Manual Bio. Mol 2011

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN

Facultad de Ciencias Químicas

Biología Molecular

Manual de Laboratorio

Bioq. Clín. Mª Cristina Romero R.

Jefe de Trabajos Prácticos de Área

2011



Tabla de contenidos

CONSIDERACIONES GENERALES ........................................................................................... 4

Introducción ................................................................................................................................. 4 Normas generales del laboratorio ................................................................................................... 5

Normas de bioseguridad ............................................................................................................... 5

Reglamento de evaluación ........................................................................................................... 6 La evaluación global ............................................................................................................... 6 Lista de cotejo ......................................................................................................................... 6 Observaciones ......................................................................................................................... 6 Cronograma de Clases ............................................................................................................ 7

Partes del informe de laboratorio ................................................................................................. 8 Las partes de un informe técnico del laboratorio son: ................................................................. 8

Referencias bibliográficas ............................................................................................................ 9 PRÁCTICA Nº 1 ........................................................................................................................... 10 AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS ............................................................................. 10

Objetivo general ......................................................................................................................... 10

Objetivos específicos ................................................................................................................. 10 Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 10

PRÁCTICA Nº 1.1 ........................................................................................................................ 10

AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS BACTERIANO ................................................... 10 Objetivo general ......................................................................................................................... 10

Objetivos específicos ................................................................................................................. 10 Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 11

Materiales y Reactivos. ......................................................................................................... 12

Procedimiento. ...................................................................................................................... 12

Resultados ............................................................................................................................. 13 Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 13 Referencias bibliográfica ........................................................................................................... 13

PRÁCTICA Nº 1.2 ........................................................................................................................ 14 EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO ANIMAL............................................................. 14

Objetivo general ......................................................................................................................... 14 Objetivo general ......................................................................................................................... 14 Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 14

Materiales y Reactivos .......................................................................................................... 14 Procedimiento ....................................................................................................................... 14

Resultados ............................................................................................................................. 15 Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 15 Referencias bibliográficas .......................................................................................................... 15

PRÁCTICA Nº 1.3 ........................................................................................................................ 16 EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO VEGETAL .......................................................... 16

Objetivo general ......................................................................................................................... 16 Objetivo general ......................................................................................................................... 16

Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 16 Mini preparación de ADN de soja ............................................................................................. 16

Materiales y Reactivos .......................................................................................................... 16 Procedimiento ....................................................................................................................... 16 Resultados ............................................................................................................................. 18

Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 18 Referencias bibliográfica ........................................................................................................... 18

Bioquímica

3

PRÁCTICA Nº 2 ........................................................................................................................... 19 CUANTIFICACION DE ADN ..................................................................................................... 19

Objetivo general ......................................................................................................................... 19 Objetivo específico ..................................................................................................................... 19 Fundamentos teórico teóricos de la práctica .............................................................................. 19 Cuantificación de ADN .............................................................................................................. 19

Materiales y Reactivos .......................................................................................................... 19 Procedimiento ....................................................................................................................... 20 Resultados ............................................................................................................................. 20

Método de eliminación de Residuos .......................................................................................... 20 Referencias bibliográficas .......................................................................................................... 20

PRÁCTICA Nº 3 ........................................................................................................................... 21 ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA ........................................................................... 21

Objetivo general ......................................................................................................................... 21 Objetivos específicos .................................................................................................................. 21

Fundamentos teóricos de la práctica .......................................................................................... 21 Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% .................................................................................... 22

Materiales y reactivos ........................................................................................................... 22 Procedimiento ....................................................................................................................... 22

Resultados ............................................................................................................................. 23 Método de eliminación de residuos ............................................................................................ 23 Referencia bibliográfica ............................................................................................................. 23

PRÁCTICA N° 4........................................................................................................................... 24 REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA ................................................................... 24

Objetivo general ......................................................................................................................... 24

Objetivos específicos .................................................................................................................. 24 Fundamento teórico de la práctica .............................................................................................. 24

Reacción en cadena de polimerasa de Glicine max. .................................................................. 24

Materiales y reactivos ........................................................................................................... 24

Procedimiento ....................................................................................................................... 25 Resultados ............................................................................................................................. 28

Método de eliminación de residuos ............................................................................................ 28 Referencias bibliográfica ............................................................................................................ 29

ANEXOS ....................................................................................................................................... 30 Anexo 1: Verificación de la calibración de pipetas automáticas................................................ 30

Anexo 2 ......................................................................................................................................... 33 Normograma para la determinación de la Fuerza Centrifuga Relativa ......................................... 33 Anexo 3 ......................................................................................................................................... 34

Como convertir textos de Word a PDF ...................................................................................... 34



CONSIDERACIONES GENERALES

Introducción La Biología Molecular es el estudio de la vida a un nivel molecular. Está relacionada con otros

campos de la Biología y la Química, particularmente Genética y Bioquímica. La biología molecular

concierne principalmente al entendimiento de las interacciones de los diferentes sistemas de la célula, lo

que incluye muchísimas relaciones, entre ellas las del ADN con el ARN, la síntesis de proteínas, el

metabolismo, y el cómo todas esas interacciones son reguladas para conseguir un afinado

funcionamiento de la célula.

Al estudiar el comportamiento biológico de las moléculas que componen las células vivas, la

Biología molecular roza otras ciencias que abordan temas similares: así, p. ej., juntamente con la

Genética se interesa por la estructura y funcionamiento de los genes y por la regulación (inducción y

represión) de la síntesis intracelular de enzimas y de otras proteínas. Con la Citología, se ocupa de la

estructura de los corpúsculos subcelulares (núcleo, nucléolo, mitocondrias, ribosomas, lisosomas, etc.) y

sus funciones dentro de la célula. Con la Bioquímica estudia la composición y cinética de las enzimas,

interesándose por los tipos de catálisis enzimática, activaciones, inhibiciones competitivas o alostéricas,

etc. También colabora con la Filogenética al estudiar la composición detallada de determinadas

moléculas en las distintas especies de seres vivos, aportando valiosos datos para el conocimiento de la

evolución.

Sin embargo, difiere de todas estas ciencias enumeradas tanto en los objetivos concretos como en los

métodos utilizados para lograrlos. Así como la Bioquímica investiga detalladamente los ciclos

metabólicos y la integración y desintegración de las moléculas que componen los seres vivos, la Biología

molecular pretende fijarse con preferencia en el comportamiento biológico de las macromoléculas

(ADN, ARN, enzimas, hormonas, etc.) dentro de la célula y explicar las funciones biológicas del ser vivo

por estas propiedades a nivel molecular.

Bioquímica

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Normas generales del laboratorio

1º. El horario de laboratorio es como sigue:

A confirmar

2º. Durante la permanencia en el Laboratorio el estudiante deberá obligatoriamente llevar puestos:

guardapolvo largo de color blanco y con mangas largas, cofia, guantes, calzados cerrados.

3º. No se permitirá el acceso al laboratorio a los estudiantes que no dispongan o no hagan uso de los

objetos antes mencionados.

4º. Solo permanecerán en el laboratorio dentro de sus horarios estipulados y con el consentimiento

explicito del profesor

5º. Está prohibido fumar, comer y beber dentro del laboratorio.

6º. Los materiales a utilizar en la práctica serán prestados y utilizados por grupos de alumnos según la

distribución realizada por el docente el primer día de práctica.

7º. Los alumnos deberán tener durante todas las prácticas los materiales propios y materiales de

limpieza.

8º. Las mesadas de trabajo, las campanas, las balanzas y sus alrededores deben conservarse limpios en

todo momento, cualquier producto que se derrame deberá retirarse inmediatamente.

9º. Las balanzas deben dejarse a cero después de finalizar la operación de pesada y limpiarlas de todo

resto de material químico.

10º. En el espacio de laboratorio destinado a las balanzas analíticas solo deben permanecer los alumnos

que se encuentren pesando (uno por balanza).

11º. Antes de dar por finalizada cada práctica, se realizara una conclusión general sobre los resultados

obtenidos en la práctica en donde el alumno debe consultar al profesor sobre la calidad de los

mismos.

12º. Cada grupo deberá presentar un informe de cada práctica realizada, el cual será entregado una

semana después de realizada la práctica y siguiendo el modelo proporcionado.

13º. Los alumnos que incurrieren en alguna falta en los siguientes puntos serán sancionados:

Por llegada tardía:

Llegada Tardía se considera luego 10min de iniciada la práctica.

Será evaluado ese día en lista de cotejo con dos puntos menos del puntaje total del día, en el ítem

de de puntualidad.

Tres llegadas tardías se considerarán como una ausencia, debiendo recuperar la última práctica a

la que ha llegado tarde en otra fecha.

Por incumplimiento de normas de bioseguridad:

Amonestaciones verbales.

Disminución del puntaje en lista de cotejo en el ítem bioseguridad.

Suspensión por unas horas

Por incumplimiento en la entrega de informes en la fecha asignada:

Excluirá al alumno en cuestión de la realización de la práctica asignada a ese día.

Normas de bioseguridad

1. Antes de utilizar un reactivo, asegurarse bien de que es el que se necesita, familiarizarse

con las claves criptográficas que expone de tal manera a tomar a trabajar en las

condiciones que requiere dicho reactivo y así evitar accidentes.

2. No pipetear con la boca, utilizar la propipeta.

3. Recordar que al preparar una dilución partiendo de ácidos concentrados, se debe colocar

el acido sobre el agua, nunca en el orden inverso.

4. Los productos inflamables (alcohol, éter, etc.) no deben estar nunca cerca de fuentes de

calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se harán siempre a baño María,

nunca directamente a la llama.



5. Numerosas sustancias orgánicas e inorgánicas son corrosivas o se absorben fácilmente

por la piel, produciendo intoxicaciones o dermatitis, por lo que se ha de evitar su contacto

directo; si esto ocurriera, deberá lavarse inmediatamente con abúndate agua la parte

afectada.

6. Si se rompe algún material de vidrio durante el desarrollo de la práctica, se deberá

desechar en un contenedor de materiales punzocortantes.

7. A continuación se dan algunas recomendaciones para el manejo de algunas sustancias

específicas más utilizadas en el laboratorio:

a. Acido nítrico (HNO3): El ácido nítrico es una sustancia corrosiva que cuando

entra en contacto con los ojos puede provocar dolor, enrojecimiento y

quemaduras profundas graves.

b. Acido sulfúrico (H2SO4), Clorhídrico (HCl): Las soluciones

concentradas lesionan rápidamente la piel y los tejidos internos. En caso

de entrar en contacto lavar con abundante agua la zona afectada y acudir al

médico.

Reglamento de evaluación La asistencia a todas las sesiones de laboratorio son obligatorias (100% de asistencia)

Las faltas o inasistencias por enfermedad o causas muy graves, serán recuperables hasta 1 (una)

práctica, previa presentación del certificado médico en caso de enfermedad o de una nota dirigida a la

Jefatura de Trabajos Prácticos mencionando el motivo de la ausencia.

La hora de entrada a las prácticas es a las 08:00 hs los días martes y a las 13:00hs los días jueves, se

sancionará cada llegada tardía con 2 puntos menos en lista de cotejo del día.

El alumno queda excluido de rendir la prueba pre- laboratorio del día en el caso de que llegue luego de

los 10min de tolerancia.

La evaluación global

* Lista de cotejo: 10

* Informes: 10

* Prueba pre- laboratorio: 20

* Seminario: 10

* Exámenes parciales : 50

Total 100 puntos

Lista de cotejo

Los puntos a ser evaluados en la lista de cotejo son:

Puntualidad: 2 puntos

Bioseguridad: 2 puntos

Trabajo en clase: 3 puntos

Orden y limpieza: 2 puntos

Respeto: 1 punto

Total: 10 puntos

Observaciones

- La lista de cotejo se evaluará todos los días de trabajo, y al finalizar las prácticas del semestre

se promediará las puntuaciones para cada alumno en forma individual.

- Las pruebas cortas de laboratorio se tomaran al inicio de cada jornada de práctica, los temas a

evaluar son sobre la practica a ser desarrollada en el día.

- Los temas de a ser evaluados en los exámenes parciales serán informados por el profesor una

semana antes de las pruebas.

Bioquímica

7

Cronograma de Clases

Plan 3

T. P. Nº TEMA A DESARROLLAR FECHA

Martes

1 Presentación del laboratorio

Indicaciones generales y reglamento

Formación de grupos.

Introducción teórica

Aislamiento y purificación de Ácidos nucleícos.

22 de febrero

2 Introducción teórica

Técnica de extracción de ADN bacteriano, tejido animal y vegetal

Cuantificación de ADN.

8 de marzo

3 Preparación de reactivos para:

Aislamiento y purificación de Ácidos nucleicos y Corrida electroforética

Extracción de ADN bacteriano Extracción de ADN de tejido animal

G1

15 de marzo



Extracción de ADN bacteriano Extracción de ADN de tejido animal

G2

22 de marzo

5 Extracción de ADN de tejido vegetal

Cuantificación de ADN G1

29 de marzo

6 Primer examen parcial G2 yG1

5 de abril

7 Extracción de ADN de tejido vegetal

Cuantificación de ADN G2

12 de abril

8 Electroforesis en gel de agarosa G1

19 de abril

9 Electroforesis en gel de agarosa G2

26 de abril

10 Introducción teórica a las técnicas de reacción en cadena de polimerasa

Reacción en cadena de polimerasa G1 y G2

3 de mayo

11 Seminario (Discusión y análisis de articulo) G1

10 de mayo

12 Seminario (Discusión y análisis de articulo) G2

17 de mayo

13 Introducción a la Bioinformática. Uso de bases de datos para el análisis de secuencias de

ADN G1 y G2

24 de mayo

14 Segundo examen parcial G1 y G2

31 de mayo

Plan 2008

T. P. Nº TEMA A DESARROLLAR FECHA

Martes Jueves

1 Presentación del laboratorio

Indicaciones generales y reglamento

Formación de grupos.

Introducción teórica

Aislamiento y purificación de Ácidos nucleicos.

22 de

febrero 3 de marzo

2 Introducción teórica

Técnica de extracción de ADN bacteriano, tejido animal y vegetal

Cuantificación de ADN.

8 de marzo 10 de

marzo



15 de

marzo

17 de

marzo

4 Extracción de ADN bacteriano 22 de

marzo

24 de

marzo

5 Extracción de ADN de tejido animal 29 de

marzo

31 de

marzo

6 Primer examen parcial 5 de abril 7 de abril

7 Extracción de ADN de tejido vegetal 12 de abril 14 de abril

8 Cuantificación de ADN 19 de abril Semana

Santa

9 Electroforesis en gel de agarosa 26 de abril 28 de abril



10 Introducción teórica a las técnicas de reacción en cadena de polimerasa

Reacción en cadena de polimerasa

3 de mayo 5 de mayo

11 Seminario (Discusión y análisis de articulo) 10 de mayo 12 de mayo

12 Introducción a la Bioinformática. Uso de bases de datos para el análisis de secuencias de

ADN

17de mayo 19 de mayo

13 Segundo examen parcial 22 de mayo

Partes del informe de laboratorio Una parte importante del desarrollo científico es la divulgación de los hallazgos. Mediante esta

divulgación, conocemos lo que otros han hecho y podemos fortalecer nuestra gestión, como

científicos. La base de la divulgación es el informe técnico o informe de laboratorio. A través de este

informe se puede resumir lo realizado para contestar, al menos, cinco preguntas clave:

¿Cuál es la situación sobre la cual se experimentara? (Introducción)

¿Por qué se hizo el ejercicio de laboratorio? (Objetivos)

¿Cómo se llevó a cabo el ejercicio? (Materiales y métodos)

¿Cuáles fueron los datos obtenidos ¿ (Resultados)

¿Qué importancia o significado tienen los resultados? (Discusión y conclusiones)

Es importante señalar que en cualquier experimento se podrá obtener resultados diferentes a los

esperados. Después de todo, si se supiera los resultados de antemano, ¿para qué experimentar? Bajo

ningún concepto esto debe entenderse como un fracaso. Más aún, es mediante el análisis y la

experimentación repetida que se trata de entender. Muchos hallazgos de valor en las ciencias naturales

se dieron por “accidentes” o casualidades que ocurrieron a estudiosos que supieron determinar el

significado de los experimentos que condujeron.

El informe de laboratorio es el material que se presentará al profesor como prueba de haber realizado

el experimento. Dicho informe debe basarse en los datos y observaciones que se haya anotado en la

libreta de laboratorio. Dicho informe deberá ser entregado en la fecha acordada por el profesor.

Las partes de un informe técnico del laboratorio son:

1. Título: refleja en el contenido del experimento de forma que el lector pueda interesarse en la

lectura. El título debe ser corto pero informativo.

2. Lista de autores: todos aquellos que participaron en la redacción, diseño o realización del

experimento deben aparecer como autores del trabajo. Es importante que todos los miembros del

grupo sean reconocidos.

3. Resumen: el resumen debe contener información suficiente sobre la introducción, los materiales

y métodos, los resultados y la discusión. No debe pasar de un párrafo.

4. Introducción: debe ser una descripción breve de lo que se conoce con relación al problema bajo

estudio, de modo que el lector sepa qué se ha hecho y qué se sabe con relación al problema. La

introducción debe exponer claramente por qué es necesario completar el experimento que se

propone realizar e incluir los objetivos. Estos objetivos deben ser redactados antes de hacer el

experimento, y deben ser realistas en términos de tiempo y capacidad analítica del laboratorio. La

introducción deberá ser lo más breve posible y su longitud también será evaluada por el

instructor.

5. Materiales y métodos: esta parte del informe recoge la manera en que se condujo el experimento

para contestar las preguntas formuladas o alcanzar los objetivos propuestos. La manera en que se

redacta esta parte del informe debe ser tan clara como para que cualquier otra persona, con acceso

a los mismos reactivos y materiales, pueda obtener resultados similares. Este concepto se conoce

como reproducibilidad y es una idea clave en las ciencias naturales. Los materiales y métodos

deben aparecer de forma resumida detallando lo que se hizo, cómo se hizo y en qué forma se hizo

(por ejemplo, se añadió 5 mL de agua al tubo que contenía el reactivo de precipitación y se

mezclo por 30 segundos). Si se utiliza un instrumento especifico (puede haber más de uno en el

salón) se debe mencionar en el informe cuál fue el modelo utilizado.

6. Resultados: esta parte del informe recoge, precisamente, los datos que se generaron del

experimento. Es importante reconocer que no necesariamente estos resultados deben concordar

con lo que se esperó Siempre que se pueda, debes presentar los datos en forma gráfica (tablas o

cuadros, gráficas o dibujos). Estos permite la representación concisa y clara de muchos datos en

poco espacio. Se debes incluir en el informe de laboratorio las fórmulas y cálculos matemáticos

Bioquímica

9

utilizados para obtener los resultados.

7. Discusión de los resultados: en esta parte del informe se debe explicar los resultados y cuál es su

significado. Siempre que sea posible, debes comparar los resultados obtenidos con los resultados

esperados y tratar de explicar las posibles razones para las discrepancias entre las cifras. Es aquí

que se podrá demostrar la capacidad analítica e intuitiva.

8. Referencias: se debe citar las referencias de todo lo que se haya usado para comparar, obtener

información o guiarte en la realización del experimento. Mínimo 2.

Es importante señalar que el trabajo de laboratorio en este curso permitirá desarrollar destrezas

analíticas que servirán para entender mejor los procesos biológicos y prepararán adecuadamente para

cursos futuros. En algunos casos dependerá de compañeros de grupo para obtener e interpretar los

datos obtenidos. Es muy importante que se intercambie y discuta resultados. Obtener el mejor

provecho a tu experiencia y acude a tu instructor en caso de dudas.

ENTREGA DE INFORMES

El informe se enviará en formato digital a la dirección de correo [email protected]. El informe

deberá ser presentado como documento “pdf”, en el ANEXO se explica cómo convertir documentos al

formato pdf.

El nombre del archivo pdf que se enviará deberá tener la siguiente estructura: “Informe N° 3 –

Grupo 3”. Esto significa que es el tercer informe del grupo 3.

LA LIBRETA DE LABORATORIO

La libreta de laboratorio que se utilizará durante todo el semestre y que el profesor podría

recoger en cualquier momento del semestre deberá:

1. Estar identificada con nombre, número de grupo y día de trabajo.

2. Tener las páginas enumeradas de antemano, no tener hojas sueltas y no tener páginas arrancadas.

3. Escrita con tinta (azul o negra), nunca con lápiz. Si es necesario corregir algún dato que ya se

anoto, se debe tachar pasando una sola raya sobre el error (de modo que el dato permanezca

legible) escribiendo el dato correcto al lado del dato erróneo y colocando tus iniciales sobre

ambos datos.

4. Tenerla siempre a mano. De esta manera, se podrá utilizar cada vez que se necesite anotar datos y

se evitará tener que anotarlos en hojas de papel sueltas o en la mano, de donde se pueden perder o

borrar fácilmente.

5. Recoger los datos que generen otros miembros del grupo y que sean necesarios para el análisis

fuera del salón de clases. Indicar sus nombres al lado del dato recogido.

6. El informe recoge el punto más significativo del trabajo que realizado y establece claramente qué

se hizo, quién lo hizo, por qué se hizo, cómo se hizo, cuáles fueron los resultados y cuál es el

significado de esos resultados.

Referencias bibliográficas 1. Benjamin Lewis. Genes VII. 7ª ed. 1999. Oxford University Press. USA

2. Nelson Portillo. Manual de trabajos prácticos de Biología Molecular. 2009



PRÁCTICA Nº 1

AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS

Objetivo general

Aislar ADN partiendo de distintas muestras biológicas.

Objetivos específicos

Adquirir conocimientos de extracción y purificación de ADN.

Comprender las diferencias existentes en el proceso de aislamiento de ADN dependiendo del

material biológico de partida.

Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad y de forma

ordenada.

Fundamentos teórico teóricos de la práctica

El ADN genómico puede obtener se a partir de cualquier microorganismo, planta o animal en

cualquier instante durante su desarrollo, y nos provee de copias moleculares de genes de cada

organismo. Este material puede entonces ser utilizado para la construcción de bibliotecas, en análisis

de hibridación, como molde en reacciones de amplificación y secuenciamiento, entre otras

aplicaciones.

Los métodos de aislamiento de ácidos nucleícos, sin importar de que tipo o procedencia,

siguen siempre cuatro etapas fundamentales: lisis de células, inhibición de nucleasas,

desproteinización y precipitación de ácidos nucleídos. La diferencia entre cada método radica en el

pre- tratamiento, lo cual dependerá del origen del material; además deberá tenerse en cuenta de que

el método de purificación tiene que ser perfectamente compatible con el uso futuro que se piensa dar

al ADN o ARN purificado.

El ADN puede aislarse mediante ruptura de tejidos, y luego explotando las diferencias en las

propiedades de los ácidos nucleícos, las proteínas y demás constituyentes celulares. Tras la lisis

celular, se trata de inhibir las nucleasas, que de otra forma degradarían el material a purificar, para

luego desproteinizar la muestra, ya sea mediante métodos químicos (solventes orgánicos, detergentes

no iónicos) o enzimáticos (proteasas).

Finalmente, los ácidos nucleícos son concentrados mediante precipitación en presencia de

etanol o isopropanol, y sales monovalentes como acetato de sodio o de amonio, a bajas temperaturas.

PRÁCTICA Nº 1.1

AISLAMIENTO DE ACIDOS NUCLEICOS BACTERIANO

Objetivo general

Extraer ADN de plásmido de una bacteria mediante el método de lisis alcalina y

conocer la importancia biológica de los plásmidos así como la de los vectores

moleculares como herramientas para el clonaje de genes.






ordenada.

Bioquímica

11


Fundamento.- El ADN genómico es fácil de aislar y caracterizar pero será de escasa utilidad a

menos de que sea de elevado peso molecular como para ser posteriormente manipulado mediante

tratamientos enzimáticos.

En el caso de las bacterias, el pre- tratamiento se lleva a cabo está destinado a la digestión

de la pared celular para liberar el contenido citosólico, para luego separar el cromosoma usando

sus propiedades diferenciales.

Un plásmido es una molécula de ADN circular, extracromosómico, bicatenario,

superenrollado, que se replica de forma independiente del genoma y que puede ser propagado en

una población. Los plásmidos han sido descritos en varios organismos como bacterias y hongos.

Aunque la función de la mayoría de los plásmidos descritos hasta ahora se desconoce, existen

algunos que pueden conferir ventajas selectivas al organismo que lo posee, como por ejemplo la

resistencia a agentes antimicrobianos. La presión selectiva que se induce al aplicar un antibiótico

no específico para el tratamiento de una infección en particular genera en algunos casos un

resultado contraproducente: al aplicar por ejemplo un antibiótico para el cual las bacterias

poseen un plásmido que les confiere resistencia al mismo, se está seleccionando precisamente

por una población bacteriana que sobrevive al tratamiento y que eventualmente puede

contraatacar causando una infección más difícil de controlar.

A su vez, al ser los plásmidos transmisibles entre poblaciones, las bacterias resistentes

pueden transmitir esta información genética a su progenie o a bacterias vecinas las cuales

también se tornan resistentes. El fenómeno de resistencia a los antibióticos es un problema

causado por el mal uso de los mismos tanto en el campo de la salud humana y la veterinaria.

Esto a su vez se traduce en un reto más exigente para la industria farmacológica, la cual debe

generar antibióticos con formulaciones novedosas en períodos de tiempo cada vez más cortos.

Debido a algunas características como lo son bajo peso molecular (en comparación con

un genoma) replicación independiente y rastreabilidad, los plásmidos han sido modificados en el

laboratorio para su uso como herramientas de ingeniería genética. Estos plásmidos son

conocidos como vectores.

Los vectores se utilizan como portadores de información genética exógena que puede ser

fácilmente aislada y amplificada en las bacterias en un procedimiento denominado clonación de

genes.

Algunas propiedades de los vectores de clonación son:

-Presentan un alto número de copias por célula

-La replicación es independiente del ADN del huésped

-Sus secuencias de nucleótidos completa es conocida para muchos vectores, lo cual

permite digerir con enzimas llamadas enzimas de restricción estas secuencias para la posterior

inserción del ADN en estudio.

La bacteria de uso más común para contener los plásmidos o vectores a utilizar en el

laboratorio con fines de clonaje es conocida como Escherichia coli. Esta bacteria es un huésped

común del tracto digestivo de mamíferos, por lo tanto el riesgo de infección por manipulación es

bajo si es manipulada adecuadamente.

Las técnicas de aislamiento y purificación de plásmidos han tenido gran desarrollo hoy en

día lo que permite obtener preparaciones de cantidad y calidad adecuadas que son la base de la

mayoría de los protocolos en biología molecular. Uno de los métodos más utilizados es el de

desnaturalización alcalina en presencia del detergente dodecil sulfato de sodio (SDS). Este

método, que utilizaremos en la práctica de laboratorio, se basa en las diferencias con respecto a

la forma y tiempo de desnaturalización y renaturalización del ADN de plásmido versus el ADN

cromosomal. Los plásmidos al tener un tamaño menor, pueden ser separados fácilmente de las

moléculas de ADN cromosomal que son grandes y precipitan más rápidamente. El primer paso

consiste en crear un ambiente osmótico hostil para la bacteria y lograr así su lisis y consecuente



liberación del material genético. Para ello, las bacterias son puestas en contacto con una solución

de alta concentración de sales, glucosa y ácido etilendiamino tetracético (EDTA) (solución I).

Este último es un agente quelante de calcio (el calcio es un ión estabilizador de las membranas

bacterianas). Posteriormente se agrega una solución (solución II) con una alta concentración de

SDS e hidróxido de sodio: en condiciones alcalinas (pH 11) el ADN se desnaturaliza. Sin

embargo, el ADN cromosomal al no ser tan compacto se desnaturaliza más rápidamente que el

ADN de plásmido. Cuando a esta solución se le agrega acetato de potasio (solución III), el ADN

desnaturalizado (genómico) forma un agregado junto con el SDS y las proteínas bacterianas, el

cual precipita, mientras que el ADN del plásmido se mantiene en solución. La separación de la

fracción soluble de la insoluble se logra mediante centrifugación. Finalmente, el ADN del

plásmido es concentrado por precipitación con etanol.

Debido a que este procedimiento no garantiza una alta pureza, es posible que la muestra

final contenga trazas de ADNasas bacterianas que se acarrean durante el proceso de extracción.

Para evitar la degradación de las moléculas de ADN por estas enzimas, se aconseja trabajar de

forma rápida y con soluciones a baja temperatura. Recuerde además que usted también es

portador de ADNasas en sus manos, saliva, lágrimas que pueden contaminar su muestra y dar al

traste con la extracción

Materiales y Reactivos.

Solución I: 50 mM Tris.Cl, pH 8, 10 mM EDTA, 20 mM glucosa 60

Solución II: 200 mM NaOH, 1% SDS

Solución III: 3 M Acetato de potasio

Etanol al 70% y al 95%

Cloroformo

Amortiguador de Tris y EDTA (TE)

Hielo

Tubos descartables de 1.5 ml

Micropipetas y pipetas

Procedimiento.

1. Cultivar por 14 horas las cepas de Escherichi a coli en 5 mL de la medio LB a 37 ° C con

agitación.

2. Colectar las células por centrifugación durante 10 minutos a 2500 RPM.

3. Resuspender las células en 100μL de la solución "I", previamente enfriada. Se agita

vigorosamente para evitar que las células permanezcan juntas.

4. Agregar 200 µl de la solución II (Lisis) preparada recientemente a cada suspensión de

bacterias. Se cierran los tubos y se homogeniza invirtiendo el tubo rápidamente

alrededor de 5 veces. Para prevenir ruptura del ADN genómico y por tanto la

contaminación del ADN del plásmido con el mismo, se debe agitar invirtiendo el tubo

suavemente. Incubar el tubo por 5 minutos exactos en hielo.

5. Agregar 150 µl de la solución III (Neutralización) previamente enfriada. Se cierran los

tubos y se homogeniza invirtiendo el tubo varias veces. El tubo se incuba 3 – 5 minutos

en hielo.

6. Centrifugar el lisado de bacterias a máxima velocidad por 5 minutos a 4 ºC. Tomar el

sobrenadante obtenido luego de la centrifugación y pasarlo a un tubo limpio.

7. Aspirar la fase superior (acuosa) que contiene al ADN, y transferir la a un tubo nuevo.

8. Adicionar a la fase acuosa 1 mL de Cloroformo, y homogenizar por inversión durante 5

minutos. Centrifugar 10 minutos. Aspirar la fase acuosa que contiene al ADN y

transferirla a un tubo nuevo de centrífuga de 2 mL.

9. Repetir el procedimiento (8) hasta obtener una fase acuosa completamente clara.

Bioquímica

13

10. Adicionar 1 volumen de alcohol isopropílico helado, y dejar en reposo por una hora en

hielo. Luego centrifugar por 15 minutos.

11. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante, y enjuagar el sedimento con 1 mL de etanol al

70%. Trasladar el contenido a un tubo de microcentrífuga.

12. Centrifugar en la microcentrífuga durante 10 minutos. Eliminar el alcohol y dejar secar a

medio ambiente.

13. Resuspender el sedimento con 300 uL de agua.

Resultados

Se obtendrá ADN plasmídico que se almacenara hasta la práctica de electroforesis para

observar la calidad del material obtenido.

Método de eliminación de Residuos

Los residuos se clasificaran en los siguientes Tipo I (Compuestos orgánicos

halogenados) y Tipo III (Soluciones acuosas: Hidróxidos y orgánicas acuosas). Los mismos se

almacenaran temporalmente en contenedores debidamente rotulados e identificados.

Referencias bibliográfica

Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. 2007. Molecular

Biology of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU

UNAM (Universidad Nacional Autónoma de México). 2000. Bioquímica y Biología

Molecular Manuales departamentales. Editorial Mc Graw-Hill. México.

Ausubel, F. M.; Brent, R.; Kingston, R. E.; Moore, D. D.; Seidman, J. G.; Smith, J. A.;

Struhl, K. 1999. Polymerase Chain Reaction. ln: Current Protocols in Molecular

Biology.



PRÁCTICA Nº 1.2

EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO ANIMAL

Objetivo general

Extraer ADN genómico partiendo de una muestra de origen animal.

Objetivo general






Método de aislamiento de ADN genómico sin emplear extracción con fenol ni centrifugación.

Adaptado de Laird (1991). El método general es descrito en Sambrook et el. (2001).

Materiales y Reactivos

100mM Tris HCl pH 8.5


0.5M EDTA

10% SDS

5M NaCl

20mg/ml Proteinasa K

Isopropanol

agua bidestilada.

Procedimiento

1. Lisis: El buffer de lisis se agrega al tejido o células (usualmente 0.5 mL). La digestión se

completa después de varias horas a 37° (células, 2-3 hrs.) o 55° (tejidos) en agitación.

Buffer de Lisis:

100mM Tris HCl pH 8.5: 5ml

0.5M EDT A: 0.5ml

10% SDS: 1ml

5M NaCl: 2ml

20mg/ml Proteinasa K 0.25ml

Completar hasta 50ml con agua bidestilada.

2. Precipitación: Se agrega un volumen de isopropanol al lisado, y se mezcla por inversión

hasta que se complete la precipitación (unos 10-20 minutos); (debe desaparecer la

viscosidad).

3. Recuperación del Precipitado: El ADN precipitado se recupera levantándolo con una

punta descartable de micropipeta. Debe secarse al ambiente el exceso de líquido. El ADN

luego se debe resuspender en 20 a 500ul de 10mM Tris HCl, 0.1mM EDT A, pH 7.5.,

dependiendo del volumen de células o tejido procesado. La resuspensión total requiere de

varias horas de agitación a 37 ó 55° (mejor overnight). Es importante que el ADN esté

totalmente resuspendido para asegurar se de remoción reproducible en alícuotas par a el

análisis.

Bioquímica

15

Resultados

Se obtendrá ADN genómico animal que se almacenara hasta la práctica de electroforesis

para observar la calidad del material obtenido.





Referencias bibliográficas

Sambrook,J.,Rusell,D.W.(2001).Molecularcloning:alaboratorymanual.3aEd

ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NewYork,U.S.A.



Biology.

ALBRIGHT L. M.; COEN D. M.; VARKI A. John Wiley & Sons, Inc. United States of

America. pp. 740.



PRÁCTICA Nº 1.3

EXTRACCIÓN DE ADN CROMOSOMICO VEGETAL

Objetivo general

Extraer ADN genómico partiendo de una muestra de origen vegetal.

Objetivo general






El ADN vegetal es más difícil de obtener de una forma que sea luego clonable o digerible,

que el proporcionado por células animales, debido principalmente a la presencia de metabolitos

secundarios y polisacáridos, los cuales interfieren con el procedimiento de extracción y se

copurifican con el ADN; algunos de estos problemas pueden superar se usando hojas sin

expandir.

Los tejidos de plantas son robustos y por lo tanto requieren pre- tratamientos intensivos,

tales como largas incubaciones enzimáticas, molido en nitrógeno líquido con polvo de alúmina

seguida por extracción con el tampón CTAB, etc.

El método aquí descrito proporciona cantidades relativamente puras de ADN genómico,

que puede usar se como molde de amplificación con fines de fingerprinting molecular (RAPDs,

microsatélites u otras metodologías).

Mini preparación de ADN de soja


Harina de soja

50mM Tris HCl pH 8


EDTA

SDS

NaCl

β-mercaptoetanal

Acetato de potasio

Isopropanol

agua bidestilada.

Procedimiento

Obtención de Harina de soja

1. Triturar de la semilla se soja

2. Lavar el molino de cuchillas profundamente con agua y detergente.

3. Enjuagar bien con agua para eliminar los restos de detergente

4. Volver a enjuagar esta vez con agua tridestilada varias veces

5. Pasar por todas las superficies del molino etanol al 70% con la ayuda de papel

absorbente. Dejar secar.

Bioquímica

17

6. Exponer el molino a luz ultravioleta por 15 min.

7. Proceder al molinado utilizando 10 gr de la semilla hasta obtener harina de soja.

8. Se tamiza para obtener un polvo bien fino.

Extraccion de ADN 1. Poner en un tubo de 1.5 ml el equivalente a 100 mg. De harina muy fina

(aproximadamente 70 ul)

2. Agregar 700 ul de Buffer de extracción (BE)

a. 50 mM Tris Cl (pH 8)

b. 10 mM EDTA (pH 8)

c. 100 mM NaCl

d. 10 mM mercaptoetanol

e. 1% SDS

3. Incubar 10 min a 65 / 70 °C. Agitar ocasionalmente.

4. Agregar 200 μl de Acetato de Potasio 5M, agitar brevemente e incubar en hielo 20 min.

5. Centrifugar 20 min a 12.000 rpm a 4° C.

6. Tomar 500 μl del sobrenadante y transferir a otro tubo de 1,5 ml rotulado

7. Precipitar el ADN con un volumen de isopropanol, incubar 10 min en hielo

8. Centrifugar 10 – 20 min a 12.000 rpm a temperatura ambiente.

9. Lavar con etanol al 70% (380 μl) y volver a centrifugar (dar un spin)

10. Descartar el sobrenadante. Retirar con pipeta las últimas gotas

11. Repetir el paso 9 y 10

12. Secar el pellet bajo lámpara y resuspenderlo en 50 μl de H2O bidestilada.

Preparación del Buffer de Extracción

1) Tris- Base: Tris (hidroximetil)aminometano.

PM: 121,14, ver PM en la etiqueta del envase

Solución Stock de Tris Cl: 50 ml de Tris-Cl 100 mM

Utilizar agitadores si es necesario: La cantidad necesaria de Tris se disuelven en 35ml de

agua, ajustar el pH con HCl concentrado (se usa aproximadamente entre 1 a 3 ml), una vez

ajustado llevar a 50 ml con agua.

Por dilución calcular el volumen que será necesario para obtener la concentración final

del buffer de extracción.

2) EDTA pH 8 (Etilendiamino tetraacetico) (CH4N2(CH2COONa)4).

PM: 380.17 si es una sal tetrasodica. Ver PM en la etiqueta del envase

Solucion Stock de EDTA:Se prepara 20 ml de una concentracion 30 mM.

Los gramos de EDTA se disuelven en 10 ml de agua, ajustar el pH con NaOH de alta

concentración (se usa aproximadamente entre 1 a 4 gr de NaOH), una vez ajustado llevar

a 20 ml con agua.Por dilución calcular el volumen que será necesario para obtener la

concentración final del buffer de extracción.

3) NaCl 100 mM

4) Mercaptoetanol: Se agrega ultimo al Buffer de extraccion, se calculan

cuantos ml se necesitan (tener en cuenta % del reactivo)y se agrega directamente al

buffer de extraccion. Posee un desagrable olor por lo que se realizara el agregado en

otro laboratorio



5) SDS (dodecil sulfato de sodio) (CH3(CH2)11OSO3Na)

Solucion Stock de SDS: Se prepara 20 ml de una concentracion 2%

Pesar los gramos de SDS se disuelven en 15 ml de agua, utilizar agitadores y calentadores si es

necesario, una vez ajustado llevar a 20 ml con agua. Por dilución calcular el volumen que será

necesario para obtener la concentración final del buffer de extracción.

Resultados

Se obtendrá ADN genómico vegetal que se almacenara hasta la práctica de electroforesis

para observar la calidad del material obtenido.






Sambrook,J.,Rusell,D.W.(2001).Molecularcloning:alaboratorymanual.3aEd

ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NewYork,U.S.A.



Biology.

Dellaporta, S. L.; Wood J.; Hicks, J. B. 1983. A plan DNA minipreparation: version II.

Plant. Mol. Biol. Reporter. 1:19-21.

Bioquímica

19

PRÁCTICA Nº 2

CUANTIFICACION DE ADN

Objetivo general

Cuantificar el ADN obtenido en las practicas anteriores, utilizando espectrofotometría

UV

Objetivo específico

Cuantificar la cantidad de ADN de las muestras.

Medir el grado de pureza de las mismas por métodos indirectos.



Cualquier experimento que requiera la manipulación de ácidos nucleícos, también requiere su

cuantificación para obtener resultados óptimos y reproducibles. Las bases nitrogenadas que se

encuentran a lo largo de la hebra de ADN absorver la luz ultravioleta a 260nm, a esta longitud de

onda la absorción es proporcional a la concentración de ácidos nucleicos. La relación entre la

concentración de ADN y la absorbancia es lineal hasta 2 a una longitud de onda de 260 nm como

se observa en la Figura 1.

Figura 1. La relación entre la concentración de ADN y la Absorbancia a 260nm es lineal hasta

aproximadamente 2.

Las muestras a cuantificar son estan constituidas por ADN de doble hebra debido a que se trata

de plasmidos y ADN genómico. La cuantificación se realiza típicamente tomando los valores de

absorbancia a 260nm, debido a que es especifico de los ácidos nucleicos, además se registra la

absorbancia a 280nm (que corresponde a proteínas).

Para ácidos nucleicos sometidos a purificación se puede calcular la relación de A260/A280 , si esta

relación es 1,8 la muestra se considera pura. Si existe contaminación con fenol o proteína la

relación es inferior a 1,8. Si la muestra contiene ARN la relación es mayor que 1,8. El

coeficiente de absortividad molar es de 50μg DNA /mL

Cuantificación de ADN


Solución de ADN extraído en las practicas anteriores



50mM Tris HCl pH 8


EDTA

SDS

NaCl

β-mercaptoetanal

Acetato de potasio

Isopropanol

agua bidestilada.

Procedimiento

1. Agregue 15 μl de cada muestra a 735 μl de TE, mezcle bien y lea la DO260 y la DO280 para

determinar la pureza.

2. Después de la cuantificación con UV, diluya la muestra a 0.3 μg/ μl (u otra concentración) con

TE y almacene a 4 ˚C. La muestra se mantendrá utilizable hasta seis meses. Si desea conservarla

más tiempo, manténgala en congelación.

Concentración de ADN (μg/ μl) = DO260 x factor de dilución x 50 μg/ml.1000

3. Es preciso determinar la relación DO260/DO280 para evaluar la pureza de la muestra. Si esa

relación es de 1.8-2.0, es probable que la absorción sea causada por los ácidos nucleicos. Una

relación inferior a 1.8 indica que pueden existir proteínas y/u otros elementos absorbentes de UV

en la muestra; en ese caso, es conveniente volver a precipitar el ADN. Una relación superior a 2.0

indica que las muestras pueden estar contaminadas con cloroformo o fenol y se debe volver a

efectuar la precipitación con etanol.

Resultados

Se obtendrá la cantidad de ADN aisladas de las distintas muestras, que se almacenara hasta

la práctica de electroforesis para observar la calidad del material obtenido.


Los residuos se clasificaran en los siguientes Tipo III (Soluciones acuosas: Hidróxidos y

orgánicas acuosas). Los mismos se almacenaran temporalmente en contenedores debidamente

rotulados e identificados.

Referencias bibliográficas



Biology.

CIMMYT. 2006. Protocolos de laboratorio: Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del

CIMMYT. Tercera edición. México, D.F.: CIMMYT.

Bioquímica

21

PRÁCTICA Nº 3

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Objetivo general

Caracterizar los ácidos nucleícos usando electroforesis en geles de agarosa, de manera a

validar la utilización del mismo en distintas técnicas.


Realizar un gel de agarosa para visualización de ADN genomico.

Preparar correctamente las soluciones tampón a ser utilizadas en la electroforesis.

Conocer los factores a tener en cuenta en la elección de la concentración de agarosa a ser

utilizada en el experimento.

Desarrollar la capacidad de trabajo en grupo, aplicando normas de bioseguridad de forma

ordenada.

Fundamentos teóricos de la práctica El problema de realizar separaciones de biomoléculas grandes es enfrentado frecuentemente en

las ciencias de la vida, tanto para análisis cualitativos como cuantitativos de mezclas o de preparaciones

individuales. En la mayoría de casos es deseable causar el mínimo de daño a las moléculas de manera que

sus propiedades no cambien de manera significativa.

Los métodos actuales para la separación de biomoléculas descansan por lo tanto en procesos

físicos que causan el mínimo de desnaturalización, lo cual resulta en la máxima retención de cualquier

actividad biológica.

Un gran grupo de métodos de separación están basados en algunas propiedades químicas o

biológicas, o en interacciones de la molécula que se investiga, y algunas otras están basadas en

diferencias en pesos moleculares o cargas netas, o a veces una combinación de las dos propiedades.

Los métodos electroforéticos pueden diseñarse para explotar cualquiera de los dos, o ambos

parámetros, aunque las diferencias en tamaño son las principales en el caso de las separaciones de ácidos

nucléicos.

Los geles de agarosa son el medio más popular par a separaciones electroforéticas de ácidos

nucleicos de mediano y gran tamaño. Las concentraciones más típicas de agarosa van de 0.3 hasta 2.5 %,

y esta concentración depende de los tamaños de los ácidos nucleicos a separar. Aunque los geles de

agarosa carecen de fuerza mecánica (especialmente los más diluidos), la manipulación se facilita por el

uso de geles horizontales, los cuales pueden ser soportados por láminas de vidrio o de plástico.

El sistema de electroforesis en gel que seleccione, así como sus varios componentes, dependerá del

tamaño anticipado del producto (o productos) y, en menor grado, de la intensidad de éste (o éstos). En el

laboratorio del CYMMIT se han ensayado geles de agarosa horizontales a diferentes concentraciones y

diversas mezclas de distintas proporciones de agarosa de buena calidad y de calidad normal; geles de

poliacrilamida pequeños con distintas concentraciones y proporciones de acrilamida y bisacrilamida

teñida con bromuro de etidio y nitrato de plata; geles secuenciadores de poliacrilamida para

desnaturalización con tintura de plata; y separación de productos marcados con fluorescencia mediante un

secuenciador automático. A continuación se muestras las condiciones que han estado utilizando tanto

para la electroforesis en gel de agarosa como la electroforesis pequeña en gel de poliacrilamida no-

desnaturalizante/desnaturalizante (PAGE).

Normas generales para la realización de la electroforesis dependiendo de la muestra que se va

separar:

• Utilizar geles de agarosa para los fragmentos de gran tamaño.

• En el caso de los SSR utilizados en estudios de diversidad genética o fingerprinting, siempre usar

PAGE debido a que se requiere una mayor resolución.



• En el caso de los SSR utilizados en estudios de mapeo, buscar polimorfismos en líneas

progenitoras en geles de agarosa y volver a correr en poliacrilamida sólo los SSR con diferencias tan

pequeñas o de intensidad tan baja que no se observan claramente en los geles de agarosa.

Electroforesis en gel de agarosa

Hay que considerar estos factores al decidir el tipo y tamaño de geles de agarosa que se deben

utilizar:

• La concentración de agarosa, dependiendo del tamaño de los productos amplificados(cuando se

realiza PCR); generalmente se utiliza 1.5% para fragmentos más grandes (200 a 3500 pb), como los STS,

y 4% para fragmentos más chicos (menos de 400 pb), como los SSR.

• La distancia de migración y la proporción de agarosa de buena calidad a una de calidad

normal son factores que influyen en la resolución de las diferencias en los tamaños de los productos

amplificados. A mayor distancia, mejor resolución

• Se utiliza amortiguador 1X TBE (para preparar el gel y correrlo), en vez de 1X TAE, para

lograr una mejor resolución. Este amortiguador puede volverse a utilizar una o dos veces sin problema ya

que el tiempo de corrida suele ser breve. Otra opción que se puede ensayar en vez de volver a usar el

amortiguador es utilizar 0.5X TBE.

Control de la calidad del ADN

Este paso es esencial para verificar que el ADN aislado es de alto peso molecular. El ADN original

debe emigrar como una banda apretada de peso molecular ≥40 kb. No obstante, es inevitable la

degradación de una parte del ADN aislado y el protocolo presentado a continuación está diseñado para

correr el ADN en condiciones óptimas con el fin de asegurar las cantidades relativas de ADN degradado

y de ADN de alto peso molecular. El procedimiento también permite verificar la cuantificación con UV

antes señalada.

Electroforesis en gel de agarosa al 0,8%

Materiales y reactivos

- Cámara electroforética horizontal

- Fuente de poder

- Cámara fotográfica

- Recipiente para tinción

- Transiluminador UV

- Lentes UV

- Cinta de papel

- Agarosa (grado biologia molecular),

- Tris

- Acido acético glacial

- EDTA

- Azul de bromofenol

- Bromuro de Etidio 10 mg/mL

Procedimiento

Preparación de reactivos

Agarosa 0,8%: disolver la cantidad necesaria de agarosa en buffer TAE 1X en el volumen

necesario para el soporte del gel. Calentar en un Baño Maria evitando que la solución

hierva.

Buffer de Electroforesis TAE: Prepare a 10x stock solución en 1 litro de H20: 48,4 g de

Tris base 11,4 ml de acido acético glacial, 20 ml of 0.5 M EDTA (pH 8.0). La solución de

trabajo 1x contiene 40 mM Tris-acetato/1 mM EDTA.

Bromuro de etidio: colocar 20μL de bromuro de etidio en 400mL de TAE 1X. Guardar la

solución en un frasco

Loading Buffer 10X: Bromophenol blue: 0.125g, xylene cyanol: 0.125g, 500mM EDTA

pH 8.0: 0.1ml, Glycerol: 15 ml, milliQ-dH2O: hasta 50ml

Protocolo de preparacion.

Bioquímica

23

1. Preparación de la Cámara Electroforética: Colocar la base del gel sobre la cámara

electroforética, y delimitar con cinta de papel los límites del gel, y luego el peine que

marcara los pozos.

2. Vertir la agarosa cuando este lista, y dejar solidificar. Una vez solido, se agrega un poco

de Buffer de Corrida TAE 1X, y se retira el peine. Lo siguiente será colocar los

electrodos, ayudándose de cinta de papel para sujetarlos.

3. Preparación de las Muestras: Los acidos nucleicos a estudiar se mezclan en una

proporcion 1:10 con el Buffer de Muestra sobre un trozo de parafilm, y cada muestra se

siembra en uno de los pozos del gel.

4. Corrida Electroforetica: Se conectan los electrodos a la Fuente de Poder, y se deja correr

a 60 – 80 voltios durante 1½ - 3 horas, o hasta que el azul de bromofenol haya migrado

2/3 de la longitud del gel.

5. Tincion del Gel de Agarosa: Trasladar el gel a un recipiente que contenga Bromuro de

Etidio (concentracion final 0.5 ug/mL). Agitar por 5 minutos. Luego, enjuagar primero

con agua corriente y después con agua destilada.

6. Visualizacion y Fotografia: El gel teñido se coloca sobre el Trans-Iluminador UV y se

observan teniendo en cuenta el usar lentes de protección. La vista se toma en cuarto

oscuro con una cámara.

Realizar el mismo experimento pero con una agarosa al 2%.

Resultados

Se obtendrá una banda de ADN genómico para cada muestra, en caso de estar integra. Si

aparecen manchas difusas comentar y justificar esos resultados.

Método de eliminación de residuos

Los residuos químicos se clasificaran en los siguientes Tipo III (Soluciones acuosas:

Hidróxidos y orgánicas acuosas) y Tipo VI (Residuos sólidos). Los mismos se almacenaran

temporalmente en contenedores debidamente rotulados e identificados.

Referencia bibliográfica

CIMMYT. 2006. Protocolos de laboratorio: Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del

CIMMYT. Tercera edición. México, D.F.: CIMMYT.



PRÁCTICA N° 4

REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA

Objetivo general

Amplificar un fragmento de ADN de interés median la reacción en cadena de la

polimerasa.


Seleccionar los cebadores para realizar la amplificación.

Comprender los pasos que incluye la reacción en cadena de la polimerasa.

Comprender la utilidad de la técnica en distintos campos de la ciencia tanto en investigación

y diagnóstico

Colaborar activamente en las actividades grupales.

Fundamento teórico de la práctica

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método para amplificar un segmento

específico de ácido nucleico. Una reacción de PCR contiene un ADN molde (ADN o ARN), una

polimerasa estable en calor, los cuatro desoxirribonucleosidos trifosfato (dNTPs), magnesio,

oligonucleótidos o cebadores y el buffer de reacción.

El proceso consta de tres pasos que se nombran a continuación:

1. Desnaturalización: El acido nucleico de doble hebra se desnaturaliza a ADN de

hebra simple, para exponer las bases nitrogenadas. Este paso se desarrolla a una

temperatura entre 92-98°C

2. Anneling: Este paso se realiza entre 65 – 72°C, los oligonucleótidos se unen a la

secuencia que flanquean el segmento de ADN que se desea amplificar.

3. Extension: Es el último paso de la reacción, la Taq-polimerasa adhiere los dNTPs

al extremos 3´ tal como ocurre en el proceso de replicación.

Estos tres pasos contituyen un ciclo y se repiten varias veces según sea necesario para obtener el

producto de reacción en una cantidad deseable, dependiendo de las especificaciones y puede

variar de 25 a 40 ciclos.

Reacción en cadena de polimerasa de Glicine max.

Materiales y reactivos

Soluciones: PCR Buffer 10X

MgCl2 25mM

dNT Ps 2.5 mM

Primer Forward INTGF 10 mM

Primer Reverse INT ER 10 mM

DNA 25 ng/mL

AmpliTaq DNA Polimerasa 5 U/mL

Bioquímica

25

Procedimiento

1. A un tubo nuevo de microcentrífuga de 0.2 mL agregar :

Reactivo Volumen (uL)

Agua 18 MOhm 33.5

PCR Buffer 10X 5.0

MgCl2 25mM 3.0

DNT P mix 2.5 mM 4.0

Primer INTGF 10 mM 1.0

Primer INTER 10 mM 1.0

Mezclar y centrifugar

DNA molde 25 ng/mL 2.0

Taq DNA Polymerase 5 U/mL 0.5

Volumen Final 50mL

2. Cubrir con aceite mineral si el termociclador lo requiere.

Concentraciones Finales.

T r is-HCl , 20 mM pH 8.4 (a 22°C)

KCl, 50 mM

MgCl2, 1.5 mM

Primer s, 200 mM cada uno.

dNT Ps, 200 mM de cada uno.

AmpliTaq DNA Polymerase, 2.5U

3. Realizar el siguiente ciclaje:

Denaturación Inicial 94°C 5´

Denaturación 94°C 45”

Hibr idación 40°C 30”

Extensión 72°C 2´

Extensión Final 72°C 10´

4. Analizar 10 mL de la reacción mediante una electroforesis en gel de agarosa al 2%, o

almacenar la reacción a -20°C hasta su uso.

Comprobación de la calidad de la extracción por PCR. Soja Normal

La PCR se realiza utilizando primers que amplifiquen secuencias propias de la especie. A

estas secuencias se los denomina eventos. Mediante la amplificación por PCR del DNA de cada

muestra se comprueba que el mismo se halla en buen estado (susceptible de ser amplificado) y

que no hay inhibidores de gran efecto contaminando la muestra.

Procedimiento de amplificación

Se debe realizar en optimas condiciones de concentración de Taq DNA polimerasa,

primers, MgCl2 y esto dependerá del sistema utilizado.

Necesariamente de debe determinar estas optimas condiciones de trabajo para cada

componente de la reacción. Esto es especialmente importante para la Taq polimerasa, el numero

ciclos y el tiempo de cada uno y la concentración de MgCl2



Los primer a ser utilizados son

Gen pirmers Secuencia Temp de annealing

del par

Producto

amplificado

Endo Soja GM03 GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C 60º C 118 PB

GM04 GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG

Ciclado

95º C 94º C

10’ 30”+…”

72º C 72º C

1’+…” 3’

50º C

30”+…”

4º C

Inicial 35 Ciclos final

Detección de soja transgénica mediante la amplificación de segmentos del Promotor 35S

La secuencia que se introduce en la soja para dotarla de resistencia al glifosato es la siguiente:

Soja “40-3-2”

El promotor 35 S del CaMV (Cauliflower Mosaic Virus) y el terminador NOS del gen Nopalin

Sintetasa de Agrobacterium tumefasciens, son elementos regulatorios de la expresión de los

genes introducidos y se han utilizado en la mayoría de las plantas transgénicas que están siendo

comercializadas.

El gen CP4 EPSPS codifica para la enzima 5-enolpiruvilsikimato-3-fosfato sintasa. El principal

mecanismo de acción del glifosato, es la inhibición competitiva de la EPSPS. Esta enzima forma

parte de la ruta del ácido sikímico implicado en la producción de aminoácidos aromáticos y otros

componentes aromáticos en plantas (Steinrucken y Amrhein, 1990). Cuando las plantas

tradicionales son tratadas con glifosato, no pueden producir los aminoácidos aromáticos

necesarios para su supervivencia.

Las variedades de soja “40-3-2” desarrolladas mediante la tecnología del ADN recombinante,

expresan la proteína CP4 EPSPS, la cual se obtuvo de una bacteria común del suelo. La proteína

CP4 EPSPS es, de forma natural, mucho menos sensible a la inhibición por el glifosato y de este

modo, las plantas que expresan esta proteína son tolerantes al herbicida glifosato.

CP4 EPSPS P35S nos

Bioquímica

27

La secuencia se introdujo a través del plasmado PV-GMGT04

Por esta razón la amplificación de una de las secuencias (P35S o nos) o de las dos se utilizan

para la detección de OGM en la mayoría de los casos. Una amplificación positiva de cualquiera

de estas secuencias es una fuerte evidencia de la presencia de material OGM. Ante un resultado

positivo siempre debe considerarse la posibilidad de contaminación de la muestra con el CaMV

o con Agrobacterium tumefasciens.

Los primer a ser utilizados son

pirmers Secuencia Temp de annealing

del par

Producto

amplificado

P35S-U GCT CCT ACA AAT GCC ATC A 54º C 195

P35S-L GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA

Ciclado

95º C 94º C

10’ 20”+…”

72º C 72º C

40”+…” 3’

50º C

40”+…”

4º C

Inicial 35 Ciclos final



Técnica de PCR manual

1. El primer punto a tener en cuenta es el problema de la contaminación. Para ello se toma

las siguentes medidas.

a. Limpieza constante de los equipos.

b. Esterilización de materiales a utilizar

c. Tener cuartos de trabajo separado

2. Reconstituir los primers liofilizados. Para ello utilizamos un buffer TE que contiene

a. 10 mM de Tris-Cl, pH:8

b. 1 mM de EDTA

3. Esterilizar todos los elementos a utilizar. Puntas, eppendorf, Pipetas.

4. Preparación del master mix. Normalmente la mezcla de los reactivos se realiza en un

tubo eppendorf y de allí se alícuota la cantidad estipulada a otros tubos para realizar ya la

reacción.

5. Alícuotar el master mix en cada tubo de reacción y etiquetarlo con un pincel indeleble.

Mantener siempre en hielo.

6. Agregar la muestra de DNA (2.0 ul - 200 ng/uL), mantener en hielo hasta que se inicie la

PCR

Preparación del MASTER MIX.

Seguir el orden de cargado!:

Reactivos Vol. x tubo (eppendorf)

en uL.

Vol. total utilizado (Vol =Nro. de Tubos + 1)

1- Agua destilada 29,4

2- Buffer 10X 5,0

3- MgCl2 (25 mM) 3,6

4- d NTP´s (10 nM) 1,0

5- Primer 1 1 (0,5 y 0,5)

6- Taq Polimerasa. 2

Subtotal 43 uL

Muestra (200 ng/uL) 2

Volumen Total 45 uL

7. Programar el termociclador según el protocolo de trabajo requerido

8. Una vez terminada la reacción se procederá a observar el producto de PCR en un gel de

agarosa como se procedió en la práctica numero 3

Resultados

Se espera obtener fragmentos menores a los ADN genómico observados en la electroforesis en

gen anterior. Discutir los fragmentos obtenidos

Método de eliminación de residuos

Los residuos químicos se clasificaran en los siguientes Tipo III (Soluciones acuosas:

Hidróxidos y orgánicas acuosas) y Tipo VI (Residuos sólidos). Los mismos se almacenaran

temporalmente en contenedores debidamente rotulados e identificados.

Cuarto de

Extracción

Cuarto

Blanco

Cuarto

Negro

Bioquímica

29


Robyt, John y White, Bemard (1990). "Biochernical Techniques- Theory and Practice

".Waveland Press, INC. USA.

Frank Stephenson. (2003). Calculation for Molecular Biology and Biotechnology.

Elesevier. USA.



ANEXOS

Anexo 1: Verificación de la calibración de pipetas automáticas Para que la cuantificación de proteínas, ácidos nucleídos o cualquier analito sea adecuada se requiere la

habilidad de medirlo de manera exacta y reproducible. El transferir volúmenes pequeños de líquidos es

crítico para obtener resultados confiables es por ello que en los laboratorios de ciencias para medir

volúmenes pequeños, se utiliza un dispositivo conocido como micropipeta (Fig 1). Las micropipetas

tienes diferentes capacidades de medida, 0.1-1 μL, 0.5-10 μL, 10-100μL, 20-200 μL, 100-1000 μL, 1000-

5000 μL. .

Figura 1: Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta así como puntas de diferente tamaño

para la medición de diferentes volúmenes.

Objetivos

Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas.

Adquirirá destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes pequeños

Bioquímica

31

Materiales

1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por grupo

Agua desionizada

Balanza analítica con límite de 0,0001 g

Tapas de cajas de petri de plástico

Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 μL)

Procedimientos

Importante: Para el uso adecuado de la micropipeta asegúrese que está usando la micropipeta correcta

para el volumen que necesita medir. También, asegúrese que la micropipeta está realmente lista para el

volumen que necesita revisando la “ventana de volumen”. Si es necesario, cambiar el volumen mediante

el “dispositivo” del control o mando del volumen hasta que la micropipeta corrija el volumen (la

micropipeta no lee su mente; varias personas usarán las pipetas, no siempre se encontrará como usted la

necesita).

NO trate de colocar la micropipeta para volúmenes mayores que el máximo, o para volúmenes menores

del cero, esto descalibrará y dañará la micropipeta.

1) Partes de la micropipeta

a) Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura 1.

b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en la Figura

2) Llenado de la pipeta

a) Colocar una punta según corresponda.

b) Colocar el pulgar sobre el mando o émbolo de pipeteado.

c) Oprimir el émbolo hasta el primer un punto de resistencia “alto” o "tope". Si continúa

presionando encontrará un punto donde el émbolo ya no se mueve hacia abajo, este corresponde al

segundo punto de resistencia “alto” o "tope".

d) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y colocar la punta dentro del líquido hasta una

profundidad menor a 1 mm. De una manera lenta y controlada, disminuya la presión del émbolo para

permitir que se desplace hacia arriba. No suelte el émbolo abruptamente, al permitirlo causará que el

líquido pueda salpicar dentro de la punta produciendo volúmenes inexactos y generando contaminación

de la pipeta. Una vez el émbolo se haya desplazado hasta arriba mantenga la micropipeta en el líquido

durante un segundo, esto evita que se aspire aire en la parte final.

3) Expulsión de la muestra

a) Llevar la micropipeta al tubo de polipropileno de 1.5 mL.

b) Se apoya la punta en la pared inferior del tubo.

c) Oprimir el émbolo hasta el primer tope y luego hasta el segundo tope. Haga este procedimiento a

una velocidad moderada, hacerlo muy rápido hará que queden gotas de muestra en la punta. Si observa

cuidadosamente, entonces notará que al oprimir hasta el segundo alto se expele todo el líquido de la

punta.

d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las soluciones

de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la micropipeta transferirá

volúmenes inexactos.

4) Calibración de Micropipeta

La micropipeta puede perder su calibración. Comprobar la calibración de la pipeta es un

procedimiento simple que puede ahorrar tiempo considerable, energía, y reactivos. En esta

práctica aprenderá a usar la micropipeta de tamaños diversos medir su exactitud, precisión y

calibración.

Para cada micropipeta revisar el porcentaje de exactitud (E%) y el coeficiente de variación

(CV%) en todo el rango usando al menos dos volúmenes diferentes; por ejemplo: Para la

micropipeta P1000 revisar los volúmenes de 300 μL y 1000 μL. Para P200 revisar los volúmenes

de 60 y 200 μL. Para P10 revisar 3 y 10 μL.

a) Seleccionar la micropipeta y las puntas adecuadas.

b) Colocar la tapa de la caja de petri en la balanza y tarar a cero.

c) Tomar el volumen de agua destilada con la micropipeta y dispénselo en la tapa de la

caja de petri. Registre el peso del agua añadido. La densidad del agua es 1 g/mL a 25ºC, por lo



tanto un volumen de 1 mL corresponde aproximadamente a una masa de 1 g, 300 μL a 0.3 g, 200

μL a 0.2 g, 60 μL a 0.06 g, 10 μL a 0.01 g y 3 μL a 0.003 g.

d) Repita el procedimiento cinco veces para cada volumen.

e) Repetir todo el procedimiento para glicerol. La densidad del glicerol es de 1,2656 g/mL

a 25 ° C.

f) Calcular la masa esperada para cada volumen

5) Cálculo de la exactitud (E%) y del coeficiente de variación (CV%)

Valor medio

X = Σ Xi /n

Donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas

Volumen medio

V=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)

Valore del control a 21,5 ° C (Z = 1,0032)

Exactitud E (%)= ((V-Vnominal)/Vnominal) *100

Los valores de exactitud aceptados deben ser proveídos por los fabricantes.

Bioquímica

33

Anexo 2

Normograma para la determinación de la Fuerza Centrifuga Relativa



Anexo 3

Como convertir textos de Word a PDF Normalmente los informes son hechos en formato doc. Esto es utilizando el programa de Microsoft

Word.

Los pasos para convertir el archivo a pdf depende de las versiones utilizadas de programa Word

Si utilizas Microsoft Word 2003

Aunque Word 2003 o versiones anteriores no proporcionan una forma directa de guardar documentos

en el formato pdf, muchos programas ofrecen la capacidad de convertir documentos de Word en

archivos PDF y viceversa.

El programa recomendado se denomina “CutePDF Writer” es un software gratuito que se puede

descargar de internet (http://cutepdf-writer.softonic.com/). CutePDF Writer (antes CutePDF Printer),

se instala como una impresora virtual

Una vez instalado el programa seguimos los siguientes pasos para convertir el documento a pdf:

1. Abrir el informe en formato Word (.doc) que ya has escrito

2. Ir al menú Archivo seleccionar el menú de impresión y una vez allí seleccionar de la lista

desplegable CutePDF como impresora.

3. Clic en Botón Aceptar

4. Esto envía el documento a imprimir como si lo hicieras normalmente, pero esta vez,

en lugar de salir en papel, CutePDF te pedirá un nombre con el que grabará tu recién

generado documento PDF.

Si utilizas Office Word 2007

1. Clic sobre el botón de office

2. Situar el cursor sobre “guardar como” (ver figura 1) aparecen varias opciones en la parte derecha

de la ventana

3. Clic sobre “pdf o xps”

4. Aparece otra ventana (ver figura 2) en que te pedirá el nombre del archivo a generar. Tildar la

opción “tamaño mínimo”.

5. Clic en el botón Publicar y se generará el archivo pdf.

Figura 1

Bioquímica

35

Figura 2

Manual Bio. Mol 2011

Documents

Transcript of Manual Bio. Mol 2011