información que garanticen el uso adecuado de la misma y preserve el derecho de todo paciente a la confi-

dencialidad y respeto.

En la actualidad con la moderniza-

ción de los laboratorios, la constante rotación del personal y la demanda de pruebas, la protección de la infor-mación se vuelve un reto que debe-mos superar día a día, haciendo uso del recurso más valioso con el que contamos que es el recurso humano

que labora en nuestros laboratorios.

Es sensibilizando, generando empat-ía y compromiso en nuestros colegas y demás trabajadores de salud, que lograremos el cumplimiento de los principios éticos de respeto, privaci-dad, confidencialidad y justicia, que cada persona que solicita los servi-

cios de salud merece y espera recibir.

Como región centroamericana hemos avanzado mucho en el desa-rrollo de nuestras capacidades tec-nológicas y de mejora continua, pero todavía tenemos la tarea de seguir mejorando el manejo de la informa-ción a través de la implementación de estrategias integrales de desarrollo

humano, técnico y administrativo, que nos permitan brindar servicios

confiables y con calidez.

Licda. Patricia L. Mira Gómez

Directora Laboratorio Regional de

Referencia-VIH/SIDA

Proyecto Regional VIH/SIDA

pmira@sica.int

Dentro del ejercicio profesional, así como en la vida diaria, nuestras ac-ciones deben estar enmarcadas en los principios éticos, que nos permitan

desarrollarnos integralmente sin perjuicio de las personas con las cua-les interactuamos y de nuestro entor-no. Como profesionales de la salud uno de nuestros compromisos y deberes hacia nuestros pacientes, es el garan-tizarles la confidencialidad y protec-

ción de toda la información que nos proporcionan, como parte del proceso de atención que requiere cada caso. En el tema de VIH, este compromiso se vuelve prioritario, por todo el es-tigma y discriminación que conlleva esta patología, impactando el entorno en el que día a día se desenvuelven

las personas que viven con VIH. El Programa Conjunto de las Nacio-nes Unidas para el SIDA (ONUSIDA) en una de sus publica-ciones hace mención a que “Existen tres conceptos interrelacionados que influyen enormemente en el desarro-

llo y la puesta en marcha de la pro-tección de todo tipo de información sensible: privacidad, confidencialidad y seguridad. A pesar de estar relacio-nados entre sí, cada uno tiene un significado distinto, y se desarrolla y se aplica de forma diferente. Privacidad es un concepto jurídico y

ético al mismo tiempo. Desde el pun-to de vista jurídico, hace referencia a la protección legal que se le concede a un individuo, con el fin de controlar tanto el acceso a su información per-sonal como el uso de la misma; dicho aspecto de protección jurídica consti-tuye el marco general en el que se

aplican los conceptos de confidencia-lidad y seguridad. Confidencialidad es un término que está relacionado con el derecho de

los individuos a la protección de sus datos durante las fases de almacena-miento, transferencia y uso, con el objetivo de evitar que se revele dicha información a terceras personas sin autorización previa. En el desarrollo de las políticas y los procedimientos de confidencialidad, también se debe

debatir cuestiones sobre el uso apro-piado y la difusión de información sanitaria, teniendo en cuenta cuestio-nes éticas y jurídicas, tal y como aparece recogido en los reglamentos y las leyes de privacidad. Seguridad es un concepto que recoge

diversos enfoques técnicos que, a su vez, abarcan aspectos físicos, electró-nicos y procedimentales relacionados con la protección de la información recogida como parte de la ampliación de servicios relacionados con el VIH. La seguridad debe estar encaminada a la protección de los datos frente a la

difusión de los mismos (tanto volun-taria como involuntariamente), así como a la falta de disponibilidad de información a causa de fallos del sistema o errores del usuario”. Considerando los conceptos antes mencionados y para dar cumplimien-to a los mismos, cada profesional de

Laboratorio tiene el deber de poner en práctica, sin excepciones, los prin-cipios contemplados en el Código de ética que rige el quehacer diario de-ntro de la Institución, así como implementar estrategias de manejo de

Editorial

Julio 2010 LRR EN ACCIÓN

LRR EN ACCIÓN

Contenido:

LRR implementa

nueva opción ...

2

Validación del uso de

concentrado leucocita-

rio como muestra para

3

La micropipeta:

un instrumento

imprescindible

4

En breve…. 4

Galería fotográfica 5

LRR en acción es publicado por:

Laboratorio Regional de

Referencia de VIH/SIDA para

Centroamérica.

Ciudad de Panamá

(507) 527-4837

http://www.sica.int/lrr/

EL LABORATORIO REGIONAL DE REFERENCIA DE VIH IMPLEMENTA NUEVA OPCIÓN

METODOLÓGICA PARA DETECTAR MUTACIONES EN EL VIH-1 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A

LOS MEDICAMENTOS ANTIRETROVIRALES

Página 2

LRR EN ACCIÓN

Dalis Mojica

El estudio de la resistencia a los me-

dicamentos de las cepas de VIH es

esencial para determinar la utilidad

de los medicamentos antirretrovira-

les. Actualmente en la región Cen-

troamericana la disponibilidad de

alternativas de tratamiento es limi-

tada, así como la disponibilidad de

recursos de laboratorio para el mo-

nitoreo de la efectividad de la tera-

pia antiretroviral, por lo que el uso

de pruebas especializadas, como

lo son las pruebas de resistencia ha

tenido que ser priorizadas y ade-

cuadas a los recursos disponibles.

La implementación de métodos

genotípicos de detección de resis-

tencia a los medicamentos antirre-

trovirales requiere de una evalua-

ción adecuada a fin de garantizar

al máximo la fiabilidad de los resul-

tados obtenidos. En este sentido,

hemos analizado resultados obteni-

dos con la nueva opción meto-

dológica (ViroSeq HIV-1 System, v

2.0, software 2.8) que utiliza el se-

cuenciador 3130XL, comparándo-

los con el Sistema OpenGene v

4.1 (Trugene HIV-1 Genotyping

Test, Guidelines 14.0) existente en

el LRR. Ambos métodos utilizan

una Secuencias de Referencia

(SR) en particular, B-LAV-1 para

Trugene y HXB2 en el ViroSeq. Uti-

lizamos 16 muestras clínicas

(plasma) pertenecientes a pa-

cientes con historia previa de

ARV, todos con falla terapéutica y

promedio de Carga Viral de

17012 copias de ARN/mL. Ambas

metodologías fueron trabajadas

siguiendo las instrucciones de ca-

da fabricante obteniéndose se-

cuencias de alta calidad para

todas las muestras.

Se obtuvo una concordancia de

100% entre los dos ensayos consi-

derándose 63 sitios de mutaciones

identificados en las muestras (30

correspondientes a la región de la

proteasa y 33 a la RT) con Truge-

ne. Con los resultados obtenidos,

la implementación del Sistema de

ViroSeq en el LRR, ha sido todo un

éxito.

Aunque los protocolos de ambas

pruebas son diferentes, el nivel de

complejidad es comparable y se

requiere personal debidamente

entrenado para la ejecución de

estas pruebas. Es importante se-

ñalar que son diferentes las bases

de datos utilizadas por estos dos

sistemas para asociar mutaciones

con un tratamiento determinado, y

cada uno de ellos utiliza para su re-

porte reglas o guías particulares. Se

recomienda que para la interpreta-

ción clínica de las mutaciones indivi-

duales y patrones de mutaciones

que proporcionan información sobre

resistencia se tomen en cuenta,

además de la historia previa de anti-

rretrovirales, las diferencias en las

bases de datos.

ID TRUGENE VIROSEQ ID TRUGENE VIROSEQL10I + + M41L + +

I13V* + + A62V + +

I15V* + + K65R + +

G16E* + + D67N + +

L19I* + + K70R + +

K20R* + + K70E + +

L33V + + L74V + +

L33F + + V75I + +

M36I* + + V75M + +

E35G + + V75T + +

K43T + + V90I* + +

M46I + + A98G + +

M46L + + L100I + +

I47V + + K101E + +

I54V + + K103N + +

D60E* + + V106I + +

I62V* + + V106M + +

L63P* + + V108I + +

L63T* + + Y115V + +

A71V + + V118I + +

A71T + + V179D + +

G73S + + Y181C + +

L76V + + M184V + +

G73S + + G190S + +

V77I* + + G190A + +

V82T + + H208Y* + +

N83D + + L210W + +

I85V* + + T215Y + +

L90M + + T215F + +

I93L* + + K219Q + +

P225H + +

F227L + +

M230L + +

ID Mutaciones identificadas en el estudio

+ Mutación identificada

* "Mutación Adicional" según informe de ViroSeq

REGIONES

PROTEASA TRANSCRIPTASA REVERSA

TABLA 1

MUTACIONES IDENTIFICADAS EN EL ESTUDIO

Sensibilidad: 100%, Especificidad: 100%

Valor predictivo positivo: 100%, Valor predictivo negativo: 100%

manera: 64 viales de 1 ml de sangre fresca

completa, 64 tiras de papel filtro Whatman 903

impregnada con sangre completa (5 círculos de

50μL en cada tira) y 64 viales con 250μL de

concentrado leucocitario. Los viales con sangre

completa se procesaron inmediatamente, mientras

que las alícuotas de concentrado leucocitario se

almacenaron a -70°C; la sangre impregnada en el

papel filtro se dejó secar por al menos 4 horas a

temperatura ambiente y posteriormente se

almacenó a temperatura ambiente en bolsas

plásticas con cierre hermético y sobres conteniendo

agente desecante; estas muestras de sangre seca

en papel filtro se recopilaron para una validación

posterior.

Materiales: se trabajó con los insumos y reactivos

indicados por Roche AMPLICOR® HIV-1 DNA Test

version 1.5.

Metodología: las muestras de sangre completa y concentrado leucocitario fueron preparadas y extraídas usando el reactivo Amplicor HIV-1 DNA Assay versión 1.5 según las indicaciones del fabricante; siendo la única diferencia en el

procedimiento en el caso del concentrado leucocitario, el uso de 200μL de muestra en lugar de 500μL. El ADN extraído fue amplificado específicamente en

un fragmento de 155 nucleótidos de una región

altamente conservada del gen gag que codifica los

antígenos específicos del core viral del VIH-1. La

detección se realiza mediante la hibridización de

sondas específicas en placas de micropozos y

lectura de absorbancia de la reacción colorimétrica

generada por el cromógeno y las enzimas ligadas a

los ácidos nucleicos hibridizados. Los ensayos

fueron validados e interpretados según las

indicaciones del fabricante3.

Resultados:

Para realizar los análisis de validación de los tipos

Introducción:

El diagnóstico de la infección por el VIH es

usualmente realizado con la detección de

anticuerpos contra el VIH. También es posible el

diagnóstico mediante detección directa del virus;

sin embargo, la detección del virus es necesaria

solo en situaciones muy particulares como el

diagnóstico de bebés nacidos de madres

infectadas por VIH, en quienes aún están

presentes los anticuerpos maternos, en sospecha

de infecciones primarias o en casos de ausencia

de anticuerpos durante el período de ventana

propia de la infección1.

De las alternativas más prácticas y costo-efectivas

que se pueden realizar en los laboratorios para la

detección directa del virus es la determinación de

la presencia de los ácidos nucleicos virales. Las

técnicas cualitativas son de gran utilidad como

marcadores de infección; ejemplo de estas

técnicas es la prueba de detección de ADN

Proviral del VIH en leucocitos, que se basa en el

principio de la reacción en cadena de la

polimerasa (PCR)1.

El Laboratorio Regional de VIH/SIDA -LRR- utiliza

la prueba comercial Roche AMPLICOR® HIV-1

DNA Test version 1.5 para la detección de ADN

Proviral utilizando como muestra sangre

anticoagulada (EDTA), según indica la prueba 2.

Sin embargo, por razones técnicas y de logística

en el manejo de las muestras, el LRR ha conside-

rado necesario evaluar la efectividad de uso de

muestras alternativas como el concentrado

leucocitario.

Objetivo:

Validar la utilización de concentrado leucocitario

como muestra para la determinación de ADN

proviral de VIH-1, considerando que el

aseguramiento de la calidad de las pruebas de

laboratorio es crítica para el buen funcionamiento

de los Programas Nacionales de VIH/SIDA. Se

consideró como muestra de referencia la sangre

fresca completa, al ser la muestra recomendada

por el fabricante.

Materiales y métodos:

Muestra: se analizaron 64 muestras hemáticas

donadas voluntariamente por individuos cuyo

estado serológico era conocido al haber sido previa-

mente determinado por dos a tres pruebas

inmunodiagnósticas para VIH; estas muestras, 49

positivas y 15 negativas, son parte del banco de

muestras de referencia del LRR. Las muestras

fueron recolectadas en viales con EDTA como

anticoagulante y fraccionadas dentro de las

primeras 6 horas posteriores a la toma de muestra.

El fraccionamiento se realizó de la siguiente

de muestra, se consideró como muestra de referencia

la sangre completa, al ser la muestra recomendada

por el fabricante. Los resultados obtenidos de las

pruebas realizadas a las muestras de concentrado

leucocitario al ser comparados con los resultados de

las muestras de sangre completa correspondiente,

generaron valores para los parámetros de sensibili-

dad, especificidad y valores predictivos positivo y

negativo de 100%, siendo la precisión diagnóstica de

100% (ver tabla No. 1).

Los parámetros estimados en la evaluación de los

tipos de muestras para la detección de ADN Proviral

de VIH-1 utilizando el reactivo Amplicor HIV-1 DNA

Assay versión 1.5 reflejan que es factible el uso del

concentrado leucocitario como muestra; es más, el

uso del concentrado leucocitario facilita la logística de

almacenamiento de la muestra ya que la sangre

fresca debe ser preparada en los 4 días posteriores a

la toma de muestra 2 , no obstante, el concentrado

leucocitario congelado a bajas temperaturas puede

durar por mucho más tiempo, mejorando así la

organización del trabajo en el laboratorio.

Conclusión:

El uso de concentrado leucocitario como muestra

para la detección de ADN Proviral de VIH-1 es viable

y práctico para los laboratorios utilizando el reactivo

Amplicor HIV-1 DNA Assay versión 1.5.

Referencias

1. Hoffman, Rockstroch, Kamps HIV Medicine 2007

2. Jennings Cheryl; Danilovic Aleksandra; Stability of

Human immunodeficiency Virus Type 1 Proviral

DNA in whole blood samples; Journal of Clinicl

Microbiology, Aug 2005, p4249-4250

3. Roche Molecular System , 2005. Roche amplicor

HIV-1 Test manual. Roche Molecular System, Inc.,

Pleasanton, Calif

Validación del uso de concentrado leucocitario como muestra para la detección de

ADN Proviral de VIH-1 utilizando el reactivo Amplicor HIV-1 DNA Assay versión 1.5

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LRR EN ACCIÓN

A. Girón y C. González

Tabla No. 1 Comparación de muestras de sangre completa vs concentrado leucocitario para la detección de ADN Proviral de VIH-1

Sangre Completa

Se detectó ADN proviral

No se detectó ADN proviral

Total

Concentrado Leucocitario

Se detectó ADN proviral

49 0 46

No se detectó ADN proviral

0 15 15

Total 49 15 64

La micropipeta: un instrumento imprescindible

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El Laboratorio Regional de Referencia para VIH/SIDA C.A. visitará a los Laboratorios Centrales de Referencia de la Región

Centroamericana, con la finalidad de apoyarles en el fortalecimiento de la implementación del sistema de gestión de

calidad. En estas visitas se proporcionará asesoría técnica y se diseñarán planes de trabajo para dar continuidad al trabajo

que se ha estado realizando de tan buena manera por estas instituciones. Las visitas a Panamá, Honduras y El Salvador se

realizaron en julio; durante el mes de agosto serán visitados los laboratorios de Costa Rica, Guatemala y Nicaragua.

Durante el mes de julio, el Laboratorio Regional de Referencia para VIH/SIDA C.A. -LRR- continuo con su objetivo de transferir

metodologías a la región, mediante la realización del taller de “Preparación de paneles de suero” que se impartió a los pro-

fesionales del Laboratorio Central de Referencia de VIH de la Secretaría de Salud de Honduras. Así mismo, con estos profe-

sionales se desarrollo un taller sobre el transporte adecuado de las muestras biológicas por vía aérea según lo regulado por

normativas de la Asociación Internacional de Transporte Aéreo (IATA por sus siglas en inglés).

Aunado a estas actividades, el LRR apoyó técnicamente al Laboratorio Max Bloch, Laboratorio Nacional de Referencia, de

El Salvador en la implementación de la metodología para la detección de ADN Proviral de VIH-1.

A manera de acercamiento a los profesionales de los Laboratorios Centrales de Referencia de Centroamérica con las

metodologías de laboratorio para genotipaje de VIH, el LRR ha programado un entrenamiento a realizarse durante el mes de

agosto en la ciudad de Panamá. En esta actividad teórica y práctica, se ensayará mediante el secuenciamiento de

fragmentos amplificados del genoma del VIH (específicamente de la región que codifica para las enzimas Transcriptasa

Reversa y Proteasa), su comparación con la cepa salvaje del virus y su posterior análisis con bases de datos de referencia,

determinando así las mutaciones asociadas a la resistencia a medicamentos ARV del VIH-1.

En breve…

LRR EN ACCIÓN

Iván Ríos V.

A. Girón

La micropipeta es un instrumento de

laboratorio empleado para aspirar y

transferir pequeños volúmenes de

líquidos y permitir su manejo en las

distintas técnicas científicas. Cuando

realizamos una prueba, preparamos un

reactivo o una mezcla depositamos

nuestra confianza en la mayoría de los

casos en este instrumento llamado a

ser preciso, y que ya sea por su uso

diario, golpes o caídas pueden

desajustarse generando errores

sistemáticos que pueden repercutir en

los resultados obtenidos. Por la

importancia y magnitud de los

procedimientos que se realizan en un

laboratorio de VIH, tal confianza

debe sentarse sobre la base de un buen

programa de verificación que involucre

a todos los miembros científicos del

laboratorio, y para el cual utilizamos

herramientas como la media, la exacti-

tud, desviación estándar y el coeficien-

te de variación que nos permiten anali-

zar los valores obtenidos al pesar volú-

menes dispensados. Recalcar que

cada laboratorio debe establecer sus

límites de tolerancia (a falta de registros

por el fabricante) para cumplir con las

políticas de calidad establecidas por la

dirección permitiendo decidir que pipe-

tas necesitan ajuste y cuáles no, logran-

do así un buen monitoreo de las pipetas.

Es grato señalar que miembros de los

Laboratorios Nacionales de Referencia

para VIH de la región centroamericana

han sido entrenados en la metodología

para la verificación de mircopipetas y

quienes son agentes multiplicadores de

estos conocimientos en sus respectivos

países, contribuyendo así a elevar la cali-

dad de los procedimientos realizados

en nuestros laboratorios.

A través del Componente de Vigilancia Epidemiológica del Proyecto Regional de VIH y el LRR-VIH/SIDA, se esta apoyando la

realización de los estudios de Sub-Notificación y Evaluación del cumplimiento del Algoritmo diagnóstico de VIH en Costa Ri-

ca, Nicaragua y El Salvador; estudios que permitiran la implementación de acciones que ayuden a mejorar los sistemas de

notificación con que se cuentan actualmente, así como al fortalecimiento de las redes de laboratorio locales

GALERÍA FOTOGRÁFICA

Página 5

LRR EN ACCIÓN

“Taller Regional de Vigilancia Epidemiológica de Laboratorio”

17 al 21 de mayo 2010, San Salvador, El Salvador

Taller de “Preparación de paneles de suero”

impartido a los profesionales del Laboratorio

Central de Referencia de VIH/SIDA de la

Secretaría de Salud de Honduras

GALERÍA FOTOGRÁFICA

Página 6

LRR EN ACCIÓN

Taller de entrenamiento en el sistema ViroSeq para genotipaje de VIH-1 Personal del área de Biología Molecular del Laboratorio Regional de Referencia para VIH/SIDA C.A. y profesionales del

Laboratorio Central de Referencia de Panamá

Ciudad de Panamá, 25 al 28 de Mayo de 2010

Implementación de la metodología para la detección de ADN Proviral de VIH-1 Laboratorio Max Bloch. San Salvador, El Salvador

GALERÍA FOTOGRÁFICA

Página 7

LRR EN ACCIÓN

Taller de “Preparación de control de calidad interno”

Laboratorio Central Dr. Max Bloch, Laboratorio Nacional de Referencia de

El Salvador. Este laboratorio está preparando paneles de suero, ha imple-

mentado el programa de control interno para VIH por la metodología MEIA

con Axsym y Vironostika de cuarta generación.

Curso de Gestión de Calidad y Buenas Prácticas de Laboratorio de OPS, II edición Personal del Laboratorio Central de Referencia de la Secretaría de Salud de Honduras