manual de biologia celular.pdf

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE BAJA CALIFORNIA FACULTAD DE CIENCIAS

Biologa Celular y Molecular MANUAL DE PRCTICAS

BIOLOGIA: PLAN DE ESTUDIOS 2008

Nombre del Profesor: Dr. Faustino Camarena Rosales

Biologa Celular y Molecular

2 Nombre del profesor Dr. Faustino Camarena Rosales

CONTENIDO

Tabla de contenido

PROPSITO GENERAL DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE: BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR .................5

INTRODUCCIN AL LABORATORIO:.....................................................................................................7

REGLAMENTO DE LABORATORIO ........................................................................................................8

CONSIDERACIONES GENERALES ..................................................................................................................8

NORMAS DE TRABAJO ........................................................................................................................8

COMPORTAMIENTO .........................................................................................................................10

DISPOSICIONES PARA ACADMICOS, ALUMNOS Y COLABORADORES DEL LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR, .......11

LIBRETA DE LABORATORIO ......................................................................................................................13

REPORTE DE PRCTICAS DE LABORATORIO ..................................................................................................14

PRCTICA 1: INTRODUCCIN AL TRABAJO DE LABORATORIO ............................................................17

PRCTICA #2: IDENTIFICACIN DE CLULAS Y SUS ESTRUCTURAS ......................................................18

USO DEL MICROSCOPIO ..........................................................................................................................19

USO DEL OBJETIVO DE INMERSIN .............................................................................................................20

ILUMINACION KHELER ....................................................................................................................20

OBSERVACIN DE CLULAS ......................................................................................................................21

TINCIN GRAM ....................................................................................................................................22

PRCTICA 3: SISTEMA DE MEMBRANAS ............................................................................................25

PRIMERA PARTE: PROCESOS DE TRANSPORTE PASIVO, CORRESPONDIENTE A LA OSMOSIS Y LA DIFUSIN.....................25

SEGUNDA PARTE: TINCIN DE HEMATOXILINA- EOSINA (HE) ..........................................................................29

TERCERA PARTE: OBSERVACIN DE CLULAS EN TEJIDOS.................................................................................29

PRCTICA 4: OBSERVACIN Y SEPARACIN DE ORGNELOS DE DOBLE MEMBRANA .........................31

PRIMERA PARTE: SEPARACIN Y OBSERVACIN DE PLSTIDOS .........................................................................31

AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS.............................................................................32

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS....................................................32

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA.....................................33

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON TRITON..................................33

IDENTIFICAR CROMOPLASTOS ...................................................................................................................33

OBSERVACIN DE AMILOPLASTOS..............................................................................................................34

OBSERVACIN DE LEUCOPLASTOS. ............................................................................................................34

SEGUNDA PARTE: EXTRACCIN DE MITOCONDRIAS .......................................................................................34

RECOMENDACIONES PARA PLASMAR LOS RESULTADOS Y SU ANLISIS ..................................................................35



TERCERA PARTE: RESPIRACIN ................................................................................................................36

RESPIRACIN: ......................................................................................................................................36

COMPLEMENTO: USO DE LOS MICROPIPETEADORES AUTOMTICOS ..................................................................37

EJERCICIO A:........................................................................................................................................37

EJERCICIO B: ........................................................................................................................................38

EJERCICIO C: ........................................................................................................................................38

EJERCICIO D:........................................................................................................................................38

CON PIPETAS DE GRAN VOLUMEN (MAYOR DEL ML) .......................................................................................39

RECOMENDACIONES PARA PLASMAR LOS RESULTADOS Y SU ANLISIS ..................................................................39

PRCTICA 5: OBSERVACIN DE CLULAS ASOCIADAS A LA DIVISIN CELULAR ...................................40

PRIMERA PARTE: EXAMINANDO CLULAS DE LEVADURA ................................................................................40

SEGUNDA PARTE: OBSERVACIN DE MITOSIS ..............................................................................................41

TERCERA PARTE: MEIOSIS.......................................................................................................................41

OBSERVACIN DE ESPERMAS EN VIVO.........................................................................................................42

TINCIN WRIGHT .................................................................................................................................42

OBSERVACIN DE LAMINILLAS ..................................................................................................................43

PRCTICA 6: TECNOLOGA DE ADN ...................................................................................................44

INTRODUCCION: ..............................................................................................................................44

GENERALIDADES DE LOS PROTOCOLOS. .......................................................................................................44

CONSERVACIN....................................................................................................................................44

HOMOGENIZACIN ...............................................................................................................................45

DEGRADACIN Y ELIMINACIN DE COMPUESTOS ORGNICOS............................................................................46

RESUSPENSIN Y CONSERVACIN ..............................................................................................................46

GENERALIDADES DE LA ELECTROFORESIS......................................................................................................47

DESCRIPCIN DE LA ELECTROFORESIS..........................................................................................................47

CARACTERSTICAS DE LA MUESTRA .............................................................................................................48

CORRIENTE ELCTRICA............................................................................................................................48

AMORTIGUADOR ..................................................................................................................................49

MATRIZ .............................................................................................................................................49

OTROS REACTIVOS. ...............................................................................................................................51

CUANTIFICACIN DE ADN.......................................................................................................................52

ESTIMACIN DE LA CONCENTRACIN DE ADN POR VISUALIZACIN. ....................................................................52

ESTIMACIN MEDIANTE ESPECTROFOTMETRO.............................................................................................53

EXTRACCIN DE ADN POR EL MTODO DE CLOROFORMO ................................................................................53

EXTRACCIN DE ADN POR EL MTODO DE FENOL ..........................................................................................54

EXTRACCIN SALINA ..............................................................................................................................55

EXTRACCIN DE ADN CON CTAB .............................................................................................................56

ELECTROFORESIS ..................................................................................................................................56

PREPARACIN AGAROSA EN HORNO DE MICROONDAS.....................................................................................56



PREPARACIN EN TERMOPLATO ................................................................................................................57

ELECTROFORESIS ..................................................................................................................................57

PRCTICA REPLICACIN ARTIFICIAL DE ADN.....................................................................................59

INTRODUCCION: ..............................................................................................................................59

PCR ..................................................................................................................................................59

MUESTRA DE LOS CIDOS NUCLEICOS.........................................................................................................59

CONDICIONES QUMICAS DE LA REACCIN....................................................................................................59

CONDICIONES FSICAS ............................................................................................................................61

OTROS CUIDADOS .................................................................................................................................63

PRIMERA PARTE PCR INESPECFICO............................................................................................................63

SEGUNDA PARTE: PCR ESPECFICO ............................................................................................................65

LITERATURA.....................................................................................................................................67



PROPSITO GENERAL DE LA UNIDAD DE APRENDIZAJE

Las Ciencias Naturales constituyen disciplinas cuyo campo de estudio son los fenmenos fsicos,

qumicos y biolgicos que se dan en el medio natural; analizndolos bajo diferentes enfoques, para

construir generalizaciones de manera racional que permitan explicar el comportamiento de los

organismos en el marco de la evolucin biolgica.

En este contexto, el curso de biologa celular y molecular, busca bridarles a los alumnos los fundamentos

bsicos para comprender y estudiar a la unidad bsica de la vida, a la clula, desde el punto de vista

funcional y estructural, as como su interaccin con su ambiente. Por otro lado, el curso involucra el

desarrollo de habilidades prcticas para el estudio microscpico y bioqumico de algunos componentes

celulares, como por ejemplo el ADN.

Busca adems, que el alumno integre los elementos bsicos para su incorporacin en los cursos

avanzados de su formacin profesional, as como en optativas vinculada al rea de biologa celular y

molecular, ya que el conocimiento a nivel celular resulta indispensable para comprender la estructura

elemental de todos los individuos.

Los conocimientos y habilidades adquiridos le brindaran las herramientas para realizar investigacin

cientfica, as como para poder preparar informes tcnicos en el rea, con responsabilidad y tica

profesional.

En este contexto el manual del curso constituye un auxiliar y gua de las actividades prcticas y de

laboratorio. El documento est organizado en dos partes, la descripcin de la normatividad para el

trabajo en el laboratorio y la gua de las actividades practicas.

Las prcticas estn divididas en una sesin de introduccin al trabajo de laboratorio y 5 mdulos

prcticos, correspondientes a 48 horas de trabajo en laboratorio, de acuerdo a la siguiente tabla:

#

Competencia(s) Descripcin Material de

Apoyo

Duracin

1 Introduccin al trabajo de

laboratorio

3

2 Categorizar los mtodos de

estudio aplicados a la

Biologa y Fisiologa Celular,

para su tipificacin, con base

en la utilizacin practica de

algunas de ellos, para su

posterior aplicacin en el

trabajo profesional con

Identificacin de clulas y

sus estructuras

Trabajo en

laboratorio

Microscopios

compuestos y

material

biolgico

3



responsabilidad

3 Diferenciar las estrategias

para el estudio de las

cubiertas celulares,

mediante el anlisis de las

tcnicas bsicas, para su

utilizacin en laboratorio,

con actitud crtica.

Identificacin de cubiertas

celulares y sistema de

membranas de clulas

eucariontes

Microscopios

compuestos y

material

biolgico

9

4 Comparar los mtodos

utilizados para la

identificacin de orgnelos

en tejidos multicelulares,

con base en la utilizacin de

tcnicas bsicas, para su

posterior aplicacin en el

campo profesional, con

disciplina y respeto.

Identificacin de clulas

eucariontes en tejidos

orgnicos y separacin

mecnica de orgnelos y

sistemas

Microscopios

compuestos y

material

biolgico

Centrifugas,

micro pipetas

9

5 Comparar las metodologas

convencionales para la

descripcin de los estadios

de la divisin celular,

explorando las tcnicas de

microscopia en forma

profesional

Reconocimiento de estadios

de la divisin celular

Microscopios

compuestos y

material

biolgico

6

6 Valorar diferentes

metodologas de la

tecnologa de ADN a nivel

celular para ejemplificar su

aplicacin, con actitud

profesional

Metodologa para los

estudios en Biologa

Molecular

Material de

laboratorio

diverso

12

7 Aplicar tcnicas de

replicacin artificial de ADN

para analizar sus fases con

actitud crtica y profesional

Replicacin artificial de ADN Material de

laboratorio

diverso

6

Debemos destacar que las practicas involucran varias sesiones de laboratorio, por lo que una vez

concluido se reportar a mas tardar una semana despus.



Introduccin al laboratorio:

En el desarrollo de las prcticas se busca la familiarizacin metodolgica con las tcnicas bsicas

utilizadas en la Biologa Celular y Molecular. Por seguridad para los usuarios, los materiales y equipos se

mantendrn en el laboratorio.

La evaluacin de las prcticas se realizar con los siguientes criterios

- Asistencia (menos del 80%, no tiene derecho a la evaluacin ordinaria)

- Reporte individual de la prctica de laboratorio, para su entrega ser requisito llevar a cada sesin la

libreta de laboratorio.

-- y contestar en el reporte de la prctica las siguientes preguntas

Qu material y equipo aprendi a usar?

Genero datos experimentales?

Qu conocimientos son bsicos en el tema?

Qu habilidades y destrezas son requeridas para obtener adecuados resultados?

Se enviar por la plataforma Blackboard en PDF

. .



Reglamento de Laboratorio

Consideraciones generales El trabajo en los laboratorios relacionados con las reas de Ecologa Molecular y Biotecnologa, estn

asociados con diferentes tipos de riesgos, que los podemos categorizar en:

Peligros para las personas que trabajan en el laboratorio.

Peligros para la salud de otras personas, as como riesgos para el ambiente, producidos por las

actividades que se realizan.

Riegos en el manejo de los materiales y equipos utilizados.

Por lo tanto es necesario tener una serie de precauciones para garantizar la reproducibilidad de los

resultados.

NORMAS DE TRABAJO Es Obligatorio

En el laboratorio utilizar en todo momento: bata, guantes y zapato cerrado.

Lavarse las manos antes y despus del trabajo en el laboratorio.

Mantener en funcionamiento el aire acondicionado a la temperatura indicada por el encargado

del laboratorio (esto tiene como objetivo mantener en buenas condiciones el equipo de trabajo

en condiciones de temperatura extrema).

Mantener limpia el rea de trabajo y material que se utilice.

Si utiliza equipos, materiales de uso delicado y reactivos, es responsabilidad del usuario leer

manuales o consultar sobre su funcionamiento.

Muchos de los reactivos que se emplean son sensibles a la luz o temperatura y peligrosos para la

salud humana (mutagnicos o carcinognicos), por lo que se debe estudiar las fichas tcnicas

donde se sealan las propiedades qumicas y fsicas de los mismos as como su manejo y los

riesgos para la salud.

Cuidar los reactivos y trabajar con alcuotas independientes.

Respetar las bitcoras, los cronogramas de actividades y los registros de uso de los aparatos.

Notificar cualquier desperfecto del equipo e informar al responsable del laboratorio cuando los

reactivos estn por terminarse.

Mantener en buen estado los reactivos, soluciones y los espacios de trabajo asignados.



Todo el material deber ser lavado con jabn enzimtico, posteriormente deber enjuagarse

con abundante agua destilada.

Etiquete las muestras, reactivos y soluciones adecuadamente, indicando la siguiente

informacin:

Muestras

Nombre del responsable

Fecha

Origen y detalle del contenido de la muestra

Soluciones

Nombre del responsable

Fecha

Nombre de la solucin, indicando los componentes y la concentracin

Reactivos

Fecha en que se recibi y fecha de apertura

En caso de que pierda la etiqueta original, rotular el reactivo.

DE LOS CONGELADORES Y REFRIGERADORES SE ELIMINAR TODO LO QUE NO CUMPLA LA

REGLAMENTACIN

Es responsabilidad de cada uno de los usuarios el disponer adecuadamente los desechos txicos,

mediante la asignacin de contenedores especficos. Por otro lado, es importante esterilizar el material

biolgicamente peligroso (bacterias modificadas, sustancias), antes de depositarlos en sus respectivos

contenedores.

Est prohibido

Sacar fuera del laboratorio, equipo y materiales (nicamente podrn salir con autorizacin del

responsable del laboratorio).

El acceso a personas no autorizadas.

Comer y Fumar dentro del laboratorio.

Utilizar artculos personales (celulares, computadoras, etc.) con guantes.



El laboratorio es un lugar de trabajo, si es requerido platicar se recomienda ocupar los espacios externos

al laboratorio.

En caso de duda contactar a la persona responsable del laboratorio.

El trabajo operativo en estos laboratorios implica costos, tanto en tiempo como en recursos, por lo

que se recomienda utilizar el sentido comn en todas sus acciones.

COMPORTAMIENTO En los laboratorios relacionados con la Ecologa Molecular y la Biotecnologa, generalmente se

comparten equipos y recursos, adems de largos tiempos de compaa, por lo que tambin es

importante considerar los aspectos relacionados con la actitud, particularmente la disposicin al trabajo

en equipo, el respeto a los colegas y finalmente el buen humor.

DEJE FUERA DEL LABORATORIO TODO LO QUE SEAN CRITICAS DESTRUCTIVAS, ACTITUDES OFENSIVAS Y

NEGATIVAS

La limpieza y el orden en el espacio de trabajo auxilian para obtener buenos resultados al disminuir los

riesgos de contaminacin de los artculos que utilizamos y de nosotros mismos, adems permiten un

mejor ambiente de trabajo. Si hay orden en el laboratorio y en el espacio de trabajo, tambin lo hay en

las ideas.



Disposiciones para acadmicos, alumnos y colaboradores del laboratorio de

Biologa Molecular, La normatividad federal vigente en materia de seguridad, obliga a los usuarios del laboratorio seguir las

siguientes recomendaciones:

1. Todas las gavetas deben de estar disponibles para cualquier inspeccin que se realice. Si

alguien desea mantener sus reactivos o materiales bajo candado, deber mantener disponible

una copia de la llave con el encargado del laboratorio.

2 Todos los reactivos deben estar colocados en charolas de contencin.

3. De todos los reactivos deber estar disponible la hoja de seguridad, en espaol.

4. Los residuos del laboratorio quedan clasificados en las siguientes categoras:

a. Residuos biolgico infecciosos

i. Punzo cortantes como navajas

ii. Guantes

iii. Desechos de disecciones o residuos animales y vegetales

iv. Desechos de cultivo microbiolgicos

b. Residuos lquidos

i. Mezcla de solventes

ii. Contaminados con bromuro de etidio

c. Residuos slidos contaminados con bromuro de etidio

d. Basura general

5. Los desechos se colocaran en recipientes especficos para su acumulacin, posteriormente se

pasaran al almacn general de la Facultad de Ciencias. En bitcoras especficas se anotaran las

cantidades generadas.

a. Residuos biolgico infecciosos

i. Punzo cortantes como navajas:

1. Los desechos se colocaran en el bote rojo ubicado en la mesa del laboratorio

2. En la bitcora se anotar la cantidad aproximada que mensualmente deposite por responsable

ii. Guantes (no contaminados con Bromuro de etidio):

1. Los desechos se colocaran en el bote con bolsa roja ubicada al frente del laboratorio

2. En la bitcora el encargado del laboratorio anotar la cantidad aproximada que semanalmente se

deposite



3. La bolsa roja no debe llenarse a ms del 80 % de su capacidad. En caso de llenarse por favor cerrar y

colocar la siguiente.

4. NO DEBEN DE TIRARSE GUANTES NO CONTAMINADOS EN NINGUN OTRO RECIPIENTE

iii. Desechos de disecciones o residuos animales y vegetales

1. El responsable de la generacin del desecho determinara su mejor destino. S corresponde a la bolsa

roja (biolgico infecciosos), favor de anotar en la bitcora.

iv. Desechos de cultivo microbiolgicos

1. El responsable de la generacin del desecho determinara su mejor destino. S corresponde a la bolsa

roja (biolgico infecciosos), favor de anotar en la bitcora.

b. Residuos lquidos (no contaminados con bromuro de etidio)

i. Mezcla de lquidos no contaminados con bromuro de etidio

1. Los desechos se colocaran temporalmente en los frascos cubiertos con papel alumi nio que estn

sobre las mesas, despus en el frasco de galn color mbar, el cual esta etiquetado y ubicado en la

gaveta debajo de la campana de extraccin de vapores al final del laboratorio

2. En la bitcora se anotar la cantidad aproximada que mensualmente se deposite por responsable

ii. Contaminados con bromuro de etidio

1. Los desechos se colocaran temporalmente en el frasco de galn color mbar, el cual esta etiquetado y

ubicado en cuarto oscuro, en la gaveta debajo de la tarja

2. En la bitcora se anotar la cantidad aproximada que mensualmente se deposite por responsable

c. Residuos slidos contaminados con bromuro de etidio

i. Geles

1. Los desechos se colocaran en el bote etiquetado, ubicado en el cuarto oscuro

2. En la bitcora ubicada en el cajn superior del lado izquierdo, se anotar la cantidad aproximada que

semanalmente se deposite

ii. Plsticos, papel y cartn

1. Los desechos se colocaran en el bote etiquetado, ubicado en el cuarto oscuro

2. En la bitcora ubicada en el cajn superior del lado izquierdo, se anotar la cantidad aproximada que

semanalmente se deposite

d. Basura general.

NO DEBERA CONTENER NINGUNO DE LOS RESIDUOS ANTES INDICADOS. El conserje asignado al

laboratorio la recoger peridicamente



Libreta de Laboratorio Toda la descripcin del proceso que involucra la generacin de datos en el laboratorio debe estar anotada en la libreta de laboratorio o bitcora. Es una herramienta obligada que garantiza la reproduccin de los experimentos y respalda nuestra investigacin al registrar las actividades e ideas, errores y aciertos.

PREVIO A CUALQUIER ACTIVIDAD PRACTICA, DEBE OBTENER INFORMACION TEORICA DEL TEMA Y

ESCRIBIRLO EN LA LIBRETA

La libreta deber ser de pasta dura, hojas enumeradas y cosidas (evite cuadernos engargolados). Toda anotacin debe ser escrita con tinta.

La libreta deber ser nica; exclusivamente se usar en el laboratorio.

- Etiquete correctamente la libreta con sus datos personales, ttulo del curso o proyecto, nombre del profesor o tutor.

- De preferencia dejar las dos primeras pginas como ndice, la ltima pgina para incluir una tabla de abreviaturas y cdigos utilizados. Las penltimas pginas sern para anotar las frmulas de los reactivos que se utilicen

- Anote todo lo que realice en laboratorio en forma cronolgica, con informacin clara y entendible. Remarque sus resultados.

- Indique lo que sucedi en cada ocasin que trabaje en el laboratorio, incluyendo la informacin terica, variaciones de los protocolos y la justificacin correspondiente, evitando anotar datos en hojas sueltas.

- No utilice corrector, ni sobrescriba, en su caso cruce con una lnea las palabras o frases escritas errneamente.

- En cada pgina se recomienda anotar: ttulo de la actividad o experimento, fecha, nmero de pgina y en lo posible los archivos electrnicos generados y asociados a los experimentos realizados.

- No arranque las hojas. No se admite la bitcora si no tiene continuidad en su enumeracin.

- Anote todos los clculos que realice.

- Cronolgicamente, pegue las fotos, grficas y otros documentos o comprobantes que se generen de su trabajo en el laboratorio.

- Resuma sus resultados, analcelos y contrstelos, finalmente sintetice sus conclusiones.

Anote el listado de todos los materiales y equipos utilizados y describa los mtodos seguidos

Discuta las actividades realizadas as como los resultados obtenidos, explicitando sus sugerencias

Sintetice sus conclusiones

Nota: para ms informacin de la libreta de laboratorio se recomienda la siguiente bibliografa:

Kanare, H. M: 1985. Writing the Laboratory Notebook. Washington D.C.: American Chemical Society.

http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/tools/notebook/notebook.html

http://www.chem.tamu.edu/class/majors/syllabusmaterials/laboratorynotebook.htm



Reporte de Prcticas de laboratorio Un reporte debe llenar dos objetivos. Primero, debe describir clara y completamente los

procedimientos seguidos (en trminos reproducibles) y los resultados hallados (en forma original y

posteriormente con su anlisis). Segundo, debe ubicar los resultados en perspectiva con el estado actual

del conocimiento, interpretando su importancia.

Las partes que contiene un reporte cientfico, son las siguientes:

TITULO.

Nominacin sinttica de la investigacin, la cual debe ser breve y concreta, enunciando el

problema a resolver.

INTRODUCCIN.

Presentacin de la informacin base, que dentro del cuerpo de conocimiento nos ubica en el

problema planteado as como la informacin relacionada a su resolucin. Tambin se refiere a la

importancia del trabajo, esto ltimo puede tratarse en un punto separado.

ANTECEDENTES.

Resumen de otras investigaciones similares o bien que fundamenten los aspectos

metodolgicos del trabajo.

COMPETENCIA.

MATERIALES Y MTODOS DE TRABAJO.

En forma sinttica se explica la aplicacin de los mtodos, generalmente en forma referencial,

as como la descripcin de los materiales, de tal forma que el lector del trabajo, cuente con la

informacin necesaria para poder repetir la experiencia, con base a lo descrito.

RESULTADOS.

Presentacin ordenada tanto los datos obtenidos sin procesamientos, as como la informacin

procesada, con los resultados de los estadgrafos.

DISCUSIN.

Corresponde a una disertacin razonada del contraste de los resultados obtenidos contra los

antecedentes bibliogrficos (cuerpo de conocimiento existente), as como los puntos de vista

fundamentados del autor.

Se buscar obtener algunos de los siguientes puntos:

1) Analizar los resultados.

2) Compararlos con los de otros.

3) Identificar fuentes de error, sin llegar al extremo de invalidar el propio trabajo.

4) Especular acerca de los significados ms amplios de las conclusiones obtenidas.

5) Identificar los siguientes pasos en la investigacin del problema.



6) Sugerir mejoras.

CONCLUSIONES.

En forma breve se presenta el cuerpo de conocimiento adquirido a partir de la investigacin

realizada as como los ms sobresalientes resultados obtenidos.

BIBLIOGRAFA REFERIDA.

Se cita en forma organizada y homognea, tanto los libros, los artculos y en general las obras

consultadas, que fue indispensable su indicacin o referencia en el contenido del trabajo.

Considerando su valor utilitario, se describe a continuacin en sntesis los procedimientos para

citar material bibliogrfico en el texto y en la seccin final del reporte cientfico de literatura citada.

Como citar en el texto.

- Despus de un prrafo donde se cite a un determinado autor, se anota entre parntesis,

ejemplo (Barnes, 1969).

- En el caso de que el nombre del autor forme parte del texto, el ao se indica entre parntesis,

ejemplo Barnes (1969).

- Si se trata de ms de un autor, se anota entre parntesis despus del primer autor la palabra et

al., que del latn significa "y otros", ejemplo (Barnes, et al., 1969).

- En el caso de que un autor, sea consultado para ms de una referencia de un mismo ao, estas

se anotan con una letra en orden, despus del ao, ejemplo (Barnes, 1969a), (Barnes, 1969b), etc. y en

la seccin de literatura citada se enlistan en orden cronolgico.

Como indicar las referencias en la seccin de literatura citada.

La literatura deber anotarse en orden alfabtico y en caso de que un autor contribuya con ms

de un trabajo en orden cronolgico, siguiendo el mismo formato en toda la seccin, se recomienda

seguir el siguiente formato:

- Datos que se registran:

1. Nombre del autor. Se indica apellido paterno (primer apellido) completo, inicial de segundo apellido,

inicial de nombre.

2. Fecha de publicacin.

3. Ttulo de la obra. Se ponen maysculas en las letras iniciales.

4. Numero de edicin. En el caso de la primer edicin o edicin nica, no se indica.

5. Pas o en su caso ciudad de edicin.

6. Casa editorial. Cuando la casa editorial es muy conocida, no es necesario poner la casa editorial.

7. Paginas referidas.

8. En el caso de artculos, el sustitucin de los incisos anteriores 4 a 6, se indica el nombre de la revista

(en caso de conocerse se utiliza la abreviatura convencional), Volumen y Nmero de la revista.



a) Referencia de un libro:

Barnes, R.P. 1969. Invertebrate Zoology. 2da. ed. Philadelphia. Ed. Saunders. 350-355 pp.

b) Referencia de una revista:

Hunter, P.A. y D.D. Keck. 1949. California Plant Communities. Aliso, 2 (1): 87-105.

TABLAS, GRFICAS Y FIGURAS.

Debido a que existen diversos criterios de ubicacin de las presentaciones grficas,

especialmente cuando intervienen polticas editoriales, usualmente se presentan al final del trabajo,

aunque en un reporte interno que no tiene que pasar por consideraciones editoriales, se recomienda

intercalarlas de acuerdo al escrito.



PRCTICA 1: Introduccin al trabajo de laboratorio

INTRODUCCION:

Durante la primera sesin de laboratorio se busca promover la exploracin rpida de los aspectos

bsicos para el trabajo en el laboratorio de Biologa Celular y Molecular de la Facultad de Ciencias,

considerando la normatividad, reglas de operacin y sobre todo los cuidados que se deben tener. l

Para el reporte de prctica se recomienda investigar el marco de referencia terico de la sesin, as

como la introduccin para el reporte, por parte del estudiante

Informacin relacionada con el marco de referencia:

Cules son las principales recomendaciones para trabajar en laboratorios de Biologa?

Cules son las caractersticas que diferencian a los laboratorios de zoologa, botnica, qumica y

biologa molecular?

MATERIAL:

BATA PARA LABORATORIO

METODOLOGIA:

1. En forma terica se revisaran aspectos generales del laboratorio, as como el reglamento y las

recomendaciones para el manejo de los desechos.

2. Recorrido en el laboratorio, con el fin de identificar las diferentes reas de trabajo as como

los principales equipos.

3. Revisin del manejo de la libreta de laboratorio.

Recomendaciones para plasmar los resultados y su anlisis:

1. Resuma la informacin terica y contrstela con el marco de referencia que obtuvo.

2. Esquematice la distribucin de las reas del laboratorio, identifique los recipientes para

desechos y analice los cuidados que debe tener en cada rea.

3. Prepare su libreta de laboratorio, contraste con la informacin que recomiendan diversos

autores para llevar la libreta de laboratorio y explique su valor utilitario.

4. Procure emitir recomendaciones para mejorar los diferentes aspectos sealados en la sesin.



PRCTICA #2: Identificacin de clulas y sus estructuras

INTRODUCCION:

En una primera parte se busca promover la exploracin rpida de algunas clulas procariontas y

eucariontas, para lo cual se debe conocer el adecuado uso de los microscopios compuestos y el uso de la

iluminacin Klher. En forma adicional para las clulas procariontas se promover el desarrollo de

habilidades asociadas a la tincin gram.




Cules son los tipos de microscopio tiles en la actividad relacionada con la biologa celular y

molecular?

Cules son las principales caractersticas de los microscopios compuestos?

Copie un esquema de un microscopio compuesto

Cules son las principales recomendaciones para el uso del microscopio?

COMPETENCIA: Categorizar los mtodos de estudio aplicados a la Biologa y Fisiologa Celular, para su

tipificacin, con base en la utilizacin practica de algunas de ellos, para su posterior aplicacin en el

trabajo profesional con responsabilidad

MATERIAL:

5 Portaobjetos y 5 cubreobjetos

Hematoxilina

Eosina

Alcohol etlico absoluto

Estuche de diseccin

Caja Petri

Muestras celulares (por ejemplo: sangre, muestras de charcas, raspado bucal, plantas)

Microscopios compuestos

METODOLOGIA:



Uso del microscopio

El microscopio es un instrumento delicado. Debido a esto debe recordar las siguientes instrucciones

bsicas:

a) Coloque el microscopio en una posicin cmoda sobre la mesa. Tmelo siempre del brazo. Si desea

cambiar la posicin del instrumento levntelo y NO lo arrastre por la mesa.

b) Es conveniente verificar la limpieza de los lentes antes de comenzar a realizar observaciones.

c) Encienda la lmpara, baje el condensador y abra el diafragma completamente. Recuerde, la

observacin se realiza ms eficientemente con iluminacin Kheler.

Realizacin de la observacin

a) Aleje el objetivo de la platina y coloque la lente de aumento menor (4x).

b) Seleccione la preparacin que desea observar, revsela para asegurarse que esta se encuentra limpia.

c) Abra la pinza del carro, coloque la preparacin con el cubreobjetos hacia arriba y cierre el carro.

d) Ajuste la posicin del carro de modo que la regin a observar quede justo en el orificio de la platina.

e) Usando el macromtrico acerque la lente a la preparacin. Cuando logre un foco aproximado utilice el

micromtrico (grelo lentamente) para el ajuste de precisin.

f) Si desea cambiar el aumento, gire el revlver y seleccione el nuevo objetivo a utilizar. Debiera bastar

un pequeo ajuste del micromtrico para llegar a foco, si fuera necesario reajuste la iluminacin usando

el condensador.



Si requiere usar el lente de inmersin (100x en los microscopios de la FC) NUNCA lo use como objetivo

seco, puede rayarlo.

Uso del objetivo de inmersin

a) La preparacin debe estar enfocada a 40X (objetivo a seco), gire el revlver de modo que el objetivo

de inmersin quede en una posicin intermedia (40X y 100X).

b) Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el cubre objeto.

c) Lleve el objetivo de inmersin al eje ptico.

d) Utilizando el tornillo micromtrico lleve el objeto a foco, si lo requiere modifique la cantidad de luz

del condensador.

e) Cuando finalice la observacin baje la platina, retire la preparacin. Limpie tanto el objetivo como la

preparacin con un pao humedecido con Xilol.

Al finalizar las observaciones el microscopio y las preparaciones deben quedar limpios. Gire el revlver y

deje la lupa como lente de observacin. Apague la lmpara y enrolle el cordn en el pie del microscopio.

Recomendaciones para plasmar los resultados y su anlisis

Debe seguir una estructura, que puede variar segn el observador, pero que debe ser sistemtica y

ordenada. Se sugiere que considere en sus observaciones el siguiente esquema:

a) Objetivo: referido al porque se realiza la observacin (Ej. observacin de ncleo)

b) Material: es el rgano o tejido del que se obtuvo la preparacin (Ej. rin de rata)

c) Mtodo: se refiere a la tcnica histolgica usada para elaborar la preparacin (a fresco o

permanente) y a la tincin utilizada. (Ejemplo Preparacin a fresco de clulas)

d) Aumento: la amplificacin del objeto observado y depende del ocular y del objetivo.

Aumento = aumento del objetivo x aumento del ocular

e) Observaciones: considere describir la forma celular; relacin con otros elementos presentes,

tamao celular; forma, nmero y posicin del ncleo y algunas caractersticas del citoplasma

f) Esquematice y coloree lo observado

ILUMINACION KHELER

El Dr. Kheler, desarroll un nuevo sistema de iluminacin, que an hoy en da se maneja

y lleva su nombre, agregando un diafragma de campo luminoso posterior a la emisin de



luz emitida por un bombillo de bajo poder, y centrando la mayor intensidad de luz

exactamente cubriendo el dimetro de cada lente frontal de cada objetivo en su apertura

numrica especfica, para de esta manera, poder aprovechar al 100% la luz emitida por la

fuente emisora.

Metodologa:

1.-Llevar el espcimen a foco utilizando el objetivo 10X.

2.-Cerrar completamente el diafragma del condensador.

3.-Cerrar completamente el diafragma de campo.

4.-Con el control de altura del condensador llevar el condensador hasta arriba.

5.-Bajar el condensador poco a poco hasta observar una figura geomtrica (octgono) bien definida con

el reborde ligeramente azulado.

6.-Con los tornillos de centrado del condensador colocar el octgono al centro del campo de

observacin.

7.-Abrir el diafragma de campo hasta que una de las aristas toque el borde del campo de observacin y

repetir el centrado hasta que todas las aristas toquen el borde del campo de observacin al mismo

tiempo.

8.-Cambie al objetivo 40X.

9.-Abrir el diafragma del condensador a la apertura numrica marcada por el objetivo.

10.-Observando con un solo ojo (derecho) mover el mando micromtrico hasta obtener el mejor punto

de enfoque.

11.-Observando con el otro ojo (izquierdo) sin tocar el micromtrico gire la dioptra hasta obtener el

mejor punto de enfoque.

12.- Cambie al objetivo 10X.

13.- Abrir el diafragma del condensador a la apertura numrica marcada por el objetivo.

14.- S el espcimen continua en foco, los ajustes se hicieron correctamente, de lo contrario repita desde

el punto 8 hasta lograr el correcto ajuste.

Observacin de clulas

Buscando revisar las caractersticas generales de las clulas eucariontas, se recomienda obtener una

muestra donde exista una notable riqueza, como puede ser una muestra de una charca o de tejido

epidrmico de la boca tomado con un palillo.



1. Coloque la muestra sobre el portaobjetos en hmedo, por lo que si es necesario agregue una gota de

agua.

2. Incremente el aumento hasta 100x utilizando adecuadamente el aceite mineral.

3. Utilizando la iluminacin Klher y optimizando la iluminacin, observe las clulas..

4. Esquematice sus observaciones, indicando los datos de la laminilla y tcnica de tincin.

No se olvide utilizar ampliamente el sistema de iluminacin as como los campos de poca y gran

profundidad, as como el uso del micrmetro para el adecuado enfoque por cada campo.

Tincin Gram

l. Coloque la muestra sobre el porta objetos y distribyala.

2. Fije la muestra por secado, pasndolo sobre un mechero. El paso del portaobjetos sobre la llama del

mechero debe ser rpido, repita hasta que este seca la muestra. La temperatura del porta debe ser la

que soporta el dorso de la mano sin quemarla

2. Coloque unas gotas del colorante violeta de genciana, cubriendo la extensin; el tiempo de actuacin

del colorante es de dos minutos.

3. Lave con agua destilada para arrastrar el colorante.

4. Ponga solucin de lugol durante un minuto.

5. Lave nuevamente con agua destilada.

6. Decolore con unas gotas de alcohol de 96, que debe actuar de 30 segundos a un minuto, para

arrastrar el colorante que queda libre.

7. Lave cuidadosamente con agua destilada.

8. Agregue unas gotas de safranina durante un minuto.

9. Lave con agua destilada.

10. Seque al aire.

11. Agregue aceite de inmersin y observe a 100X, utilizando adecuadamente el aceite mineral.

12. Utilizando la iluminacin Klher y optimizando la iluminacin, observe las clulas. No se olvide

utilizar ampliamente el sistema de iluminacin as como los campos de poca y gran profundidad, as

como el uso del micrmetro para el adecuado enfoque por cada campo.



13. Esquematice sus observaciones.

Las bacterias Gram positivas aparecen en visin microscpica teidas de un color morado intenso, por la

violeta de genciana.

Las bacterias Gram negativas, aparecen en visin microscpica teidas de un color rosado dbil, por la

safranina.

a) Se arranca del suelo una planta de leguminosa con sus races. En las raicillas finas se vern unos

ndulos en forma de pequeas verrugas. Con las pinzas se desprende un ndulo. Se lava para quitarle la

arena. El ndulo se parte con el bistur sobre un portaobjetos agregando una gota de agua. Se quitan los

residuos del ndulo, secando la preparacin a la llama del mechero, se coloca el portaobjetos en el

soporte de tinciones y se tie segn la tcnica de Gram.

b) Con la aguja de diseccin se toma una pequea porcin de yogurt. Se disuelve en una gota de agua y

se hace una extensin sobre el portaobjetos. Se lava la preparacin, dejando caer con un cuentagotas

unas gotas de la mezcla alcohol-cloroformo para arrastrar las gotas de grasa del yogurt y se deja secar al

aire. Se coloca el portaobjetos en el soporte de tinciones y se tie segn la tcnica de Gram.

c) Disuelva en una gota de agua sobre un portaobjetos, una pequea porcin de sarro dentario tomada

con la aguja y con esto se hace una extensin o frotis que se seca a la llama del mechero. Se coloca el

portaobjetos en el soporte de tinciones y se tie segn la tcnica de Gram.

Rhizobium leguminosarum: Ndulos de leguminosas: trbol, soya, alfalfa. Gram negativas

Acetobacter aceti: Telita que se forma sobre el vinagre. Gram negativa.

Lactobacilus vulgaris: Yogurt. Gram positiva

Informe de resultados

Los resultados de una tincin de Gram se reportan como sigue:



- Forma bacteriana

- Coloracin

- Agrupacin bacteriana (escasa, media, abundante)

- En muestras de esputo, excretas, saliva o "pus" se considera la respuesta leucocitaria y su tipo

(polimorfonuclear o monocitos) as como el conteo de clulas epiteliales a 10X.

La flora bacteriana observada por tincin de Gram se informa por gnero, forma o agrupacin, pero

nunca por especie, ya que la identificacin solo se puede lograr mediante pruebas bioqumicas



PRCTICA 3: Sistema de membranas

INTRODUCCION:

En una primera parte se busca promover la exploracin rpida de algunas caractersticas del sistema de

membranas, como lo es el transporte pasivo (difusin y osmosis). Posteriormente la identificacin de

clulas eucariontes y caractersticas microscpicas principales, para lo cual se promover el desarrollo

de habilidades asociadas a la tincin Hematoxilina-Eosina.




Primera parte: procesos de transporte pasivo, correspondiente a la osmosis y

la difusin. OBJETIVO: Demostrar los procesos pasivos de transporte de molculas, de difusin y osmosis.

MATERIAL:

METODOLOGIA:

Materiales

Vasos de precipitado o recipientes

Pipeteador

Pipetas de 10 y 5 mL

Estuche de diseccin

Cuchillo

Portaobjetos y cubreobjetos

Aproximadamente 100 gr de azcar

Aproximadamente 100 gr de sal

1 zanahoria

2 huevos frescos

1 microscopio compuesto



Metodologa:

1. Demostracin de la difusin

a. Coloque agua destilada en un recipiente (mida el volumen)

b. Agregue 5 gotas de azul de metileno

c. Describa lo que sucede cada 15 minutos

2. Demostracin de la osmosis, prueba A, en zanahoria

a. Corte un trozo de la zanahoria

b. Horade de tal forma que se forme un recipiente.

c. Llene la cavidad con azcar o sal

d. Coloque el trozo en un recipiente con agua, de tal forma que la parte externa este en contacto con

lquido

e. Describa lo que sucede despus de 2 horas

3. Demostracin de la osmosis, prueba B, en zanahoria



a. Corte un trozo de zanahoria y hordelo.

b. Agregue 1 mL de agua destilada

c. Coloque el trozo en un recipiente con solucin hper-salina o hper azucarada, de tal forma que la

parte externa este en contacto con el lquido

d. Describa lo que sucede despus de 2 horas

4. Demostracin de la osmosis con un huevo.

a. Rompa con sumo cuidado la cscara de un huevo, en el extremo ms cnico, dejando una pequea

perforacin.

b. Por el otro extremo del huevo rompa la cscara, sin daar la membrana

c. Llene la cavidad con agua destilada

d. Coloque el huevo de tal forma que la parte externa este en contacto con lquido hper-salino o hper

azucarado

e. Describa lo que sucede despus de 2 horas

5. Demostracin de la osmosis con bolsa de dilisis

a. Cierre uno de los extremos de un tubo de dilisis, amarrando fuertemente un hilo.

b. Llene el interior con una determinada concentracin de sal o azcar

c. Colquelo de tal forma que la parte externa este en contacto con lquido que contenga una diferente

concentracin.

6. Demostracin de la osmosis en clulas

a. Vegetales a escala macroscpica. Coloque un trozo de tejido vegetal en diferentes concentraciones de

sal o azcar y anote las caractersticas del tejido cada 30 minutos



b. Clulas vegetales a escala microscpica. Coloque tres finos tejidos (como el de la cebolla) en

portaobjetos. Agregue a cada gota de un lquido con una diferente concentracin de sal o az car y

observe al microscopio. Esquematice sus observaciones.

c. Clulas animales a escala microscpica. Coloque tres gotas de sangre en portaobjetos. Agregue a cada

gota de un lquido con una diferente concentracin de sal o azcar y observe al microscopio.

Esquematice sus observaciones.


En cada inciso se realizan recomendaciones para plasmar resultados. Analice los resultados con respecto

a lo esperado de acuerdo a la bibliografa.



Segunda parte: Tincin de Hematoxilina- Eosina (HE) 1. Obtencin una gota de sangre o muestra de clulas.

2. Realizacin del frotis sanguneo. Se hace colocando una pequea gota de sangre sobre un extremo del

porta, con el lado de otro porta, en un movimiento uniforme, extiende la gota sobre el primer porta.

3. Secar el frotis al aire.

4. Fijar del frotis con alcohol absoluto (echar alcohol sobre la muestra hasta cubrirla totalmente, dejar

que el alcohol se evapore totalmente).

5. Tincin con hematoxilina (Echar el colorante sobre la muestra hasta cubrirla totalmente, esperar

exactamente 15 minutos, echando ms colorante si ste se evaporara).

6. Lavar abundantemente con agua para que el colorante sobrante desaparezca y deje de actuar.

7. Tincin con eosina (echar el colorante sobre la muestra y dejar actuar durante 1 minuto

exactamente).

8. Lavar abundantemente con agua para que el colorante sobrante se elimine y no siga actuando.

9. Secar al aire.

10. Observar al microscopio comenzando con pocos aumentos.

Tercera parte: Observacin de clulas en tejidos. Para la realizacin de esta parte de la prctica, se tendrn disponibles diversas laminillas, preparadas en

el laboratorio de histologa de la Facultad de Ciencias, las cuales principalmente correspondern a tejido

epitelial teido con la tcnica de Hematoxilina-Eosina (HE).



Para cada una de las laminillas.

1. Observe el tejido utilizando los menores aumentos, hasta localizar zonas donde se puedan identificar

claramente a las clulas.


3. Utilizando la iluminacin Klher y optimizando la iluminacin, observe las clulas, procurando

identificar orgnelos internos, especialmente del sistema de membranas.






PRCTICA 4: Observacin y separacin de orgnelos de doble membrana

INTRODUCCION:

En una primera parte se busca promover el desarrollo de habilidades para la separacin de orgnelos de

doble membrana y su observacin. Posteriormente la identificacin de procesos fisiolgicos

relacionados con la respiracin.



Competencia:

Comparar los mtodos utilizados para la identificacin de orgnelos en tejidos multicelulares, con base

en la utilizacin de tcnicas bsicas, para su posterior aplicacin en el campo profesional, con disciplina

y respeto.

Materiales y equipos

Tubos eppendorf

Homogeneizador

Amortiguador STE y TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%)

Sacarosa

Tubos de centrfuga

Centrfuga eppendorf

Centrfuga refrigerada

Mini fuga

Primera parte: Separacin y observacin de plstidos Los cloroplastos de las clulas de espinaca se aislarn utilizando el mtodo modificado de F.R Whatley y

D.I. Arnon (1962). La espinaca se homogeniza en un amortiguador de sal. Despus que el tejido de la

planta se macera en un mortero, el homogenizado se filtra a travs de una gaza para remover los

pedazos grandes de tejidos. El filtrado es centrifugado a 200 g por 1 minuto. El sobrenadante se

centrfuga a 1300 g por 5 minutos, sedimentando los cloroplastos.



AISLAMIENTO DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS

1. Pese 4 g de hojas frescas de espinaca, a las cuales se les removieron las venas centrales.

2. Corte las hojas en pequeos pedazos y colquelas en un mortero fro.

Aada 15 ml de la solucin amortiguadora de Tris-NaCl fra y arena purificada. Macere el tejido por 2

minutos.

3. Filtre la suspensin a travs de varias capas de gaza a un tubo de centrfuga de 15 ml fro.

4. Centrifugue el lquido filtrado a 200 g por 1 minuto. Verifique que los tubos de centrfuga estn

balanceados.

5. Decante el sobre nadante a un tubo fro y centrifugue a 1300 g por 5 minutos.

6. Despus de la centrifugacin, mida la distancia A. A es la distancia en centmetros desde el extremo

inferior del tubo de centrfuga al tope del pellet. Anote los datos en la pgina; stos se utili zarn para

calcular el Coeficiente de Sedimentacin.

7. Decante y descarte el sobre nadante y usando una probeta, aada unas gotas de la solucin

amortiguadora fra de Tris-NaCl al pellet que qued en el tubo de centrfuga. Resuspenda el pellet

con una pipeta Pasteur.

8. Tape el tubo de centrfuga, e invierta el mismo para mezclar su contenido. Colocar en hielo.

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LA FRACCION DE CLOROPLASTOS

1. Con una pipeta Pasteur remueva una gota de la suspensin de cloroplastos y lleve a cabo una

preparacin hmeda wet mount. Use una pequea gota de modo que no tenga que ejercer presin

sobre el cubreobjetos, daando los cloroplastos.

2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y luego y luego bajo el objetivo de

inmersin en aceite.

3. Observa la morfologa de varios cloroplastos. Identifica los cloroplastos que tengan una morfologa

interna poco homognea.

4. Represente con un diagrama los cloroplastos que muestren detalles internos e identifique sus

estructuras.



OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON UREA

1. Coloque una pequea gota de la suspensin de cloroplastos en un portaobjetos limpio. Aada una

gota de la solucin de urea saturada y coloque un cubreobjetos. Cuidado de no presionar el

cubreobjetos.

2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersin de aceite por 5 minutos y

conteste las preguntas de la pgina 12

3. Dibuje los cloroplastos que presenten una morfologa alterada.

OBSERVACIN MICROSCPICA DE LOS CLOROPLASTOS TRATADOS CON TRITON

1. Prepare un montaje hmedo usando una pequea gota de la suspensin de cloroplastos y una gota

de solucin de Triton X-100 al 2%.

2. Examine la preparacin bajo el objetivo de alta potencia y el de inmersin de aceite

Identificar cromoplastos

Cromoplastos

1. De un tomate maduro corte finamente una pequea porcin de la parte pulposa.

2. Coloca el tejido sobre un portaobjetos, sin adicionar agua y se protege con un cubreobjetos.

3. Comprima suavemente la preparacin con los dedos hasta obtener un completo aplastamiento del

fragmento de pulpa de tomate.

4. Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo 10x y seleccionar una zona en la que las

clulas estn menos aglutinadas.

5. Examinar la preparacin al microscopio con los objetivos 40x y 100x (aceite de inmersin).

6. Identificar los distintos orgnulos celulares visibles y dibujar las observaciones. Al microscopio se

observan unas clulas muy separadas unas de otras, aprecindose en el citoplasma una serie de

grnulos rojizos-anaranjados que son los cromoplastos. Tambin se puede ver el ncleo redondeado. En

las zonas poco alteradas por la compresin es posible visualizar grandes vacuolas incoloras as como la

presencia de grnulos de almidn en forma arrionada.



Observacin de amiloplastos

1. Un pltano maduro se abre y con cuidado se corta muy finamente, colocando el material en un

portaobjetos y distribuyndolo procurando hacer un frotis, con la misma navaja.

2. Fijar la muestra por secado a temperatura ambiente (3 min.)

3. Agregar una gota de lugol y mantenga a temperatura ambiente durante 3 minutos.

4. Lavar suavemente con agua destilada.

5. Colocar un cubreobjetos y comprimir suavemente la preparacin con los dedos.

6. Examinar la preparacin al microscopio con el objetivo 10x y seleccionar una zona en la que las

clulas estn menos aglutinadas. Posteriormente examine con los objetivos 40x y 100x (aceite de

inmersin), cerrando el diafragma hasta el mximo permitido por el foco luminoso.

7. Identifique los distintos orgnulos celulares visibles. Los amiloplastos se observan como estructuras

ovaladas y de tamao considerable, por lo general, muestran capas concntricas de crecimiento del

grano, las cuales son muy variadas y especficas de cada especie de planta, fruto o semilla. En el pltano,

los granos de almidn se tien de color violeta al reaccionar con el lugol.

Observacin de Leucoplastos.

El reactivo lugol, que se utiliza para observar estas estructuras, es a la vez una fijador (agente qu mico

que destruye las clulas sin modificar su estructura) y un colorante de algunos tejidos vegetales

(celulsicos, lignificados y suberificados), as como de sustancias de reserva (almidn), siendo de gran

inters para el reconocimiento de diferentes especies vegetales, pues cada especie, dentro del mismo

gnero, presenta distinta organizacin de los tejidos y almacena el almidn de forma diferente.

De la papa se toma una porcin y se raspa con la punta de la lanceta. Se deposita el raspado sobre el

portaobjetos y se aade una gota de agua y otra de lugol. Se coloca un cubre y se observa al

microscopio.

Los grnulos de almidn se tien de color azul-violeta intenso por el yodo. Se pueden observar las capas

de crecimiento excntricas, que presentan los grnulos de almidn alrededor de un punto central.

Segunda parte: Extraccin de mitocondrias Extraccin de mitocondrias a partir de tejidos ricos en mitocondrias, utilizando al menos de 3 a 5 gr. de

tejido rico en mitocondrias (hgado, cerebro o gnadas maduras).

1. Con un homogeneizador de aspas o vidrio, se homogeneza el tejido (3 a 5 gr., rico en mitocondrias)

en dos volmenes de TEK (Tris-HCl 50 mM pH 7.5; EDTA 10 mM y KCl al 1.5%). Durante el

homogeneizado mantenga la muestra en hielo y evite la formacin de espuma (caracterstica de un

exceso de molido).



2. Centrifugue a 200 xg, por 5 min. a 4 C.

3. Subyaciendo (es decir desde la parte de abajo) a la muestra agregue lentamente un volumen de TEK-

15% sacarosa.

4. Centrifugue (1,500 xg por 10 min. a 4C) y obtenga el precipitado (obscuro- ncleos) y el

sobrenadante (claro- mitocondrias).

5. Para concentrar el precipitado o el sobrenadante, por separado (no los revuelva), centrifugue a

14,000 x g durante 1:30 hora a 4 C y elimine el sobrenadante.

6. Resuspenda el precipitado con 10 ml de TEK y repita la centrifugacin a 14,000 xg por 30 minutos.

7. En caso de que el sobrenadante este turbio o con pigmentos, repita el paso 6.

9. Resuspenda el precipitado con TEK (mitocondrias en 0.9 ml por cada 5 gr. de teji do inicial) y conserve

en congelador, correctamente etiquetado, posteriormente para observar los orgnelos en microscopio,

tia con verde de malaquita, y para extraer ADN, utilice cualquiera de los protocolos.


Describa en cada protocolo lo que sucede en cada paso.

Analice cada uno de los pasos, con base en la informacin terica de la prctica, es decir interprete lo

que se hace en cada paso.

Con base en el anlisis, describa puntualmente lo que aprendi.



Tercera parte: Respiracin

Respiracin:

1. Marque en una curva del tubo en forma de "S", una escala, utilizando un marcador y una regla.

2. En una gradilla coloque tres tubos de ensayo y prepare el sistema, colocando el tubo S en un tapn,

sellando cualquier posible fuga y en la curva lejana del tubo coloque unas gotas de colorante. Marque

los tubos 1, 2, 3 y llnelos del siguiente modo:

Tubo 1 = 1 ml de sacarosa (2% p/v)+ 1 ml de suspensin de levadura.

Tubo 2 = 1 ml de galactosa (2% p/v)+ 1 ml de suspensin de levadura.

Tubo 3 = 1 ml de agua + 1 ml de suspensin de levadura.

2. Mezcle las soluciones. En cada tubo coloque el tapn horadado al cual previamente le coloco el tubo

en forma de "S". El tapn debe quedar bien sellado con parafilm.

Anote cualquier cambio que observe en la mezcla.

El gas producido se acumular en el extremo cerrado del tubo "s". Registre el nivel del gas cada minuto

por alrededor de 20 min. Anote los datos en una tabla.


Describa en cada protocolo lo que sucede en cada paso.





Las levaduras son procariotas o eucariotas?

En qu partes de la clula de levadura ocurre la gluclisis?

El tipo de carbohidrato fermentado afecta la tasa formacin de gas?

Qu tipo de carbohidrato sustent la tasa ms rpida de fermentacin?

Qu molcula es desdoblada en la reaccin que produce el CO2?

Por qu es ventajoso para un organismo realizar fermentacin?


Complemento: Uso de los micropipeteadores automticos

Materiales y equipos requeridos:

Puntas de pipeteador automtico

Pipeteas Pasteur

Pipetas de diferentes medidas

Minifuga

Pipeteadores automticos

Pistones para pipetas

METODOLOGIA:

Ejercicio a:

- Deposite los siguientes volmenes (en microlitros):

Tubo Solucin I

(agua)

Sol. II

(aceite)

Sol. III

(alcohol)

1 40 15 ---

2 40 --- 40

3 40 10 10

- Centrifugue

- Extraiga las fases y anote los volmenes recuperados.



Ejercicio b:

- Deposite en un trozo de papel aluminio los siguientes volmenes:

Muestra Solucin I

(agua)

Sol. II

(aceite)

Sol. IV

(colorante)

1 4 --- 2

2 4 4 2

- Homogenece y solo coloque el agua con el colorante en el pozo del gel, en la muestra 2, tenga cuidado

de no agregar aceite

Ejercicio c:

- Deposite los siguientes volmenes en un tubo (en microlitros):

Tubo Solucin I

(agua)

Sol. II

(aceite)

Sol. III

(alcohol)

1 0.5 0.5 ---

2 0.5 --- 0.5

3 0.3 0.3 0.4

- Centrifugue y extraiga el volumen completo, que en los tres ejercicios debe ser de 1 microlitro

Ejercicio d:

Para cada pipeteador:

1.- En una balanza coloque un recipiente (acorde a los volmenes que posteriormente se manejaran)

2.- Acorde al pipeteador, tome el menor volumen posible de agua destilada y coloque en el recipiente

que tiene en la balanza, anote el resultado.

3.- En eventos independientes, tome al menos 4 volmenes diferentes de agua destilada y colquelo en

el recipiente que tiene en la balanza, anote el resultado.

4.- Grafique el resultado para cada pipeteador, anotando el nmero de inventario del equipo.



Con pipetas de gran volumen (mayor del mL)

Para las siguientes sesiones prcticas tambin se requiere un dominio de las tcnicas de pipeteo de

grandes volmenes, por lo que se plantean solo recomendaciones especficas:

Nunca se aspire con la boca.

No moje los pistones con los reactivos.







PRCTICA 5: Observacin de clulas asociadas a la divisin celular

INTRODUCCION:

En una primera parte se busca promover el desarrollo de habilidades para la observacin de l os estadios

de mitosis. Posteriormente la identificacin de clulas reproductivas de organismos dioicos.




Revise los estadios de la mitosis y meiosis, esquematcelos y resuma las caractersticas de cada estadio.

OBJETIVO: Utilizando como herramienta el microscopio, reconocer morfolgicamente clulas que se

encuentren en los diferentes estadios de divisin celular.

Materiales y Equipos

Estuche de diseccin

Cubreobjetos

Portaobjetos

Vaso de precipitado de 50 ml

Navaja

laminillas

Microscopio compuesto

Termoplato

METODOLOGIA:

Primera parte: Examinando Clulas de Levadura 1.- Mezcle un poco de azcar en agua con levaduras y deje por unos 5 minutos la mezcla. Usando una

pipeta Pasteur, transferir varias gotas de levaduras a un portaobjetos. Agregar una gota de rojo neutro y

colocar el cubreobjetos. Usar aumento (40 X) para observar la levadura.

2.- Bajo condiciones ptimas, las levaduras se multiplican por gemacin, que involucra un proceso en el

citoplasma con un subsiguiente desprendimiento de una nueva clula. Busque en su preparado, clulas

con yemas.



Segunda parte: Observacin de mitosis Al menos una semana antes de la sesin, escoja una cebolla fresca de 5 a 7 cm de dimetro. Quite las

races y fibras secas de la base del bulbo.

1. Inserte 3 palillos de forma que la cebolla se pueda suspender en un vaso o recipiente con agua, de tal

forma que las races toquen continuamente el agua.

2. Procedimiento de tincin:

a. Elija de la cebolla una o varias races completa. La regin de mayor inters es la apical (zona de

crecimiento).

b. Con la hoja de afeitar de un solo filo corte la mitad inferior de la punta de una raz. Pngala en un vaso

pequeo y cbrala con colorante de acetocarmin. Caliente paulatinamente el vaso con el colorante de 3

a 5 minutos, evitando que el lquido hierva.

c. Corte la parte ms intensamente teida de la punta de la raz y colquela en un portaobjetos,

agregndole una gota de acetocarmin. Corte la raz en pequeos trozos y cbrala con un portaobjetos.

Coloque papel absorbente sobre la preparacin y con el borrador de un lpiz presione firmemente, para

convertir el material en una capa delgada, evitando resbale el cubreobjetos. Limpie el exceso de

colorante con papel.

d. Localice en la preparacin a las clulas que presenten estructuras filamentosas teidas ms

intensamente.

e. Localice y esquematice una clula que se encuentre en: a) Interfase. b) Profase. c) Metafase. d)

Anafase. e) Telofase. Preste especial atencin en la forma y disposicin de los cromosomas.

Considerando que la mayora de las clulas que se observen estarn en interfase, se recomienda ser

persistente en la bsqueda de los diferentes estadios de la mitosis.


Analice cada uno de los pasos, con base en la informacin terica de la prctica, es decir i nterprete lo

que se hace en cada paso. Esquematice lo observado en el microscopio. Con base en el anlisis, describa

puntualmente lo que aprendi.

Tercera parte: Meiosis OBJETIVO: Identificar clulas gamticas y en diferentes estadios meiticos

Material y equipos:

Muestras de esperma

tubos cnicos de centrfuga de 15 mL



pipetas Pasteur con bulbo.

pipetas graduadas de 5 mL

caja de Petri

Porta y cubre objetos

Estuche de diseccin

Solucin Wright

Fijador "buffer"

Aceite de inmersin

Preparaciones permanentes de diferentes tejidos gamticos

Microscopio

METODOLOGIA:

NOTA IMPORTANTE PARA LA PRACTICA SE TENDRAN DISPONIBLES LAMINILLAS DE GONADAS DE

DIFERENTES TIPOS DE ORGANISMOS NO SERA NECESARIO SACRIFICAR A UN ORGANISMO

Por otro lado, ser muy interesante contar con donadores de esperma para observar los espermas en

vivo

Observacin de espermas en vivo

1. A partir de la muestra donada, tome una gota de semen y depostelo en un portaobjetos.

2. Coloque un cubreobjetos y observe con los menores aumentos, utilizando la menor cantidad de luz

posible.

3. Observe las clulas, con el mayor aumento de 100x utilizando adecuadamente el aceite mineral, la

iluminacin Klher y optimizando la iluminacin,

4. Esquematice lo observado.

Tincin Wright

Preparacin de laminillas

1. Con una pipeta Pasteur tomar una muestra de esperma y colocar una gota en un extremo de un

portaobjetos.



2. Con el extremo de un segundo portaobjetos distribuir la muestra de manera homognea a manera de

frotis, repartiendo lo mejor posible la muestra.

3. Agregar 3 gotas de solucin Wright y cubriendo el portaobjetos en el interior de una caja Petri.

4. Esperar 5 minutos

5. Agregar 3 gotas del fijador "bfer".

6. Esperar 7 minutos.

7. Lavar con agua destilada.

8. Secar al aire.

9. Observar al microscopio

Observacin de laminillas

1. Observe el tejido utilizando los menores aumentos, hasta localizar zonas donde se puedan identificar

claramente a las clulas.


3. Utilizando la iluminacin Klher y optimizando la iluminacin, observe las clulas, procurando

identificar orgnelos internos, especialmente del sistema de membranas.




Observacin de laminillas

1. En cada una de las laminillas procure reconocer los diferentes tipos de gametos. Utilice el microscopio

a 100x.


Esquematice sus observaciones e intrprete lo observado.



PRCTICA 6: Tecnologa de ADN

INTRODUCCION: En una primera parte se practicaran diversos protocolos de extraccin de ADN para posteriormente

evaluar su calidad y cantidad utilizando mtodos electroforticos. Con el objetivo de buscar la mayor

racionalizacin en las actividades que se desarrollaran se explican los pasos de las metodologas que se

utilizarn.



Generalidades de los protocolos.

El primer paso de los mtodos moleculares, aplicados a los estudios poblacionales es la extraccin del

ADN. En la extraccin de cidos nuclecos, existen cinco etapas principales: 1) conservacin de tejidos, 2)

homogenizacin de tejidos, 3) degradacin y eliminacin de compuestos orgnicos diferentes al ADN o

ARN, 4) precipitacin de los cidos nucleicos y 5) resuspensin y conservacin.

Conservacin

Para la conservacin de tejidos existen diversas alternativas, las cuales son utilizadas de acuerdo a las

condiciones especficas de trabajo. La tcnica de mayor eficacia es la de crio-conservacin en nitrgeno

lquido, pero lamentablemente es la que presenta una mayor dificultad en su aplicacin, ya que son

requeridos recipientes especiales y facilidades para la adquisicin del nitrgeno lquido.

Una alternativa fcil de aplicar en cualquier lugar de Mxico, es la combinacin entre el uso de Hielo

seco (dixido de carbono comprimido), para el transporte de muestras hasta el laboratorio y la

conservacin en ultracongelador a temperaturas menores de -70 C. Con el hielo seco tambin se

pueden congelar rpidamente las muestras, ya que al ponerlo en contacto con alcohol o ter, disminuye

notablemente la temperatura y para proteccin de las muestras solo se requieren utilizar bolsas de

plstico. En trabajo de campo, se recomienda poner en una bolsa de plstico a la muestra, la cual se

introduce en otra bolsa, a la que se le agrega el hielo seco y el alcohol, resultando una reaccin

inmediata que literalmente congela a la muestra.

Otras alternativas, incluyen el uso de etanol, con el que se deshidrata rpidamente la muestra, o

soluciones hipersalinas con DMSO al 20% y en casos especiales la deshidratacin con el sol as como con

otros agentes castrantes de la humedad.



Homogenizacin

Para facilitar la degradacin de los tejidos, sin daar los cidos nucleicos, podemos combinar el uso de

mtodos fsicos con los qumicos. El ms eficiente de los mtodos fsicos, involucra la congelacin de la

muestra y su posterior macerado en un mortero precongelado. La congelacin ms recomendable se

logra con nitrgeno lquido y como mtodo alternativo, con el uso de hielo seco y etanol.

Debido a las dificultades operativas de estas tcnicas, es posible utilizar homogeneizadores de vidrio

(Potter Elvehjen) y lo ms comn, es el macerado con una navaja sobre una superficie slida, como

podra ser un portaobjetos.

Posteriormente se aplican mtodos de homogenizado qumico, con detergentes (para desnaturalizar los

lpidos) y enzimas que facilitan la degradacin de las protenas (como proteinza K). Con soluciones

amortiguadoras se mantienen las condiciones salinas (con KCl 1 mM) y de pH neutro en la muestra (Tris-

HCl, 0.25mM, pH 7.8 a 8.0). Adicionalmente se agrega EDTA (0.02 a 1.0 mM), como agente castrante de

los iones magnesio y calcio, requeridos para la accin de las exonucleasas que degradan los cidos

nucleicos.

Para garantizar una adecuada reaccin, los tejidos macerados, se colocan en tubos de 1.5 ml, con el

amortiguador (TES, TEK o TEN), el detergente (comnmente SDS al 0.2 % u otros detergentes no inicos

como el IGEPAL) y protenas K, posteriormente se tapan hermticamente y se mantienen en agitacin

constante, con temperaturas desde la ambiental (TA) hasta los 65 C. Cabe aclarar que el tiempo de

digestin qumica, vara dependiendo de la naturaleza del tejido y la tcnica de conservacin,

ocupndose desde una hasta veinticuatro horas. Los tiempos y cantidades de reactivos se deben

estandarizar, buscando evitar la sobre digestin por efecto de las exonucleasas.

Otros agentes utilizados en el homogenizado qumico son la albumina (al 0.5% para remover cidos y

fosfolpidos), sorbitol o manitol (balance inico), carbonato de sodio (controlar la concentracin de

sales), sacarosa (mantener la densidad del medio).



Degradacin y eliminacin de compuestos orgnicos

Para la degradacin de los compuestos orgnicos, generalmente se utiliza fenol estabilizado, cloroformo

estabilizado con alcohol isomlico o cloroformo. Dependiendo de la tcnica de conservacin as como

de las condiciones y tipo de tejido, se elige la tcnica ms adecuada. Para la eliminacin de los

compuestos, en cada paso se utilizan tcnicas de centrifugacin, con velocidades superiores a 10,000 xg

con tiempos superiores a los 5 minutos.

Precipitacin de los cidos nucleicos

Despus de la eliminacin de los compuestos orgnicos, en solucin quedan los cidos nucleicos, debido

a su alto gradiente de sedimentacin en agua (o en el amortiguador). Para precipitarlos, a la solucin se

le incrementa notablemente la salinidad (con acetato o cloruro de sodio) y se le agrega alcohol y

posteriormente es centrifugado en velocidades superiores a 10,000 xg por ms de 10 minutos.

Cabe aclarar, que comnmente son utilizados dos tipos de alcohol, el etanol y el isopropanol. Con

etanol, se necesita facilitar la precipitacin utilizando temperaturas bajas por largos periodos (la noche a

-20 C o una hora a -70 C). En algunos casos, pueden requerirse sucesivos lavados con alcohol, para

eliminar las sales.

Una vez formado el precipitado (el cual puede no observarse a simple vista), se elimina el alcohol, por

centrifugacin, decantacin y evaporacin. El precipitado de los cidos nucleicos, en caso de que se

observe, pasara de un color blanquecino, cuando est hmedo, a uno semi transparente, cuando est

totalmente seco. Es importante eliminar totalmente el alcohol y las sales, ya que pueden interferir con

las reacciones posteriores.

Resuspensin y conservacin

Para la resuspensin, es prudente considerar el uso que se le dar al ADN. En el caso de requerir la

muestra por unos cuantos das, para PCR (reaccin de polimerasas en cadena, por sus siglas en ingles), el

precipitado obtenido previamente puede resuspenderse en agua que preferentemente haya sido

destilada, desionizada, nanopurificada y esterilizada (H20ddue).

Para un aplicacin general se conserva en TE y en algunos casos es recomendable agregarle enzimas que

degraden el ARN, como la ARNaza. La posterior conservacin se realiza a bajas temperaturas, como la de

-20 C cuando se utilizara en las siguientes semanas, o a -80 C para mantenerla por meses o incluso

aos.

Los protocolos especficos para la extraccin del ADN dependern de las muestras y costos de extraccin

permisibles (en tiempo y esfuerzo), que van desde unos cuantos pesos hasta decenas de pesos. En el

primer caso, con costos muy bajos, encontramos las tcnicas de extraccin fenlica o de cloroformo que

requieren al menos unas 4 horas de dedicacin.



En el mercado existen juegos comerciales, con un costo de alrededor de 3 a 6 veces el equivalente al de

una extraccin convencional, pero que requieren generalmente una hora de trabajo en laboratorio y

generalmente con una mayor garanta de reproducibilidad.

Generalidades de la electroforesis

La electroforesis es el movimiento de partculas elctricamente cargadas a travs de un gas o lquido

como resultado de un campo elctrico formado entre unos electrodos sumergidos en el medio. En

nuestro caso, la tcnica se aplica para la separacin por tamao de los fragmentos en l os cidos

nucleicos. Por efecto de la corriente elctrica directa, las molculas se mueven a travs de una matriz

inerte (de polmetros de agarosa o acrilamida), que se encuentra en un amortiguador, todos estos

durante un tiempo determinado.

Considerando las caractersticas de las muestras, son diversas las variables que intervienen en la

electroforesis y que es necesario controlar. Las principales a considerar son: caractersticas de la

muestra, corriente elctrica (Volts, Watts y Amperes), amortiguador, matriz (tipo y concentracin) y

otros reactivos.- al final de la pgina, se presenta una mayor explicacin.

Descripcin de la electroforesis

La electroforesis es el movimiento de partculas elctricamente cargadas a travs de un gas o lquido

como resultado de un campo elctrico formado entre unos electrodos sumergidos en el medio. En

nuestro caso, la tcnica se aplica para la separacin por tamao de los fragmentos en los cidos

nucleicos. Por efecto de la corriente elctrica directa, las molculas se mueven a travs de una matriz

inerte (de polmetros de agarosa o acrilamida), que se encuentra en un amortiguador, todo esto durante

un tiempo determinado.



Considerando las caractersticas de las muestras, son diversas las variables que intervienen en la

electroforesis y que es necesario controlar. Las principales a considerar son: caractersticas de la

muestra, corriente elctrica (Volts, Watts y Amperes), amortiguador, matriz (tipo y concentracin) y

otros reactivos.

Caractersticas de la muestra

Previo a la realizacin de una electroforesis, se debe tener una idea del tamao de los fragmentos, para

tomar adecuadas decisiones en las variables a controlar. La informacin requerida es mnima y puede

ser subjetiva, separando los tamaos de las molculas en tres categoras simples:

Tamaos grandes, fragmentos mayores de 2,000 pares de bases (pb)

Tamaos medianos, de entre 500 y 5,000 pb

Tamaos pequeos, menores de 1,000 pb

Corriente elctrica

Las tres variables a considerar

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