EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGÍONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGIA AGRICOLA Y VETERINARIA

BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006

EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

TRABAJO DE GRADO COMO REQUISITO PARCIAL PARA OPTAR AL TITULO DE

MICROBIÓLOGO AGRÍCOLA Y VETERINARIA

JOSE SALVADOR MONTAÑA DIRECTOR

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA

BOGOTA D.C DICIEMBRE DE 2006

NOTA DE ADVERTENCIA

Articulo 23 de la resolución No 13 de Julio de 1946

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus

trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica

y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en

ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”

EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGIONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

APROBADO

_______________________________ ______________________________

José Salvador Montaña MSc Clara Patricia Peña MSc.

Director Co-Director Instituto SINCHI

_______________________________

Gladys Ines Cardona MSc.

Asesor Instituto SINCHI

______________________________ ______________________________

Adriana Arcos Ingeniero Agronomo MSc Maria Ximena Rodríguez PhD

Jurado 1 Jurado 2

Bogota D.C. Diciembre 2006

EVALUACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MICORRIZAS ARBUSCULARES ASOCIADAS A

YUCA (Manihot esculenta sp) EN DOS REGÍONES DE LA AMAZONÍA COLOMBIANA.

DANIELA LEÓN VELANDIA

APROBADO

----------------------------------------- -----------------------------------------

Angela Umaña MPhil, David Gómez MSc.

Decana Académico Director de Carrera

DEDICATORIA

Dedicada a mis padres por su amor incondicional, constante esfuerzo y dedicación durante todos

estos años.

AGRADECIMIENTOS

A mis directores de tesis José, Gladys y Clarita por su cordinación, dirección, apoyo y por

compartir sus invaluables conocimientos conmigo.

Al Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas – SINCHI por haber permitido el desarrollo

del presente trabajo de investigación.

A las comunidades Indígenas del Sur del Trapecio Amazónico y a los propietarios de los arreglos

agroforestales del municipio de San José de Guaviare por permitir el muestreo.

A todo el personal vinculado con el laboratorio de Biotecnología del Instituto Sinchi por compartir

recursos y conocimientos.

A la Dra. María Mercedes Zambrano, Directora Científica de Corpogen por su asesoría científica.

A los eminentes científicos Dirk Redecker y Francisco de Souza por su interés, asesoría científica,

y por compartir su experiencia e información.

A Adriana Arcos por facilitarme documentación relacionada con esta investigación.

A mis hermanos Pacho, David y Lucha, y a mi Abuelita por su compañía y su apoyo durante todo

este proceso.

A mi prima Paula por su colaboración e interés.

A mi Danny por estar siempre conmigo apoyándome en todo y por su valiosa colaboración y

compañía en la realización de este proyecto.

A Fiona, Figo, Ramona y Galileo por estar siempre ahí.

TABLA DE CONTENIDO

37 Introducción .................................................................................................................... 3 38 Marco Teórico y revisión de literatura ............................................................................ 8

38.1 Micorrizas ................................................................................................................ 8 38.2 Importancia de las micorrizas ................................................................................ 11 38.3 Clasificación de HMA ........................................................................................... 12 38.4 Ciclo de vida de HMA .......................................................................................... 14 38.5 Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en sistemas suelo/planta 15

38.5.1 Germinación de las esporas ............................................................................ 16 38.5.2 Colonización ................................................................................................... 18

38.6 Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales ..................................................... 19 38.7 Planta hospedera y producción de esporas ............................................................ 21

38.7.1 Manihoto esculenta (YUCA) y su relación con los HMA .............................. 24 38.8 Aproximaciones moleculares al estudio de HMA ................................................. 25

38.8.1 Detección de HMA en raíces ........................................................................ 27 38.8.2 Espaciadores internos de trascripción (ITS) ................................................... 28

38.9 Métodos de estudio de diversidad de HMA ........................................................... 30 38.9.1 Métodos de cultivo de raíces y órganos de micorriza ..................................... 30 38.9.2 Análisis moleculares del genoma fungal ........................................................ 32

38.10 Área de Estudio .................................................................................................... 35 38.10.1 Sur del Trapecio Amazónico ........................................................................ 35 38.10.2 San José del Guaviare La región Colombiana ............................................. 40 38.10.4 La región amazónica de Colombia, comprende las cuencas de los ríos que tributan al Amazonas y de algunos que lo hacen al Alto Orinoco. Limita al norte con el río Guaviare y hacia el occidente no sobrepasa la cota de los 500 m. en la vertiente de la Cordillera Oriental (Herrera, 1989). ......................................................................................................... 40 38.10.5 La Amazonía colombiana comparte con la cuenca hidrográfica del río Amazonas ciertos rasgos de clima y morfología. El 70% de esta inmensa región, está cubierta de bosques tropicales húmedos tipo hylea, para cuyo desarrollo se requiere de una temperatura media superior a los 22ºC y una precipitación anual superior a los 2.000 mm., con lluvias constantes, repartidas a lo largo del año y un período seco, corto y marcado (Herrera, 1989). .. 40 38.10.6 En Colombia se encuentran algunas de las áreas con mayor precipitación de la cuenca amazónica: en los altos ríos Putumayo, Caquetá, Napo, en la región fronteriza con Venezuela y Brasil, en el Guainía y Vaupés esta alcanza los 3.500 - 4.500 mm anuales. Estas áreas habrían conservado la vegetación selvática durante varios períodos largos en el pleistoceno y holoceno cuando, al bajar la temperatura y disminuir la pluviosidad por efectos de episodios glaciales, grandes extensiones de bosque fueron transformados en sabanas. En estas áreas con mayor pluviosidad se habrían refugiado especies de animales y de flora de adaptación selvática. El aislamiento prolongado de estos refugios, habría permitido que sus habitantes evolucionaran en formas distintas. Se explicaría así la amplia variación de especies de la Amazonía, donde no hay barreras geográficas que la justifiquen. Esta hipótesis se podría aplicar, durante los últimos episodios secos, a poblaciones humanas, para explicar la gran variación lingüística y la distribución de algunas características culturales dentro del área; sin embargo no ha sido puesta a prueba todavía por los arqueólogos (Herrera, 1989). .............................................. 40 38.10.7 Morfológicamente la planicie amazónica es una inmensa región sedimentaria. Los sedimentos más antiguos, depositados durante el terciario, en un mar o lago salobre, sufrieron posteriormente procesos erosivos, de manera que el relieve es de lomeríos. Intercaladas en este paisaje hay elevaciones mayores, superficies aún más antiguas, reductos de formaciones montañosas del precámbrico, que forman mesetas y colinas rocosas y son parte del Escudo de las Guayanas. También sobresale en el relieve la región de pie de monte andino, formada por terrazas, serranías y terrenos levemente ondulados que se alinean en un cinturón al pie de la

Cordillera Oriental. Los materiales que la constituyen provienen en su mayor parte de erosión y lavado de la cordillera, por lo tanto, allí pueden encontrarse los mejores suelos (Herrera, 1989). ......................................................................................................................... 40 38.10.8 Las superficies más recientes están formadas por los sedimentos fluviales, que forman auténticas planicies a lo largo de los ríos más caudalosos. Se pueden distinguir en ellas tres niveles: terrazas antiguas del plioceno-pleistoceno , que hoy se encuentran sobre el nivel actual de los ríos, y las llanuras aluviales de inundación (várzea), con dos niveles, el más alto de los cuales se inunda cada 5 ó 10 años cuando vienen las grandes crecientes ("conejeras") y el más bajo, lo hace en un lapso corto de tiempo todos los años, y recibe periódicamente sedimentos rejuvenecedores, óptimos para la agricultura (Herrera, 1989). .................................. 41 38.10.9 Los ríos que forman llanuras de inundación extensas, son frecuentemente, aquellos que nacen en las vertientes orientales de los Andes. Desde allí, arrastran sedimentos en suspensión que les dan una apariencia barrosa; de ahí su apelativo de "ríos de aguas blancas". Los sedimentos que cargan, propician el desarrollo de vida orgánica numerosa y variada. Otros ríos nacen dentro del Escudo de las Guayanas o en las superficies de denudación, atraviesan suelos empobrecidos y sus aguas cristalinas o ambarinas adquieren en gran volumen, una coloración oscura, debida a la presencia de minúsculas porciones de ácidos húmicos; de ahí su apelativo de "ríos de aguas negras" (Herrera, 1989).Estos se caracterizan por su extrema acidez, pobreza de nutrientes y escasez de la fauna acuática (Herrera, 1989). ................................. 41 38.10.10 Considerados en general los suelos de la Amazonía son pobres, tanto en materia orgánica como en minerales. Aún los del pie de monte y las vegas inundables son inferiores a los suelos andinos fértiles. Los nutrientes para la frondosa vegetación, no se encuentran en el delgado suelo, sino en la capa de hojarasca y detritus que lo cubre, de donde las plantas los obtienen directamente a través de raíces "alimentadoras" y hongos micorriza (Herrera, 1989). .................................................................................................................................... 41 38.10.11 Con respecto a los solidos en suspensión que transportan los rios Cotuhe, Putumayo y Amazonas, la mayor parte esta representada por arcillas, limos y arenas finas, ademas de algunas fracciones de plancton procedente de los lagos de sus llanuras de inundación. 41 38.10.12 Por su parte, el rio amazonas supera ampliamente el Putumayo en el transporte de solidos en suspensión y alcanza una concentración de 116 mg/l. En contraste, los afluentes del amazonas encontrados en la orilla colombiana presenta una concentración promedio de solidos disueltos de 29 mg/l que corresponde a 4 veces menos que lo encontrado en el amazonas. .................................................................................................................................... 41

38.11 Antecedentes del estudio ..................................................................................... 44 39 FORMULACIÓN del problema y justificación ........................................................... 47

39.1 Formulación del problema ..................................................................................... 47 39.2 Justificación ........................................................................................................... 47

40 Objetivos ....................................................................................................................... 49 40.1 Objetivo General .................................................................................................... 49 40.2 Objetivos Específicos ............................................................................................. 49

44 Materiales y Métodos .................................................................................................... 50 44.1 Muestreo ............................................................................................................... 50

44.1.1 Muestreo de raíces .......................................................................................... 52 44.1.2 Muestreo de suelo .......................................................................................... 52

44.2 Material Biológico ................................................................................................ 53 44.3 Iniciadores para PCR ............................................................................................. 53 44.4 Métodos .................................................................................................................. 54

44.7.1 Tinción de raíces (Philips & Hayman 1970) .................................................. 54 44.7.2 Determinación del porcentaje de colonización ............................................... 55 44.7.3 Extracción de esporas ..................................................................................... 57 44.7.4 Evaluación morfológica de las esporas ........................................................... 59

44.8 ExtraccionExtracción de DNA ............................................................................. 59

44.8.1 Amplificación de la región ITS ....................................................................... 61 44.8.2 Purificación de los productos PCR ................................................................. 63 44.8.3 5.4.5 Clonación ............................................................................................... 63 44.8.4 5.4.3 Análisis de restricción de DNA ribosomal (ARDRA)Digestión de los productos PCR ............................................................................................................................ 63 44.8.6 La digestión de los productos de PCR se realizo de acuerdo a lo reportado por Redecker et al, 1997. utilizando las enzimas de digestión Hinf I y Taq I. La digestión con Hinf I se realizo a 37ºC durante 1 hora y la digestión con Taq I se realizo a 65ºC por 1 hora. Los productos de las digestiones fueron visualizados por electroforesis en geles de agarosa ultrapura al 3% con buffer TAE. Se utilizo dos marcadores de peso molecular (50 pb y 100 pb). ............................................................................................................................ 64 44.8.7 ........................................................................................................................ 64 44.8.8 5.4.4 Visualización de los productos y lectura de patrones de restricción. ... 64 44.8.9 La comparación de los patrones de bandas obtenidas después de la digestión con las respectivas enzimas (RFLP) se realizará utilizando el software Quantity one de Bio-Rad .................................................................................................................................... 65 44.8.10 5.4.6 Secuenciación ...................................................................................... 65

45 Resultados .................................................................................................................... 67 45.1 Porcentaje de colonización .................................................................................... 67 45.4 Recuento de esporas ............................................................................................... 69 45.5 Análisis Fisicoquímicos ......................................................................................... 70 45.6 Análisis morfológico .............................................................................................. 74 45.7 Extracción de DNA ............................................................................................... 79 45.8 Amplificación. ....................................................................................................... 80 45.11 Clonación ............................................................................................................. 83 45.12 Análisis de patrones ARDRA .............................................................................. 86 45.13 Secuenciación ..................................................................................................... 94

46 Discusión de resultados ................................................................................................. 97 46.1 Porcentaje de colonización de HMA y su relación con recuentos de esporas y el contenido de fósforo (ppm) en el suelo. ........................................................................................ 97 46.2 Recuento de esporas de HMA ............................................................................. 100 46.3 Porcentaje de colonización de HMA y su relación con los valores del pH, el contenido de materia orgánica, acidez intercambiable y % de saturación de Aluminio. .................. 102 46.4 Evaluación Morfológica de Esporas .................................................................... 104 46.5 Extracción de DNA .............................................................................................. 106 46.6 Amplificaciones con primers generales y género- específicos, clonación y secuenciación ...................................................................................................................................... 108

47 Conclusiones ............................................................................................................... 113 48 RECOMENDACIONES ........................................................................................... 114 49 ................................................................................................................................... 116 62 Referencias .................................................................................................................. 116 11 Anexos…………………………………………………………………………………..117

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura No 1 Clasificación de los HMA del orden Glomales…………………………………7

Figura No 2 Ciclo de vida de HMA…………………………………………………………...11

Figura No 3 Estructura morfológica de las micorrizas vesiculo arbuscular……………...12

Figura No 4 Chagra del Sur del Trapecio Amazónico……..……………………………....36

Figura No 5 Arreglo Agroforestal de San José del Guaviare……………………………...38

Figura No 6 Área de muestreo Sur del Trapecio Amazónico……………………………...43

Figura No 7 Área de muestreo San José del Guaviare…………………………………....44

Figura No 8 Tipos de muestreos empleados en campo……………………………………45

Figura No 9 Proceso de tinción de raíces……………………………………………………47

Figura No 10 Determinación del porcentaje de colonización……………………….……..48

Figura No 11 Aislamiento de esporas………………………………………………………..49

Figura No 12 Recuento de esporas…………………………………………………………..49

Figura No 13 Representaciones esquemáticas de los genes rRNA con sitios de anillamiento de los

primers……………………………………………………………………52

Figura No 14 Porcentaje de colonización total de HMA en Manihot esculenta en el Sur del

Trapecio Amazónico y San José del Guaviare…………………………………………57

Figura No 15 Porcentaje de colonización de HMA por arbúsculos y vesículas en Manihot

esculenta en el Sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare………………….57

Figura No 16 Recuentos de esporas de HMA en suelos rizosféricos de Manihot esculenta en el

Sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare………………….59

Figura No 17 Relación entre porcentaje de colonización y concentración de fósforo en suelos

rizosféricos de Manihot esculenta en dos regiones de la Amazonía Colombiana……………………

………………………………………………………………..61

Figura No 18 Porcentaje de colonización y su relación con acidez intercambiable y porcentaje de

saturación de aluminio………………………………………………………..62

Figura No 19 Esporas encontradas en suelos rizosféricos de las muestras del sur del Trapecio

Amazónico……………………………………………………………………………65

Figura No 20 Esporas encontradas en suelos rizosféricos de las muestras de San José del

Guaviare…………………………………………………………………………………….65

Figura No 21 Primera y segunda PCR anidada ……………………………………………69

Figura No 22 Clones positivos muestras Sur del Trapecio Amazónico…………………..71

Figura No 23 Clones positivos de los arreglos agroforestales 2, 7,10 y 13 del muestreo de San

José del Guaviare……………………………………………………………………..71

Figura No 24 Clones positivos para GIGA5.8R……………………………………………..72

Figura No 25 Análisis ARDRA CHTR1………………………………………………………73

Figura No 26 Análisis ARDRA CHTR3………………………………………………………73

Figura No 27 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 2……………………………………...74

Figura No 28 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 7……………………………………...74

Figura No 29 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 10…………………………………….75

Figura No 30 Análisis ARDRA Arreglo Agroforestal 13……………………………………75

Figura No 31 Análisis ARDRA (GIGA5.8R) Arreglo Agroforestal 7………………………76

Figura No 32 Análisis ARDRA (GIGA 5.8 R) Arreglo Agroforestal 10…..………………..77

Figura No 33 Secuenciación del clon 12 del arreglo agroforestal 13…………………….78

Figura No 34 Secuencia del clon 6 del arreglo agroforestal 10…………………………...78

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla No 1 Características de los lugares de muestreo……..…………………………….44

Tabla No 2 Secuencias de iniciadores……………………………………………………….46

Tabla No 3 Enzimas de restricción usadas en los ensayos de ARDRA de los amplificados de

HMA…………………………………………………………………………..54

Tabla No 4 Porcentaje de colonización de HMA en raíces de Manihot esculenta……...56

Tabla No 5 Recuento de esporas a partir de 100g de suelo rizosférico………………….58

Tabla No 6 Análisis fisicoquímicos de las muestras de suelo rizosférico del Sur del Trapecio

Amazónico y San José del Guaviare……………………………………………...59

Tabla No 7 Características fenotipicas de las esporas encontradas en los suelos rizosféricos de

Manihot esculenta en las muestras del sur del Trapecio Amazónico y San José del Guaviare……

……………………………………………………………………64

Tabla No 8 Morfotipos encontrados por muestra…………………………………………...66

Tabla No 9 Datos clonación…………………………………………………………………...70

RESUMEN

Se caracterizó la población micorrítica asociada a raíces de yuca (Manihot esculenta) colectadas

en 2 regiones de la Amazonía Colombiana (Chagras del Sur del trapecio Amazónico y arreglos

agroforestales (A.AF) en San José de Guaviare). Se evaluaron diferentes variables como fueron:

porcentaje de colonización, recuento de esporas, identificación taxonómica por características

macro y microscópicas, características fisicoquímicas del suelo y caracterización molecular.

Respecto al porcentaje de colonización se observó que en todas las muestras analizadas se

encontró colonización por MA evidenciándose un valor mayor en las muestras colectadas en San

José de Guaviare. De igual forma el número de esporas por gramo de suelo fue mayor en estas

muestras con respecto a las colectadas en chagras del sur del trapecio amazónico. Los

recuentosmásbajos se encontraron en las rizósferas de yuca colectadas en chagras bajo el

paisaje de llanura aluvial en el sur del trapecio amazónico.

En la identificación taxonómica se encontraron 12 morfotipos en las muestras del sur del trapecio

amazónico y 10 morfotipos en las muestras de San José de Guaviare. Hubo predominancia de

especies del género Glomus, y en menor porcentaje especies de los géneros Acaulospora y

Gigaspora.

Para la caracterización molecular, se extrajo DNA a partir de raíces de yuca colonizadas por

diferentes géneros de hongos MA. A partir de este se realizó una PCR general utilizando primers

universales (ITS4-NS5), obteniéndose un fragmento de aproximadamente 1200 pb. Del producto

obtenido de la PCR general se realizaron PCRs anidadas con primers género específicos (GLOM

5.8 R, GIGA 5.8 R, ACAU 1660, ARCH 1311, LETC 1670), reportados por (Redecker et al, (2000)

para la identificación molecular de hongos MA.

En las muestras evaluadas se observó solamente amplificación con los primers GIGA 5.8 R y

GLOM 5.8 R, específicos para amplificar secuencias de Glomus y Gigaspora respectivamente.

Dos de las seis muestras colectadas en chagras del sur del trapecio amazónico (CHTR1 y

CHTR3) amplificaron con el primer GLOM 5.8 R, evidenciándose un fragmento de

aproximadamente 200 pb, sin embargo no se observó amplificación en ninguna de las muestras

con el primer GIGA 5.8 R. De las muestras colectadas en A.AF en San José de Guaviare, 4 de las

6 amplificaron con el primer específico GLOM 5.8 R (Arreglos agroforestales 2, 7, 10 y 13)

obteniendo un fragmento de aproximadamente 200 pb y 2 con el primer específico para Gigaspora

GIGA 5.8 R (A.AF 7 y 10), obteniéndose un fragmento de aproximadamente 300 pb.

Los productos PCR con el fragmento de interés fueron clonados dentro del vector TOPO pCR2.1

de Invitrogen y transformados en células de E. coli DH5-α químicamente competentes. De cada

muestra evaluada se obtuvo un promedio entre 3 y 17 clones con el inserto de interés, 10 clones

para las muestras del sur del trapecio amazónico y 68 clones para las de San José de guaviare.

De cada clon se extrajo el DNA plasmídico, se purificó y se realizaron los análisis de ARDRA

con las enzimas de restricción Hinf I y Taq I de Invitrogen. Se construyó una matriz de presencia y

ausencia con los resultados de las 2 enzimas, agrupando los clones según su semejanza genética

por medio del coeficiente de Dice y el método de agrupamiento de UPGMA.

En las muestras del sur del trapecio amazónico se encontró en general una alta similaridad entre

los clones evaluados, a diferencia de lo encontrado en las muestras de San José de Guaviare,

donde los clones fueronmásdisímiles, encontrándose con esto una mayor diversidad. De acuerdo

a estos agrupamientos se escogieron los clones para la secuenciación. Hasta la fecha solamente

se tienen datos de 2 secuencias. La primera corresponde al clon número 3 del A.AF 10, el cuál

reportó un 94% de similitud en el alineamiento con el clon Giga 3538.1 aislado de raíces de Inga

parteno en Costa Rica. La otra secuencia corresponde al clon 12 del A.AF 13 la cual fue alineada

con el clon de Glomus Pa106 con una similitud del 92%, clon aislado de raíces colonizadas por

HMA de Prunus africana.

El mayor porcentaje de colonización y diversidad de hongos MA en las muestras colectadas en

A.AF en San José de Guaviare se relacionó con: niveles bajos de fósforo (0.61-5.51 ppm),

porcentaje de carbono orgánico con niveles medios y bajos (1.14 – 2.62 %) y valores de pH

extremadamente ácidos (4.05-5.0). Igualmente se observó que la cobertura de los A.AF

proporciona mayor oferta de recursos y por lo tanto mejores beneficios para el establecimiento de

esta simbiosis.

ABSTRACT

A mycorrhizal population associated to yucca roots was characterized. There were collected in 2

regions of the Colombian Amazon (chagras from the South of the Amazonic trapezium and

agroforestal arrangements AF.A in San José del Guaviare). There were evaluated different

variables which were: colonization percentage, spores recount, taxonomic identification by

macroscopic and microscopic characteristics as well, physicochemical characteristics of the soil,

and molecular characterization. In reference to the colonization percentage, in all the samples

analyzed it was found that AMF colonization showed a greater value in the sample collected in San

José del Guaviare. Also, the number of spores per gram of soil was bigger in these samples than

in the samples collected in the chagras of the South of the Amazonic trapezium. The lowest spore

recounts were found in the yucca rhizospheres collected in chagras under the landscape of llanura

aluvial in the South of the Amazonic trapezium.

In the taxonomic identification there were found 12 morphotypes in the samples collected from the

South of the Amazonic trapezium and 10 morphotypes in the samples collected in San José del

Guaviare. Species of the genera Glomus were the ones which prevailed although there were also

found species from Acaulospora and Gigaspora in a lower percentage.

For the molecular characterization, DNA was extracted from yucca roots colonized by different

genera of AMF. With this DNA a general PCR was performed using ITS4-NS5 universal primers

obtaining a fragment of ca. 1200bp. From the product obtained from the general PCR there were

performed nested PCRs with genera-specific primers (GLOM 5.8 R, GIGA 5.8 R, ACAU 1660,

ARCH 1311, LETC 1670) reported by (Redecker et al., 2000) for the molecular identification of

AMF.

In the samples evaluated there was only observed amplification with the specific primers GIGA 5.8

R and GLOM 5.8 R to amplify Glomus and Gigaspora sequences respectively. 2 of the 6 samples

collected in chagras of the South of the Amazonic trapezium (CHTR1 and CHTR3) amplified with

the GLOM 5.8 R primer showing a fragment of ca. 200bp. However it was not observed any

amplification in none of the samples tested with the GIGA 5.8 R primer. From the samples

collected from AF.A in San José del Guaviare, 4 of the 6 samples amplified with the GLOM 5.8 R

primer (AF.A 2, 7, 10, and 13) obtaining a fragment of ca. 200bp and 2 with the Gigaspora-specific

primer GIGA 5.8 R (AF.A 7 and 10), obtaining a fragment of ca. 300bp.

The PCR products with the intended fragment were cloned inside the TOPO pCR2.1 vector from

Invitrogen and transformed in chemical competent E. coli DH5-alpha cells. From each sample

tested it was obtained an average between 3 and 17 clones with the intended fragment, 10 clones

for the samples from the South of the Amazonic trapezium, and 68 clones for the ones from San

José del Guaviare. From each clone plasmidic DNA was extracted, purified and ARDRA analysis

were performed with the restriction enzymes Hinf I and Taq I from Invitrogen. It was built up a

presence-absence matrix simultaneously considering the results for the 2 enzymes, grouping the

clones according to their genetic resemblance by means of the Dice coefficient and the UPGMA

grouping method.

In the samples from the south of the amazonic trapezium it was found, in general, a high similarity

between the tested clones in contrast to the findings in the samples from San José del Guaviare,

where the clones were more different thus finding a greater diversity. According to these groupings

the clones to be sequenced were chosen. Until now, there only exist data from 2 sequences. The

first, corresponds to clone number 3 of the AF.A 10 which reported 94% of similarity in the

alignment with clone Giga 3538.1 isolated from roots of Inga parteno in Costa Rica. The other

sequence corresponds to clon 12 of AF.A 13 which was aligned with Glomus Pa106 clone with

92% of similarity, the clon isolated from roots colonized by Prunus aficana AMF.

The greater colonization percentage and AMF diversity in the samples collected in AF.A in San

José de Guaviare were related to: low phosphorus levels (0.61 - 5.51 ppm), low and medium levels

of organic carbon percentage (1.14 – 2.62 %) and extremely acid pH values (4.05 – 5.0). Likewise,

it was observed that the covering of the AF.A gives a higher resource offering, thus giving better

benefits for the symbiosis establishment.

INTRODUCCIÓN

En la Amazonía Colombiana los suelos son pobres, tanto en materia orgánica como nutrientes,

estos últimos se encuentran en la capa de hojarasca y detritus de donde las plantas los obtienen a

partir de raíces alimentadoras y hongos de micorriza (Peña et al., 2006).

Los agroecosistemas de la amazonía colombiana presentan como rasgo característico la no

utilización de agroquímicos, a pesar de establecerse en suelos muy poco fértiles. La fertilidad de

los suelos en tales agroecosistemas es altamente dependiente de la participación de la microbiota

del suelo en procesos de descomposición, mineralización, solubilización y fijación simbiótica de

nutrientes. Por esta razón se afirma que las comunidades vegetales de la Amazonía se establecen

bajo un potencial de microorganismos transformadores y enriquecedores del suelo. De ahí la

importancia de conocer la riqueza microbiana presente (www.

geocities.com/RainForest/Jungla/1143/Micorrizas.htm, septiembre 2006).

En los suelos amazónicos, las micorrizas arbusculares, son casi una relación obligada para el

establecimiento de las especies vegetales tanto en condiciones naturales como en

agroecosistemas. El conocimiento de la diversidad de estos microorganismos, el estudio de la

simbiosis que establecen con la vegetación, su relación con factores fisicoquímicos del suelo y

otras poblaciones biológicas, el aporte en el establecimiento de especies vegetales, su uso en la

recuperación de zonas degradadas y en el desarrollo potencial de biofertilizantes, son algunas de

las razones que han llevado al Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas (Sinchi) a

abordar esta comunidad como tema de investigación.

La fase inicial de investigación sobre HMA consiste en identificar las condiciones naturales de la

simbiosis, con el fin de conocer la ocurrencia y distribución nativa de los hongos de micorriza

arbuscular. Por esto se evaluó el porcentaje de colonización, número de esporas presentes en

suelo rizosférico, morfotipos encontrados e identificación molecular a partir de raíces de plantas

micorrizadas.

Uno de los puntos más difíciles de abordar sobre este grupo de microorganismos es su

caracterización taxonómica, lo cual limita el conocimiento de su diversidad y su aplicación. La

razón básica es que estos organismos son simbiontes obligados, por lo que no pueden ser

aislados y mantenidos in vitro; además la única estructura que permite diferenciaciones

morfológicas entre géneros y especies son las esporas que producen y que pueden ser fácilmente

aisladas en el suelo (Dodd et al., 1996 citado en Antoniolli, 1999).

A pesar de que las características morfológicas de las esporas han sido usadas por años para su

determinación, no existen claves taxonómicas suficientes y actualizadas que lleven a una fácil y

correcta determinación, por lo que en muchos casos se necesita de expertos dedicados a esta

labor para la correcta determinación de un morfotipo, y aún entre ellos existen discrepancias sobre

género y especies reportadas (Peña et al., 2006).

El entendimiento de la importancia de la diversidad de HMA en los ecosistemas naturales ha sido

un gran reto. El hecho de que muchas plantas puedan ser colonizadas por la mayoría de HMA

indica una ausencia de especificidad de los hospederos, lo que puede contribuir al mantenimiento

de la diversidad fungal en los suelos. Los estudios de la diversidad de los HMA y la ecología de la

simbiosis se han soportado en datos de la ocurrencia y frecuencia de diferentes tipos de esporas y

métodos de clasificación morfológicos los cuales están limitados por la pequeña cantidad relativa

de diversidad morfológica entre especies. Los hongos se clasifican bajo una base de morfología

de las esporas y su desarrollo. Es frecuentemente difícil identificar los taxones en material de

campo de los aislamientos por la condición y preservación variables de las esporas (Antoniolli,

1999).

La sola utilización de datos de esporas puede dar origen a conclusiones erróneas sobre la

diversidad de las poblaciones de hongos ya que el número de esporas no refleja la presencia de

hongos no esporulantes ni el grado o nivel de colonización por especies particulares en las raíces

vegetales. Más aún, aunque las esporas muestran una baja diversidad morfológica estas son

altamente diversas a nivel genético. Las técnicas de biología molecular ofrecen la posibilidad de

tener métodos rápidos, sensibles y confiables para la identificación de aislamientos fungales tanto

como componentes de las poblaciones de esporas como estructuras vegetativas en raíces y

suelo. También tienen el potencial de proveer información cuantitativa en cuanto al desarrollo

vegetativo del HMA (Antoniolli, 1999).

El número de esporas presentes en el suelo no siempre está relacionado con presencia de HMA

en raíz, ya que en algunas especies la producción de esporas ocurre después de que es

alcanzado el umbral de la colonización. Además, la producción de esporas esta influenciada y

puede ser afectada por diversos factores. El porcentaje de colonización varía en diferentes

especies (Abbot y Robson, 1984 b; Ebbers et al., 1987; McGee, 1989; Gazey et al., 1992;

Tomeroup, 1983 y Gemma et al., 1989). Esto es importante en los estudios de HMA ya que un

número alto de esporas en el suelo no es criterio suficiente para decir que hay una colonización

eficiente dentro de la raíz. Por esto, con las técnicas moleculares, amplificando directamente DNA

de la raíz se puede aclarar si hay o no una colonización efectiva y conocer el genero de HMA que

esta colonizando la raíz.

En años recientes, el desarrollo de técnicas moleculares basadas en PCR ha dado una

aproximación alternativa y valiosa a la identificación morfológica. Estas técnicas moleculares

incluyen: Amplificación de regiones variables tales como los genes ribosomales espaciadores

internos de trascripción (ITS) o espaciadores intergénicos (IGS), polimorfismos en la longitud de

los fragmentos de restricción (RFLP´s) , amplificación de secuencias cortas repetidas

(microsatélites) y amplificación al azar de DNA polimorfito (RAPD). Aunque estos métodos han

sido aplicados exitosamente a estudios de HMA el uso potencial de la región ITS para diseñar

primers a ser usados para identificación de especies y cuantificación no ha sido bien explorado. La

utilización de la región ITS tiene ventajas porque los genes pueden ocurrir en copias múltiples y

las regiones son lo suficiente variables para permitir una clara discriminación entre especies

cercanamente relacionadas (Antoniolli, 1999).

En cuanto al área de estudio los inventarios de micorrizas arbusculares de la región amazónica

son escasos y en muchos casos los morfotipos aislados no han sido descritos o incluidos en las

guías taxonómicas publicadas, por lo que el conocimiento de la diversidad de estos hongos en la

región es limitada. De allí la necesidad de usar otras técnicas que apoyen estos estudios. En el

año 2001 Schüßler et al revolucionó la taxonomía de Glomales a partir del análisis molecular de

las secuencias SSU del rRNA, lo cual permitió reconocer las técnicas moleculares como una

alternativa válida para su estudio.

Con base en lo anterior, y teniendo en cuenta que no existe información detallada acerca de la

heterogeneidad de especies presentes en la región amazónica colombiana, se planteó la

realización de un trabajo de investigación, cuyo objetivo general fue: Caracterizar la población

micorrítica presente en raíces de plantas de yuca (Manihot esculenta) aisladas de dos regiones

de la Amazonía Colombiana. El análisis de la región ITS del rDNA se constituye una herramienta

molecular valiosa para la identificación de estos hongos de manera rápida y confiable,

complementando la metodología tradicional.

La yuca (Manihot esculenta) ha sido uno de los principales cultivos agrícolas de las comunidades

amazónicas, además de ser, su base alimenticia. Es empleada como ritual de intercambio cultural

y comercial. Es por esto que fue seleccionada como modelo de estudio (Arias, J et al., 2005). La

yuca es también una especie vegetal que tiene gran afinidad con la simbiosis de HMA debido a

sus necesidades nutricionales en suelos tan pobres como los de la región amazónica.

MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA

Micorrizas

Las asociaciones simbióticas entre raíces vegetales y hongos fueron denominadas en 1885 por el

patólogo forestal alemán A. B. Fran como micorriza, derivado de la palabra en griego que traduce

raíz fungal (Aristón, 1999).

Las micorrizas, de las que hace muchos años se sabe son comunes en árboles forestales, hoy en

día se consideran como las raíces nutricias normales de la mayoría de las plantas, incluyendo

cereales, hortalizas, plantas de ornato y, por supuesto, los árboles (Agrios, 2002).

Hay tres tipos de micorrizas que se distinguen por la forma en que las hifas del hongo se

encuentran dispuestas dentro de los tejidos corticales de la raíz:

Las ectomicorrizas. Se caracterizan por formar en las células corticales una red de micelio

característica denominada red de Hartig. Estas raíces comúnmente son hinchadas y en algunas

combinaciones que se establecen dentro el hongo y su hospedante se encuentran

considerablemente más bifurcadas que las raíces no micorrizales. Las ectomicorrizas se forman

principalmente en árboles forestales debido a los basidiomicetes que forman setas y bejines y a

varios ascomicetes. Las esporas de los hongos ectomicorreicos se forman sobre el suelo y son

diseminadas por el viento. Las hifas de estos hongos frecuentemente producen un “manto

fungoso” estrechamente entretejido en torno a las raíces nutricias y dicho manto tiene un grosor

que varia desde el diámetro de una a dos hifas hasta como de treinta a cuarenta. Dichos hongos

penetran también en las raíces, pero solo crecen alrededor de las células corticales,

reemplazando a parte de la lámina media entre las células y formando la denominada red de

Hartig (Agrios, 2002).

Los árboles con asociaciones ectomicorríticas son dominantes en bosques de confieras, en

regiones boreales frías o alpinas, y muchos bosques de hoja ancha en regiones templadas o

mediterráneas, pero también se presentan en sabanas tropicales o subtropicales o en bosques

lluviosos. La mayoría de los hospederos de ectomicorrizas son los árboles o arbustos, pero

existen asociaciones formadas por unas pocas plantas herbáceas. Los hongos ectomicorriticos

contribuyen significativamente con la biomasa de los ecosistemas de bosque. Las hifas de los

hongos ectomicorriticos tienen capacidad saprofitita, pueden absorber fósforo y nitrógeno de

fuentes inorgánicas y orgánicas (Bledsoe 1992).

En las endomicorrizas el hongo crece dentro de las células corticales de la raíz y forma

estructuras características (Currah 1991). Existen dos tipos de endomicorrizas, el grupo más

común se distingue por presentar hifas aseptadas, vesículas y estructuras ramificadas que le

confieren el nombre de micorrizas vesículo-arbusculares. El segundo grupo está constituido por

hongos con hifas septadas que invaden las células de la raíz sin romper la membrana plasmática

y crecen dentro de la célula formando estructuras globosas (Richardson et al., 1993).

Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que proceden de los propágulos

existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raíz micorrizados, o plantas micorrizadas

que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la superficie de una célula epidérmica de

la raíz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa colonizadora que penetrara en

dicha célula o atravesara el espacio intercelular. En la zona externa del cortex de la raíz forma

unas estructuras intracelulares típicas que son los ovillos; en la zona media las hifas crecen

normalmente en forma longitudinal en los espacios intercelulares; Mientras que en la zona interna

las hifas penetran intracelularmente y forman los arbusculos por ramificación dicotómica repetida,

a nivel de los cuales se produce el intercambio de nutrientes.

También habría que destacar la formación de vesículas en el cortex cuya función es el

almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonización interna se produce la ramificación y

desarrollo del micelio externo, que es clave en la captación de nutrientes y da lugar a nuevos

puntos de colonización en la propia raíz o en otras próximas. Sobre la red tridimensional de hifas

que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia que, al madurar, completan el

ciclo del hongo (Bledsoe 1992). Estas micorrizas no se encuentran rodeadas por un manto

fungoso denso, sino por una masa micelial laxa que se forma sobre la superficie de la raíz a partir

de la cual se forman subterráneamente hifas y grandes zigosporas de color perla o bien

clamidosporas. Las endomicorrizas tienen una distribución mundial, encontrándose desde los

ecosistemas árticos hasta los ecosistemas desérticos (Bledsoe, 1992).

Las endomicorrizas son la simbiosis predominante tanto en coberturas naturales como en

coberturas antrópicas. Igualmente se ha observado que el fenómeno de dominancia de algunas

especies es más evidente en zonas con climas fríos que en zonas de climas templados (Bhatia et

al., 1996)

Los hongos micorriticos arbusculares son todos miembros de la división Glomeromycota del

orden de los Glomales; la clasificación actual contiene 2 subórdenes que son Glomineae y

Gigasporineae; dentro de los Glomineae se encuentras las familias Glomaceae (Glomus),

Acaulosporaceae (Acaulospora y Entrophospora), Archaeosporaceae (Archaeospora) y

Paraglomaceae (Paraglomus) y dentro del suborden Gigasporineae se encuentra la familia

Gigasporineae (Gigaspora y Scutellospora (INVAM, 2006) (Figura 1). El número de especies

http://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77441998000200004&script=sci_arttext#Richardson#Richardsonhttp://www.scielo.sa.cr/scielo.php?pid=S0034-77441998000200004&script=sci_arttext#Currah91#Currah91

dentro de los glomales actualmente es de 154 (INVAM, 2006).

Figura 1: Clasificación de los HMA del orden Glomales (INVAM, 2006)

Importancia de las micorrizas

Las micorrizas al parecer mejoran el crecimiento de la planta al aumentar la superficie de

absorción del sistema radial; al absorber selectivamente y al acumular ciertos nutrientes,

especialmente el fósforo; al solubilizar y hacer disponibles para la planta algunos minerales

normalmente insolubles; al permitir que las raíces alimentadoras funcionen durante más tiempo; y

al hacer que las raíces alimentadoras sean más resistentes a la infección que ocasionan algunos

hongos del suelo tales como Phytophthora, Pythium y Fusarium (Agrios, 2002).

Sin embargo, debe tenerse en cuenta que hay muchas asociaciones distintas que se establecen

entre el hongo y su hospedante y que cada combinación puede tener efectos distintos sobre el

crecimiento de la planta. Algunos hongos micorriticos tienen un amplio rango de hospederos,

mientras que otros son más específicos. Así mismo, algunos de ellos benefician el mayor grado a

un determinado hospedante que otros hongos, y algunos hospederos sacan un mejor provecho al

asociarse con ciertos hongos micorriticos que con otros hospedantes. Los hongos micorrizales

necesitan también a un hospedante para poder crecer y reproducirse; en ausencia de

hospedantes, el hongo se mantiene en reposo en forma de esporas (Agrios, 2002).

Las micorrizas arbusculares estimulan el crecimiento, desarrollo y nutrición de las plantas,

especialmente en suelos de baja y moderada fertilidad los estudios llevados a cabo han puesto de

manifiesto que dichos efectos se deben a que la micorriza mejora sustancialmente la absorción de

nutrientes y agua por la planta y que el principal nutriente implicado es el fósforo (Barea et al.,

2002).

Se sabe que la mayor parte de los suelos naturales tienen un bajo contenido en fosfato asimilable,

e incluso la mayoría de los suelos arables productivos necesitan un aporte considerable de

fertilizante fosforado para mantener su fertilidad. En efecto, el 95-99% del fósforo de un suelo esta

integrado en compuestos orgánicos o inorgánicos insolubles. De otro lado, se conoce que el ritmo

de absorción de los iones fosfato por la planta es superior al del desplazamiento de dichos iones

desde el suelo no rizosférico hacia la raíz. Ello condiciona que se forme una zona de agotamiento

del elemento en la rizósfera. Esta zona de agotamiento, que ha podido ser puesta de manifiesto

por autorradiografía, es la base que justifica que el PO4-3 sea el factor limitante del crecimiento de

las plantas en gran número de suelos. Efectivamente, el desplazamiento del ión fosfato hacia la

raíz tiene lugar por difusión; en su camino hacia la planta se fija fácilmente a arcillas y coloides del

suelo por medio de combinaciones insolubles con calcio, hierro o aluminio (Barea et al., 2002).

Los mecanismos propuestos para explicar la mayor capacidad de absorción de fósforo por las

plantas están basados en lo siguiente: (a) que la micorrización induzca cambios morfológicos en la

planta; (b) que la micorrización induzca cambios fisiológicos, lo que provocaría un incremento de

la capacidad de la superficie de la raíz de la planta para absorber fósforo; (c que la micorrización

proporcione una superficie de absorción adicional (hifas del hongo), o más eficaz; (d) que las hifas

o las raíces micorrizadas tengan capacidad para solubilizar fuentes de fósforo no disponibles para

raíces no infectadas y (e) que la raíz micorrizada tenga más longevidad que la que no lo esta

(Barea et al., 2002).

Clasificación de HMA

La clasificación puede estar basada tanto en la identificación de una población como en la

estructura para entender las relaciones filogenéticas entre unidades taxonómicas (Bentivenga y

Morton, 1994). Todas las clasificaciones están basadas en las mismas categorías taxonómicas

lineanas (por ejemplo especie, genero). Sin embargo las clases y las causas de diversidad son

menos universales y pueden existir grandes diferencias dentro de cada uno de los organismos.

Las esporas fueron el único foco de atención en el que se centraron los primeros estudios de

taxonomía de los HMA. Los cuales no fueron formalizados utilizando la nomenclatura tradicional

hasta 1974 (Gerdemann y Trappe, 1974). Pocas áreas del mundo han sido extensivamente

muestreadas para especies silvestres de HMA y las investigaciones taxonómicas todavía

incluyen unos componentes de exploración y descripción significativo (Morton, 1993).

Hasta ahora la espora ha sido la estructura más importante usada para la identificación. El

diámetro de las esporas de HMA en el suelo se encuentra en un rango de 50-600 µm (Mosse et

al., 1981).

La primera aproximación a la clasificación de HMA fue hecha en los años 1960’s todas las

especies fueron puestas dentro del genero Endogone de los zigomicetos basándose en la

producción de esporas muy grandes multinucleadas. Después fueron agrupados los géneros

Acaulospora, Gigaspora, Glaziella, Modicella y Sclerocystis con Endogone en Endogonaceae,

Zygomycetes en ese tiempo se conocían unas pocas características, pero a medida que fueron

descritas nuevas especies, se descubrieron nuevos caracteres y la información base fue

ampliada. Glaziella y Modicella fueron transferidos a los Ascomycetes. Ames y Schneider (1979)

eligieron un nuevo genero, Entrophospora, y Walker y Sanders (1986) situaron a la especie

Gigaspora sensu lato (con paredes internas y un escudo de germinación) a un nuevo genero

Scutellospora.

Entre 1982 y 1990, el número de HMA descrito se incremento marcadamente Trappe (1982), en

su clave sinóptica para la familia Endogonaceae, describió 77 especies excluyendo Endogone, y

Hall (1984) en su clave dicotómica para Endogonaceae listo 67 especies, otra vez excluyendo a

Endogone. Luego, Schenck y Pérez catalogaron 120 especies descritas (1987) y

subsecuentemente 147 especies (1990) en el género de hongos que producen asociaciones

micorríticas. Walker (1986) y otros (Berch y Koske, 1986; Morton, 1986; Spain et al, 1989)

definieron tipos de paredes fenotípicamente diferentes y separables, representados por

murogramas (Representación grafica de tipos de paredes y sus posiciones relativas). Esta

clasificación de HMA se basa en características morfológicas de esporas (incluyendo murógrafos),

ya que los caracteres vegetativos de los hongos no varían mucho entre taxones y están también

influenciadas por especies de hospederos vegetales.

Ciclo de vida de HMA

Las micorrizas arbusculares se originan a partir de hifas que proceden de los propágulos

existentes en el suelo (esporas maduras, fragmentos de raíz micorrizados, o plantas micorrizadas

que crecen en vecindad). Cuando una hifa contacta con la superficie de una célula epidérmica de

la raíz, forma un apresorio que originara seguidamente la hifa colonizadora que penetrara en

dicha célula o atravesara el espacio intercelular. En la zona externa del cortex de la raíz forma

unas estructuras intracelulares típicas que son los “ovilllos”; en la zona media las hifas crecen

normalmente de forma longitudinal en los espacios intercelulares; mientras que en la zona interna

las hifas penetran intercelularmente y forman los arbusculos por ramificación dicotómica repetida,

a nivel de los cuales se produce el intercambio de nutrientes (Figura 2).

Figura 2. Ciclo de Vida de HMA (INVAM, 2006).

También habría que destacar la formación de vesículas en el cortex cuya función es el

almacenamiento de reservas lipidicas. Tras la colonización interna se produce la ramificación y

desarrollo del micelio externo, que es clave en la captación de nutrientes y da lugar a nuevos

puntos de colonización en la propia raíz o en otras próximas. Sobre la red tridimensional de hifas

que constituye se forman las esporas, estructuras de resistencia que, al madurar completan el

ciclo del hongo (Figura 3).

Figura 3.

Estructura morfológica de las micorrizas vesículo arbuscular (http://www.turipana.org.co/micorrizas.htm

corredor Gloria)

http://www.turipana.org.co/micorrizas.htmhttp://www.turipana.org.co/micorrizas.htm

Etapas del desarrollo de Hongos de Micorriza Arbuscular en sistemas suelo/planta

Los Hongos de Micorriza Arbuscular (HMA) son simbiontes biotróficos obligados con un ciclo de

vida dividido en dos etapas distintas. Por un lado, los estadios de reposo y reproductivo (esporas,

esporocarpos, y posiblemente también vesículas) son independientes de la planta. Por otra parte,

los estadios vegetativos están involucrados en interacciones complejas con las plantas entre las

cuales se incluyen el reconocimiento, la colonización y el intercambio de nutrientes. Estas etapas

son representadas por el desarrollo de hifas externas en el suelo e hifas y espirales, arbusculos y

vesículas dentro de la raíz.

Esporas de HMA

Las esporas son producidas rápidamente en presencia de una planta hospedera, de manera que

a los 4 a 6 meses son producidas miles de nuevas esporas del mismo tipo. Las esporas son

formadas en el micelio extraradical o agregadas en estructuras más o menos bien definidas

llamadas esporocarpos. Aunque en algunas especies las características de los esporocarpos son

importantes, las características individuales de las esporas son las que principalmente se utilizan

para la identificación. Las esporas difieren en forma, estructura, contenido citoplasmático, color,

tamaño, número de paredes vía de germinación, morfología de esporas secundarias y presencia o

ausencia de esporocarpos (Mosse et al., 1981; Gerdemann y Trappe, 1974; Morton, 1990).

El fenotipo de la espora es el resultado de procesos de desarrollo completamente diferentes de

aquellos del talo, por lo que la espora es considerada ser autónoma en forma y función por

algunos investigadores. Sin embargo, el tubo germinal de la espora puede originarse a partir de

una red hifal filamentosa, arbusculos, vesículas o células accesorias (Morton et al., 1995b). El

compromiso de la hifa arbuscular altamente modificada en la colonización no es muy posible.

Morton (1993) considera que un individuo fungal es representado por una sola espora identificable

la cual consiste de una sola célula multinucleada. Esta célula puede dar origen a una nueva

colonia fungal con componentes del micelio dentro de una raíz y en el suelo. Esta colonia

vegetativa eventualmente dará origen a nuevos individuos en forma de nuevas esporas.

Las esporas son células morfológicamente especializadas las cuales no contribuyen directamente

ni soportan actividades del desarrollo de la micorriza e interacciones hospedero-hongo. La función

de la espora es llevar la información genética a nuevos hábitats e iniciar nuevos individuos

espacialmente separados del organismo parental. En ausencia de información sobre el ciclo

nuclear o existencia de etapas sexuales no es posible determinar si las esporas representan

realmente nuevas generaciones de nuevos individuos. Sin embargo, existe una gran variabilidad

genética entre las esporas dentro de una sola especie e incluso entre las que se originan de un

cultivo que parte de una sola espora (Lloyd-McGilp et al., 1996; Rosendahl y Taylor, 1997;

Sanders et al., 1995; Wyss y Bonfante, 1993; Zézé et al., 1997). Esto complica los factores y

resalta la necesidad de investigaciones en el ciclo de vida y la genética del hongo.

Germinación de las esporas

La germinación de esporas es una parte integral del ciclo de vida de los hongos de micorriza

arbuscular ya que representa la iniciación de la etapa vegetativa del crecimiento. Los caracteres

de germinación son importantes para la taxonomía ya que son utilizados para distinguir entre los

dos géneros de Gigasporinae, Gigaspora y Scutellospora. En Gigaspora la germinación ocurre

directamente a través de la pared celular mientras que en Scutellospora ésta ocurre a partir de un

escudo de germinación formado sobre o dentro de una capa de pared interna (Walter y Sanders,

1986).

La dormancia de esporas puede variar desde dos semanas hasta muchos meses en especies de

Acaulospora, G. intraradices y Gigaspora gigantea (Gazey et al., 1992; Tommerup. 1983). La

germinación de esporas puede también estar influenciada por el pH, la humedad, los exudados de

la raíz hospedera y otros factores (Tommerup, 1983; Hetrick, 1984; Hepper, 1984; Siquiera et al.,

1985). Por ejemplo, las esporas de Glomus mosseae germinan más rápidamente cuando son

almacenadas a bajas temperaturas (Hepper y Smith, 1976). Muchas bacterias del suelo pueden

afectar la germinación de esporas. Algunas pueden ser inhibidoras mientras otras promueven la

germinación y formación micorrizales (Fitter y Garbaye, 1994).

En presencia de factores de la raíz hospedera, el crecimiento hifal a partir de esporas no es

todavía bien comprendido. Originalmente se propuso que la falta de síntesis de DNA y

proliferación nuclear podrían ser la causa (Burggraaf y Beringer, 1989), pero las observaciones de

migración nuclear y replicación de DNA nuclear en la hifas creciendo a partir de esporas

(Bianciotto y Bonfante, 1993); Bécard y Pfeffer, 1993), han llevado al rechazo de ésta hipótesis, y

otros mecanismos deben ser los responsables de la falta de crecimiento. Estos podrían incluir

sistemas de transporte de membrana no efectivos tal que la habilidad de absorber nutrientes es

limitada (Smith y Smith, 1986).

Las esporas transportadas por el suelo de HMA son consideradas las estructuras reproductivas

más importantes, pero sus números en suelo están a menudo poco relacionadas con la formación

de micorrizas en raíz (Abbott y Robson, 1984b; Ebbers et.al, 1987; McGee, 1989). Para algunas

especies, la producción de esporas solo ocurre después de que un nivel umbral de colonización

es alcanzado (Gazey et al., 1992). Además la producción de esporas es influenciada por muchos

factores incluyendo la planta hospedera y el tipo de suelo.

Solo se pueden hacer pocas generalizaciones útiles acerca de las condiciones que llevan a la

formación de esporas a parte de la necesidad dejar pasar algunos meses desde la colonización

inicial del hospedero. En relación a otros propágalos micorríticos de MA, las esporas son

consideradas generalmente como más resistentes a condiciones adversas (Abbott y robson,

1982b) que otros fragmentos colonizados de raíz o hifas y pueden actuar como estructuras de

supervivencia a largo plazo, con alguna capacidad para la dispersión por agua y por viento (Koske

y Gemma, 1990; Friese y Allen, 1991).

Colonización

El proceso y la taza de colonización determinan la efectividad de un HMA o una asociación

micorrizal. La colonización puede originarse a partir de esporas, fragmentos de raíz infectados o

hifas (Smith y read, 1997). La red hifal y los fragmentos de raíz son dados a ser la fuente principal

por la cual las plantas son colonizadas (Smith y Walter, 1981; Jasper et al., 1992; Hepper, 1981).

Al mismo tiempo que la infección de esparce dentro de las células corticales de la raíz hospedera,

un micelio de hifas extraradicales crece afuera, hacia el suelo. Las hifas extraradicales tienen un

papel importante en la adquisición de nutrientes y forman una fuente de colonización secundaria a

lo largo de y entre las raíces (Harley y Smith, 1983; Smith y Gianiazzi-Pearson, 1988; Smith et al.,

1992).

Dentro de la corteza, las hifas crecen longitudinalmente entre las células e intracelularmente para

formar arbusculos. Utilizando a G. mosseae como modelo, Giovannetti et al., (1993) demostraron

que los primeros apresorios fueron formados dentro de las 36 horas siguientes al principio de la

interacción con Ocimum basilicum y Helianthus annuus y los primeros arbusculos fueron formados

entre las 42 y las 48 horas después de la inoculación de H. annuus. Estas observaciones

concuerdan con observaciones anteriores (Cox y Sanders, 1974; Brundrett et al., 1985). Utilizando

un sistema de materas nodriza con Glomus intraradices y Lycopersicon esculentum, Rosewarne

et al., (1997) mostraron que después de solo 4 días aproximadamente el 60% de la raíz estaba

asociada con hifas y el pico de número de arbusculos ocurrió 4 días después de que el

crecimiento hifal lograra su máximo. Es asumido por parte de muchos investigadores que los

arbusculos son la interfase principal para la toma de azúcares por parte del hongo y la

transferencia de iones desde el hongo a las células corticales de las raíces de las plantas

hospederas, aunque existen evidencias de la separación espacial de las funciones de

transferencia de Carbono y Fósforo y esta disponible una interfase hifal y arbuscular. (Gianiazzi-

Pearson, 1991; Smith y Read, 1997).

Las vesículas, que son órganos de almacenamiento que contienen gran cantidad de lípidos y

muchos núcleos, son formadas por miembros de Glominaceae después de que la unidad de

infección ha madurado. Las vesículas producidas por muchos HMA se considera que funcionan

como órganos de almacenamiento temporal. Sin embargo éstas tienen a menudo paredes con

múltiples capas, como las esporas, y pueden funcionar como propágalos cuando están aisladas

de la raíz (Biermann y Linderman, 1983).

Poblaciones de HMA en ecosistemas naturales

Existe muy poca información acerca de HMA en ecosistemas naturales, sin embargo han surgido

evidencias de que la diversidad es mayor que la que se ha inferido a partir de estudios

morfológicos de esporas. Las poblaciones en diferentes ecosistemas, sobre la base de conteo de

esporas, varían entre 5 y 25 especies diferentes. Este número depende de las especies

hospederas involucradas (tabla 2.1). El número de esporas no siempre esta bien correlacionado

con el grado de formación micorrizal (Brundrett, 1991) y su porcentaje de germinación varía en

diferentes tiempos del año (Tommerup, 1983; Gemma et al., 1989)

La composición de una especie de HMA puede ser explicada como una respuesta a los cambios

en la comunidad de plantas, ya que la naturaleza obligada de los simbiontes de HMA une el

crecimiento y la reproducción tanto de la planta hospedera como del hongo a las condiciones del

suelo (Adelman y Morton, 1986; Hendrix et al., 1995; Sanders y Fitter, 1992a). En estudios de

campo, se ha mostrado que la secuencia de cosechas modifica la comunidad de HMA y la

composición de especies. La predominancia de una sola especie de HMA para cada cosecha se

desarrolló en secuencias continuas de maíz y soya (Johnson et al., 1991), favoreciendo la

especies benéficas para la cosecha y reduciendo la población de especies de HMA menos

benéficas (Johnson et al., 1992a).

Las prácticas de manejo tales como la labranza (Evans y Miller, 1988), tasa y método de

aplicación de fósforo, aplicación de pesticidas o abonar con cal se ha demostrado que también

influencian la esporulación y la colonización por HMA (Duke et al., 1994; Medeiros et al., 1994;

Ryan et al., 1994; Wang et al., 1993). En algunos casos la diversidad de la comunidad de HMA ha

sido incrementada en el manejo de sistemas que utilizan la rotación de cultivos y entradas

reducidas de herbicidas (Douds et al., 1993).

Para estudiar la contribución micorrizal a una comunidad de plantas de sucesión temprana en el

campo, Gange et al., (1990) utilizó un fungicida para reducir la colonización durante el primer año

de establecimiento de las plantas en suelo raso. Una menor cantidad de especies de plantas se

establecieron en comunidades tratadas con fungicidas, soportando la idea de que los HMA

promueven la diversidad de especies de plantas (Helgason et al., 1998; Van der Heijden et al.,

1998). Los hongos micorrizales deben también afectar el patrón de diversidad de especies y la

abundancia relativa, una vez el estatus micorrizal de la comunidad de plantas ha sido restaurado

en un ecosistema previamente perturbado (Barea y Jeffries, 1995). El HMA puede reducir la

diversidad de plantas si la simbiosis representa un beneficio relativamente más grande para la

especie dominante dentro de la comunidad Hetrick et al., 1994).

Cuando los ecosistemas son perturbados, por ejemplo por monocultivos o por utilización de

pesticidas, la dinámica de la comunidad es perturbada y se puede desarrollar un sesgo hacia

pocos e incluso un solo hongo dominante (Johnson et al., 1992a). Por ejemplo, en algunos

ambientes la labranza y el uso de fertilizantes ha llevado a que se encuentren menos especies de

HMA en el suelo (Hetrick y Bloom, 1983; Schenck y Kinloch, 1980) mientras que en otros el uso

agricultural debe promover una mayor diversidad (Abbott y Robson, 1977).

Aunque los estudios poblacionales de hongos micorrizales de MA están basados en caracteres

morfológicos de los cuerpos fructificantes, esporas, micelios vegetativos o estructuras simbióticas,

la aproximación es todavía limitada dado que los factores que influencian la esporulación de una

especie individual son poco entendidos y no pueden ser extrapolados hasta la extensión de

colonización vegetativa de diferentes especies de plantas. Las poblaciones de esporas proveen

solo una indicación relativa de la abundancia y la composición de especies de poblaciones

fungales de MA. Sin embargo, los estudios moleculares de la diversidad de los hongos (Van

Tuinen et al., 1994) en ecosistemas naturales pueden ofrecer un mejor medio de identificación

para información sobre poblaciones, especialmente cuando es difícil acumular un número

suficiente de características morfológicas.

La ocurrencia de muchas especies de HMA en suelos o dentro de raíces sugiere, que la

competencia interespecífica es posible. La variación en la producción de esporas entre endófitos

coexistentes ha sido observada (Gemma et al., 1989) y una abundante producción de esporas por

un HMA era usualmente correlacionada con niveles más bajos de producción de esporas por

otros. Esto puede deberse al antagonismo entre las especies. En experimentos de cultivo con

materas, donde muchos aislamientos de HMA son inoculados conjuntamente, se ha probado que

algunos son mejores competidores que otros (Wilson, 1984; López-Aguillon y Mosse, 1987).

Planta hospedera y producción de esporas

Casi el 90% de las especies de plantas vasculares hasta ahora examinadas pueden ser

colonizadas por HMA (Harley y Smith, 1983) y son normalmente micorrizales en el campo. La

especificidad del hospedero es aparentemente muy baja. Bajo condiciones experimentales un solo

aislamiento del hongo puede formar asociaciones con plantas hospederas taxonómicamente

diversas (Gerdemann, 1975; Smith y Read, 1997) y solo una especie de planta hospedera se

asocia con muchos aislamientos fungales, llevando a la visión ampliamente aceptada de que las

asociaciones micorríticas carecen de especificidad. Sin embargo hay algunas evidencias de que

existe un cierto grado de especificidad entre HMA y plantas, particularmente en ecosistemas

naturales (Rosendahl et al., 1994; Sanders y Fitter, 1992b; Smith y Read, 1997).

No hay duda de que las asociaciones incluyendo diferentes especies de plantas y hongos exhiben

una variabilidad funcional. Algunas plantas hospederas dan un mayor beneficio al HMA que otras,

lo cual es reflejado en las diferencias de cantidad de producción de esporas. En la mayoría de los

casos la formación de esporas esta estrechamente relacionada con la longitud total de las raíces

micorrizales producidas por determinado hospedero (Giovannetti et al., 1988; Hetrick y Bloom,

1988; Howeler et al., 1987; Simpson y Daft, 1990; Gazey et al., 1992). De este modo, la

proporción de diferentes especies en determinado lugar dependerá de la extensión a la cual

colonicen los sistemas radiculares de las plantas. Cualquier grado de especificidad o diferencia en

la efectividad será entonces reflejado en las poblaciones de esporas.

Hay evidencias que soportan esta idea. En una investigación de plantas perennes de 19 familias,

en un desierto del Sur de California, la mayoría de las plantas eran hospederos potenciales para

hongos endomicorriticos y fue mostrado que la diversidad de estos hongos esta directamente

relacionada con la diversidad de plantas (Bethlenfalvay et al., 1984). De nuevo la situación es

compleja ya que en algunos estudios de comunidades de plantas los datos han sido presentados

mostrando que toda la diversidad de hongos puede ser soportada por un gran número de

especies relacionadas (ie. en el mismo género o familia) mientras que especies de solo una planta

solo soportaban algunos de los hongos (Brundrett y Kendrick, 1988; Trappe et al., 1984). Más

aún, en un estudio de los hongos presentes en el bosque bluebell, Scutellospora, Acaulospora y

Glomus solo ocurrían cuando la planta Hyacinthoides non-scripta estaba presente (Clapp et al.,

1995), otra vez, implicando algún nivel de especificidad del hospedero.

Este resultado confirma los estudios realizados por Molina et al. (1978), los cuales mostraban que

dos o más especies pueden colonizar una planta individual. Los datos en esta área no son

extensivos y por esto los métodos que nos permiten comparar el grado de colonización de raíces

por especies individuales con producción de esporas son esenciales para comprender a cabalidad

la competencia entre especies de hongos y las especificidad de las plantas hospederas.

Las asociaciones micorrizales son normalmente benéficas, (mutualísticas) para las plantas

(Johnson et al., 1997; Smith y Read, 1977). Las micorrizas incrementan la tasa de crecimiento de

las plantas a través de un incremento en la toma de nutrientes, especialmente Fósforo bajo

condiciones controladas (Fitter, 1989; Smith et al., 1994; Jackson et al., 1972), sin embargo, bajo

condiciones naturales, no hay suficiente evidencia que muestre los incrementos en el crecimiento

de las plantas debido a micorrizas (Fitter, 1989; Newsham et al., 1995a; West et al., 1993).

Las respuestas de bajo crecimiento podrían estar asociadas con las diferencias en la efectividad

de las especies micorrizales (eg. Abbott y Robson, 1981a; Abbott y Robson, 1981b; Bevege y

bowen, 1975; Jakobsen et al., 1992).Por ejemplo, el pequeño endófito Glomus tenue no produce

una respuesta de crecimiento, aún en suelo con baja fertilidad (Powell, 1979), G. intraradices y G.

City Beach WUM 16 incrementaron el crecimiento de la planta y la toma de fósforo, pero G.

etunicatum y G. mosseae no tuvieron efectos en el crecimiento de la planta ni en la toma de

Fósforo en diferentes niveles de compactación del suelo (Nadian et al., 1998). La contribución

relativa de las raíces en la toma total de fósforo vario ampliamente entre plantas colonizadas por

S. calospora, Glomus sp. y G. caledonium en cohombro (Pearson y Jakobsen, 1993). Entonces,

las diferencias entre los HMA de sus requerimientos aparentes de eficiencia de toma de carbono o

nutrientes deberían ser evaluados para HMA de especies colectadas en campo. Mas aún, en esta

situación, las sondas moleculares harán más fácil la distinción de diferentes especies de hongos

que están actualmente presentes en las raíces.

Los efectos de los HMA en plantas son dependientes de la planta hospedera y las condiciones

ambientales (Sieverding o Howeler, 1985; Smith y Read, 1997; Smith, 1993; Newsham et al.,

1995b). Los números de esporas de HMA individuales en un ecosistema natural de sabana en

Colombia cambiaron como resultado de diferentes prácticas de manejo (Dodd et al., 1990). En los

suelos originales, doce tipos de esporas fueron identificadas y se observó que las poblaciones de

diferentes tipos de esporas cambiaron rápidamente bajo diferentes regimenes de cosecha. Por

ejemplo, las esporas de Glomus occultum y Acaulospora myriocarpa incrementaron en

subtransectos de sorgo, mientras que aquellos de Entrophospora colombiana, A. melleae y A.

morrowiae dominaron subtransectos donde cowpea (Vigna unguilata) crecía tras un cultivo de

kudzu (Pueraria phaseoloides) (Dodd et al., 1990b). Este estudio soporta la idea de que