la prctica:

1. Describe la morfologa de las colonias de Staphylococcus spp., Streptococcus spp. y Corynebacterium spp.

2. Observa la produccin de hemolisinas en agar sangre de las bacterias mencionadas.

3. Realice la tincin de Gram con las 3 especies bacterianas

4. . Compruebe la morfologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana.

5. Realice la prueba de catalasa,oxidasa, O-F, tinsion acido alcohol resistente, con los medios de cultivo proporcionados y anote el resultado.

6. Realice pruebas bioqumicas sembrando medios de urea, citrato, SIM, lactosa, maltosa, manitol, glucosa, MR-VP e incube 24 horas a 37C.

7. Concluya la identificacin en base a tablas de identificacin.

pruebas bioqumicas complementarias: coagulasa, fermentacin del manitol, prueba de la desoxirribonucleasa, prueba de bacitracina, hidrlisis de hipurato de sodio, tolerancia al cloruro de sodio, reaccin bilis-esculina, prueba PYR, prueba de CAMP, reduccin de nitrato, hidrlisis de gelatina, fermentacin de carbohidratos, azucares: glucosa, lactosa,sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa, ramnosa, xilosa, trehalosa, celobiosa, galactosa, inulina, fructuosa, melibiosa, maltosa.

Al terminar sers competente para determinar la presencia de bacterias a partir de muestras tomadas de procesos pigenos, neumnicos y de mastitis de casos clnicos de diferentes especies animales. Tendrs la capacidad de identificar los gneros y especies a partir de evaluacin del metabolismo bacteriano por el uso de pruebas bioqumicas. Aprenders a integrar el diagnstico clnico en base a una remisin de muestra al laboratorio diagnstico.

Material necesario

los aislamientos se realizaran a partir de las muestras obtenidas de casos clnicos de vacas con mastitis suclinicas y clnicas, abcesos, heridas infectadas, y rganos con abcesos.

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1. Cultivo en agar sangre con Staphylococcus spp., Streptococcus spp. y Corynebacterium spp.

2. Reactivos para tincin de Gram

3. Mechero

4. Cubreobjetos 5. microscopios pticos

6. juegos de pruebas bioqumicas de urea, citrato, SIM, lactosa, maltosa, manitol, glucosa, MR-VP , catalasa, O-F, acido a partir de Glucosa, oxidasa.

. El desarrollo de la prctica ser impartido por personal capacitado en el rea.

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PRCTICA NO 7 ENTEROBACTERIAS

Introduccin: Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram negativas que contiene ms de 30 gneros y ms de 100 especies que pueden tener morfologa de bacilos. Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota del intestino (llamados coliformes) y de otros rganos de otras especies animales. Algunas especies pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuticos. Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes, incluido el cloro. No son exigentes, son de fcil cultivo, son oxidasa negativo, es decir, carecen de la enzima citocromo oxidasa. Son capaces de reducir nitrato en nitrito. Son anaerbicos facultativos. Son fermentadores de carbohidratos en condiciones anaerbicas con o sin la produccin de gas (en especial glucosa y lactosa) y oxidadores de una amplia gama de substratos en condiciones aerbicas. Muchos gneros tienen un flagelo que sirve para desplazarse, aunque algunos gneros no son mviles. Entre las especies de importancia veterinaria podemos mencionar a Escherichia spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., Serratia spp., Salmonella spp., Proteus spp. Propsito especfico de la prctica: Conocers las caractersticas morfolgicas de cultivo y bioqumicas ms relevantes de las enterobacterias de mayor importancia en Medicina Veterinaria.

Propsito especfico de la prctica: Conocers las caractersticas morfolgicas de cultivo y bioqumicas ms relevantes de las enterobacterias de mayor importancia en Medicina Veterinaria.

Desarrollo de la prctica:

1. Observa las placas de agar Mac Conkey, describe la morfologa de colonias y determina si son fermentadoras o no de la lactosa.

2. Realiza frotis fijos con los cultivos, telos con Gram. 3. Observa la morfologa, afinidad tintorial y agrupacin.

4. Realice la prueba de oxidada para cada uno de los cultivos.

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5. Siembre las pruebas bioqumicas de TSI, urea, citrato, SIM con el cultivo que te indique tu instructor. , RM-VP, LIA, MIO, CM, CS, CALDO ARGININA, CALDO PEPTONADO,

6. Incube a 37C durante 24 horas.

7. Haga la lectura de las pruebas bioqumicas.

8. Concluya la identificacin en base a las tablas que te proporcionara el instructor.

Al terminar la sesin sers competente para identificar la presencia de bacterias a partir de muestras tomadas de procesos diarreicos de casos clnicos de diferentes especies animales. Tendrs la capacidad de identificar los gneros y especies a partir de evaluacin del metabolismo bacteriano por el uso de pruebas bioqumicas. Aprenders a integrar el diagnstico clnico en base a una remisin de muestra al laboratorio diagnstico.

Recursos: Material necesario

1. Caja de agar Mac Conkey con cultivo de Proteus y E. coli 2. Porta objetos 3. Mechero

4. Reactivos

5. juegos de pruebas bioqumicas que incluya TSI, urea, citrato, SIM con el cultivo que te indique tu instructor.

6. Reactivo para prueba de oxidasa.

El desarrollo de la prctica ser impartido por personal capacitado en el rea.

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PRACTICA No 8

Bacilos Gram negativos no fermentadores

Introduccin: Las bacterias no fermentadores estn asociados principalmente a procesos respiratorios. Este grupo de bacterias son principalmente Gram negativas, oxidasa positiva, aerobios o anaerobios facultativos. Dentro de las bacterias de este grupo estn los gneros Pasteurella spp, Manhemia spp, Haemophilus spp, Actinobacillus spp y Bordetella spp. Este grupo penden estar como comensales de infecciones en animales. Para su crecimiento requieren de medios enriquecidos con sangre, suero; el caso especfico de Haemophilus spp, requiere el factor X (hemina) o factor V (nicotinamida adenin dinucletido NAD) o ambos para su crecimiento. Las colonias se hacen visibles entre las 24 y 48 horas, crecidas a 37C.

Propsito especfico de la prctica: Conocers las caractersticas morfolgicas de cultivo y bioqumicas ms relevantes de los gneros Pasteurella spp, Manhemia spp, Haemophilus spp, Actinobacillus spp y Bordetella spp. Con este conocimiento asociars el hbitat con el metabolismo bioqumico de las bacterias y su relacin en la patogenia de la enfermedad.

Desarrollo de la prctica:

1. Con los cultivos de Pasteurella que se te proporcionarn, realiza un frotis y telo con Gram.

2. Observa la morfologa y afinidad tintorial.

3. Realice la prueba de oxidasa con los cultivos.

4. Observa la hemolisis de Pasteurella en las cajas de petri de agar sangre. 5. Inocule los medios TSI y SIM con las colonias bacterianas.

6. Incube la prueba bioqumica por 24 horas a 37C

7. Concluya la identificacin del microorganismo utilizando las tablas de pruebas bioqumicas.

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Al trmino de la sesin sers capaz de identificar la presencia de bacterias a partir de muestras tomadas de infecciones del sistema respiratorio de casos clnicos de diferentes especies animales. Tendrs la capacidad de identificar los gneros y especies a partir de evaluacin del metabolismo bacteriano por el uso de pruebas bioqumicas. Aprenders a integrar el diagnstico clnico en base a una remisin de muestra al laboratorio diagnstico

Material necesario

1. Cultivo de Pasteurella spp en agar sangre

2. Reactivos para tincin de Gram

3. Juego de pruebas bioqumicas para inocular: TSI y SIM

El desarrollo de la prctica ser impartido por personal capacitado en el rea.

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PRACTICA No. 9

Bacilos Gram positivos esporulados

Introduccin: Dentro de los miles de gneros bacterianos, solo existen dos capaces de inducir la formacin de esporas; el Clortridium y el Bacillus. Las esporas son estructuras densas en las que se transforman las bacterias para resistir el calor o la desecacin, y son muy resistentes a la accin de desinfectantes. Cuando las condiciones vuelven a ser favorables, las esporas germinan y dan lugar de nuevo a la bacteria en forma vegetativa. El descubrimiento de que existen esporas bacterianas, fue de gran importancia para la microbiologa. El saber que existen tales formas notablemente termo resistente fue esencial para el desarrollo de mtodos adecuados de esterilizacin. Una espora es capaz de permanecer en latencia por muchos aos, pero puede convertirse de nuevo en una clula vegetativa en cuestin de minutos. Clostridium es un gnero de bacterias anaerobias, bacilos Gram positivas, parsitas y saprfitas algunas de ellas; son mviles, en general por intermedio de flagelos pertricos. En animales pueden estar involucradas en procesos nerviosos como el ttanos y el botulismo y el sistema musculo esqueltico como las miositis clostidianas. El gnero Bacillus, son aerobios estrictos o anaerobios facultativos y estn involucrados en procesos de intoxicacin alimentaria, sin embargo hay algunas de gran inters veterinario como la inductora del ntrax.

Propsito especfico de la prctica: Conocers las caractersticas morfolgicas de cultivo y bioqumicas ms relevantes de los gneros Bacillus spp y Clostridium spp. Conocers las formas que adquieren las esporas en estos gneros bacterianos. Asociars la produccin de esporas con la patogenia de las enfermedades inducidas por estos gneros bacterianos

Desarrollo de la prctica:

1. Observe el desarrollo de las colonias en agar sangre del Bacillus spp.

2. Realice dos frotis; tia uno con Gram y el otro con Scheaffer y Fulton

3. Observe la formacin de esporas

4. Resiembra la colonia en agar sangre e incbalo en aerobiosis.

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5. Incube a 37C por 24 horas

6. Siembre una prueba bioqumica para determinar la especie de la bacteria (Diagrama 2).

Al trmino de la prctica sers competente para identificar los gneros de bacterias que son capaces de formar esporas; tendrs la capacidad de identificar esas esporas cuando adquieras la habilidad de observar esa estructura en el microscopio diferente de una clula bacteriana. Tendrs la capacidad de identificar los gneros y especies cuando hagas evaluaciones del metabolismo bacteriano por el uso de pruebas bioqumicas. Aprenders a integrar el diagnstico clnico en base a una remisin de muestra al laboratorio diagnstico.

Material necesario

1. Agar sangre

2. Reactivos de Gram

3. Reativos de Scheaffer y Fulton

4. Cultivo de Bacillus spp.

5. Asa microbiolgica

6. Porta objetos 7. Microscopio

8. aceite de inmersin

9. mecheros de bunsen

El desarrollo de la prctica ser impartido por personal capacitado en el rea

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Practica No 10

Prueba de sensibilidad a agentes antimicrobianos

Introduccin: Se piensa que los quimioterapeticos actan de forma similar en las infecciones; sin embargo, existe diversidad tanto en los grupos de antibiticos y sus mecanismos de accin, como los microorganismos causantes de infeccin y su susceptibilidad a aquellos, as como tambin debe considerarse al individuo afectado y su estado inmunitario, el sitio de infeccin, la cronicidad y la sensibilidad a la droga. El uso indiscriminado de los antimicrobianos a originado la seleccin de cepas bacterianas multiresistentes, por lo que es difcil predecir la susceptibilidad con base en la sola experiencia clnica. La susceptibilidad de microorganismos in vitro a los antimicrobianos puede medirse en el laboratorio. Las pruebas de susceptibilidad bacteriana por el mtodo de difusin en agar son pruebas cualitativas en las que se utilizan discos de papel filtro impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes quimioterapeticos. Estos discos se colocan sobre la superficie de cajas de agar previamente inoculados con la cepa problema. Despus de la incubacin se observan halos de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor de los discos con quimioterapeticos a los cuales el microorganismo es susceptible. Por el contrario, si la bacteria es resistente hay crecimiento alrededor del disco. En Medicina Veterinaria no existen mtodos similares estandarizados para cada una de las especies animales por lo que la aplicacin de los estndares establecidos por Bauer et al., debe interpretarse con cautela.

Propsito especfico de la prctica: Conocers la susceptibilidad de las bacterias a quimioteraputicos segn el mtodo de Bauer y cols. Comprenders por que es necesario auxiliarse con mtodos de laboratorio para dar un tratamiento con antibiticos para evitar la induccin de cepas drogoresistentes, adems de tener un tratamiento ms certero en infecciones inducidas por bacterias.

Desarrollo de la prctica:

1. Usars el mtodo de Bauer y et al. Desarrllalo siguiendo los siguientes pasos

2. Estandarice el inoculo agregando unas gotas del cultivo de 1 ml de E. coli al tubo de SSF, hasta alcanzar una turbidez igual a la del tubo de 0.5 de Mc Farland.

3. Compara la turbidez de ambos tubos auxilindose con la tarjeta que te fue proporcionada para este fin. Esta turbidez corresponde aproximadamente a 5x107 a 5x109 unidad formadoras de colonias (UFC) por ml en el caso de E. coli, o en su caso que se tenga una absorbancia de 0.1.

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4. Inocula la caja de agar MH con la suspensin estandarizada de E. coli antes de 15 min. para evitar cambios en las cuentas bacterianas.

5. Para la siembra introduce el hisopo en el inoculo, exprima el exceso de lquido en las paredes del tubo y simbralo con estra cerrada sobre toda la superficie del agar.

6. Seca la superficie del agar dejando la caja semitapada junto al mechero durante 3 o 5 min.

7. Flamea las pinzas con el alcohol y con ellas coloque los sensidiscos sobre la superficie del agar, asegurndose que queden perfectamente adheridos. Los sensidiscos no deben quedar a menos de 15 mm. De la orilla del agar y deben estar suficientemente separados entre si para evitar que las zonas de inhibicin se mezclen, interpretando mal su lectura.

8. Incuba las cajas a 37c por 24 hrs. 9. Determina el patrn de sensibilidad y resistencia de la cepa de E. coli midiendo los halos de inhibicin alrededor de los sensidiscos y comparando los mm con los que aparecen en las tablas de referencia proporcionados.

10. Los antimicrobianos a pobrar son: ampicilina (10 microg), cloranfenicol (30 microg), gentamicina (10 microg), penicilina (10 U), tetraciclina (30 microg), kanamicina (30 microg). Al finalizar la sesin sers competente para seleccionar el tratamiento adecuado por el uso de antibiticos cuando hayas evaluado diferentes drogas contra el agente etiolgico causante de la enfermedad. Tendrs la capacidad de prevenir la drogo resistencia cuando selecciones adecuadamente la droga que usaras para el tratamiento de los animales enfermos.

Material necesario

1. Un cultivo de E. Coli en caldo nutritivo 2ml.

2. Estndar de turbidez 0.5 de Mc Farland.

3. Tarjeta para comparacin de turbidez 4. Discos de papel filtro impregnados con quimioteraputicos (sensidiscos) 5. Pinzas

6. Tablas de referencia para leer resultados de susceptibilidad a quimioteraputicos.

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7. Agar Meller Hinton (MH) 8. Cuatro hisopos estriles.

9. Un tubo con 2.5 ml de solucin salina fisiolgica (SSF) 10. caldo de infusin cerebro corazn

11. una caja de agar Muller Hinton (MH) 12. una pipeta Pasteur.

El desarrollo de la prctica ser impartido por personal capacitado en el rea

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Bibliografa:

Balows, A. et al., Manual of Clinical Microbiology. 1991. 5 th, ed ASM Washington D.C.

Carter, G.R., Diagnostic procedures in Veterinary Bacteriology and Mycology. 1978. 4 th, ed Charles C. Thomas Publishers. USA.

Scanlan Ch. M. Introduccin a la bacteriologa veterinaria. 1991. Ed Ediciones Acribia, S.A. Espaa.

Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA. 1987. Microbiologa Mdica. Ed. Manual Moderno. Mxico DF.

Koneman EW, Allen SD, Dowell VR, Janda MW, Sommers HM, Winn JT. 1992. Diagnstico Microbiolgico. Ed. Panamericana. Argentina.

Baron E, Fineguid S. 1990. Diagnostic Microbiology. Ed. Mosby Compan

Mc Faddin. jean. f. 1993. pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica. edit panamericana.

M en C GIL CRUZ MARTINEZ